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Departamento de Genética
Biología Celular y Molecular 2009
Organización y Flujo de la Información Genética
CONTENIDOS
Tema: Organización del material hereditario
Estructura y propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos. Compactación de los ácidos
nucleicos, niveles y correlación estructura-función. Genomas: tipos de secuencias, organización y
distribución.
Tema: Mantenimiento de la información hereditaria
Bioquímica y mecanismo de la replicación. Principios de reparación y estabilidad genética.
El mecanismo de la recombinación y la generación de diversidad.
Tema: Expresión de la información hereditaria
Concepto de gen, el mecanismo de la transcripción, comparación de los procesos de síntesis de
ácidos nucleicos, tipos de ARN, maduración y procesamiento en eucariotas. El mecanismo de la
traducción. El código genético, características.
Tema: Regulación de la expresión génica
Niveles de regulación en procariotas y eucariotas. Regulación de la iniciación transcripcional.
Operones bacterianos. Acoplamiento transcripción-traducción. Promotores y potenciadores
eucariotas. Relación cromatina-transcripción. Acoplamiento transcripción-procesamiento.
Procesamiento diferencial.
TURNOS
8:00-11:00
12:30-15:30
15:30-18:30
Lunes
TEORICOS
Martes
DISCUSIONES GRUPALES
Miercoles
Jueves
Viernes
Coordinación por Genética: José Tort / Mónica Cappetta
Consultas: bcelular@fmed.edu.uy
www.genetica.fmed.edu.uy / www.bcelular.fmed.edu.uy
Prohibida la comercialización de este material sin la autorización del Dpto. Genética de la Fac. Medicina (UDELAR).
1
ORGANIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LA INFORMACIÓN HEREDITARIA
DISCUSIÓN 1: Acidos Nucléicos (Semana 8)
1. Considerando el esquema que aparece a la derecha, indique si la molécula dibujada es ADN o
ARN y analice las siguientes afirmaciones e indique las correctas:
A. Individualice los nucleótidos de la molécula, y defina la
direccionalidad de ella.
B. En que parte de este ácido nucleico reside la información
genética?
C. Puede éste oligonucleótido formar parte de moléculas doblehebra? En que procesos fisiológicos? Esquematice la doblehebra posible.
D. Se representa una cadena de ARN
E. El nucleótido de Guanosina fue el primero agregado en esta
cadena.
F. Con (1) se señalan el extremo 5´ de la cadena y un enlace Nglicosídico.
G. El número (2) señala el carbono 3´ del azúcar.
H. Los numeros (3) y (4) señalan un enlace fosfodiester y un
enlace glicosídico respectivamente.
I. El número (4) señala un puente de hidrógeno.
J. La primera base de la cadena representada formará dos
puentes de hidrógeno con la base complementaria.
2.
1
A
C
3
4
G
2
Cuando se degrada a nivel de nucleótidos el material hereditario de 3 tipos de virus
distintos se obtienen los siguientes porcentajes de bases nitrogenadas:
Virus
1
2
3
A (%)
31
30
25
G (%)
19
25
24
C (%)
19
19
18
T (%)
--------33
U (%)
31
26
----
a) ¿Qué tipo de ácido nucleico constituyen el material hereditario de estos virus?
b) Proponga una hipótesis que explique estos resultados y describa un experimento que
realizaría para comprobarla.
3.
Los ADN de dos organismos distintos tienen idéntico porcentaje de GC.
a)
b)
c)
d)
e)
¿Indica este dato que ambos poseen ADN de doble hélice?
¿Significa que tienen la misma secuencia de bases nitrogenadas?
¿Indica que tienen la misma longitud?
¿Sugiere que poseen la misma velocidad de renaturalización?
¿Tendrían estos dos ADN la misma temperatura de fusión Tm?
2
4.
Dos especies eucariotas diploides diferentes tienen igual cantidad de ADN, 2 x 108 pares
de bases:
a) La especie A tiene un mayor contenido en guanina que la especie B.
b) La especie A posee un 20% de secuencias altamente repetidas y la especie B un 40%.
c) La especie A presenta las secuencias altamente repetidas localizadas en las regiones
próximas a los centrómeros de los cromosomas, mientras que las secuencias altamente
repetidas de la especie B se encuentran en regiones teloméricas.
Indique tres experimentos, al menos uno para cada una de las diferencias indicadas entre las
especies A y B, que pongan de manifiesto las características mencionadas.
3
DISCUSIÓN 2: Genoma (Semana 8)
1. El mapa de restricción que aparece debajo muestra los sitios de la enzima de restricción
MstII en una porción del alelo de globinas BA, mientras que el alelo BS no tiene el sitio de
restricción interno. Se obtuvo ADN genómico de varios individuos, se corto con la enzima
MstII, se separó por electroforesis, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, y se
hibridizó con el fragmento de 1.2 Kb generado
1.2 Kb
por MstII marcado (sonda).
0.2 Kb
Cual de estos individuos es portador del alelo BS?
M
M
M
Por que no es detectada la banda electroforética
correspondiente al fragmento de 200 pb?
1
2
3
M
4
1.4 Kb
1.2 Kb
0.2 Kb
2.
Se extrae el ADN de todos los miembros de una familia en la que algunos individuos están
afectados por una enfermedad rara autosómica dominante. Se corta el ADN de todos ellos
con una endonucleasa de restricción, se separan los fragmentos por tamaños, se transfieren
a una membrana y se hibrida con una sonda radiactiva de VNTR. Los resultados obtenidos
aparecen en el esquema siguiente.
a) A partir de estos resultados indique
el número de loci que están
segregando en esta familia. Indique
el número de alelos de cada locus.
b) ¿Se comporta alguno de los loci de
VNTR
como
ligado
a
la
enfermedad?
c) Existe algún individuo homocigoto
para alguno de los loci?
3.
Un forense extrae el ADN de la sangre de una víctima (V) de violación, del semen extraído
de su cuerpo (S) y de muestras tomadas de 4 sospechosos (S1, S2, S3 y S4). Decide llevar a
cabo un estudio de minisatélites (VNTRs) estudiando un locus muy polimórfico (D1S80)
situado en el cromosoma 1. Una vez realizada la electroforesis de D1S80 se obtienen los
siguientes resultados:
Explique los patrones obtenidos.
V S S1 S2 S3 S4
a) ¿Por qué es de esperar que la mayoría de los
individuos sean heterocigotos para los minisatélites?
b) ¿Existe algún sospechoso que parezca culpable?
4
DISCUSIÓN 3: Compactación de la Cromatina (Semana 8)
1. En la siguiente figura analice los distintos niveles de compactación del ADN
considerando en cada caso el tamaño de la unidad de compactación, el estado funcional,
el grado de expresión génica, y la etapa del ciclo celular en que se espera encontrar.
2. La desoxirribonucleasa pancrática I (Dnasa I) es una
nucleasa que produce mellas de una sola hebra en el DNA
de doble hebra. El tratamiento de partículas core
nucleosómicas con Dnasa I produce un resultado peculiar.
