Download Análisis microbiológico en combustible turbo kerosinas y en fluidos
Document related concepts
no text concepts found
Transcript
FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE Cristina Goncalves Araujo Erika Isabel Sirit López Tutor: Beatriz Leal de Rivas Caracas, febrero 2005 i TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN………………….…………………………………………………………1 CAPÍTULO I I.1PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………...…………………………….5 I.2 DELIMITACIÓN DEL TEMA……………………………………………………6 I.3 OBJETIVOS……………………………………………………………………...7 I.3.1 Objetivo General……………………………………………..……….7 I.3.2 Objetivos Específicos……………………………………………...…7 I.4 JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………...…8 CAPITULO II. MARCO TEÓRICO II.1. ANTECEDENTES DE CONTAMINACIÓN EN TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE…………………………………………………………….11 II.2. BIODETERIORO……………………………………………………………..12 II.3. FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA…………………………………..13 II.3.1. Definición de Microbiología……………………………………….13 II.3.2. Bacterias……………………………………………………………14 II.3.3. Hongos……………………………………………………………...17 II.3.3.a. Levaduras………………………………………………..18 II.3.3.b. Mohos …………………………………………………...18 II.4 ACTIVIDAD MICROBIANA…………………………………………………..19 II.4.1. Metabolismo de Nutrición…………………………………………19 II.4.2. Metabolitos…………………………………………………………21 II.5. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD MICROBIANA……………………………………………………………………...22 ii II.6. FACTORES OPERACIONALES……………………………………………25 II.6.1. Configuración del sistema…………………………..……………25 II.6.2. Mantenimientos básicos…………………………………..……...26 II.7. ECOLOGÍA MICROBIOLÓGICA DE SISTEMAS DE COMBUSTIBLES………………………………………………………………….27 II.8. BIOMASA Y BIOPELÍCULA ……………………………………….............28 II.8.1. Biopelículas………………………………………………………...29 II.9. MÉTODOS DE TOMA DE MUESTRA Y DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN TANQUES Y EN SISTEMAS………………………………………...............................................35 II.10. FACTORES QUE AFECTAN LA DISTRIBUCIÓN DE MICROORGANISMOS EN TANQUES Y EN SISTEMAS DE COMBUSTIBLES………………………………………………………………….36 II.11. INVESTIGACIÓN EN TANQUES Y SISTEMAS COMBUSTIBLES………………………………………………………..………...41 II.12. INVESTIGACIÓN EN LA CALIDAD DEL COMBUSTIBLE…………….41 II.13. PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS……………..………….42 II.13.1. Preparación para el Transporte y Análisis de Muestras…………………………………………………………………...43 II.13.2. Etiquetado………………………………………………………...45 II.13.3. Botellas y Contenedores de Muestras……………..…............45 II.14. ORGANISMOS PRESENTES EN FLUIDOS HIDROCARBONADOS DERIVADOS DEL PETRÓLEO...………………………………………………..46 II.15. GÉNERO PSEUDOMONAS…………..………………………….............48 II.15.1. Pseudomonas aeroginosas....................................................48 II.15.1.a. Morfología……………………………………………...49 II.15.1.b. Aspectos microbiológicos…………………………….49 II.15.1.c Propiedades Bioquímicas…………………………….50 II.15.1.d. Propiedades metabólicas……………………...........51 iii II.16. BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS………………………………...51 II.17. ESTERILIZACIÓN…………………………………………………………..53 II.17.1. Métodos de esterilización………………………………............54 II.17.2. Agentes Físicos…………………………………………………..55 II.17.2.a. Calor……………………………………………...........55 II.17.2.a.1. Calor húmedo……………………………….56 II.17.2.a.2. Calor seco…………………………………...58 II.18. MEDIOS DE CULTIVO……………………………………………………..58 II.18.1. Medios naturales o complejos…………………………............59 II.18.2. Medios definidos o sintéticos…………………………………...60 II.18.3. Medios de cultivos de enriquecimiento y selectivos…………………………………………………………………..60 II.18.3.a. Medios de enriquecimiento…………………………..60 II.18.3.b. Los medios selectivos………………………………...61 II.19. FLUIDOS DE CORTE………………………………………………………61 II.19.1. Microorganismos asociados con el deterioro de los fluidos de corte………………………………………………………………………...64 II.20. TURBO KEROSINAS............................................................................67 II.20.1. Contaminación y deterioro de Turbo Combustibles…............68 II.21. CAUSAS DEL DETERIORO………………………………………………70 II.22. EFECTOS DEL DETERIORO MICROBIANO…………………………...71 CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO III.1. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS.............................................74 III.2. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN O EXPLORACIÓN............................75 III.3. INVENTARIO DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS DISPONIBLES...............................................................................................76 iv III.4. ESTANDARIZACIÓN DE METODOLOGÍAS.........................................77 III.5.IMPLEMENTACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ESTANDARIZADAS……………………………………………...……………….78 III.5.1. Preparación y esterilización del material de vidrio..............................78 III.5.2. Equipos y su funcionamiento..............................................................80 III.5.3. Preparación y Esterilización de Medios de Cultivo.............................84 III.5.3.1. Preparación de Medios de Cultivo Líquidos (m-TGE, Medio Tioglicolato y Caldo TSB).............................................84 III.5.3.2. Preparación de Medios de Cultivo Sólidos (Sabouraud Dextrosa Agar y Cetrimide Agar)........................86 III.5.3.3. Procedimiento para el Plaqueo y Almacenamiento de los Medios de Cultivo Sólido...................................................87 III.5.4. Procedimiento para la Toma de Muestra de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................89 III.5.5. Procedimiento para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos y Hongos utilizando el método de filtración de membrana..................................................................93 III.5.5.1. Determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte......................................................................93 III.5.5.2. Determinación de Pseudomonas aeroginosa y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los Caldos contaminados (turbios) por medio de repiques...................................................................98 III.5.5.3. Procedimiento para realizar la Coloración Simple de Gram.....................................................................................102 III.5.6. Procedimiento para la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte............................................................103 III.6. ELABORACIÓN DE LOS KITS MICROBIOLÓGICOS (PROTOTIPO)..............................................................................................108 III.6.1. Kit Microbiológico para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo Combustibles de Aviación.........................................108 v III.6.1.1. Objetivo..................................................................108 III.6.1.2. Instructivo de Operación para el manejo del Kit microbiológico.......................................................................108 III.6.1.6. Procedimiento de Prueba y Puesta en marcha del Kit Microbiológico (prototipo)......................................................111 III.6.2. Kit Microbiológico para la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo Kerosinas...............................................................................111 III.6.2.1. Objetivo..................................................................111 III.6.2.3. Instructivo de Operación para el Manejo del Kit Microbiológico.......................................................................112 III.6.2.4. Procedimiento de Prueba y Puesta en Marcha del Kit Microbiológico (prototipo)......................................................114 CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS IV.1. RESULTADOS....................................................................................116 IV.1.1 Determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................................116 IV.1.2. Determinación de Pseudomonas aeroginosas y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques.....................119 IV.1.3 Resultados obtenidos de la tinción de Gram para verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosa las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte en placas con Cetrimida agar contaminadas...................................................................................123 IV.1.4 Determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................................................................125 IV.1.5. Resultados obtenidos de la puesta en marcha del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.............................................................................130 IV.1.6. Costos Primarios asociados a la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……………………............133 vi IV.1.7. Costos Primarios asociados a la determinación de Pseudomonas aeroginosas y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……………………............135 IV.1.8. Costos Primarios asociados a la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte a nivel de Laboratorio (Año 2005)……………………………...137 IV.1.9. Costos Primarios asociados al Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)……..139 IV.1.10. Costos Primarios asociados al Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte (Año 2005)…………………141 IV.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS IV.2.1. Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................143 IV.2.2. Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de Pseudomonas aeroginosa y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques…….........................146 IV.2.3 Análisis de los Resultados obtenidos de la Tinción de Gram para verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte en placas con Cetrimida Agar contaminadas..........................................................149 IV.2.4 Análisis de los Resultados obtenidos en la determinación de la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte.......................................150 IV.2.5. Análisis de los Resultados obtenidos de la puesta en marcha del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte.................................................153 IV.2.6. Análisis de los Resultados obtenidos de los de costos asociados a los estudios realizados.................................................154 CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES V.1 Conclusiones.........................................................................................158 vii V.2. Recomendaciones................................................................................159 BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................162 ANEXOS..................................................................................................................165 Anexo A. Turbo Kerosina Jet A1..................................................................165 Anexo B. Aceite de Corte Vanosoluble AW (Aceite emulsionalble para mecanizado).................................................................................................166 Anexo C. Medios de Cultivo Sólidos............................................................166 C.1. Sabouraud Dextrosa Agar....................................................................166 C.2. Agar Cetrimide......................................................................................166 Anexo D. Medios de Cultivo Líquidos..........................................................168 D.1. Medio Tioglicolato.................................................................................168 D.2. “Tryptone Soy Broth” (TSB)……………………………………………….169 D.3. “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE)…………………………..170 Anexo E. Reactivos utilizados......................................................................171 Anexo F. Identificación de algunos microorganismos en los Fluidos analizados....................................................................................................178 Anexo G. Imagen de tanque de aeronave con contaminación microbiana....................................................................................................179 GLOSARIO………………………………………………………………………………..180 viii LISTA DE TABLAS Y FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Bacterias comúnmente recuperadas de muestras de combustibles contaminadas……………………………………….………………………………………17 Tabla 2. Propiedades Básicas de las biopelículas………….………………………….28 Tabla 3. Microorganismos responsables de la degradación de compuestos derivados del petróleo………………………………………………….………………….46 Tabla 4. Algunos agentes físicos utilizados para la esterilización………….………...54 Tabla 5. Algunos agentes mecánicos utilizados para la esterilización………………54 Tabla 6. Algunos agentes químicos utilizados para la esterilización………………...54 Tabla 7. Microorganismos detectados por volumen y placa; acciones correctoras aplicadas en sistemas o tanques…………………………………………………………62 Tabla 8. Descripción de los fluidos utilizados en la fase experimental durante la Toma de Muestra.......................................................................................................91 Tabla 9. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos…………………………………………………………………………95 Tabla 10. Muestras analizadas para determinar la presencia de bacterias sulfatoreductoras anaeróbicas………………………………………………………………….105 Tabla 11. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (Kit Prototipo)………………………………………………………111 Tabla 12. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………….............................................................116 Tabla 13. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Sabouraud Dextrosa Agar……………………….119 Tabla 14. Observaciones de los resultados obtenidos a través de la determinación de Pseudomonas aeroginosa en las muestras de Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Cetrimida Agar…………...........................................................................................................121 ix Tabla 15. Observaciones de los resultados de la Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas…………………………………………………………..123 Tabla 16. Observaciones de los resultados obtenidos en la determinación de la presencia de bacterias sulfato reductoras anaerobias en las muestras de Turbo kerosinas y Fluidos de corte…………………………………………………………….125 Tabla 17. Observaciones de los resultados obtenidos de la puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………130 Tabla 18. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………………………………………133 Tabla 19. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Pseudomonas Aeroginosas y hongos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………………………………………….…………….135 Tabla 20. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………………………………………….137 Tabla 21. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra del Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………139 Tabla 22. Costos de Reactivos, Materiales y mano de obra, para 5 análisis, del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte……………………………………………………141 Tabla 23. Tabla comparativa que incluye los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN y los costos asociados a la metodología desarrollada en el presente trabajo (en $) para los diferentes estudios realizados………………………………………..155 x ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Diversas formas bacterianas encontradas en combustibles y sistemas de combustibles……………………………………………...………………………………...14 Figura 2. Diagrama del proceso de formación de una biopelícula…………….……..29 Figura 3. Polímeros extracelulares (polisacáridos) visualizados a través de un microscopio electrónico……………………………………………………………………31 Figura 4. Dinámica de la formación de biopelículas…………………………………...33 Figura 5. Distribución típica de microorganismos en un tanque de almacenamiento de combustible contaminado en reposo…………………………………………………37 Figura 6. Tinción de Gram de la Pseudomonas aeroginosa………………………….49 Figura 7. Presencia de Pseudomonas aeroginosa en Cetrimide Agar……..............50 Figura 8. Bacterias Sulfato-reductoras en una tubería………………………………..51 Figura 9. Representación del funcionamiento de un Fluido de Corte en una maquinaria…………………………………………………………………………………..63 Figura 10. Cephalosporium acremonium (hongos encontrados en Fluidos de Corte)………………………………………………………………………………………..65 Figura 11. Fusarium (hongo encontrado en Fluidos de Corte)……………………….66 Figura 12. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte..........................................................................97 Figura 13. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosa y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presente en los caldos contaminados...........................................................................................................101 Figura 14. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte...................................................................107 Figura 15. Representación esquemática del instructivo de operación del Kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos……………………………..…………………………………………110 Figura 16. Representación esquemática del instructivo de operación del Kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de bacterias sulfato- xi reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte…………………………………………………………………………...................113 Figura 17. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (mTGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C…………..……………………………………………………….117 Figura 18. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (mTGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C…………………………………………………………………...117 Figura 19. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (mTGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C…………………...118 Figura 20. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C……………………….……………...............................................................120 Figura 21. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C…………………………….………...............................................................120 Figura 22. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C…………………………………………………………………………………..120 Figura 23. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122 Figura 24. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122 xii Figura 25. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C……………………………………………………………………………………………122 Figura 26. Tinción de Gram de la muestra 4 (Jet A1) en Medio m-TGE 1 (repetición 1)……………………………………………………………………………………………124 Figura 27. Tinción de Gram de la muestra Corte (Fluido de Corte) en Medio Tioglicolato 1 (repetición 1)……………...……………………………………..............124 Figura 28. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………126 Figura 29. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………126 Figura 30. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………127 Figura 31. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………127 Figura 32. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………128 Figura 33. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………….………...128 Figura 34. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al xiii período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente…………………………………………..129 Figura 35. (a) Observación inicial del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) después de 21 días de incubación a temperatura ambiente……………………………………………………………………129 Figura 36. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (mTGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)…………………………………………………..131 Figura 37. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (mTGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)…………………………………………………..131 Figura 38. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (TSB, m-TGE y Tioglicolato) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo)……………………………………….131 Figura 39. Observación de los blancos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kitgmicrobiológicog(prototipo)…………………………………………………………..131 xiv RESUMEN “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE” Autores: Cristina Goncalves Araujo Erika Isabel Sirit López Tutor: Lic. Beatriz Leal de Rivas Caracas, Febrero 2005 El presente Trabajo de Grado se realizó con la finalidad de desarrollar un protocolo para analizar microbiologicamente Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte con la posibilidad de implementar un laboratorio con características comerciales en la Universidad Metropolitana. Para ello se recolectaron muestras de JetFuel proporcionadas por los Aeropuertos de La Carlota y Maiquetía y muestras de Fluidos de Corte, específicamente AW-Venosoluble, suministrados por Industrias Venoco en Guacara. Para el análisis de las muestras se desarrollaron metodologías que permitieron llevar a cabo la determinación de la presencia (en general) de bacterias y hongos aerobios mesófilos, Pseudomonas aeroginosas y bacterias anaerobias sulfatoreductoras. Las metodologías desarrolladas resultaron adecuadas para la realización de análisis microbiológico, ya que, fueron ideadas en base a una matriz de selección, la cual contempla: la complejidad del análisis, el acceso y la disponibilidad de los reactivos, materiales y equipos. DERECHO DE AUTOR Quienes suscriben, en condición de autores del trabajo titulado “Análisis Microbiológico en Combustibles Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte”, declaramos que: “Cedemos a título gratuito, y en forma pura y simple, ilimitada e irrevocable a la Universidad Metropolitana, los derechos de autor de contenido patrimonial que nos corresponden sobre el presente trabajo. Conforme a lo anterior, esta cesión patrimonial sólo comprenderá el derecho para la Universidad de comunicar públicamente la obra, divulgarla, publicarla o reproducirla en la oportunidad que ella así lo estime conveniente, así como autores de la obra antes señalada. La Universidad en todo momento deberá indicar que la autoría o creación del trabajo corresponde a nuestra persona, salvo los créditos que se deban hacer al tutor o a cualquier tercero que haya colaborado o fuere hecho posible la realización de la presente obra. __________________________ Autor: Cristina Goncalves Araujo C.I. V-15761948 _________________________ Autor: Erika Isabel Sirit López C.I. V-14897049 En la ciudad de Caracas, a los 15 día del mes de febrero del año 2005. APROBACIÓN Considero que el Trabajo Final titulado “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE” elaborado por las ciudadanas ERIKA ISABEL SIRIT LÓPEZ CRISTINA GONCALVES ARAUJO para optar al título de INGENIERO QUÍMICO reúne los requisitos exigidos por la Escuela de Ingeniería Química de la Universidad Metropolitana, tiene méritos suficientes como para ser sometido a la presentación y evaluación exhaustiva por parte del jurado examinador que se designe. En la ciudad de Caracas, a los 15 día del mes de febrero del año 2005. _________________________ Tutor: Lic. Betriz Leal de Rivas ACTA DE VEREDICTO Nosotros, los abajo firmantes, constituidos como jurado examinador y reunidos en Caracas, el día 28 de febrero de 2005, con el propósito de evaluar el Trabajo Final titulado “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE” presentado por las ciudadanas ERIKA ISABEL SIRIT LÓPEZ CRISTINA GONCALVES ARAUJO Para optar al título de INGENIERO QUÍMICO Emitimos el siguiente veredicto: Reprobado __ Aprobado __ Notable __ Sobresaliente __ Sobresaliente mención publicación __ Observaciones:_________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________ Prof. Beatriz Leal _____________ _____________ Prof. Alicia Dienes Prof. Nancy de Pérez DEDICATORIA A mi mamá (Graciette), a mi papá (Antonio) y a mis hermanos (Antonio y Karina) por ser más que un centenar de profesores y mis grandes fuentes de inspiración. CRISTINA GONCALVES A mis padres por ser luz que iluminan cada día mi camino, mis hermanos por ser mi apoyo y mis ganas de levantarme cuando sin querer caigo. A MIS DOS HERMOSAS SOBRINAS… Los quiero mucho… ERIKA SIRIT AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer en primer lugar a Dios y a la Virgen María por estar siempre conmigo (especialmente los más difíciles), quienes me han guiado hasta este momento tan especial en mi vida. A mis padres Graciette Araujo de Goncalves y Antonio Goncalves Simoes, y a mis hermanos Antonio y Karina, por ser mis mejores amigos, mis aliados, mis ejemplos de vida, de lucha, de responsabilidad y sobretodo de perseverancia, gracias por el apoyo que me han brindado durante toda mi vida y por supuesto durante el transcurso de esta tesis. Discúlpenme los dolores de cabeza que les hice pasar por mis preocupaciones, gracias por estar siempre allí. Los quiero muchísimo A mi amiga Getty Barrios que desde que entré a la Universidad siempre ha estado conmigo, gracias por regalarme momentos simpáticos y agradables. Tú me has ayudado sin pedir nada a cambio. A mi compañera de tesis Erika Sirit, que con sus conocimientos brindó aportes útiles y valiosos para el desarrollo de esta investigación. Gracias por el apoyo, la paciencia y la tolerancia durante esta aventura que juntas hicimos realidad. Espero que esto tan sólo sea el comienzo de una bonita y sincera amistad. A la profesora y tutora Beatriz Leal quien con sus conocimientos y experiencias nos guió y acompañó durante el proceso investigativo. Agradezco que me hubiese dado la oportunidad de realizar esta investigación. A Magaly de Villegas que desde que te conocí me has enseñado muchísimo, y aunque no lo creas eso vale mucho para mi. Gracias por ayudarme y apoyarme desinteresadamente para que logremos culminar este trabajo de grado. A la Profesora Beatriz Soledad y la Licenciada Carmen Molina por sus valiosas colaboraciones, apoyo y paciencia para que llevemos a buen termino este proyecto. Mil Gracias. A la Lic. Rosa Vidal por su valiosa colaboración y enseñanza. Muchas gracias. Al Histólogo Víctor Salazar en el Centro de Biofísica y Bioquímica del IVIC por su ayuda desinteresada en el logro de este proyecto. A todos mis profesores quienes me orientaron, porque cada uno, con sus valiosas aportaciones, me ayudaron a crecer como persona. Finalmente, agradezco a mis compañeros de grupo, que han contribuido en gran medida en mis estudios a lo largo de mi carrera, especialmente a aquellos que me brindaron momentos muy agradables. CRISTINA GONCALVES ARAUJO AGRADECIMIENTOS A Dios, por ser mi fuente de inspiración y mi guía, mi fuente de protección y refugio. A mi Mamá, por enseñarme el bien y cuidar siempre de mí en las buenas y malas. Por enseñarme a aborrecer lo malo, por enseñarme valores. Por llevarme de la mano a emprender y superar etapas de mi vida. Gracias por tus, siempre oportunas, palabras de aliento en mis momentos más tristes y tus silencios que me calman tan dulcemente. Por tu mirada sabia y tu expresión serena, por tu paciencia, sencillamente…Gracias! A mi Papá, gracias por ser un padre bondadoso, tan lleno de sabiduría, mi modelo a seguir. Por enseñarme a luchar y a conseguir lo que quiero de la vida de una manera justa y honrada. Por enseñarme a mirar alto, a aspirar siempre a lo mejor, y a no renunciar a mis sueños. Gracias por instruirme en la vida, ser el mejor de mis profesores; por hacer mi vida mucho más alegre y más dulce. A mis hermanos, Ulises, Daniel, Lorena Y Gilberto, gracias por apoyarme en los momentos cuando más los necesitaba. Gracias por hacerme sentir que puedo contar con ustedes y ustedes conmigo. A Douglas Sirit, yo sé que desde allá arriba en el cielo y junto a Dios estás