Download Perfil de expresión genética en el carcinoma no microcítico de

Perfil de expresión genética en el carcinoma no
microcítico de pulmón: utilidad de las biopsias
endoscópicas, correlación con la histología y
predicción pronóstica en pacientes operables.
FIS 04/2641
„ Objetivo
principal del proyecto
„ Metodología
de trabajo de microarrays
„ Ejemplos aplicaciones en pulmón
„ Resultados
OBJETIVO PRINCIPAL
Analizar los perfiles de expresión génica de carcinomas de pulmón
no microcítico operables ( biopsias endobronquiales y piezas
quirúrgicas) mediante microarrays de oligonucleótidos de genoma
humano completo.
Ajustar un modelo multidimensional con la información molecular
obtenida de los perfiles de expresión y la información clínica para
predecir niveles de TLE y supervivencia.
Principales alteraciones genético-moleculares
RB
p53
CPM
LOH 3p
CPNM
CPM
p53(mutación)
RB (inactivación)
K-ras (mutación)
EGFR (sobreexpresión)
HER-2/ neu (sobreexpresión)
p16 INK4 (inactivación)
P27 (inactivación)
FHIT (delecciones)
RASSFA1 (metilación)
CPNM
80%
50%
80-100% 30%
1%
20%
0%
60%
0%
30%
0-10%
70%
100%
70%
80%
40%
100%
30-40%
SCC
ADC
*
70%
25%
30%
40%
*
Aplicación de la genómica funcional al cáncer
Un alto porcentaje de los genes descubiertos son de función desconocida
Genómica funcional: Asignar función a cada uno de los genes de un organismo y
hacerlo mediante análisis sistemáticos a gran escala
ARRAYS EXPRESIÓN
“ variaciones en la expresión de miles de genes de forma simultánea”
CITACIONES DESDE 1995-2002
Citaciones encontradas en MEDLINE
por 'microarray' (amarillo, 396) o por
'microarray+cancer‘ (rojo, 1325).
MICROARRAYS
„
„
„
„
Definición
Tipos
Ventajas y desventajas
Metodología:
„
„
„
Diseño y fabricación de un microarray
Hibridación de las muestras
Procesamiento de datos
cDNA / Oligo - microarrays
Sondas de DNA inmovilizadas y ordenadas espacialmente en
superficies planas (cristales).
-
+
Sondas: oligonucleótidos
Productos de PCR: cDNA
MICROARRAYS
Formato miniaturizado
Impresión ordenada de cientos o miles de genes en un
formato estándar que consiste en un porta convencional
similar al utilizado para inmunohistoquímica.
SONDAS: cDNA, oligos
GEN 1
GEN 2
cDNA (fragmentos de DNA de 500-1000 pdb )
Oligonucleótidos (fragmentos de DNA de 40-70 pdb )
GEN 3
PLATAFORMAS DE ARRAYS DE cDNA/OLIGOS
Arrays Oligonucleotidos
cDNA Arrays
Alta densidad
Baja densidad
Alta especificidad
Hibridación cruzada no puede ser
determinada
Requiere poca cantidad de muestra
Requiere gran cantidad de muestra
Perfil de expresión y alteraciones
genéticas/polimorfismos
Mayoritariamente perfil de expresión
Alto coste
Bajo coste
Difícil de realizar, petición de oligos
Poca flexibilidad
Arrays de propia generación
Alta flexibilidad
VENTAJAS DE LAS NUEVAS TECNOLOGÍAS :
MICROARRAYS DE cDNA /OLIGOS
•Los métodos tradicionales sólo permiten el análisis de expresión
simultáneo de un número de genes reducido (1-10), insuficiente para
entender un escenario biológico complejo donde la activación génica es
mucho mayor.
•Los Microarrays permiten la integración e inmovilización, ordenada
y conocida, de una alta densidad de material biológico (genoma
completo)
Metodología
„
„
„
„
„
Diseño y fabricación de un microarray
Preparación de la muestras
Hibridación Competitiva
Escaneado y obtención de datos
Análisis de los datos
Diseño y fabricación de un microarray
Cristal
ARRAYER
Colección de genes blanco
Siembra de 1000-1500 ng
generando spots de entre
120-140 μm diámetro.