Cuando el DNA obtenido en esta digestión se estudia
mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes, se
observa que los fragmentos de una sola hebra se producen
con una periodicidad regular de unas 10 bases. Sugiera una
explicación de este resultado en función de la estructura del
nucleosoma.
3. Las histonas tienen una alta proporción de aminoácidos básicos. Qué ventajas puede
ofrecer esta característica de acuerdo a la función que estas proteínas cumplen. ¿Por qué
otras moléculas de unión al ADN pueden no presentar esta característica?
4. Discuta las funciones de los telómeros a nivel del mantenimiento del cariotipo normal.
5. Suponga que quiere expresar un gen de resistencia a un herbicida en una planta de interés
comercial. Para esto utiliza una técnica que introduce el gen de interés de manera azarosa
en el genoma de la planta. Analizando dos plantas resultantes de dicho procedimiento
usted comprueba que ambas insertaron el gen de resistencia en el genoma. Sin embargo
solo una de ellas es capaz de resistir el herbicida. Proponga una explicación para este
fenómeno.
5
DISCUSIÓN 4: Mitosis, Meiosis y Cariotipo (Semana 9)
1. Si “c” es la cantidad de ADN contenida en un gameto, ¿cuál será la cantidad de ADN (c,
2c, 4c, etc.), cromosomas y cromátidas en los siguientes períodos del ciclo celular en la
especie humana? Marque con H ó D si la célula es haploide o diploide.
valor “c”
Nº cromosomas Nº cromátidas
H/D
G1 premitótica
G2 premitótica
Profase mitótica0
Metafase mitótica
Telofase mitótica (en c/núcleo)
Espermatozoide
Profase meiótica I leptoteno
Anafase meiótica I
Metafase meiótica II
Telofase meiótica II
Interfase pre-meiótica (antes S)
Interfase pre-meiótica (después S)
2. Realice un esquema de las siguientes etapas de la mitosis y meiosis de una célula 2n=4
con un par de cromosomas metacéntricos y un par de acrocéntricos.
a. metafase mitótica
b. metafase de meiosis I
c. metafase de meiosis II
d. anafase de mitosis
e. anafase de meiosis I
f. anafase de meiosis II
3. Sobre la meiosis, señala la/s opción/es correcta/s:
a) Durante la meiosis de la especie humana se observan 46 tétradas o bivalentes.
b) El intercambio (recombinación) sucede en la profase II.
c) La recombinación ocurre entre cromátidas homólogas.
d) Los quiasmas mantienen unidos a los cromosomas homólogos durante la metafase I.
e) Las células resultantes de la meiosis son haploides.
6
4. Represente en forma esquemática cromosomas metacéntricos, acrocéntricos y
submetacéntricos:
a) Señale las siguientes estructuras: cromátida, centrómero, telómero, brazo corto, brazo largo,
constricción secundaria, satélite.
b) Describa las características de los cromosomas que integran cada grupo (A al G) del cariotipo
humano
5. En un laboratorio de citogenética se están estudiando dos pacientes, se muestra un
ejemplo de un cariotipo de cada uno de estos pacientes.
a. Escriba la fórmula cromosómica de cada paciente.
b. ¿Qué información se ha obtenido mediante este estudio?
7
MANTENIMIENTO DE LA INFORMACIÓN HEREDITARIA
DISCUSIÓN 5: Replicación del ADN (Semana 9)
1. Analice el siguiente esquema de una burbuja de replicación e indique las opciones
correctas:
A. El
origen
de
replicación
está
4
representado por el número 1.
B. La cadena retrasada está representada
5
por el número 2.
C. La cadena retrasada está representada
por el número 3.
D. El extremo 5’ está representado por el
número 4.
E. El extremo 5’ está representado por el número 5.
2
3
1
1
1
3
2
5
4
2. Durante el desarrollo de los erizos de mar, luego de la fecundación las células se dividen cada
30 o 40 minutos. En el adulto lo hacen cada 10 o 15 horas. La cantidad de ADN no varía,
pero claramente el ADN es replicado más rápidamente en el embrión temprano. Como se
explica este fenómeno? Fundamente su respuesta.
3. La alta mutabilidad del virus HIV es uno de los principales
problemas en el tratamiento del Sida. HIV es un retrovirus, y su ciclo
depende de una transcriptasa reversa responsable de la generación de
copias de ADN del genoma viral que se integrará al genoma del
huésped. La alta mutabilidad del virus se relaciona con una fidelidad
un orden de magnitud menor de la enzima viral con respecto a otras
polimerasas del huésped. A qué se puede deberse esta diferencia?
La primera droga utilizada con éxito en el control del Sida fue el
AZT. El AZT es un análogo de la deoxitimidina cuyo nombre formal
es 3´- azido-2´3´-dideoxitimidina (ver figura). Sugiera un mecanismo
de acción del AZT. Se ha verificado que la transcriptasa reversa tiene
mayor afinidad por el AZT que por el TTP, a la inversa de lo que
ocurre con las DNA polimerasas eucariotas. Cuáles son los efectos
de esta observación?
4. La bacteria Thermus aquaticus fue aislada de las surgentes de aguas termales en el parque de
Yellowstone. La ADN polimerasa de esta bacteria es capaz de sobrevivir a altas
temperaturas, tiene su óptimo de actividad de síntesis a 72ºC, y resiste temperaturas de hasta
100ºC. Puesto que es termoestable, resiste varios ciclos de aumento y descenso de la
temperatura sin afectar su función. Es posible utilizar esta enzima para la síntesis de ADN in
vitro? Si su respuesta es si, que otros elementos debe incluir en la reacción? Cual es la
posible aplicación de esta enzima?
5. La infección con papilomavirus es bastante frecuente en mujeres. Existen distintas variedades
del virus que pueden ser reconocibles a nivel molecular. Se extrae ADN a partir de muestras
cervicales (cervix uterino) y se amplifican con juegos de cebadores específicos de HPV. Se
8
analizan las muestras por hibridación con sondas específicas (secuencias particulares) para
dos variantes del virus (HPV16 y HPV18). Por que tenemos amplificación? Indicar cuáles de
las pacientes 1 al 7 están infectadas y por que variante viral.
6. La producción de una oveja clonada (Dolly) por tecnología de transferencia nuclear fue uno
de los mayores acontecimientos de la era biotecnológica. Dolly fue producida mediante la
transferencia de un núcleo derivado de una célula mamaria de una oveja adulta, a un oocito
enucleado. Una de las cuestiones que se plantearon fue la posibilidad de que Dolly pudiese
desarrollar “envejecimiento precoz”, ya que se desarrolló a partir de un núcleo de una oveja
de 6 años. Manejando la hipótesis de que el tamaño de los telómeros está relacionado con el
proceso de envejecimiento celular, Shiels y colaboradores midieron el tamaño medio de
fragmentos teloméricos terminales de Dolly, y otras ovejas clonadas a partir de fibroblastos
embrionarios y fetales. Se obtuvo ADN genómico de tejidos de ovejas de diferentes edades,
se cortó con una enzima de restricción, se realizó un Southern blot utilizando como sonda
secuencias específicas de telómeros.
El tamaño medio de los fragmentos de
restricción terminales (TRF o terminal
restriction fragment) se grafica en la figura.
