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Grandes descubrimientos RNAs pequeños siRNA miRNA piRNA !   Small interfering RNAs (siRNAs): se generan por corte con Dicer (RNasa 8po III) a par8r de RNA de doble cadena (dsRNA) !   Piwi-­‐interac8ng RNA (piRNAs): se generan a par8r de RNA de simple cadena !   MicroRNAs (miRNAs): se generan por corte con proteínas Dicer a par8r de precursores 8po tallo-­‐asa Co-supresión post-transcripcional en TRANS en plantas
RNAs pequeños no-codificantes reguladores de desarrollo
lin-­‐4 fue el primer miRNA que se descubrió (1993); su blanco el mRNA de lin-­‐14 (C.elegans) Lagos-­‐Quintana et al., 2001 Lau et al., 2001 Biogénesis de RNAs pequeños en animales Transcripción nuclear Generación de fragmentos de sRNA 21-­‐24nt Distribución a complejos RISC Función en la célula Diferencias y similitudes entre miRNAs y siRNAs Transposones, secuencias repe8das, virus, dsRNA exógeno Genes que codifican para miRNA 1. Las moléculas de las cuales se originan (diferente) 2. El procesamiento (similar) 3. El mecanismo de acción (diferente) 4. El efecto final – silenciamiento (similar) RISC Bernstein y col., 2001: Al analizar los genomas de Drosophila y C. elegans encontraron solo tres enzimas de 8po RNasa III específicas para dsRNA: (1) La Ypica RNasa III con un solo mo8vo de RNasa III y otro de unión a dsRNA (dsRM), (2) Drosha con dos mo8vos de RNasa III y uno dsRM, y (3) CG4792/Dicer-­‐1 en Drosophila con dos mo8vos de RNasa III, un dominio de helicasa amino terminal y un dsRM. Ellos demostraron que solo Dicer puede producir fragmentos de 22 nt. El experimento consis8ó en expresar cada una de las proteínas marcadas con un epítope en células de Drosophila, inmunoprecipitarlas y evaluar su ac8vidad sobre dsRNA para ciclina E. DICER Tiene dominio de RNasa 8po III. Corta RNA de doble cadena en fragmentos entre 21 y 25 nt, dejando 2 nt sobresalientes en los extremos 3’. En mamíferos, solo hay una proteína Dicer En Drosophila hay dos diferentes DCR1 y DCR2 Vía miRNA Vía siRNA Lee et al., 2004 En Arabidopsis thaliana hay cuatro diferentes DCL1 – DCL4 DCL1
miRNA, nat-siRNAs
DCL2
nat-siRNAs
DCL3
ca-siRNAs
DCL4
ta-siRNAs
En Drosophila hay dos Dicers y dos AGOs que aparentemente REVIEWS
distribuyen Current
Biology Vol 15 No 15siRNAs y miRNAs en diferentes complejos R604
hairpin-shaped TAR RNA,
implicated in the response to HIV
Dcr-2
long dsRNA
pre-miRNAs
infection [18]. Moreover, TAR RNA
Loqs
has recently been suspected to be
Ago1
a viral pre-miRNA [19]. The
homology between Loqs and
TRBP is especially intriguing, as
Dcr-1
R2D2 Dcr-2
there is no clear human homolog
‘holo-RISC’
for R2D2. Furthermore, human
Loqs
Ago2
Dicer is more closely related to
Ago1
Dispatch
Hannon, R605
Loqs
Drosophila’s Dicer-1. As
Dicer-1 2011 Dcr-1
and Loqs are required for miRNAand siRNA-mediated gene
RNAi in Drosophila. Cell 117, 83–94.
12. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and
Microprocessor complex. Nature 432,
Siomi, M.C. (2004). Distinct roles for
231–235.
17. Cox, D.N., Chao, A., Baker, J., Chang, L.,
silencing, and Dicer-1 even shows
Argonaute proteins in small RNA7. Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim,
Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class
directed RNA cleavage pathways. Genes
J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Radmark,
of evolutionarily conserved genes
miRISC
Dev. 18, 1655–1666.