K-ras
p53
RB
Cada círculo contiene el cDNA / oligo de un gen
PREPARACION DE LAS MUESTRAS
EXTRACCIÓN ARNT
(ARNm 1%)
mRNA
mRNA
AAAAA
TTTTTT PROMOTOR
AAAAA
TTTTTT PROMOTOR
RT
RT
T7P
Cy3
Cy3
cDNA
T7P
Hibridación con poly( dT)
Cy5
Cy5
cDNA
cDNA (Retrotranscripción inversa)
AMPLIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS
MARCAJE CON FLUOROCROMOS
A
A
Tipos de Hibridación
HIBRIDACIÓN
COMPETITIVA
HIBRIDACIÓN
NO COMPETITIVA
Agilent
Affymetrix
HIBRIDACION COMPETITIVA
DE LAS MUESTRAS
HIBRIDACIÓN
COMPETITIVA
Cy3
REFERENCIA
TUMOR
ARNm
Cy5
Marcaje
cDNA -marcado
HIBRIDACIÓN
1) Marcaje fluorescente
referencia
tumoral
A
A
B
B
C
C
2) Hibridación
3) Cuantificación y análisis del resultado
1,8 cm
A
B
C
A
B
C
ESCANEADO
DEL MICROARRAY
láser 1
Cy3
láser 2
Cy5
EMISION
www.broad.mit.edu/chembio/lab_schzeiber/anims/videos/microarray.html
PROCESAMIENTO
DE LA IMAGEN
Puntos VERDES
representan
genes downregulados
en el tumor
Cy5
Puntos AMARILLOS
representan
genes no modificados
Puntos ROJOS
representan
genes sobreexpresados
en el tumor
Cy3
TRANSFORMANDO
IMÁGENES EN DATOS
Análisis: GenePixPro 6.0
Intensidad: nivel de expresión
Muestra problema marcada con rojo (Cy5)
Muestra de referencia marcada con verde(Cy3)
Rojo
Verde
= Ratio de expresión
2 = 2x sobre-expresado
0.5 = 2x downregulado
RATIOS DE EXPRESIÓN
ARRAYS /CASOS
GENES
COMPARACIÓN
DE VARIAS MUESTRAS
RESULTADOS
RDC-1: (A,1)
Genes
1
Código de
colores
según el
nivel de
expresión
2
3
1 2 3 4 ...
4
Muestras
Perfil de
expresión
transcripcional
PROCESAMIENTO DE DATOS
Array
Escaneado,
Procesamiento imágen
Normalización
DNMAD
Selección de genes
GEPAS
CLUSTERING
No Supervisado
Supervisado
Clasificación muestras
Expresión diferencial: predictor
PROCESAMIENTO DE DATOS
Array
Escaneado,
Procesamiento imágen
Normalización
DNMAD
Normalización
Hay muchas fuentes de error que pueden afectar seriamente a la interpretación de los
resultados. Diferencias en la eficiencia de hibridación, marcaje, efectos locales, etc.
La Normalización de los datos es un paso necesario antes al procesamiento y análisis.
BoxPlots
PREPROCESADO DE DATOS
Array
Escaneado,
Procesamiento imágen
Normalización
DNMAD
Selección de genes
GEPAS
Rojo/verde: ratio de expresión
2 = 2x sobre-expresado
0.5 = 2x downregulado
log rojo/verde: log ratio
1 = 2x sobre-expresado
-1 = 2x downregulado
1. Transformación logarítmica en base 2
2. Quitar replicados
3. Fusionar duplicados que existan tomando
como único valor resultante la media de todos
ellos para cada condición.
4. Eliminar los genes de los que se disponga
menos del 70% de los datos.
5. Imputar valores desconocidos utilizando
los 15 registros más parecidos (KNN).
6. Filtrar aquellos registros en los que no
se observa una diferencia de +/1.0 para
cada condición experimental,
tratándose de registros con un perfil plano.
7. Filtrar genes desconocidos
PROCESAMIENTO DE DATOS
Array
Escaneado,
Procesamiento imágen
Normalización
DNMAD
Selección de genes
GEPAS
CLUSTERING
No Supervisado
Supervisado
Clasificación muestras
Expresión diferencial:
PERFIL DE EXPRESIÓN
FIRMA MOLECULAR
APLICACIÓN DE MICROARRAYS EN PULMON
CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS TUMORES : DESCUBRIMIENTO
DE CLASES
Estudio de la existencia de nuevos subgrupos específicos definidos según su patrón
de expresión. Heterogeneidad dentro de un mismo tipo tumorales
PREDICCIÓN DE CLASES (RESPUESTA A TRATAMIENTO, METASTASIS)
Estudio comparativo de clases predefinidas basando en el perfil de expresión
diferencial de genes previamente seleccionados: PREDICTOR
Aplicado al análisis de numerosas situaciones clínicas (diagnostico, selección del
tratamiento)
APLICACIÓN DE MICROARRAYS EN PULMON
CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS TUMORES : DESCUBRIMIENTO
DE CLASES
Estudio de la existencia de nuevos subgrupos específicos definidos según su patrón
de expresión. Heterogeneidad dentro de un mismo tipo tumorales
PREDICCIÓN DE CLASES (RESPUESTA A TRATAMIENTO, METASTASIS)
Estudio comparativo de clases predefinidas basando en el perfil de expresión
diferencial de genes previamente seleccionados: PREDICTOR
Aplicado al análisis de numerosas situaciones clínicas (diagnostico, selección del
tratamiento)
Oncogene, 2005
48 SCC, 9 AD, 30 normales
‘Down en SCC’
‘Different en SCC’
‘Up en SCC’
SCC-B: adhesión, invasión, metástasis
SCC-A: transducción de señales
Clustering supervisado
Entre SCC-A, y SCC-B no existe una
correlación significativa con ningún
parámetro clínico-patológico,
incluyendo estadios y grado de
diferenciación tumoral
432
genes
PNAS, 2001
72 muestras
Group 1: 19 casos Grado 2
Group 2: 7 casos Grado 2-3
Group 3: 9 casos Grado 3
CLUSTERS:
A.- 918 genes modificados con respecto a la referencia
B.- Genes marcados por su implicación en AD
Se definen 3 grupos de adenocarcinomas, cuyo perfil de expresión
se puede correlacionar con grado de diferenciación tumoral y
supervivencia
APLICACIÓN DE MICROARRAYS EN PULMON
CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LOS TUMORES : DESCUBRIMIENTO
DE CLASES
Estudio de la existencia de nuevos subgrupos específicos definidos según su patrón
de expresión. Heterogeneidad dentro de un mismo tipo tumorales
PREDICCIÓN DE CLASES (RESPUESTA A TRATAMIENTO, METASTASIS)
Estudio comparativo de clases predefinidas basando en el perfil de expresión
diferencial de genes previamente seleccionados: PREDICTOR
Aplicado al análisis de numerosas situaciones clínicas (diagnostico, selección del
tratamiento)
Cancer Res., 2002
NSCLC: 39 Lobectomías parciales o totales
2899 genes se encontraron modificados al menos 2 veces en
>80% de las muestras.
