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1º Congreso Bioquímico del Litoral Santa Fe, 9, 10 y 11 de junio de 2011 DIAGNÓSTICO MOLECULAR: APLICACIONES EN HEMATOLOGÍA Dra. Margarita Bragós Cátedra Hematología FCByF. UNR ibragos@fbioyf.unr.edu.ar imbragos@yahoo.com.ar DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE TALASEMIAS Talasemias Talasemia (+, º) Talasemia (+, º) Hb F aumentada ()º th, HPFH th IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Se estima que el 3% de la población mundial porta un gen para talasemia IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE th 10 % 20 % 10 % IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Valle del Po, Calabria y Sicilia: 10% Cerdeña y Grecia: 15-20% IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE HEMOGLOBINOPATÍAS Hb S < 5 % 15 % > 20 % 10-20 % 40 % IMB 5% DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA HERENCIA IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Datos de nuestro país proporcionados por FUNDATAL Registro a partir de 1997. Talasemias mayores: 140 Talasemias mayores c/TMO: 17 Talasemias intermedias: 45 HbS/Talasemia y otras: 55 HBSS: 14 IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Curvas de expresión de genes IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Clusters de y Globinas IMB Patrinos Hum Mut, 2005 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia Esquema del proceso de biosíntesis de la cadena globina. En la fase de Transcripción se sintetiza el pre-ARNm en el interior del núcleo. Durante el Procesamiento se modifica y acorta el transcripto primario (splicing). En el citoplasma, por el proceso de Traducción, el ARNm maduro se pega a los ribosomas para comenzar la síntesis proteica. IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia LCR + +1 G º ºº ºº ºº30º A º º31º * º º ** ºº º 105 º 104 3’ HS1 ** 146 5' 3' gt 7 ag 8 gt 7 Defectos en la transcripción del RNA Promotor Defectos en el procesamiento del RNA Cap site º IMB Splicing RNA cleavage ag 8 Defectos en la traducción del RNA + Initatiation codon Nonsense mutation Frameshift * Unstable Globin Small deletion DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia MUTACIONES QUE AFECTAN AL PROCESAMIENTO DEL ARNm A.- Mutación en el sitio de unión del CAP: una sola mutación ha sido encontrada en esta posición. B.- Mutaciones en el proceso de empalme (splicing) 1. - Mutaciones en las secuencias donadora o aceptora para el splicing: IVS1-1 GA, IVS2-l GA (0 –talasemia). 2. - Mutaciones en los exones (mutación sin sentido): Hb Malay (19 GA), HbE (26 G A) y Hb Knossos (27 G T) (+ -talasemia) 3. - Mutaciones en los intrones que originan un lugar alternativo para el splicing: IVS1-6 TC, IVS1-110 GA; IVS2-745 (+ talasemia). , C.- Mutaciones que afectan a la escisión y poliadenilación IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones en Talasemia MUTACIONES EN EL PROCESO DE TRADUCCIÓN A.- Codon de iniciación: en la posición 49 a la izquierda del sitio CAP, aparece un codon AUG que corresponde a la señal para iniciar la traducción. Las posibles mutaciones que se originen en este codon, suprimen la traducción y originan una 0-talasemia. B.- Terminación prematura 1. - Mutación sin sentido: la sustitución de una de las bases de un triplete que codifica a un aminoácido, origina uno de los tres codones de terminación (UAG, UAA y UGA) lo cual da lugar a la terminación prematura de la traducción del ARNm. CAGTAG en el codon 39 (0 – talasemia). 