O., Kim, S., et al. (2003). ThesiRISC
nuclear
defined
by piwi are essential for stem weak siRNA-generating activity in
Ago2 13. Liu, Q., Rand, T.A., Kalidas, S., Du, F.,
Ago1 cell self-renewal. Genes Dev. 12,
RNase III Drosha initiates microRNA
the absence of Loqs, it seems
Kim, H.E., Smith, D.P., and Wang, X.
processing. Nature 425, 415–419.
3715–3727.
(2003). R2D2, a bridge between the
8. Landthaler, M., Yalcin, A., and Tuschl, T.
18. Gatignol, A., Buckler-White, A.,
plausible that human Dicer could
initiation and effector steps of the
(2004). The human DiGeorge syndrome
Berkhout, B., and Jeang, K.T. (1991).
Drosophila RNAi pathway. Science 301,
critical region gene 8 and its D.
Characterization of a human TAR RNA- function in a fashion similar to
1921–1925.
melanogaster homolog are required for
binding protein that activates the HIV-1
14. Saito, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and
miRNA biogenesis. Curr. Biol. 14,
LTR. Science 251, 1597–1600.
Dicer-1. Dicer-2 may play a
Siomi, M.C. (2005). Processing of pre2162–2167.
19. Bennasser, Y., Le, S.Y., Yeung, M.L., and
microRNAs by the Dicer-1-Loquacious
9. Schwarz, D.S., Hutvagner, G., Du, T., Xu,
unique role in Drosophila. Thus,
Jeang, K.T. (2004). HIV-1 encoded
complex inAAAAA
Drosophila cells. PLoS Biol.
Z., Aronin, N., and Zamore,
candidate micro-RNAs and their cellular
m G P.D. (2003).
3, e235.
Asymmetry in the assembly of the RNAi
findings in Drosophila siRISC
targets. Retrovirology 1, 43.
15. Förstemann, K., Tomari, Y., Du, T., Vagin,
enzyme complex. Cell 115, 199–208.
20. Griffiths-Jones, S. (2004). The microRNA
Ago2
biogenesis should be applied
V.V., Denli, A.M., Bratu, D.P., Klattenhoff,
10. Lee, Y.S., Nakahara, K., Pham, J.W., Kim,
registry. Nucleic Acids Res. 32,
G
C., Theurkauf, W.E., andm
Zamore,
P.D.
K., He, Z., Sontheimer, E.J., and
D109–D111. AAAAA
carefully to the human system.
(2005). Normal microRNA maturation and
Carthew, R.W. (2004). Distinct roles for
Ribosome
germ-line stem cell maintenance
Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the
Beyond that, Loqs may be
Institute ofAgo1
Molecular Biotechnology of
requires Loquacious, a double-stranded
siRNA/miRNA silencing pathways. Cell
RNA-binding domain protein. PLoS Biol.
117, 69–81.
the Austrian Academy of Sciences,
involved
in processing other types
m G A.A., Hammond, OH
P 3, e236.
AAAAA
11. Bernstein, E., Caudy,
IMBA, Vienna, Austria.
16. Pham, J.W., Pellino, J.L., Lee, Y.S.,
S.M., and Hannon, G.J. (2001). Role for a
E-mail: javier.martinez@imba.oeaw.ac.at
of non-coding RNAs. Further
Current Biology
Carthew, R.W., and Sontheimer, E.J.
bidentate ribonuclease in the initiation
(2004). A Dicer-2-dependent 80s
step of RNA interference. Nature 409,
studies on other binding partners
DOI: 10.1016/j.cub.2005.07.044
complex cleaves targeted mRNAs during
363–366.
will certainly help to characterize
Figure 1. Model of the Dicer-1 and Dicer-2 pathways in Drosophila.