En dicha gráfica los círculos negros
representan las ovejas control de diferentes
edades. Los TRFs promedios a la edad de 1
año fueron determinados para Dolly (6LL3),
para una oveja clonada a partir de células de
embrión de 9 días (6LL7), y para una oveja
clonada a partir de fibroblastos de fetos de
25 días (6LL6).
A. ¿Existe alguna correlación entre el tamaño medio de los TRF y la edad?
B. ¿Cómo es el tamaño medio de los TRF de una oveja clonada comparada con los controles
de la misma edad?
C. Basándose en estos datos, como minimizaría los efectos del acortamiento telomérico en
los animales clonados por transferencia nuclear?
D. Podrían existir otras alternativas para evitar el acortamiento telomérico?, si es así, a que
complicaciones se vería expuesto?
9
DISCUSIÓN 6: Generación de variabilidad genética (Semana 10)
1. En la siguiente genealogía el sombreado en la parte superior indica que el individuo muestra
fenotipo a. El sombreado en la parte inferior indica que muestra fenotipo b. El sombreado
total indica los fenotipos a y b. La falta de sombreado indica fenotipos A y B (en la parte
superior e inferior, respectivamente). En esta genealogía se muestra la transmisión de dos
caracteres recesivos ligados al cromosoma X. Indique cual o cuales de los individuos de la
generación III presentan fenotipos determinados por genotipos producidos por recombinación
de los loci A y B
2. Se realiza un estudio genético de diagnóstico prenatal para una enfermedad autosómica
recesiva en una familia que tuvo un hijo anterior afectado. Existe un polimorfismo con alelos
de 7, 9 y 12 Kb que está ligado cercanamente a la enfermedad. La hibridación de ADN por
Southern blot a partir del ADN de los miembros de la familia aparece indicada al lado de la
genealogía. En función de estos antecedentes:
1. Indique el genotipo presuntivo del padre para el marcador ligado
2. Cual es la fase en la madre y en el padre?
3. Cuales de los hijos son portadores de la enfermedad y cuáles son normales?
4. Cual es el diagnóstico para el embarazo en curso? En que basa su diagnóstico?
I2
I
1
-------
2
2
3
4
II3
II4
-------
------- =====
?
II
1
II1
5
-------
II5
------- 12 kb
-------
------- 9kb
-------
7kb
3. Los genes a cargo de la visión normal y producción de la enzima glucosa 6- fosfato
dehidrogenasa (G6PD) son dominantes sobre sus alelos dt para deuteranopia (ceguera para
los colores rojo y verde) y gd para la deficiencia de G6PD. Los loci están ubicados en el
cromosoma X con un 6 % de recombinantes máximo entre ambos marcadores. Una pareja
normal respecto a ambas características fenotípicas tiene 4 hijos: dos niñas normales, un
varón con deficiencia de G6PD y visión normal, y otro niño con deuteranopia aunque es
normal para la producción de la enzima.
En función de estos datos:
1 Dibujar la genealogía de esta familia.
2 Indicar los genotipos posibles de los padres y de los hijos
3 Si tienen otro hijo varón, cual es la probabilidad de que tenga deuteronopia?
4 Cual es la probabilidad de que tenga ambas afecciones?
5 Cual es la probabilidad si el siguiente hijo es mujer?
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6 Cuales serían las respuestas a las preguntas 1-5 si los genotipos de los padres se
invierten?
4. La enfermedad de Huntington (HD) es una enfermedad autosómica dominante de inicio
tardío causada por la expansión de tripletes repetidos. La afección comienza a ser notoria en
personas adultas, con pérdida progresiva de la función motora, especialmente movimientos
involuntarios de la cabeza y deterioro de la función intelectual. Previamente a la elucidación
del mecanismo molecular subyacente en HD, se buscaron marcadores genéticos asociados a
la enfermedad, y en 1983 se demostró por primera vez ligamiento de un marcador genético
polimórfico a HD en una familia numerosa venezolana.
El equipo de médicos en la comunidad extrajo ADN de varios miembros de esta familia y se
digirió el ADN con la enzima de restricción Hind III. Luego de la separación electroforética
de los fragmentos generados, se hibridó el ADN con una sonda que se denominó G8, la que
se unía a una región única del cromosoma 4. Se observaron 4 patrones de hibridación
diferentes de acuerdo a lo que se indica en la figura B. En función de estas observaciones:
1. Indique los genotipos probables para los miembros de la genealogía no estudiados.
2. Cual de los cuatro haplotipos encontrados está ligado a HD?
3. En que cromosoma considera Ud que se localiza el locus principal para HD?
4. Que genotipos indicarían la presencia de un evento de recombinación entre HD y el
marcador?
5. Explique los fenotipos de los individuos V-22 y VI-5.
11
5. En el modelo mas aceptado de recombinación homóloga en bacterias, se da la iniciación a
partir de una rotura de doble cadena de una de las moléculas de ADN involucradas. Como
parte del proceso de recombinación se generan dos estructuras de Holiday adyacentes que
deben ser resueltas por el clivaje mediado por la proteína RuvC. Para cada estructura de
Holiday es posible el clivaje en dos sitios (1) cortando las hebras que no participan del
intercambio, y (2) cortando las hebras que se intercambiaron. Analizando el esquema
siguiente, y tomando en cuenta los loci indicados (A, B y C, con sus alelos A,a, B, b y C, c)
indique en que condiciones de resolución de las estructuras de Holiday se producen
recombinantes
(I)
(II)
B
A
b
a
C
c
Corte en I
Corte en II
a.
1
1
b.
1
2
c.
2
1
d.
2
2
Resultado
12
EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
DISCUSIÓN 7: Transcripción y Procesamiento del ARN (Semana 10)
1. El siguiente es un esquema simplificado de la transcripción de un gen eucariota. La flecha
indica la dirección de avance de la ARN polimerasa. Indique las opciones correctas:
A. La letra a indica los deoxirribonucleótidos a ser
incorporados
B. La letra b indica el promotor del gen.
C. La letra c indica el sitio con actividad exonucleasa
3´-5´de la polimerasa.
D. La letra d representa el lugar donde se colocará la
caperuza al ARN mensajero.
E. Las letras e y f representan los extremos 5´ y 3´
respectivamente de la hebra molde de ADN
c
a
e
d
f
b
2. El siguiente es un fragmento de la región que se encuentra alrededor del sitio de inicio de la
transcripción de un gen procariótico. Escriba la secuencia de ARN del transcripto.
5´CTCCCTATAATGCGCCTCCATCGTCGATCTTAGTC 3´
3´GAGGGATATTACGCGGAGGTAGCAGCTAGAATCAG 5´
3. La siguiente secuencia de ADN doble cadena pertenece al gen que codifica el factor de
transcripción de tipo “dedos de Zinc” SP1. La mayoría de la secuencia promotora (la
secuencia “río arriba” se numera negativamente) y parte del primer exon (la transcripción
comienza en el +1) se muestran a continuación:
A. Escriba las primeras 10 bases del transcripto primario del gen SP1.
B. En que se diferenciaría el extremo 5´ de este transcripto con el del ARNm maduro?
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C. Considerando que la secuencia consenso de unión del factor de transcripción SP1 es
CCCGCCC, ¿podría el factor de transcripción SP1 regular su propia transcripción?