2. - Frameshift (Alteración del marco de lectura): inserciones o deleciones de 1, 2 o 4 nucleótidos en la región codificadora del gen globina (0 – talasemia). IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA CORRELACIONES GENOTIPO-FENOTIPO Cualquier condición heredada o adquirida que reduce el desbalance de cadenas de globina alpha/no-alpha en ß-talasemia resulta en un menor grado de precipitación de cadenas de globina alfa y conduce a un fenotipo menos manifiesto [Galanello & Cao 1998]. •El cuadro clínico que resulta de la homocigosidad ß+ -talasemia u homocigosidad para ߺ-talasemia puede ser mejorado por la co-herencia de mutaciones en el gen que codifica la cadena de alfa globina, lo que reduce la producción cadenas de alfa globina y por lo tanto disminuye la relación alpha/no-alpha. •ß-talasemia Heterocigota puede en algunas circunstancias dar una fenotipo de talasemia intermedia en lugar del carrier asintomático. Triplicación o (menos frecuentemente) cuadruplicación del gen alpha (/ o / o /), lo que aumenta el desbalance en la relación de cadenas alpha/no-alpha. IMB Técnicas Moleculares para Screening de Talasemia y Hemoglobinopatías IMB Patrinos Hum Mut, 2005 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA PCR-ARMS 1 30 31 104 IVS 1 Exon 1 (281 bp) Primer (286 bp) IVS 2 Exon 2 Exon 3 IVS-1 nt 6 (436 bp) IVS-1 nt 110 Codon 39 (634 bp) IMB 146 IVS-1 nt 1 (390 bp) Common 105 IVS-2 nt 1 The Lancet 1990; 336:834-37 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA PCR-ARMS + 1-110 / 0 39 Talasemia IVS-1-nt110 a 500bp 1 2 3 CD39 4 b 1 2 3 4 861bp 861bp 390bp 436bp Línea 1: control de contaminación, H2O Líneas 2 y 4: 100 bp ladder a- Líneas 3 y 4: doble-heterocigota IVS-1-nt110 con primer normal y mutado (390 bp) b- Líneas 2 y 3: doble-heterocigota CD39 con primer normal y mutado (436 pb). IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA - Talasemia DOT-BLOT B2, C1 y D1 son heterocigotas para IVS 1-110 IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Espectro de mutaciones de - Talasemia en el Mediterráneo, Brasil y Argentina CD 39 % IMB IVS 1-110 IVS 1-1 IVS 2-745 IVS 1-6 IVS 2-1 % % % % % Argentina 57,4 22,1 4,9 4,1 2,5 Argentina 47 22,4 9,4 Italia 40,1 23,0 10,2 Cerdeña 95,7 0,5 0,03 España 64 8,5 2,5 Portugal 52,6 10,7 32,9 Francia 41,9 25,7 10,5 2,8 8,6 Brasil 64,3 20,0 5,7 0 7,1 1,6 ? % 7,4 5,9 15,3 5,0 9,9 12 0,4 0,10 0,03 15,5 1,0 2,9 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Espectro de mutaciones de - Talasemia en Rosario MUTACIONES Nº DE ALELOS % FENOTIPO IVS-1-nt l (G A) 6 4,9 º IVS-1-nt 6 (T C) 3 2,5 + IVS-2-nt l (G A) 2 1,6 º IVS-1-nt 110 (G A) 27 22,1 + IVS-2-nt 745 (C G) 5 4,1 + CD39 (C T) 70 57,4 º Desconocidos 9 7,4 122 100 Total Origen de los pacientes: 89,3 % italianos; 9,8 % españoles; 0,9 % griegos IMB Bragós et al. Haematologica, 2000 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA HETEROGENEIDAD MOLECULAR DE LA -TALASEMIA Autores Mutaciones estudiadas 6 % de alelos identificados 92,6 Rosatelli, MC (Italia) 5 88 Martins, C (Brasil) 4 97,1 Villegas, A (España) 5 86,6 Varela, V 4 90 6 90 4 84,7 Bragós, I (Argentina)´96 Varela, V (Argentina)´99 Roldán, A (Argentina) IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Mutaciones más frecuentes en el gen beta en poblaciones de riesgo Mediterranean IVS1-1 GA, IVS1-6 TC, IVS1110 GA, IVS2-l GA , cd 39 CT, IVS2-745 CG Middle East cd 8 -AA, cd 8/9 + G, IVS1-5 GC, cd 39 CT, cd 44-C, IVS2-1 GA Indian 91-95% -619 bp deletion, cd 8/9 + G, IVS11 GT, IVS1-5 GC, 41/42 - TTCT Thai -28 AG, 17 AT, 19 AG, IVS1-5 GC, 41/42 -TTCT, IVS2-654 CT Chinese -28 AG, 17 AT, 41/42 -TTCT, IVS2654 CT African / AfricanAmerican IMB 