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Rev Panam Infectol 2011;13(2):8-11.
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Staphylococcus aureus meticilino-resistente adquiridos
en la comunidad: Detección de leucocidina de PantonValentine y su relación con el sitio de aislamiento en
pacientes de la ciudad de Santa Fe - Argentina
Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus:
PVL detection and its relationship with infection body sites in patients
from Santa Fe City, Argentina
Antonela Giusti1; María Rosa Baroni1,2; María Alejandra Mendosa1,3; Alicia Nagel3; Stella Virgolini4;
Cristina Ochoteco4; Analía Mollerach3; María Liliana Roldán5; Emilce de los Ángeles Méndez6
Bioquímica, Cátedra de Bacteriología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral,
Santa Fe, Argentina; 2Especialista en Bacteriología Clínica,
Hospital de Niños “Dr. Orlando Alassia”, Santa Fe, Argentina; 3Especialista en Bacteriología Clínica, Hospital “Dr. José
María Cullen”, Santa Fe, Argentina; 4Bioquímica, Hospital
de Niños “Dr. Orlando Alassia”, Santa Fe, Argentina; 5Master Microbiología Clínica, Profesora de Bacteriología, Cátedra
de Bacteriología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina;
6
Master Microbiología Clínica, Magister en Metodología de
la Investigación, Profesora de Bacteriología, Cátedra de
Bacteriología, Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas,
Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina.
1
Lugar donde se realizó el trabajo: Cátedra Bacteriología - Facultad de Bioquímica y Ciencias
Biológicas - Universidad Nacional del Litoral.
Paraje El Pozo (3000) Santa Fe, Argentina.
Rev Panam Infectol 2011;13(2):8-11.
Conflicto de intereses: ninguno
Recibido en 10/9/2010.
Aceptado para publicación en 20/2/2011.
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Resumen
Staphylococcus aureus meticilino-resistente (SAMR) es
una bacteria asociada a infecciones intrahospitalarias. Desde
1990 emergió como patógeno de la comunidad, SAMR-AC,
afectando a personas previamente sanas. Se caracteriza por
presentar staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec)
que le confiere resistencia a meticilina, siendo sensible al resto
de los antimicrobianos o resistente a no más de un antibiótico
no betalactámico. Su virulencia se asocia principalmente a
la leucocidina Panton-Valentine. Objetivos: a) confirmar la
meticilino-resistencia; b) determinar la prevalencia de los genes
pvl; c) relacionar su presencia con la muestra clínica, el grupo
etario y la evolución clínica. Se estudiaron 141 SAMR-AC: 70
de pediatría y 71 de adultos. Se investigaron los genes mec
A y pvl por PCR. Todos los aislamientos presentaron el gen
mec A. Del total, 92 (65%) fueron PVL (+) y 49 (35%) PVL
(-). De los PVL (+), 51 provenían de niños y 41 de adultos.
Respecto al sitio de aislamiento, 73 (79%) SAMR-AC PVL
(+) se recuperaron de piel y partes blandas (PPB) en ambas
poblaciones. Se produjo el deceso de 4 pacientes (2 niños y
2 adultos) portadores de SAMR-AC PVL (+). Conclusíon: a)
la detección fenotípica de la meticilino-resistencia coincidió
con la portación del mec A, b) existe una alta circulación de
SAMR- AC PVL (+) en la población estudiada, c) la recuperación de SAMR-AC PVL (+) se asoció principalmente a PPB y la
prevalencia fue similar para ambos grupos etarios. Se comprobó
SAMR-AC PVL (+) en los 4 pacientes fallecidos.
Palabras clave: SAMR adquiridos en la comunidad, mec
A, leucocidina Panton-Valentine.
Abstract
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an
Antonela G et al • Staphylococcus aureus meticilino-resistente adquiridos...
important agent associated with nosocomial infections.
Since 1990, community acquired meticillin-resistant
Staphylococcus aureus (CA-MRSA) has emerged as a
pathogen in previously healthy people. These isolates are
characterized by the SCCmec presence which confers
methicillin resistance. They are susceptible to the rest of
antimicrobial agents or resistant to no more than one not
betalactamic antibiotic. Its virulence is mainly associated
to Panton-Valentine leucocidin (PVL). The aims were: a) to
confirm meticiline-resistance; b) to determine pvl genes
prevalence; c) to relate its presence with the infection body
site, the age group and clinical evolution. One hundred
and forty one CA-MRSA were studied: 70 from paediatric
patients and 71 from adult ones. Mec A and pvl genes
were investigated by PCR. Mec A gene was confirmed in all
isolates. Sixty-five percent were PVL positive and thirty-five
percent were PVL negative. 51 (73 %) of the 70 paediatric
isolates and 41 (58 %) of the 71 adults ones carried pvl
genes. In regard to the infection body site, 73 (79 %) CAMRSA PVL (+) were recovered from skin and soft tissues
(SST) in both groups. We concluded that: a) the phenotypic
detection of methicilline-resistance was coincident with the
mec A presence in all isolates, b) there was a great number
of CA-MRSA PVL (+) circulating among the studied group,
c) there was not a statistically significant difference in the
PVL prevalence in age groups and d) MRSA - PVL (+) was
associated to SST in both pediatric and adults. CA-MRSA
PVL (+) caused four deaths (2 children and 2 adults).