its function in greater detail. There
(A) The RNase III-like enzyme Dicer-2 (Dcr-2) is needed to process long dsRNAs into
are more than 70 miRNAs known
A
B
Dcr-1
7
7
7
4 proteínas
Microsecuenciación
homólogo de rde-1: Argonaute 2 (Ago2)
IdenWficación de la enzima "Slicer" en un complejo RISC programado con siRNA La enzima AGO2 de mamíferos muestra ac8vidad de RNasa dentro del complejo RISC que degrada al mRNA blanco del siRNA con el cual ha sido programado RISC. La ac8vidad de AGO2 no es requerida para la función de RISC-­‐miRNA en el apagado de síntesis de proteína a par8r de un mRNA blanco del miRNA. Estructura cristalográfica de Argonauta de Pyrococcus furiosus Song et al., 2004 Modelo para la acWvidad "Slicer" de Argonauta Song et al., 2004 ARGONAUTE PAZ Dominios de Argonaute
PIWI/Argonaute/Zwille/RDE-­‐1 PIWI: Dm; requerida para la renovación de células madre Argonaute: At; relacionada con el desarrollo y <loración Zwille: At; relacionada con genes expresados en meristemo RDE-­‐1: Ce; RNAi de<icient PAZ: unión de ácidos nucléicos
PIWI: Plegamiento RNasaH
Proteínas PPD (PAZ & PIWI Domains)
Las dos cadenas del dsRNA generado por Dicer no ocupan de igual manera a RISC (A) mRNA blanco: LUC sen8do (corresponde a siRNA an8-­‐sen8do: negro) y an8-­‐sen8do (corresponde a siRNA sen8do: rojo) (B) RNAi programado con el dúplex indicado arriba (C) RNAi programado la cadena sen8do o an8-­‐sen8do con el extremo 5’ fosforilado (D) Ocupación de las cadenas de siRNA sen8do (rojo) ó an8-­‐sen8do (negro) en RISC (columnas vacías) o su presencia como cadena sencilla (columnas llenas) después de la incubación con el lisado de Drosophila mostrado en (B) y (E). (E) RNAi programado con el dúplex indicado arriba (la C en el 5’ de la cadena sen8do (rojo) fue sus8tuida por U (azul) generando un desapareamiento U-­‐G En un dúplex de RNA de 21-­‐24 nt, la cadena cuyo extremo 5’ muestra mayor inestabilidad de apareamiento se selecciona como la cadena “efectora” del silenciamiento. La otra cadena “pasajera” se degrada. La asimetría explica el por qué se acumula preferencialemente solo una de las cadenas proveniente de los precursores de miRNAs encontrados (miRNA maduro) El hallazgo permite diseñar siRNAs efec8vos en el silenciamiento por RNAi RISC: RNA Induced Silencing Complex Argonaute discrimina el dúplex de RNA de 21-­‐25nt generado por Dicer, quedándose con el miRNA ó siRNA acorde a la estabilidad termodinámica del extremo 5’. La cadena cuyo extremo 5’ muestra MENOR estabilidad de apareamiento en el dúplex es seleccionada para ser cargada a RISC. menor estabilidad Se degrada cadena pasajera Regulación por RNAs pequeños a nivel transcripcional IUBMB LIFE
Silenciamiento de secuencias repe8das (transposones) FIG 1
A model of transposon mediated genomic instability. A copy and paste model (left) and a cut andGuo paste
& model
Wu, 2(right)
013 are presented. In the copy and paste model, retrotransposons copy themselves in two stages: first from DNA to RNA by transcription,
then from RNA back to DNA by reverse transcription (RT). The DNA copy is then inserted into the genome in a new position.
Biogénesis y complejos funcionales de piRNAs REVIEW
piRNA cluster
Pol-II
piRNA precursor
Nucleus
Epigenetic regulation
Import of Piwi–
piRNA complex
Export of
piRNA precursor
Cytoplasm
5′
Piwi
3′
2′-O methylation
5′ end
formation
Yb
Vreteno
5′ U
piRNA intermediates
3′ Me
U
Armi
Piwi
U
Shutdown
Zuc
U
Piwi
?