75-80% -88 CT, -29 AG, IVS1-5 GT, cd 24 TA, IVS11-849 AG, AC Deleciones causantes de Talasemia y Persistencia Hereditaria de Hemoglobina Fetal IMB ()0 Siciliana 1 1585 pb 1150 pb IMB 2 3 4 5 1- Control normal 2- Control positivo heterocigota 3- Paciente positivo heterocigota 4- Blanco de reacción 5- Marker DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Talasemia Intermedia. Co-herencia de triplicación de genes α y th RBC Hb (1012/l)( g/dl) Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) (a) 5.7 8.8 28.5 51 15.8 30.9 (b) 5.0 8.6 27 53 17.1 32.2 (a) + II-745/ anti 3,7 IMB (b) 0 39/ anti 3,7 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA ASOCIACIÓN DE -TALASEMIA HETEROCIGOTA (CD 39) CON DELECIÓN -3.7 GR Hb Hto VCM HCM CHCM (1012/l) (g/dl) (%) (fl) (pg) (g/dl) 4.9 11,2 37 75 22,8 30,3 1 2 3 4 5 6 1,76 kb IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA PORTADORES DE TALASEMIA CD39 (0) GR Hb Hto VCM HCM CHCM (1012/l) (g/dl) (%) (fl) (pg) (g/dl) (a) 4,87 10,5 36 73,9 21,5 29,1 (b) 4,84 10,0 31,5 65 20,7 31,7 Hb A2 2,2 % (a), 2,4 % (b) Hb F de 7,2 % (a), 13 % (b) IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Hb S con talasemia º39 RBC Hb (1012/l)( g/dl) 3.34 7.8 Hct (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) 24 80 26 32.0 Reticulocitos: 17.8 % Hb A2: 6%, Hb F: 14 %, Hb S: 80% IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BETA TALASEMIA Talasemia Mayor: Co-herencia de + 1-110 / º 39 RBC Hb (1012/l)( g/dl) MCV (fl) MCH (pg) RBC Propósito 3.29 6.7 21 63 20.4 32.4 Mamá 5.78 10.2 34 58 17.6 30.4 Papá 5.90 12.1 38 65 20.5 31.6 Reticulocitos: 12 % Hb A2: 2.9 %, Hb F: 46 % IMB Hct (%) DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ALFA TALASEMIA Clusters de y Globinas IMB Patrinos Hum Mut, 2005 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ALFA TALASEMIA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE th 5 - 10 % 20 - 30 % 80 % 80 % IMB α TALASEMIA Los alelos talasémicos (-/) (--/) (T/) de los progenitores portadores se combinan en sus diferentes posibilidades dando distintos genotipos IMB α TALASEMIA Los alelos talasémicos (-/) (--/) (T/) de los progenitores portadores se combinan en sus diferentes posibilidades dando distintos genotipos IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ALFA TALASEMIA Diagnóstico Molecular de Talasemias IMB Deleciones causantes de -talasemia - 70 kb 5’HVRHS-40 0 kb 10 kb 2 inter HVR 20 kb 1 1 30 kb 2 1 1 3’HVR 5’ 3’ -3.7 -4.2 -5.2 --MED --SEA --THI --BO 60 kpb 230 kpb --DUCH 35 kpb IMB 30 kpb Mutaciones puntuales causantes de -Talasemia - 70 kp 0 kp 5’HVRHS-40 10 kp 20 kp 2 inter HVR 1 1 2 2 30 kp 1 1 3’HVR 1) Mutaciones en el procesamiento del RNA Mutaciones en el sitio de splicing CAP Poly A signal Mutaciones en la señal de poliadenilación 1 31 32 99 100 141 5' 3' 2) Mutaciones en la traducción del RNA CAT ATA box box Mutaciones en el codon de iniciación Hph Nco T Saudí CS Mutaciones en el codon de terminación Mutaciones Frameshift Mutaciones sin sentido 3) Mutaciones que causan inestabilidad post-transcripcional IMB Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Hph I Hph I Hph I Hph I 1078 322 IMB 163 Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Hph I Hph I Hph I 1400 163 IMB Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Nco I 1094 IMB 894 Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 1998 IMB Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Mse I Mse I Mse I 1379 401 163 IMB Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Mse I Mse I Mse I 1379 401 163 IMB Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Mse