Download TITULO DE PROYECTO: Diversidad de Lycaste skinneri (Batem

DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM EX. LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA:
ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN.
FODECYT 59-00
Marzo 2003
TITULO DE PROYECTO:
DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA:
ANÁLISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN.
FINANCIADO POR: SENACYT
LÍNEA DE FINANCIAMIENTO: FODECYT
NUMERO DE PROYECTO: 59-00
INSTITUCIÓN EJECUTORA: UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INVESTIGADOR PRINCIPAL: GERDA MARIA HUERTAS DE ORDÓÑEZ
INVESTIGADOR ASOCIADO: MAYRA MALDONADO
INVESTIGADOR ASOCIADO: MARGARET ANN DIX
INVESTIGADOR ASOCIADO: MICHAEL WILLIAM DIX
TÉCNICO REPRODUCCIÓN IN VITRO: LISBETH PANIAGUA
TÉCNICO ANÁLISIS GENÉTICO: LUIS CARLOS CASTELLANOS
FECHA DE INICIO: 03 DE SEPTIEMBRE 2001
FECHA FINAL: 28 DE FEBRERO 2003
Índice Temático
Contenido
AGRADECIMIENTOS
I. INTRODUCCIÓN
II. ANTECEDENTES
A. Análisis Morfométrico
B. Análisis Genético
C. Cultivo de Tejidos in vitro
III. OBJETIVOS
IV. HIPÓTESIS
V. METODOLOGÍA
A. Fuente de Muestreo
B. Análisis Morfométrico
C. Análisis Genético
1. Extracción de ADN
2. Cuantificación de ADN por fluorimetría
3. Amplificación de ADN por medio de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
4. Técnicas de “Touchdown” para la amplificación de ADN por
medio de PCR
5. Electroforesis en Agarosa
6. Visualización en Gel de Agarosa
D. Cultivo de Tejidos in vitro
1. Selección de Tejidos
2. Desinfección de muestras
3. Siembra in vitro
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A. Fuente de muestreo
B. Análisis Morfométrico
C. Análisis Genético
1. Extracción de ADN
2. Cuantificación de ADN por Fluorimetría
3. Visualización de ADN en gel de Agarosa
D. Cultivo de Tejidos in vitro
Pag.
v
1
1
4
5
11
15
15
16
16
16
18
18
18
19
21
22
23
23
23
24
24
25
25
25
31
31
31
32
39
ii
Índice Temático
(continuación)
Contenido
VII. CONCLUSIONES
VIII. RECOMENDACIONES
IX.BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
ANEXO A. SOLUCIONES MADRE ANÁLISIS GENÉTICO
ANEXO B. MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO
ANEXO C. INFORME FINANCIERO
Pag.
41
42
44
47
48
49
54
iii
Índice de Cuadros
Contenido
Cuadro 1. Comparación de los tres genomas en la célula vegetal (Judd et al.,
1999)
Cuadro 2. Datos continuos medidos (en mm) y proporciones basadas en
estas mediciones de partes florales de Lycaste skinneri
Cuadro 3. Estadígrafos que describen las partes florales de Lycaste skinneri
(n=110).
Cuadro 4. Análisis de componentes principales de las características florales
de Lycaste skinneri
Cuadro 5. Cantidades de ADN cuantificado (ng/ml) de las extracciones
realizas de hojas de orquídeas del género Lycaste
Cuadro 6. Cantidad de muestras amplificadas y visualizadas en agarosa,
clasificadas por gen analizado, incluye extracciones en triplicado
Cuadro 7. Cantidad de muestras de ADN amplificadas y visualizadas en
agarosa, por experimento, bajo distintas condiciones.
Cuadro 8. Cantidad de muestras sembradas en los diferentes medios
Pag.
5
16
28
30
32
32
33
40
iv
Índice de Figuras
Contenido
Figura 1. Distribución histórica de Lycaste skinneri en Guatemala
(Modificado de Chavaría Samayoa, 1982).
Figura 2. Localización de genes en el ADN cloroplásmico de Oryza sativa L.
(Hiratsuka et al., 1989).
Figura 3. Diagramas de la localización de los cebadores en las regiones
amplificadas. (Tomados de Neyland y Urbasch, 1995; Johnson y Soltis, 1995;
modificado de Bodo Slotta, 2000; y Saar Polans, 2000) A. Gen de la
subunidad F de la NADH deshidrogenasa; B. Gen de la subunidad K de las
madurasas C. Epaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en
el núcleo.
Figura 4. Partes florales, mostradas en Lycaste skinneri var. rosea (en
cultivo).
Figura 5. Localidades historicas de Lycaste skinneri comparadas con
localidades de germoplasma disponible y no disponible para el año 2001-2002
en Guatemala
Figura 6. Variabilidad de Coloración y Forma del Labio de Lycaste skinneri
de Guatemala
Figura 7. Cladograma que agrupa las localidades de las flores medidas de
Lycaste skinneri en base a sus características morfométricas.
Figura 8. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de orquídeas del género
Lycaste (2-9).
Figura 9. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Solanum sp
(1-5).
Figura 10. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste del
Sección Xanthanthae
Figura 11. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de Lycaste skinneri var.
rosea en cultivo en Baja Verapaz (2-11)
Figura 12. Amplificación del gen ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var.
rosea en cultivo de Baja Verapaz (2-11).
Figura 13. Metodología de PCR touchdown con tres distintas muestras de
Lycaste skinneri var. rosea (1, 2, 3) utilizado 3 cebadores (A=matK, B=ITS-1
y C=ITS-2)
Figura 14. Producto esperado de seis muestras de Lycaste de la sección
Xanthanthae utilizando cebadores para el gen matK realizado en el año 2000
(datos no publicados)
Figura 15. Partes de plantas de Lycaste vivas y muertas en los diferentes
medios de cultivo
Pag.
3
6
10
17
26
27
31
34
35
35
36
36
38
38
40
v
AGRADECIMIENTOS
A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología por el financiamiento otorgado
(Proyecto FODECYT 59-00) y la ayuda y orientación a través del apoyo prestado por el
personal de la línea FODECYT.
A los integrantes de la Asociación Guatemalteca de Orquídeologia (AGO) y a los de la
Asociación Verapacense de Orquideología por proporcionarnos muestras de flores y
hojas de sus plantas, en especial a Regina Lizama, Regina de Castejón, Mario Palmieri y
Silvia de Palmieri.
A los Drs. Dix por su asesoría durante el proceso, y apoyo en viajes de campo y muestras
de sus plantas cultivadas.
A la Licenciada Margarita Palmieri por su asesoría en el cultivo de tejidos y uso de
espacio en el laboratorio de cultivo de tejidos.
Al Dr. Paul Manos de la Universidad de Duke, Carolina del Norte (EE.UU.) por su
asesoría en el análisis genético y obsequio de cebadores ITS.
1
I. INTRODUCCIÓN
En el campo de la horticultura las especies del género Lycaste son muy cotizadas
porque sus híbridos con otras especies son muy vistosos y de variados colores.
Por esta razón y el avance de la frontera agrícola, las plantas en el campo casi han
desaparecido en su totalidad, y han sufrido erosión genética porque pocos
fenotipos son apreciados por los horticultores. La mayoría de plantas de la
especie Lycaste skinneri, cuya variedad alba es la flor nacional de Guatemala, se
pueden encontrar en colecciones privadas y muy pocas veces en su hábitat
natural.
Se realizaron análisis morfométricos de flores y análisis genéticos de la porción
matK y ndhF en ADN cloroplásmico y de la porción ITS1 e ITS2 de los
ribosomas nucleares para tratar de determinar la procedencia genética de Lycaste
skinneri, además se evaluó el crecimiento in vitro de diferentes porciones de la
planta y sus semillas en 8 medios diferentes.
El análisis morfométrico muestra 8 grupos de caracteres medidos que presentan
mayor varianza y sirven para poder agrupar los diferentes tamaños de las flores de
las plantas dentro de Lycaste skinneri. Estos datos muestran una tendencia de
aumentar el tamaño de la flor desde las poblaciones en el Sur hacia el área de las
Verapaces. No hay suficiente evidencia en los caracteres medidos como para
separar la especie en varios grupos. En el análisis genético no se puede alcanzar
una conclusión ya que el método es altamente sensible a la contaminación por
ARN y a la degradación del ADN de las muestras obtenidas. En el cultivo de
tejidos se logró poca producción de embriones a partir de meristemos. Los más
exitosos son los meristemos de partes florales y raíces. Las hojas presentan una
alta tasa de sobrevivencia pero no han producido embriones explantables. Las
semillas tienen buena sobrevivencia. Se mantienen los clones sobrevivientes en el
laboratorio de cultivo in vitro de la UVG.
II. ANTECEDENTES
Las orquídeas han sido depredadas de los bosques tropicales desde su
descubrimiento. Las especies del género Lycaste no han sido la excepción. Se
distribuyen en Latinoamérica, desde México hasta Perú, con unas pocas especies
en el Caribe y Brasil. Las especies guatemaltecas son las más utilizadas para la
hibridación ex situ en el mundo(Ames y Correl, 1953; Oakeley, 1998).
Fueron introducidas, junto con otras especies de orquídeas y plantas epífitas, al
Viejo Mundo durante el siglo XVIII, en embarques medidos en toneladas. Entre
los cargamentos de plantas llevadas a Inglaterra durante los años comprendidos
entre 1840 y 1870, fue descubierta Lycaste skinneri (Batem ex Lindley) Lindley.
Esta especie consta de muchas variedades, entre ellas la L. skinneri var. rosea, que
es la más común y la L. skinneri var. alba, la flor nacional de Guatemala, que es la
2
más cotizada por los horticultores. Las variedades presentan colores que van
desde el rojo y morado hasta el blanco. De la variedad alba, solo se puede
encontrar una planta en 2,000 plantas de Lycaste skinneri (Ames y Correl, 1953;
Dix y Dix com. pers.; Oakeley, 1993).
El 70% de los híbridos, registrados para este género, tiene en su acervo genético a
L. skinneri. Este interés ha mermado el banco de germoplasma que se encontraba
en los bosques nubosos de Guatemala, Chiapas (en México) y el norte de
Honduras y El Salvador. El hábitat natural de esta especie es el bosque
premontano húmedo y pluvial, con una precipitación anual entre 1,900 mm a
4,000 mm, ver Fig. 1. En Guatemala se encuentran en los bosques de la parte
norte del país como Huehuetenengo, Quiche, Alta Verapaz, baja Verapaz, Zacapa
e Izabal. En la parte sur existen dos áreas, una en el suroeste en San Marcos,
Quetzaltenango, Totonicapán y Sololá y en el sureste en Jalapa, Jutiapa y
Chiquimula. Cohabita con árboles como encinos, liquidambar, aguacatillo,
laureles, y pino de candelaria, y también con helechos arborescentes (chipe),
epífitas y otras plantas ornamentales (Dix y Dix, com. pers.).
La gran cantidad de variedades de L. skinneri ha impulsado a que los expertos y
cultivadores de este género aventuren hipótesis sobre su origen. Las dos hipótesis
más difundidas exponen que (i) al menos dos especies están unidas en una sola
descripción (Archila, 1998; Dix y Dix, 2000; Tinschert, 1983) y (ii) existe una
especie central y un enjambre de híbridos con las siguientes especies: L. cruenta,
L. macrophylla, L. lasioglossa y L. deppei (Dix y Dix, 1992; Oakeley, 1991).
El hábitat de L. skinneri ha sido reemplazado por cultivos como el café de
montaña, la agricultura tradicional (maíz y frijol) y por el monocultivo propiciado
por el PINFOR. Además, fue colectada de forma que las poblaciones originales
de L. skinneri no pudieron volver a recuperarse. La mayor diversidad genética
real para esta especie, se encuentra en las plantas de colecciones o invernaderos
privados; una forma de conservación ex situ. Para asegurar la conservación de la
especie se propone analizar muestras foliares de las distintas variedades de esta
especie y crear un banco de germoplasma para la misma en el invernadero de la
Universidad del Valle de Guatemala.
Las colecciones de germoplasma son ensambles de genotipos o poblaciones
representativas de cultivares, grupos genéticos, especies silvestres, etc. Que son
mantenidas en forma de plantas, semillas y cultivo de tejidos. Se ha considerado
que la variación genética en plantas es una fuente ilimitada. Pero últimamente se
ha registrado que la mayoría de la variación genética solo la encontramos en
centros de diversidad natural que pronto desaparecerán si no se toman las acciones
necesarias (Ramanatha Rao y Riley, 1994).
3
92°
90°
Departamentos
18°
AV Alta Verapaz
México
BV Baja Verapaz
Cm Chimaltenango
Belice
Cq Chiquimula
Es Escuintla
EP El Progreso
Pe
Gu Guatemala
Hu Huehuetenango
Mar de las
Antillas
16°
Iz Izabal
Ja Jalapa
Ju Jutiapa
AV
Pe Petén
Iz
Hu
Qz Quezaltenango
Qc Quiché
SM
To
Qc
EP
So
Cm
Qz
Re
Za
BV
Gu
Ja
Sa
Su
Honduras
Cq
Re Retalhuleu
Sa Sacatepéquez
SM San Marcos
SR Santa Rosa
So Sololá
Es
14°
SR
Ju
El Salvador
Océano Pacífico
Su Suchitepéquez
To Totonicapán
Za Zacapa
Clave
Km
0
50
100
Distribución
Histórica de L. skinneri
Figura 1. Distribución histórica de Lycaste skinneri en Guatemala (Modificado de
Chavarría Samayoa, 1982).
4
A. Análisis Morfométrico:
La descripción de especies se basa mayormente en sus características
morfológicas como tamaño y descripción de la planta, sus flores y frutos. Este conjunto
de características es el que nos ayuda a reconocer cuáles son las especies más
emparentadas y cuáles menos. Como se utilizan muchas características para describir
cada uno de los organismos estos datos se muestran complejos, con ruido (información
no valiosa), con redundancia y con relaciones internas o externas que los modifican.
Estos grupos de datos son voluminosos y alguna información sólo se puede interpretar de
forma indirecta. Los métodos multivariados hacen más fácil el manejo de estos datos
(Jongman, TerBraak y VanTongeren, 1995). Se utiliza el análisis multivariado para
analizar estas características ya que al ser muchas, se necesita poder unificar las que se
comportan de forma más parecida y las que no.
El análisis de componentes principales es uno de los procedimientos que se recomienda
antes que cualquier otro análisis multivariado, ya que agrupa las unidades experimentales
en subgrupos semejantes e identifica las variables significativas subyacentes (Gauch,
1982; Johnson, 2000). El análisis de componentes principales resume la redundancia de
los datos localizándolos en entidades similares próximas en el espacio ordenado y
produce una descripción económica de los datos en términos de unos pocos gradientes
dominantes de variación. En el grupo original de datos encontramos mucha redundancia
por lo que los análisis de componentes principales extraen la mayoría de la variación en
la menor cantidad posible de dimensiones (Matus, González y del Pozo, 1999;
McGarigal, Cushman y Stafford, 2000; Molina Cano, 1977).
El análisis de componentes principales permite la reducción de la complejidad o
dimensión del problema mediante la creación de nuevos componentes, fuera de las
variables originales que maximizan la variación entre los individuos a partir de un
modelo linear dado en valores Eigen (Matus, González y del Pozo, 1999; McGarigal,
Cushman y Stafford, 2000).
El análisis de componentes principales agrupa varios
caracteres relacionándolos en factores, y muestra como cada uno de los factores
encontrados, contribuye a separar grupos (Rojas, Barriga y Figueroa, 2000). Se toman en
cuenta todos los componentes principales cuyo valor Eigen es mayor de 1.00 y se explica
con base a la cantidad de varianza acumulada en esos datos (Matus, González y del Pozo,
1999). El significado biológico de cada componente se refleja en la importancia de cada
variable que define el componente. Esto es, mientras más importancia tenga la variable
medida, más extremo será el valor del componente (McGarigal, Cushman y Stafford,
2000).
