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Escasas Evidencias de las Bacterias Lácticas del Yogur en Heces
Humanas tras Consumo Diario de Yogur en Voluntarios Sanos
∗
Rosa del Campo1* , Daniel Bravo1, Rafael Cantón1, Patricia Ruiz-Garbajosa1,
Raimundo García-Albiach2, Alejandra Montesi-Libois2, Francisco-Javier Yuste1, Victor
Abraira1 y Fernando Baquero1.
5
1 Departamentos de Microbiología, Medicina Preventiva, y Bioestadística, Hospital Universitario Ramón y
Cajal; y 2 Departamento de Microbiología, Universidad San Pablo-CEU, Madrid, España.
Parte de este trabajo se presentó en el 43 ICAAC meeting, Chicago (2003).
En este estudio se ha analizado la presencia en heces de los organismos del yogur
Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus tras consumo reiterado de
yogur (15 días) en 114 voluntarios sanos. Las técnicas empleadas han sido cultivos
microbiológico clásicos, PCR con cebadores específicos para estas bacterias e
hibridación de ADN con sondas específicas. El diseño del estudio fue prospectivo y de
doble ciego. Se obtuvieron resultados consistentemente negativos en los cultivos
microbiológicos, así como en la detección específica del ADN de las bacterias lácticas
del yogur mediante PCR. En los experimentos de hibridación, se detectó únicamente
ADN compatible con las bacterias del yogur en 10 de 96 individuos que habían
consumido yogur fresco (10,52 %) y en 2 individuos que habían consumido yogur
pasteurizado (2,10 %) (p=0.01).
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15
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INTRODUCCIÓN
Tradicionalmente se ha considerado al yogur como
un alimento probiótico con importantes efectos
saludables. Sin embargo, estos efectos no han sido
científicamente demostrados ni estudiados en
profundidad, particularmente en la población sana
que es la principal consumidora de estos productos
(1). Al mismo tiempo, parece obvio que estos
presuntivos efectos dependan de la capacidad de
los organismos para sobrevivir y multiplicarse en
el tracto grastrointestinal, teniendo que alcanzar
una gran concentración en el intestino (8). La
combinación de las bacterias Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, y Streptococcus
thermophilus se ha utilizado clásicamente como
organismos iniciadores de la fermentación de la
leche para la producción de yogur. La posible
presencia de estos organismos en el tracto
gastrointestinal de hombres o animales no se ha
explorado por el momento tanto como en otros
probióticos. El objetivo de este trabajo fue valorar
la presencia de los microorganismos del yogur en
las heces de voluntarios sanos en condiciones
basales así como tras consumo reiterado de yogur
y comparando con el consumo de yogur
pasteurizado.
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∗
MATERIAL Y MÉTODOS
50 Se incluyeron un total de 114 voluntarios sanos
jóvenes con una edad media de 23,6 años (49
hombres y 65 mujeres). La condición de individuo
sano se comprobó mediante el test de salud
gastrointestinal GIQLY (4), análisis hematológicos
55 de amplio espectro, así como análisis
inmunológicos (linfocitos, CD3, CD4, CD8 e
inmunoglobulinas (IgA, IgG, e IgM). A los
voluntarios no se les impuso ningún régimen de
dieta especial, excepto la imposición de consumir
60 diariamente 375 gr. de yogur. En una primera
ronda de quince días, 48 voluntarios consumieron
diariamente yogur fresco que contenía 1.3x107 y
2x108 UFC/gr de L. delbrueckii y S. thermophilus,
respectivamente (1011 bacterias totales). Este
65 mismo esquema pero con yogur pasteurizado fue
seguido por otros 48 voluntarios. Tanto el yogur
fresco como el pasteurizado procedieron del
mismo fabricante, y fueron marcados con nombres
codificados para garantizar el doble ciego del
70 estudio, por lo que ni los voluntarios ni los
microbiólogos que procesaron las heces sabían el
tipo de preparación que manejaban.
*Dirección: Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Ramón y Cajal. Ctra. Colmenar, Km 9,1.