3′ end trimming
piRNA loading
(Yb body)
piRNA biogenesis in the Drosophila ovarian soma. piRNAs
ted from specific genomic loci known as piRNA clusters, which
menco, the 5ʹ UTRs of mRNAs and traffic jam in the soma. The
e-stranded piRNA precursor (red) is then exported from the
Armitage (Armi) and Vreteno. Overlapping proteins indicate prote
protein interaction. The co-chaperone Shutdown plays an uncharac
but crucial, part in piRNA loading. The putative
Ross endonuclease
et al., 2014 Zucc
(Zuc) is required for piRNA maturation and for nuclear localization
IUBMB LIFE
Modelos propuestos para la acción de piRNAs en animales Models depicting how piRNA represses transposable element expression. Piwi-piRNA complexes repress transpo
sion by increasing CpG methylation upstream or within the transposon region (left), and/or chromatin modifica
Guo &
Wu, transposon region (middle), or by directly degrading a transposon’s transcript (right). [Color figure
can
be2013 viewed i
Modulación epigené8ca por piRNAs INSIGHT REVIEW
a
RNA precursors74.
interfering RNAs75
Su(Var)3-9
Pol-II
H3K9
Me
sequence-specificity
ing somatic macron
HP1a
Piw
i
methylation then gr
current model, for w
and Paramecium, lo
tal somatic macron
Thus, unbound piR
b
the genome for elim
HP1a
By contrast, piR
Piw ?
Su(Var)3-9
orthologue, Otiwi1
Nascent
i
transcript
opment of the soma
that on knockdown
not survive after m
Me
HP1a
normally deleted ge
generations79. This
somatic macronucl
Pol II
rahymena, the mino
deletion, whereas in
Figure 2 | Piwi–piRNA mediated epigenetic regulation. Simplified
genome is directed
illustrations of the currently proposed models of Piwi-mediated transcriptional distantly related sp
Ross et al., 2014 gene silencing. a, In heterochromatin, Piwi may be guided to its target
opposite ways, it is c
siRNAs:
hpRNAs: small RNAs
Silenciamiento transcripcional por siRNAs
cHeterochromatic
a-­‐siRNAs (
ra-­‐siRNAs) en plantas produced chiefly from
whose precursor is
single-stranded hpRNA
intergenic and/or repetitive regions;
typically 23–24 nt in length and
associated with de novo deposition of
repressive chromatin marks
Other hpRNAs: imprecisely
processed precursor hairpins
that do
not qualify as miRNAs
AGO
RDR
siRNAs: small RNAs whose
precursor is dsRNA
trans-Ac
siRNAs that
distinct fr
P
wh
p
Secondary siRNAs:
siRNAs whose precursor dsRNA synthesis
depends on an upstream small RNA
trigger and subsequent RDR activity
Heterochromatic siRNAs:
siRNAs produced chiefly from
intergenic NAT-siRNAs:
and/or repetitive regions;
typically
23–24
nt indsRNA
length
siRNAs whose
precursor
is and
formed by
the de
hybridization
of
associated
with
novo deposition
of
complementary
and
independently
repressive
chromatin marks
transcribed RNAs
Figure 1
si
cis-NAT
whose pre
from o
op
tra
NAT-siRNA
transcribe
genes
co
s
2013 AGORNAs. Thick black linesAxtell, Hierarchical classification system for endogenous plant small
indicate
hiera
Modelo de biogénesis y función de ca-­‐siRNAs en plantas these
1
1
C-terminal
both
domain of Pol V
rochr
largest subunit
Pol IV
Pol V
V fun
Pol IV
DRM2
produ
DDR
A
GO
transcript
complex
4
Pol V
A su
RDM1
transcript 2
howe
3
siRN
RDR2
AGO4
(113)
DCL3
indep
analy
short
1 What are the Pol IV and Pol V core promoters? How is transcription
initiation by Pol IV and Pol V regulated?
half o
clear
2 Is there a role for AGO4-catalyzed slicing of target scaffold transcripts?
Pol V
Axtell, 2013 3 What are the complementarity requirements between siRNAs and
V gen
views.org
use only.
Repressive
chromatin
marks
Reprogramación epigené8ca durante reproducción Transducción de la señal de sRNAs en plantas Parent et al.
FIGURE 1 | Cascades of reactions leading to the production of sRNA
Small RNA signaling in plants
Parent et al., 2012 after a known (in the case of TAS genes) or unknown (in the case of sense