I Mse I 1379 IMB 564 Amplificación del gen 2 y análisis con enzimas de restricción 2 1 ARNm Cap site C8 C3 Mse I Mse I Mse I 1379 401 163 IMB Patient Control Mse I Nco I Hph Mse I Nco I HphI φ x 174 RF. 1379 1353 564 603 461 163 Electroforesis en gel de acrilamida: los fragmentos obtenidos corresponden a un homocigota para una mutación en el codon de terminación del gen 2: Hb Cs-Sp (TAA CAA). IMB Gap- PCR: Deleción --Med - 70 kb 5’HVRHS-40 0 kb 10 kb 2 inter HVR 20 kb 1 1 2 30 kb 1 5’ 3’HVR 3’ --MED IMB 1 Deleción --Med 1 2 3 4 5 6 7 1- pUC Mix Marker 8 2– Control Positivo 1118 pb 861 pb 692 pb 561 pb 3- Propósito 4- Mamá 5- Papá 6- Hermano 7- Hermano IMB GAP-PCR: Deleción -20.5 - 70 kb 5’HVRHS-40 0 kb 10 k b 2 inter HVR 20 kb 1 1 2 5’ 1 1 3’HVR 3’ --20.5 IMB 30 kb Deleción -20.5 1 2 3 4 5 6 7 8 1- pGEM DNAMarkers 2- Control Positivo 1118 pb 692 pb 861 pb 615 pb 3- Propósito 4- Mamá 5- Papá 6- Hermano 1997 7- Hermano 1994 8- Control de contaminación IMB GAP-PCR: Deleción -3.7 2 1 5’ 3’ 3.7 kb IMB GAP-PCR: Deleción -3.7 2 1 5’ 3’ 3.7 kb IMB Deleción -3.7 1 2 3 4 5 6 7 8 N M N M N M 1-9- pGEM DNAMarker 2-3- Control Positivo 2.64 kb 1.60 kb 1.76 kb 4-5- Propósito 6-7- Mamá 10-11 Papá 1.76 kb 12-13 Hermano 1997 14-15 Hermano 1994 N M N M N M 9 10 11 12 13 14 15 16 IMB 8-16 control de contaminación Morfología eritrocitaria Propósito Mamá IMB Papá Datos Hematológicos Propósito Papá Mamá Hermano 1994 Hermano 1997 --/-3.7 /--20.5 /-3.7 /-3.7 / RBC x 1012/L 4.88 6.62 3.87 4.58 4.67 Hb g/dl 8.8 13.3 10.8 12.8 13.7 MCV fl/ MCH pg 57.7 / 18.0 65.8 / 20.0 81.1/ 28.0 79.2 / 28.0 86.6 / 29.3 CHCM g/dl / RW % 31.3 / 22.4 30.5 / 16 34.5 / 14.2 35.3 / 12.9 33.9 / 12.8 Reticulocitos % 1.0 0.6 2.0 1.9 0.8 Ferritina 72.4 141.4 4.1 44.2 32.6 Aniso+++, Micro++, Macro+, Hipo++, Elip+, Oval+, Esquis+, TC++ Aniso++, Micro++, Hipo++, Elip+, Ovalo, TC+ Aniso+, Hipo+ Aniso+, Hipo+, Micro+, Oval+ Aniso+ Genotipo Morfología +++: marcada; +: ocasional; -: negativo hip: hipocromía, aniso: anisocitosis, macro: macrocitos, micro: microcitos, oval: ovalocitos, elip: eliptocitos, esquis: esquistocitos, TC: target cells IMB Prevalencia de talasemia -3.7 en Argentina IMB Genotipo n Prevalencia (/) 303 97,74 % (-3.7/) 6 1,94 % (-3.7/-3.7) 1 0,32 % Noguera et al Hemoglobin, 2002 Valores hematológicos promedio de acuerdo al genotipo IMB Desarrollo de una tira ELISA para la detección de talasemias Detección de Hb de Bart en soluciones de Hb mediante mAb altamente específico . Sensibilidad (93.4%), especifidad (93,7). 167 sujetos con alfa talasemia 8 muestras positivas por Elisa no pudieron ser genotipificadas por PCR Published online 22 October 2009 Haematologica | 2010; 95(2) IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE TALASEMIAS Pruebas de Genética Molecular: Usos Clínicos •Diagnóstico Molecular para identificar: oMutaciones puntuales específicas causantes de la enfermedad en el gen que codifica la cadena beta de la hemoglobina oDeleciones de extensión variable del gen ß o del cluster, que resultan en ß-talasemia o en ß-talasemias complejas denominadas ß-talasemia y ß-talasemia. Nota: las Deleciones son raras causas de ß-talasemia. •Testeo de Portadores •Diagnóstico Prenatal •Pronóstico: predicción de la severidad clínica IMB DIAGNÓSTICO MOLECULAR TALASEMIAS El diagnóstico prenatal para identificar la anemia del Meditarráneo en el feto -DNA de vellosidad corial: 10-12 semanas de embarazo -Tener identificadas las mutaciones que afectan a ambos integrantes de la pareja -Este estudio permite conocer la situación genética del feto, pero, en