El uso de los fenotipos morfológicos para la caracterización de los genotipos tiene
sus ventajas y desventajas. La naturaleza multialélica de estas características provee de
información muy útil a los cultivadores. Aun así, lo complejo de su herencia hace que las
predicciones de los cruces realizados sea difícil (Ramanatha Rao y Riley, 1994). Las
características morfológicas del individuo prevalecen en el ADN nuclear que es heredado
de ambos padres por lo que estas técnicas son utilizadas para complementar el análisis
genético.
5
B. Análisis Genético
La sistemática es la ciencia de la diversidad, es decir, la organización del conjunto total
del conocimiento sobre los organismos, dentro de estos conocimientos incluimos los
análisis de los genomas o fuentes de información genética. La célula vegetal contiene
tres diferentes genomas: núcleo, mitocondria y cloroplasto. Para estudios en sistemática
se han utilizado datos producidos de los tres. Los organelos, y por lo tanto sus genomas,
son heredados uniparentalmente (en Lycaste es heredado maternalmente, Dressler 1981);
en el caso del núcleo y su información genética se hereda biparentalmente. Como se
puede ver en el Cuadro 1, los tres genomas difieren notablemente entre ellos,
principalmente en su tamaño. El tamaño del genoma de núcleo es el más grande y puede
medir millones de kilobases (kb); mientras que la mitocondria tiene un genoma
relativamente pequeño de hasta 2,500 kb y el genoma del cloroplasto es el más pequeño
alcanzando a medir hasta 160 kb (Judd et al., 1999).
Cuadro 1. Comparación de los tres genomas en la célula vegetal (Judd et al., 1999)
Organelo
Tamaño en Kilobases (Kb)
Tipo de Herencia
Cloroplasto
135-160
Maternal generalmente
Mitocondria
200-2,500
Maternal generalmente
Núcleo
1.1x106 hasta 110x109
Biparental
Las mitocondrias y los cloroplastos son eubacterias que poseen genomas circulares. Los
genomas de las mitocondrias son variables y están separados por grandes regiones de
ADN que no codifican. Frecuentemente, los genomas de las mitocondrias se rearreglan
ellos mismos, y pueden existir muchas dentro de una misma célula. Esto indica que los
rearreglos del genoma se pueden dar dentro de un mismo individuo, y que no son útiles
para identificar y caracterizar especies y grupos de especies. No son adecuadas para
inferir relaciones filogenéticas. Por el contrario, el cloroplasto es estable, tanto celular
como molecularmente. La característica más obvia del genoma cloroplásmico es la
presencia de dos regiones que codifican para los mismos genes pero en dirección opuesta,
regiones conocidas como secuencias invertidas. Entre ellas existen una región pequeña y
una región grande de copia sencilla. Los rearreglos en el genoma cloroplásmico son tan
poco frecuentes que permiten el uso de este genoma para estudios filogenéticos para
delimitar a los taxones mayores. La ganancia o perdida de genes o sus intrones son tan
poco frecuentes que pueden ser utilizados como marcadores estables de cambios
evolutivos (Judd et al., 1999).
Se tiene evidencia que el orden de los genes en el genoma nuclear es estable, al menos
dentro de especies y puede que también sea estable entre grupos de especies. Dicha
evidencia ha sido mostrada a través de mapeos genómicos. Las secuencias de ADN
cambian a distintas velocidades comparadas con la velocidad de cambio genómico. Los
genes cloroplásmicos tienden a acumular mutaciones más rápido de lo que lo hacen los
genes mitocondriales. Es difícil generalizar acerca de los genes nucleares por el poco
conocimiento que se tiene de ellos y la gran cantidad de genes presentes en el núcleo
celular (Judd et al., 1999).
6
El ADN cloroplásmico (ADNcp) es circular y de hebra doble. Dentro del organelo se
pueden encontrar muchas copias del mismo. El ADNcp está organizado en unidades
discretas llamadas nucleoides, en los que se cree que están localizados en el estroma del
cloroplasto y están asociadas con las membranas de los tilacoides (Coleman, 1985). El
genoma del cloroplasto varía entre 120 a 217 kb. En la mayoría de las angiospermas
estas secuencias de cientos de kilobases miden entre 39 y 46 micrómetros (μm) en
dicotiledóneas, y entre 37 y 55 μm en monocotiledóneas (Palmer, 1985). La estructura
típica del ADNcp consiste de dos segmentos compuestos de secuencias invertidas (IR) de
20 a 30 kb separadas por una copia única corta (SSC) y una copia única larga (LSC), ver
Fig. 2 (Hiratsuka et al., 1989; Palmer y Thompson, 1981).
Figura 2. Localización de genes en el ADN cloroplásmico de Oryza sativa L. (Hiratsuka et al., 1989).
SSC Copia única pequeña (Small Single Copy); IR Secuencias Invertidas (Inverted Repeats) y LSC Copia
única larga (Large Single Copy). Los genes en el interior del círculo se transcriben en el sentido de las
agujas del reloj; los del exterior, en contra sentido. Los asteriscos resaltan los genes de fisura (split genes).
La flecha azul y el sombreado marcan al gen ndhF en la SSC. La flecha roja y el sombreado muestran
el gen matK, en la región trnK en la LSC.
7
En la última década el uso del ADNcp ha aumentado su valor en estudios evolutivos y en
sistemática. La invención de nuevas técnicas moleculares más simples y eficientes para
la extracción y purificación de ADN, ha ayudado al progreso general que se da en la
biología molecular. Los avances alcanzados utilizando el ADNcp son recientes, pero
ampliamente documentados contribuyendo con información sobre la sistemática y
evolución de las angiospermas a todo nivel taxonómico. El mayor énfasis se ha realizado
en plantas de importancia económica, a pesar de que los casos más interesantes se
presentan en otras especies de plantas (Hilu, 1987).
Existen numerosas dificultades en la sistemática de angiospermas como en el caso de
estudios morfológicos en la cual la microscopía para determinar caracteres, no es
suficiente. El uso de ADNcp puede ayudar a aclarar incógnitas (Hilu, 1987). La
sistemática molecular difícilmente hubiera sido posible sin la invención del ADN
recombinante, mejoramiento de las técnicas de secuenciación y el uso de la reacción en
cadena de la polimerasa. También hay que agregar los avances en la secuenciación
automatizada, la cual hará las técnicas notablemente rápidas (Judd et al., 1999).
Inicialmente la mayoría de estudios genéticos se habían realizado utilizando análisis de
sitios de restricción. La cuál había sido utilizada para la generación de mapas de genes
individuales o genomas enteros. La mayoría de lo que se conoce de genomas
mitocondriales y cloroplásmicos, proviene de estudios utilizando enzimas de restricción.
La técnica consiste en la extracción del ADN y luego cortar en sitios específicos de la
hebra de ADN con éstas enzimas. Un mapa genético se puede construir cortando el ADN
con una enzima y examinando el patrón del tamaño de los fragmentos resultantes. Se
repite el mismo procedimiento utilizando otra enzima de restricción y se analiza. Por
último, el procedimiento se repite utilizando las dos enzimas de restricción al mismo
tiempo. Este análisis crea una especie de rompecabezas, el cuál, para formarlo se
necesitan colocar en orden las combinaciones de los fragmentos de restricción (Judd et
al., 1999).
El procedimiento utilizado anteriormente era muy laborioso, debido a que se realizaba
una separación de organelos del resto del tejido vegetal, para luego separar el ADN de
dichos organelos, cortarlo con las enzimas de restricción y visualizarlo en gel teñida con
bromuro de etidio. Dicho análisis fue simplificado por la introducción de la hibridación
de hebras de ADN (llamado Southern Blot) y luego su visualización con autoradiografía.
El análisis de los sitios de restricción es actualmente más útil para estudios de variación
en el genoma cloroplásmico y en los espaciadores del ARN ribosomal, además para
aumentar la variación en los fragmentos amplificados por reacción en cadena de la
polimerasa. El proceso del análisis requiere de mucho tiempo y esfuerzo pero es el que
se aplica en el mapeo del genoma nuclear para el análisis de los polimorfismos del
individuo y sus dos padres.
La secuenciación de genes, partes de genes o regiones no codificantes, son las que se han
vuelto cada vez más comunes y ampliamente utilizadas en sistemática. La dificultad
principal de la secuenciación es tener la cantidad adecuada de ADN. Antiguamente, se
realizaba por medio de la clonación de los genes a bacterias y permitiendo que estas se
8
replicaran. Era un método lento pero permitía la utilización de metodologías más
eficientes (Judd et al., 1999).
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) sustituyó el
procedimiento de clonación de genes. El PCR requiere algún conocimiento de la
secuencia que se va a estudiar. Pequeñas piezas de ADN de hebra sencilla (llamados
“primers” o cebadores) son producidas para encajar en las secuencias de ADN que
interesan. Dichos cebadores son colocados en un recipiente junto con el ADN a estudiar,
nucleótidos libres y una enzima ADN polimerasa. Esta mezcla es expuesta a diversos
cambios de temperatura. Al calentar la muestra, la hebra doble se desnaturaliza y se
vuelve una hebra sencilla. Al enfriarse, los cebadores se unen al final y al principio de su
hebra complementaria de la región de interés de la hebra de ADN. Luego, la temperatura
es aumentada al punto en donde la polimerasa se activa para unir al cebador con los
nucleótidos libres; formando una hebra complementaria a la que se usó como molde o
patrón. Se continúa con una elevación de temperatura para que se vuelva a desnaturalizar
el ADN y se repite el ciclo (Judd et al., 1999).
El surgimiento de la biología molecular aplicada a resolver preguntas sistemáticas y
evolutivas ha permitido el establecimiento de la sistemática molecular como un campo
interdisciplinario muy sólido en la actualidad. La secuenciación de ADN se ha
convertido en una de las técnicas más populares utilizadas en la sistemática molecular.
Un número considerable de secuencias ha sido utilizado, entre las secuencias más
destacadas están las regiones codificadas y no codificadas del genoma tanto nuclear,
mitocondrial y cloroplásmico. Entre los genes más utilizados son el gen cloroplásmico
rbcL y el gen nuclear que codifica para regiones codificantes y no codificantes del ADN
ribosomal que es nuclear, por ejemplo, el gen ITS (Liang, 1997).
El gen matK, conocido también como orfK o como parte de la región trnK, ha surgido
como uno de potencial uso a la sistemática y evolución molecular en plantas. El gen
consta de aproximadamente 1,500 pares de bases (pb) y está localizado adentro del intrón
del gen cloroplásmico trnK, que se encuentra adyacente a la repetición invertida de la
copia larga del ADN cloroplásmico (ver Figs. 2 y 3). La función de este gen está
relacionada con el proceso extracelular de preparación de intrones, antes de ser
decodificados como proteínas. En un estudio de homología se puede observar que los
102 últimos aminoácidos están relacionados con los polipéptidos análogos a las
madurasas. También hay indicios que pueden estar relacionados con las madurasas y con
el procesamiento de intrones del tipo II (Liang, 1997).
El gen matK es desde un punto de vista filogenético, una de las regiones más
evolucionadas del genoma cloroplásmico. Según Hilu y Liang (1997) el gen matK
presenta las siguientes propiedades para estudios filogenéticos:
-Tamaño razonablemente grande (1,500) pares de bases
-Alta tasa de sustitución
-Alta proporción de variación en la primera y segunda posición en los
codones
-Tasas de transición y transversión bajas
9
-Presencia de sectores conservados potencialmente mutables.
-Presencia de una región 3´ más conservada que la región 5´ le permite
versatilidad para trabajar distintos niveles taxonómicos.
El gen cloroplásmico ndhF ha sido utilizado tanto para el estudio de individuos vegetales
de una especie, así como, para los miembros de un género. Terry et al. (1997) se refieren
a él como un locus que codifica para un péptido clororespiratorio. Este gen es miembro
de los que sintetizan la NADH deshidrogenasa (también llamada subunidad F del gen
ndh), los cuales tiene una taza de variación muy baja a nivel de todas las angiospermas
(Olmstead y Palmer, 1994). Hay que hacer notar que los genes ndh pueden ser
transcritos pero sus productos proteínicos no han sido del todo identificados. En la
mayoría de los genomas, ndhF se encuentra localizado en la región pequeña de hebra
simple del genoma cloroplásmico (Kim y Jansen, 1995).
El uso de secuencias del gen ndhF ha provisto un mayor número de caracteres para
analizar relaciones que las que provee el gen rbcL. Al comparar el gen ndhF contra el
gen rbcL, se concluye que ndhF es más grande y evoluciona más rápido. El tamaño del
gen ndhF en tabaco es de 2,133 pares de bases (por sus siglas en inglés, bp), el cuál es 1.5
veces más grande que el rbcL (Olmstead y Reeves, 1995). En el caso de arroz, se ha
visto que es de 2,205 bp (Sugiura, 1989). Los análisis comparativos de ndhF demuestran
que la velocidad de sustitución de nucleótidos es dos veces más grande que la que se da
en rbcL (Olmstead y Reeves, 1995).
En tabaco se ha obtenido el producto de transcripción de este gen y es cuatro veces más
grande que el producto del gen rbcL (Kim y Jansen, 1995). El producto obtenido es una
proteína de 740 aminoácidos, una subunidad de NADH deshidrogenasa. Esto permite
aseverar que ndhF es mucho más informativo que rbcL para fines de reconstrucción
filogenética (Catala, Sabater y Guera, 1997; Kim y Jansen, 1995).
En estudios realizados con Asteracea, Kim y Jansen (1995) demostraron el potencial del
gen ndhF para resolver filogenias dentro y entre familias que han experimentado una
radiación reciente y rápida. La variación del gen ndhF solamente es superada por la del
gen matK en todos los genes codificantes en el ADNcp mayores de 1000 bp (Olmstead y
Palmer, 1994). El gen ndhF ha sido utilizado mucho a nivel interfamiliar (Olmstead y
Reeves, 1995). Un gran número de caracteres variables ha hecho que el gen ndhF tenga
las secuencias ideales para grupos taxonómicos que no han sido resueltos adecuadamente
cuando se usaran datos de rbcL (Smith y Atkinson, 1998).
Se ha analizado el gen cloroplásmico ndhF (ver localización en Figs. 2 y 3) para las
orquídeas amarillas del género Lycaste (Sección Deciduosae, Subsección Xanthanthae) y
se encontraron dos fragmentos diferentes entre las especies que componen este grupo. El
fragmento (haplotipo) en L. cochleata tiene entre 200 a 300 pares de bases (pb) más, que
el fragmento encontrado en L. cruenta, que mide aproximadamente 1,500 pb
(Maldonado, 2001). Por esta razón se cree que este gen puede ser útil para determinar
diferencias entre grupos del género Lycaste más alejados evolutivamente.
10
Figura 3. Diagramas de la localización de los cebadores en las regiones amplificadas. (Tomados de
Neyland y Urbasch, 1995; Johnson y Soltis, 1995; modificado de Bodo Slotta, 2000; y Saar Polans, 2000):
A. Gen de la subunidad F de la NADH deshidrogenasa; B. Gen de la subunidad K de las madurasas
C. Espaciador Interno Transcrito de unidad del ADN ribosomal en el núcleo.
A. Localización aproximada en el ADN cloroplásmico de los cebadores usados para la caracterización del
gen ndhF, según Neyland y Urbatsch (1995).
5’
3’
ndhF
ORF 350
Å+607
1201Æ
400pb
B. Localización relativa del gen matK en el genoma cloroplásmico y la posición de los cebadores utilizados
para amplificación y secuenciación de ADN en orquídeas. (Johnson y Soltis, 1995).
5’
3’
Rps16
5’ trnK
psbA
ÅmatK1520
matK56FÆ
100pb
3’ trnK
matK
C. Diagrama de las las dos regiones (ITS-1 e ITS-2) del Espaciador Interno Transcrito de unidad del ADN
ribosomal en el núcleo, en donde se encuentran 3 regiones codificantes (18S, 5.8S y 26S). Los números
con flecha indican la localización aproximada de los 4 cebadores utilizados para su amplificación, no
dibujado a escala (modificación de Bodo Slotta, 2000; Saar y Polans 2000).