(Pista: las secuencias subrayadas en negro indican regiones del gen que están
“protegidas”, o cubiertas por proteínas, cuando se adicionan proteínas nucleares a
éste ADN).
4. Las endonucleasas de restricción son enzimas (en gral. de origen bacteriano) que cortan el
ADN en las zonas en que se encuentran determinadas secuencias cortas (por ej. GAATTC),
llamadas “dianas” o “sitios”. Los investigadores sabían que dos endonucleasas (EcoR I y
Hind III) no cortaban ningún ADNc (es decir el ADN obtenido por retrotranscripción del
ARNm) del gen de la ovoalbúmina de Gallina. Sin embargo, al someter al ADN genómico
(que naturalmente contiene entero el gen de la ovoalbúmina) de Gallina a estas enzimas, el
gen en cuestión es cortado en varios fragmentos. Serían explicaciones posibles de este
fenómeno, las siguientes:
A. El ARNm del gen de la ovoalbúmina sufre un procesamiento diferencial.
B. Porque el ADN genómico es sintetizado por la ADN polimerasa y el ADNc por la
retrotranscriptasa.
C. Las dianas de las enzimas de restricción se encuentran en los intrones del gen.
D. Porque los nucleosomas que enrollan el gen la ovoalbúmina están muy acetilados.
E. El ARNm del gen de la ovoalbúmina sufre un proceso de edición (o “editing”) que
elimina las secuencias diana.
5. Se sospecha que el gen HEP está asociado a una patología hepática (figA). Se extrae ARN
mensajeros de distintos tejidos de un paciente afectado Se separan en un gel de electroforesis
y se analizan mediante Northern blot (hibridación de ARN con sondas de ADN marcadas)
utilizando dos sondas. En un experimento se usa como sonda una secuencia correspondiente
al tercer exón del gen y en otro experimento una sonda correspondiente al exón 4. El patrón
obtenido es el siguiente (figB):
A Estructura del gen HEP
E1
E2
E3
E4
E5
E6
B Patrón de hibridación por Northern blot.
EXPERIMENTO 1
EXPERIMENTO 2
SONDA EXON 3
piel
SONDA EXON 4
músculo hígado sangre
piel
músculo hígado sangre
850 pb
850 pb
650 pb
650 pb
Indique cuales de las siguientes afirmaciones son correctas
A. El exón 3 mide 650 pares de base
B. El exón 4 mide 850 pares de base
C. La patología puede estar asociada a la ausencia del exón 3 en hígado.
D. El gen HEP sufre splicing alternativo
E. El gen se expresa en todos los tejidos analizados.
14
6.
De entre los genes de los eucariotas, los correspondientes a las histonas tienen la
peculiaridad de que no poseen intrones, y los mRNA de las histonas no tienen colas poli
(A) y presentan una vida media de menos de 30 minutos, cuando los ARNm humanos en
general tienen una vida media de 10 hrs. Además, en casi todos los eucariotas, los genes de
las histonas están dispuestos en múltiples dominios en tándem, de manera que cada
dominio lleva una copia de cada uno de los cinco genes de las histonas. ¿Cuales serán las
ventajas de estas características a la hora de sintetizar esta proteína?
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DISCUSIÓN 8: Código Genético y Traducción (Semana 10/11)
1. El gen de la alfa-tropomiosina contiene varios exones y señales de poliadenilación (indicadas
por una A. Como resultado del procesamiento alternativo de intrones y señales de
poliadenilación, el transcripto primario puede procesarse en varios ARNm, de los cuales se
representan a continuación tres, que son expresados específicamente en músculo estriado,
músculo liso y cerebro.
Transcripto primario
Músculo estriado
Músculo liso
Cerebro
En base a estos datos, considera a la alfa tropomiosina como una unidad transcripcional
simple o compleja? Cual es la ventaja de tener un gen que puede ser procesado de maneras
diferentes?
Una mutación en el gen de la alfa-tropomiosina resulta en la perdida de de tropomiosina
funcional en los tres tejidos analizados. Donde podría ubicar esta mutación. Una mutación
diferente produce la pérdida de función sólo en músculo liso. Donde ubicaría usted esta
mutación?
2. Suponga que en otro planeta de nuestra galaxia se han encontrado proteínas que contienen
125 aminoácidos diferentes; ácidos nucleicos con cinco bases nitrogenadas distintas, un
código genético que al igual que el nuestro está organizado en tripletes:
a) ¿Son suficientes 5 nucleótidos distintos para codificar 125 aminoácidos diferentes?
b) ¿El código genético sería degenerado? ¿Qué consecuencias tendrían las mutaciones
puntuales (cambio de base en el ADN)?
c) ¿Cree usted que la iniciación y la terminación de la traducción podrían ser semejantes
al de nuestro planeta?
3. Se esquematiza un ARNm maduro eucariótico. mG5´ representa el cap, y (AA)200 la cola
de poliA. Considere cuales de las siguientes afirmaciones son correctas si se traduce este
ARNm.
mG5´-CUCUCAGGCAUGACCUCGCCUAGGUCGAGUAGGUGACACGUACUGAG(AA)200
A. El polipéptido codificado tiene 12
aminoácidos.
B. El último aminoácido del polipéptido es
Glu.
C. El tercer aminoácido es Ser.
D. El anticodón del ARNt para el segundo
aminoácido podría ser GGU.
E. El anticodón del ARNt para el penúltimo
aminoácido podría ser ACU.
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4. La genealogía que se muestra corresponde a una familia afectada de una Miocardiopatía
Dilatada. Se evidencia un claro patrón
de herencia autosómica dominante.
Buscando la causa de esta enfermedad,
se analizó el gen de la beta-Miosina,
una proteína fundamental en la
arquitectura del sarcómero (aparato
contráctil del músculo cardíaco). En el
esquema inferior se ve la región del
cromosoma 14 donde se encuentra el
gen de la beta-miosina.
Intron 15
ACAATCTAGÆACAATGTAG
Exon 16
Exon 20
ATGTCCATCÆATGCCCATC ATCTCAATCÆATCTAAATC
Ser532Pro
Ser635Stop
Exon 29
ATGGCACCTÆATGGCGCCT
Ala745Ala
Se indican cuatro mutaciones encontradas en miembros de esta familia. Tres de éstas son
comunes a todos los individuos afectados. La mutación en el exón 20 es exclusiva del individuo
IV-10. ¿Cuáles de estas mutaciones pueden estar asociadas a la patología? ¿Por qué?
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REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
DISCUSIÓN 9: Regulación en Procariotas (Semana 11)
1. La siguiente figura se tomó de un catálogo de un sistema
recombinantes en Escherichia coli.
de expresión de proteínas
A. ¿Cuál sería la función de los
elementos
que
aparecen
marcados en el esquema?
Gene
B. Cuando
algunas
proteínas
eucariotas son expresadas en
este sistema se obtienen
proteínas con la secuencia
correcta de aminoácidos, pero
que no tienen actividad
biológica. ¿A que puede
deberse esto?