Madrid 28.034. España. Télefono: 34-91 3368542. Fax: 34-91 3368809 E-mail: rosacampo@yahoo.com
Bacterias Lácticas del Yogur en las Heces Humanas
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Tras un período de lavado de 15 días en los
que los voluntarios no ingirieron ningún tipo de
yogur, ambas grupos experimentales de 48
individuos consumieron el producto contrario al
ingerido en la primera ronda (yogur fresco o
pasteurizado). En el estudio se incluyó además un
grupo control de 18 individuos que no consumió
ningún tipo de yogur y a los que se les aplicó el
mismo proceso que al resto de los 96 voluntarios.
A cada individuo se le recogió tres muestras
fecales: una primera muestra basal en el inicio del
estudio , en la cual, los individuos habían estado
una semana sin ingerir ningún yogur, y la segunda
y la tercera muestra fecales fueron recogidas tras
los quince días de ingesta de yogur. El método
estadístico Fleiss se utilizó para validar los análisis
estadísticos de los resultado (5).
Para procesar las heces, se suspendieron 0,5
gr. de cada muestra fecal en 5 ml. de solución
salina, y se centrifugaron a baja velocidad durante
5 min. Tras la centrifugación se recogió 1 ml de la
fase superior y se traspasó a un eppendorf limpio.
Se realizaron diluciones consecutivas en solución
salina partiendo de 100 l de esta última muestra
y se sembraron en placas de MRS y M17
apropiadas para el recuento bacteriano y la
detección fenotípica de colonias con morfología
compatible con L. delbrueckii ó S. thermophilus.
Tras incubar las placas durante 48 horas, se
subcultivaron cinco colonias de cada morfología
diferente y testadas con cebadores específicos en
experimentos de PCR para la posible identificación
de las bacterias del yogur. Se extrajo ADN total a
partir de las heces frescas, utilizando 200 l del
sobrenadante de la centrifugación y el método de
extracción QIAamp DNA stool mini kit
(QiaGen, Germany), que es el método
recomendado para este tipo de muestra (14).
También se aplicaron los cebadores escpecíficos
para las bacterias del yogur en experimentos de
PCR con el molde de ADN total de heces. La
extración de ADN se realizó en todas las muestras
fecales, incluyendo las recogidas tras la ingestión
de yogur pasteurizado y las del grupo control que
nunca consumieron yogur. Para evaluar el límite
de amplificación de ADN en las heces, se
mezclaron heces con yogur de ambos tipos en
distintas proporciones (1:10 hasta 1:1.000.000) y
se procedió a repetir en ellas los experimentos de
PCR con los cebadores específicos.
Se obtuvieron cultivos control de las cepas L.
delbrueckii y S. thermophilus sembrando el
iniciador de yogur industrial (Christian Hansen.,
referencia YF203.) en placas de MRS agar (Difco,
Detroit, MI) a 37ºC, y en M17 agar (Difco) a 42ºC
y 10% CO2, tras 48 h. de incubación. Estas cepas
fueron utilizadas como controles positivos en los
experimentos de PCR e hibridación. La
identificación de estas bacterias se confirmó
mediante reacciones de PCR utilizando los
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cebadores específicos descritos por Lick et al. (12).
Los cebadores para L. delbrueckii están basados en
la secuencia del gen add y se denominaron DEL-F
(5’→3’): AATTCCGTCAACTCCTCATC, y
DEL-R(5’→3’) TGATCCGCTGCTTCATTTCA.
Las condiciones de PCR para estos cebadores
fueron 10 ciclos de 20 seg. a 94ºC, 75 seg. a 65ºC,
y 40 seg. a 72ºC, seguidos de 35 ciclos a 20 seg. a
94ºC, 50seg. a 55ºC, y 30 seg. a 72ºC. Finalmente
se aplicó un ciclo de elongación de 3 min a 72ºC.
El producto amplificado en el control positivo
tiene un tamaño de 715 pb. Los cebadores
específicos basados en el gen lacZ utilizados para
S. thermophilus
fueron: THER-F (5’→3’):
CACTATGCTCAGAATACA,
and
THERR(5’→3’): CGAACAGCATTGATGTTA. Las
condiciones utilizadas fueron 35 ciclos de 20 seg. a
94ºC, 60 seg. a 58ºC, y 30 seg. a 72ºC y finalmente
una elongación de 3 min a 72ºC. En el control
positivo se observó un producto de amplificación
de 968 pb.
Utilizando la normativa estandarizada (Int.