5’
3’
ITS5a Æ
18S
ITS3Æ
ITS-1
5.8S
Å ITS2
Región ITS
ITS-2
Å ITS4
26S
11
La región ITS (ver Fig. 3)consiste en dos espaciadores transcritos internamente del ADN
ribosomal, ITS1 e ITS2 y el gen intermedio 5.8S de los ribosomas nucleares. La región
5.8S es pequeña y conservada por lo que no nos provee de muchas características útiles
para el análisis filogenético, aún entre los taxa de división y clases. Pero las regiones
ITS1 e ITS2 son usadas comúnmente para las comparaciones al nivel de especies. Un
nivel al cual ha provisto de suficientes caracteres para el análisis genético (Stanford et al.,
2000). Este gen fue seleccionado para poder comparar las características morfológicas
con los caracteres genéticos.
En orquídeas se han realizado varios estudios que incluyen a los genes ndhF (Maldonado,
2001; Neyland y Urtsbatch, 1995 y 1996), matK (Ryan et al., 2000; Whitten, Williams y
Chase, 2000) e ITS (Ryan et al., 2000; Salazar, 2001; Sosa et al. 2001; Soto Arenas,
2001; Szalanski et al., 2001; Whitten, Williams y Chase, 2000). Para dilucidar las
relaciones genéticas del género Lycaste en Guatemala se han encontrado problemas ya
que los estudios que han sido realizados no son concluyentes, o no incluyen todas las
especies presentes en la naturaleza (Maldonado, 2001; Neyland y Urtsbatch, 1995 y
1996; Ryan et al., 2000).
C. Cultivo in vitro:
El pionero en cultivo in vitro de orquídeas fue Bernard en 1909. Él trabajó con el
aislamiento de hongos que benefician en la simbiosis raíz-hongo para la germinación de
semillas de orquídeas. Él demostró que aumentaba el porcentaje de germinación al
cultivar semillas esterilizadas e inoculadas con hongos. Knudson en 1922, 1924 y 1925
aclaró muchas dudas relacionadas con la organogénesis de las semillas. Demostró que
los hongos eran los responsables del rompimiento del almidón en azúcares simples, los
cuales favorecían la germinación de las semillas de orquídeas. Knudson logró la
germinación de las semillas sin la asociación con hongos. En 1949, Vacin & Went
desarrollaron un medio ampliamente usado para la germinación de semillas de híbridos.
Este ha sido utilizado en el Jardín Botánico de Singapur en las últimas cuatro décadas. A
la fecha se conocen por lo menos 25 medios de cultivo, incluyendo Murashige & Skoog,
para la germinación de orquídeas (Macz, 1995).
El medio Hill de cultivo de orquídeas fue desarrollado hace treinta años por el químico
Daniel Hill. Nunca se conocieron los componentes exactos del medio y cuando él murió
su receta fue vendida a la única compañía que la produce en la actualidad, Gallup y
Stribling. Se cree que esta compañía la ha mejorado para el cultivo exclusivo de
orquídeas. Dicho medio, vendido en forma de polvo deshidratado, es destinado para el
cultivo in vitro de semillas y otro para promover el enraizamiento y desarrollo de
plántulas (Gallup & Stribling, 2003).
En 1960, el cultivo de meristemos fue iniciado por el Dr. G. Morel en INRA, Versalles,
Francia. Además de ofrecer la ventaja de clones libres de virus, posibilitó una forma
importante de multiplicación de plantas y semillas de alto valor comercial en un tiempo
12
relativamente corto (Macz, 1995). Técnicas recientes utilizando los tallos florales se
realizaron por Intuwong y colaboradores en 1972 en géneros Ascofinetia, Neostylis y
Vascostylis. En 1973-74 Intuwong y Sagawa emplearon los géneros Dendrobium,
Phalaenopsis y Vanda. Los mismos investigadores continuaron ensayando con la
propagación utilizando las yemas axilares dormidas presentes en la base de los tallos
florales. Dicha técnica fue aplicada en Costa Rica por Ospina, Intuwong y Sagawa en
orquídeas pero no se han logrado resultados consistentes (Macz, 1995).
En Guatemala la técnica se ha aplicado para evaluar el comportamiento de especies
nativas de importancia económica en los géneros Cattleya sp. y Lycaste sp. Pero no se
tienen resultados concretos (Macz, 1995). González (1999) realizó un estudio para
desarrollar una metodología in vitro de propagación de Lycaste skinneri var. alba. Evaluó
48 tratamientos consistentes en todas las combinaciones posibles de dos medios de
cultivo Murashige y Skoog (desarrollado en 1962) y el medio de Morel (desarrollado en
1965), tres reguladores de crecimiento (Bencilaminopurina, 2,4-Diclorofenoxiacético y
cinetina). El tratamiento que dio el mayor número de brotes (4.2 promedio por
protocormo), con una adecuada altura de planta (20 mm) a los 50 días de la siembra, fue
el medio de Murashigue y Skoog suplementado con 0.1 mg/l de cinetina.
El cultivo de tejidos es un método de propagación de tejidos vegetales bajo condiciones
controladas. Involucra tres fases: en la primera se aísla el material vegetal de su ambiente
original, conocido como explante; en la segunda fase se aplican técnicas asépticas para
obtener material libre de contaminantes bacterianos, fúngicos (micóticos), virales y por
algas microscópicas; y tercero, el cultivo y mantenimiento de este material in vitro en
ambientes químicamente y físicamente controlados. Dependiendo de los fines de la
investigación, una posible cuarta fase podría consistir en recuperar plantas enteras para
sembrar en recipientes como macetas (Hall, 2000).
Para lograr resultados óptimos se deben tomar las siguientes precauciones, sugeridas por
Hall (2000):
− Usar material de plantas jóvenes y vigorosas, evitar las que sean muy viejas o
enfermas. El uso de semillas puede garantizar que las plantas estén libres de
contaminantes;
− Todo equipo utilizado debe mantener condiciones estériles porque los medios,
ricos en nutrientes, y los cultivos de crecimiento lento, permiten condiciones
favorables a la contaminación por organismos del ambiente. Es necesario utilizar
campanas de flujo laminar con o sin irradiación con luz UV y /o mecheros
encendidos. En un mismo laboratorio no se deben mezclar estudios con
diferentes organismos. Todo instrumento u objeto debe estar esterilizado y
desinfectado en el caso del material de siembra. Para la esterilización del equipo
como cristalería y medios de cultivo, se debe tener una autoclave;
− Es necesario balanzas adecuadas para pesar en mg y en Kg para la preparación de
medios de cultivo así como, aparatos para agitar soluciones y medios
simultáneamente;
− Para ajustar el pH de los medios o soluciones es necesario un pHímetro con
soluciones preparadas de HCl y KOH (0.01, 0.1, 1.0 y 10 M);
13
− Es importante usar cristalería de vidrio o plástico desechable para cultivo, como
tubos, Erlenmeyer, frascos, cajas de Petri (9 cm, 6cm, y 3 cm), etc.;
− Se necesita equipo para filtrar, jeringas, recipientes plásticos para congelar
medios y soluciones stock por periodos prolongados;
− Las membranas aislantes son necesarias para evitar la entrada de contaminantes y
estas pueden ser papel aluminio, papel Parafilm y Saranwrap;
− Para la preparación de medios es necesaria la cristalería para medir volúmenes,
probetas, instrumentos de disección, estufas, agitadores magnéticos, gas, agua,
electricidad, estereoscopios y microscopios;
− Se necesitan áreas de lavado de cristalería para poder remover toda impureza que
quede impregnada de usos anteriores. Residuos de jabón, medios viejos u
hormonas pueden contaminar o afectar los cultivos nuevos, si estos no son
removidos adecuadamente al lavar la cristalería. Se recomienda lavar con ácido
clorhídrico al 2% con regularidad, para eliminar residuos adheridos al vidrio.
(Hall, 2000)
Los medios de cultivo proveen todos los nutrientes necesarios para el desarrollo del
material vegetal que se va a estudiar. Hall (2000) y Macz (1995) describen los
componentes principales:
A. Nutrientes inorgánicos:
1. Macronutrientes: Ca, K, Mg, N, P, y S incluidos en forma aniónica y/o catiónica
en concentraciones milimolares (mM). Son esenciales para el crecimiento
sostenido in vitro.
2. Micronutrientes: B, Co, Cu, Fe, I, Mo, Mn, y Zn incluidos en concentraciones
micromolares (µM). Algunos como Al y Ni se necesitan en cantidades tan
minúsculas que pueden ser suficientes los contaminantes ya presentes en el agar,
por ejemplo. Los micronutrientes permiten el funcionamiento metabólico
adecuado.
B. Nutrientes orgánicos
1. Vitaminas: generalmente, tiamina(vitamina B1), piridoxina (vitamina B6), ácido
nictotínico (vitamina B3) y mioinositol se incluyen. Tiamina se considera como
esencial, otras vitaminas tienen propiedades de mejorar el crecimiento porque
participan en reacciones catalíticas en el metabolismo vegetal.
2. Amino Ácidos: algunos medios lo contienen. No son esenciales para plantas
porque la planta los produce. Tienen propiedades de mejorar el crecimiento, como
por ejemplo glicina en el medio Murashige y Skoog.
3. Fuente de Carbono: se usa la sucrosa (o sacarosa) normalmente, y ocasionalmente
glucosa o maltosa dependiendo de lo que se va a cultivar.
14
4. Fitohormonas: las más utilizadas son las auxinas y citocininas. Para aplicaciones
especificas se pueden usar ácido abscísico o ácido giberílico. Las auxinas inducen
la elongación celular en material vegetal y pueden estimular la formación de
raíces. Existen formas naturales como ácido indol-3 acético, IAA(siglas en
inglés) y sintético (Ej. Ácido indol–3 butírico, IBA; ácido naftalenacético, NAA.;
ácido 2,4 diclorofenoxiacético, 2,4 –D; ácido p-clorofenacético, pCPA). Todos se
utilizan pero el IAA se inactiva rápidamente con la exposición a la luz. Las
citocininas son importantes en la división celular. Están involucradas con ARN
de transferencia y la síntesis de proteínas. Las sintéticas se utilizan ampliamente,
como: benziladenina, BA o 6-benzilaminopurina, BAP; cinetina, K (por su
nombre en inglés); e 2-isopentiladenina, 2iP. Alterando el balance hormonal de la
planta en el medio de cultivo, especialmente el balance auxina / citocinina, es una
de las herramientas más poderosas disponibles para el investigador en determinar
la respuesta del material vegetal en el cultivo in vitro.
5. Otros: Se han utilizado otros componentes como suplementos en el cultivo de
tejidos, entre estos se encuentran: hidrolizados de proteínas, extractos de frutas,
extractos de levaduras, extractos de papas. El que más se usa es el agua de coco y
ya esta disponible comercialmente.
C.
Agentes gelificantes: La concentración y el tipo de agente utilizado para los
medios influyen en la respuesta del tejido de cultivo. Existen extractos de algas
como agar, agarosa y alginato y recientemente los substitutos como Gelrite y
Phytagel obtenidos de la fermentación microbiana. Los agares y agarosas
producen geles estables por periodos prolongados y no se enlazan con los
componentes excesivamente. Gelrite y Phytagel producen un gel rígido a
menores concentraciones que el agar y la agarosa. Estos son mas transparentes y
facilitan la detección de contaminantes en etapas tempranas. En cultivos
prolongados tienden a licuarse por la disminución de sales o el pH.
Finalmente, para incubar los tejidos que se desean estudiar, es necesario un área cerrada
que provea de forma controlada la cantidad de luz(horas de luz), temperatura estable,
humedad relativa y circulación de aire adecuada para los tejidos vegetales que se van a
evaluar. Un sistema de alarma las 24 horas es indispensable para detectar cambios o
cortes del flujo eléctrico para alertar a los técnicos y evitar cambios bruscos que puedan
afectar los cultivos. También se debe cuidar de que se realicen investigaciones
relacionadas en el mismo lugar para que no sean necesarias muchas variaciones en las
condiciones del cuarto de incubación (Hall, 2000).
15
III. OBJETIVOS
A. General
Evaluar la diversidad genética de Lycaste skinneri encontrada en
colecciones ex situ.
B. Específicos
-Realizar estudios de morfometría en flores de las diversas variedades de L.
skinneri.
-Determinar los posibles haplotipos de L. skinneri basados en la secuencia de los
genes matK y ndhF del ADN de cloroplastos e ITS de los ribosomas nucleares
para confirmar los resultados obtenidos de la morfometría y compararlos con otras
especies que conviven con ellas en forma simpátrica.
-Reproducir in vitro clones de las variedades encontradas utilizando diferentes
partes de las plantas y de nuevas plantas provenientes de semillas en diferentes
medios para iniciar el establecimiento de un banco de germoplasma de esta
especie en la Universidad del Valle de Guatemala.
IV. HIPÓTESIS
Existe diversidad genética entre las plantas de la especie Lycaste skinneri que están
siendo cultivadas ex situ en Guatemala.
16
V. METODOLOGÍA
A. Fuente de muestreo
Se usaron flores y material foliar de plantas cultivadas de Lycaste skinneri de los
siguientes departamentos: Alta y Baja Verapaz, Chiquimula y Jalapa. Durante viajes de
campo, realizados durante fines de semana, se visitaron los departamentos de Izabal,
Suchitepéquez, Sololá y Quetzaltenango.
B. Análisis Morfométrico
Se usaron 110 flores de L. skinneri para este análisis. Estas incluyen flores de
plantas en cultivo y las almacenadas en líquido (75% Etanol, 20% agua destilada y 5%
glicerina o FAAG) depositadas en el Herbario UVAL, desde 1975 hasta noviembre de
2002. Se midieron 33 características continuas (ver cuadro 2 y Fig. 2), con un vernier,
todas con la ayuda de un estereo microscopio.
Se ingresaron los datos en una matriz rectangular en Excel 97, el cual es
compatible con el resto de programas. La interpretación de todos los datos se basa en
análisis multivariado (Gauch, 1982; Johnson, 2000; Jongman, Ter Braak y VanTongeren,
1995; McGarigal, Cushman y Stafford, 2000; Molina Cano 1977; Rojas, Barriga y
Figueroa, 2000). Con SYSTAT 8.0 (SPSS, 1998) se realizó el análisis de componentes
principales para señalar diferencias morfológicas de las diferentes variedades de L.
skinneri. Se reportaron las medias y respectivas desviaciones estándar de cada carácter
medido.
Cuadro 2. Datos continuos medidos (en mm) y proporciones basadas en estas
mediciones de partes florales de Lycaste skinneri. Ver lugar y forma de las mediciones
en la figura 4.
Caracteres
Caracteres
Mediciones Absolutas
Largo y Ancho de:
Base de la flor
Labio
Columna
Callo del Labio
Lóbulos laterales del Labio
Lóbulo medio del Labio
Sépalos laterales
Sépalo dorsal
Pétalo
Largo de:
Ovario
Bráctea floral
Primer segmento del Escapo a partir del Ovario
Ancho del istmo del lóbulo medio del Labio
Proporciones entre datos continuos
Ancho con respecto a largo de:
Base de la flor
Labio
Columna
Callo del Labio
Lóbulos laterales del Labio
Lóbulo medio del Labio
Sépalos laterales
Sépalo dorsal
Pétalo
Largo del ovario en proporción al largo de la bráctea
floral
Ancho del callo con respecto al ancho del istmo del
lóbulo medio del Labio
17
A.
Sépalo
Dorsal
Pétalo
Sépalo
Lateral
Labio
B.
C.
Lóbulos
Laterales
D.
Bráctea
Floral
Columna
Callo
Ovario
Figura 4. Partes florales, mostradas en Lycaste skinneri var. rosea (en cultivo). A. Partes separadas y
aplanadas de toda la flor. B. Detalle del Labio, C. Vista lateral de la columna, D. Vista frontal de la
columna. Las líneas muestran la posición en la que se midieron las características morfológicas; las sólidas
muestran los anchos y las punteadas los largos medidos.