2. Qué efecto tienen las siguientes mutaciones en el operón lac:
A.
B.
C.
D.
una mutación cambio de sentido en el represor que impide su unión a la alolactosa.
una mutación cambio de sentido en el represor que impide su unión al operador.
una mutación en el operador que elimina su función.
una mutación sin sentido en el gen lac Z.
3. El mapa del operón lac es: I POZY
La región promotora (P) es el sitio donde se inicia la transcripción mediante la unión de la
ARN polimerasa. Los promotores alterados (P-) impiden la unión de la ARN polimerasa.
Complete la siguiente tabla insertando un signo “+” donde se produzca enzima y un signo “–
“en caso de que no se sintetice la enzima.
Beta-galactosidasa
Genotipo
Ej: I+P+O+Z+Y+/I+P+O+Z+Y+
P
P
Sin lactosa
Con lactosa
Sin lactosa
Con lactosa
-
+
-
+
a) I- P+ OC Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
P
P
b) I+ P- OC Z- Y+/I- P+ OC Z+ YP
P
c) IS P+ O+ Z+ Y-/I+ P+ O+ Z- Y+
P
P
d) IS P+ O+ Z+Y+/I- P+ O+ Z- Y+
P
P
f) I- P- O+ Z+ Y+/I- P+ OC Z+ YP
Permeasa
P
18
DISCUSIÓN 10: Regulación en Eucariotas (Semana 11)
1. Cuál es la diferencia entre “promotor” y “potenciador”?
2. Cuál es la diferencia entre “factores generales” y “factores específicos” de la transcripción?
3. En la figura se detalla un experimento de los efectos de mutaciones puntuales en distintas
regiones del promotor, en los niveles de expresión del gen para la β-globina.
CGTAGAGCCACACCCTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGGCATATAAGGTAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACA
¿Cuáles son los efectos y por qué?
4. La enzima acetil-coA carboxilasa (AcAC) cataliza el paso limitante de la síntesis de ácidos
grasos de cadena larga. Los niveles de enzima dependen de la regulación del inicio de la
transcripción del gen AcAC. Por splicing alternativo se generan varios mensajeros diferentes.
Por otra parte el gen cuenta con dos promotores diferentes PI regulable y PII constitutivo. La
hormona Y aumenta la transcripción a partir de PI. El cuadro A representa el dominio de
regulación alostérica. El asterisco representa un sitio de fosforilación que se activa cuando
está presente la hormona Y, y aumenta la actividad de la proteína.
A. Discuta que transcriptos se encontrarán en los diferentes tejidos, en presencia o en
ausencia de la hormona Y.
B. La actividad de esta enzima está regulada alostéricamente y por modificaciones
covalentes de la proteína. Discuta la actividad enzimática que se encontrará en los
diferentes tejidos, en presencia o en ausencia de la hormona Y.
19
5. Se extrajo ARN de moscas Drosophila en varias etapas del desarrollo y en varios tejidos
adultos: sistema nervioso (CH5), tubo digestivo (gut), glándulas salivares y céulas de
Schneider) fue separado en un gel de electroforesis, transferido a una membrana e
hibridizado con una sonda de ADNc del gen de la mucina de Drosophila. Iguales cantidades
de ARN-poliA+ fueron sembradas en cada pocillo del gel. Las células de Schneider en
cultivo responden al tratamiento con la hormona RZR alterando su patrón de expresión
génica. Se estudió el ADNc de células tratadas (50 mg/ml RZR) o sin tratar (0 mg/ml RZR).
¿Cuál o cuales de las siguientes afirmaciones se justifica basándose en el Northern blot que
se observa a continuación?
A.
B.
C.
D.
El transcripto de mucina es más abundante en las glándulas salivares del adulto.
El transcripto de mucina sufre splicing alternativo.
La expresión de mucina se incrementa con el tratamiento con RZR.
El transcripto de 1.5 kb es el más abundante en todos los tejidos en que se expresa este
gen.
E. El transcripto de 1 kb es específico del tubo digestivo (gut).
6. El genoma del virus HIV pese a tener varias regiones codificantes (indicadas con rectángulos
en la parte A del esquema), da lugar a un único transcripto primario de 9 kilobases. Por
splicing alternativo se generan otros dos ARNm de 4kb y 2 Kb. El transcripto de 2 Kb da
lugar a la proteina Rev que es imprescindible para el transporte al citoplasma de los ARNm
de 9Kb y 4 Kb. Teniendo en cuenta el esquema, indique cuáles de las siguientes
afirmaciones considera correctas:
A.
La proteína Gag sólo puede ser traducida a partir del mensajero de 9 kb.
B.
La proteína Rev es una proteína de unión al ARN.
C.
La proteína de cubierta Env puede sintetizarse a partir del ARNm de 4 Kb.
D.
La región codificante para la proteína Vpu es escindida como intrón en el ARNm de 2
Kb.
E.
Es necesaria la existencia de ARNm de 2Kb funcionales para poder traducir la
proteína Pol a partir del ARNm de 9 Kb.
20
A
B
7. ¿Que papel juega la acetilación/deacetilación de histonas en la regulación de la actividad
transcripcional de los genes eucariotas?
21
Biología Celular y Molecular
Ciclo Básico Clínico Comunitario
Práctico Genética 2009
Práctico: Análisis citogenético-molecular de una patología
OBJETIVOS GENERALES
La actividad práctica, en paralelo a los teóricos y discusiones grupales, pretende conseguir los siguientes
objetivos:
1- Familiarizar al alumno de las técnicas y metodologías utilizadas habitualmente en experimentación
en el área de genética.
2- Mostrar aplicaciones directas para la medicina del estudio genético en patologías clínicas, tanto en la
elucidación de sus bases moleculares así como métodos diagnósticos y de seguimiento de
tratamientos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Familiarizar al estudiante con el cariotipo humano y metodología de análisis.
Evidenciar posibles alteraciones estructurales y/o numéricas en cromosomas humanos y comprender su
asociación con la patología estudiada.
Evidenciar la presencia de una alteración cromosómica mediante técnicas de biología molecular.
Comprensión de las bases moleculares de la patología en estudio mediante la interpretación de los datos
obtenidos por análisis genéticos.
METODOLOGÍA
Los objetivos planteados se alcanzarán por medio de:
-
Discusión de una historia clínica real de un paciente.
-
Discusión de experimentos realizados para elucidar las bases moleculares de la patología e
interpretación de los resultados.
-
Búsqueda bibliográfica (y/o información en internet) sobre la patología en estudio.
-
Visualización al microscopio (y en fotografías digitales) de cromosomas humanos en metafase
tanto de pacientes afectados de la patología como individuos sanos.
-
Realización de una corrida electroforética en gel de agarosa del producto de amplificación de
PCR específica para la región genómica alterada en la patología.
-
Observación e interpretación de los resultados de la electroforesis.
Actividades
1- Discusión al respecto de las posibles alteraciones genéticas responsables de la patología y
metodologías para comprobar dichas hipótesis.