Análisis estadístico: firma molecular asociada a recaída (>1
año) local y/o metástasis.
Perfil génico sin recidiva (15 muestras):
- up Cluster A
- down Cluster B y Cluster C
Perfil génico recidiva local /distancia (24 muestras):
- down Cluster A
- up Cluster B y Cluster C
APLICABILIDAD EN MUESTRAS NO QUIRURGICAS
Clin. Cancer Res., 2003
47 FNAs: únicamente de 17 se obtuvo material necesario para el
análisis de expresión : 17 FNAs / 17 tej. nomal / 17 tej. Tumoral
La mayoría de las FNAs muestran un perfil de expresión similar a
la muestra tumoral
El perfil de expresión de FNAs de NSCLC puede determinar
malignidad, y podrá ser utilizado como método alternativo a la
muestra quirúrgica
PCA
PCA
Perfil de expresión génica en carcinoma
no microcítico de pulmón:
Utilidad de las biopsias endoscópicas
Correlación con la histología
Predicción pronostica en pacientes operables
„
„
Metodología
Resultados
Objetivo principal
PERFILES EXPRESIÓN
200 pacientes (230 muestras)
30 pacientes
muestra quirúrgica vs. muestra endoscópica
METODOLOGÍA A SEGUIR
Marcaje cDNA e
HIBIRIDIZACION
ADQUISICION
MUESTRA
ANALISIS SUPERVISADO
Expresión diferencial
entre dos o más clases
Predictor de clases
EXTRACCION
RNA TOTAL
ANALISIS NO SUPERVISADO
METODOLOGÍA A SEGUIR
Marcaje cDNA e
HIBIRIDIZACION
ADQUISICION
MUESTRA
ANALISIS SUPERVISADO
Expresión diferencial entre dos o
más clases
Predictor de clases
EXTRACCION
RNA TOTAL
ANALISIS NO SUPERVISADO
Extracción del RNA total
„
Cantidad
„
Calidad
„
RNA CANTIDAD
Cantidad mínima necesaria para hibridar con
microarrays (Agilent (500 ng ARN total))
Caso con T < 50%
Caso con T > 50%
RNA CALIDAD
28 S
28 S
18 S
18 S
Buena calidad
MUESTRAS
MARC
P11, P12, P13, P13b, P14a, P14b,P14c, P15a, P15b
Degradado
CONTROLES
M14, M12-1, M31, M77, M5
RNA CALIDAD
Agilent Bioanalyzer 2100
25
28 S
20
18 S
Fluorescence
15
10
0
19
24
29
34
39
Time (seconds)
28S
18S
5
44
49
54
59
3.0
2.5
1.5
1.0
15
20
25
4 - 28S
0.0
23 - 1 8 S
0.5
1
Análisis de 1μl de muestra
Nivel de detección: picogramos
Proceso completo: 30 minutos
(12 muestras)
F lu o r e s c e n c e
2.0
30
35
40
Time (seconds)
45
50
55
METODOLOGÍA A SEGUIR
Amplificación / marcaje e
HIBIRIDIZACION
ADQUISICION
MUESTRA
ANALISIS SUPERVISADO
27 muestras
Expresión diferencial entre dos o
másRNA
clases suficiente en 13
8 no degradadas
Predictor de clases
EXTRACCION
RNA TOTAL
ANALISIS NO SUPERVISADO
8 muestras no degradadas
6 tenían T> 50%
Resultados-Hibridación
AGRADECIMIENTOS
Hospital 12 de Octubre
„ Hospital Severo Ochoa
„ Grupo de Cáncer mamario y ginecológico del
CNIO
„ Banco de Tumores
„