18
C. Análisis genético
1. Extracción de ADN (modificación basada en Doyle y Doyle 1990)
Se realizaron 700 extracciones de ADN total de orquídeas del género Lycaste, dentro
de estas extracciones se utilizó material de hojas de 45 plantas de L. skinneri. Se
procesaron de la siguiente forma:
a. Tomar muestra de 0.05 a 0.1 gramos de material foliar fresco o de 0.004 a 0.005
gramos de material foliar seco.
b. Agregar 600 microlitros (µl) de CTAB y 3 µl de mercaptoetanol.
c. Macerar el material foliar con un pistilo plástico desechable hasta que quede todo el
material resuspendido.
d. Agitar en vortex por dos segundos.
e. Colocar en el horno a 65° C con agitación constante durante 50 minutos si es un
material fresco y 60 minutos si es material seco. Sí el material es muy antiguo,
agregar una hora más.
f. Agregar 500μl de cloroformo y agite suavemente veinte veces por inversión.
g. Centrifugar entre 6,000 a 8,000 revoluciones por minuto(rpm), por 5 minutos.
h. Remover la fase acuosa, descartando la interfase y la fase orgánica, y colocar en
nuevo tubo de 1.5ml.
i. Agregar 7/10 volúmenes de isopropanol y agite hasta ver precipitarse las hebras de
ADN (alrededor de 350 µl fueron utilizados).
j. Centrifugar de 8-10 minutos a 12,000 rpm.
k. Decantar el isopropanol.
l. Lavar el ADN con 100 µl de etanol al 70%.
m. Secar con microcentrífuga o dejar secar al aire.
n. Resuspender con buffer de Trisma-Base-HCl-EDTA (TE), aproximadamente de 30 a
50 µl.
2. Cuantificación de ADN total por fluorimetría (utilizando protocolos del fabricante,
Amersham Bioscience, 1998)
a. Se preparan las siguientes soluciones:
-Solución amortiguadora de Tris- HCl, sal (NaCl) y EDTA disódico (TNE) 10x.
-Control positivo de ADN de timo de ternera
-Solución Madre de bis-benzimida
b. Se prepara 100 ml de la solución de tinción de bajo rango de ADN para
soluciones de concentración entre 10 y 500 nanogramos (ng) de concentración
final. La composición de la solución es la siguiente:
− Solución Madre de bis-benzimida
− Solución TNE 10 x
− Agua desmineralizada
10 μl
10 ml
90 ml
19
c. Calibración del fluorímetro con estándar de ADN de timo de ternera.
i.
ii.
Encender el fluorímetro 15 minutos antes de realizar las lecturas de las muestras.
Tener preparadas las siguientes soluciones:
− Solución de tinción de bajo rango.
− Una dilución 1:10 (100 µg/ml) de 1 mg/ml de la solución de timo de ternera.
iii.
iv.
v.
vi.
vii.
viii.
d.
i.
ii.
iii.
iv.
v.
vi.
Cuando esté colocado, remover la celda de la cámara de muestreo, notando su
orientación. Agregar 2 ml de solución de tinción. Si es necesario, limpie los lados de
la celda con un paño y colocar la celda de regreso a la cámara en su orientación
original.
Calibrar a cero (0) de transmitancia: cerrar la tapa y presionar el botón del cero, hasta
que en la pantalla de lectura aparezca el cero (000). Una fluctuación aceptable es de
+/- 003 unidades.
Colocar 2 µl de la dilución de ADN en dos ml de la solución en la celda con una
exactitud de la micropipeta a 0.02 µl. Mezclar el tinte con el estándar de ADN por
medio de pipeteo dentro de la celda.
Cerrar la tapa del aparato y apretar el botón de SCALE para que se lea en pantalla
“100”. Este movimiento ajusta el instrumento a que lea la concentración de ADN
directamente.
Repetir los pasos “d” a “g” al menos una vez para verificar que los resultados son
reproducibles.
Desechar el contenido de las celdas invirtiéndolas sobre una toalla de papel.
Lectura de la concentración de muestras desconocidas
Repetir los pasos “a” a la “h” de la calibración de una solución de celda y reemplace.
Tener a mano las soluciones para poder calibrar a cero y una concentración estándar.
Colocar 2 μl de la muestra y mezclar con 2 ml de la solución de tinción.
Colocar dentro de la cámara de lectura del equipo y apuntar la lectura.
Limpiar las celdas
Trabajar en triplicado y promediar los resultados
3. Amplificación de ADN por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
González et al., 1995)
a. Sacar del refrigerador las muestras de ADN que se encuentran suspendidas en Buffer
TE.
LAS
MUESTRAS NO DEBEN DE ESTAR CONGELÁNDOSE Y DESCONGELÁNDOSE
FRECUENTEMENTE PORQUE SE ROMPEN LAS CADENAS LARGAS DE ADN Y DA LUGAR A
PRODUCTOS INESPECÍFICOS DE PCR.
20
b. En un tubo de 0.5ml colocar 3 μl de muestra a analizar. Trabajar una muestra por
tubo.
LOS SIGUENTES PASOS TRABAJARLOS EN LA CAMPANA CON LUZ FLUORESCENTE, NO
USAR LA LUZ UV CUANDO SE TIENEN LAS MUESTRAS DENTRO.
c. Preparar la siguiente mezcla madre (también llamada, master mix o MM) un tubo
Eppendorf de 1.5 ml con los reactivos especiales para PCR.
Reactivo
Buffer
Solución de MgCl2
D NTP
Agua desmineralizada
Cebador 5´ (Delantero, F)
Cebador 3´ (Reverso, R)
Taq Polimerasa
Cantidad
3.0 μl l * Y
3.0 μl * Y
1.0 μl * Y
17.7 μl * Y
1.0 μl * Y
1.0 μl * Y
0.3 μl * Y
Nota: Y es un factor de multiplicación que depende de la cantidad de muestras que se
vayan a trabajar. Por ejemplo, si se van a analizar 20 muestras, la cantidad de reactivos a
agregar en la mezcla madre se multiplica por 23, las extras son para control positivo,
control negativo, y una extra para contrarrestar el error por pipeteo. Para evitar
contaminaciones, procure agregar de último y rápidamente de Taq polimerasa.
Los cebadores usados para analizar la estructura genética de las diferentes variedades de
Lycaste skinneri, con las mismas metodologías anteriores son:
ADN de Cloroplastos:
Región de copia única larga (Large Single Copy)
MATK56 F
ACT TCC TCT ATC CGC TAC TCC TT
MATK 749 F TTG AGC GAA CAC ATT TTT CTA TGG AA
MATK 832 R ACA TAA TGT ATG AAA GTA TMT TTG A
MATK1520 R CGG ATA ATG TCC AAA TAC CAA ATA
matK tiene un producto de ~1,500pb
23 BASES
26 BASES
25 BASES
24 BASES
Región de copia única corta (Small Single Copy)
NDHF1201 F AGG TAC ACT TTC TCT TTG CGG TAT TCC
NDHF 10 F
ATA CTA TGT TAT TTC CTC TC
NDHF 10.7 R GAA AAA AGG TTG TCG ATG GAG
NDHF607 R
ACC AAG TTC AAT GTT AGC GAG ATT AGT C
ndhF tiene un producto entre ~1,500 a 1,700pb
27 BASES
20 BASES
21 BASES
28 BASES
ADN de Ribosomas Nucleares:
ITS 5a F
ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G
ITS 2 R
GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC
ITS 3 F
GCA TCG ATG AAG GCA GC
ITS 4 R
TAG ATT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C
ITS tiene un producto de ambas regiones de ~ 950pb
28 BASES
20 BASES
17 BASES
28 BASES
d. Luego de mezclada la solución madre, colocar en cada uno de los tubos 27 μl de la
misma.
21
e. Colocar los tubos ya preparados para ser amplificados en el termociclador.
f. Iniciar el proceso de amplificación utilizando el siguiente programa:
Paso
1
2
3
4
5
6
7
Temperatura (° C)
Tiempo (min.)
94
10
94
0.75
54
1
72
2
Repetir pasos del 2-4 por 30 veces
72
10
4
Hasta terminar
g. Luego de terminar el proceso, se sacan los tubos y se colocan en el congelador a
–20° C o se analizan en gel de agarosa directamente.
4. Técnica de “Touchdown” para amplificación de ADN por medio de reacción en
cadena de la polimerasa (Court, 2001).
a. Prepare los tubos igual que en los pasos 1 al 5 de la metodología anterior
b. Coloque en un termociclador para realizar de 35 a 40 ciclos de PCR touchdown como
sigue:
Paso
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Temperatura (° C)
Tiempo (min.)
94
4
94
0.5
65
0.5
72
1
Repetir los pasos del 2-4 por 20 veces,
bajando la temperatura de alineamiento
de 65º C a 45º C en 1º por ciclo
94
0.5
45
0.5
72
1
Repetir pasos del 6-8 de 15 a 20 veces
72
10
4
Hasta terminar
c. Luego de terminar el proceso, se sacan los tubos y se colocan en el congelador a
–20° C o se analizan en gel de agarosa directamente.
22
5. Electroforesis de agarosa (según protocolos del fabricante de la cámara Amersham
Pharmacia Biotech 1997 y González et al., 1995)
a. Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar la electroforesis (ver
proporciones en el ANEXO A):
Solución madre de Ácido Etilendiamino Tetracético Disódico (EDTA), al 0.5 M
Solución madre de Trisma-Base-HCl, Ácido Bórico y EDTA (TBE) 10X
b. Preparación de la agarosa
i. En un Erlenmeyer se colocan 90 ml de agua y la cantidad de agarosa que se necesita
para hacer el gel. Se utilizaron las siguientes concentraciones
Concentración de Agarosa
(% p/v)
0.5
1.0
1.5
2.0
Peso de Agarosa
(g)
0.45
0.90
1.35
1.80
DE LA CONCENTRACIÓN DE AGAROSA DEPENDERÁ LA RESOLUCIÓN DE LOS SEGMENTOS
SEPARADOS. A MAYOR CANTIDAD DE AGAROSA, MAYOR RESOLUCIÓN, PERO EL
PROCESO ES MÁS LENTO.
ii. Disolver la agarosa en el Erlenmeyer y llevar a ebullición con agitación magnética,
hasta que la solución quede cristalina.
iii. Quitar de la estufa y esperar a que la solución esté tibia y sin que empiece a
gelatinizar en el beaker.
iv. Colocar la plataforma de cámara de electroforesis en el molde para hacer gel de
agarosa, nivelar y colocar el peine plástico que es el molde de los pocitos donde van
las muestras.
v. Agregar de una forma uniforme y rápidamente la solución de agarosa en la
plataforma, a manera que quede homogénea y sin burbujas.
vi. Esperar a que enfríe y remover los peines de la plataforma.
vii. Llenar la cámara con buffer TBE en disolución 1X a manera que cubra el gel cuando
esté colocado.
viii.
Sacar la plataforma con gel del molde y colocarla en la cámara.
23
ix. Se utilizaron dos tipos de peines para hacer los pocitos del gel de agarosa,
dependiendo de la cantidad de muestras amplificadas. El llenado con muestras de los
pocitos del gel depende de los peines que se hayan utilizado. En los peines de 15
dientes, los pocitos tienen una capacidad de 10.6μl. En los peines de 20 dientes, los
pocitos tienen una capacidad de 7.10μl.
x. En un pocito colocar 3μl de marcador de peso molecular conocido, por cada frente
que vaya a trabajar.
xi. En el siguiente pocito colocar 5μl de agua desionizada y 2μl de buffer de cargado.
xii. Llenar los siguientes pocitos con las muestras amplificadas en PCR: Sí se va a
trabajar en pozos de 10.6μl de muestra cargue cada pozo con 8μl de muestra y 2μl de
solución amortiguadora de cargado (loading buffer). Una muestra por pocito. Sí se va
trabajar en pozos de 7.10μl de muestra, cargue cada pozo con 6μl de muestra y 1μl de
buffer de cargado. Una muestra por pocito.
SIEMPRE SE AGREGA 1/5 DE SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE CARGADO CON RESPECTO A
LA CANTIDAD DE MUESTRA A TRABAJAR.
c. En cada frente de corrida se coloca un marcador de peso molecular, un control
positivo, control negativo y el resto de muestras que se van a analizar.
d. Luego de haber llenado los pocitos, cerrar la cámara con su tapadera.
e. Colocar los electrodos en sus respectivos lugares.
f. Conectar y encender la fuente de poder.
g. Colocar el voltaje constante de la fuente a 90 voltios por un minuto, luego bájelo a
80volts por alrededor de dos horas y media.
h. Al finalizar se apaga la fuente y se remueve la tapadera.
i. Se saca el gel y se pasa de inmediato al proceso de tinción y visualización.
6. Visualización de ADN en gel de Agarosa (González et al., 1995)
a. Se coloca el gel en una solución de 0.5 μg/ml de bromuro de etidio para su tinción.
b. Se agita por 20 minutos
c. Se lava en un recipiente con agua del chorro para remover el exceso de bromuro de
etidio por 10 min.
d. Se visualiza con un transiluminador UV y se fotografía para documentar el resultado.
D. Cultivo de Tejidos in vitro
1. Selección de tejidos
a. Tejidos jóvenes de las plantas de orquídeas se cortaron con hojas de afeitar de un solo
filo, estériles y se trasladaron al laboratorio de cultivo de tejidos en cajas de Petri
estériles: Se utilizaron las siguientes partes vegetales:
24
Hoja
i.
ii.
Pseudobulbo joven
iii.
Raíz
iv.
Flor
v.
Semillas
b. Las muestras de meristemos colectados se cortaron en 3 pedazos más pequeños
(repeticiones) con un bisturí limpio pasado en alcohol al 95% después de cada corte.
c. Las muestras de semillas fueron tomadas de cápsulas que se guardaron en frascos
tapados.
2. Desinfección de muestras
Para las muestras de meristemos de hojas y raíces se utilizó el siguiente método:
a. Lavar las muestras con agua de chorro abundante para remover polvo y material
vegetal seco.
b. Colocar las muestras en beakers con Phisan al 10% por una hora con agitación.
c. Seguidamente, trasvasar las muestras a otros beakers con cloro al 10%, agitar
suavemente por 10 minutos. Debido a contaminaciones posteriores, el tiempo de
agitación se aumentó en 10 minutos.
d. Trasladar las muestras a una campana donde se colocan en un medio Murashige &
Skoog (MSO) para remover completamente el cloro. Las muestras están preparadas
para sembrar en medios de cultivo.
e. Se repitió la metodología con hojas y flores. En el caso de las semillas se desinfectó
la cápsula antes de abrirla.
3. Siembra in vitro
a. Tomar las muestras desinfectadas y partirlas en 3 partes iguales.
b. Colocar los pedazos con todos en un mismo tubo de cultivo o caja Petri, según
corresponda. En uno de los siguientes medios de cultivos (ver composición en
ANEXO B):
ƒ MURASHIGE & SKOOG (MSO)
ƒ Modificaciones de MSO
− con Ácido naftalenacético
− con Ácido naftalenacético (NAA, por sus siglas en inglés) y bencil amina
(BA)
− con agua de coco
ƒ KNUDSON
ƒ .HILL y Agua de Coco (para semillas)
Otros medios utilizados únicamente para hojas y flores fueron:
ƒ
ƒ
MEDIO VACIN & WENT
MEDIO MSD 20 (pH 5.8)
25
VI. RESULTADOS Y DISCUSION
A. Fuente de muestreo
Solamente se trabajó con plantas en cultivo de miembros de la Asociaciones
Guatemalteca y Verapacense de Orquideología y de los Drs. Dix. Para el análisis
morfométrico encontramos 110 flores cuyas localidades originales estaban en Alta
Verapaz, Baja Verapaz, Jalapa y Chiquimula. En las localidades visitadas de Izabal,
Quetzaltenango, Sololá y Suchitepéquez no encontramos plantas de Lycaste skinneri, por
lo que se cree que las poblaciones han sido diezmadas o están extintas, ver Fig. 5.