2- Discusión de cómo estas alteraciones genéticas repercuten a nivel fenotípico causando la
enfermedad.
22
3- Observación de metafases de cromosomas de pacientes afectados e individuos sanos en
microscopio y/o fotografías digitales. Caracterización del cariotipo normal y de cariotipos con
alteraciones estructurales y/o numéricas.
4- Discusión para definir un protocolo de PCR para identificar dichas alteraciones cromosómicas a nivel
molecular.
5- Realización de una corrida electroforética con estos productos de PCR y observación de un gel
previamente teñido.
6- Discusión al respecto de aplicaciones de la técnica de PCR y estudios citogenéticas en el diagnóstico
y evaluación del tratamiento en esta y otras patologías.
7- Discusión final grupal tendiente a asegurar el cumplimiento de los objetivos.
Información para la discusión en subgrupos
Observación de cromosomas humanos
La extracción y cultivo de células somáticas humanas (generalmente linfocitos de sangre periférica)
ofrece la oportunidad de observar células mitóticas y distinguir los 23 pares de cromosmas (2n=46). En la
mitosis cada cromosoma se ha duplicado formándose 2 cromátidas que quedan unidas por el centrómero
hasta la anafase (cromátidas hermanas). La cantidad, el tamaño y las formas de los cromosomas en
metafase constituyen el cariotipo, que es distintivo de cada especie. En la mayoría de los organismos,
todas las células tienen el mismo cariotipo, excepto en situaciones especiales que existe una patología o
mosaicismo de alteraciones cromosómicas.
En general, los cromosomas se clasifican según su tamaño en: grandes, medianos y pequeños; y según
la posición del centrómero en: metacéntricos (centrómero en el medio del largo del cromosoma de
manera que ambos brazos son de igual tamaño), submetacéntrico,
acrocéntricos y telocéntricos (Fig. 1).
Figura 1. Clasificación de los cromosomas por posición del centrómero.
El cariotipo humano normal consta de 46 cromosomas, 44 autosomas y
2 cromosomas sexuales, XX en las mujeres y XY en varones, que se
agrupan en 7 grupos según el tamaño y la disposición del centrómero: AG (fig. 2). La distinción precisa de cada cromosoma se realiza en base a
la morfología (constricciones, satélites) y a la observación de un patrón
único de bandas que aparecen cuando a los cromosomas se les realiza
un tratamiento desnaturalizante o enzimático con posterior tinción (fig.
3).
A fines de los años 50 se establecieron el número cromosómico humano y la base citogenética del
Síndrome de Down. A partir de este momento la Citogenética se transforma en una herramienta
fundamental de la Genética Humana y Médica. Posteriormente se incorporan técnicas que permiten un
mayor nivel de resolución: técnicas de bandeo en los años 70 y de hibridación in situ con fluorescencia
en los años 80.
Figura 2. Cariotipo
humano. Clasificación
de cromosomas en
grupos.
23
La mayor aplicación en medicina de la determinación del
cariotipo es servir de comparación para la identificación de
patologías que lo afecten. La representación del mismo se hace
habitualmente a partir del cariograma o idiograma (fig.3):
construido a partir de una microfotografía de una metafase donde
se puedan individualizar todos los cromosomas teñidos.
Para su elaboración se deben obtener muestras de células
nucleadas (leucocitos de sangre periférica, células obtenidas por
punción de amniocentesis, o Vellosidades coriales) y se cultivan
en medio adecuado. Se utilizan inhibidores del huso mitótico,
como la Colchicina, para aumentar el número de células
“detenidas” en metafase. Se añade una solución hipotónica para
producir una lisis osmótica de las células y separado de los
cromosomas. Estos se fijan y son teñidos, ya sea con Giemsa
(técnica standard) o distintas técnicas de bandeo. Se visualizan
al microscopio con el objetivo 100x.
Figura 3. Idiograma de cromosomas de
individuo masculino normal con bandeo C.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Esta técnica consiste en la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN, imitando el proceso
de replicación del ADN celular. Se basa en el uso de oligonucleótidos (primers o cebadores) que son
complementarios a las secuencias que delimitan el fragmento que se quiere amplificar. Es una técnica
con alta sensibilidad y especificidad que permite a partir de unas pocas moléculas de un ADN molde,
amplificar millones de veces un fragmento de interés para que pueda ser visualizado.
Utiliza una ADN polimerasa (generalmente Taq pol.), una mezcla de deoxiribonucleotidos-trifosfato
(dNTPs), un par de cebadores específicos y un buffer que brinda las condiciones iónicas apropiadas para
la polimerización.
La reacción se lleva a cabo en un equipo (termociclador) que trabaja por ciclos de temperatura:
desnaturalización (por ej. 95º), luego de hibridización de los cebadores y por último la temperatura de
polimerización a la cual actúa la enzima. Estos pasos se repiten unas 30 veces, aumentando
exponencialmente el número de copias de la secuencia blanco.
Los fragmentos amplificados podrán ser evidenciados de varias formas siendo la más usada la
visualización directa en geles de agarosa mediante tinción con bromuro de etidio reconociendo una
banda que corresponde al peso molecular esperado.
Otra técnica muy aplicada al revelado de reacciones de PCR, es la hibridización con sondas específicas.
Habitualmente se realiza una corrida electroforética y se transfiere el DNA a una membrana de nylon o
nitrocelulosa (proceso llamado Southern blot).
A la membrana se le agrega una solución de ácido nucleico marcado (sonda) complementario a la
secuencia que se quiere detectar. De estar presente la secuencia buscada, la sonda se hibridizará y
luego de revelar se detectará una señal que varía según el tipo de marca (por ej. radioactiva o
colorimétrica)
La PCR es desde hace tiempo una técnica ampliamente utilizada en el laboratorio con fines de
investigación, para identificar la presencia o ausencia de regiones precisas tanto en ADN de procedencia
eucariota como procariota. Cada vez más se utiliza en el laboratorio clínico, con fines de diagnóstico
fundamentalmente.
Corrida electroforética de ADN en gel de agarosa
La electroforesis es una técnica que permite separar distintos fragmentos o moléculas de ADN en función
de sus pesos moleculares y/o de su conformación (circular superenrollada, circular relajada o lineal). El
DNA a pH neutro está cargado negativamente por lo que migra hacia el polo positivo cuando es sometido
a un campo eléctrico. La distancia recorrida esta en relación inversa con el tamaño del ADN, por lo que
las moléculas pequeñas migrarán más que las de mayor tamaño.
Preparación del Gel
Según el tamaño de las moléculas de ADN que se van a estudiar, se preparará el gel con diferentes
concentraciones de agarosa. El buffer a utilizar en la corrida electroforética es el mismo utilizado para
diluir la agarosa. En el práctico se trabajará con agarosa 1,5 % en buffer TBE.
24
Se calienta la suspensión agitando, hasta alcanzar el punto de ebullición. Se deja enfriar hasta 60-70 ºC
y se vierte en el portagel conteniendo el peine, hasta un espesor de aproximadamente 0,5 cm. Se deja
solidificar unos minutos en una superficie nivelada.