compartiendo este gran momento conmigo. Como te dije un día: “Quiero seguir tu ejemplo”. Mírame ahora…Ingeniero A Cristina, gracias por tu paciencia y por brindarme tu amistad. Gracias por compartir este sueño conmigo y por alcanzar esta meta juntas. Espero que nuestra amistad se fortalezca mucho más de aquí en adelante. A Magaly, gracias por tu valiosa ayuda en el laboratorio, gracias por ayudarnos en nuestras incontables carreras para conseguir lo que necesitábamos. Sin ti, hubiese sido demasiado difícil. Eres un claro ejemplo de gente eficiente, competente, amable y trabajadora. Gracias! A la Profesora Beatriz Soledad, nuestro ángel, infinitamente agradecida por su invaluable ayuda. Gracias por permitirnos realizar experimentaciones en Laboratorios International Health y brindarnos sus sabios consejos a lo largo de nuestra investigación. A la Lic. Carmen Molina, gracias por instruirnos en este nuevo mundo de la microbiología. Gracias por su paciencia, su dedicación y ayuda desinteresada. A la Prof. Beatriz Leal, por ser la pionera de este trabajo. Gracias por el tiempo que invirtió en nuestra tesis, creo que al final va a valer la pena. Gracias por sus consejos y opiniones, por darnos siempre mucho ánimo y mostrarse siempre optimista ante cualquier tropiezo. A la Lic. Rosa Vidal, en la Clínica Santa Sofía, por su valiosa colaboración en este proyecto y por instruirnos en esta área tan nueva para nosotras. Al Histólogo Víctor Salazar por su amable y valiosa colaboración en pro del desarrollo de nuestra Tesis. A mis chinas, Elizabeth e Iliana, definitivamente, sin ustedes jamás hubiese sido lo mismo. Gracias por compartir risas y lágrimas conmigo, por compartir un mismo sueño, por enseñarme que la amistad sí vale la pena, las quiero mucho A Valentina, Hanen, Huei por brindarme su amistad y su apoyo en los momentos más críticos. A ti, porque me permitiste conocerme más y saber que era más fuerte de lo que creía y gracias porque contigo me di cuenta lo que verdaderamente quiero de la vida. A todos los que de una forma u otra contribuyeron a hacer de este gran proyecto una hermosa realidad. Le doy Gracias a Dios porque los tuve y los tengo en mi vida, que Dios los bendiga a todos. Gracias! Los quiero mucho!! ERIKA SIRIT LÓPEZ Introducción 1 INTRODUCCIÓN “No se conoce una Ciencia si no se conoce su historia” Anónimo Una gran variedad de bacterias y hongos pueden proliferar en los fluidos hidrocarbonados derivados del petróleo, si predominan las condiciones adecuadas de temperatura, agua, y ciertos nutrientes esenciales. Con técnicas apropiadas, se podrían detectar de forma temprana la presencia de contaminación microbiana, y evitar los problemas operacionales derivados. El presente trabajo contempla el análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, con el objeto de realizar un protocolo de análisis que permita efectuar dicho estudio, además de elaborar kits microbiológicos prototipos para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos, así como también de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas. Las metodologías elaboradas se sometieron a prueba, cuyos resultados son expuestos a lo largo del mismo. Introducción 2 Este trabajo pretende ser el punto de partida de estudios posteriores relacionados con la elaboración de análisis microbiológicos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, para una futura búsqueda de biocidas que permitan remediar y controlar la presencia de microorganismos que puedan afectar seriamente los fluidos y los sistemas donde están contenidos, ya que en Venezuela son muy pocas las investigaciones y los laboratorios que realizan análisis microbiológicos en fluidos de corte y ninguno en turbo combustibles de aviación. La estructura del trabajo está comprendida en cinco capítulos cuyo contenido se resume a continuación: En el CAPÍTULO I, se especifica el tema de la investigación, el planteamiento del problema, la delimitación del tema, los objetivos de la investigación y la justificación, lo cual permite inferir sobre el problema planteado y su alcance. En el CAPÍTULO II, se presenta el soporte teórico, donde se exponen puntos importantes relacionados con el biodeterioro, una breve explicación sobre la microbiología, los microorganismos que afectan tanto a los fluidos de corte como a los turbo combustibles de aviación y los efectos que ocasionan los mismos. En el CAPÍTULO III, el marco metodológico, se presenta la parte experimental describiéndose los pasos empleados para resolver el problema planteado y cuya organización estuvo orientada a los ensayos realizados a nivel de laboratorio de la Introducción 3 metodología elaborada. De la misma forma se expone la implementación y la puesta en marcha de los kits microbiológicos. En el CAPÍTULO IV, se analizan y discuten los resultados obtenidos en el mismo orden en que se realizaron las pruebas. Asimismo se presentan los costos primarios asociados con los análisis realizados. Por último en el CAPÍTULO V, se enumeran las conclusiones que surgieron del desarrollo del trabajo y las recomendaciones para trabajos futuros que puedan apoyarse en esta investigación. CAPÍTULO I “ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO EN COMBUSTIBLES TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE” “El sabio no dice todo lo que piensa, pero siempre piensa todo lo que dice”. Anónimo Capítulo I 5 I.1 PANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Las bacterias y/u hongos son microorganismos que crecen y pueden crear un ambiente propicio para la corrosión en los depósitos donde se encuentran contenidos, ya que, los subproductos metabólicos de los microbios son ácidos orgánicos y ácido sulfhídrico, los cuales ejercen un efecto negativo en piezas metálicas. Los microbios requieren para su desarrollo la presencia de agua que les permita llevar a cabo el intercambio metabólico con el ambiente que lo rodea. En la actualidad, la presencia de estos microorganismos ha sido motivo de preocupación tanto en el área aeronáutica como en el área automotriz e industrial. El crecimiento fungicida y bacteriológico en depósitos donde están contenidos el combustible y el aceite pueden comprometer la seguridad de las aeronaves, maquinarias y motores de combustión interna, ya que se produce un limo que puede bloquear los filtros del combustible y causar la corrosión del metal de las paredes del tanque. El atasco de los filtros del combustible es quizás el síntoma más común y fácil de reconocer como indicador de la presencia de contaminación microbiana en los depósitos de combustible. Con frecuencia la presencia de las bacterias y/u hongos no se detectan hasta que es demasiado tarde. En Venezuela son muy pocos los laboratorios o empresas que realizan análisis microbiológicos en Fluidos de Corte y ninguno en Turbo Combustibles de aviación. Por tal motivo, en este proyecto se desarrollarán procedimientos para los análisis microbiológicos de los Fluidos de Corte, combustibles Turbo Kerosinas que podrían estar contaminados. Los resultados Capítulo I 6 que se obtengan de estos estudios permitirán estandarizar la metodología del análisis microbiológico para una posterior comercialización de los servicios que se puedan generar. I.2 DELIMITACIÓN DEL TEMA En el transcurso de este proyecto se contemplará realizar el análisis microbiológico de algunos combustibles y lubricantes (Turbo kerosinas, Fluidos de Corte) a través del desarrollo de nuevas metodologías orientadas a la detección de la presencia o no de microorganismos aerobios mesófilos y de bacterias sulfato-reductoras anaerobias, adaptándolas a las condiciones de trabajo que se podrían realizar y aplicar en las instalaciones de la Universidad Metropolitana. Asimismo, una vez llevada a cabo el desarrollo de la metodología del análisis microbiológico se efectuará un estudio de costos básico para determinar la factibilidad de cada servicio de análisis, para una posterior comercialización hacia los sectores aéreos, marítimos, terrestres e industriales. Capítulo I 7 I.3 OBJETIVOS I.3.1 Objetivo General: Desarrollar un protocolo para realizar análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte. I.3.2 Objetivos Específicos: Desarrollar los métodos y técnicas necesarias para el análisis microbiológico de bacterias y/u hongos en Fluidos de Corte y Turbo Combustibles. Determinar la presencia de bacterias y/u hongos en combustibles Turbo Kerosinas (JET A1) y Fluidos de Corte (Venosolubles Aw) que podrían estar contaminados. Determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas, bacterias y hongos mesófilos aerobios y la presencia de bacterias anaerobias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas (JET-A1) y Fluidos de Corte (Venosoluble Aw). Aplicar las técnicas para el análisis microbiológico de combustibles Turbo kerosinas y Fluidos de Corte en la Universidad Metropolitana. Estandarizar metodologías, para realizar análisis microbiológico de los combustibles Turbo kerosinas y los Fluidos de Corte que podrían estar contaminados. Elaborar Kits microbiológicos (Prototipo) que permitan determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos y bacterias sulfato reductoras en Turbo kerosinas y en Fluidos de Corte Capítulo I 8 Analizar las posibles causas que provocaron la contaminación microbiana de los combustibles y fluidos de corte analizados. Evaluar los costos primarios asociados a los análisis realizados en el laboratorio para la aplicación de las técnicas microbiológicas que se desarrollarán en la Universidad Metropolitana. I.4 JUSTIFICACIÓN Las bacterias y hongos en un sistema de manejo de combustibles están relacionados con el grado de contaminación presente en un aceite o combustible. El funcionamiento seguro de los equipos, aeronaves y vehículos exige un combustible esencialmente limpio, seco y sin contaminantes. Hoy en día existe una preocupación motivada a la contaminación microbiana de muchos combustibles y aceites lubricantes, causantes del deterioro químico y físico de fluidos, piezas aeronáuticas, automotrices e industriales. Muchas empresas se ven en la necesidad de evaluar la calidad de sus fluidos, siendo un parámetro de calidad la ausencia de bacterias y/u hongos; por ello se pretende desarrollar técnicas de análisis que permitan detectar la presencia de bacterias y hongos a nivel de trazas, sentando las bases para su posterior caracterización. De esta forma satisfacer las necesidades percibidas en las empresas que laboran con diferentes tipos de aceites y combustibles. (23) Actualmente en el mercado existen kits que permiten realizar análisis que detectan la contaminación, cuando ya ha ocurrido corrosión interna de los diferentes Capítulo I 9 componentes de las maquinarias. Cabe destacar que en algunas industrias o empresas, el alto costo de dichos kits ha significado un obstáculo para determinar la contaminación microbiana de sus fluidos. (12) CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO " La teoría es cuando uno ya sabe todo, y nada funciona. La práctica es cuando las cosas funcionan, y nadie sabe porqué. " Albert Einstein Capítulo II. Marco Teórico 11 MARCO TEÓRICO II.1. ANTECEDENTES DE CONTAMINACIÓN EN TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE La incontrolable contaminación microbiana en el combustible, sistemas de combustibles y fluidos de corte pueden causar problemas de biodeterioro que se traducen en grandes pérdidas económicas. Los problemas de contaminación microbiológica son, algunas veces, difíciles de diagnosticar y requieren de la experticia de un microbiólogo especializado en biodeterioro. Sin embargo, una persona capacitada puede reconocer a menudo la contaminación microbiológica y tomar la mejor acción para controlarla. Por lo tanto, si todo el personal implicado en la manipulación del combustible, del sistema del combustible y fluidos de corte tiene una comprensión general de la microbiología del combustible, estarán mejor preparados para reducir los costos causados por el biodeterioro. (4) Se han conocido problemas relacionados con la contaminación microbiológica tanto de los fluidos de corte como de Turbo kerosinas. (23) De hecho, Industrias Venoco ha mostrado una gran preocupación debido a que sus clientes, a quienes ellos surten de sus fluidos de cortes, se quejan porque éstos, al cabo de cierto tiempo, presentan malos olores, además de ello algunos de sus trabajadores muestran erupciones en la piel debido al contacto directo con fluido contaminado. Capítulo II. Marco Teórico 12 El profesor Harold Rossmoore, fundador de laboratorios Biosan en Estados Unidos, dedicó prácticamente toda su vida en estudiar la contaminación microbiológica que presentaban los fluidos de corte. (12) El crecimiento de microorganismos en productos derivados del petróleo ha sido reportado desde 1895. Problemas en gasolinas de aviación se reportaron a comienzos de 1950 y en Turbo Kerosinas a finales de 1950. El ataque microbiano se evidenció a causa de la corrosión de un ala de la aeronave Lockheed Electra en Australia en 1961. ♣ En Venezuela se han reportado casos de Turbo Kerosinas contaminadas microbiológicamente; tal es el caso reciente (en el año 2004) de un accidente aéreo en el cual un SKY TRUCK precipitó a tierra, alegándose como posible hipótesis de la causa del accidente, la corrosión inducida por microorganismos en el tanque de combustible. ♥ II.2. BIODETERIORO El biodeterioro se refiere a todo proceso por el cual los microorganismos afectan los materiales de forma desfavorable, ya sea de forma directa o indirecta. El biodeterioro de forma directa o biodeterioro en primer orden, ♣ ♥ Fuente: HILL, Edwadr y Graham C. Hill. 2000. ECHA Microbiology Ltd, UK. Fuente: S/A. (2004, 11 de Diciembre). Autoridades esperan concluir hoy rescate de víctimas de accidente aéreo. EL UNIVERSAL, pp. 4-10 Capítulo II. Marco Teórico 13 ocurre cuando los microorganismos consumen el material directamente, usándolo como fuente alimenticia. El biodeterioro de forma indirecta incluye detrimento, deterioro y efectos incidentes de la actividad de los organismos. (4) Los microorganismos formadores de biopelículas sobre superficies metálicas excretan productos de desecho, o metabolitos. Los metabolitos poliméricos forman la matriz de la biopelícula. Debido a que las superficies no son uniformes, se diferenciarán condiciones fisicoquímicas en la interfase fluidometal cuyas áreas estén libres de biopelículas, de aquellas en la interfase fluido-metal de las áreas cubiertas por la biopelícula. Estas diferencias hacen que surjan varios gradientes, de los cuales el más comúnmente medido es el gradiente electropotencial o Celda Galvánica (medida potenciométrica en mV). Muchos metabolitos son ácidos orgánicos débiles. Las sales inorgánicas, como sales de cloruro de sodio, pueden reaccionar con estos ácidos débiles, formando ácidos inorgánicos fuertes (por ejemplo, ácido clorhídrico). (4) II.3. FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA II.3.1. Definición de Microbiología La microbiología es la parte de la ciencia dedicada al estudio de organismos que son muy pequeños para ser vistos a simple vista. (4) Capítulo II. Marco Teórico 14 II.3.2. Bacterias Las Bacterias son los organismos unicelulares que, a diferencia de las células de los animales, contienen paredes celulares. Su tamaño varía entre 0.2 y 3 micras de diámetro. Hay tres formas básicas de las bacterias: las bacterias espirales, algunas de las cuales se llaman espiroquetas, incluyen el Treponema pallidium, el organismo causante de la sífilis (ver Figura 1). También se pueden encontrar bacterias redondeadas, denominadas cocos. Los organismos médicamente significativos tales como Staphylococcus y Streptococcus se incluyen en este grupo. El tercer tipo es el que tiene forma de barra y se llaman bacilos. En este último grupo están incluidas las Pseudomonas, un organismo importante en la degradación de combustibles y fluidos de corte. Figura 1. Diversas formas bacterianas encontradas en combustibles y sistemas de combustibles. Fuente:S/A. S/F. “Temas atuais relacionados á Biología”. (2005). Disponible en: http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm Capítulo II. Marco Teórico 15 Las bacterias son microorganismos procariotas de organización muy sencilla. Históricamente, los microbiólogos han caracterizado a las bacterias basándose en su forma y características fisiológicas. Los principales rasgos fisiológicos usados para categorizar las bacterias son: Química de la pared celular-reacción de coloración Habilidad para transformarse en endosporas Fuente de energía para su metabolismo (luz solar, moléculas orgánicas, oxígeno, u otros iones inorgánicos) Requerimientos de tolerancia de oxígeno Requerimientos de moléculas específicas para su alimentación (dióxido de carbono o moléculas orgánicas) Habilidad para producir productos finales específicos (metabolitos) La prueba de coloración más comúnmente utilizada es la Coloración de Gram, desarrollada por Christian Gram en 1884. La coloración divide claramente a las bacterias en dos categorías: Gram positivas (G+) Gram negativas (G-) Cuando se observa bajo la luz del microscopio, las bacterias G+ aparecen coloreadas de azul o violeta. Las bacterias G- aparecen rosadas. Los microbios encuentran sus requerimientos energéticos por tres vías: Capítulo II. Marco Teórico 16 Fotosintético. Los organismos fotosintéticos convierten directamente la luz en energía. Todos los demás organismos obtienen su energía de moléculas orgánicas e inorgánicas. Oxidativo. El metabolismo oxidativo usa moléculas inorgánicas como oxígeno, sulfato o nitrato. Fermentativo. El metabolismo fermentativo usa moléculas orgánicas. Los microbios que dependen del oxígeno para su metabolismo oxidativo son conocidos como Aerobios. Los aerobios no pueden crecer en ausencia de oxígeno. Los Anaerobios Obligados no pueden tolerar el oxígeno. Algunos anaerobios obligados dependen de sulfatos o nitratos para su metabolismo oxidativo. Anaerobios fermentativos usan moléculas orgánicas. Algunos tipos de bacterias pueden operar como aerobios cuando existe oxígeno disponible, y pueden cambiar su metabolismo energético a fermentativo una vez que se alcance una atmósfera libre de oxígeno. Estos microbios son llamados Anaerobios facultativos. La biodegradación incluye todos los procesos por los cuales los organismos rompen las moléculas o, de una forma u otra, las transforman. Aunque algunas moléculas que son productos de biodegradación pueden ser nutrientes, no siempre ocurre así. Ciertamente, algunas, pueden ser más tóxicas que la molécula original de la cual fue derivada. Las moléculas nutritivas incluyen aquellas que suministran energía. Capítulo II. Marco Teórico 17 Es difícil determinar una correcta designación taxonómica de una bacteria. Aunque más de un millón de especies diferentes de bacterias han sido identificadas, los microbiólogos estiman que sólo se han descubierto 1/10000 especies de bacterias sobre la Tierra. Afortunadamente, para el personal responsable del control de la contaminación microbiológica en sistemas de combustibles, la información no-taxonómica es más fácil de obtener y es, generalmente, más útil para las decisiones sobre el control de la contaminación. La Tabla 1 enumera las bacterias más comúnmente recuperadas de los sistemas de combustibles. (4) Tabla 1. Bacterias comúnmente recuperadas de muestras de combustibles contaminadas Taxa Acinetobacter spp. Aerobacter spp. Aeromonas spp. Alcaligenes spp. Bacillus spp. Taxa Desulfovibrio desulfuricans Flavobacter spp. Micrococcus spp. Pseudomonas spp. Fuente: S/A. S/F. “Jet Fuel Biodeterioration. Kerosene prevention against microorganisms”. S/L. (2005) II.3.3. Hongos Los hongos comprenden el segundo mayor grupo de microbios comúnmente recuperados del sistema de combustible. Los hongos incluyen diversos tipos de organismos que van desde levaduras unicelulares hasta largos hongos. Los mohos forman filamentos-largos, hilos enredados de células. El crecimiento de filamentos ocurre cuando la célula se divide. En líquidos, las Capítulo II. Marco Teórico 18 colonias de mohos, generalmente aparecen en formas esféricas y gelatinosas. En la interfase combustible-agua los hongos pueden formar una densa película que puede ser, estructuralmente, bastante fuerte. Más de un millón de diferentes especies de hongos han sido descritas, aunque sólo algunas son recuperadas de combustibles y sistemas de combustibles habitualmente. (4) II.3.3.a Levaduras Las levaduras, como las bacterias, son organismos unicelulares que son algo más grandes que las bacterias y que tienen menos variación en su forma; son redondeadas u ovaladas. Las levaduras pueden también formar colonias en medios de cultivo sólidos. Estas colonias son muchas veces indistinguibles y requieren a menudo un análisis adicional para confirmar su identidad. (12) II.3.3.b Mohos A diferencia de las bacterias y de las levaduras, los mohos pueden estar compuestos por más de una célula. Los mohos son organismos que pueden ser observados a simple vista sin la ayuda de cualquier instrumento que magnifique. Sin embargo, los mohos pueden también, formar colonias en medios de cultivos sólidos y éstos son fácilmente distinguibles de las bacterias y de las levaduras por su aspecto borroso y filamentoso. (12) Capítulo II. Marco Teórico 19 II.4. ACTIVIDAD MICROBIANA II.4.1. Metabolismo de Nutrición Carbono. Todos los microorganismos necesitan una fuente de carbón, para alimentarse y una fuente de energía para llevar a cabo su metabolismo. Al igual que los demás organismos, los microbios excretan productos de desecho. Los productos de desechos carbonados van desde dióxido de carbono hasta polímeros de alto peso molecular constituidos por cadenas de aminoácidos (péptidos) y azúcar. Llevando a cabo una serie de pruebas que verifiquen los diferentes cambios químicos que se dan en los sistemas de combustibles, es posible reconocer el proceso de biodeterioro. Los microbios reducen los combustibles de menor peso molecular, hidrocarburos alifáticos, selectivamente, enriqueciendo al combustible con más cadenas complejas. El biodeterioro se verá reflejado en cambios en la distribución de los puntos de ebullición. (4) Nitrógeno y Azufre. Además del Carbono, todos los organismos requieren Nitrógeno, Fósforo y Azufre. Los microbios atacan compuestos nitrogenados (aminas, amidas, cicloamidinas, amidinas y nitrilos) que pudieran encontrarse en el combustible. Parte del Nitrógeno se incorpora a la biomasa como aminoácidos. El balance se excreta como Amoníaco (generalmente, como el ion amonio –NH4+). Las bacterias nitrificadas oxidan los iones amonio a nitritos (-NO2-) y nitratos (NO-3). Capítulo II. Marco Teórico 20 Similarmente, los compuestos azufrados son metabolizados para suministrarle el azufre necesario para el crecimiento de los microorganismos. Algunos microbios almacenan gránulos de azufre elemental (S0) como reserva de energía. Otros, oxidan compuestos azufrados, produciendo iones sulfatos (SO4=). Las bacterias que oxidan el azufre se desarrollan en ambientes bastante ventilados y fuertemente acidificados (pH<2; acidez comparable al ácido sulfúrico 2.0N). Las bacterias sulfato-reductoras utilizan SO4= como un aceptor de electrones terminal, produciendo sulfuro de hidrógeno (H2S) en el proceso. Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) y otros géneros de anaerobios obligados producen la enzima hidrogenasa. La hidrogenasa juega un papel importante en la Corrosión Inducida por Microorganismos (CIM). Cuando se desarrolla una celda galvánica sobre la superficie de un metal, se forma una región anódica y una región catódica. En la celda, los electrones (e-) fluyen del ánodo al cátodo, dándole al cátodo una carga negativa. Los protones (H+) son atraídos hacia la superficie catódica. Cuando la concentración de H+ y ese igualen, cesará el flujo de electrones y la superficie estará pasiva o equilibrada. La enzima hidrogenasa remueve los iones H+, acelerando el flujo de electrones. Esto se traduce en una aceleración del proceso de corrosión. Carbono, Hidrógeno, Oxígeno, Nitrógeno, Azufre y Fósforo son todos macronutrientes. Un déficit significante en la concentración absoluta o Capítulo II. Marco Teórico 21 relativa de cualquiera de estos elementos podría restringir el crecimiento y proliferación de los microbios. Igualmente, los microbios necesitan otros elementos en menores cantidades, conocidas como micronutrientes. Algunos de los micronutrientes más comunes son: sodio, potasio, calcio, hierro, manganeso y magnesio. (4) II.4.2. Metabolitos Algunos microbios también excretan surfactantes, los cuales facilitan la biodegradación del combustible. Los biosurfactantes permiten, a los microbios degradadores de hidrocarburos, ponerse en contacto con moléculas no polares, esto constituye el primer paso en el metabolismo de hidrocarburos. Algunas consecuencias de la producción de biosurfactantes incluyen la emulsión del agua de depósito del combustible (formación de emulsión invertida). Las gotas de emulsión invertida traen consigo moléculas de contaminantes polares a la fase del combustible. Estas moléculas polares pueden polimerizarse, reduciendo la estabilidad del combustible y acelerando la sedimentación. (4) Capítulo II. Marco Teórico 22 II.5. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD MICROBIANA Los principales factores que afectan el crecimiento microbiano son: Aire (disponibilidad de Oxígeno) Agua Temperatura pH Disponibilidad de nutrientes Aire. Los aerobios requieren oxígeno para poder ser activos (generalmente >5 mg/L). Los anaerobios sólo pueden ser activos en atmósferas libres de oxígeno (generalmente < 2 mg/L). (4) Agua. Los microbios no requieren la total ausencia de agua. Debido a que la habilidad del combustible para retener agua disminuye con la temperatura, las condiciones de ausencia de agua, generalmente, se alcanzan a medida que el combustible se enfría. El agua que no se mantiene suspendida en el combustible, precipita y se acumula como agua de depósito. Una gota de agua de 1.0mm de diámetro (~0.5mm3) puede acomodar varios millones de bacterias. (4) Temperatura. Cada tipo de microbio tiene una temperatura característica en la cual se da su crecimiento óptimo. Según esto, existen tres patrones generales: Capítulo II. Marco Teórico 23 Sicrófilos obligados: cuyo crecimiento óptimo es a temperaturas menores de 20° C. Mesófilos: requieren temperaturas moderadas (20-40° C) Termófilos obligados: son aquellos microbios que requieren temperaturas >45° C. (4) pH. El agua precipitada presente en el combustible, mejor conocida como agua de depósito, generalmente, tiene un pH de 6.8-8.5. Sin embargo, algunos procesos biológicos y químicos pueden afectar considerablemente el pH del agua. Es importante destacar que el pH es una propiedad de sustancias acuosas, por lo tanto, los combustibles podrían tener mediciones de acidez o basicidad. Aunque estas propiedades están relacionadas al pH, no tienen el mismo significado. Estas propiedades de combustibles son análogas a la alcalinidad y la acidez, las cuales se describen a continuación. El pH, definido como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno en una solución acuosa (-log [H+]), es la medición de las propiedades ácido-base de un líquido. Los fluidos con pH > 7.0 son considerados alcalinos. Aquéllos con pH < 7.0 son ácidos y las soluciones neutras tienen un pH~7.0. La capacidad buffer de un fluido es su resistencia al cambio de pH. Esta resistencia, generalmente reportada en mg CaCO3/l, se conoce como alcalinidad o acidez dependiendo de la dirección del cambio que está ofreciendo resistencia. Capítulo II. Marco Teórico 24 Los microbios alcalinofílicos crecen solo en atmósferas cuyo pH sea mayor que 8. Los microbios acidófilos requieren atmósferas de pH menores que 4. La mayoría de los microbios prefieren atmósferas cuyos pH estén en el rango de 6-8.5. Cuando el pH del agua de depósito de los combustibles sea mayor que 8 y su alcalinidad sea mayor que 1.000 mg CaCO3/L, es muy probable que los constituyentes alcalinos del combustible hayan pasado a la fase acuosa. Un pH<6 con una acidez >150 mg CaCO3/l indica biodeterioro del combustible. Cuando una bacteria es cultivada en el laboratorio, por lo general, produce ácidos que interfieren en su crecimiento; para neutralizar estos ácidos y mantener el pH adecuado, se adicionan soluciones amortiguadoras en el medio de cultivo. (4) Disponibilidad de nutrientes. En sistemas de combustibles, los microbios que no son capaces de usar los componentes hidrocarburos del petróleo todavía son capaces de sobrevivir. Primero, los constituyentes no-hidrocarburos del combustible pueden ser lo suficientemente nutritivos para los organismos degradadores de este tipo de componentes. Segundo, los metabolitos producidos por los degradadores de hidrocarburos pueden sostener una gran variedad de microbios degradadores de componentes no-hidrocarburos. De hecho, sin una cadena alimenticia dinámica, en la que los desechos de los Capítulo II. Marco Teórico 25 microbios sean el alimento de otros, la acumulación de metabolitos podría convertirse en agentes tóxicos para los organismos. La biopelícula formada por bacterias que producen biosurfactantes aumenta la disponibilidad de moléculas no-polares en el combustible para su propio consumo y para el consumo de los organismos vecinos que no producen biosurfactantes. (4) II.6. FACTORES OPERACIONALES Muchos factores operacionales importantes afectan la contaminación microbiana en sistemas de combustibles. Estos incluyen la configuración del sistema y buenas prácticas de operación. II.6.1. Configuración del sistema. La dinámica del flujo de líquidos en la mayoría de los tanques se puede describir en tres zonas. Generalmente, hay una zona en el fondo del tanque que es prácticamente inmóvil. Es en esta zona donde se acumulan agua, lodos y sedimentos y hay muy poca circulación, exceptuando los momentos en que se drenan los tanques. Bajo condiciones normales de operación, la interfase combustible-agua reposa en esta zona. De igual forma, es aquí donde se dan las condiciones más óptimas para el crecimiento y desarrollo de los microbios. La biopelícula crece acumulándose sobre las paredes del tanque que está en contacto con Capítulo II. Marco Teórico 26 esta zona, y aunque esta biopelícula constituye sólo el 5% del volumen total del tanque, es la primera zona de biodeterioro. En contraste, más del 90% del fluido constituye la zona altamente cambiante o la zona de gran flujo o circulación. Aunque los microbios pueden ser introducidos durante el tránsito a través de tuberías y tanques, es muy poco probable que ellos empiecen a degradar el combustible sin antes asentarse o depositarse en el fondo del tanque. La tercera zona está muy poco caracterizada. Es la zona de transición entre la región donde el flujo es prácticamente cero y la región de mayor flujo en el combustible. En su límite inferior, la zona de transición es prácticamente indistinguible de la zona inmóvil del fondo. Los metabolitos producidos en la zona inmóvil del fondo del tanque se difunden a la zona de transición. En esta zona también se pueden encontrar micelas, producto de la emulsión invertida y estalagmitas de biopelícula. Si se agita el tanque, mezclando el fluido, se va acercando más a la zona cambiante o de mayor flujo en el combustible. Los microbios y metabolitos pueden ser transportados a la zona de mayor flujo y, consecuentemente, llevarlos a otros componentes de sistemas de combustibles. (4) II.6.2. Mantenimientos básicos. Aunque puede no ser posible prevenir totalmente la actividad microbiana, es importante reducir el volumen total y el Capítulo II. Marco Teórico 27 área superficial que conduce a la actividad microbiana. En la mayoría de los casos, mientras más seco se encuentre un sistema, menor será el riesgo de problemas de biodeterioro. Un sistema capaz de remover todo excepto 10-20 ppm de agua (0.2-0.4 m3 agua en un tanque de 20000 m3 de capacidad) va a tener menos problemas de contaminación microbiana que un sistema que deje ≥ 1% de agua en él (200 m3 en un tanque de 20000 m3 de capacidad). (4) II.7. ECOLOGÍA MICROBIOLÓGICA DE SISTEMAS DE COMBUSTIBLES Comunidades y Consorcios En sistemas de combustibles, las comunidades forman biopelículas. Estas biopelículas se desarrollan en las interfases del sistema, las cuales incluyen las interfases de: combustible-aire, combustible-tanque, tanque-aire, combustible-agua y agua-tanque. Por ejemplo, las bacterias sulfatoreductoras requieren una atmósfera libre de oxígeno (anóxica) de manera que puedan desarrollarse y reducir el sulfato a sulfito. Las bacterias aeróbicas y facultativas consumen el oxígeno que pudo permear la región superficial de la biopelícula. Consecuentemente, ellas crean un ambiente adecuado para el desarrollo de las bacterias sulfato-reductoras en la base o en el fondo de la biopelícula. Además, las bacterias sulfato-reductoras prefieren los ácidos dicarboxílicos C1 a C3 como su fuente de alimentación primaria, los mismos ácidos orgánicos débiles que fueron mencionados anteriormente a propósito de la corrosión inducida por microorganismos. Los Capítulo II. Marco Teórico 28 microorganismos capaces de atacar combustibles de alto peso molecular y moléculas de aditivos de combustibles, excretan metabolitos que las bacterias sulfato-reductoras y otros microorganismos pueden digerir. Los microorganismos que usan estos metabolitos como alimento los previenen de convertirse tóxicos metabolitos. La para suma los de microorganismos que generaron las actividades de los estos consorcios de microorganismos es dramáticamente mayor que la de sus miembros individuales. (4) II.8. BIOMASA Y BIOPELÍCULA Los microorganismos en la biopelícula se comportan de modo diferente que las bacterias en un medio de cultivo. La Tabla 2 enumera las diferentes propiedades que caracterizan a las biopelículas. Tabla 2. Propiedades Básicas de las biopelículas PROPIEDADES BÁSICAS DE LAS BIOPELÍCULAS Comunidad de varios tipos de microorganismos que cooperan entre sí Los microorganismos están dispuestos en microcolonias Las microcolonias están rodeadas por una matriz que las protegen Entre las microcolonias hay diferentes ambientes Los microorganismos en la biopelícula son resistentes a los antibióticos y a los antimicrobianos Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm Capítulo II. Marco Teórico 29 Vistos a través del microscopio, las bacterias en la biopelícula no están distribuidas caprichosamente, están agrupadas en microcolonias rodeadas por una matriz intermicrobiana. La matriz es penetrada por fluidos y canales que conducen una corriente de nutrientes, productos de desechos, enzimas, productos de secreción del metabolismo y oxígeno. Estas colonias tienen un micro ambiente con diferentes pH, disposición de nutrientes, y concentraciones de oxígeno (Ver Figura 2). (10) Figura 2. Diagrama del proceso de formación de una biopelícula. Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm II.8.1.Biopelículas Las biopelículas son comunidades microscópicas que consisten, principalmente, en una comunidad de células microbianas, algas, hongos, bacterias y de un biopolímero extracelular que estas células producen. Forman capas finas en todas las superficies incluyendo sistemas Capítulo II. Marco Teórico 30 combustibles. En las biopelículas pueden adherirse ciertas bacterias a la superficie y diferenciarse en una estructura compleja multicelular. Las bacterias se adhieren a la superficie por apéndices proteicos caracterizados por una estructura que se engancha en la superficie donde va a permanecer. Una vez que una cierta cantidad de estos "brazos" pegan la célula a la superficie es muy difícil desplazar a este organismo. Una vez fijado, empiezan a producir material polimérico, consistente básicamente de polisacáridos y agua. La cantidad producida puede exceder la masa de las células bacterianas por un factor de 100 veces o más. La estructura de la biopelícula provee una protección muy favorable para la supervivencia del organismo. Los microorganismos comúnmente se adhieren a superficies tanto vivas como inertes y forman biopelículas hechas de polímeros extracelulares que facilitan la adhesión y proveen una matriz estructural. En este estado, los microorganismos son altamente resistentes al tratamiento antimicrobiano y están tenazmente aferrados a la superficie. Capítulo II. Marco Teórico 31 Figura 3. Polímeros extracelulares (polisacáridos) visualizados a través de un microscopio electrónico. Fuente: LEVIT, Bernando. (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa” (2005). Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm Las biopelículas se desarrollan cuando los microorganismos se adhieren irreversiblemente a una superficie sumergida y producen polímeros extracelulares que facilitan la adhesión. Estos polímeros son ante todo, polisacáridos, que pueden ser visualizados con un microscopio electrónico (ver Figura 3). De hecho, la mayor parte de las biopelículas, están compuestos de esta sustancia extracelular polimérica, más que de células, y esto ha sido confirmado por el microscopio. Esta superficie puede ser inerte, material sin vida o tejido vivo. (10) El taponamiento prematuro de filtros es el síntoma más comúnmente observado de acumulación de biomasa. Para comprender mejor como los microbios obstruyen los filtros, resulta bastante útil entender los procesos básicos del desarrollo de la biopelícula. (4) Capítulo II. Marco Teórico 32 Colonización Inicial. Cuando un sistema combustible es puesto en servicio, éste podría estar ya contaminado con microbios latentes adsorbidos a través de partículas de polvo y otros residuos. Los tanques son, generalmente, probados con agua antes de ser puestos en servicio. El agua usada para estas pruebas contiene, generalmente, 102 a 106 microorganismos/ml. Como consecuencia, los microorganismos se asientan en el sistema de combustible antes que el sistema sea puesto en servicio. Una vez en servicio, los tanques respiran a medida que se añade o se remueve combustible. Durante los ciclos de succión, las partículas de polvo y agua entran al tanque a través de orificios o escapes. También, el combustible puede tomar los microorganismos de cada etapa de los canales de distribución desde la refinería hasta el consumidor último. Capítulo II. Marco Teórico 33 Figura 4. Dinámica de la formación de biopelículas: a) Inoculación y asentamiento inicial-las bacterias se asientan sobre la superficie y comienzan a producir limo o sedimentos; b) Formación de microcolonias a partir de la reproducción del asentamiento inicial. Se empiezan a desarrollar gradientes electroquímicos entre las zonas expuestas y las zonas sumergidas; c) Biopelícula madura. Las microcolonias se han desarrollado a través de la biopelícula. Los canales facilitan el transporte de nutrientes y desechos. Las condiciones fisicoquímicas en la biopelícula madura son sustancialmente distintas de aquellas condiciones del resto del fluido. Fuente: PASSMAN, F. Fuel and Fuel System Microbiology-Fundametals, Diagnosis and Contamination Control. USA. Una vez los microbios estén en el sistema combustible, ellos tienden a asentarse y a difundirse (Ver Figura 4). Muchas especies de bacterias producen biopolímeros mucilaginosos, viscosos, conocidos como sustancias poliméricas extracelulares (SPE). Cuando una bacteria hace contacto con la superficie, la SPE permite al microorganismo adherirse a ella. Bajo condiciones apropiadas, los microbios pioneros (aquellos en adherirse primero) empiezan a multiplicarse. El tiempo de generación para las Capítulo II. Marco Teórico 34 bacterias encontradas en sistemas de combustibles es, generalmente, 0.5-6 horas. Como consecuencia, en unas cuantas horas después de la adhesión, los pioneros forman pequeñas colonias. (4) Maduración de la biopelícula. Una biopelícula madura comparte muchas características similares con los organismos multicelulares, alimentándose de los nutrientes disponibles y excretando sus desechos en el fluido donde están inmersos. Debido a la viscosidad y a la polaridad natural del material de la biopelícula, las partículas inorgánicas quedan inmersas en la sustancia polimérica extracelular (SPE). Por lo tanto, se tendrán microorganismos y sus metabolitos enredados en una matriz viscosa y acuosa, que también estarán combinados con moléculas orgánicas, organometálicas e inorgánicas. (4) Equilibrio Dinámico. Las biopelículas maduras son dinámicas. Al igual que la piel, cuyas células externan mueren y se desprenden, pequeños pedazos de biopelículas se desprenden y son transportadas a través de un medio en suspensión. Aunque las dimensiones aparentes de las comunidades de las biopelículas pueden parecer estables, ellas están renovándose constantemente. La apariencia general de la biopelícula refleja las condiciones bajo las cuales se desarrolló. En sistemas de elevado flujo (por ejemplo, en tuberías) las biopelículas tienden a ser uniformes y compactas. Las biopelículas suaves se Capítulo II. Marco Teórico 35 tienden a formar en ambientes en reposo (por ejemplo, las paredes de tanques de almacenamiento). Virtualmente toda (> 99%) la biomasa en un sistema de combustibles se encuentra en biopelículas. (4) II.9. MÉTODOS DE TOMA DE MUESTRA Y DETECCIÓN CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN TANQUES Y EN SISTEMAS DE Probablemente en más que cualquier otro tipo de contaminación combustibles, la contaminación microbiana tiende a tener una alta dispersión heterogénea la cual será, posiblemente, un continuo estado de cambio. Se pueden dar cambios en el número total de microorganismos presentes, en su viabilidad, en el número relativo a los tipos de microorganismos predominantes (género y especie) y en la cantidad de biomasa microbiana presente. Estos cambios pueden ser ocasionados por la actividad microbiana por sí misma o puede ser una consecuencia de las actividades o condiciones en las que opera el tanque o el sistema; es por esto, que, aparentemente, el tiempo en el que se realiza la toma de muestras y los puntos adecuados donde debe ser tomada la misma, requieren especial consideración y una cuidadosa planificación. (4) Capítulo II. Marco Teórico 36 II.10. FACTORES QUE MICROORGANISMOS EN COMBUSTIBLES AFECTAN TANQUES LA DISTRIBUCIÓN Y EN SISTEMAS DE DE Los microorganismos proliferarán activamente solo si existe la presencia de una fase acuosa. En un tanque/sistema de poco flujo o en reposo, la fase acuosa se localizará, generalmente, en el punto más bajo o en el fondo de éste. Los cambios de temperatura pueden desencadenar la condensación de agua del combustible y del aire en el tanque; dicha agua condensada puede acumularse en forma de gotas en las paredes del tanque. La fase acuosa no debe, necesariamente, ser de gran volumen para que exista crecimiento microbiano. Probablemente, el área superficial de la interfase combustible-agua, sea lo más importante en la determinación de la extensión de la proliferación microbiana. El nivel de nutrientes hidrocarburos será, particularmente, alto en la vecindad inmediata de esta interfase. La concentración de oxígeno también será relativamente alta, ya que, el combustible por sí mismo contiene una cierta cantidad de oxígeno disuelto. Como consecuencia de esto, se promoverá el crecimiento microbiológico aeróbico extendiéndose sobre la interfase hongos filamentosos. Estos filamentos pueden producir esporas hidrofóbicas, que permanecerán suspendidas en la fase combustible. Las bacterias y hongos (levaduras y mohos) pueden producir surfactantes que ocasionan la formación de una capa emulsionada y la pérdida de una distinción clara entre las fases acuosas y combustibles. Capítulo II. Marco Teórico 37 La materia polimérica producida por microorganismos también mostrará afinidad tanto por la fase acuosa como la fase combustible. Un gran número de microorganismos se desarrollan formando biopelículas (viscosas) sobre las superficies internas del tanque, especialmente aquellas superficies que se encuentran en contacto directo con el agua depositada en el fondo de éste. Las bacterias sulfato-reductoras (anaeróbicas), un importante grupo de microorganismos relacionadas al proceso de corrosión y a la generación de azufre, tienden a encontrarse en lo más profundo de las biopelículas, donde los niveles de oxígenos son escasos, el potencial óxido-reducción es bajo y donde se mantienen por la producción de ácidos orgánicos a cargo de los degradadores aeróbicos primarios del combustible. La Figura 5 muestra una distribución típica de microorganismo en un tanque de almacenamiento en reposo. Capítulo II. Marco Teórico 38 Figura 5. Distribución típica de microorganismos en un tanque de almacenamiento de combustible contaminado en reposo. La fase combustible, generalmente, solo contendrá microorganismos aeróbicos, los cuales lentamente se asentarán en la interfase combustibleagua. Los niveles de nutrientes hidrocarburos y de oxígeno será relativamente alto en la interfase, por lo que, se promueve el crecimiento de microorganismos aeróbicos en el agua que se encuentra inmediatamente bajo el combustible. En el fondo del tanque, el oxígeno es escaso, el potencial óxido-reducción se vuelve negativo y es cuando se promueve el crecimiento anaeróbico de bacterias sulfato-reductoras con la consecuente generación de azufre (S-). Fuente: PASSMAN, F. Fuel and Fuel System Microbiology-Fundametals, Diagnosis and Contamination Control. USA Aparentemente, aunque el crecimiento microbiano está restringido a las áreas en la vecindad inmediata del agua, puede haber penetración de microbios hacia la fase combustible. En un sistema en reposo, esta penetración generalmente será de no más de unos pocos centímetros. Sin embargo, si hay perturbaciones físicas del tanque o sistema, particularmente si las interfases se rompen, ocurrirá una gran dispersión de microbios hacia el combustible. Por ejemplo, las operaciones de llenado de tanques y movimiento de productos ocasionarán una turbulencia significativa y una Capítulo II. Marco Teórico 39 dispersión de microorganismos en el combustible, esto traerá problemas de ensuciamiento y taponamiento de filtros a los usuarios. Debido a que la densidad de los microorganismos es, considerablemente, mayor que la del combustible, después de un tiempo, los microbios suspendidos en la fase combustible se asentarán en el fondo del tanque. De acuerdo a la Ley de Stoke, la velocidad a la cual se asientan es una función de la viscosidad del combustible y de la densidad y diámetro de las partículas microbianas. Esto determina que una célula microbiana típica de, por ejemplo, 2μm de diámetro, se asentará en, aproximadamente, 0,2cm/h en un gas oil típico; y es por ello que puede tomar varias semanas, incluso meses, para que se asienten del todo. La fase combustible presenta un ambiente hostil para la mayoría de los microorganismos. Sólo las esporas (microbios en estados viables pero inactivos) tienen la capacidad de desarrollar una viabilidad a largo plazo en la fase combustible. La mayoría de las bacterias presentes en los combustibles no producen esporas y, por tanto, mueren rápidamente, a menudo en días o en horas, a menos que estén contenidas en gotas de agua. Las levaduras tienden a sobrevivir un poco más, mientras que los mohos, los cuales tienden a producir esporas proliferándose en la interfase agua-combustible, pueden sobrevivir indefinidamente. Es importante destacar que la contaminación de combustibles causada por microorganismos muertos puede, todavía, causar Capítulo II. Marco Teórico 40 problemas operacionales tal como la obstrucción de filtros. La poca capacidad de sobrevivencia de algunos microorganismos en la fase combustible tiene algunas implicaciones en la validez de los resultados de las pruebas realizadas cuando hay un gran retardo entre la toma de muestras del combustible y el hecho de llevar a cabo los análisis para los microorganismos viables (por ejemplo, conteo de unidades formadoras de colonias). Los análisis para microorganismos viables que son llevados a cabo unos cuantos días después de la toma de muestras del combustible podrían subestimar significativamente la contaminación de éste. Es importante tener en cuenta el riesgo para la salud debido a los contaminantes microbiológicos en los combustibles, aunque la presencia de organismos patógenos es muy poco probable. Debido a que, generalmente, no se requiere, entrar al tanque para tomar las muestras, no hay una exposición directa de la persona que toma la muestra a grandes cantidades de contaminantes microbianos. Como consecuencia de esto, en la mayoría de los casos no habrá un riesgo microbiológico significativo para la salud de aquellos que toman las muestras. La toma de muestras de combustibles como parte de una investigación microbiológica no representa, generalmente, ningún peligro para la salud, al igual que la toma de muestras para cualquier otro propósito. Un riesgo significativo para la salud se presentará cuando el personal necesite entrar a un tanque que contenga una gran cantidad de residuos de crecimiento microbiológico. Por ejemplo, la inspección del tanque Capítulo II. Marco Teórico 41 de combustible de un avión, donde las superficies internas estén cubiertas de mohos que exhiban un crecimiento de esporas. En este caso se deberían tomar las precauciones pertinentes. (4) II.11. INVESTIGACIÓN EN TANQUES Y SISTEMAS COMBUSTIBLES Cuando la tarea es determinar la presencia de contaminación en un tanque/sistema, un análisis microbiológico de una muestra de la fase acuosa resulta lo más apropiado. Una muestra de la fase acuosa será una muestra en “el peor de los estados”. Los microbios en esta agua tienen el potencial de contaminar el combustible pasando del tanque hacia el sistema deseado por el usuario, con las implicaciones adversas pertinentes a la calidad del combustible y a la diseminación de la contaminación en la posterior cadena de distribución del combustible. (4) II.12. INVESTIGACIÓN DE LA CALIDAD DEL COMBUSTIBLE Es necesario incorporar como parte del programa de las refinerías y de los centros de distribución de combustible, una rutina de revisión o chequeo de la calidad microbiológica de éste. Pero, es frecuente el caso en que la esta calidad sólo se chequea cuando la rutina de monitoreo de la fase acuosa del combustible indica que podría estar presente una contaminación significativa. Los chequeos también se hacen cuando un usuario final tiene una buena razón para sospechar que un combustible tiene una calidad dudosa. Las muestras de combustibles seleccionadas deben ser representativas del Capítulo II. Marco Teórico 42 tanque o sistema completo de combustible. Debido a la alta distribución heterogénea de la contaminación microbiológica en el combustible, una sola muestra muy pocas veces proporcionará los resultados adecuados que refleje la verdadera contaminación del fluido. Muchos operadores en la aviación llevan a cabo una rutina o un monitoreo microbiológico ocasional en los tanques de combustibles como una medida de precaución. Algunos factores resultan importantes, particularmente, aquellos factores relacionados al amplio rango de fluctuaciones de temperatura que sufre el tanque de combustible (menos de -40° C en vuelo a +40° C en tierra). Estas variaciones de temperatura afectan directamente la tasa de crecimiento microbiológico, así como también, la condensación de agua en el tanque. (4) II.13. PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRAS Cuando las muestras van a ser usadas en pruebas de cultivo para microorganismos viables, se deben tomar las precauciones pertinentes para asegurar que otros microorganismos, aparte de los que están presentes en la muestra, no contaminen la muestra, debido a que la contaminación de ésta puede perjudicar los resultados. La mayoría de las pruebas microbiológicas que involucran un período de incubación de varios días son pruebas de cultivo. Las partículas microbianas individuales en la muestra son cultivadas en un medio nutritivo, en el cual se reproducen, alcanzando poblaciones de Capítulo II. Marco Teórico 43 varios millones de microorganismos y empiezan a ser visibles como colonias contables (unidades formadoras de colonias o ufc) o se comienza a apreciar un cambio de color o turbidez en el medio de crecimiento. Si se introducen microorganismos que no pertenecen a la muestra durante el proceso de toma de muestras, éstos también se reproducirán durante el período de incubación y producirán un resultado artificial alto o hasta podrán enmascarar una genuina contaminación de combustible. Los microbios son ubicuos y aquellos que pueden contaminar las muestras pueden venir del aire, del personal que toma la muestra y del recipiente, equipo, tubería o accesorio donde se toma la muestra. Se deben tomar medidas razonables para minimizar las ocasiones en que la muestra pueda contaminarse y producir impactos adversos en los resultados de las pruebas o análisis. (4) II.13.1. Preparación para el Transporte y Análisis de Muestras Para minimizar retrasos entre la toma de muestra y el análisis, deben tomarse ciertas medidas antes de realizar el análisis, tales como: prepararse para las pruebas que se llevarán a cabo y realizar los arreglos necesarios en el transporte de la muestra hacia el laboratorio. Es muy probable que ocurran cambios en la población microbiana de la muestra durante el transporte de ésta. Se debe asegurar que, una vez tomada la muestra, mantener, en la medida de lo posible, las mismas características de la población microbiana Capítulo II. Marco Teórico 44 hasta el momento en que se llevará a cabo el análisis. Las muestras tomadas de sistemas a temperatura ambiente, idealmente, deben mantenerse frías (4°C) durante el transporte, pero nunca deben ser congeladas. El retraso entre la toma de muestras y el análisis debe ser minimizado, realizando las pruebas microbiológicas lo más pronto posible después de la que la muestra es tomada, esto es en un período no mayor de 48 horas. El uso de análisis in-situ tiene una gran ventaja, ya que, se reducen los retrasos entre la toma de muestra y el análisis. Si se está trabajando en un laboratorio analítico, es necesario avisar con antelación la entrega de la muestras, de modo que, el personal esté preparado para desarrollar los análisis y, así, minimizar retrasos. De igual forma, se debe facilitar al personal del laboratorio toda la información posible acerca del sistema del cual se tomó la muestra y las razones y objetivos de la investigación, de esta forma, se hará una mejor selección de los procedimientos que se desarrollarán en el laboratorio y conducirán a una mejor interpretación de los resultados obtenidos. Esta información puede incluir una descripción de la apariencia de la muestra al momento en el que se que tomó, temperatura del tanque/sistema, el método usado para descontaminar equipos o recipientes de toma de muestras, el volumen de la muestra de combustible y la ubicación y tipo de tanque. Si se han usado biocidas, las técnicas de análisis deben adaptarse para neutralizar este compuesto. (4) Capítulo II. Marco Teórico 45 II.13.2. Etiquetado Siempre se debe etiquetar los contenedores de muestras inmediatamente antes de llevar a cabo los análisis. Se debe preparar una etiqueta lo suficientemente detallada incluyendo las siguientes especificaciones: Lugar en el cual se tomó la muestra Descripción del material de la muestra Número de referencia o nombre del tanque, sistema, avión