Se necesita realizar viajes de campo a otros invernaderos y localidades donde se cultiva la
Lycaste skinneri para completar la información obtenida con esta investigación. Las
regiones de mayor importancia a visitar son Huehuetenango, Quiché, San Marcos,
Totonicapán, Alta Verapaz, Zacapa, Chiquimula, Jalapa y Jutiapa (ver Fig. 3). Esta
priorización se basa en la posible distribución de Lycaste skinneri en el país y los
departamentos poco o no representados en el muestreo.
B. Análisis Morfométrico
Las mediciones de las flores de Lycaste skinneri se resumen en el cuadro 3. En la
Fig. 6 se observan distintas formas de esta especie y la variación de su coloración. No se
encontró diferencia significativa entre los tamaños de las variedades de las Verapaces y
las de la forma Ipala.
En el cuadro 3 observamos los valores críticos para la Kurtosis, que explica la forma de
la distribución de datos en relación a la curva normal, se encuentra entre de ±0.93 (para
n=110). Los caracteres que salieron de esta distribución fueron la proporción largo/
ancho del Labio, el largo del ovario y las proporciones largo/ ancho del pétalo y del
sépalo dorsal y la proporción ancho del callo contra el ancho del istmo del lóbulo medio
del Labio. Las distribuciones de estos caracteres fueron positivas por lo que se dice que
sus curvas son supergaussianas. Esto significa que presentan muchos datos cercanos a su
media y la distribución de frecuencias es poco variable.
26
92°
90°
Departamentos
18°
AV Alta Verapaz
México
BV Baja Verapaz
Cm Chimaltenango
Belice
Cq Chiquimula
Es Escuintla
EP El Progreso
PePe
Gu Guatemala
Hu Huehuetenango
Mar de las
Antillas
16°
Ja Jalapa
Ju Jutiapa
AVAV
Pe Petén
IzIz
Hu
Iz Izabal
Qz Quetzaltenango
Qc
Qc Quiché
SM
SM
Qc
To
Qz
So
So
Qz
Re
Re
BV
BV
EP
Cm
Cm
Gu
JaJa
Sa
SuSu
Za
Honduras
CqCq
Re Retalhuleu
Sa Sacatepéquez
SM San Marcos
SR Santa Rosa
So Sololá
EsEs
14°
SR
SR
JuJu
Su Suchitepéquez
El Salvador
To Totonicapán
Océano Pacífico
Za Zacapa
Clave
Km
0
50
Distribución Histórica de
Lycaste skinneri
100
Germoplasma disponible
Germoplasma no localizado
Figura 5. Localidades históricas de Lycaste skinneri comparadas con localidades de
germoplasma disponible y no disponible para el año 2001-2002 en Guatemala.
27
Figura 6. Variabilidad de Coloración y Forma del
Labio de Lycaste skinneri de Guatemala. Fotografías
tomadas en la Exposición Nacional de Orquídeas, 14
al 17 de febrero de 2002, por la AGO.
Fotos por M. Maldonado, L. C. Castellanos.
28
Cuadro 3. Estadígrafos que describen las partes florales de Lycaste skinneri (n=110).
Parte Floral
Máximo
Mínimo
Media
±
Ancho Total de la apertura de la flor
Labio
Largo de la Base
130.0
33.0
55.0
44.0
32.0
8.0
14.0
10.0
6.0
16.0
15.0
27.0
26.0
79.0
46.0
75.0
47.0
55.0
38.0
57.0
70.0
102.0
4.6
2.0
6.3
2.8
0.6
1.8
2.7
2.8
2.4
1.4
2.0
3.4
30.0
22.0
38.0
22.0
21.0
4.0
7.0
3.0
2.0
8.0
7.0
15.0
10.0
53.0
23.0
48.0
24.0
37.0
16.0
20.0
26.0
34.0
1.1
1.1
3.1
1.0
0.2
0.8
1.5
1.3
1.2
0.4
0.6
1.0
81.4
26.1
45.2
34.6
25.2
5.8
10.5
6.2
4.3
12.5
10.1
20.6
18.2
66.4
34.7
61.3
34.2
46.6
29.2
31.2
46.0
68.7
3.1
1.3
4.5
1.8
0.4
1.2
2.0
1.8
1.6
0.7
1.1
1.9
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
Largo
Ancho
Columna
Largo
Ancho
Callo del Labio
Largo
Ancho
Lóbulos
Largo
Laterales
Ancho
Lóbulo Medio
Istmo
Largo
Ancho
Sépalos
Largo
Laterales
Ancho
Sépalo Dorsal
Largo
Ancho
Pétalo
Largo
Ancho
Ovario
Largo
Bráctea Floral
Largo
Escapo1
Largo
Rel. L/A2 Base de la Flor
Rel. L/A Labio
Rel. L/A Columna
Rel. L/A Callo del Labio
Rel. L/A Lóbulos Lateral
Rel. L/A Lóbulo Medio
Rel. L/A Sépalos Lateral
Rel. L/A Sépalo Dorsal
Rel. L/A Pétalo
Rel. L/L3 Ovario- Bráctea Floral
Rel. A/A4 Callo-Istmo
Rel. A/A Lóbulo Medio – Istmo
1
n=80
3
L/L Largo contra Largo
Valor de Kurtosis fuera del intervalo dado por el valor
crítico aceptado entre:
± 1.09 para n=80
± 0.93 para n=110
2
Desviación
Estándar
22.2
2.9
4.4
5.4
2.5
1.1
1.9
1.7
1.1
1.9
2.2
2.7
4.1
7.3
5.9
7.2
6.7
4.9
5.5
8.1
12.7
15.6
0.8
0.2
0.9
0.4
0.1
0.2
0.3
0.3
0.2
0.2
0.3
0.6
Varianza
Kurtosis
Coeficiente de
Asimetría
491.4
8.5
19.0
29.5
6.2
1.2
3.5
2.9
1.2
3.8
4.9
7.2
16.4
53.8
34.6
52.1
44.6
24.0
29.8
66.2
161.4
242.0
0.6
0.1
0.7
0.2
0.0
0.0
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.4
0.06
-0.02
0.12
0.07
0.57
-0.58
-0.31
0.18
-0.86
-0.39
-0.89
0.34
-0.45
-0.68
-0.53
-0.59
-0.82
-0.72
-0.22
2.15
-0.71
0.86
0.38
2.33
-0.24
0.00
0.22
0.83
0.22
1.45
1.67
-0.18
1.30
0.19
0.07
0.68
0.65
-0.39
0.62
-0.32
-0.08
0.25
-0.16
-0.08
0.13
0.34
-0.03
0.08
-0.04
-0.08
0.32
-0.21
-0.40
1.24
0.36
-0.31
-0.32
1.59
0.72
0.26
0.60
0.81
0.38
0.77
0.84
0.51
1.36
1.13
L/A Largo contra ancho
A/A Ancho contra Ancho
Valor de Coeficiente de Asimetría fuera del intervalo dado
por el valor crítico aceptado entre:
± 0.55 para n=80
± 0.47 para n=110
4
29
Estos caracteres también presentaron un coeficiente de asimetría mayor que el valor
crítico (encontrado entre ±0.47, para n=110), lo que implica que la distribución de los
datos se encuentra sesgada hacia la derecha. Otros caracteres con distribución sesgada
hacia la derecha son la proporción entre el ancho del lóbulo medio y el ancho del istmo,
las relaciones entre largo y ancho del lóbulo medio del Labio, la columna y los lóbulos
laterales, la proporción entre largo del ovario y de la bráctea floral y los largos de la base
del Labio, el Labio completo y la columna.
Para poder continuar con el análisis multivariado se normalizaron los datos. La
normalización consistió en restarle a cada dato la media para hacer los más cercanos a
ella (cero) y a los más lejanos darles más peso. Esta metodología hace que cada uno de
los valores sea más comparable (Zar, 1999). El análisis de componentes principales sirve
para encontrar diferencias dentro de las características morfológicas que puedan servir
para describir nuevos grupos en base a su tamaño.
En el cuadro 4 muestra el análisis de componentes principales entre las diferentes partes
de las flores de Lycaste skinneri. Estos ocho factores explican el 86.2% de la varianza
total de estas características. En este cuadro el factor uno está conformado por los
pétalos, el largo del callo y bráctea floral, y los anchos de los sépalos, lóbulos laterales y
medio del Labio.
Estas características se relacionan de manera inversamente
proporcional a la proporción largo–ancho de la columna, por lo que mientras más grandes
sean estas partes florales, menor es la diferencia entre el largo y ancho de la columna, lo
que la hace ver más cuadrada.
El factor dos consiste en la relación largo y ancho del sépalo dorsal y el ancho de callo
del Labio, relacionándose inversamente con el largo de los lóbulos laterales y la
proporción largo y ancho del callo del Labio. El factor tres muestra que la proporción de
los anchos del callo y del istmo del lóbulo medio del Labio es una característica
importante y que el ancho del istmo del lóbulo medio del Labio es una de las más
variables (9% de la varianza total).
El factor cuatro denota que mientras más largo sea el Labio, el largo del ovario y la
bráctea floral menos se abre la flor. El factor 5 muestra una relación inversa entre la
proporción entre el largo y el ancho del callo y el largo del ovario, por lo que se dice que
el ovario será más corto mientras más rectangular se observe el callo. El factor 6, el largo
del ovario, la proporción largo–ancho de la flor y el ancho del lóbulo medio del Labio
son una fuente alta de variación.
El factor 7 muestra que la proporción entre el largo y el ancho del Labio es inversamente
proporcional al largo de la columna. Finalmente, el factor 8 muestra que mientras más
grande sea el largo de la columna, el ovario será más corto y menos puntiagudo se verá el
lóbulo medio del Labio.
30
Cuadro 4. Análisis de componentes principales de las características florales de Lycaste
skinneri. Porcentaje total de la varianza explicado 86.2%.
Partes Florales
Ancho Total de la apertura de la flor
Labio
Largo de la Base
Largo
Ancho
Columna
Largo
Ancho
Callo del Labio
Largo
Ancho
Lóbulos Laterales Largo
Ancho
Lóbulo Medio
Istmo
Largo
Ancho
Sépalos Laterales Largo
Ancho
Sépalo Dorsal
Largo
Ancho
Pétalo
Largo
Ancho
Ovario
Largo
Bráctea Floral
Largo
Rel. L/A Base de la Flor
Rel. L/A Labio
Rel. L/A Columna
Rel. L/A Callo del Labio
Rel. L/A Lóbulos Lat.
Rel. L/A Lóbulo Medio
Rel. L/A Sépalos Lateral
Rel. L/A Sépalo Dorsal
Rel. L/A Pétalo
Rel. L/L Ovario-Bráctea Floral
Rel. A/A Callo-Istmo
Rel. A/A Lóbulo Medio - Istmo
Varianza explicada por componente
% de la Varianza total explicada
% de la Varianza total explicada
acumulado
Inversamente relacionadas
1
n=80
3
L/L Largo contra Largo
1
0.6
0.5
0.7
0.5
0.3
0.9
0.8
0.5
0.1
0.9
0.1
0.6
0.8
0.7
0.9
0.7
0.9
0.8
0.9
0.1
0.8
0.4
-0.1
-0.8
-0.1
-0.5
-0.6
-0.6
-0.4
-0.7
-0.6
0.5
0.6
12.9
39.2
2
0.0
0.2
0.3
-0.3
0.1
0.1
-0.2
0.6
-0.7
-0.1
0.4
0.1
-0.2
0.3
-0.2
0.4
-0.3
0.4
0.0
0.3
0.3
-0.1
0.5
-0.1
-0.6
-0.5
0.3
0.5
0.6
0.1
-0.1
-0.4
-0.4
3.9
11.9
Factores Encontrados
3
4
5
6
0.0
-0.6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.2
-0.4
0.0
0.2
0.0
-0.1
0.4
0.4
0.2
-0.2
0.4
0.1
-0.1
0.0
0.1
0.0
0.0
-0.3
0.1
0.2
0.2
-0.1
-0.1
0.2
-0.5
-0.1
0.2
0.4
0.0
-0.1
0.2
0.0
0.1
-0.1
-0.7
0.4
0.2
0.0
0.5
0.0
-0.1
0.2
0.0
0.1
0.2
0.4
0.4
0.1
0.3
0.2
-0.1
0.0
0.0
0.0
0.2
0.1
0.3
0.2
-0.1
0.0
-0.1
-0.1
0.3
0.1
0.0
-0.2
-0.2
0.2
-0.1
0.0
0.3
0.3
-0.5
0.4
-0.2
-0.1
0.1
0.1
-0.2
-0.7
0.0
0.4
0.1
-0.3
-0.4
-0.4
0.1
0.1
-0.1
0.3
0.2
-0.1
0.6
0.0
0.1
0.4
0.0
0.0
0.3
-0.2
0.2
-0.4
0.4
0.0
0.3
0.2
0.2
0.1
0.4
0.3
0.5
-0.2
0.1
-0.2
0.4
0.4
-0.3
0.2
0.6
-0.2
-0.1
-0.2
0.5
-0.2
-0.3
0.2
3.0
2.4
2.1
1.6
9.0
7.1
6.4
4.8
51.1 60.1 67.2 73.6 78.4
Directamente relacionadas
2
L/A Largo contra ancho
4
A/A Ancho contra Ancho
7
0.3
0.3
0.2
-0.3
-0.5
-0.1
-0.1
-0.2
0.3
0.0
0.2
0.0
0.0
0.2
0.1
0.1
0.1
0.0
0.0
0.3
0.0
0.2
0.4
-0.1
0.2
0.3
0.0
0.0
-0.1
0.0
0.2
-0.2
-0.2
1.4
4.2
8
0.2
0.1
0.2
-0.1
0.4
0.1
0.1
0.1
0.2
-0.1
0.1
-0.2
0.2
-0.1
-0.1
0.0
-0.1
-0.2
-0.2
-0.4
-0.2
0.2
0.3
0.1
-0.1
0.3
-0.4
0.1
0.2
0.1
-0.1
0.0
0.1
1.2
3.6
82.6
86.2
31
Figura 7. Cladograma que agrupa las localidades de las flores medidas de Lycaste
skinneri en base a sus características morfométricas.
En la figura 7 encontramos agrupadas a las poblaciones cuyas flores son más
pequeñas y delgadas, y que los horticultores describieron como L. skinneri var. Ipala, e
inferimos que a través del transiente altitudinal de la Sierra de las Minas las
características morfológicas de las flores se van haciendo más grandes en su distribución
hacia las Verapaces. Las plantas que son más grandes son las que provienen de Alta
Verapaz.
C. Análisis genético
1.
Extracción de ADN
Se logró extraer ADN de 45 muestras diferentes de hojas de Lycaste skinneri, sección
Macrophyllae. En total se realizaron 700 extracciones (incluyen al menos dos
repeticiones de cada individuo) de ADN de diferentes especies de orquídeas del género
Lycaste que incluyen al menos dos especimenes de: L. dowiana, L. macrophylla var.
desbosiana (sección Macrophyllae), L. lasioglossa, L. cruenta, L. cochleata y L.
suaveolens (sección Deciduosae). Las extracciones de ADN de otras especies de Lycaste
sirven para poder comparar los resultados obtenidos con los resultados de investigaciones
anteriores (Maldonado, 2001; Ryan et al., 2000).
2.
Cuantificación de ADN total por fluorimetría
La lectura del ADN total sirve para estimar si se tiene la cantidad mínima de ADN
para realizar la amplificación. La cantidad óptima se encuentra entre 3 y 100 ng de ADN
total (Hoy, 1994). Se hicieron 398 lecturas de concentración de ADN total; ver en cuadro
5 el resumen de las lecturas obtenidas por fluorimetría. En general la cantidad de ADN
total extraída es mayor de 100ng/ml. La cantidad de ADN total extraída es suficiente
para poder realizar una amplificación exitosa de PCR.
32
Se logró un aumento en la cantidad de ADN extraído con las variaciones en la
metodología de extracción implementadas durante el proyecto. Estas variaciones
incluyeron el aumento de la solución amortiguadora de extracción al inicio del proceso y
la disminución de la solución amortiguadora de suspensión del ADN extraído al finalizar
el mismo. En las concentraciones de ADN obtenidas de las modificaciones la Kurtosis
indica que la distribución es normal. Mientras que el coeficiente de asimetría, indica que
la media está tirada hacia la derecha, esto es que la mayoría de las muestras tienen
concentraciones altas de ADN total.