Dairy Fed. Int. Stand. 1996. Milk and milk
products. Preparation of samples and dilutions for
microbiological examinations No. 122C), se
comprobó que la carga bacteriana de los yogures
frescos estuviera dentro de los límites marcados
por la legislación durante el tiempo de
almacenamiento de la mercancía y durante los
quince días de consumo de los yogures por los
voluntarios.
Partiendo de los productos amplificados
mediante PCR de los controles positivos, se
obtuvieron sondas específicas purificadas para
cada bacteria. Se aplicó la técnica de dot blot (13)
en 5 l de ADN total obtenido mediante el kit de
QIAamp de cada una de las muestras heces, que
previamente se había transferido a una membrana
de nylon (Hybond, Amersham), incluyendo
controles positivos y negativos. Las sondas se
marcaron mediante marcaje al azar (Rediprime,
Amersham) con [32P]dCTP (Redivue, Amersham).
Las pre- y las hibridaciones se realizaron en Rapid
Buffer (Amersham) a 60ºC durante 30 min. y a
56ºC durante 18 h., respectivamente. Los filtros se
lavaron dos veces a 56ºC en 2xSSC-0.1% SDS y
después a temperatura ambiente con 1xSSC-0.1%
SDS, y 0.7xSSC-0.1% SDS. La exposición se
llevó acabo durante 72 h. a –80ºC con
autoradiografías de la marca Kodak.
185
RESULTADOS
En las placas de MRS y M17 se observó el
crecimiento de diferentes colonias bacterianas con
morfología compatible con las de las bacterias del
190 yogur. Se subcultivaron cinco colonias de cada
morfología diferente y se les practicó una tinción
de gram seguida de una PCR específica de
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Del Campo et al.
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identificación con los cebadores de las bacterias
del yogur. En total se realizaron 427 experimentos
de PCR que resultaron ser consistentemente
negativos para los organismos testados,
independientemente de si las muestras provenían
de las toma inicial de base, del grupo que ingirió
yogur fresco, yogur pasteurizado o del grupo
control sin ingesta de yogur. Estos resultados,
indican la ausencia de células viables de L.
delbrueckii y S. thermophilus a concentraciones
superiores a 103 UFC/gramo (nuestro límite de
detección) en las muestras fecales.
La detección de restos de ADN de las bacterias
mediante PCR directa del ADN extraído de las
heces fue también consistentemente negativa en
todas las muestras. No se obtuvo ninguna
amplificación positiva para L. delbrueckii ni para
S. thermophilus en ninguna de las tres muestras
recogidas a los 114 voluntarios. Sin embargo
amplificaciones claramente positivas con un
producto del tamaño esperado para L. delbrueckii o
S. thermophilus se obtuvieron cuando se utilizó
como molde el ADN extraído de un yogur fresco,
o de uno pasteurizado o de las mezclas de yogur
con organismos viables y heces (1.000.000:1), con
un límite estimado de detección de 1-5 bacterias
/ml. En definitiva, las bacterias del yogur no son
detectables mediante cultivos convencionales ni
mediante técnicas moleculares específicas como la
PCR, dentro de nuestros límites experimentales.
La detección de restos de ADN específicos de
L. delbrueckii ó S. thermophilus mediante
hibridación radioactiva con ADN extraído de las
heces fue ser más sensible que el cultivo
microbiológico clásico ó las técnicas de
amplificación específica mediante PCR. Dichos
experimentos de hibridación, confirmaron la
negatividad de las muestras basales de todos los
voluntarios y de las tres muestras del grupo control
sin consumo de yogur. Se observaron de 8
muestras positivas cuando se utilizó la sonda
específica de L. delbrueckii, correspondiendo 7 de
las 8 muestras a ADN de heces tras consumo de
yogur fresco (8,4 %), y 1 muestra tras la ingesta de
yogur pasteurizado (1,05 %).
En los experimentos de hibridación con la
sonda específica de S. thermophilus, se observaron
4 muestras positivas que correspondían a 3
muestras tras la ronda de yogur fresco (3,15 %) y 1
muestra tras la ronda de yogur pasteurizado(1.05
%). En dos sujetos distintos se obtuvieron
positivas ambas hibridaciones para las dos
bacterias lácticas del yogur y en ambos casos
correspondían a las muestras tras la ronda de yogur
fresco. Por lo tanto, tras el consumo reiterado
durante 15 días de yogur fresco, se detectó
mediante hibridación ADN compatible con las
bacterias iniciadoras del yogur en 10 sujetos de un
total de 96 (10.52 %). En el caso del yogur
pasteurizado, se detectaron restos de ADN
compatible en 2 individuos de los 96 (2.10%)
(p=0.01).