Key words: Community acquired MRSA, mec A,
Panton-Valentine leukocidin.
Introducción
Desde la aparición de Staphylococcus aureus meticilinoresistente (SAMR) en Inglaterra en 1961, su incidencia ha
ido en constante aumento constituyéndose en uno de los
patógenos prevalentes en infecciones hospitalarias. Estas
cepas, de origen nosocomial (SAMR-AH), también se detectaron en la comunidad en pacientes que habían estado
hospitalizados previamente o que estaban en contacto con
el sistema asociado a cuidados de la salud. Sin embargo, la
epidemiología de SAMR ha ido cambiando con el transcurso
del tiempo. En los últimos años se ha observado un incremento de infecciones adquiridas en la comunidad causadas por
este microorganismo (SAMR-AC), en pacientes sin factores
de riesgo. Los primeros casos se reportaron en niños, posteriormente en adultos y se diseminaron por todo el mundo.(1,2)
La resistencia de Staphylococcus aureus a meticilina y
a todos los antibióticos betalactámicos es conferida por el
gen mec A que codifica una proteína ligadora de penicilina
alterada (PBP 2a), con baja afinidad por dichos antibióticos.
El gen mec A está localizado en el staphylococcal cassette
chromosome mec (SCC mec), elemento genético móvil
que se localiza en un sitio específico del cromosoma de
Staphylococcus aureus. El análisis del genoma de SAMR
permitió definir la presencia de tres tipos de SCCmec (I, II,
III) entre los SAMR-AH y otros tipos SCCmec (IV, V, VII) entre los SAMR-AC. Tres importantes marcadores genotípicos
distinguen los aislamientos de SAMR-AH de SAMR-AC: su
linaje genético, la arquitectura de SCCmec y la frecuente
presencia de la leucocidina de Panton-Valentine (PVL).(3,4,5)
El modelo actual aceptado para explicar el origen de
los SAMR-AC establece que, el cassette de resistencia
a meticilina más pequeño (SCCmec IV) se transmite
horizontalmente y se integra de forma independiente al
genoma bacteriano de cepas ancestrales de Staphylococcus aureus meticilino-sensible (SAMS), que ocupaban
nichos tradicionalmente comunitarios y circulaban en
distintas regiones geográficas.(1)
Datos clínicos y epidemiológicos muestran que la alta
virulencia de los SAMR-AC está asociada con la presencia
de diversos genes; entre ellos los más estudiados hasta
el momento son lukS-PVL y lukF-PVL, que codifican las
subunidades de la leucocidina de Panton-Valentine (PVL).
Dicha leucocidina es una citotoxina, codificada por un
bacteriófago, que produce la lisis de leucocitos. En 1932
fue por primera vez asociada a infecciones de piel y partes
blandas (PPB). Su toxicidad involucra la acción de dos exotoxinas; clase S y clase F, las cuales permiten la formación
de un poro transmembrana que causa la muerte celular,
llevando a un proceso de necrosis tisular por estimulación
de mediadores de la respuesta inflamatoria.(4)
Las infecciones que más frecuentemente se han asociado a SAMR-AC son las relacionadas con piel y tejidos
blandos (PPB), bacteriemias y también casos de infecciones graves, como neumonía necrotizante y osteomielitis,
tanto en niños como en adultos previamente sanos.(1,2,6,7)
Los objetivos del trabajo fueron: a) confirmar la
meticilino-resistencia a través de la detección del gen
mec A; b) determinar la prevalencia de los genes pvl;
c) relacionar la presencia de los genes pvl con el grupo
etario y d) relacionar la presencia de los genes pvl con
los sitios de aislamientos y evolución clínica.
Materiales y métodos
Pacientes
Se analizaron retrospectivamente las historias clínicas de 141 pacientes ambulatorios, previamente sanos,
con diagnóstico de infección por Staphylococcus aureus
meticilino-resistente adquiridos en la comunidad (SAMRAC), que concurrieron a dos hospitales de la ciudad de
Santa Fe, Argentina, durante el período 2007-2009. Los
motivos de consulta fueron: infecciones severas, tales
como abscesos, celulitis, impétigo y neumonía. Del total,
70 eran niños y 71 adultos.