Cuadro 5. Cantidades de ADN cuantificado (ng/ml) de las extracciones realizas de hojas
de orquídeas del género Lycaste.
Variación
de
metodología
Extracción
la
de
Macerado en 700μl de
CTAB, Resuspensión
en 10μl de TE
Macerado en 700μl de
CTAB, Resuspensión
en 50μl de TE
Original: Macerado en
600 μl de CTAB,
Resuspensión en 50μl
de TE
Desviación
Estándar
(ng/ml)
Valor
Crítico
KURTOSIS
COEFICIENTE
Valor
Crítico
COEF.
ASIM.
MEDIA
(ng/ml)
±
312.9
± 189.5
137
53
806
0.0368
0.8371
0.9734
0.4185
168.9
± 84.3
129
24
432
0.4071
0.8627
0.8614
0.4313
103.9
± 70.7
132
14
320
0.9770
0.8528
0.9931
0.4264
n
Mínimo
Máximo
KURTOSIS
DE
ASIMETRÍA
3. Visualización de ADN amplificado en gel de Agarosa
Se analizaron 436 muestras amplificadas por PCR (ver cuadro 6), para poder
estandarizar la técnica de amplificación. Para alcanzar la etapa de secuenciación se
hicieron varias modificaciones a la metodología (ver cuadro 7). Estas modificaciones
incluyeron el cambio en la concentración de ADN total, cambio en la concentración de
magnesio, renovación de cebadores, enzimas y nucleótidos y cambio en la temperatura de
alineamiento de los cebadores con el ADN.
Como se puede observar en las figuras de la 8 a la 13, no se lograron obtener los
productos de la calidad esperada en las amplificaciones de ADN de orquídeas que se
realizaron. Estas figuras corresponden a las metodologías más representativas,
visualizadas por electroforesis en agarosa, ver descripción en el cuadro 7.
Cuadro 6. Cantidad de muestras amplificadas y visualizadas en agarosa, clasificadas por
gen analizado, incluyen extracciones en triplicado.
GEN
MUESTRAS ANALIZADAS
matK
208
ndhF
92
ITS-1
68
ITS-2
68
TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS
436
33
Cuadro 7. Cantidad de muestras de ADN amplificadas y visualizadas en agarosa, por
experimento, bajo distintas condiciones.
Experimento
Gen
amplificado
1
ADN Total
2
3
4
matK
ndhF
ndhF
38
38
36
5
matK
36
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
ndhF
matK
matK
matK
matK
matK
ITS-1
ITS-2
matK
matK
matK
matK
ITS-1
18
16
40
10
10
10
10
10
10
10
10
12
8
19
ITS-2
8
20
ITS-1
21
ITS-2
22
ITS-1
23
ITS-2
24
ITS-1
25
ITS-2
26
ITS-1
27
ITS-2
28
ITS-1
29
ITS-2
30
matK
31
ITS-1
32
ITS-2
33
matK
34
ITS-1
35
ITS-2
TOTAL de muestras
Numero de
muestras
trabajadas
7
5
5
6
6
5
5
18
18
10
10
3
3
3
3
3
3
443
Condiciones
Visualización del ADN presente en las muestras extraídas
para confirmar existencia de ADN de alto peso
molecular.
Metodología Original de amplificación
Metodología Original de amplificación
Metodología Original de amplificación, uso de cebadores
nuevos
Metodología Original de amplificación, uso de cebadores
nuevos
Metodología Original de amplificación
Metodología Original de amplificación
Metodología Original de amplificación
Desarrollo del control positivo con Solanum sp.
Prueba Mayra Maldonado
Prueba Luis Castellanos
Pruebas con ITS-1
Pruebas con ITS-2
Con 1 μl de ADN
Con 2 μl de ADN
Con 3 μl de ADN
con polimerasa nueva
Visualizado en gel de agarosa al 0.5,1(Fig. 8) y 2% en
concentración
Visualizado en gel de agarosa al 0.5,1 y 2% en
concentración
Pruebas con Solanum sp. (Fig. 9)
Pruebas con Solanum sp. (Fig. 9)
Cambio en la concentración de magnesio (Fig. 10)
Cambio en la concentración de magnesio (Fig. 10)
Cambio en las temperaturas de alineación
Cambio en las temperaturas de alineación
Cambio en las temperaturas de alineación
Cambio en las temperaturas de alineación
Cambio en las temperaturas de alineación (Fig. 11)
Cambio en las temperaturas de alineación (Fig. 12)
Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
Cebador experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
Segundo experimento PCR tipo “touchdown” (Fig. 13)
34
Figura 8. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de orquídeas del género Lycaste (29). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de
la casa Sigma.
Otras pruebas con muestras del género Lycaste con el gen ITS-1 pueden observarse en la
figura 8. Observamos marcas tenues de los productos esperados, menos de 500pb, en las
columnas de la 2 a la 7. En las columnas 8 y 9 presentan las marcas más visibles, pero
con mucho barrido. Los controles positivos de macuy funcionaron.
Se utilizó material fresco de macuy (Solanum sp.) para producir los controles positivos y
confirmar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la figura 9 observamos los
resultados de dicha prueba para los genes ITS-1 e ITS-2. Para el gen ITS-1 hay banda del
tamaño de producto esperado (~300 pb) en las columnas 1 y 4. Para ITS-2 hay reacción
positiva en 1, 2 (la más visible) y 4. Esto muestra que aunque se tenga ADN total
suficiente, y la PCR tenga los reactivos en buen estado no siempre se obtendrán los
productos esperados.
En las ocasiones que se lograron obtener productos, estos fueron muy débiles (Fig. 10).
Esto puede deberse a: concentración de cebadores baja, cantidad necesaria de ciclos
insuficientes o tiempo de extensión muy corto. Aun así se observa que hay al menos dos
tamaños diferentes en los productos de ITS-1 de diferentes especies de Lycaste, comparar
columna 1 (tamaño pequeño) con columnas 2, 4, 5 y 6 (tamaño grande) en la Fig. 10.
Para ITS-2 no se puede tener una conclusión válida debido a los barridos presentes en las
columnas.
35
Figura 9. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Solanum sp (1-5). Ccontrol negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “PCR marker” de
la casa Sigma.
Figura 10. Amplificación del gen ITS-1 e ITS-2 en muestras de Lycaste del Sección
Xanthanthae. La muestra 1 es Lycaste cochleata y las demás son de L. cruenta (2 a 6).
C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la
casa Sigma.
36
Figura 11. Amplificación del gen ITS-1 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en
cultivo en Baja Verapaz (2-11). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de
pesos moleculares “PCR marker” de la casa Sigma, en la columna 1 no se colocó
muestra.
Figura 12. Amplificación del gen ITS-2 en muestras de Lycaste skinneri var. rosea en
cultivo de Baja Verapaz (2-11). C- control negativo, C+ control positivo, L marcador de
pesos moleculares “PCR marker” de la casa Sigma, en la columna 1 no se colocó
muestra.
Las figuras 11 y 12 muestran los resultados obtenidos para los genes ITS-1 e ITS-2 en
muestras de Lycaste skinneri var. rosea provenientes de Baja Verapaz. No se logra tener
una buena resolución de las franjas obtenidas. Se pueden ver marcas del tamaño
esperado, más definidas en las columnas 6, 7 y 8 en la figura 11 y las columnas de la 7 a
la 11 en la figura 12. No se observa diferencia entre el tamaño de los fragmentos
obtenidos.
37
Los barridos se pueden presentar por diversas razones entre ellas se puede destacar
(Sigma, 2002):
-
Demasiados ciclos de amplificación de ADN.
Temperatura de desnaturalización muy baja
Tiempo de extensión muy largo.
Exceso de ADN polimerasa en la mezcla de reacción.
Concentración de magnesio muy alta.
Concentración de los cebadores muy alta.
PCR del tipo “Touchdown” es recomendable.
La PCR “Touchdown” sirve para simplificar la determinación de la temperatura óptima
de alineamiento de los cebadores. El concepto se basa en que cualquier diferencia en las
temperaturas de fusión, correcta e incorrecta, será corregida y no importa que tan
inespecífica sea la reacción, se obtendrá un producto favorable (Court, 2001; Don et al.,
1991). En la figura 13 se observa la prueba con tres genes y tres muestras para esta
técnica
En las muestras presentadas encontramos grandes franjas (o barridos) de ADN en lugar
de encontrar bandas angostas y definidas. La figura 14 presenta los productos para el gen
matK en diferentes especies de Lycaste de la sección Xanthanthae obtenidas con
anterioridad (datos no publicados) que muestran la resolución necesaria para poder hacer
secuenciación. Muestras del ADN total extraído de varias plantas se llevaron al
laboratorio del Dr. Paul Manos, Departamento de Biología, Universidad de Duke,
Carolina del Norte, en Estados Unidos, para ayudarnos a determinar posibles fuentes de
error. El Dr. Manos (com. pers., 2003) estima que el ADN se encontraba en poca
cantidad o degradado, por lo que no continuó con ningún tipo de análisis.
Ninguno de los productos obtenidos durante la fase de trabajo de este proyecto presenta
la resolución encontrada en experimentos anteriores por lo que no se logró pasar a la
siguiente etapa de secuenciación manual de los productos obtenidos por la PCR. Se cree
que Lycaste skinneri presenta otros tipos de interferentes que no fueron encontrados en
las especies analizadas de este género con anterioridad.
Se cree que los interferentes pueden ser polifenoles, ADNasas y ARN. Por no poder
realizar los viajes de campo planificados, no se pudo utilizar material foliar fresco en
todas las extracciones, sólo 15 de las 45 muestras de Lycaste skinneri eran frescas. Por
esta razón se cree que el material almacenado en refrigeración a –20ºC inició el proceso
de degradación de ADN antes de que se pudiera extraer.
38
Figura 13. Metodología de PCR touchdown con tres distintas muestras de Lycaste
skinneri var. rosea (1, 2, 3) utilizado 3 cebadores (A=matK, B=ITS-1 y C=ITS-2). Ccontrol negativo, C+ control positivo, L marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa
Sigma.
Figura 14. Producto esperado de seis muestras de Lycaste de la sección Xanthanthae
utilizando cebadores para el gen matK realizado en el año 2000 (datos no publicados). L,
marcador de pesos moleculares “1 Kb” de la casa Sigma.
39
D. Cultivo de Tejidos in vitro
El medio de siembra más utilizado en este proyecto fue el Knudson, por ser el más
general. Los medios de cultivo ½ MSO y NA, ½ MSO y agua de coco, MSD20 (pH=5.8)
y MSDO (pH=7.0) fueron utilizados solamente para un tipo de meristemo; raíces,
semillas, hojas y raíces, respectivamente. El medio Vacin y Went fue utilizado para
sembrar tejidos foliosos (hojas y partes florales). El medio de Hill con agua de coco
utilizado es específico para semillas de orquídea y se utilizó para confirmar su eficacia
con otras partes de la planta.
En el cuadro 8 encontramos la cantidad de muestras sembradas por medio durante este
proyecto. Para cada muestra se contaron con al menos tres pedazos de planta por
recipiente. En el caso de semillas no se contabilizaron exhaustivamente, pero fueron
sembradas cientos por recipiente. A estos datos se les aplicó un análisis de χ2 con un
resultado de 664.32 (grados de libertad = 21) por lo que la probabilidad de que estos
datos sean comparables es de 0.0000. Debido a esto, no se realizó ningún análisis
estadístico posterior.
No se logró obtener mucho material en condiciones óptimas para desarrollar clones por la
poca cantidad disponible en cultivos privados de la capital, ya que se podía dañar
permanentemente a la planta donadora. Los tejidos debían ser jóvenes y vigorosos para
poder resistir el manejo y proceder de plantas sin enfermedades, como virus y bacterias.
Al compartir laboratorio de cultivo no se cuenta con las condiciones óptimas de
temperatura, luz y humedad para todas las especies cultivadas. Esto colaboró con la
mortalidad de plantas por infecciones de hongos y bacterias.
Las repeticiones de varios tipos de cultivos se encontraban en el mismo envase de
cultivo. Al contaminarse una porción vegetal, se contaminan las demás y se perdía todo
el material de ese individuo.
Por la consistencia del medio y del tejido sembrado hubo problemas de desecamiento en
el caso de los tejidos foliosos. Debido a lo anterior, se cambió el tipo de medio en el cual
se sembraron estos tejidos. Para futuros proyectos se recomienda que los tejidos foliosos
se coloquen en medios líquidos para evitar su desecación. En el tiempo que se llevó a
cabo este estudio solamente tres meristemos produjeron embriones listos para explantar.
El resto de material sembrado que sobrevivió no ha desarrollado embriones. Las semillas
si presentaron un mayor porcentaje de germinación (76%), pero las plantas provenientes
de estas pueden tardar hasta 10 años en producir flores (Dix, com. pers.).
En la Fig. 15 observamos las plantas que sobrevivieron y las que no para cada medio.
Las partes vegetativas que produjeron embriones listos para ser transvasados fueron el
tallo de la flor y las raíces. Las hojas aunque han sobrevivido por más tiempo no han
presentado crecimiento de embriones que puedan ser transvasados. Las semillas tienen
una buena tasa de sobrevivencia. Las causas de muerte para las partes de la planta en el
cultivo in vitro fueron por ataque de hongos, bacterias, en general, o desecamiento en el
caso de hojas y partes florales foliosas.
40
Cuadro 8. Cantidad de muestras sembradas en los diferentes medios.
Órgano
Sembrado
MSO
MSO +
NAA+BA coco
0
0
MSO
Flor
8
Medios de Cultivo
Hill +
Knudson
coco
1
13
MSD20 MSDO Vacin & TOTAL
pH=5.8 pH=7.0 Went
0
0
4
26
% Fila
30.8
0
0
3.8
50
0
0
15.4
100
% Columna
26.7
0
0
3.4
36.1
0
0
26.7
20.6
Hoja
0
0
0
0
10
4
0
11
25
% Fila
0
0
0
0
40
16
0
44
100
19.8
% Columna
0
0
0
0
27.8
100
0
73.3
raíces
20
5
0
3
11
0
2
0
41
% Fila
48.8
12.2
0
7.3
26.8
0
4.9
0
100
% Columna
66.7
100
0
10.3
30.6
0
100
0
32.5
Semillas
2
0
5
25
2
0
0
0
34
100
% Fila
5.9
0
14.7
73.5
5.9
0
0
0
% Columna
6.7
0
100
86.2
5.6
0
0
0
27
TOTAL
30
5
5
29
36
4
2
15
126
% Fila
23.8
4
4
23
28.6
3.2
1.6
11.9
100
% Columna
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Foliosos
20
18
Pruebas
Específicos
20
Raices
16
16
14
14
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
18
16
Muertas
Vivas
0
A
20
Hojas
18
B
C
D
E
F
G
H
A
20
Partes
C
D
E
F
G
H
C
D
E
F
G
H
Semillas
18
Florales
B
16
14
14
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
0
A
B
C
D
E
F
G
H
A
B
Figura 15. Partes de plantas de Lycaste vivas y muertas en los diferentes medios de
cultivo. Los medios utilizados son A) ½ MSO; B) ½ MSO y NA; C) ½ MSO y agua de
coco; D) HILL y agua de coco; E) KNUDSON; F) MSD 20 pH=5.8; G) MSDO pH=7;
H) Vacin & Went.
41
VII. CONCLUSIONES
1. La diversidad genética de Lycaste skinneri, basada en morfología, encontrada ex
situ, en colecciones privadas, está bien representada.
Análisis Morfológico
2. El análisis morfométrico muestra 8 grupos de caracteres medidos que agrupan los
diferentes tamaños de las flores de las plantas dentro de Lycaste skinneri.
3. Basados en los datos utilizados no podemos separar a Lycaste skinneri en grupos
más pequeños.