Se retira el peine y se coloca en la cuba de electroforesis, la cual se llena con buffer de corrida hasta
cubrir la totalidad del gel.
Siembra de las muestras
Sobre una superficie limpia y lisa, se mezcla un volumen adecuado de la muestra a ensayar (por ejemplo
5 μl de un producto de PCR), con el buffer de muestra (el cual contiene azul de bromofenol que marcará
el avance de la corrida electroforética y glicerol para darle consistencia a la muestra facilitando su carga
en los pocillos del gel).
El buffer a utilizar se encuentra 6 veces más concentrado que la dilución de uso, por lo que deberá
diluirse 6 veces en la muestra (por ejemplo 5 ul muestra más 1 ul buffer). Se mezcla bien con micropipeta
y se carga el pocillo.
Se repite la operación por cada muestra a correr.
Corrida electroforética
Se cierra la cuba conectando los electrodos y se larga la corrida.
Se recomienda en general aplicar un voltaje de hasta 5 voltios por cm (medido entre electrodo y
electrodo), por ejemplo, para una minicuba de 15-20 cm, se trabajará a 70-100 V.
Revelado y observación
Una vez que el frente de corrida ha avanzado lo suficiente, se para la electroforesis interrumpiendo la
corriente, se abre la cuba y se retira el portagel. El gel se sumerge en una solución previamente
preparada de Bromuro de Etidio durante unos minutos y se observa el gel en un transiluminador o fuente
emisora de luz ultravioleta.
25
HISTORIA CLÍNICA
FICHA PATRONÍMICA
J.P 45 años, sexo femenino, raza blanca, empleada doméstica. Casada, tres hijos. Procedente de Montevideo, zona urbana.
Motivo Consulta: Anemia y tumoración en hipocondrio izquierdo.
Enfermedad Actual: Comienza hace cuatro meses con astenia y adinamia, que se instalan de manera insidiosa y que le obliga
progresivamente a disminuir sus actividades habituales. Al mismo tiempo se nota pálida y presenta disnea de esfuerzo. Todo esto
se acompaña de anorexia y adelgazamiento de 6 kg y la aparición de una tumoración en hipocondrio izquierdo que causa molestia.
También relata mareos y cefaleas. Presenta dolores óseos, con predominio nocturno. No ha tenido episodios de angor.
No tuvo sangrados cutáneos ni mucosos. No fiebre.
Tránsitos digestivo y urinario sin particularidades.
Antecedentes Enfermedad Actual: no ha presentado episodios previos similares.
Antecedentes Personales: Fumadora moderada. Niega otros antecedentes
Antecedentes Familiares: Padres fallecidos, desconoce la causa. Tres hermanos sanos.
Antecedentes Ambientales: Casa de material. Luz y agua corriente. Saneamiento.
A. SocioEconómicos y Culturales: Curso hasta cuarto año de secundaria.
EXAMEN FÍSICO
Paciente lúcida, que colabora con el interrogatorio, impresiona buen estado general, apirético, polipneico, buen estado de
hidratación y de nutrición.
Piel y Mucosas: Palidez cutáneo mucosa. Piel sana sin lesiones.
Bucofaringe: orofaringe sin particularidades, lengua papilada, piezas dentarias en buen estado.
Cuello: Eje visceral bien centrado no se palpa glándula tiroides, ni tumoraciones.
Linfoganglionar: no se palpan adenomegalias en los territorios explorados.
Cardiovascular: a destacar una taquicardia regular de 110 cpm, resto sin particularidades.
Pleuropulmonar: sin particularidades.
Abdomen: asimétrico a expensas de una tumoración en hipocondrio izquierdo y flanco izquierdo que sobrepasa la línea umbilical y
llega a la pelvis, no permitiendo introducir la mano por debajo de la parrilla costal, de consistencia aumentada, con escotadura y
que se moviliza desde el inicio de la respiración. Espacio de Traube mate a la percusión.
FFLL: La tumoración presenta contacto lumbar externo a izquierda.
Osteoarticular: Dolor a la palpación y calor a nivel de la rodilla derecha. Signo de Craver presente.
Neurológico: sin particularidades.
EN SUMA
Paciente de 45 años, de sexo femenino, sin AF patológicos a destacar, con AP de fumadora moderada, sin otros antecedentes a
destacar; que consulta por anemia y una tumoración a nivel de hipocondrio izquierdo de tres meses de evolución, que se
acompaña de astenia, adinamia, anorexia , adelgazamiento de 6kg y disnea de esfuerzo. Destacándose al examen físico palidez
cutáneo-mucosa y una tumoración que ocupa hipocondrio izquierdo y flanco izquierdo, con características tumorales. Signo Crave
presente.
Historia Clínica: es un registro escrito de todos los
datos relativos al paciente que pueden ser pertinentes
en relación a su estado de salud o enfermedad, cuyo
propósito primario es el diagnosticar y tratar al
paciente, y seguir su evolución. Constituye también,
un elemento decisivo en toda tarea de investigación
clínica prospectiva o retrospectiva, así como con fines
docentes. Es un documento médico-legal.
Angor: Dolor precordial, de particulares características
que traduce Insuficiencia Coronaria.
Lúcido: Paciente vigil (despierto y con los ojos
abiertos), y bien orientado en tiempo y espacio
Apirético: ausencia de fiebre
Polipnea: Aumento de la frecuencia respiratoria > 20
respiraciones/minuto.
Ficha Patronímica: registro de los datos del paciente:
Nombre, Sexo, Edad, Profesión, Nacionalidad, Raza,
Domicilio, Zona, Estado civil, la Fecha de ingreso.
Adenomegalia: Ganglio y/o cadenas ganglionares
aumentadas de tamaño
Astenia: cansancio físico y psíquico
Signo de Craver: dolor a la compresión esternal.
Aparece en hemopatías que desarrollan un
considerable aumento de la celularidad de la médula
ósea en un corto período. El signo debe ser buscado
presionando la mitad o los dos tercios inferiores del
esternón, lo cual provoca un dolor exquisito.
Adinamia: debilidad muscular
Disnea: Sensación subjetiva de dificultad respiratoria
con sensación de falta de aire; conciencia de la
respiración.
Anorexia: ausencia de apetito
Espacio de Traube: el espacio semilunar de Traube
está delimitado por un borde superior convexo que va
de la sexta articulación condroesternal izquierda hasta
la novena o décima costilla, y su borde inferior lo
constituye el reborde costal. Este espacio
normalmente es timpánico a la percusión, la
desaparición de este espacio o su borramiento indica
agrandamiento del bazo y/o del hígado.
Tumoración: toda masa o bulto que se ve y/o se palpa
en alguna región del cuerpo; no prejuzga si esa masa
es tumor en el sentido estricto del concepto de la
patología, o si es una masa no tumoral(ej: un quiste,
un cuerpo extraño, una víscera agrandada, etc.)
Cefalea: Dolor de cabeza
26
1. Se extrae sangre del paciente y se realiza un extendido para el análisis citológico de esta muestra y un
hemograma. Se observa lo siguiente:
Paciente
Hemograma
Hemoglobina
Globulos Blancos
Globulos Rojos
Plaquetas
Paciente
5.5 gr/cc
200 000/cc
2.0 millones
180 mil
Valores normales
14.5-15.5 gr/cc
4-8000/cc
4.8-5.5 millones
140-380 mil
Normal
¿Qué conclusiones se pueden sacar de estos estudios?