este momento, no hay posibilidad de una intervención terapéutica para una posible afección fetal. IMB DIAGNÓSTICO PRENATAL DE BETA TALASEMIA Diagnóstico Pre-implantación Técnica pre-concepción Recolección de oocitos no fertilizados de la mujer portadora de β-thal. Durante las diferentes fases de maduración, el oocito expele el 1° y el 2° cuerpo polar. El analisis del DNA de uno de esos cuerpos polares, implicando que si la mutación talasémica está presente en el cuerpo polar, no está mas presente en el oocito, permite la selección del oocito sin la mutación talasémica y por lo tanto la fertilización in vitro para la implantación en el útero. IMB DIAGNÓSTICO PRENATAL DE BETA TALASEMIA Recientemente se han identificado mutaciones puntuales responsables de β-talasemia y anemia drepanocítica en células fetales obtenidas de sangre materna (19 células fetales en 16 ml de sangre materna) mediante separación de los mononucleares en un gradiente de densidad, enriquecimiento de las células fetales usando anticuerpo anti receptor de transferrina, identificación de las mismas por medio de anticuerpos anti Hb fetal, aislamiento de glóbulos rojos nucleados por microdisección bajo microscopía óptica y análisis por PCR (Cheung et al, 1996). La simplificación y la automatización parcial de este procedimiento permitirá la introducción del diagnóstico prenatal mediante análisis de células fetales en circulacuón materna en la práctica clínica. IMB DIAGNÓSTICO PRENATAL DE BETA TALASEMIA El mayor problema con la terapia génica ha estado relacionado con la construcción del vector. El gen terapéutico debe ser insertado en una célula hematopoyética y debe ser expresado a altos niveles, por un período de tiempo extendido, de forma eritroide específica; el vector debe ser seguro con respecto a recombinación o mutagénesis. Vectores lentivirales que portan un pequeño gen RNA nuclear que codifica un RNA antisense han demostrado que corrigen los defectos de splicing causados por las mutaciones talasémicas (forzando la selección de sitios de splice normal). IMB -Screening de Beta Th en 23.485 sujetos (2000-2006) -3.934 tenían HbA2 borderline (3,1 – 3,9%). -410 muestras (con fenotipo normal o de portador ) estudiadas por PCR por tener parejas portadoras de beta Th clásica. -De estos sujetos, 94 (22.9%) fueron positivos para un defecto molecular en el gen β, ó . El defecto molecular mas prevalente fue β IVS1 nt 6, co-herencia de mutaciones severas de β y talasemia, mutaciones en el promotor βy triplicación de genes alfa y algunas Hbs Variantes. -Ningún defecto molecular fue encontrado en los restantes 316 individuos. IMB Molecular Biology in heterozygous beta Thalassemia diagnosis XXXI World Congress of the International Society of Hematology 2007 March 20-24, 2007- Punta del Este - Uruguay -Mujer con: GR 4,9 x 1012/l, Hb 11,7 g/dl, Hto 37%, VCM. 73,7 fL, HCM 23,4 pg. Serie roja: microcitos hipocrómicos. Estudio de Hierro: normal. HbA2 3,8%; Hb F 1%. -La elevación de Hb A2 es la característica más importante en la identificación de Th heterocigotas. Sin embargo algunos portadores pueden tener Hb A2 normal o en el límite inferior del rango para un portador. -En 124 portadores de Th identificamos tres individuos con la mutación + I-6; Hb A2 5,5; 5,6 y 4,9 %. -Altay y col encontraron que el aumento de Hb A2 no se correlaciona con la severidad de la mutación responsable de talasemia; Stefanis L y col encontraron valores más bajos de Hb A2 en pacientes portadores de la mutación + 1-6. -PCR-ARMS + 1-6: positivo IMB Bragós et al., 2007 ¡¡¡MUCHAS GRACIAS!!! IMB