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DISCUSIÓN
Pese a que el convencimiento generalizado que
existe sobre los efectos probióticos de las bacterias
lácticas del yogur L. delbrueckii, y S.
thermophilus, los datos sobre la verdadera
funcionalidad de estos organismos en el intestino
humano permanecen ocultos, e incluso podrían no
existir (16). Las nuevas técnicas moleculares nos
ofrecen una gran oportunidad de investigar esta
interesante cuestión. En los experimentos bien
controlados que se han realizado en este trabajo,
nosotros hemos sido incapaces de detectar
bacterias lácticas del yogur viables en las heces
humanas tras consumo reiterado de yogur y sólo
tras la ingestión de yogur fresco hemos detectado
restos de ADN de L. delbrueckii y/o S.
thermophilus en las heces del 10% de los
voluntarios mediante experimentos de hibridación.
Nosotros sólo testamos la viabilidad de las
bacterias en las heces, con lo que la pérdida de
viabilidad de estas bacterias en el tracto
gastrointestinal superior no puede ser inferida a
partir de nuestros resultados. Sin embargo, los
resultados negativos en los cultivos y en la
detección de ADN en heces mediante PCR,
indican que no cabe esperar una multiplicación de
estas bacterias en el intestino delgado. En los
experimentos de hibridación, una proporción
significativamente mayor de resultados positivos
se obtuvo en los voluntarios que consumieron
yogur fresco que entre lo voluntarios que
consumieron yogur pasteurizado, pero aún con
todo en el primer grupo, el 90 % de las muestras
no se detectó ningún resto de ADN. No podemos
descartar que el mayor número de positivos entre
los voluntarios que consumieron yogur fresco sea
debido a una mayor colonización de las bacterias,
pero nosotros creemos que es debido a una mayor
degradación del ADN en los productos
pasteurizados por el propio proceso de
pasteurización, que mata a las bacterias y se
empieza a degradar el ADN antes del consumo del
producto.
Bacterias lácticas del yogur se han detectado
viables en muestras duodenales humanas (15),
aunque presentan la escasa viabilidad tras contacto
con los jugos gástricos o las sales biliares (2), y
son altamente sensibles al tipo y a la cantidad de
comida que ingieren los sujetos (3, 10, 12).
Consecuentemente, el presunto efecto probiótico
del yogur depende de la frecuencia de ingestión (9,
11, 17) y todo esto es esperable para dos
microorganismos como L. delbrueckii y S.
thermophilus que no están sustancialmente
representados en la microbiota intestinal humana.
La definición recomendada de la FAO y de la
OMS para los probióticos es “ Organismos vivos
3
Bacterias Lácticas del Yogur en las Heces Humanas
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los cuales administrados en cantidad adecuada
confieren un beneficio saludable al huésped” (6).
Nuestros resultados muestran que este no debe de
ser el caso de las bacterias lácticas utilizadas para
la fabricación del yogur. Obviamente, nosotros no
podemos descartar en nuestros experimentos que el
efecto beneficioso del yogur demostrado
empíricamente esté más relacionado con los
prebióticos que con los probióticos. Por lo que
respecta a la supuesto beneficio saludable (¡si la
salud pudiera ser mejorada!), nuestros grupos
experimentales han sido analizados mediante
cuestionario sobre su confort gastrointestinal y de
nuevo no se han detectado diferencias entre el
consumo del yogur fresco y del pasteurizado
(datos sin publicar). Esto contrasta con los
resultados publicados por otros autores que
encuentran que las bacterias vivas son esenciales
para lograr el supuesto efecto beneficioso (7, 18).
En definitiva, mediante métodos clásicos o
herramientas moleculares, nosotros somos
incapaces de confirmar el verdadero papel del
yogur fresco como proveedor de bacterias
“saludables” a la microbiota intestinal humana.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido subvencionado en parte por
340 una beca de investigación del “Grupo Leche
Pascual” para el Hospital Universitario Ramón y
Cajal.