o barco Tipo de muestra (del tope, medio o fondo) Fecha y hora en la que se tomó la muestra Identificación del operador que tomó la muestra Cuando el laboratorio reciba la muestra, también debe reportar la fecha y la hora en la que fue recibida y la fecha y la hora en la que la muestra fue analizada. (4) II.13.3. Botellas y Contenedores de Muestras Las botellas en las que se tomará la muestra deben ser de un tamaño adecuado (las botellas de 500 mL son generalmente apropiadas) y tanto la botella como su tapa o rosca deben estar hechos de un material que sea compatible con el combustible (por ejemplo, no puede estar hecho de poliestireno). Las botellas de vidrio limpias son ideales, ya que éstas permiten un contacto visual preliminar, lo cual es una parte importante en cualquier investigación microbiológica. Idealmente, se deben usar botellas estériles. Las botellas de vidrio pueden esterilizarse calentándose en un Capítulo II. Marco Teórico 46 horno a 160° C por, al menos, 2 horas. También se pueden esterilizar en un autoclave (tratamiento con vapor a 103-138 KPa por 20 min). Pequeñas cantidades de agua residual en el contenedor de la muestra podría ocasionar resultados erróneos para los análisis de la fase combustible, porque cualquier microbio en la muestra siempre tenderá a concentrarse en el agua. (4) II.14. ORGANISMOS PRESENTES EN FLUIDOS HIDROCARBONADOS DERIVADOS DEL PETRÓLEO Existe una gran variedad de microorganismos identificados en la degradación de compuestos derivados del petróleo. La Tabla 3 muestra algunos de los microorganismos responsables de la degradación de combustibles, así como su género, su especie y el compuesto que éstos degradan. Tabla 3. Microorganismos responsables de la degradación de compuestos derivados del petróleo Género Acinetobacter Achromobacter Arthrobacter Alcaligenes Bacilus Beauveria Candida Cellulomonas Comamonas Deslfotobacterium Desulfococcus Flavobacterium Gordona Especie sp. baumanii calcoaceticus calcoaceticus sp. sp. sp. faecalis lentus mascerans alba tropicales flavigena acidovorans deshalogenans sp. devorans sp. Compuesto degradado n-Alcanos Hidrocarburos saturados y aromáticos Bifenilos policlorados Petróleo Crudo Bifenilos policlorados Hidrocarburos saturados y aromáticos Petróleo crudo Fenol Bifenilos policlorados Bifenilos policlorados Hidrocarburos saturados y aromáticos Petróleo crudo Petróleo crudo Bifenilos policlorados o-Clorofenol Alquilobencenos Bifenilos policlorados Dibenzotiofeno Capítulo II. Marco Teórico 47 Marinobacter Micrococcus Mycobacterium Nocardia Nocardipsis Paenbacillum Phormidium Penicillum Pleorotus Pseudomonas Rhizobium Rhodococcus Saccharomyces Serratia aquaelolei spp. chthonoplastes sp. sp. sp. sp. spp. corium simplicis simum ostreatus sp. sp. sp. sp. spp. aeruginosa fluorescens putida stutaeri meliloti sp. sp. erythropolis sp. sp. marcescens paucimobilis Petróleo crudo Pireno n-Alcanos Pireno n-Alcanos Dibenzotiofeno Petróleo crudo Dibenzotiofeno n-Alcanos Hidrocarburos saturados y aromáticos Polinúcleo aromáticos Tolueno Bifenilos policlorados Fenantreno Petróleo crudo Petróleo crudo Fenol Petróleo crudo Petroleo crudo Tetracloroetileno Dibenzotiofeno Dibenzotiofeno Alcanos Petróleo crudo Petróleo crudo Fenol Petróleo crudo HPAs Fuente: VALDERRAMA BLANCO, Brenda. S/F. México. “Microbiología del petróleo y sus derivados”. (2005). Disponible en:kjnjknkjnjnkjnjnknkjnkjnkjnknkjnkjnjknkjnkjnjnjnjnjknkjnjknjknjknjnjnjhbbjhb http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap2/imagenes/c2im3.html Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que permiten la oxidación más ó menos específica de algunas fracciones del petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversión a dióxido de carbono y agua. (22) Capítulo II. Marco Teórico 48 II.15. GÉNERO PSEUDOMONAS De las numerosas especies de Pseudomonas (familia Pseudomonadaceae), solamente Pseudomonas aeroginosas, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei, son consideradas patógenos importantes para el hombre. Los miembros del género Pseudomonas son bacilos gramnegativos móviles, aeróbicos, algunos pueden producir pigmentos y están ampliamente distribuidos en suelos, agua, plantas, animales, combustibles y fluidos lubricantes. Todos son bacilos gramnegativos, rectos o ligeramente curvados, catalasa positiva, usualmente oxidasa positiva y capaces de crecer a temperaturas de 4-43° C. (3) II.15.1. Pseudomonas aeroginosas La Pseudomonas aeroginosas está ampliamente distribuida en la naturaleza. Sus necesidades nutritivas son simples y pueden metabolizar una gran variedad de fuentes de carbono. De ahí su capacidad para multiplicarse en cualquier medio húmedo que contenga incluso cantidades mínimas de compuestos orgánicos. (3) Capítulo II. Marco Teórico 49 II.15.1a. Morfología En la Figura 6 se presentan bacilos gramnegativos aeróbicos de 0,5 a 1,0 por 1,5 a 3,0 μm. Se presenta aislado, en pares o cadenas cortas. Es inmóvil, no tiene esporas, ni posee cápsula. Cuando crece en ausencia de sucrosa, se produce una capa polisacárida extracelular, similar a una cápsula. (3) Figura 6. Tinción de Gram de la Pseudomonas aeroginosas Fuente: TODAR, K. (2004). Pseudomonas aeroginosas. (2005). Disponible en: http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html II.15.1.b. Aspectos microbiológicos Las Pseudomonas aeroginosa crecen rápidamente en diferentes medios de cultivos. Forman colonias lisas, redondas, de color verdoso fluorescente (ver Figura 7), algunas veces produciendo un olor dulzón o parecido a la uva, debido a la aminoacetofenona. A menudo producen un pigmento azulado, soluble en agua y cloroformo, no fluorescente, el cual difunde dentro del agar, llamado piocianina. La piocianina es un pigmento de fenazina, capaz de Capítulo II. Marco Teórico 50 inhibir el crecimiento a su alrededor de otras bacterias, especialmente grampositivas. La Pseudomonas aeroginosas es la única especie de Pseudomonas y de gramnegativo que producen piocianina. Muchas cepas de Pseudomonas aeroginosas producen también un pigmento fluorescente que le da un color verdoso al medio, la pioverdina. Otras cepas producen pigmentos de color rojo oscuro, la piorrubina, y otras un pigmento negro, la piomelanina. (3) Figura 7. Presencia de Pseudomonas aeroginosas en Cetrimide Agar Fuente: (S/A).(2003).All microbiology news. (2005). Disponible en: http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHist&m=MAY%202 003. II.15.1.c. Propiedades Bioquímicas Las Pseudomonas aeroginosas es un bacilo aeróbico obligado (crece en presencia de O2 solamente), no fermenta los hidratos de carbono, pero puede oxidar los azúcares, tales como glucosa y xilosa, pero no la maltosa. Producen gas a partir de nitratos y no producen ácido sulfhídrico o la Capítulo II. Marco Teórico 51 presencia de un precipitado negro en el fondo tubo de ensayo en medio Starkey. (3) II.15.1.d. Propiedades metabólicas La Pseudomona aeroginosa es un microorganismo extremadamente adaptable que puede utilizar más de 80 compuestos orgánicos diferentes para su crecimiento, y el amoníaco puede servir como fuente de nitrógeno. La temperatura óptima para el crecimiento es de 37° C pero puede crecer a 42° C, no así a 4° C. (3) II.16. BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS Desulfovibrio desulfuricans ha sido catalogado como el agente causante del deterioro de muchas áreas de interés industrial. Ellas ocasionan la corrosión del acero y de tuberías de hierro (Ver Figura 8). Figura 8. Bacterias Sulfato-reductoras en una tubería Fuente: CALGARY,Alberta.2003. Canadá. “Iron, Manganese, Hydrogen Sulfide”. Disponible en: http://www.davnor.com/articles/publications/bio_residential/ironfact.pdf Capítulo II. Marco Teórico 52 Las bacterias sulfato reductoras más ampliamente conocidas son las Desulfovibrio desulfuricans, referidas también como BSR. Estas bacterias son no patógenas (que no causan ninguna enfermedad) y anaeróbicas (requieren de un ambiente libre de oxígeno), pero son capaces de causar corrosiones severas en materiales ferrosos en sistemas acuosos, debido a que ellas producen enzimas que tienen la propiedad de acelerar la reducción de sulfatos a ácido sulfhídrico (bastante corrosivo), por lo tanto, BSR actúan como un catalizador en la reacción de reducción. Sin embargo, para que esta reducción se lleve a cabo, deben estar presentes cuatro componentes, estos son: BSR, sulfatos, una fuente de energía en forma de electrones libres y la temperatura del agua debe ser aproximadamente menor a 65° C. (7) La presencia de bacterias sulfato reductoras en sistemas acuosos puede ser determinada mediante tres métodos: percepción sensorial, determinación del pH y análisis biológico. - Percepción Sensorial: como el ácido sulfhídrico es un sub-producto de su metabolismo, el olor característico a “huevo descompuesto” asociado al azufre es un indicador de la posible presencia de bacterias sulfato reductoras en sistemas acuosos. - Determinación de pH: como el ácido sulfhídrico es un sub-producto de su metabolismo, las BSR también causan una disminución en el Capítulo II. Marco Teórico 53 nivel del pH del agua (pH ~ 5). Por lo tanto, si son necesarias varias adiciones de sustancias básicas para mantener el nivel de pH cercano del sistema acuoso dentro de los límites establecidos, entonces es muy probable que exista la presencia de bacterias sulfato-reductoras. - Análisis biológico: se toman muestras del agua o del depósito del sistema y se analizan en un laboratorio. El procedimiento básico de esta técnica involucra elaborar un caldo nutritivo con las muestras tomadas para un posterior período de incubación. (7) II.17. ESTERILIZACIÓN El término esterilización denota la destrucción o eliminación de todos los organismos vivientes y sus esporas, de un determinado material o producto. El método para alcanzar la esterilidad está determinado por las características del producto. La elección del proceso de esterilización más adecuado requiere un conocimiento íntimo del equipo usado y de la estabilidad del material a esterilizar. El proceso de esterilización requiere, no sólo una estricta supervisión del equipo y procedimiento por parte de un personal bien entrenado en la Capítulo II. Marco Teórico 54 aplicación de los métodos de esterilización, sino también una prueba adecuada de la efectividad del procedimiento usado. (1) II.17.1. Métodos de esterilización Variados son los métodos utilizados para la esterilización de los cuales se pueden considerar: agentes físicos, químicos y mecánicos, tal como muestran las Tabla 4, 5 y 6. Tabla 4. Algunos agentes físicos utilizados para la esterilización Calor húmedo Calor Calor seco♣ Radiaciones No ionizantes Ionizante Agentes físicos Vapor a presión♣ Tindalización Agua hirviendo Pasteurización Aire caliente Incineración Ultravioleta Luz visible (inactivación fotodinámica) Rayos X, Gamma, etc Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12 Tabla 5. Algunos agentes mecánicos utilizados para la esterilización Agentes mecánicos Filtros de profundidad Filtración Filtros de superficie (membranas filtrantes) Ondas sónicas y ultrasónicas Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12 ♣ ♣ Método utilizado en el fase experimental del trabajo de grado Método utilizado en el fase experimental del trabajo de grado Capítulo II. Marco Teórico 55 Tabla 6. Algunos agentes químicos utilizados para la esterilización Agentes químicos Oxido de etileno, betapropiolactona, Gaseosos formaldehído Inorgánicos (cloruro de mercurio y óxido de mercurio) Derivados del mercurio Orgánicos (Mercuriocromo y Merthiolate) No Cuartenarios de Amonio (cloruro de gaseosos benzalconio y cloruro de benzetonio) Compuestos fenólicos (fenol y cresol) Aldehídos (glutaraldehído) Fuente: CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-12 II.17.2. Agentes Físicos II.17.2.a. Calor Las actividades metabólicas de un organismo, son el resultado de reacciones químicas y como tales son influenciadas por la temperatura. Las diferentes especies de microorganismos son capaces de crecer a temperaturas que varían ampliamente y cada tipo en particular tendrá una temperatura óptima, una mínima, y una máxima a la cual crecerá. Temperaturas por encima de la máxima ejercen un efecto letal sobre los microorganismos y temperaturas por debajo de la mínima, detienen su multiplicación y causan la muerte de alguna de las células de la población microbiana. La acción letal del calor depende de la relación tiempo-temperatura, relación que es afectada por numerosos factores, los cuales se deben tomar en consideración cuando se selecciona el tiempo y la temperatura requerida Capítulo II. Marco Teórico 56 para reducir la población microbiana a los límites deseados. (1) II.17.2.a.1. Calor húmedo El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de las proteínas. La presencia del agua facilita el proceso de destrucción de los microorganismos, lo cual se explica de la siguiente manera: La configuración natural de una proteína es estabilizada en parte por puentes de hidrógeno, especialmente entre los grupos carbonilo y amino de diferentes péptidos, el calor altera la configuración proteica y estos puentes en presencia de agua se pueden romper fácilmente y ser reemplazados por puentes de hidrógeno unidos a moléculas de agua. (1) Esterilización por vapor a presión Este proceso se lleva a cabo por autoclave y emplea vapor saturado bajo presión. A menos que se indique otra cosa, la esterilización en autoclave emplea vapor saturado a presión, a un mínimo de 121° C por 15 minutos contados a partir del momento que el material alcance 15 lbs de presión (121° C). La presión a la que el autoclave trabaja es medida por un dispositivo medidor de presión localizado en la salida de vapor del autoclave. Como el proceso depende tanto de la presencia de humedad como de la temperatura elevada, deben tomarse las medidas adecuadas para asegurar que todo el aire ha sido removido de la cámara del autoclave, previo al Capítulo II. Marco Teórico 57 comienzo del ciclo de esterilización, ya que de no ser así, la atmósfera no estará saturada de vapor de agua y no se logrará el efecto esterilizante deseado. El tiempo de exposición varía con la naturaleza del producto y el tamaño de los recipientes. Por ejemplo una solución en ampollas de vidrio delgado de 50 ml, puede llegar a los 121° C en 6-8 minutos o más en el caso que la solución sea envasada en botellas de vidrio grueso, de 1000 ml. Es importante recordar que no es la presión lo que mata a los gérmenes, sino la temperatura que alcanza el vapor bajo presión y el efecto hidrolítico del mismo. La presión es sólo un medio de lograr vapor de agua a temperaturas superiores a los 100° C, temperatura de ebullición del agua a presión normal. (1) Usos de la esterilización de vapor a presión El autoclave es esencial en cualquier laboratorio de microbiología, la mayoría de los medios de cultivo y materiales contaminados son rutinariamente esterilizados en él. Existen algunos materiales que no pueden ser esterilizados por autoclaves, entre ellos: sustancias no miscibles con el agua, como grasas y aceites, que como no son penetrados por el vapor, los gérmenes en su interior no son destruidos. Tampoco sustancias que se alteren con la humedad. (1) Capítulo II. Marco Teórico 58 II.17.2.a.2. Calor seco Deshidrata las células y destruye los microorganismos por oxidación de sus constituyentes. Este proceso se lleva a cabo usualmente en un horno esterilizante diseñado específicamente para ese propósito. Éste es calentado normalmente por gas o electricidad, que en algunos casos están provistos de un ventilador para hacer circular el aire con el fin de obtener una temperatura uniforme en todo su interior. La esterilización por calor seco se realiza usualmente a 160-170° C por un período de 2 a 4 horas. Se pueden emplear temperaturas más bajas y tiempos más largos para los materiales más sensibles, y temperaturas más altas y tiempos más cortos para los más resistentes al calor. El uso de la esterilización con calor seco se recomienda para esterilizar materiales termoestables que no se pueden esterilizar en autoclave, como por ejemplo aceites y polvos, y es el procedimiento de elección para esterilizar material de vidrio. (1) II.18. MEDIOS DE CULTIVO Los microorganismos para crecer deben obtener del medio ambiente todas las sustancias que ellos requieren para la síntesis de sus materiales celulares Capítulo II. Marco Teórico 59 y para la producción de energía. Estas sustancias son llamadas nutrientes. Por lo tanto un medio debe contener cantidades apropiadas de los requerimientos específicos de los microorganismos para los cuales ha sido diseñado. Sin embargo los microorganismos son extraordinariamente diversos en sus propiedades fisiológicas específicas y, como consecuencia, en sus requerimientos nutricionales específicos. Existe, por la razón antes expuesta, una gran variedad de medios de cultivos, los cuales pueden clasificarse de la siguiente manera: (1) II.18.1. Medios naturales o complejos Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las cuales usualmente son completadas por la adición de minerales y otras sustancias, es decir, que no se conocen todos los componentes del medio de cultivo ni las cantidades exactas que están presentes. Muchos de los componentes de los medios complejos son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos tejidos vegetales, carne, caseína, células de levadura, etc.; según la sustancia que se trate, proporcionan fuentes ricas en polipéptidos, aminoácidos, vitaminas o sales minerales. (1) Capítulo II. Marco Teórico 60 II.18.2. Medios definidos o sintéticos Son aquellos que ofrecen lo que se requiere para el crecimiento, en forma de productos químicos relativamente puros y a una concentración conocida. Los medios de cultivo pueden ser preparados en forma líquida o sólida. Cuando se requiere cultivar los gérmenes sobre medios sólidos se prepara un medio de cultivo líquido que se convierte en sólido añadiendo agente gelificante, el más usado es el agar aunque la gelatina y la sílica-gel también se usan en ciertas ocasiones. (1) II.18.3. Medios de cultivos de enriquecimiento y selectivos Los microorganismos varían ampliamente en sus requerimientos nutricionales y ambientales, es posible, eligiendo las condiciones apropiadas, seleccionar de una mezcla un tipo de microorganismo en particular, esto es lo que se llama un medio de cultivo de enriquecimiento o selectivo. (1) II.18.3.a. Medios de enriquecimiento Son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de bacteria u hongos en particular, permitiendo de esta manera aumentar el número de microorganismos de esa especie. (1) Capítulo II. Marco Teórico 61 II.18.3.b. Los medios selectivos Son semejantes a los de enriquecimiento, se diferencian por ser sólidos y son diseñados para el aislamiento de organismos específicos. Estos medios contienen usualmente una o más sustancias inhibidoras de los gérmenes excepto de aquellos que se quieren seleccionar. (1) II.19. FLUIDOS DE CORTE Los fluidos de corte son productos líquidos de composición más o menos compleja, que se adicionan en el sistema de piezas metálicas, a fin de lubricar y eliminar el calor producido. Generalmente, estos productos reciben el nombre genérico de "aceites de corte". Sin embargo, esta denominación no es del todo apropiada, si se tiene en cuenta que algunos de estos productos no contienen la más mínima cantidad de aceite mineral en su composición. Por tanto, la designación "fluidos de corte" resulta más correcta. Atendiendo a su contenido en aceite mineral, los fluidos de corte pueden clasificarse del siguiente modo: • Fluidos aceitosos o aceites de corte. • Fluidos acuosos o taladrinas, que a su vez pueden ser: o Emulsiones o Sintéticas Capítulo II. Marco Teórico 62 o Semisintéticas Con frecuencia, los fluidos de corte contienen aditivos, con el fin de proporcionarles cualidades determinadas, acordes con el propósito al que se les destina. Entre los aceites de corte, los aditivos más usuales son los de extrema presión. Por lo que respecta a las taladrinas, además de éstos pueden contener emulsionantes, antioxidantes e inhibidores de corrosión, bactericidas y bacteriostáticos, perfumes, colorantes, quelantes, etc. En determinadas circunstancias y especialmente en taladrinas semisintéticas y emulsiones, una disminución significativa de la concentración suele favorecer el crecimiento de la población microbiana, lo que facilita la reducción del pH y la degradación del producto. En los sistemas y depósitos de taladrinas que poseen buena aireación existe un predominio de microorganismos aerobios del género Pseudomonas, principales responsables de su degradación, así como coliformes. Por el contrario, en los sistemas mal aireados suelen aparecer organismos anaerobios estrictos del género Desulfovibrio, que reducen los sulfatos a sulfuro de hidrógeno, originando olores desagradables. También aparecen, con cierta frecuencia, hongos y levaduras de los géneros Fusarium, Cefalosporium y Cándida. En la Tabla 7 se muestra la cantidad de microorganismos detectados por volumen y por placa, así como también, las posibles acciones correctivas aplicadas a fin de solventar el problema de contaminación en el combustible. Capítulo II. Marco Teórico 63 Tabla 7. Microorganismos detectados por volumen y placa; acciones correctoras aplicadas en sistemas o tanques Microorganismos Detectados Bacterias/ml Mohos/placa <105 <3 105-107 3-10 >107 >10 Acción Correctora Aplicada No se adopta acción alguna Adicionar biocidas. Controlar semanalmente Cambiar el producto. Limpiar y desinfectar el sistema o tanque Fuente: LABORDA GRIMA, Roberto. S/F. España. “NTP 317: Fluidos de corte: criterios de control de riesgos higiénicos”. (2005). Disponible en: http://www.mtas.es/insht/ntp/ntp_317.htm Con independencia de las acciones indicadas, una forma sencilla y eficaz de paliar el problema de los malos olores es airear las taladrinas, a fin de suministrar al fluido, el oxígeno necesario para impedir el desarrollo de los microorganismos anaerobios responsables del problema en cuestión. Los Fluidos de Corte tienen las siguientes cualidades: Propiedades lubricantes que permitan construir películas aunque no sean más que de tipo molecular para disminuir las fricciones y tendencias a soldaduras locales Gran calor específico y propiedades refrigerantes Débil tensión superficial que sitúen el fluido de corte lo más cerca posible del filo o arista de la herramienta Propiedades anticorrosivas protectoras Carencia de efectos fisiológicos sobre el personal La mayor transparencia posible para no impedir la visibilidad del trabajo que se realiza Capítulo II. Marco Teórico 64 Una viscosidad apropiada si se requiere que ejerzan una acción de arrastre y evacuación de residuos metálicos. La Figura 9. muestra una representación de la labor de un Aceite de Corte en una maquinaria. Figura 9. Representación del funcionamiento de un Fluido de Corte en una maquinaria Fuente: CRESPO, M.; 1972; “Los lubricantes y sus aplicaciones”; INTERCIENCIA; España. II.19.1. Microorganismos asociados con el deterioro de los fluidos de corte Un número algo extenso de especies de microorganismos, que han sido aislado de algunos fluidos de corte, han demostrado su capacidad de crecer en el laboratorio. Dichos organismos vienen de una gran variedad de fuentes donde se crea un ambiente propicio para el desarrollo microbiano. Los principales microorganismos responsables del deterioro químico real de los fluidos debido a su propensión y números son aquellos que pertenecen al género Pseudomonas aeruginosas y Pseudomonas oleovorans. Este grupo Capítulo II. Marco Teórico 65 tiene una reputación de ser muy difícil de eliminar y de tener una menor necesidad alimenticia para sobrevivir en comparación con otros grupos. De esta forma es extremadamente difícil encontrar una formulación que no se convierta tarde o temprano en un alimento para estas criaturas voraces. Entre las actividades que realizan dichos organismos esta la oxidación de los hidrocarburos saturados y no saturados; y por tanto de los fluidos de corte. Estos organismos son altamente oxidativos, lo cual significa que crecen en condiciones máximas de aireación, se reproducen aproximadamente cada 45 minutos en condiciones ambientales en el fluido. Existen también microorganismos que no requieren de oxigeno para su supervivencia y que afectan de manera significativa a los fluidos de corte como lo son los anaeróbicos sulfato reductores. Estos no pueden comenzar, al parecer, su crecimiento en el fluido fresco sino requieren de los materiales previamente formados del crecimiento bacteriano aerobio. Su importante contribución al deterioro es considerado desagradable por la presencia y exposición del sulfuro de hidrógeno al ambiente, adicionalmente puede ser un factor que contribuye a la corrosión puesto que lo puede causar en ausencia del oxígeno. Un tercer factor microbiano que se ha considerado y que ha ganado más interés recientemente son los hongos. En los fluidos de corte tienden a Capítulo II. Marco Teórico 66 desarrollarse los hongos que pertenecen sobre todo a los géneros: Fusarium y Cephalosporium y Cladosporium. La presencia de hongos obstruye los filtros y los inyectores de las maquinarias donde puedan estar presentes. En la Figura 10 y Figura 11 se observan los hongos del género Cephalosporium y Fusarium, respectivamente, que pudieran estar presentes en los Fluidos de Corte. (11) Figura 10. Cephalosporium acremonium (hongos encontrados en Fluidos de Corte) Fuente: : HAMLYN, P. (1982). Protoplast fusion and genetic analysis in Cephalosporium acremonium. (2005). Disponible en: http://fungus.org.uk/cv/thesis_fig5.9.htm Figura 11. Fusarium (hongo encontrado en Fluidos de Corte) Fuente: S/A. (S/F). Fungi Fusarium. (2005). http://byebyemold.com/mold_images/images/fusarium/fusarium_c.html II.20. Turbo Kerosinas Disponible en: Capítulo II. Marco Teórico 67 Es un destilado incoloro, menos volátil que la gasolina. El mayor volumen de Kerosene (Turbo Kerosina) se logra mediante destilación atmosférica del petróleo, a temperaturas que oscilan entre 240° C y 300° C. Las propiedades más importantes que debe exhibir el turbokerosene, son en especial, las siguientes: Estabilidad térmica: determina la resistencia a la oxidación y a la polimerización del producto para las condiciones de operación, se mide en función de la cantidad de depósitos formados en el sistema de combustibles. Composición: la composición de los hidrocarburos del producto determina la calidad de su combustión. Específicamente hay limitaciones respecto al contenido de aromáticos y nafténicos, porque éstos están asociados a la producción de humo y carbón durante la combustión del producto. Contenido de Azufre: los óxidos de azufre, formados durante la combustión, son corrosivos y afectan las partes metálicas de las turbinas, razón por la cual su presencia en el combustible debe ser reducida a su mínima expresión. Destilación: el punto inicial y el punto final del rango de destilación del producto determinan las temperaturas de inflamación y congelamiento. Capítulo II. Marco Teórico 68 La primera temperatura es importante por aspectos de seguridad en tierra y la segunda por aspecto de operación de los equipos. Los combustibles de aviación pueden clasificarse en dos grupos básicos: gasolinas de aviación, para usar en aeronaves de motor alternativo o de pistón y combustibles para turbinas de aviación (combustible Jet), para usar en aeronaves de turbohélice o turborreactor. (6) II.20.1. Contaminación y deterioro de Turbocombustibles Los combustibles de aviación pueden resultar contaminados por diversas sustancias (suciedad, agua, materia microbiológica, agentes