Aislamientos bacterianos
Se estudiaron 141 aislamientos de Staphylococcus
aureus meticilino-resistentes, sensibles al resto de los
antibióticos ensayados.
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Pruebas de sensibilidad
Se realizó el método de difusión con discos en agar
medio Müeller Hinton (Laboratorio Britania, Argentina)
para comprobar la resistencia fenotípica. Se incubaron
las placas durante 24 h a 35ºC según las normas del
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (8).
Se ensayaron los siguientes antimicrobianos: oxacilina (1
µg), cefoxitina (30 µg), gentamicina (10 μg), eritromicina
(15 μg), clindamicina (2 μg), trimetoprimasulfametoxazol
(1,25/23,75 μg), ciprofloxacina (5 μg), minociclina (30
μg), rifampicina (5 μg), vancomicina (30 μg) y teicoplanina (30 μg) (Laboratorio Britania, Argentina). Se utilizó la
prueba del doble disco (eritromicina-clindamicina) para
detectar el mecanismo de resistencia MLSb.
Estudios genotípicos
Extracción del ADN: A partir de aislamientos de 24 hs,
se realizó un inóculo 0,5 Mc. Farland en Tris-EDTA pH: 8
- 0,1M. Se llevó a ebullición 15 min y luego se centrifugó
5 min a 10.000g para eliminar los restos celulares. El
sobrenadante se usó como templado para la Multiplex PCR.
PCR: A todos los aislamientos se les realizó PCR para
investigar la presencia de los genes mec A, pvl y 16S
rRNA como control de amplificación, usando cebadores
previamente descriptos (9, 10,11). La amplificación fue
hecha en un termociclador Eppendorf Master, siendo el
volumen final de reacción de 25 µl, conteniendo buffer
1X de PCR (Invitrogen), 3 mM MgCl2, 200 µM de cada
dNTP, 0.2 µM de cada cebador, 1 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y 2,5 µl de ADN blanco.
Las muestras fueron desnaturalizadas durante 5
min a 94ºC, seguido de 30 ciclos de: desnaturalización
a 94ºC durante 30 seg, hibridación a 52ºC durante 30
seg, extensión a 72ºC 30 seg y una extensión final a
72°C durante 5min.
Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% con Bromuro de Etidio 0,5 μg/ml.
Se usaron como controles positivos para PCR las
siguientes cepas: Staphylococcus aureus meticilinoresistente ATCC 43300 y Staphylococcus aureus
meticilino-resistente portadora de PVL, cedida por la
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de
Salud (ANLIS) “Dr. Carlos Malbrán”, Instituto Nacional
de Enfermedades Infecciosas - Buenos Aires, Argentina.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Fisher. Se investigó la proporción de los genes pvl en niños y adultos para los distintos
sitios de aislamientos y se completó con el cálculo de
IC95% de la proporción estimada.
Resultados
Se constató la presencia del gen mec A en todos los
aislamientos. Del total (adultos y pediátricos), 92 (65%)
fueron PVL positivos y 49 (35%) PVL negativos.
10
De los aislamientos de pacientes pediátricos, 47 se
recuperaron de PPB, 20 de hemocultivo y 3 de otras
muestras clínicas. Se detectó la presencia de genes pvl
en 51 de los aislamientos, 38 de los cuales correspondieron a PPB con una prevalencia puntual igual a 0,81
(IC95%: 0,70; 0,92). De los aislamientos de sangre, 11
portaban los genes pvl.
Con respecto a los pacientes adultos, 59 SAMR provenían de PPB, 6 de hemocultivo y 6 de otras muestras
clínicas. Se confirmó la presencia de los genes pvl en 41
aislamientos, 35 de los cuales correspondieron a PPB con
una prevalencia puntual igual a 0,59 (IC95%: 0,47; 0,72).
En la población pediátrica, se observó sepsis clínica
y shock séptico en 14 pacientes con SAMR-AC PVL (+) y
en 5 con PVL (-). Se constató óbito en dos pacientes con
SAMR-CA PVL (+) y no hubo fallecimiento en el grupo
de pacientes con SAMR-CA PVL (-).
En la población adulta se produjeron dos decesos. El
primero correspondió a un paciente joven que ingresa con
cuadro respiratorio, desarrolló una neumonía necrotizante
y sepsis. El segundo caso se trató de una mujer de 40
años que comenzó con dolor agudo lumbar y un registro
febril; fue tratada con antiinflamatorios y betalactámicos
no registrando mejoría; posteriormente ingresa en mal
estado general con dolores abdominales, insuficiencia
respiratoria siendo derivada a Unidad de Cuidados Intensivos donde fallece.