Abbott, A. 2004. Microbiology: gut reaction.
Nature, 427:284-286.
2.
Conway, P. L. 1995. Microbial ecology of the
human large intestine. In: Human Colonic Bacteria:
Role in Nutrition, Physiology, and Pathology, pp.
1-18 (GR Gibson and GT MacFarlane, editors).
Boca Raton: CRC Press.
350
(www.fao.org/es/ESN/food/foodandfood_probio_e
n.stm).
8.
Guarner, F., and J. R. Malagelada. 2003. Gut
flora in the health and disease. Lancet, 360:512519.
9.
Holzapfel, W. H., P. Haberer, R. Geisen, J.
Bjorkroth, and U. Schillinger. 2001. Taxonomy
and important features of probiotic microorganisms
in food and nutrition. Am. J. Clin. Nutr. 73(2
Suppl):365S-373S.
375
380
385
390
395
400
345 REFERENCIAS
1.
7.
405
10. Johansson, M. L., S. Nobaek, A. Berggren, M.
Nyman, I. Bjorck, S. Ahrne, B. Jeppsson, and G.
Molin. 1998. Survival of Lactobacillus plantarum
DSM 9843 (299v), and effect on the short-chain
fatty acid content of faeces after ingestion of a rosehip drink with fermented oats. Int. J. Food
Microbiol. 42:29-38.
11. Klaenhammer, T. R. 2000. Probiotic bacteria:
today and tomorrow. J. Nutr. 130 (Suppl 2S):415S416S.
12. Kullen, M. J., M. M. Amman, M. J.
O'Shaughnessy, D. J. O'Sullivan, F. F. Busta,
and L. J. Brady. 1997. Differentiation of ingested
and endogenous bifidobacteria by DNA
fingerprinting demonstrates survival of an
unmodified strain in the gastrointestinal tract of
humans. J. Nutr. 127:89-94.
13. Lick, S. K. Drescher, and K. J. Heller. 2001.
Survival of Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus and Streptococcus thermophilus in the
terminal ileum of fistulated Göttingen minipigs.
Appl. Environm. Microbiol. 67:4137-4143.
14. Maniatis T., E. F. Fristch, and J. Sambrook.
1982. Molecular cloning, a laboratory manual. New
York: Cold Spring Harbor.
15. McOrist A. L., M. Jackson, and A. R. Bird.
2002. A comparison of five methods for extraction
of bacterial DNA from human fecal samples. J.
Microbiol. Methods. 50:131-139.
410 16. Pochart, P., O. Dewit, J. F. Desjeux, and P.
Bourlioux. 1989. Viable starter culture, betagalactosidase activity, and lactose in duodenum
after yogurt ingestion in lactase-deficient humans.
Am. J. Clin. Nutr. 49:828-831.
3.
Drouault, S., G. Corthier, S. D. Ehrlich, and P.
Renault. 1999. Survival, physiology, and lysis of
Lactococcus lactis in the digestive tract. Appl.
Environm. Microbiol. 65:4881-4886.
4.
Eypasch, E., J. I. Williams, S. Wood-Dauphinee,
B. M. Ure, C. Neugebauer, and H. Troidl. 1995.
Gastrointestinal quality of live index: development,
validation, and application of a new instrument. Br.
J. Surg. 82:216-222.
415 17. Steer, T., H. Carpenter, K. Tuohy, and G. R.
5.
Fleiss, J. L. 1986. The design and analysis of
clinical experiments. New York: John Wiley &
Sons.
420
365 6.
Food and Agriculture Organization of the
United Nations and World Health Organization.
2002 Guidelines for the evaluation of probiotics in
food. Food and Agriculture Organization of the
United Nations and World Health Organization
Working Group Report.
355
360
370
Gibson. 2000. Perspectives on the role of the
human gut microbiota and its modulation by proand prebiotics. Nutr. Res. Rev. 13:229-254.
425
18. Tannock, G.W. 1999. Analysis of the intestinal
microflora:
a
renaissance.
Antonie
Van
Leeuwenhoek. 76:265-278.
19. Tuohy, K. M., H. M. Probert, C. W. Smejkal,
and G. R. Gibson. 2003. Using probiotics and
prebiotics to improve gut health. Drug Discov.
Today. 8:692-700.
4