4. Los datos morfológicos muestran una tendencia a aumentar el tamaño de la flor
de las poblaciones en el Sur hacia el área de las Verapaces.
Análisis Genético
5. Se encontró diversidad de tamaño entre los fragmentos amplificados de las
Lycaste de la sección Xanthanthae con los de la sección Macrophyllae donde se
encuentra la Monja Blanca.
6. No se logró hacer una evaluación exhaustiva de Lycaste skinneri con la
información proporcionada por los genes matK, ndhF, ITS-1 e ITS-2
amplificados.
Cultivo in vitro
1. En el cultivo de tejidos se logró poca producción de embriones a partir de
meristemos.
2. Los meristemos que lograron producir un embrión que se pueda explantar son los
de partes florales y raíces.
3. Los pedazos de hojas presentan una alta tasa de sobrevivencia pero no tienen una
alta producción de embriones explantables.
4. Las semillas tienen buena sobrevivencia (76%).
5. Se ha iniciado el establecimiento de un banco de germoplasma de las orquídeas
del género Lycaste en la Universidad del Valle de Guatemala.
42
VIII. RECOMENDACIONES
Administrativas
1. Informar por escrito las condiciones permitidas en los proyectos antes de que se
sometan a selección para los fondos. Por ejemplo, no se permitieron hacer viajes
de campo los fines de semana. La mayoría de investigadores tienen trabajo dentro
de la Universidad aparte de sus proyectos de investigación y el único tiempo
disponible para viajes es el fin de semana. En el caso del proyecto 59-00 tuvimos
que trasladar la cantidad autorizada para viáticos y gasolina a materiales y
suministros. Los viajes que se lograron realizar fueron llevados a cabo por los
Drs. Dix como parte de cursos del Departamento de Biología.
2. Funcionó muy bien el calendario de entrega de papelería, como informes, facturas
y planilla para los pagos mensuales. Fue muy útil, pero también deben
planificarse adecuadamente cuando las fechas de entrega coincidan con los
feriados y asuetos.
3. La compra de materiales y equipo se atrasó mucho porque no se había definido
que todas las compras aunque tengan un tercio del valor importándolas se deben
comprar a distribuidores nacionales.
4. La obtención de requisiciones que cumplieran todas las condiciones necesarias
para la SENACYT en el extranjero atrasó mucho el inicio del análisis genético.
No se esperaban problemas de contaminación en los laboratorios para estos
análisis, en especial en la PCR y la secuenciación.
5. El inicio del proyecto debe coincidir con las fechas que sean más propicias para el
investigador. Por ejemplo la mejor época para colectar muestras de flores y hojas
de Lycaste skinneri debe ser entre noviembre y febrero de cada año. Después de
esta época las hojas son muy viejas y las plantas sólo florean una vez al año.
Análisis Morfológico
6. Se necesita realizar más viajes de campo para conseguir más flores de las
localidades sureñas en el país para agregar al análisis de componentes principales
y poder tener mejor representado a este grupo.
Análisis Genético
7. Tratar de conseguir más muestras de hoja frescas y jóvenes para extraer ADN
total.
8. Tratar de tener un laboratorio no compartido para evitar posibles contaminaciones
con organismos de otros reinos.
9. En proyectos futuros deben investigarse posibles interferentes a las reacciones en
cadena de la polimerasa incluyendo en los materiales ARNasas y otras enzimas
que sirven para eliminar interferentes.
Cultivo in vitro
10. Conseguir más muestras de meristemos en invernaderos privados que están fuera
de la capital. No se puede sacar mucho material de cada planta para evitar que se
dañe permanentemente.
43
11. Tratar de que las repeticiones de tejidos en los medios se encuentren en envases
individuales. Esto mejorará la calidad de los datos para un análisis estadístico
adecuado.
12. Tener en cuenta que los tejidos foliosos son muy delicados con respecto a la
humedad del cuarto y del medio de cultivo, por lo que es mejor sembrarlos en
medios con superficie líquida.
13. Tratar de tener un laboratorio no compartido con otros grupos en cultivo para
evitar posibles contaminaciones con bacterias y hongos provenientes de otros
organismos.
44
IX. BIBLIOGRAFÍA
Amersham Pharmacia Biotech.
1997. Hoefer® HE 99X MaxTM
Submarine
Electrophoresis Unit: User Manual.
Código del producto 80-6067-53.
Piscataway, New Jersey. 16pp.
Amersham Pharmacia Biotech. 1998. DyNA Quant© 200: Fluorometer User Manual.
Código del producto 80623124. Piscataway, New Jersey. 60 pp.
Ames, O y D.S. Correll. 1953. Orchids of Guatemala. Flora of Guatemala, Fieldiana:
Botany 26(2): 549-557.
Archila, F. 1998. Lycaste guatemalensis Archila, una nueva especie del género Lycaste
(Orchidaceae) en Guatemala. Guatemalensis (Cobán, Guatemala) 1(2): 1-19.
Bodo Slotta, T. A. 2000. Phylogenetic analysis of Iliamna (Malvaceae) using the
Internal Transcribed Spacer region. Tesis de Maestría, Departamento de
Biología. Virginia Polytechnic Institute and State University. 70pp.
Catala, R., B. Sabater y A. Guera. 1997. Expression of the plastid ndhF gene product in
photosynthetic and non-photosynthetic tissues of developing barley seedlings.
Plant Cell Physiology 38(2): 150-166.
Center for Plant Conservation. 1991. Genetic sampling guidelines for conservation
collections of endangered plants. Pp. 225-238. En D.A. Falk y D.E. Holsinger
(eds.). Genetics and Conservation of Rare Plants. Oxford University Press, New
York.
Chavarría Samayoa, J. A. 1982. La Monja Blanca: Lycaste virginalis var. alba
(Scheidw.) Lindl. Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación, Sector
Público Agropecuario y de Alimentación. Unidad de Comunicación Social,
Guatemala. 31 pp.
Clark, L. G., W. Shang y J.F. Wendel. 1995. A phylogeny of the grass family (Poaceae)
based on ndhF sequence data. Systematic Botany 20(4): 436-460.
Coleman, A. W. 1985. Diversity of the plastid configuration among classes of Eucariotic
algae. Journal of Phycology. 21: 1-16.
Court,
M.
2001.
Basic
“Touchdown
PCR”
technique.
http://www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/PCR-basic.doc.
Cruzan, M. B., M. L. Arnold, S. E. Carney y K. R. Wollenberg. 1993. cpDNA
inheritance in interspecific crosses end evolutionary inference in Lousiana irises.
American Journal of Botany 80(3): 344-350.
Dix, M. A. y M. W. Dix. 2000. Orchids of Guatemala: a revised annotated checklist.
Monographs in Systematic Botany 78, Missouri Botanical Garden Press,
Missouri. 61pp.
Dix, M. A. y M. W. Dix. 2001. La distribución de orquídeas y su implicación en cuanto
al diseño de sistemas de áreas protegidas. Programa de 2º. Seminario
mesoamericano de orquideología y conservación, San José (Costa Rica, resumen
de ponencias): 16.
Dix, M. W. Y M. A. Dix. 1992. Radiation of the genus Lycaste in Northern
Mesoamerica. Selbyana (Symposium Abstracts) 13: 151.
Domínguez, C.A., L. E. Eguiarte, J. Núñez-Farfán y R. Dirzo. 1998. Flower
morphometry of Rhizophora mangle (Rhizophoraceae): Geographical variation
in Mexican populations. American Journal of Botany 85(5): 637-643.
45
Don, R.H., P. T. Cox, B. J.Wainwright, K. Baker y J. S. Mattick. 1991. 'Touchdown'
PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids
Research 19(14): 4008.
Dowling, T. E., C. Moritz, J. D. Palmer y L. H. Riesberg. 1996. Nucleic Acids III:
Analysis of Fragments and Restriction Sites. Pp. 249-320. En D. M. Hills, D.
Moritz y B. K. Mable (eds.). Molecular Systematics. 2a. edición. Sinauer,
Sunderland (MA).
Doyle, J. J. y J. L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. FOCUS
12(1): 13-15.
Dressler, R. L. 1981. The Orchids: Natural History and Classification. Harvard
University Press, Massachusetts. 332 pp.
Edwards, K., C. Johnstone y C. Thompson. 1991. A simple and rapid method for de
preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research
19:1349.
Endangered Species Act. 1995. Science and the Endangered Species Act. Committee
on Scientific Issues in the Endangered Species Act, National Research Council.
National Academy Press, Washington, DC. 288pp.
Fowlie, J. A. 1970. The Genus Lycaste: Its speciation, distribution, literature, and
cultivation; a monographic revision. Day Printing Corporation, California. 90pp.
Freudestein, J. V. y J. J. Doyle. 1994. Plastid DNA, morphological variation and the
phylogenetic species concept:
The Corallorhiza maculata (Orchidaceae)
complex. Systematic Botany 19(2): 273-290.
Gauch, H. G., Jr. 1982. Multivariate Analysis in Community Ecology. Cambridge
Studies in Ecology. Cambridge University Press, Reino Unido. 298pp.
González, D. O., N. Palacios, G. Gallego y J. Tohme. 1995. Protocolos para Marcadores
Moleculares. Unidad de Investigación en Biotecnología, Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT). Publicación CIAT 258. Cali, Colombia. 82pp.
González, H., Sagastume, H. y Franco E. 1999.XLV Reunión Anual PCCMCA:
Memoria de resúmenes. Evaluación de medios de cultivo y reguladores del
crecimiento para la micropropagación de Monja Blanca (Lycaste skinneri var.
alba). Programa cooperativo centroamericano para el mejoramiento de cultivos y
animales. 82pp.
Grant, V. 1989. Especiación Vegetal. Editorial Limusa, México, D. F. 587pp.
Hall, R.D. 2000. Plant cell culture initiation: Practical Tips. Molecular Biotechnology.
16:161-173.
Hamer, F. 1983. Icones Plantarum Tropicarum. The Marie Selby Botanical Garden.
Plates 827, 828 y 831.
Hamer, F. 1988. Orchids of Central America: An Illustrated Field Guide. Selbyana 10
(suplemento, 1): 407-421.
Hietz, P. 1998. Diversity and conservation of epiphytes in a changing environment.
Pure
and
Applied
Chemistry
70(11).
11pp.
URL:
http://www.iupac.org/symposia/proceedings/phuket97/hietz.html.
Hilu, K.W. 1987. Chloroplast DNA in the Systematics of Poaceae. En Soderstrom,
Hilu, Campbell y Barkworth (Eds.). “Grass Systematics and Evolution”
Smithsonian Institute Press. Washington, D. C. Pp. 65-72.
46
Hilu, K.W. y Liang, H. 1997. The matK gene: sequence variation and application in
plant systematics. American Journal of Botany. 84(6): 830-839.
Hiratsuka, J., H. Shimada, R. Whittier, T. Ishibashi, M. Sakamoto, M. Mori, C. Kondo,
Y. Honji, D. Sun, B. Meng, Y. Q. Li, A. Kanno, Y. Nishizawa, A. Hirai, K.
Shinozaki y M. Siguria. 1989. The complete sequence of the rice (Oryza sativa)
chloroplast genome: Intermolecular recombination between distinct tRNA genes
account for major plastid DNA inversion during the evolution of cereals.
Molecular and General Genetics 217: 185-194.
Hoy, M.A. 1994. Insect Molecular Genetics: An introduction to principles and
applications. Academic Press, San Diego. 546pp.
Johnson, D. E. 2000. Métodos Multivariados Aplicados al Análisis de Datos.
International Thompson Editores. México, D. F. 566pp.
Johnson, L. A. y D. E. Soltis. 1995. Phylogenetic inference in Saxifragaceae sensu
stricto and Gilia (Polemioniaceae) using matK sequences. Annals of the Missouri
Botanical Garden 82: 149-175.
Jongman, R. H. G., C. J. F. TerBraak y O. F. R. VanTongeren. 1995. Data Analysis in
Community and Landscape Ecology. Cambridge University Press, Reino Unido.
299pp.
Judd, W. S., C. S. Campbell, E. A. Kellog y P. F. Stevens. 1999. Plant Systematics: A
phylogenetic approach. Sinauer, Sunderland (MA). 410pp.
Kim, K. J. y R. K. Jansen. 1995. ndhF sequence evolution and major clades in the
sunflower family. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 92:
10379-10383.
Lawrence, G. H. M. 1957. Selected Families of Vascular Plants. Illustrated Glossary of
Taxonomic Terms. The MacMillan Company, New York. Pp 737-775.
Liang, H. 1997. The Phylogenetic Reconstruction of the Grass Family (Poaceae) Using
matK Gene Sequences. Ph D. in Biology Thesis Dissertation submitted to the
Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University.
MacDade, L. 1990. Hybrids and phylogenetic systematics. I. Patterns of character
expression in hybrids and their implications for cladistic analysis. Evolution
44(6): 1685-1700.
Macz, O. E. 1995. Manual para la propagación de orquídeas in vitro. Programa de
Fortalecimiento Académico de las Sedes Regionales. Universidad Rafael
Landívar, Guatemala. 59pp.
Maldonado, M. L. 2001. Hibridación natural y relaciones genéticas entre Lycaste
cochleata, L. cruenta y L. suaveolens (Orchidaceae) en Guatemala. Tesis de
Licenciatura, Universidad del Valle de Guatemala.
McGarigal, K., S. Cushman y S. Stafford. 2000. Multivariate Statistics for Wildlife and
Ecology Research. Springer-Verlag, New York. 283pp.
Molina Cano, J. L. 1977. Introducción a la Taxonomía Numérica. Monografía 52.
Departamento de Biología Vegetal, ETS Ingenieros Agrónomos. Universidad
Politécnica de Madrid, Madrid. 80 pp.
Neyland, R. y L. E. Urbatsch. 1995. A terrestrial origin for the Orchidaceae suggested
by a phylogeny inferred from ndhF chloroplast gene sequences. Lindleyana 10(4):
244-251.
47
Neyland, R. y L. E. Urbatsch. 1996. Evolution in the number and position of fertile
anthers in Orchidaceae inferred from ndhF chloroplast gene sequences.
Lindleyana 11(2): 47-53.
Oakeley, H. F. 1991. Lycaste skinneri: Hybridization in Nature and in Cultivation.
American Orchid Society Bulletin 60(8): 738-747.
Oakeley, H. F. 1993. Lycaste species: the essential guide. Vigo Press, London. 34 pp.
Olmstead, R. G. y J. D. Palmer. 1994. Chloroplast DNA systematics: a review of
methods and data analysis. American Journal of Botany 81(9): 1205-1224.
Olmstead, R. G. y P. A. Reeves. 1995. Evidence for the polyphyly of the
Scrophulariaceae based on chloroplast rbcL and ndhF sequences. Annals of the
Missouri Botanical Garden 82(2): 176-193.
Olmstead, R. G., J. A. Sweere y K. H. Wolfe. 1993. Ninety extra nucleotides in ndhF
gene in tobacco chloroplast DNA: A summary of revisions to the 1986 genome
sequence. Plant Molecular Biology 22(6): 1191-1193.
Olmstead, R.G., C. W. DePamphilis, A. D. Wolfe, N. D. Young, W. J. Elisons, y P. A.
Reeves. 2001. Disintegration of the Scrophulariaceae. American Journal of
Botany 88 (2): 348-361.
Palmer J. D. y W. F. Thompson. 1981. Rearrangement in chloroplast genomes of Mung
Beans and Peas. Proceedings of the National Academy of Science. 78: 55335537.
Palmer, J. D. 1987. Chloroplast DNA evolution and biosystematic uses of chloroplast
DNA variation. The American Naturalist 130 (suplemento): S6-S29.
Palmer, J. D. 1985. Evolution in the Chloroplast and Mitochondrial DNA in plants and
algae. En MacIntyre (ed.) “ Monographs in Evolutionary Biology: Molecular
Evolutionary Genetics”. Plenum Press. New York. P. 131-240.
Palumbi, S. R. 1996. Nucleic Acids II: The Polymerase Chain Reaction. Pp 205-247.
En D. M. Hills, C. Moritz y B. K. Marble (eds.) Molecular Systematics. 2a. ed.