tensoactivos o residuos de otros compuestos químicos) así como por productos de petróleo que se encuentren en los sistemas de distribución. En el caso de la gasolina de aviación, el número de octano (índice de detonación) es de primordial importancia. Cualquier contaminación que cause una reducción, aunque sea pequeña, en el índice de la mezcla pobre o rica puede tener efecto rápido y catastrófico sobre el funcionamiento de los motores de pistón de un avión, con grave pérdida de potencia, recalentamiento y avería mecánica de los componentes. La diferencias serias de otras propiedades especificadas, tales como el rango de destilación, la volatilidad y el contenido de tetraetilo de plomo, también pueden originar graves defectos de funcionamiento dentro de un tiempo Capítulo II. Marco Teórico 69 relativamente corto. Los motores de turbohélice y los turborreactores no son tan sensibles de inmediato a las deficiencias de cualquiera de las propiedades de los combustibles de turbina; pero, si tienen que marchar durante un tiempo prolongado con combustible que estén fuera de los límites de las especificaciones, se puede perturbar el funcionamiento de elementos críticos del sistema del combustible (como son las bombas y los dispositivos de control) y reducir la duración o producir averías de las partes calientes del motor, por ejemplo, las cámaras de combustión y los álabes de las turbinas. En el caso de los combustibles de turbina, son la suciedad y el agua las que producen el efecto más rápido y dañino, ya que obstruyen los filtros de las aeronaves y restringen el paso del combustible a los motores. Todos los combustibles pueden contener agua en solución hasta un límite de saturación que depende de su composición química y de la temperatura. El contenido real de agua disuelta en un momento determinado (es decir, el grado de saturación) dependerá de varios factores, incluso la humedad relativa del espacio lleno de aire que queda por encima del combustible y la cantidad de agua no disuelta (libre) que está en contacto con el combustible (por ejemplo, agua asentada en el fondo del tanque). Mientras el agua disuelta permanece en solución, no tiene efecto adverso en el funcionamiento del motor y el abastecedor de combustible no necesita tenerla en cuenta. Sin embargo, el agua disuelta puede precipitarse ante un descenso de la temperatura y entonces se convierte en agua libre o, si la Capítulo II. Marco Teórico 70 temperatura es muy baja, en hielo. Estas condiciones pueden presentarse durante el vuelo, especialmente en las aeronaves de turbina y los cristales de hielo son capaces de obstruir los filtros del motor, impidiendo el flujo de combustible con la consiguiente falla parcial o total del motor. El agua separada que se asienta en los tanques de la aeronave también favorece el crecimiento microbiológico. El agua en el combustible puede presentarse en dos formas: Agua libre: agua en forma de una capa separada en el fondo del recipiente que lo contenga. Agua en suspensión: agua como su nombre lo indica, suspendida en el combustible, en forma de pequeñas gotas. (6) II.21. CAUSAS DEL BIODETERIORO Existen varios factores que pueden afectar de forma negativa a los fluidos. Entre los cuales se pueden mencionar: Largos períodos de uso de los fluidos, cuya rata de reemplazo es muy baja. Esto ocasiona que el fluido sea propenso a un ataque microbial La acumulación de iones metálicos que son solubles durante la operación de la maquinaria que pueden contribuir al estímulo del crecimiento microbiano Capítulo II. Marco Teórico 71 La inhibición de la acción germicida, el deterioro catalítico del fluido y los productos de la descomposición subsiguiente llegan a ser mejores medios alimenticios para los microbios residentes La adición de fluidos nuevos en sistemas poco saneados donde posiblemente había la presencia de fluidos contaminados con microorganismos Los altos niveles de humedad en el ambiente es una condición perfecta para la iniciación y continuación del crecimiento microbiológico en las diferentes partes de las maquinarias (11) II.22. EFECTOS DEL DETERIORO MICROBIANO Los efectos de la contaminación microbiana, en resumen, pueden ser clasificados como: físicos, químicos, y biológicos Efectos físicos del deterioro Estos efectos están relacionados sobre todo con la acción de los hongos ya que por su misma naturaleza y agregación, interfieren con: la operación física del flujo, la función de la máquina, y la filtración de los fluidos. Los hongos, pueden formar depósitos fangosos en el fluido de corte. Si este crecimiento no se trata correctamente pueden llegar a obstruir masivamente tanto las líneas de entrega como los equipos de la filtración. Y las industrias afectadas por este problema tendrían que parar su producción de vez en cuando, para quitar físicamente este material. Capítulo II. Marco Teórico 72 Efectos químicos del biodeterioro Corrosión Hay una ley de la física que indica que para cada acción hay una reacción igual y opuesta. Este axioma se puede ampliar a los sistemas de fluidos de corte contaminados, es decir, los microbios son afectados por su ambiente, y ellos alternadamente tienen un efecto sobre su ambiente. Un} área donde los microorganismos pueden afectar es en la corrosión de ciertas piezas metálicas. Ciertas bacterias son capaces de establecer una pila electrolítica o de estimular reacciones anódicas o catódicas en el metal u otras superficies. Estas reacciones electroquímicas en sistemas de corte pueden causar la corrosión de la herramienta y del objeto. La contaminación bacteriana en los fluidos de corte puede causar indirectamente la corrosión. Esto es realizado de dos maneras, o consumiendo los inhibidores de la corrosión y/o produciendo subproductos corrosivos tales como ácidos orgánicos. Otros cambios químicos La pérdida de los componentes anticorrosivos no es el único cambio químico que los microbios pueden ejercer en un fluido. Varios estudios controlados muestran que otros componentes de los fluidos son parcialmente perdidos y algunas veces completamente agotados en presencia poblaciones microbianas. Este cambio químico en los fluidos puede estar directamente correlacionados con las pérdidas de las funciones que debería cumplir el fluido, particularmente en el caso de aceites solubles donde se degrada el Capítulo II. Marco Teórico 73 hidrocarburo. Una pérdida concurrente de lubricidad puede ocurrir con este tipo de actividad microbiana. La instrumentación sofisticada tal como cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y la espectroscopia infrarroja (IR) pueden detectar incluso los cambios más sutiles en la química del fluido, causada por la actividad metabólica microbiana. Existen otros cambios menos sutiles en el fluido lo cual también es causado por los microbios, por ejemplo, algunos microorganismos son responsables de la variedad de olores desagradables como huevos putrefactos. En algunos casos a causa de dichos olores, muchos trabajadores se ven en la obligación de parar la producción hasta que tales olores se encuentren bajo control. Efectos biológicos del deterioro Este se relaciona sobre todo con las interacciones organolépticas de los trabajadores con su ambiente. Los olores a huevo putrefacto, los olores fecales, o los olores a añejos, pueden afectar la vida de los trabajadores sometidos a esa clase de olores, por los que si estos problemas no son tratados a tiempo traerían consigo consecuencias muy serias. (11) CAPÍTULO III MARCO METODOLÓGICO “Una experiencia nunca es un fracaso, pues siempre viene a demostrar algo”. Thomas Alva Edison "La teoría es asesinada tarde o temprano por la experiencia." Albert Einstein Capítulo III: Marco Metodológico 74 III. MARCO METODOLÓGICO III.1 CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS Con el fin de realizar una correcta definición de las actividades a llevar a cabo durante el desarrollo experimental se decidió orientar el estudio en cinco fases, las cuales se explican a continuación: 1. Búsqueda de información o exploración: En esta fase se reúnen todos los requisitos del proyecto a fin de tener una visión más global del proceso a desarrollar. Se identificaron las fuentes de información y se inició con la recolección de los datos para la realización del proyecto. 2. Inventario de materiales, reactivos y equipos disponibles: En esta etapa se realiza un inventario informal de los materiales, reactivos y equipos de los cuales se disponen y necesitan para realizar los análisis microbiológicos. 3. Estandarización de Metodologías: Conociéndose los materiales, reactivos y equipos disponibles se estandarizan las metodologías asociadas al análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte. 4. Implementación de las metodologías estandarizadas: En esta fase se aplican, a nivel de laboratorio, las metodologías estandarizadas ASTM “Fuel and Fuel Systems Microbiology-Fundamentals, Diagnosis, and Contamination Control” para la determinación de bacterias sulfato- Capítulo III: Marco Metodológico 75 reductoras anaerobias. De igual forma, se aplican las metodologías estandarizadas propuestas en el Manual de Control de Calidad de Laboratorios International Health, L.I.H. C.A. y del Manual de Métodos Generales de Microbiología de la Universidad Central de Venezuela para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos, así como también, de Pseudomonas aeroginosa (específicamente), y de hongos en general. 5. Elaboración de Kits (prototipos) Microbiológicos: Con la aplicación de las metodologías estandarizadas se logran elaborar “Kits (prototipos) microbiológicos” para determinar la presencia de bacterias sulfatoreductoras anaerobias y microorganismos aerobios mesófilos (en general), de fácil manipulación y correlacionados linealmente con la metodología aplicada a nivel de laboratorio. Los Kits se preparan y ponen a prueba de manera paralela al análisis realizado a nivel de laboratorio, para que de esta forma se verifique la aplicabilidad de los mismos. III.2 BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN O EXPLORACIÓN A lo largo de esta actividad se llevó a cabo un levantamiento de la información disponible sobre Microorganismos asociados a los Combustibles de Aviación y Fluidos de Corte, asimismo, se investigó acerca de metodologías aplicables para realizar análisis microbiológico en dichos fluidos. La información recolectada sirvió para obtener los conocimientos Capítulo III: Marco Metodológico 76 necesarios que fueron la herramienta fundamental en la realización del presente trabajo. En esta fase se encontraron metodologías que se adaptaban a los materiales, equipos y reactivos que la Universidad Metropolitana disponía para realizar los análisis microbiológicos necesarios, fundamentalmente: en la metodología ASTM “Fuel and Fuel Systems Microbiology-Fundamentals, Diagnosis, and Contamination Control”, “Manual de Control de Calidad de Laboratorios International Health, L.I.H. C.A. “ y “Manual de Métodos Generales de Microbiología de la Universidad Central de Venezuela”. Como resultado de esta investigación se tiene el desarrollo del Marco Teórico (Capítulo II), el cual es una síntesis de la información recopilada y además permitió elaborar parte del Marco Metodológico (Capítulo III). III.3 INVENTARIO DISPONIBLES DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS En esta fase se realiza un inventario, de forma preliminar, de materiales, reactivos, equipos y lugar de experimentación, tanto los disponibles como los necesarios, para probar las metodologías ASTM “Fuel and Fuel Systems Microbiology-Fundamentals, Diagnosis, and Contamination Control”, “Manual de Control de Calidad de Laboratorios International Health, L.I.H. C.A.” y “Manual de Métodos Generales de Microbiología de la Universidad Central Capítulo III: Marco Metodológico 77 de Venezuela”. Se determinó la necesidad de adquisición de los reactivos y materiales, teniendo en cuenta su valor económico para un posterior estudio de costos. El inventario se efectuó, realizando las consultas pertinentes a los técnicos encargados de los laboratorios, dado sus conocimientos de empresas y/o laboratorios que pudiesen surtir los reactivos, materiales y equipos que hacían falta para llevar a cabo el trabajo experimental. III.4 ESTANDARIZACIÓN DE METODOLOGÍAS En esta fase se ajustaron los métodos experimentales, de forma tal de introducir estándares metodológicos a la hora de realizar los estudios microbiológicos. Se establecieron procedimientos experimentales para realizar análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, basándose principalmente en la verificación y presencia de equipos, reactivos y/u otros elementos de los cuales se disponían a la hora de realizar la experimentación. En esta etapa se estandarizaron las metodologías de análisis para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en general y la presencia de Pseudomonas aeroginosas y hongos, así mismo para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas. Los Capítulo III: Marco Metodológico 78 procedimientos llevados a cabo se detallan en el apartado III.5 (implementación de las metodologías estandarizadas). III.5 IMPLEMENTACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS ESTANDARIZADAS III.5.1 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO III.5.1.1 Objetivo - Preparar de una manera conveniente, previa a la esterilización, el material de laboratorio limpio, para que una vez esterilizado conserve esta condición Pipetas: Con un alambre de grosor adecuado, se colocó en la boquilla un trocito de algodón que actúa como filtro, impidiendo la contaminación del material absorbido de la propipeta, y a la vez como protector de la propipeta. Para su esterilización, se les introducía dentro de cajas o estuches metálicos, o envueltas en papel Kraft, ya sea individualmente o en grupos, y se esterilizaban con calor seco a 160° C durante 2 horas y/o en autoclave a 15 psi (121° C) durante 15 min. Tubos de ensayo: Se taponaban uno a uno con algodón, se envolvían en grupos o se colocaban en cestas para ser esterilizados. El tapón quedaba introducido en el tubo no más de 3 cm., siendo de un tamaño que permitiera su fácil manipulación y se trataba que no quedara ni muy flojo ni muy apretado. Capítulo III: Marco Metodológico 79 Placas de Petri: Se envolvían en grupos de 1 a 10 placas de Petri en papel Kraft. Otros materiales: Los matraces, fiolas, probetas, equipo de filtración, kitazatos y frascos se taponaban como los tubos de ensayo y se cubrían el algodón con papel kraft antes de esterilizarlos. Todos los materiales antes nombrados se esterilizaban en autoclave a 15 psi (121° C) durante 15 minutos. III.5.1.2 Limpieza del Material de Vidrio III.5.1.2.1 Reactivos Detergente líquido Agua destilada Solución sulfocrómica: Dicromato de potasio................... 65g Agua destilada..............................900 ml Ácido sulfúrico concentrado........completar 1 litro III.5.1.2.2 Equipos y materiales Autoclave, estufa, papel kraft, algodón, pabilo Capítulo III: Marco Metodológico 80 III.5.1.2.3 Procedimiento experimental El material de vidrio sucio se remojaba en solución sulfocrómica, luego se lavaba y enjuagaba. Si el material de vidrio poseía material biológico o microorganismos, la limpieza del mismo se efectuada de la siguiente manera: a) Se esterilizaba el material de vidrio junto con el medio inoculado en autoclave b) Posteriormente se remojaba en una solución jabonosa, se eliminaba el contenido y se lavaba c) Una vez limpio, se enjuagaba no menos de 10 veces con agua corriente y 3 o 4 veces con agua destilada d) Una vez seco se cubría con papel Kraft y se esterilizaba en autoclave a 15 psi durante 15 minutos. Nota: El material de vidrio utilizado soporta temperaturas de 121° C III.5.2 EQUIPOS Y SU FUNCIONAMIENTO Objetivo - Conocer el funcionamiento de los equipos utilizados para realizar análisis microbiológico. Capítulo III: Marco Metodológico 81 Los equipos que se requirieron son los siguientes: Autoclave Características - Debe alcanzar temperatura de 121° C y una presión de 15 libras - Debe mantenerse limpio y seco - Debe contener un controlador de temperatura apropiada y un medidor de presión - Debe contener una llave o válvula de aliviadero del vapor Funcionamiento - Se agrega agua destilada hasta cubrir el nivel indicado - Se coloca el material a esterilizar en las cestas - Se cierra, para lo cual las llaves deben quedar en forma paralela. - Se abre la llave de vapor - Se enciende al máximo - Cuando se comienza a incrementar la presión (aproximadamente a 5 libras) se espera unos 5 minutos de escape de vapor con el fin de purgar el autoclave. - Se cierra la llave de vapor - Al llegar a 15 libras y 121° C se disminuye un poco la temperatura para mantener estas condiciones y se cuentan 15 minutos - Se apaga y se abre la llave de vapor - Al bajar la presión (se puede apreciar en el manómetro), se abre el autoclave Capítulo III: Marco Metodológico 82 Estufa Características - Debe alcanzar temperaturas de 250° C - La temperatura debe controlarse - Debe mantenerse limpia Funcionamiento - Se coloca el material a esterilizar - Se gradúa la temperatura a 170° C - Se esteriliza por 1 hora - Al finalizar, se disminuye la temperatura a 60° C (como mínimo) Incubadora Características - Debe alcanzar temperatura de 70° C - Mantenerse limpia y libre de gérmenes - La temperatura debe controlarse Funcionamiento - Se coloca el material a incubar - Se gradúa la temperatura adecuada para el análisis Plancha de calentamiento Características - Debe ser de acero inoxidable Capítulo III: Marco Metodológico 83 - Debe alcanzar temperaturas de por lo menos 60° C - Mantenerse limpia y seca Funcionamiento - Se enciende y se gradúa a la temperatura deseada - Se coloca el material sobre la plancha Nevera Características - Debe tener un compartimiento de refrigeración (2-5° C) - Debe controlar la temperatura - Mantener limpia y libre de gérmenes Funcionamiento - Se coloca en forma ordenada y sellada soluciones o material microbiológico Otros equipos Microscopio, balanza semi-analítica, equipo de filtración Millipore, campana de flujo laminar, pHmetro. Capítulo III: Marco Metodológico 84 III.5.3 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO III.5.3.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS (M-TGE, MEDIO TIOGLICOLATO Y CALDO TSB) III.5.3.1.1 Objetivo - Instruir en la preparación correcta de los medios de cultivos líquidos (mTGE, medio Tioglicolato y caldo TSB). III.5.3.1.2 Reactivos Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v Agua destilada Caldo m-TGE Medio Tioglicolato Caldo TSB III.5.3.1.3 Materiales y equipos Balanza analítica, plancha de agitación, autoclave, pHmetro, espátula, algodón, fiolas (2000 ml), frascos de dilución (mayor a 100 ml), papel Kraft, papel aluminio, tijera, marcador, pabilo. III.5.3.1.4 Procedimiento experimental - Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v mediante un algodón Capítulo III: Marco Metodológico 85 - Se pesaron los medios de cultivo según las especificaciones que se indicaban en la etiqueta - Se transvasaron cuantitativamente los medios a las fiolas - Se diluyeron los medios con el agua destilada requerida, según la etiqueta - Se llevaron a homogenización total por agitación y calentamiento - Se verificó que el pH (a 25° C) de los medios correspondían con las especificaciones de la etiqueta - Se transvasaron cuantitativamente 100 ml de los medios a cada uno de los frascos de dilución. - Se cerraron los frascos colocando papel aluminio debajo de cada tapa - Se colocó papel Kraft por encima de la tapa y se ató con pabilo - Se identificó cada frasco con el nombre del cultivo y fecha de preparación - Se esterilizaron los frascos preparados con los medios de cultivos en autoclave durante 15 minutos a 121° C y 15 lb de presión - Se almacenaron en un lugar fresco, oscuro y limpio Notas: - Todos los medios de cultivos preparados en el laboratorio tienen un período de vida útil de tres meses luego de su preparación, si se mantienen las condiciones de almacenamiento, pues de no cumplir esto se arrojarían falsos positivos en los medios - No se esterilizaban los caldos más de dos veces Capítulo III: Marco Metodológico 86 III.5.3.2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO (SABOURAUD DEXTROSE AGAR Y CETRIMIDE AGAR) SÓLIDOS III.5.3.2.1 Objetivo - Instruir en la preparación correcta de los medios de cultivo sólidos (Sabouraud Dextrosa Agar y Cetrimida Agar). III.5.3.2.2 Reactivos Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v Agua destilada Sabouraud Dextrose Agar Cetrimida Agar III.5.3.2.3 Materiales y equipos Balanza analítica, plancha de agitación, autoclave, pHmetro, espátula, algodón, fiolas (2000 ml), papel Kraft, papel aluminio, tijera, marcador, pabilo. III.5.3.2.4 Procedimiento experimental - Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v - Se pesaron los medios sólidos según las especificaciones que se indican en las etiquetas - Se transvasaron cuantitativamente los medios a unas fiolas - Se diluyeron con la cantidad de agua destilada requerida, según la etiqueta Capítulo III: Marco Metodológico 87 - Se llevaron a homogenización total por agitación y calentamiento - Se verificó que el pH (25° C) de los medios correspondían con las especificaciones - Se taparon las fiolas donde se encontraban las soluciones homogéneas, con algodón envuelto en gasa, cubriendo con papel aluminio y luego con papel Kraft - Se identificaron las fiolas (nombre del agar y fecha de preparación) - Se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 121° C y 15 lb de presión - Se dejaron enfriar, luego se almacenaron en la nevera entre 2 y 5° C Notas: - Todos los agares preparados en el laboratorio tienen un período de vida útil de tres meses luego de su preparación, pues de no cumplir esto se arrojarían falsos positivos en los medios - No se esterilizaban los agares más de dos veces III.5.3.3 PROCEDIMIENTO PARA EL PLAQUEO Y ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS III.5.3.3.1 Objetivo - Instruir en el procedimiento correcto para el plaqueo y almacenamiento de los medios de cultivo sólido Capítulo III: Marco Metodológico 88 III.5.3.3.2 Reactivos Alcohol isopropílico o etílico al 70 % v/v Agares preparados de Sabouraud Dextrose y Cetrimida♣ III.5.3.3.3 Materiales y equipos Mechero, algodón, cápsulas de Petri III.5.3.3.4 Procedimiento experimental - Se limpió el área de trabajo usando alcohol al 70 % v/v - Se identificaron las cápsulas de Petri con el nombre del Agar - Se quitó el tapón de la fiola e inmediatamente se trasvasaron cualitativamente 25 ml de agar por placa y se cerró la misma - Se dejó enfriar hasta que el agar se solidificara - Se almacenaron las cápsulas de Petri de forma invertida a temperaturas entre 2 y 5° C Notas - Todos los agares preparados en el laboratorio tienen un período de vida útil de tres meses luego de su preparación, pues de no cumplir esto se arrojarían falsos positivos en los medios - No se esterilizaban los agares más de dos veces ♣ Véase apartado III.5.3.2 Capítulo III: Marco Metodológico 89 - Todo el material de vidrio que se utiliza dentro de la campana de flujo laminar debe estar estéril - Se trabajó en todo momento bajo el mechero - Se calentaron los medios sólidos hasta fundir, en los casos de solidificación, y se enfriaron hasta 45° C aproximadamente III.5.4 PROCEDIMIENTO PARA LA TOMA DE MUESTRA DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE III.5.4.1 Objetivo - Aplicar un procedimiento correcto para la recolección de muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte con el fin de evitar contaminación III.5.4.2 Reactivos Alcohol etílico o isopropílico al 70 % v/v. III.5.4.3 Materiales 5 Frascos con rosca para la toma de muestras de capacidad de 500 - 1000 ml (vidrio, polipropileno o poliestireno), guantes quirúrgicos, algodón, mascarilla, marcador. III.5.4.4 Procedimiento experimental - Se procedió al lavado de las manos antes de manipular el material y los equipos de toma de muestra Capítulo III: Marco Metodológico 90 - Se identificaron los frascos estériles para la toma de muestra indicando número de muestra, tipo de fluido, procedencia y fecha de muestreo, tal como lo resume la Tabla 9 - Durante la toma de muestras se limpió al alrededor del área donde estaba localizado el punto de muestreo del contenedor del fluido a analizar con alcohol al 70 % v/v usando un algodón o un paño limpio - En el momento de la toma de la muestra se utilizaron guantes estériles - Se abrió la válvula completamente y se dejó correr el fluido de dos a tres minutos - Al momento de realizar el muestreo se cerró un poco la válvula para evitar salpicaduras durante la toma de muestra del fluido - En los tanques abiertos, se tomó el frasco de muestreo, se le amarró alambres limpios (con alcohol al 70 %) de forma tal que se pudiese sumergir el envase en el tanque; se sumergió el envase y se tomó la muestra correspondiente - Para evitar falsos positivos, se abrieron los frascos al momento de la recolección de la muestra del Fluido de Corte o el Combustible de Aviación y se cerraron rápidamente - Se transportaron las muestras hacia el sitio de análisis evitando en todo momento agitar el frasco. Las muestras se mantuvieron aproximadamente a 4° C hasta llegado el momento del análisis Capítulo III: Marco Metodológico 91 Tabla 9. Descripción de los fluidos utilizados en la fase experimental durante la toma de muestra Muestra/ Tipo de Fluido Procedencia 2/Jet A1 Aeropuerto Maiquetía/ Tanque de avión 4/Jet A1 Aeropuerto La Carlota/ Tanque del ala derecha de un avión inoperativo 7/Jet A1 Aeropuerto La Carlota/ Cisterna Volumen de muestra (ml) 1000 500 500 Fecha de muestreo 17/11/04 Observaciones Color amarillo con presencia, ausencia de fase acuosa (visible) 18/11/04 Color grisáceo, distinción de interfase (combustibleagua) turbidez en la fase acuosa, presencia de partículas sólidas. Picaduras en el tanque con notable presencia de limo 17/12/04 Color amarillo claro, buen aspecto, sin partículas suspendidas ni distinción de interfase 8/Jet A1 Aeropuerto La Carlota/ Tanque de helicóptero 500 9/Jet A1 en caldo nutritivo Kit para determinar presencia de bacterias sulfatoreductoras anaerobias --- 17/12/04 Desconocida Color amarillo claro, buen aspecto, sin partículas suspendidas ni distinción de interfase Fluido turbio, con interfase fácilmente distinguible, con presencia de bacterias sulfatoreductoras anaerobias (utilizado para control) Imágenes de las muestras recolectadas Capítulo III: Marco Metodológico 92 Kit para determinar presencia de bacterias sulfatoreductoras anaerobias ---- VenocoCorte/Fluido Guacara Edo. de Corte Carabobo/ Venosoluble Envase de 1 AW galón 500 10/Jet A1 en caldo nutritivo Desconocida 17/11/04 Fluido turbio, con interfase fácilmente distinguible, con presencia de bacterias sulfatoreductoras anaerobias (utilizado para control) Emulsión blanca, sin partículas sólidas Notas: - El lapso de tiempo entre la toma de muestra y el análisis no debería exceder las 24-48 horas - El volumen de las muestras recolectadas estuvo comprendido entre 500 – 1000 ml - El frasco para la toma de muestra (estéril) se mantuvo abierto solamente lo necesario - Se evitó en todo momento tocar los interiores de los envases de muestreo y casquillos de éstos - Si se quiere tomar varias muestras de un mismo tanque pero en puntos distintos, se recomienda comenzar a muestrear desde la parte superficial del tanque hasta llegar al punto más bajo del tanque de esta forma se evita mayores turbulencias del fluido ha analizar Capítulo III: Marco Metodológico 93 - Si se quiere determinar únicamente organismos anaerobios dentro de un contenedor del fluido es recomendable llenar el frasco de muestreo hasta el borde dejando suficiente espacio vacío únicamente para las expansiones que puedan ocurrir del fluido con los cambios de temperatura durante el tránsito o el transporte. En este caso es recomendable tomar la muestra del fondo del tanque - Si se quiere determinar únicamente la presencia de microorganismos aerobios se recomienda llenar el frasco de muestreo entre un 50 % (ASTM 6469) a 80 % (IP Guidelines) ya esto promueve las condiciones aerobias dentro del envase III.5.5 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS Y HONGOS UTILIZANDO EL MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA III.5.5.1 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE III.5.5.1.1 Objetivo - Determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte III.5.5.1.2 Reactivos Medio Tioglicolato Caldo TSB Capítulo III: Marco Metodológico 94 Caldo MTGE Alcohol 70 % v/v (etanol o alcohol isopropílico) Solución 30 ml de solución salina al 0.85 % p/v Solución 100 ml de Triton X-100 al 0.1 % v/v III.5.5.1.3 Materiales y Equipos 21 frascos de dilución de capacidad de 100 ml con rosca, papel aluminio, papel Kraft, 6 membranas para filtrar de 0.45 μm y diámetro de 47 mm, equipo de filtración millipore, kitazato, pinza metálica, bomba de vacío, campana de flujo laminar, mechero, algodón, marcador, autoclave, incubadora, guantes y tapaboca. III.5.5.1.4 Procedimiento experimental♣ - Se prepararon y esterilizaron los medios líquidos (Caldo m-TGE, Caldo TSB y medio tioglicolato) (Ver apartado III.5.3.1) - Se limpió y desinfectó el sitio de trabajo con alcohol al 70 % - Se encendió el mechero lo más cercano al lugar de trabajo - Se identificaron todos los medios de cultivo (fecha, nombre de la muestra y el nombre del cultivo) - Se tomaron cuantitativamente 100 ml de las muestras a analizar (Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte) y se filtraron en el equipo de ♣ Véase Figura 12 (representación esquemática) Capítulo III: Marco Metodológico 95 Filtración Millipore (esterilizado) utilizando una membrana de 0.45 μ de poro. Las muestras que se analizaron se resumen en la Tabla 10. Tabla 10. