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Opsonofagocitosis
Opsonofagocitosis
Carlos Andrés Palma Llanos
Alumno de la Carrera de Tecnología Médica Mención
Bioanálisis Clínico, Hematología y Banco de Sangre
Opsonofagocitosis (OPA)
• Qué es una Vacuna
• Fundamento de la técnica
C
C
C
C
CR
FcR
Receptores Fc
FcR
Afinidad por Igs
Distribución
celular
Función
Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004
• Ratones sin la
cadena γ del FcγR
presentan una
deficiencia en la
defensa mediada
por anticuerpos
contra los
microorganismos
IFN- γ
+
FcγR
Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004
OPA
•
•
•
•
Ensayo Clásico por Conteo
Citometría de Flujo
Fluorometría
Métodos microcópicos (sólo mencionado)
(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)
Bacterias (target)
•
•
•
•
•
Streptococcus pneumoniae (16)
Haemophilus influenzae b (2)
Neisseria meningitidis (1)
Enterococcus faecalis (2)
Staphylococcus aureus (2)
OPA clásico
(estandarización CDLI.4.4.415-422. 1997 )
Streptococcus pneumoniae (target)
CDC
•Caldo Todd-Hewitt
•420 nm DO 0,50,6
•-70ºC
•1000 UFC/20 ul
4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F
Muestras De Suero
• 37 (6 de prevacunación y 31 de post
vacunación)
• Vacuna conjugada de polisacárido14Valente <n=10> o 23-Valente <n=21>
• -70ºC (200ul)
• Sandoglobulina al 6%(referencia)
• Medición de IgG total por ELISA
CPS (10ug/ml)
490 nm
Estandar suero 89-SF
Células HL-60
(efectoras)
• Promielocitos leucemoides
• Maduración
cultivo celular
6x10E5 células /ml
ANTIBIÓTICOS
nitroblue tetrazolium
Opsonofagocitosis
• Efector/blanco (400:1)
• Preparación células efectoras
Obtención pellet
4x10E5 / 40 ul
Resuspender en buffer de OPA
•
•
•
•
•
20 ul muestra por pocillo (para cada serotipo)
OP
8 diluciones seriadas
al doble (1:8 a 1:1024)
SO
N
DUPLICADO
IZ
AC
20 ul de suspención bacteriana
(1000 UFC)
IÓ
N
37ºC 5%CO2, 15’
•10 ul suero conejo bebé (Complemento)
Happytreefriends.com
g
Fa
• 40ul de células HL-60 diferenciadas
(4x10E5)
• 45 minutos a 37ºC con mezclado horizontal
(220 rpm)
oc
s
ito
is
• 5 ul en agar Todd-Hewitt
• Toda la noche (60 UFC de base) T0
• Celda de Control complemento (s/Ac’s)
Complemento
T0
±20%
• Celda de control de la fuente de
complemento (56ºC)
• Títulos de OPA (≥50% de muerte) son el recíproco
de la dilución
e.j. 1:8
8
• También se realizó con leucocitos de sangre
periférica
• Análisis de Receptores por Citometría
CR1,CR3,FcγRI, FcγRII, FcγRIII,CD15
Algunos resultados…
Sin
alteración
en la OPA
OPA por FACS
CDLI. 5.5.703-710.1998
• Streptococcus pneumoniae
• Suero de prevacunación contiene altos
niveles de anticuerpo polisacárido C (C-PS)
• Bacterias con subcultivo 3 veces
• Inactivación por calor, alcohol y
formaldehído
• marcadas con una solución de fluoresceína
isotiocianato (0,5 mg/ml)
OPA por FACS
•
•
•
•
antisuero de conejo
antisuero humano (56ºC)
Complemento humano
PMN de sangre periférica (efector)
OPA por FACS…
•
•
•
•
•
•
•
Suero (56ºC) y Complemento [2%]
S.pneumoniae 2.5x10E6 (fuente)
30 minutos de opsonización
2.5x10E6 PMN
30 minutos de fagocitosis
Fijación con p-formaldehído en tubos FACS
Análisis por FACScan
• FITC-positivo
• Corrección con FITC-positivo del pocillo
s/anticuerpos
• Cálculos por regresión lineal en 25% de
FITC-positivo
OPA por Fluorometría
CDLI.12.10.1238-1342.2005
•
•
•
•
•
•
Se acopla a la técnica clásica
Una centrifugación
Pellet celular y bacterias dejadas en suspensión
20ul en placa hija con 40ul de “alamar blue”
Incubación 5-6h
Pocillo de control de complemento lea ≥20,000
unidades de fluorescencia
• 530/590 nm para excitación/emisión
• Bacteria cambia el indicador de azul a lavanda
• Los títulos de OPA se determinan como el
recíproco de la dilución con ≤50% de la
fluorescencia media detectada en el control
del complemento en ausencia de
anticuerpos del suero pero con otros
reagentes.
Algunas publicaciones
• Neisseria meningitidis y diferencia bactericida y
opsonofagocítica de las distintas subclases de IgG en
ratones para un epítope . Scandinavian Journal of Immunology.59, 34-39, 2004
• Enterococcus faecalis usando probióticos como inductores
de anticuerpos. Infection 33, 377-379. 2005
• Staphylococcus aureus por relación con infección
nosocomial y multirresistencia. IAI 73.10. 6752-6762. 2005
• IgA como opsonina para el neumococo. J. Clin. Invest. 104: 1139-1147. 1999
• Niños VIH positivo vacunados contra el neumococo
generan niveles similares de anticuerpos IgG que niños
sanos, pero la opsonofagocitosis muestra un decrecimiento
estadísticamente significativo. CDLI.12.1.165-170.2005
Discusión y Conclusión
• Comparar los niveles de respuesta entre diferentes grupos
etarios, socioculturales, étnicos, etc. JID. 189. 2077-2084. 2004
• Presenta variaciones dependientes de recursos
• Pero misma fundamento
• Destacado rol de S.pneumoniae
• Diferenciación entre nivel de Ac’s y funcionalidad
• Posible uso masivo en el futuro
• Comparación mundial
Vacunas más
específicas