En ambos pacientes se aisló de hemocultivos SAMRAC PVL (+).
Discusión y Conclusión
Este estudio presenta casos de infecciones producidas
por SAMR-AC en individuos previamente sanos provenientes de dos grupos etarios. Todos los aislamientos obtenidos
demostraron ser portadores de los genes que codifican para
PBP2a, lo que guarda relación con los resultados de los
ensayos de difusión con discos.
En la población pediátrica, al analizar los sitios de
aislamientos utilizando el estadístico Exacto de Fisher
se obtuvo un valor de p=0,069, lo que indica que no hay
diferencia altamente significativa entre la asociación de
PVL y sitio de aislamiento. Si se compara los aislamientos provenientes de PPB y hemocultivo, siendo éstos los
de mayor tamaño muestral, se observó una diferencia
estadísticamente significativa (p=0,038).
Respecto a los aislamientos provenientes de pacientes adultos, aplicando el estadístico Exacto de Fisher, se
obtuvo un p=0,0627, lo cual está indicando que no hay
diferencia altamente significativas entre SAMR-AC PVL
(+) y sitio de aislamiento. Contrariamente a lo demostrado
en niños, si se compara PPB y hemocultivo no se encuentran diferencias entre las proporciones de la presencia de
los genes pvl (p=0.390). Este procedimiento puede estar
afectado por el desbalanceo de los tamaños muestrales.
Antonela G et al • Staphylococcus aureus meticilino-resistente adquiridos...
Algunos trabajos consideran que SAMR-AC ha
emergido como nuevo patógeno y que el incremento de
infecciones debida a este microorganismo se observa
principalmente en la población pediátrica, teniendo una
incidencia de 47-56% de las infecciones de PPB.(1) Lina
et al. detectan la presencia de los genes pvl en el 93% de
las cepas causantes de infecciones necróticas primarias
que involucran la dermis, valor superior al obtenido en
nuestro trabajo.(10) En el presente estudio, la incidencia
de SAMR-AC PVL positivos en infecciones de PPB fue
de 81% en niños y 59% en adultos, no habiendo una
diferencia estadísticamente significativa en la prevalencia
de dichas infecciones entre ambos grupos etarios.
Reyes et al. y Guzmán Blanco et al.(12,13) en un estudio
multicéntrico que incluye 4 países latinoamericanos - Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela -, se demostró que la
mayoría de los SAMR-AC provenientes de infecciones de
PPB, infecciones pulmonares y sangre, estaban clonalmente
relacionados con la cepa epidémica USA300 MRSA-ST8-IV.
Estudios de epidemiología clonal revelan que en
nuestro país, existe un clon dominante de SAMR-AC
cuyas características son: ST5-SCCmec IVa o IVc, porta
los genes para PVL y enterotoxina A. Este grupo de trabajo
además concluye que la terapia empírica temprana debe
estar basada en la epidemiología local.(13,14)
Por lo tanto consideramos necesario continuar con el
estudio del tipo de staphylococcal cassette chromosome
mec (SCCmec) que poseen nuestras cepas y determinar
su relación clonal, objetivo que nos hemos propuesto
como próximo tema de investigación.
Concluimos que: a) la detección de la meticilinoresistencia por el método de difusión con discos coincide
con la portación del mec A en todos los aislamientos, b)
existe una alta circulación de SAMR-AC PVL (+) en la
población estudiada, c) la diferencia de la prevalencia
en ambos grupos etarios no fue estadísticamente significativa, d) la mayor recuperación de CA-MRSA-PVL
(+) se asoció a muestras de PPB tanto en niños como
en adultos y se comprobó que en los cuatro pacientes
fallecidos se recuperó Staphylococcus aureus adquirido
en la comunidad portador de los genes que codifican la
leucocidina de Panton-Valentine.
Agradecimientos
• Al Departamento de Matemática de la Facultad de
Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral por el análisis estadístico de los datos.
• Al Servicio de Antimicrobianos del ANLIS “Dr.
Carlos Malbrán” (INEI) y en especial al Dr. Diego Faccone
por el apoyo y colaboración prestado.
Financiamiento
Trabajo realizado con fondos de la Universidad Nacional del Litoral a través de la programación CAI+D 2009.
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Correspondencia:
Dra. Emilce de los Ángeles Méndez
Riobamba, 6647 (3000) - Santa Fe, Argentina.
e-mail: emilcemendez@gigared.com
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