2. Se cultivan células a partir de una muestra de sangre del paciente y se realiza un análisis citogenético
con bandeo G. Se observan alteraciones en los cromosomas indicados. ¿Cuáles son estas
alteraciones? ¿Qué significado pueden tener a nivel molecular?
27
3.
Se purificó ARN de muestras de sangre periférica del paciente. Utilizando sondas de varios genes localizados en el
brazo largo del cromosoma 9 se realizaron ensayos de hibridación Northern. Cuando se utiliza la sonda del gen
ABL se observa una banda de 8 Kb diferente a las dos bandas (6 o 7 Kb) características de pacientes normales.
¿Cómo explica estos resultados?
Carriles
A
B
C
D
E
F
G
H
4.
Control s/ARN
Normal
Paciente
Paciente
Normal
Paciente
Control s/ARN
Normal
Se purificaron proteínas a partir de una muestra de sangre del paciente, se
separaron por electroforesis y se analizaron por Western blot utilizando
anticuerpos contra la proteína ABL. El paciente está indicado como muestra
K562 y la muestra HL-60 corresponde a un paciente normal. ¿Qué concluye de
este experimento? ¿Cómo lo vincula con los resultados del experimento
anterior?
Paciente Normal
5.
Paciente Afectado
28
Utilizando como sonda un fragmento del gen ABL
marcado radiactivamente se analizó la distribución
de señales radiactivas luego de la hibridación
sobre cromosomas metafásicos. Se obtuvo una
distribución de señales particular como se indica
abajo. Explique estos resultados.
6.
Digerimos ADN de pacientes normales y afectados con la
enzima de restricción Sst I, separamos los fragmentos por
electroforesis y lo transferimos para realizar una hibridación
tipo Southern. Como sonda utilizamos la porción 5´ terminal
del cDNA de 8 Kb detectado en el paciente. Este fragmento
(que aparece indicado en la figura) es homólogo a una
región del gen BCR cuyo mapa de restricción con Sst I
aparece en la parte superior de la figura. Además de los
fragmentos de 3 y 5 Kb esperables aparece en los afectados
un fragmento de 6 Kb. ¿Cómo se explica este fragmento?
¿Cómo confirmaría su hipótesis?
7. El gen BCR cubre 130 Kb de la región 22q11.2, consta de 23 exones y se expresa como dos mensajeros de 4.5 y 7
Kb, dando lugar a proteínas de 130 y 190 kDa con una mayoritaria de 160, con función serín-treonin quinasas.
El producto del gen ABL es una tirosin quinasa de 145 kDa. El gen consta de 13 exones y se expresa como dos
mensajeros diferentes a partir del exón 1b (7kb) o 1a (6 Kb).
Busque información en internet u otra bibliografía sobre la/s estructura/s posibles del gen quimérico, así como del
transcripto y proteína que se forman al expresarse. Tenga en cuenta los sitios de corte y fusión en la translocación
(9;22) involucrada.
¿Qué relevancia clínica tiene conocer exactamente la estructura del gen quimérico resultante de la translocación?
OBS.: se recomienda hacer esta búsqueda bibliográfica antes de la actividad práctica con el fin de tener todos los
elementos posibles para una mejor comprensión del práctico.
29
8.
ACTIVIDAD PRÁCTICA 1:
Es posible detectar alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales, visualizando los cromosomas en
metafases obtenidas a partir de cultivos de sangre periférica, mediante una tinción adecuada y microscopio con objetivo
de inmersión (100x).
Observe metafases obtenida a partir de cultivos de sangre periférica o médula de un paciente con diagnóstico clínico de
leucemia mieloide crónica y de un individuo sano. Esta observación puede realizarse en microscopio utilizando el
objetivo 100x o en fotografías digitales en las computadoras del laboratorio.
Obs.: Los microscopios son instrumentos delicados. Antes de empezar a manipularlos, espere a que el docente le
explique y demuestre como hacerlo. Tenga cuidado de no rayar los lentes ni ensuciar los otros objetivos con el aceite.
a) Observe una metafase con el lente de 100x o en fotografía digital. Dibuje un esquema de los cromosomas e indique
el número cromosómico.
2N=
b) Indique las características más importantes de los 7 grupos de cromosomas humanos.
Grupo
Características
A
B
C
D
E
F
G
30
c) ¿Por qué la observación de cromosomas se realiza generalmente en metafase?
d) ¿Las alteraciones cromosómicas estructurales pueden ser consideradas mutaciones?
e) En la formación del cromosoma Ph característico de LMC, ¿se pierde o gana material genético?
9. ACTIVIDAD PRÁCTICA 2:
Es posible determinar el producto que se genera por la fusión génica BCR-ABL a través de un RT-PCR (amplificación
del ARNm quimérico formado). En el siguiente esquema, las flechas indican las posiciones relativas de los distintos
cebadores utilizados en este ensayo y los tamaños esperados de los productos de la amplificación.
Producto normal del gen BCR:
Posibles productos que se pueden obtener a partir de muestras de sangre de pacientes portadores del gen fusionado
BCR-ABL:
397 pb
472 pb
320 pb
31
Realice una corrida electroforética en gel de azarosa (previamente teñido con bromuro de etidio) de los
productos de RT-PCR obtenidos a partir de ARN de 4 pacientes con diagnóstico clínico de Síndrome
mieloproliferativo. Visualice los resultados obtenidos en un transiluminador de UV.
a) Dibuje un esquema del patrón de bandas
observados en el gel.
b) ¿Qué significa la presencia o ausencia de bandas en cada muestra?
c) ¿Puede determinar los puntos de corte y fusión de la translocación involucrada en los pacientes positivos?
Descríbalos para cada uno de los casos donde fuese posible.
d) ¿Qué otra utilidad puede tener esta metodología a lo largo de la progresión de la enfermedad y el tratamiento?
10. Con el surgimiento de las terapias oncológicas con
blancos moleculares, se inició una era de drogas
más efectivas y con menores efectos secundarios.
Este es el caso del Imatinib, inhibidor especifico de
las tirosinquinasas ABL, PDFGR y KIT. Este
inhibidor se une al dominio quinasa de ABL de la
proteína quimérica inhibiendo la capacidad de
fosforilar y activar proteínas involucradas en el
crecimiento celular. En la siguiente figura se grafica
la respuesta al tratamiento con Imatinib de un
paciente con LMC. El porcentaje del transcripto
quimérico en relación a un gen endógeno es una
medida asociada a cantidad de células leucémicas.
Meses con Imatinib
32
Meses con Imatinib
Mese con Imatinib
En las figuras A y B se muestra la respuesta al tratamiento con Imatinib de otros 2 pacientes con LMC.
a) ¿Qué diferencia en la respuesta al tratamiento presentan estos pacientes con respecto al paciente anterior?
b) ¿Cuáles podrían ser las causas y como haría para demostrarlo?
33