Sinauer, Sunderland (MA).
Petit, R. J., E. Pineau, B. Demesure, R. Bacilieri, A. Ducousso y A. Kremer. 1997.
Chloroplast DNA footprints of postglacial recolonization by oaks. Proceedings of
the National Academy of Sciences (EE.UU.) 94: 9996-10001.
Puertas Gallego, M. J. 1999. Genética: fundamentos y perspectivas. 2ª. Edición.
MacGraw-Hill Interamericana, Madrid. 812pp.
Rieseberg, L. H. 1991. Hybridization in rare plants: insights from case studies in
Cercocarpus and Helianthus. Pp. 171-181. En D. A. Falk y K. E. Holsinger
(eds.). Genetics and Conservation of Rare Plants. Oxford University Press, New
York.
Rojas W., P. Barriga y H. Figueroa. 2000. Multivariate analysis of the genetic diversity
of Bolivian quinua germplasm. Plant Genetic Resource Newsletter 122: 16-23.
Ryan, A., W. M. Whitten, M. A. T. Johnston y M. W. Chase. 2000. A phylogenetic
assessment of Lycaste and Anguloa (Orchidaceae: Maxillarieae). Lindleyana
15(1): 33-45.
Saar, D. E. y N. O. Polans. 2000. ITS sequence variation in selected taxa of Pisum.
Pisum Genetics 32: 42-45.
48
Salazar, G. 2001. Filogenia molecular de las orquídeas spiranthoides. Programa del 2º.
Seminario Mesoamericano de Orquideología y Conservación. San José (Costa
Rica, resumen de ponencias): 31.
Sauder, J. D. 1988. Plant Migration: The dynamics of geographic pattering in seed
plants species. University of California Press, Berkeley. pp
Schaal, B. A., W. J. Leverich y S. H. Rogstad. 1991. A comparison of methods for
assessing genetic variation in plant conservation biology. Pp. 123-134. En D. A.
Falk y K. E. Holsinger (eds.). Genetics and Conservation of Rare Plants. Oxford
University Press, New York.
Sigma®. 2002. Technical Bulletin No. MB-410. 7pp.
Smith, J. F. y S. Atkinson. 1998. Phylogenetic analysis of the tribes Gloxinieae and
Gesnerieae (Gesneriaceae): data from ndhF sequences. Selbyana 19(1): 122-131.
Smith, J.F. 2000. Phylogenetic Resolution within the Tribe Episicieae (Gesneriaceae):
Congruenceo of ITS and ndhF sequences from parsimony and maximumlikelihood analysis. American Journal of Botany 87(6):883-897.
Sosa, V., M. W. Chase, G. Salazar, W. M. Whitten y N. H. Williams. 2001.
Phylogenetic position of Dignathe (Orchidaceae: Oncidiinae): Evidence from
nuclear ITS ribosomal DNA sequences. Lindleyana 16(2): 94-101.
Soto Arenas. 2001. Evolución y recursos genéticos de Vanilla. Programa del 2º.
Seminario Mesoamericano de Orquideología y Conservación. San José(Costa
Rica, resumen de ponencias): 32.
SPSS. 1998. SYSTAT 8.0. Software and User’s Manuals. Prentice-Hall. New Jersey.
Szalanski, A. L., G. Steinauer, R. Bishof y J. Petersen. 2001. Origin and conservation
genetics of the threatened Ute Ladies’-tresses, Spiranthes diluvialis
(Orchidaceae). Anerican journal of Botany 88(1): 177-180.
Terry, R. G., G. K. Brown y R. G. Olmstead. 1997. Examination of subfamilial
phylogeny in Bromeliaceae using comparative sequencing of the plastic locus
ndhF. American Journal of Botany 84(5): 664-670.
Terry, R.G., Brown, G.K. y Olmstead, R.G. 1997. Examination of subfamilial phylogeny
in Bromeliaceae using comparative sequencing of the plastid locus ndhF. Am. J.
Bot. 84: 664.
Theriot, E. y E. F. Stoermer. 1984. Principal component analysis of variation in
Stephanodiscus rotula and S. niagarae (Bacillariophyceae). Systematic Botany
9(1): 53-59.
Tinschert, O. 1983. Lycaste of Guatemala- some natural hybrids, some species, and
many questions. American Orchid Society Bulletin 52(9): 908-916.
Torres, A. M., N. F. Weeden y A. Martín. 1993. Linkage among isozyme, RFLP and
RAPD markers in Vicia faba. Theoretical and Applied Genetics, 85: 973-945.
Zar, J.H. 1999. Biostatistical Análisis. 4ª. Edición. Prentice-Hall. New Jersey. 663pp.
49
X. ANEXOS
50
ANEXO A
SOLUCIONES MADRE ANÁLISIS GENÉTICO
Solución madre de Ácido Etilendiamino Tetracético Disódico (EDTA Na2), al 0.5 M
-Sal disódica de EDTA* H2O
18.6 g
-Agua desionizada
70.0 ml
-Hidróxido de sodio(10M) hasta llegar a pH=8 aproximadamente 5 ml. Aforar con agua
desionizada hasta 100 ml.
Solución madre de Trisma-Base, Ácido Bórico y EDTA (TBE) 10X
-Trisma-Base
108.0 g
-Ácido Bórico
55.0 g
-Solución EDTA(0.5 M, pH=8)
40 ml
-Aforar con Agua destilada hasta llegar a 1000 ml
Solución Amortiguadora TNE 10X
En 800ml de agua destilada, disolver:
-Trisma-Base
12.1 g
-Sal disódica de EDTA
3.7 g
-Cloruro de Sodio
58.4 g
-Ajustar pH a 7.4 con HCl.
-Completar con agua destilada hasta 1,000 ml.
-Filtrar y almacenar a 4º C
51
ANEXO B
MEDIOS DE CULTIVO IN VITRO
MURASHIGE & SKOOG Original (MSO)
MS macros
50 ml
MS micros
0.5 ml
Calcio (Ca)
5 ml
Hierro (Fe)
5 ml
Vitamina B5
1 ml
Sacarosa
15 g
Agua destilada para ajustar el volumen a un litro
pH
5.8
Gelrite
3g
MURASHIGE & SKOOG modificado con agua de coco
MS macros
50 ml
MS micros
0.5 ml
Calcio (Ca)
5 ml
Hierro (Fe)
5 ml
Vitamina B5
1 ml
Sacarosa
15 g
Agua de coco
50 ml
Agua destilada para ajustar el volumen a un litro
pH
5.8
Gelrite
3g
KNUDSON
MS Micro stock
Stock de hierro
Ca(NO3)2 4H2O
(NH4)2SO4
KH2PO4
MgSO4 7H20
Agua de coco
Sacarosa
Ajustar volumen a un litro
pH=5.5
Autoclavear y Dejar enfriar
Adenina
Stock NAA lmg/mL
Stock BA lmg/mL
1 mL
l0 mL
1g
0.5g
0.25g
0.25g
1ml
20g
0.002g
18.6 μl
180.24 μl
52
Otros medios utilizados únicamente para hojas y flores fueron:
MEDIO VACIN & WENT
MS Macro Stock
50 ml
MS Micro Stock
1 ml
Calcio Stock
5 ml
Hierro Stock
10 ml
Stock Vitamina B5
4 ml
Mn SO4 4H2O
0.0054 g
Ajustar volumen con agua destilada a un litro
pH
5.4
Gelrite
3.0 g
Autoclavear y dejar enfriar
Adenina
0.002 g
MEDIO MSD 20 (pH 5.8) con NAA y BA
MS Macro Stock
MS Micro Stock
Calcio (Ca)
Hierro (Fe)
Vitamina B5
2,4 diclorofenoxyacético (2.4 D)
Sacarosa
Agua destilada
Gelrite
pH
Autoclavear y Dejar enfriar
NAA stock l mg/mL
BA stock 1 mg/mL
100 ml
1 ml
10 ml
10 ml
2 ml
100 ml
30 g
Ajustar volumen a un litro
2g
5.8
18.6 μl
180.24 μl
MS Micro Stock
Compuesto Para ½ litro
H3BO3
3.1000g
MnSO4 H2O
8.4500g
ZnSO4 7H2O
4.3000g
Na2MoO4 2H20
0.1250g
CuSO4 5H2O
0.0125g
CoCl2 6H2O
0.0125g
KI
0.4150g
Ajustar volumen con agua destilada a 500ml
Autoclavear
53
MS Macro Stock, Compuesto Para ½ litro
NH4NO
16.5g
KNO3
19.0g
MgSO4 7H20
3.7g
KH2PO4
1.7g
Ajustar volumen con agua destilada a 500ml
Autoclavear
Medio MSO con NAA y BA, STOCK Para un litro
MS Macro
50 mL
MS Micro
0.5 mL
Calcio (Ca)
5 mL
Hierro (Fe)
5 mL
B5 Vitamina
1 mL
Sacarosa
15 g
Ajustar volumen con agua destilada a un litro
pH=5.8
Geltride
3g
Autoclavear
Dejar enfriar
NAA stock 1mg/mL
18.6 μl
BA stock 1mg/mL
180.24 μl
CALCIO Stock (100 X relativo a MS)
CaCl2.2H20
44.0 g
Ajustar con agua destilada a 500ml
HIERRO Stock (100 X relativo a MS)
EDTA Na2
3.730g
FeSO4. 7H20
2.780g
Ajustar con agua destilada a 500ml
NOTA: El EDTA debe estar completamente disuelto con NaOH (3 M) antes de agregar el
Hierro.
Vitamina B5 Stock (500X)
Tiamina. HCl
2.50g
Acido Nicotínico
0.25g
Piridoxina. HCl
0.25g
Mio-lnositol
25.00g
Agua destilada para ajustar a 500ml
54
ANEXO C.
INFORME FINANCIERO
RESUMEN DE LA EJECUCIÓN DEL PRESUPUESTO OTORGADO EL
PROYECTO FODECYT 59-00: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI
(BATEM. EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE
GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN
RUBRO
Servicios Técnicos
y Profesionales
Equipo
Materiales y
suministros
Combustible y
lubricantes
Publicación de
Resultados
Gastos no previstos
Gastos
Administrativos
Viáticos
APROBADO POR
FODECYT
Q. 62, 500.00
MONTO
EJECUTADO
Q. 61,707.62
Q. 16,160.00
Q. 36,376.00
Q. 1,600.00
Q. 12,730.00
Q. 33,278.42 +
$822.50*
No ejecutado
Q. 3,000.00
No ejecutado
Q. 1,500.00
Q. 12,533.60
No ejecutado
Q.12,533.60
Q. 4,200.00
Transferencia
OBSERVACIONES
Rubro de
Materiales y
Suministros
*Transacción realizada por SENACYT, se desconoce el cambio en quetzales por
dólar de EEUU.
55
INFORME DE LOS PAGOS DE HONORARIOS POR SERVICIOS EN EL
PROYECTO FODECYT 59-00: DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM.
EX LINDL.) LINDL. EN GUATEMALA: ANÁLISIS DE GERMOPLASMA
PARA SU CONSERVACIÓN.
Los pagos de honorarios por servicios personales se basan en los depósitos hechos por
FODECYT en la cuenta de depósitos monetarios número 81-01-54653-5 de
BANCAFE.
FECHA
MONTO DEPOSITADO MESES QUE
CORRESPONDE PAGO
en quetzales
20-11-2001
17-12-2001
29-01-2002
05-02-2002
01-04-2002
08-05-2002
10-06-2002
08-07-2002
13-08-2002
17-09-2002
TOTAL
MONTO APROBADO:
DIFERENCIA:
7,448.66
3875.00
5875.00
5813.62
11,627.24
5813.62
5813.62
5813.62
5813.62
3813.62
61,707.62
Q. 62,500.00
Q. 793.00
Septiembre y octubre 2001
Noviembre 2001
Diciembre 2001
Enero 2002
Febrero y Marzo 2002
Abril 2002
Mayo 2002
Junio 2002
Julio 2002
Agosto 2002
56
Ejecución del presupuesto aprobado por la Linea FODECYT correspondiente al
rubro de materiales y suministros en el
Proyecto FODECYT 59-00:
DIVERSIDAD DE LYCASTE SKINNERI (BATEM. EX. LINDL.) LINDL. EN
GUATEMALA: ANALISIS DE GERMOPLASMA PARA SU CONSERVACIÓN
Fecha
Descripción de materiales y
Empresa
No.
Fecha TOTAL TOTAL
Requisición suministros
Factura Factura en Q en US$
4/23/2002 10 cajas de 600 unidades cajas de MERCK C.A.
petri de poliestireno de 100 x
15mm
B13084 16-May-02 Q 4,510.50
4/25/2002 10 paquetes de papel plástico
DILAB S.A.
parafilm de 4" x 125 pies
C 15297 16-May-02 Q 1,512.00
4/25/2002 3 kilos de sucrosa (sacarosa)
SOL. ANAL
cristal
C00823 21-May-02 Q 744.78
5/7/2002
3M
10 cajas de 20 unidades
respirador para polvos y neblinas
A15908 7-Jun-02 Q 1,400.00
MERCK C.A.
5/14/2002 5 kilogramos de Maltosa
monohidrato
B14371 12-Jun-02 Q 2,000.00
5/13/2002 2 kilogramos Nitrato de potasio
P.A.
2 kilogramos Sodio Sulfato
Anhidro P.A.
1 kilogramo Sulfato Potasio P.A.
500 gramos Hierro Sulfato H.P.A. MERCK C.A.
B14363 12-Jun-02 Q 1,562.83
6/4/2002
SOL.
ANAL
3 frascos de 500 gramos EDTA
sal disódica deshidratada
C00819 21-Jun-02 Q 1,290.00
6/3/2002
4 litros propanol (iso) ACS
MERCK C.A.
2.5 litros Acido Acetico ACS
B17001 9-Aug-02 Q 464.55
PROMEGA
9/19/2002 2 Silver Sequence (TM) DNA
sequencing reagents, 100
reactions & freight
2200919 11-Oct-02
$523.00
11/11/2002 Poliza importación PROMEGA COMBEX IM
943074 30-Oct-02 Q
72.70
11/11/2002 Servicios Aduana PROMEGA
AGENCIA
TORUÑO
9/19/2002
5 Acrilamida 100 gramos
1 Bisacrilamida 250 gramos
1 Hexadecyltrimetilo OCTAB
1 TRIS HCl
1 PCR Marker
2 Genomic Ultrapure unit
4 DNTD´s 0.5 ML
1 Agarosa 100gr.
1 Minimum 99% titration,
Biotechnology
LABTRONIC
C13334 31-Oct-02 Q
417.87
57
Fecha
Descripción de materiales y
Requisición suministros
Empresa
500 G. Performance certified, cell LABTRONIC
culture tested
(continuación)
9/26/2002 2000 unidades microtubos con
tapadera de 1.5 ml
1920 unidades microtubos con
tapadera de 0.2 ml
2000 unidades microtubos con
tapadera de 0.5 ml
5 unidades gradillas para
microtubos
4 unidades cajas para almacenar ANAQUI
microtubos
8/22/2002 PRIMERS (CEBADORES)
10/11/2002 2000 unidades puntas
micropipetas 10 ul
2000 unidades puntas
micropipetas 200 ul
MERCK, SA
2000 unidades puntas
micropipetas 1000 ul
Total ejecutado
Cantidad aprobada
No.
Fecha TOTAL TOTAL
Factura Factura en Q en US$
351 22-Nov-02 Q18,103.19
$299.50
B11687 27-Jan-03 Q 1,200.00
Q33,278.42
Q40,576.00
Ejecución del presupuesto en el proyecto FODECYT 59-00 correspondiente al
rubro de equipo
Fecha
Requisición Descripción del Equipo
5/14/2002 1 unidad Cámara Sequi-gen Gt
38x50 cm
1 unidad Sequi-Gen II outer
glass plate 38x30 cm
Cantidad aprobada
Empresa
BIONUCLEAR
No. De
Factura
Fecha Total en
Factura Q
2496 18-Jul-02 Q12,730.00
Q16,160.00
$822.50