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos. N° de muestra 2 4 Corte Blanco (control) - Tipo de fluido Jet A1 Jet A1 Fluido de corte VenosolubleAw Soluciones de lavado Fecha de análisis 19/11/04 19/11/04 19/11/04 19/11/04 Se enjuagó el vaso de filtración y el filtro sucesivamente con las soluciones: 100 ml de Triton X-100 al 0.1 % v/v 30 ml de solución salina de NaCl al 0.85 % p/v - Una vez finalizado el proceso de filtración, se desmontó el equipo y se cortó el filtro en tres pedazos aproximadamente iguales - Se tomaron los trozos de filtro con una pinza estéril - Se colocó cada trozo de filtro en tres frascos de dilución distintos. Cada frasco de dilución contenía 100 ml de MTGE, 100 ml de medio Tioglicolato y 100 ml de caldo TSB - Una vez que se colocaron los pedazos del filtro dentro de los frascos de dilución, se cerraron e incubaron de 2 a 7 días a 35 ± 2° C - Durantes los días de incubación se observaron los frascos de dilución comparándolos con el blanco. Cuando los teteros exhibían enturbiamiento entonces tenían contaminación microbiana aerobia Capítulo III: Marco Metodológico 96 mesófila. Y aquellos que no estaban turbios no presentaban contaminación microbiana aerobia mesófila en las muestras analizadas♣. Notas: - En todo momento se realizó un blanco para mantener un control del procedimiento experimental y de los medios utilizados, y de esta forma evitar falsos positivos. - La experimentación se realizó por duplicado ♣ Véase resultados experimentales Capítulo III: Marco Metodológico 97 Figura 12. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte Capítulo III: Marco Metodológico 98 III.5.5.2 Determinación de Pseudomonas aeroginosas y Hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) por medio de repiques III.5.5.2.1 Objetivos - Determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo Kerosinas - Determinar la presencia de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte III.5.5.2.1 Reactivos Cetrimida Agar Sabouraud Dextrose Agar Alcohol 70 % v/v (etanol o alcohol isopropílico) III.5.5.2.3 Materiales y Equipos 21 frascos de dilución con los caldos contaminados (véase apartado III.5.5.1), 84 cápsulas de Petri, papel aluminio, campana de flujo laminar, mechero, algodón, marcador, asa de platino, autoclave, incubadora, nevera, guantes y tapaboca Capítulo III: Marco Metodológico 99 III.5.5.2.4 Procedimiento experimental♣ - Se emplearon las cápsulas de Petri que poseían aproximadamente 25 ml de los agares (42 cápsulas con Cetrimide agar y 42 cápsulas con Sabouraud Dextrose agar) ya preparados y esterilizados (ver apartado III.5.3.2) - Se identificaron las cápsulas de Petri (nombre de la muestra, fecha de análisis y el agar utilizado) - Se limpió el área de trabajo con alcohol al 70 % v/v - Se encendió el mechero lo más cercano posible al lugar de trabajo - Se cogieron los caldos que presentaron contaminación microbiana (turbios)♦ y se realizaron repiques con un asa de platino estéril de cada una de los teteros (turbios) en los agares, realizándoles estrías en el mismo - Una vez que se realizó el repique se incubaron los caldos contaminados en el medio Cetrimide Agar a 35 ± 2 ° C por 2-4 días, y los caldos contaminados en el medio Sabouraud Dextrose Agar a 25 ± 2 ° C por 3-5 días - Una vez transcurridos los tiempos de incubación se observaron las cápsulas de Petri ♣ Véase figura 13 (representación esquemática) Véase apartado III.5.5.1 y capítulo IV (relacionado con los resultados obtenidos de la turbidez de los caldos) ♦ Capítulo III: Marco Metodológico100 En el agar Cetrimide, si se observaba la presencia de una coloración verde fluorescente confirmando la presencia de Pseudomonas aeroginosas en las muestras analizadas. Y si no se observaba dicha coloración no había presencia de Pseudomonas aeroginosas. En los casos de placas con crecimiento microbiano se analizaba dicho crecimiento en el microscopio realizándose la tinción de Gram para confirmar la presencia o no de Pseudomonas aeroginosas (véase apartado III.5.5.3). En cuanto al Sabouraud Dextrose Agar, se observaba si había presencia o no de hongos. Notas: - Se debe tomar en consideración que el Cetrimide agar es selectivo para Pseudomonas aeroginosas, y el agar Sabouraud Dextrose Agar es un medio selectivo para hongos - En todo momento se realizó un blanco para mantener un control del procedimiento experimental y de los medios utilizados, y de esta forma se evitaba falsos positivos - La experimentación se realizó por duplicado Capítulo III: Marco Metodológico101 Figura 13. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de Pseudomonas aeroginosas y hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, presentes en los caldos contaminados (turbios) Capítulo III: Marco Metodológico102 III.5.5.3 PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA COLORACIÓN SIMPLE DE GRAM III.5.5.3.1 Objetivo - Realizar la tinción simple de Gram de alguna de las placas contaminadas para efectuar la observación a través del microscopio y verificar la presencia o ausencia de Pseudomonas aeroginosas. III.5.5.3.2 Reactivos Safranina Violeta cristal Azul de metileno Agua corriente Fluido de cedro Solución salina al 0.85 % III.5.5.3.3 Materiales y equipos Microscopio, asa de platino, lamina para microscopio, mechero. III.5.5.3.4 Procedimiento experimental - Sobre las láminas limpias y secas se colocó una gota de solución salina - Con el asa de platino estéril se tocó el crecimiento de uno de los cultivos y se suspendió el material recogido en la gota de solución Capítulo III: Marco Metodológico103 salina, procediendo luego a extender esta gota en la lámina. Se esterilizó el asa de platino en el mechero - Se dejó secar y luego se fijó a la llama - Se tiño de la siguiente manera: a) Se cubrió con la solución colorante: azul de metileno, safranina y violeta cristal y se dejó actuar por un minuto b) Se lavó con agua corriente, se secó cuidadosamente y se observó en el microscopio con el objetivo de inmersión Nota: - Es importante resaltar que los organismos Gram positivos aparecen teñidos de violeta y los Gram negativos de rosado - La Pseudomona aeroginosa es un microorganismo Gram negativo. III.5.6. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE III.5.6.1 Objetivo - Determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaerobias en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte III.5.6.2 Reactivos - Medio Starkey - 500 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M Capítulo III: Marco Metodológico104 - Potasio fosfato monobásico (KH2PO4) - Cloruro de magnesio (MgCl2) - Alcohol al 70 % (etílico o propílico) III.5.6.3 Materiales y equipos Balanza semianalítica, 14 inyectadotas desechables estériles graduadas de 5 ml, 1 inyectadora desechable estéril graduada de 10 ml, 15 tubos de ensayo al vacío, gradilla, autoclave, pHmetro, 2 fiolas graduadas de 1 L y 1 fiola graduada de 250 ml , 1 balón aforado de 50 ml, papel de aluminio y plancha de calentamiento III.5.6.4 Procedimiento para la preparación de las soluciones III.5.6.4.1 Procedimiento para la preparación del medio Starkey. - En una fiola de 1 L se agregaron los necesarios para preparara el medio Starkey - Se mezclaron todos los reactivos en aproximadamente 500 ml de agua destilada calentándose suavemente hasta que se disolvieran - El pH de la solución se ajustó a 7.2 ± 0.2 con la solución “Buffered Dilution Water, Working Solution” ♠ (el Agua de Dilución Buffer, Solución de Trabajo) - Se esterilizó el Medio Starkey en autoclave a 15 psi (121° C) por 20 min ♠ Según normas ASTM Capítulo III: Marco Metodológico105 - Para un análisis por duplicado de cada una de las muestras analizadas (véase tabla 11) se llenaron 2 (duplicado) x 7 (N° de muestras analizadas) + 1 (blanco) = 15 tubos de ensayo al vacío con 9 ml del Medio Starkey estéril, medidos con una jeringa graduada de 10 ml de capacidad Tabla 11. Muestras analizadas para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas N° de muestra 2 4 7 8 9 10 Corte Tipo de fluido Jet A1 Jet A1 Jet A1 Jet A1 Jet A1 con caldo nutritivo y presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas Jet A1 con caldo nutritivo y presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas Fluido de corte Venosoluble-Aw Fecha de análisis 19/12/04 19/12/04 19/12/04 19/12/04 19/12/04 19/12/04 19/12/04 III.5.6.5 Procedimiento experimental♣ - Para cada una de las muestras se necesitaron 2 tubos de ensayo al vacío que contenían 9 ml del medio Starkey. Luego usando una jeringa graduada de 5 ml, se añadió 1 ml de la muestra en cada uno de los tubos correspondientes. Entre muestra y muestra las jeringas y las agujas se desechaban y los tubos de ensayo se agitaban vigorosamente ♣ Véase Figura 14 (esquema experimental) Capítulo III: Marco Metodológico106 - Se obtuvo las condiciones anaerobias succionando el aire que podría estar presente en cada uno de los tubos de ensayo utilizando para ello las mismas jeringas con las cuales se añadieron las muestras a los respectivos tubos de ensayo - Se incubaron los tubos de ensayos a temperatura ambiente por 21 días - Los tubos de ensayo que exhibían un contenido de color negro, o un precipitado negro en el período de 21 días se tomó como resultado positivo Notas: - Se incluyó en todo momento un blanco para mantener un control del análisis - En el análisis se incluyeron muestras que poseían bacterias sulfatoreductoras (muestras 9 y 10), como patrón del análisis realizado Capítulo III: Marco Metodológico107 Figura 14. Representación esquemática del procedimiento realizado para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Capítulo III: Marco Metodológico108 III.6 ELABORACIÓN DE LOS KITS MICROBIOLÓGICOS (PROTOTIPO) III.6.1 KIT MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE FLUIDOS DE CORTE Y TURBO COMBUSTIBLES DE AVIACIÓN III.6.1.1 Objetivo - Elaborar kit microbiológico que permita determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Fluidos de Corte y Turbo kerosinas. III.6.1.2 Instructivo de operación para el manejo del kit microbiológico♣ - Tomar la muestra a analizar con el envase identificado con “toma de muestra” , utilizando guantes estériles y mascarilla - Realizar los análisis en un lugar cerrado, limpio y con toma corriente de 110 – 120 V - Al comenzar el análisis, limpiar el sitio de trabajo con alcohol isopropílico al 70 % v/v utilizando para ello algodón - Enchufar la incubadora portátil y regular la temperatura del mismo a 35 ± 2° C ♣ - Encender el mechero portátil de alcohol - Colocarse un par de guantes estériles nuevos y la mascarilla Véase figura 15 (representación del esquema experimental) Capítulo III: Marco Metodológico109 - Preparar el equipo de filtración, incorporando con la pinza metálica previamente esterilizada con el mechero, una membrana de filtración de 25 mm de diámetro y 0,45 μm por poro - Con una jeringa estéril de 20 ml, tomar 10 ml de la muestra a analizar y añadirlo al equipo de filtración, recogiendo el líquido filtrado en el frasco recolector - Seguidamente verter el contenido del envase con 10 ml de la solución Triton X-100 al 0.1 % v/v (estéril) y 3 ml de la solución salina al 0.85 % p/v (estéril) - Una vez finalizado el proceso de filtración, remover la membrana con la pinza metálica esterilizada en el mechero - Sin tocar el filtro con las manos, recortar la membrana en 3 pedazos con la tijera metálica esterilizada en el mechero - Posteriormente se añade cada uno de los pedazos en los envases con los caldos nutritivos estériles de TSB, m-TGE y Tioglicolato - Cerrar los recipientes rápidamente y colocarlos en la incubadora portátil - Mantener los caldos en incubación de 2 a 7 días a 35 ± 2° C - Una vez transcurrido el tiempo de incubación observar los medios. Si alguno de ellos presentan enturbiamiento entonces la muestra se encuentra contaminada con microorganismos aeróbios mesófilos. Si por el contrario ninguno de los caldos presenta enturbiamiento entonces la muestra no estará contaminada Capítulo III: Marco Metodológico110 Notas: - Realizar el análisis en condiciones totalmente asépticas - Trabajar con precaución en el mechero - Antes de desechar los envases con los medios, someter los mismos con calor seco a 160° C durante 2 horas o en autoclave a 15 psi (121° C) durante 15 min Figura 15. Representación esquemática del instructivo de operación del kit microbiológico para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos Capítulo III: Marco Metodológico111 III.6.1.3 Procedimiento de prueba y puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) Se puso a prueba el kit microbiológico para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos utilizando las mismas muestras empleadas en el apartado III.5.5.1 (véase tabla 12). Este ensayo se realizó con el fin de establecer una correlación lineal entre la experimentación aplicada a nivel de laboratorio (III.5.5.1) y la del kit. Tabla 12. Muestras analizadas para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (kit prototipo) N° de muestra 2 4 Corte Blanco (control) Tipo de fluido Jet A1 Jet A1 Fluido de corte Venosoluble-Aw Soluciones de lavado Fecha de análisis 19/11/04 19/11/04 19/11/04 19/11/04 Notas: - Según el procedimiento del apartado anterior (instructivo de operación para el manejo del kit microbiológico) III.6.2 KIT MICROBIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE FLUIDOS DE CORTE Y TURBO KEROSINAS III.6.2.1 Objetivo - Elaborar kit microbiológico que permita determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Capítulo III: Marco Metodológico112 III.6.2.2 Instructivo de operación para el manejo del kit microbiológico♣ - Tomar la muestra a analizar con el envase identificado con “toma de muestra” , utilizando guantes estériles y mascarilla - Al comenzar el análisis, limpiar el sitio de trabajo con alcohol isopropílico al 70 % v/v utilizando para ello algodón - Colocarse un par de guantes estériles nuevos y la mascarilla - Con una jeringa estéril de 5 ml, tomar 1 ml de la muestra a analizar eliminando el aire que pudiese estar presente en la jeringa - Añadir 1 ml de la muestra en los tubos de ensayo (al vacío) que poseen 9 ml del medio Starkey estéril. Sin retirar aún la jeringa del tubo de ensayo, eliminar la posible presencia de aire, realizando succión con la jeringa - Incubar los tubos por 21 días a temperatura ambiente en un sitio oscuro - Mantener una observación diaria de los tubos. - Una vez transcurrido el tiempo de incubación observar los tubos de ensayo. Si alguno de ellos presentan precipitado de color negro entonces la muestra se encuentra contaminada con microorganismos sulfato-reductores anaeróbicos. Si por el contrario ninguno de los tubos no presenta precipitado negro entonces la muestra no estará contaminada ♣ Véase figura 16 (representación esquemática) Capítulo III: Marco Metodológico113 Nota: - Antes de desechar los envases con los medios, someter los mismos con calor seco a 160° C durante 2 horas o en autoclave a 15 psi (121° C) durante 15 min Figura 16. Representación esquemática del instructivo de operación del kit microbiológico para la determinación de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte Capítulo III: Marco Metodológico114 III.6.2.3 Procedimiento de prueba y puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) Se puso a prueba el kit microbiológico para determinar la presencia de bacterias sulfato-reductoras. Se utilizaron las muestras que se exponen en el apartado III.5.6 (véase tabla 11). El kit elaborado que se aplicó es el mismo al expresado en el apartado III.5.6 CAPÍTULO IV RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS “ Cualquiera podría haberlo hecho, pero nadie lo hizo “ Anónimo “ Si buscas resultados distintos, no hagas siempre lo mismo “ Albert Einstein Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados116 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS IV.1. RESULTADOS IV.1.1. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE Tabla 12. Observaciones en la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Tipo de fluido Muestra Repetición Jet A1 2 1 2 Tiempo de incubación (horas) 168 168 48 1 Jet A1 4 48 2 48 1 Fluido de Corte Corte 48 2 Blanco 48-168 Medios de Cultivo m-TGE No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio Tioglicolato No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio TSB No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados117 (a) (b) Figura 17. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C (a) (b) Figura 18. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados118 (a) (b) Figura 19. (a) Observación inicial de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y antes de someterlos al período de incubación. (b) Observación de los teteros con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados119 IV.1.2. DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE, PRESENTES EN LOS CALDOS CONTAMINADOS (TURBIOS) POR MEDIO DE REPIQUES Tabla 13. Observaciones en la determinación de hongos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Sabouraud Dextrosa Agar Tipo de fluido Jet A1 Muestra 2 Tiempo de Repetición incubación (horas) 1 120 m-TGE (1-2) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2) Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento 2 120 Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento 120 CrecimientoCrecimientocoloración coloración blancablanca-presencia presencia de de levaduras levaduras Crecimientocoloración blanca-presencia de levaduras 120 CrecimientoCrecimientocoloración coloración blancablanca-presencia presencia de de levaduras levaduras Crecimientocoloración blanca-presencia de levaduras 120 Crecimientopresencia de levaduras Crecimientopresencia de levaduras 120 Crecimientopresencia de levaduras Crecimientopresencia de levaduras Crecimientopresencia de hongo filamentoso Crecimientopresencia de hongo filamentoso 120 Sin crecimiento Sin crecimiento 1 Jet A1 4 2 1 Fluido de Corte Corte 2 Blanco Blanco Sabouraud Dextrosa Agar ------------ Sin crecimiento Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados120 (a) (b) (c) Figura 20. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en (a) Medio Tioglicolato, (b) Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C (a) (b) (c) Figura 21. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en (a) Medio Tioglicolato, (b) Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C (a) (b) (c) Figura 22. Observaciones de las cápsulas de Petri con Sabouraud Dextrosa Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en (a) Medio Tioglicolato (b), Medio TSB y (c) Medio m-TGE, una vez transcurrido los 5 días de incubación a 25 ± 2° C Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados121 Tabla 14. Observaciones en la determinación de Pseudomonas aeroginosas en las muestras deTurbo Kerosinas y Fluidos de Corte presentes en los Caldos por medio de repiques en Cetrimida Agar Tiempo de Tipo de Muestra Repetición incubación fluido (horas) 1 Jet A1 2 2 96 96 96 1 Jet A1 4 96 2 96 1 Fluido de Corte Corte 96 2 Blanco Blanco ------------ 96 Cetrimida Agar m-TGE (1-2) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2) Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento Escaso Escaso crecimiento- Escaso crecimientocoloración blanca- crecimientocoloración sin presencia de coloración blanca-sin Pseudomonas blanca-sin presencia de aeroginosas presencia de Pseudomonas Pseudomonas aeroginosas aeroginosas CrecimientoCrecimientoCrecimientocoloración coloración blanca- coloración blanca-sin blanca-sin sin presencia de presencia de Pseudomonas presencia de Pseudomonas Pseudomonas aeroginosas aeroginosas aeroginosas Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Sin crecimiento Sin crecimiento Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Crecimientoausencia de Pseudomonas aeroginosas Sin crecimiento Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados122 (a) (b) (c) Figura 23. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C (a) (b) (c) Figura 24. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C (a) (b) (c) Figura 25. Observaciones de las cápsulas de Petri con Cetrimida Agar luego del repique del Fluido de Corte (muestra Corte) en Medio Tioglicolato (a), Medio TSB (b) y Medio m-TGE (c), una vez transcurrido los 4 días de incubación a 35 ± 2° C Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados123 IV.1.3 RESULTADOS OBTENIDOS DE LA TINCIÓN DE GRAM PARA VERIFICAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE EN PLACAS CON CETRIMIDA AGAR CONTAMINADAS Tabla 15. Observaciones de la Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas Tipo de fluido Muestra Tiempo de Repetición incubación (horas) m-TGE (1-2) Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta) Tioglicolato (1-2) TSB (1-2) Presencia de cocos- Presencia de Gram positivos cocos-Gram (coloración violeta) positivos (coloración violeta) 120 Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta) Presencia de cocos- Presencia de Gram positivos cocos-Gram (coloración violeta) positivos (coloración violeta) 120 Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta) Presencia de cocos-Gram positivos (coloración violeta) Presencia de cocos- Presencia de Gram positivos cocos-Gram (coloración violeta) positivos (coloración violeta) Presencia de cocos- Presencia de cocos-Gram Gram positivos (coloración violeta) positivos (coloración violeta) 120 1 Jet A1 4 2 1 Fluido de Corte Corte 120 2 Tinción de Gram en placas con Cetrimida Agar contaminadas Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados124 Figura 26. Tinción de Gram de la muestra 4 (Jet A1) en medio m-TGE 1 (repetición 1) Figura 27. Tinción de Gram de la muestra Corte (Fluido de Corte) en Medio Tioglicolato 1 (repetición 1) Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados125 IV.1.4 DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y EN FLUIDOS DE CORTE♣ Tabla 16. Observaciones en la determinación de la presencia de bacterias sulfato reductoras anaerobias en turbo kerosinas y en fluidos de corte Tipo de Fluido Muestra Tiempo de incubación (horas) Repetición Observaciones 2 504 1 Ausencia de precipitado negro 504 2 Ausencia de precipitado negro 504 1 Presencia de precipitado negro 504 2 Presencia de precipitado negro 504 1 Ausencia de precipitado negro 504 2 Ausencia de precipitado negro 504 1 Ausencia de precipitado negro 504 2 Ausencia de precipitado negro 504 1 Presencia de precipitado negro 504 2 Presencia de precipitado negro 504 1 Presencia de precipitado negro 504 2 Presencia de precipitado negro Jet A1 4 Jet A1 7 Jet A1 8 Jet A1 Jet A1 en caldo nutritivo Jet A1 en caldo nutritivo Fluido de Corte Venosoluble AW Blanco ♣ 9 10 Corte Blanco 504 1 504 2 504 Ausencia de precipitado negro Ausencia de precipitado negro Ausencia de precipitado negro Esta metodología, por ser de fácil experimentación y manipulación, fue directamente la puesta en marcha del Kit microbiológico Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados126 (a) (b) Figura 28. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 2) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente (a) (b) Figura 29. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 4) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados127 (a) (b) Figura 30. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 7) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente (a) (b) Figura 31. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 8) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados128 (a) (b) Figura 32. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 9) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente (a) (b) Figura 33. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra 10) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados129 (a) (b) Figura 34. (a) Observación inicial de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación de los tubos de ensayo al vacío con Combustible Jet A1 (muestra Corte) en Medio Starkey por duplicado después de 21 días de incubación a temperatura ambiente (a) (b) Figura 35. (a) Observación inicial del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) antes de someterlos al período de incubación; (b) Observación del tubo de ensayo al vacío con Medio Starkey (Blanco) después de 21 días de incubación a temperatura ambiente Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados130 IV.1.5. RESULTADOS OBTENIDOS DE LA PUESTA EN MARCHA DEL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE Tabla 17. Observaciones de la puesta en marcha del kit microbiológico (prototipo) para la determinación de la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en las muestras de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Tipo de fluido Muestra Repetición Jet A1 2 1 2 Tiempo de incubación (horas) 168 168 48 1 Jet A1 4 48 2 48 1 Fluido de Corte Corte 48 2 Blanco 48-168 Medios de Cultivo m-TGE No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio Tioglicolato TSB No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) No turbio No turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio Turbio con precipitado blanco (mal olor) Cristalino-no turbio Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados131 (a) (b) Figura 36. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 2, repetición 1) y después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo) (a) (b) Figura 37. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Combustible Jet A1 (muestra 4, repetición 1) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo) Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados132 (a) (b) Figura 38. (a) Observación inicial de los frascos con los tres medios de cultivo (TSB, m-TGE y Tioglicolato) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y antes de someterlos al período de incubación, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo). (b) Observación de los frascos con los tres medios de cultivo (m-TGE, Tioglicolato y TSB) luego de la filtración del Fluido de Corte (muestra Corte, repetición 2) y después de 2 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo) Figura 39. Observación de los blanco con los tres medios de cultivo (m-TGE, TSB y Tioglicolato) después de 7 días de incubación a 35 ± 2° C, haciendo uso del Kit microbiológico (prototipo) Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados133 IV.1.6. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (AÑO 2005) COSTOS POR ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 18. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Reactivos M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) Fluid Thioglucollate Medium Tryptone Soya Broth Triton X-100 Cloruro de Sodio Alcohol Isopropílico 70% Hidróxido de Amonio al 25 % Cantidad por envase Costo del Cantidad del reactivo por reactivo utilizado envase ( Bs) Costo del reactivo utilizado (Bs) 500 g 140360,00 7,20 g 2021,18 500 g 500 g 3785 ml 500 g 120 ml 82800,00 78430,00 251100,00 250,00 767,05 11,90 g 12,00 g 0,40ml 1,28g 120,00 ml 1970,64 2622,00 26,50 0,64 767,05 2500 ml 50600,00 4,00 ml Subtotal 80,96 7408,05 Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados134 Materiales Cantidad del material comprado Membranas de filtración Millipore (blanca) 47 mm de 100 unidades díametro y 0,45 Mm por poro Papel Aluminio 1 unidad (7 m) 1 unidad Pabilo (500m) 1 unidad (2 Papel Kraft m*10 m) 1 Unidad (100 Motas de algodón motas) 1 Unidad (2 Gasa estéril retazos) 1 Unidad (850 Detergente ml) 1 Unidad (2000 Cloro ml) 1 Unidad (50 Fósforos cerillos) 1 Unidad (1 par Guantes estériles de guantes) 1 Unidad (5 Mascarilla máscaras) Toallas de papel 1 Unidad (100 absorbente toallas) Costo del material (Bs) Cantidad del material utilizado Costo del material utilizado (Bs) 139151,15 3 membranas 4174,53 1950,00 20 cm = 0,2000 m 55,71 650,00 2.0000 m 2,60 1500,00 0,2000 m*2 m 30,00 1928,55 30 motas 578,57 454,00 5 retazos 1135,00 3105,00 10 ml 36,53 1639,90 10 ml 8,20 200,00 2 cerillos 8,00 1852,65 2 pares 3705,30 3188,95 2 máscarillas 1275,58 1500,00 10 toallas 150,00 Subtotal Tiempo consumido (horas) Mano de Obra Analista de laboratorio 5 horas – hombre Directa (2 analistas) Analista de laboratorio Supervisor del laboratorio 5 horas - hombre Miembros ♠ 11160,02 Sueldo por hora (Bs) Sueldo por análisis (Bs) 3129,86 3129,86 3129,86 15649,31 15649,31 15649,31 Subtotal 46947,92 TOTAL 65515,99 Bs 34,12$( Tasa de cambio actual: 1$ = 1920 Bs (Febrero-2005) Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados135 IV.1.7 COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005) COSTOS POR ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 19. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Pseudomonas Aeroginosas y hongos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Reactivos M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) Fluid Thioglucollate Medium Tryptone Soya Broth Triton X-100 Cloruro de Sodio Alcohol Isopropílico 70% Hidróxido de Amonio al 25 % Cetrimida Agar Sabouraud Dextrosa Agar Violeta Cristal Safranina Azul de metileno Glicerol o glicerina 99,5 % pureza Costo del Cantidad del Costo del Cantidad reactivo por reactivo reactivo por envase envase ( Bs) utilizado utilizado (Bs) 500 g 500 g 500 g 3785 ml 500 g 120 ml 2500 ml 500 g 500 g 25 g 25 g 25 g 140360,0000 82800,0000 78430,0000 251100,0000 250,0000 767,0500 50600,0000 149500,0000 156492,0000 86250,0000 118650,1000 55200,0000 7,20 11,90 g 12,00 g 0,40 ml 1,28 120,00ml 4,00 ml 9,06 g 13,00 g 0,05 g 0,025 g 0,10 g 2021,18 1970,64 2622,00 26,54 0,64 767,05 80,96 2708,94 4068,79 172,50 118,65 220,80 1000 ml Subtotal 20815,0000 2,00 ml 41,63 14820,32 Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados136 Materiales Membranas de filtración Millipore (blanca) 25 mm de díametro y 0,47 Mm por poro Papel Aluminio Pabilo Papel Kraft Motas de algodón Gasa estéril Detergente Cloro Fósforos Guantes estériles Mascarilla Toallas de papel absorbente Costo del material (Bs) 100 unidades 139151,15 3 membranas 4174,53 1 unidad (7 m) 1 unidad (500m) 1 unidad (2 m*10 m) 1 Unidad (100 motas) 1 Unidad (2 retazos) 1 Unidad (850 ml) 1 Unidad (2000 ml) 1 Unidad (50 cerillos) 1 Unidad (1 par de guantes) 1 Unidad (5 máscaras) 1950,00 650,00 1500,00 1928,55 454,00 3105,00 1639,90 200,00 100 cm = 1 m 4m 1m 40 motas 7 retazos 20 ml 20 ml 2 cerillos 278,57 5,20 150,00 771,42 1589,00 73,06 16,40 8,00 1852,65 3188,95 2 pares 2 mascarillas 3705,30 1275,58 1 Unidad (100 toallas) Subtotal 1500,00 10 toallas 150,00 Miembros Mano de Obra Directa Analista de laboratorio Analista de laboratorio Supervisor del laboratorio 12197,06 Tiempo consumido (horas) 8 horas - 2 hombre (2 analistas) 8 horas - 1 hombre Subtotal TOTAL ♠ Cantidad del Costo del material material utilizado (Bs) utilizado Cantidad del material comprado Tasa de cambio actual: 1$ = 1920 Bs (Febrero-2005) Sueldo por hora (Bs) Sueldo por análisis (Bs) 3129,86 25038,89 3129,86 25038,89 3129,86 25038,89 75116,67 102134,50Bs 53,20$( Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados137 IV.1.8. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS A LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE A NIVEL DE LABORATORIO (año 2005) COSTOS POR CADA ANÁLISIS (DUPLICADO + BLANCO) Tabla 20. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra en la determinación de Bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Reactivos Lactato de sodio al 50 % Cloruro de amonio p.a Potasio fosfato dibásico p.a Sulfato de magnesio extra puro Sulfato de sodio extra puro Alcohol Isopropílico 70% Cloruro de calcio dihidratado al 95 % Ácido tioglicólico al 80 % Amonio (II) sulfato hexahidratado (sal de MOHR) p.a Cloruro de magnesio p.a Potasio fosfato monobásico p.a Hidróxido de sódio p.a Subtotal 1000 ml 500 g Costo del reactivo por envase ( Bs) 120750,00 48300,00 1000 g Cantidad por envase Cantidad del Costo del reactivo reactivo utilizado utilizado (Bs) 5,55 ml 1,00 g 670,16 96,60 66700,00 0,50 g 33,35 1000 g 76475,00 2,03 g 155,12 1000 g 37375,00 0,50 g 18,69 120 ml 767,05 120,00 ml 767,05 1000 g 89700,00 0,10 g 8,97 500 ml 152490,00 0,10 ml 30,50 500 g 56350,00 0,0010 g 0,11 1000 g 80500,00 1,90 g 152,95 1000 g 82800,00 6,80 g 563,04 1000 g 36800,00 20,00 g 736,00 3232,54 Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados138 Cantidad del Costo del material material (Bs) comprado Jeringas estériles de 1 unidad 893,75 10 ml (1 jeringa) Jeringas estériles de 1 unidad 390,00 5 ml (1 jeringa) 1 unidad 1950,00 Papel Aluminio (7 m) 1 unidad Pabilo 650,00 (500m) 1 Unidad Motas de algodón 1928,55 (100 motas) 1 Unidad Gasa estéril 454,00 (2 retazos) 1 Unidad 3105,00 Detergente (850 ml) 1 Unidad Cloro 1639,90 (2000 ml) 1 Unidad Guantes estériles (1 par de 1852,65 guantes) 1 Unidad Mascarilla 3188,95 (5 máscaras) Toallas de papel 1 Unidad 1500,00 absorbente (100 toallas) Tubos de ensayo 1 Unidad 32154,00 estéril al vacío (100 tubos) descartables (11 ml) Subtotal Materiales Miembros Mano de Obra Directa ♠ Analista de laboratorio Analista de laboratorio Supervisor del laboratorio Cantidad del material utilizado Costo del material utilizado (Bs) 3 jeringas 2681,25 2 jeringas 780,00 50 cm = 0,5 m 139,29 0,5 m 0,65 10 motas 192,86 1 retazos 227,00 10 ml 36,53 10 ml 8,20 2 pares 3705,30 2 máscarillas 1275,58 10 toallas 150,00 3 tubos 964,62 Tiempo consumido (horas) 4 horas - hombre (2 analistas) 4 horas-1 hombre 8416,65 Sueldo por hora (Bs) Sueldo por análisis (Bs) 3129,86 12519,44 3129,86 12519,44 3129,86 12519,44 Subtotal 37558,32 TOTAL 49207,51 Bs 25,63 $( Tasa de cambio actual: 1$ = 1920 Bs (Febrero-2005) Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados139 IV.1.9. COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS AL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005) Tabla 21. Costos por análisis de Reactivos, Materiales y mano de obra del Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios mesófilos en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Reactivos M-Tryptone Glucose Extract Broth (MTGE) Fluid Thioglucollate Medium Tryptone Soya Broth (TSB) Triton X-100 Cloruro de Sodio Hidróxido de Amonio al 25 % Cantidad por envase Costo del reactivo por envase ( Bs) Cantidad del reactivo utilizado Costo del reactivo utilizado (Bs) 500 g 140360,00 0,90 g 252,65 500 g 82800,00 1,49 g 246,33 500 g 3785 ml 500 g 78430,00 251100,00 250,00 1,50 g 0,05 ml 0,085 g 235,29 3,32 0,04 2500 ml 50600,00 Subtotal 0,30 m 6,07 743,70 Materiales 9 envases de plástico transparente con capacidad de 20 cc (con rosca esterilizables) 3 tubos de ensayo de 9 cc 3 envases de plástico con capacidad de 11 cc (con rosca esterilizables) 3 cm = 0,03 m de papel de aluminio 3 Membranas Millipore de 25 mm de diámetro y 0,45 micrones por poro 1 Jeringa modificada estéril de 100 cc (equipo de filtración) (resistente al autoclave) Tijera metálica Pinza metálica 3 Jeringas estériles desechables de 20 cc 6 Guantes estériles 1 Mechero portátil de alcohol 1 Botella con 120 cc de alcohol isopropílico al 70 % v/v 1 Paquete de algodón (25 g) 1 Mascarilla 1 Frasco de plástico recolector del fluido filtrado Costos de los materiales (Bs) 5175,00 5126,70 931,50 8,36 4364,28 25000,00 3563,85 3500,00 557,75 11115,90 17710,00 767,05 669,30 637,79 235,75 Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados140 3 Envases de 500 cc de vidrio (cara interna estéril) utilizados para las tomas de muestras Caja de fósforos Detergente líquido Subtotal Tiempo Sueldo por consumido hora (Bs) (horas) Mano de Obra Analista de laboratorio 2 horas - hombre 3129,8600 Directa (2 analistas) Analista de laboratorio 3129,8600 Supervisor del laboratorio 2 horas - hombre 3129,8600 Subtotal Miembros TOTAL 3000,00 200,00 18,26 82581,50 Sueldo por análisis (Bs) 6259,72 6259,72 6259,72 18779,17 157504,37 Bs 82,03$ Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados141 IV.1.10 COSTOS PRIMARIOS ASOCIADOS AL KIT (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LAS MUESTRAS DE TURBOKEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE (año 2005) COSTOS PARA 5 ANÁLISIS Tabla 22. Costos de Reactivos, Materiales y mano de obra, para 5 análisis, del Kit Microbiológico (Prototipo) para la determinación de bacterias sulfato-reductoras en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte Reactivos Lactato de sodio al 50 % Cloruro de amonio p.a Potasio fosfato dibásico p.a Sulfato de magnesio extra puro Sulfato de sodio extra puro Alcohol Isopropílico 70% Cloruro de calcio dihidratado al 95 % Ácido tioglicólico al 80 % Amonio (II) sulfato hexahidratado (sal de MOHR) p.a Cloruro de magnesio p.a Potasio fosfato monobásico p.a Hidróxido de sódio p.a Cantidad por envase Costo del reactivo por envase ( Bs) Cantidad del reactivo utilizado Costo del reactivo utilizado (Bs) 1000 ml 120750,00 5,55 ml 670,16 500 g 48300,00 1,00 g 96,60 1000 g 66700,00 0,50 g 33,35 1000 g 76475,00 2,029 g 155,12 1000 g 37375,00 0,50 g 18,69 120 ml 767,05 120,00 ml 767,05 1000 g 89700,00 0,10 g 8,97 500 ml 152490,00 0,10 ml 30,50 500 g 56350,00 0,0010 g 0,11 1000 g 80500,00 1,90 g 152,95 1000 g 82800,00 6,80g 563,04 1000 g 36800,00 20,00 g 736,00 Subtotal 3232,54 Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados142 Materiales Cantidad del Costo del Cantidad del material comprado material (Bs) material utilizado Jeringas estériles de 10 1 unidad (1 jeringa) ml Jeringas estériles de 5 1 unidad (1 jeringa) ml Papel Aluminio 1 unidad (7 m) Pabilo 1 unidad (500m) Motas de algodón 1 Unidad (100 motas) Gasa estéril 1 Unidad (2 retazos) Detergente 1 Unidad (850 ml) Cloro 1 Unidad (2000 ml) 1 Unidad (1 par de Guantes estériles guantes) 1 Unidad Mascarilla (5 máscaras) Toallas de papel 1 Unidad (100 absorbente toallas) Tubos de ensayo estéril al vacío descartables (11 ml) 1 Unidad (100 tubos) Subtotal 893,75 5 jeringas 4468,75 390,00 5 jeringas 1950,00 1950,00 650,00 1928,55 454,00 3105,00 1639,90 50 cm = 0,50 m 0,5 m 10 motas 1 retazos 10 ml 10 ml 139,29 0,65 192,86 227,00 36,53 8,20 1852,65 6 pares 11115,90 3188,95 1 máscarillas 637,79 1500,00 10 toallas 150,00 32154,00 5 tubos 1607,70 Tiempo consumido Sueldo por hora (horas) (Bs) Analista de laboratorio 4 horas - 2 hombre (2 3129,86 Mano de Obra Directa Analista de laboratorio analistas) 3129,86 Supervisor del 4 horas-1 hombre 3129,86 laboratorio Subtotal Miembros TOTAL Costo del material utilizado (Bs) 16976,96 Sueldo por análisis (Bs) 12519,44 12519,44 12519,44 37558,33 57767,83 Bs 30,09$ Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados143 IV.2 ANÁLISIS DE RESULTADOS IV.2.1. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En la realización de este análisis se pudo observar que dos de las tres muestras estudiadas estaban contaminadas con microorganismos aerobios mesófilos (Ver Tabla 12), específicamente el Turbo Combustible Jet A1 (muestra 4) resultó contaminado debido a que los tres caldos empleados presentaron enturbiamiento, mostrándose el mismo hecho en la muestra de Fluido de Corte. Por el contrario, el Turbo Combustible Jet A1 (muestra 2) no resultó contaminado, puesto que no se observó enturbiamiento de los caldos utilizados. En cuanto al Jet A1 (muestra 2), la observación de los caldos se realizó diariamente, notándose que, al cabo de los 7 días (período máximo de incubación) no había ningún cambio de color en los caldos que indicara contaminación microbiana (Ver Figura 20). Esta presumible ausencia de contaminación microbiológica se puede atribuir a un mantenimiento adecuado por parte del personal encargado de ello, especialmente por el drenado del tanque regularmente; este hecho se pudo evidenciar durante la fase de toma de muestra en la cual no se observó la presencia de agua al ser drenado el combustible, medio donde se suelen alojar y desarrollar los microorganismos. Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados144 En los caldos de cultivo de la muestra 4 (Jet A1) se percibió enturbiamiento al segundo día del período de incubación, hecho que sugirió la contaminación microbiana de dicha muestra. (Ver Figura 21). Esto se evidenció por la presencia de una película y de un precipitado blanco en los tres medios de cultivo utilizados, percibiéndose, además, un olor desagradable. En cierta forma, estos eran los resultados esperados debido a que la muestra presentaba una interfase (agua/combustible), fácilmente apreciable, con presencia de limo y partículas sólidas, siendo éstas condiciones muy favorables para el crecimiento y desarrollo de microorganismos. Resulta importante tomar en consideración que la muestra fue tomada de una aeronave inoperativa, en el Aeropuerto La Carlota, facilitando, con esto, el desarrollo microbiano. Ésta podría ser una de las posibles causas de las picaduras observadas en las paredes del tanque, ya que, algunos subproductos del metabolismo (metabolitos) de los microorganismos aerobios están constituidos por ácidos, compuestos de azufre y dióxido de carbono los cuales atacan de forma directa los materiales que componen el tanque. Este resultó ser un claro ejemplo de corrosión inducida por microorganismos. Es importante destacar que el tanque de almacenamiento, del cual se surtió y se surte de combustible esta aeronave, es del tipo subterráneo, lo cual dificulta el mantenimiento y limpieza del mismo, dándose las condiciones necesarias para la aparición de actividad microbiana. Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados145 Del mismo modo, al analizar el Fluido de Corte, se observó un cambio de coloración en los tres medios de cultivo, con la presencia de un precipitado blanco, olor desagradable y enturbiamiento que fue detectado al segundo día del período de incubación (Ver Figura 22). Es importante acotar que el fluido en evaluación es del tipo emulsión de 5% Aceite Venosoluble y el resto de agua, de acuerdo a la formulación del fabricante. Como ya es sabido, el agua es uno de los factores principales que propician el crecimiento de microorganismos en fluidos de corte, los cuales degradan el fluido ocasionando un déficit en el rendimiento de sus funciones de lubricación o refrigeración, según sea el caso; esto trae como consecuencia directa el desgaste de las piezas metálicas, unido a la formación de biomasa y biopelículas que se adhieren a las paredes de la tubería causando disminución del diámetro, afectando el caudal del fluido y en los peor de los casos obstrucción. En esta prueba se utilizaron tres medios de cultivo diferentes con la finalidad de abarcar un mayor rango de microorganismos aerobios que pudiesen estar presentes en los fluidos estudiados. Esto se debe a que los tres medios de cultivo varían en su composición, dando, así, mayores opciones de nutrientes a los microorganismos que necesiten de uno u otro compuesto para su crecimiento y desarrollo (Ver Anexo D). Cada uno de estos medios son Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados146 productos comerciales, científicamente probados, cuyas composiciones permiten el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos aerobios. IV.2.2. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS Y HONGOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE, PRESENTES EN LOS CALDOS CONTAMINADOS (TURBIOS) POR MEDIO DE REPIQUES En las placas con Cetrimide Agar (medio selectivo para Pseudomonas aeroginosas) se observó crecimiento de microorganismos evidenciado por la presencia de una coloración blanca en la mayoría de las ellas (Ver Tabla 14), lo cual sugirió la ausencia de Pseudomonas aeroginosas, ya que estos microorganismos son fácilmente distinguibles macroscópicamente, manifestándose con una coloración verde-amarillenta cuando son expuestas al Cetrimide Agar. Este agar estimula la producción de fluoresceina y pioscianina, compuestos responsables de la pigmentación de estas bacterias. Específicamente, en las placas en las cuales se realizó el repique de la muestra 2 (Jet Fuel), no se encontró indicio alguno de crecimiento de microorganismos, ya que, las placas, al cabo de 4 días no mostraban un cambio apreciable (Ver Figura 26), lo cual indica la ausencia de Pseudomonas aeroginosas. Cabe destacar, que a pesar que los medios líquidos no presentaban enturbiamiento (razón por la cual se debería desechar la necesidad de realizar repiques), se decidió hacer repiques a esta Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados147 muestra sólo a manera de control de la metodología aplicada. De la misma forma, se realizó con los blancos. En las placas de la muestra 4 (Jet Fuel), se observó un escaso crecimiento de microorganismos en los repiques de los tres medios de cultivo líquido utilizados al cabo de 2 días, evidenciado por la presencia de pequeños puntos blancos de aspecto viscoso (Ver Figura 27); estos resultados descartaron la hipótesis de posible presencia de Pseudomonas aeroginosas en el combustible. Una de las posibles causas por la cual no se encontraron este tipo de bacterias en el fluido, es el uso de Biobor JF por parte del personal encargado del mantenimiento del combustible. Éste es un biocida especialmente formulado para inhibir el crecimiento de Pseudomonas aeroginosas y Cladosporium resinae, por lo tanto, el crecimiento observado debe corresponder a otro tipo de microorganismo a cuya identificación escapa de los límites de este trabajo. En los repiques de la muestra del Fluido de Corte se observó crecimiento de microorganismos de coloración blanca y aspecto viscoso, descartándose, por razones explicadas anteriormente, aeroginosas (Ver Figura 28). la existencia de Pseudomonas Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados148 Se seleccionó el Cetrimide Agar debido a que es un medio selectivo al microorganismo a analizar (Pseudomonas aeroginosas), además de ser un producto comercial y científicamente probado. En las placas con Sabouraud Dextrosa Agar (medio selectivo para hongos) se determinó que, en el repique de la muestra 2, no hubo crecimiento de microorganismos en los medios líquidos empleados, por lo tanto, se puede inferir que en esta muestra no hay presencia de hongos. (Ver Figura 23). En los repiques de la muestra 4 (Jet Fuel), se observó la presencia de superficies lisas, de coloración blanca y aspecto seco (costras blancas) en los tres medios líquidos utilizados (Ver Figura 24); este crecimiento responde claramente a la forma macroscópica de las levaduras. Adicionalmente, en las placas con los repiques de los medios líquidos m-TGE y Tioglicolato, se observó un crecimiento de microorganismos de coloración blanca y aspecto cremoso que podría estar asociado a un crecimiento bacteriano o a un desarrollo de hongos. La presencia de hongos en este tipo de muestra se debe, posiblemente, a que éstos crecen en ambientes ácidos, es decir, con un pH<7, condición que se pudiese encontrar en el combustible debido a que los productos de metabolismo de los microorganismos suelen ser ácidos, además este fluido presentaba una interfase agua/combustible favorable para su crecimiento. Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados149 En cuanto a los repiques del Fluido de Corte, se observó que en todas las placas presentaban crecimiento de microorganismos. En el repique de los medios Tioglicolato y m-TGE, se pudo apreciar la presencia de microorganismos de aspecto cremoso y de coloración blanca (posiblemente presencia de levaduras), y también se apreció en el repique del medio TSB, aunque en menor escala y acompañada con la presencia de un hongo filamentoso, fácilmente detectable a simple vista (Ver Figura 25). La selección del Sabouraud Dextrosa Agar en este estudio se debió a que es un medio selectivo a hongos, debido a que su pH ácido (5.6) inhibe parcialmente el crecimiento de bacterias, además de ser un producto comercial y científicamente probado. IV.2.3 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LA TINCIÓN DE GRAM PARA VERICAR LA PRESENCIA O AUSENCIA DE PSEUDOMONAS AEROGINOSAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE EN PLACAS CON CETRIMIDA AGAR CONTAMINADAS A pesar que ninguna de las cápsulas de Petri con Cetrimide Agar presentaban crecimiento de Pseudomonas aeroginosas, debido a la ausencia de una coloración verdosa, se llevó a cabo un análisis microscópico para confirmar su ausencia, para ello se realizaron tinciones de Gram en aquellas placas que presentaban crecimiento (placas correspondiente a las muestras 4 y Corte), observándose una coloración violeta que refleja la presencia de cocos (Gram positivos) (Ver Figura 29 y 30). La ausencia de una coloración Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados150 rosada confirma que las muestras no contenían Pseudomonas aeroginosas que se caracterizan por ser bacilos, Gram negativos. IV.2.4 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS ANAEROBIAS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En la realización de este análisis se pudo observar que las muestras 4, 9 y 10 (Jet Fuel) resultaron contaminadas con bacterias sulfato-reductoras anaerobias, utilizando el Medio Starkey (Ver Tabla 16), lo cual se evidenció por la presencia de un precipitado negro; y las muestras 2, 7, 8 (Jet Fuel) y Corte no resultaron contaminadas, ya que no se observaron cambios durante la observación a lo largo de 21 días (período máximo de incubación) (Ver Figura 31, 33, 34 y 37). Es importante resaltar que las bacterias sulfato-reductoras crecen en la interfase agua/fluido hidrocarbonado derivado del petróleo, es por ello, que en las muestras 2, 7 y 8 no hubo crecimiento anaeróbico debido a la ausencia de esta interfase. En cuanto al Fluido de Corte, aún y cuando se está en presencia de un medio acuoso, no se observó crecimiento de bacterias sulfato-reductoras (Ver Figura 37); esto pudo deberse a una posible aireación del fluido lo cual impidió el desarrollo de éstas, puesto que, las bacterias sulfato-reductoras necesitan un medio muy reductor y mueren en presencia de oxígeno porque son incapaces de eliminar productos tóxicos provenientes de su metabolismo con el oxígeno como: peróxido de Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados151 Hidrógeno (H2O2), superperóxidos (O2-) y radicales de hidroxilos (OH-). Los aerobios contienen una enzima que descompone estos productos tóxicos, los cuales no poseen los anaerobios, tal como se presentan en las siguientes reacciones: O2 + e- → 2O2-(Superperóxido) O2- + 2H+ → H2O2 (Peróxido de Hidrógeno) H2O2 + e- → H2O + OH- (Radical hidroxilo) ♣ En cuanto a las muestras 4, 9 y 10, se evidenció la presencia de un precipitado negro. En la muestra 4 se apreció este precipitado al cabo de 16 días, lo que demuestra la presencia de bacterias sulfato-reductoras anaeróbicas (Ver Figura 32). Este precipitado negro se debe a la formación del H2S (producto de metabolismo de las bacterias sulfato-reductoras), el cual reacciona con el Hierro (Fe+2) presente en el Medio, como Sulfato Ferroso de Amonio ((NH4)2SO4.FeSO4.6H2O) dando lugar a la formación de sulfuro de hierro II (FeS) cuya coloración es negra. ♣ Fuente:S/A;S/F; “Crecimiento Microbiano”. S/L. (2005). Disponible en: http://docencia.uda.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiologia_2.pdf Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados152 El H2S, producto del metabolismo de las bacterias sulfato-reductoras, se forma a partir del Lactato de Sodio y las Sales de Sulfato, tal como se muestra en la siguiente reacción: 2 CH3HOCHCOO- + SO4= → 2CH3COO- + H2S + 2 HCO3- ♥ Luego, el H2S metabolizado por las bacterias sulfato-reductoras, reacciona con el Hierro presente en el medio, formando un precipitado negro correspondiente al FeS, según lo muestra la reacción siguiente: Fe+2 + H2S → FeS + 2H+ La presencia de este tipo de bacterias en la muestra 4, posiblemente, se deba a que el avión, de cuyo tanque se tomó la muestra, estaba inoperativo, lo cual debe haber favorecido el crecimiento de bacterias sulfato-reductoras unido a la presencia de limo (producto del metabolismo de microorganismos aerobios) que propicia un ambiente anóxico, obstaculizando el paso del oxígeno hacia el fondo del tanque. Como ya se mencionó anteriormente, las bacterias sulfato-reductoras crecen en ambientes acuosos libres de oxígeno; condición que se daba en la muestra 4, ya que ésta presentaba una interfase combustible/agua fácilmente distinguible. ♥ Fuente: S/A; S/F; (2002). “Activity and Diversity of Sulfate-Reducing Bacteria in a Petroleum Hydrocarbon-Contaminated Aquifer”. (2005). Disponible en: http://ccee.oregonstate.edu/research/grl/push-pull/pdf/kleikemper_et_al2002.pdf Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados153 En cuanto a las muestras 9 y 10, éstas fueron incluidas en el análisis con el objetivo de disponer de un patrón con el cual se pudiese comparar los resultados a obtener por la presencia de bacterias sulfato-reductoras. Estas muestras, antes de analizarlas, se conocía que contenían estas bacterias, porque fueron suministradas por personal especializado que previamente habían inoculado bacterias sulfato-reductoras en ellas. Al aplicar la metodología de análisis a estas muestras, se obtuvo como resultado la aparición de un precipitado negro, tal como era de esperarse, al cabo de 15 y 16 días para las muestras 9 y 10 respectivamente (Ver Figura 35 y 36). IV.2.5. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LA PUESTA EN MARCHA DEL KIT MICROBIOLÓGICO (PROTOTIPO) PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS EN LAS MUESTRAS DE TURBO KEROSINAS Y FLUIDOS DE CORTE En este estudio se diseñó y elaboró un Kit microbiológico prototipo, a pequeña escala y para que fuese de fácil manipulación, fundamentado en la misma metodología empleada a nivel de laboratorio para determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos, es decir, que se llevó a cabo de forma paralela y en condiciones similares a los estudios realizados en el laboratorio. De hecho, las muestras 4 y Corte resultaron positivas a la presencia de microorganismos aerobios mesófilos en la puesta en marcha del kit microbiológico, así como a nivel de laboratorio (Ver Figura 40 y Figura 41). De la misma forma, la muestra 2, no resultó contaminada en la puesta Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados154 en marcha del kit microbiológico prototipo ni en la aplicación a nivel de laboratorio. (Ver Figura 39 y Tablas 13, 18) IV.2.6 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DE LOS DE COSTOS ASOCIADOS A LOS ESTUDIOS REALIZADOS Una vez conocido cuáles son los materiales, equipos y reactivos utilizados en cada una de las metodologías, se procedió a realizar un estudio de los costos asociados a cada análisis llevados a cabo a nivel de laboratorio, así como también, de los “Kits (prototipo) microbiológicos” preparados. Debido a que actualmente en Venezuela no se llevan a cabo análisis microbiológicos en fluidos hidrocarbonados derivados del petróleo, ni se producen ni comercializan kits que permitan detectar actividad microbiana en dichos fluidos, se decidió realizar una comparación directa de los costos de los análisis y kits microbiológicos (prototipos) desarrollados en el presente trabajo, con los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN (un prestigioso Laboratorio ubicado en Michigan, Estados Unidos) con la finalidad de conocer si los kits y análisis realizados se encuentran dentro de un rango económicamente aceptable. A continuación se muestra una tabla comparativa de los costos asociados a los análisis desarrollados en el presente trabajo con los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN (Ver Tabla 23). Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados155 Tabla 23. Tabla comparativa que incluye los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN y los costos asociados a la metodología desarrollada en el presente trabajo (en $) para los diferentes estudios realizados Precio ofrecido por Labotatorios BIOSAN ($) Costos asociados a la metodología desarrollada en el presente trabajo (Tesis) ($) Comparación relativa porcentual entre los precios BIOSAN vs. Tesis (%) 45,35 34,12 32,91 Determinación de la presencia de Pseudomonas y Hongos a nivel de Laboratorio 86,75 53,20 63,06 Determinación de Bacterias sulfatoreductoras a nivel de Laboratorio 38,50 25,63 50,21 Kit Microbiológico para la determinación de microorganismos aerobios (incluye incubadora portátil) 376,75 82,03 359,28 Kit Microbiológico para la determinación de bacterias sulfatoreductoras (incluye incubadora portátil) 55,75 30,09 85,28 Tipo de Análisis Determinación de presencia microorganismos aerobios a nivel Laboratorio la de de En los datos de la tabla anterior (Tabla 24) se puede observar que los costos primarios asociados a las metodologías llevadas a cabo en el presente trabajo están por debajo de los precios ofrecidos por Laboratorios BIOSAN para metodologías similares. Capítulo IV. Resultados y Análisis de Resultados156 Es importante resaltar que los costos presentados para el desarrollo de la metodología en cuestión consisten en costos primarios, que son la suma de los elementos directos del costo, es decir, el conjunto formado por la materia prima directa y por la mano de obra directa, sin tomar en consideración los costos secundarios (servicios, depreciación de activos, alquiler, etc.) que podrían incrementarlo. De igual forma, estos estudios son preliminares, lo que implica que se podría optimizar tanto materiales, reactivos y todo lo relacionado a la metodología en cuestión a fin de lograr un mayor rendimiento de los mismos. Se podría realizar un estudio económico más profundo, por parte de un personal especializado en el área contable, a fin de tomar en consideración todo aquello que implique costos secundarios, intangibles y por comercialización de los servicios que se pudiesen ofrecer a nivel de Laboratorio y de los Kits CAPÍTULO V CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES “Conclusión es el lugar donde llegaste cansado de pensar.” Anónimo “Dar un buen consejo es un oficio tan común que lo usan muchos y lo saben hacer muy pocos.” Fray Antonio de Guevara Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones 158 V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES V.1 CONCLUSIONES A través de la realización del presente trabajo se obtuvieron las conclusiones siguientes: 1. Mediante las metodologías aplicadas a nivel de laboratorio se pudo desarrollar un protocolo para realizar análisis microbiológico en Turbo Kerosinas y en Fluidos de Corte. 2. Por medio de las técnicas llevadas a cabo en el laboratorio se pudo determinar la presencia de microorganismos aerobios mesófilos (en general), Pseudomonas aeroginosas, hongos (en general) y bacterias sulfato reductoras presentes en Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte. 3. A través del desarrollo de los análisis realizados, se pudo constatar que la Universidad Metropolitana cuenta con las instalaciones y ciertos equipos necesarios para realizar análisis microbiológico, mas es necesario la adquisición de nuevos equipos que garanticen un correcto análisis microbiológico en las condiciones asépticas pertinentes. 4. Mediante la realización de este trabajo se pudo elaborar Kits microbiológicos (prototipos), de fácil manipulación que permiten efectuar análisis microbiológico in situ en Fluidos de Corte y en Turbo Combustibles de Aviación. Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones 159 5. Se pudo notar que la fase más importante en el desarrollo del análisis microbiológico es la Toma de Muestra, ya que, ésta puede afectar significativamente los resultados experimentales obtenidos. 6. Una de las causas más importantes que provocan la contaminación microbiana de Turbo Kerosinas y Fluidos de Corte, es la presencia de una fase acuosa, además de un ambiente nutritivo que propicie el crecimiento de microorganismos, aunado al mal manejo de dichos fluidos por parte de los operadores (falta de drenaje de tanques e higiene periódico de los mismos). V.2. RECOMENDACIONES En base a los estudios realizados: 1. Se sugiere que en próximas investigaciones se establezcan metodologías de análisis que determinen el número de colonias presentes en las muestras para tener una idea del grado de contaminación microbiana o el grado de higiene con la que se han manipulado los fluidos. 2. Se propone realizar estudios relacionados con la elaboración de análisis microbiológicos en combustibles (en general) y en fluidos lubricantes, para una búsqueda de biocidas que permitan remediar y controlar la presencia de microorganismos que puedan afectar seriamente los fluidos y los sistemas donde se encuentran contenidos. Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones 160 3. Se recomienda que al finalizar la experimentación, se coloque en autoclave o se esterilice los materiales que posiblemente contengan material biológico (microorganismos) a fin de evitar una contaminación microbiana en el lugar de trabajo. 4. Se propone realizar un estudio de los Combustibles y Fluidos de Corte que contemple el efecto de la contaminación microbiana en las propiedades físicas de éstos, comparándolos con combustibles y Fluidos que se encuentren en óptimas condiciones. 5. Se sugiere determinar específicamente el tipo de microorganismo hallado en los análisis, mediante pruebas bioquímicas y microscópicas que permitan su identificación. 6. Se propone a las autoridades competentes de la Universidad Metropolitana la adquisición de una campana de flujo laminar, así como de todos aquellos elementos que permitan el correcto acondicionamiento y mantenimiento (higiene y asepsia) del Laboratorio para realizar análisis microbiológicos. 7. Se recomienda mantener siempre, dentro del grupo de muestras analizadas, un blanco a fin de tener un control de los medios preparados, además de utilizarse como patrón de comparación. 8. Para la búsqueda de otros tipos de microorganismos presentes en los combustibles a analizar, se recomienda el uso de otros agares selectivos, que permitan el crecimiento tanto de bacterias u hongos que sean de interés en estudios posteriores. Capítulo V. Conclusiones y Recomendaciones 161 9. Se propone la realización de un kit microbiológico con fines comerciales que cumpla con especificaciones de diseño y presentación, de fácil manipulación y disponibilidad, económicamente accesible a la población interesada con la finalidad de determinar la presencia o no de microorganismos en combustibles y fluidos de corte sin necesidad de transportarse a un laboratorio de análisis especializado. 10. Para el cultivo de bacterias sulfato-reductoras, de un modo más especializado y confiable, se recomienda el uso de una jarra anaeróbica que permita alcanzar las condiciones anóxicas necesarias para el crecimiento de este tipo de bacterias. BIBLIOGRAFÍA “Para la ciencia prefiero los libros más recientes, para las letras los más antiguos.” Bulwer Lytton Libros: 1. CLAVELL, L., y PEDRIQUE, M.; 1983; Microbiología manual de métodos generales; Universidad Central de Venezuela; Caracas. P. 11-15, 17-18, 35-37 2. HILL, E y Graham C. Hill. 2000. ECHA Microbiology Ltd, UK. 3. NÚÑEZ, M., GÓMEZ, M., y CARMONA, O.; 1991; Microbiología médica (tomo I); ediciones de la biblioteca de la Universidad Central de Venezuela; Venezuela. 4. PASSMAN, Frederick; (S/F). Fuel and Fuel System MicrobiologyFundamentals, Diagnosis, and Contamination Control. Estados Unidos. 5. (S/A). (2003). Tribology & Lubrication Technology. Volumen 59; N° 11. Artículo: TRIBUTO A HAROLD ROSSMOORE, pág 20. Estados Unidos. 6. S/A, 1992. Seminario Técnico de Combustibles y Lubricantes de Aviación. Corpoven. Caraballeda Bibliografía163 Medios electrónicos: 7. CALGARY, Alberta; (2003). Iron, Manganeso, Hydrogene Sulphide. (2005). Disponible en: http://www.davnor.com/articles/publications/bio_residential/ironfact.pdf 8. HAMLYN, P. Cephalosporium (1982). Protoplast acremonium. fusion and (2005). genetic Disponible analysis in en: http://fungus.org.uk/cv/thesis_fig5.9.htm 9. LABORDA, Roberto; (S/F). NTP 317: Fluidos de Corte: criterios de control de riesgos higiénicos. (2005). España. Disponible en: http://www.mtas.es/insht/ntp/ntp_317.htm 10. LEVIT, Bernardo; (2001). “Bio-films, una nueva manera de ver la placa”.(2005) Disponible en: http://www.alientoassist.com/biofilm.htm 11. ROSSMOORE, H.; 1994; Metal Working Fluid Microbiology (capítulo 9); Estados Unidos. Paper disponible en: http://www.biosan.com/publication.htm 12. ROSSMOORE, H.; 1974; TECHNICAL PAPER: Microbiological causes of cutting fluid deterioration; Creative Manufacturing Engineering Programs; Estados Unidos. Paper disponible en: http://www.biosan.com/publication.htm 13. (S/A). (2003). All microbiology news. (2005). Disponible en: http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHi st&m=MAY%202003. 14. S/A. (S/F). Anthrax I. (2005). Disponible en: Guerra biológica Bibliografía164 http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.html 15. S/A. (S/F). afbreekbare plastics . (2005). Disponible en: http://www.openleercentrum.be/Natutech/afbreekbare_plastics.htm 16. S/A. (S/F). Fungi Fusarium. (2005). Disponible en: http://byebyemold.com/mold_images/images/fusarium/fusarium_c.html 17. S/A. (2001). Clasificación de las bacterias. (2005). Disponible en: http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm 18. S/A. S/F. “Temas atuais relacionados á Biología”. (2005). Disponible en: http://www.estradadosol.fot.br/vestibular/temas/anthrax1.htm 19. (S/A).(2003).All microbiology news. (2005). Disponible en: http://www.rapidmicrobiology.com/news/Show_News_List.php?sector=AllHi st&m=MAY%202003. 20. S/A;S/F; “Crecimiento Microbiano”. S/L. (2005). Disponible en: http://docencia.uda.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiolog ia_2.pdf 21. TODAR, K. (2004). Pseudomonas aeroginosa.(2005). Disponible en: http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html 22. VALDERRAMA BLANCO, Brenda. S/A. México. “Microbiología del petróleo y sus derivados”. (2005). Disponible en: http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap2/imagenes/c2im3.html Publicaciones periódicas: 23. S/A. (2004, 11 de Diciembre). Autoridades esperan concluir hoy rescate de víctimas de accidente aéreo. EL UNIVERSAL, pp. 4-10 ANEXOS “... cosas que nos quedan en el tintero a última hora” Anónimo ANEXO A. TURBOKEROSINA JET A1 Descripción El Jet A-1 es el turbocombustible de uso civil más utilizado por las líneas de aviación en el mundo. La Tabla II.8 proporciona las características o propiedades físico-químicas del turbocombustible Jet A-1. Propiedades y Características Tabla A.1. Cifras típicas de los turbocombustibles (Jet A-1) Propiedades / Características Gravedad API a 15.6° C Color Visual Punto de Congelación, ° C Azufre, %p Punto de Inflamación, ° C Acidez Total mg KOH/g Punto de Humo, mm Aditivo Antiestático Aditivo Anticongelante Aditivo Anticorrosivo Índice de Separación de Agua (WSIM) Jet A-1 45 C/B -50 0.050 41 0.010 25 SI NO NO 95 Fuente: S/A, 1992. “Seminario Técnico de Combustibles y Lubricantes de Aviación”. Corpoven. Caraballeda. Anexos166 ANEXO B. ACEITE DE CORTE VENOSOLUBLE EMULSIONABLE PARA MECANIZADO) AW (ACEITE Descripción Es un aceite de corte emulsionable formulado para operaciones de corte y mecanizado de metales blandos y ferrosos. Se elabora con bases lubricantes y aditivos especiales de alta estabilidad térmica y antidesgaste de larga vida y para condiciones severas de operación. Propiedades y Características Tabla A.2. Cifras típicas del aceite de corte Venosoluble Aw Propiedades / Características Punto de inflamación, °C Gravedad específica 15/15 °C, g/ml pH de la emulsión al 10% Protección al desgaste, mm. Concentración mínima para protección anticorrosiva, % Viscosidad a 40 °C, cSt Compuestos Clorados Aditivos antidesgastes Aditivos anticorrosivos Aceite de corte Venosoluble- Aw 180 0.88 9.0 0.6 5.0 36 No Si Si Fuente: Venoco; (S/F); VENOSOLUBLE AW; (2005); Venezuela Disponible en: http://www.venoco.com/Detalle.asp?id=35&id_linea=1 Anexos167 ANEXO C. MEDIOS DE CULTIVOS SÓLIDOS C.1 Sabouraud Dextrose Agar Descripción Medio de cultivo recomendado para el cultivo y desarrollo de hongos. El bajo pH favorece el crecimiento de hongos Composición (en gramos por litro) Tabla A.3. Composición del medio Sabouraud Dextrose Agar Composición Polipeptona Glucosa Cloramfenicol Agar Gramos por litro 10.0 40.0 0.05 15.0 pH final a 25 °C: 5.6 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Sabouraud Dextrose http://www.britanialab.com/espanol/k02_55.html Agar; (2005); (S/L); Disponible en: Instrucciones Suspender 65 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco. C.2 Agar Cetrimida Descripción Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo selectivo de Pseudomonas aeroginosa. Anexos168 Composición (en gramos por litro) Tabla A.4. Composición del Agar Cetrimida Composición Peptona pancreática gelatina Cetrimida Cloruro magnésico Sulfato potásico Agar Gramos por litro 20.0 0.3 1.4 10.0 13.6 pH final a 25 °C: 7.2 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Cetrimide Agar; http://www.britanialab.com/espanol/k01_57.html (2005); (S/L); Disponible en: Instrucciones Suspender 45.3 g del polvo y 10 ml de glicerol en 1 litro de agua destilada. . Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco. ANEXO D. MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS D.1 Medio Tioglicolato Descripción Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo de microorganismos aerobios y anaerobios. Anexos169 Composición (en gramos por litro) Tabla A.5. Composición del Medio Tioglicolato Composición Peptona caseína Glucosa Cloruro de sodio Rezasurina L-cistina Extracto de levadura Tioglicolato sódico Agar Gramos por litro 15.0 5.5 2.5 0.001 0.5 5.0 0.5 0.75 pH final a 25 °C: 7.1 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Thioglycolate medium; http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf (2005); (S/L); Disponible en: Instrucciones Suspender 29.75 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco. D.2 “Tryptone Soy Broth” (TSB) Descripción Medio altamente nutritivo para el cultivo de una gran variedad de microorganismos aerobios existentes (hongos y bacterias) Anexos170 Composición (en gramos por litro) Tabla A.6. Composición del “Triptone Soy Broth” Composición Peptona caseína Peptona de soya Cloruro de sodio Fosfato dipotásico Glucosa Gramos por litro 17.0 3.0 5.0 2.5 2.5 pH final a 25 °C: 7.3 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Triptone Soy Broth; http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf (2005); (S/L); Disponible en: Instrucciones Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco. D.3 “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE) Descripción Medio recomendado para el crecimiento y desarrollo de microorganismos aerobios mesófilos. Tabla A.7. Composición del “m-Tryptone Glucose Extract Broth” (m-TGE) Composición Peptona caseína Hidrolysate Extracto de carne Glucosa Gramos por litro 9.0 6.0 2.0 1.0 pH final a 25 °C: 7.0 ± 0.2 Fuente: (S/A); (S/F); Tryptone Glucose Extract Broth; (2005); (S/L); Disponible en: http://www.nybro.cz/pdf/ENGLISH%20MANUAL.pdf Anexos171 Instrucciones Suspender 18 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121°C. Mantener en lugar fresco. ANEXO E. REACTIVOS UTILIZADOS Cloruro de sodio (NaCl) Características: Polvo cristalino blanco Tabla A.8. Propiedades del Cloruro de sodio (NaCl) Propiedades Peso molecular Punto de fusión Punto de ebullición Solubilidad en agua a 20 °C Densidad a 25 °C Valor 58.44 g/mol 804 °C 1413 °C 360 g/l 2.14 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Triton x-100 ([C16H26O2]n) Características: Líquido cristalino espeso, surfactante no iónico, miscible en agua. Tabla A.9. Propiedades del Triton x-100: Alkilauril polieter alcohol ([C16H26O2]n) Propiedades Peso molecular Densidad a 25 °C pH a 5 % en solución acuosa Tensión superficial Valor 250.38 g/mol 1.06 g/ml 6.00 31.00 dina/cm Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos172 Glicerina (C3H8O3) Características: Líquido transparente e incoloro, miscible en agua y viscoso. Tabla A.9. Propiedades de la glicerina (C3H8O3) Propiedades Peso molecular Punto de fusión Punto de ebullición Viscosidad a 20 °C Densidad a 20 °C Valor 92.10 g/mol 17.8 °C 290 °C 1400 mPas 1.47 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Safranina solución al 1 % p/v (C20H19ClN4) Características: Líquido de color rojo cereza, utilizado para tinciones de microscopia. Tabla A.10. Propiedades de la safranina: 3,7-Diamino-2,8-Dimetil-5-Fenilfenacinio Cloruro (C20H19ClN4) Propiedades Peso molecular Densidad de la solución al 1 % 20 /4 °C Valor 350.85 g/mol 0.998 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Violeta Cristal (C25H30ClN3) Características: En solución es un líquido de color azul – violeta, en forma sólida es un polvo de color verdoso, miscible con el agua y alcohol, utilizado para tinción microscópica. Anexos173 Tabla A.11. Propiedades del violeta cristal: Hexametilpararrosanilina Cloruro (C25H30ClN3) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 25 °C Solubilidad en alcohol a 25 °C Densidad de la solución al 2 % a 20/4 Valor 407.99 g/mol 4.00 g/l 30.00 g/l 0.80 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Azul de Metileno (C16H18ClN3S.xH2O) Características: En solución es un líquido de color azul, en forma sólida es un polvo de color verdoso oscuro con lustre bronceado, miscible con el agua y alcohol, utilizado para tinción microscópica. Tabla A.12. Propiedades del azul de metileno: Tetrametiltionina Cloruro (C16H18ClN3S.xH2O) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Solubilidad en alcohol a 25 °C Punto de fusión Valor 337.85 g/mol 40.00 g/l 15.00 g/l 180 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Lactato de Sodio (C3H5NaO3) solución al 50 % Características: Líquido denso transparente e incoloro. Miscible con agua Tabla A.13. Propiedades del lactato de sodio (C3H5NaO3) Propiedades Peso molecular Densidad a 20/4 Valor 112.06 g/mol 1.27 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos174 Cloruro de Amonio (NH4Cl) Características: Polvo cristalino blanco, soluble en agua. Tabla A.14. Propiedades del cloruro de amonio (NH4Cl) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Valor 53.49 g/mol 370 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Fosfato Dibásico de Potasio (K2HPO4) Características: Pequeños cristales blancos, utilizado para preparar soluciones tampones de fosfato. Tabla A.15. Propiedades del fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Valor 174.18 g/mol 1600 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Sulfato de Magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) Características: Pequeños cristales blancos Tabla A.16. Propiedades del sulfato de magnesio heptahidratado, Sal de Epson (MgSO4.7H2O) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Valor 246.48 g/mol 710 g/l Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos175 Sulfato de Sodio (Na2SO4) Características: Polvo cristalino blanco, higroscópico. Tabla A.17. Propiedades del sulfato de sodio (Na2SO4) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Densidad a 20 °C Punto de fusión Valor 142.04 g/mol 162 g/l 2.68 g/ml 884 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Acido Tioglicólico (C2H4O2S) solución al 80 % Características: Líquido transparente e incoloro, miscible con el agua, puede causar quemaduras graves si esta en contacto con la piel y/o mucosas. Altamente peligroso. Tabla A.18. Propiedades del Acido Tioglicólico (C2H4O2S) solución al 80 % Propiedades Peso molecular Densidad a 20 °C Valor 92.12 g/mol 1.27 g/ml Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Sulfato de Amonio Ferroso ((NH4)2SO4.Fe(SO4)2.6H2O) Características: Cristales verde azulado. Tabla A.19. Propiedades del sulfato ((NH4)2SO4.Fe(SO4)2.6H2O) Propiedades Peso molecular Densidad a 20 °C Solubilidad en agua a 20 °C Punto de fusión de amonio ferroso, sal de Mohr Valor 392.14 g/mol 1.86 g/ml 269 g/l 100 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos176 Hidróxido de sodio (NaOH) (perlas) Características: Sólido blanco en forma de perlas, higroscópico, base fuerte de alta peligrosidad, altamente irritante de la piel y mucosas. Tabla A.20. Propiedades del hidróxido de sodio (NaOH) Propiedades Valor Peso molecular 40 g/mol Densidad a 20 °C 2.13 g/ml Solubilidad en agua a 20 °C 1090 g/l Punto de fusión 318 °C Punto de ebullición 1390 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Potasio fosfato monobásico (KH2PO4) Características: Pequeños cristales blancos, utilizado para preparar soluciones tampones de fosfato. Tabla A.21. Propiedades del potasio fosfato monobásico (KH2PO4) Propiedades Valor Peso molecular 136.06 g/mol Solubilidad en agua a 20 °C 222 g/l Densidad a 25 °C 2.34 g/ml Punto de fusión 252 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Cloruro de magnesio (MgCl2) Características: Polvo blanco soluble en agua Tabla A.22. Propiedades del cloruro de magnesio (MgCl2) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 20 °C Punto de fusión Valor 95.25 g/mol 300 g/l 754 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos177 Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) Características: Polvo cristalino blanco. Irritante al contacto directo. Tabla A.23. Propiedades del cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) Propiedades Peso molecular Solubilidad en agua a 1 °C Punto de fusión Valor 147.02 g/mol 1000 g/l 175 °C Fuente: Panreac Química; (S/F); Catálogo on line; (2005); (S/L). Disponible en: http://www.panreac.com/esp/catalogo/catalogo_c.htm Anexos178 ANEXO F. IDENTIFICACIÓN DE ALGUNOS MICROORGANISMOS EN LOS FLUIDOS ANALIZADOS Tabla A.24. Identificación de algunos microorganismos en los fluidos analizados. Placa analizada en el medio Sabouraud Dextrosa Agar Microorganismo identificado (género) Descripción Levadura Cándida Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso Fluido de Corte Venosoluble Aw/muestra Corte/ medio líquido TSB 1/ placa 1 Levadura Cándida / Hongo filamentoso Fusarium Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso. Fusarium: Hongo filamentoso de coloración marrón Fluido de Corte Venosoluble Aw/muestra Corte/ medio líquido m-TGE 2/ placa 1 Levadura Cándida Levadura Cándida: Presencia de colonias color blanco y aspecto cremoso JetA1/muestra 4/ medio líquido m-TGE 2/ placa 2 Características Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal) Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal y tracto genital femenino). Fusarium: Se considera un contaminante puede causar infección en los ojos, sinusitis, e infecciones de piel. Este hongo suele madurar a los 4 días, forma colonias blancas y algodonosas al principio que luego se van tornando de color oscuro, con los bordes de color más claros. Levadura Cándida: Es una levadura que en el ser humano forma parte de la flora normal de la piel y mucosas (tracto respiratorio, gastrointestinal) Fuente: Laboratorio de Bacteriología de la Clínica Santa Sofía. El Cafetal – Caracas. Anexos179 ANEXO G. IMAGEN TANQUE DE AERONAVE CON CONTAMINACIÓN MICROBIANA Figura A.1. Imagen de un tanque de una aeronave de la Guardia Nacional (Sky Truck) que presentaba problemas de contaminación microbiana. GLOSARIO "Las palabras están ahí para explicar el significado de las cosas, de manera que el que las escucha, entienda dicho significado." Aldous Huxley • Agar: Polisacárido que, por sus propiedades gelificantes, se utiliza en la preparación de medios nutritivos para los cultivos. • ASTM: Sociedad Norteamericana de Exámenes y Materiales (American Society for Testing and Materials). Es una organización con larga tradición de estandarización. • Autótrofo: Organismo capaz de sintetizar materia orgánica utilizando energía inorgánica • Biocida: Sustancia química que destruye o detiene el desarrollo de ciertos organismos • Biomasa: Es el peso total de la materia viva de una parte de un organismo, población o ecosistema Glosario 181 • Celda galvánica: Celda electroquímica en la que reacciones químicas espontáneas producen electricidad. • Costos primarios o directos: Es la suma de los elementos directos del costo, es decir, el conjunto formado por la materia prima directa y por la mano de obra directa. • Elastómeros: Son polímeros de cadenas entrecruzadas como los termoestables, sólo que debido a la estructura de las cadenas que lo constituyen presentan propiedades elásticas. Son los componentes fundamentales de los cauchos: naturales, modificados, neopreno. • Emulsión: Una emulsión es una mezcla estable y homogénea de dos líquidos que normalmente no pueden mezclarse, (son inmiscibles entre ellos • Eucariotas: Son organismos que tienen la información genética envuelta dentro de una membrana que forman el llamado núcleo • Flagelo: Es un orgánulo externo que poseen algunas células, tanto de organismos unicelulares o formando parte de seres pluricelulares, con forma de látigo, que a través de su rotación, permite el desplazamiento de estas células por un medio acuoso. • Glucosa: Molécula carbohidrogenada que en cadenas ordenadas forma celulosa y en asociación amorfa almidón. Ésta (C6H12O6) es una hexosa (monosacárido de seis átomos de carbono) y además es un aldehído (contiene un grupo -CHO) Glosario 182 • Heterótrofo: Son aquellos que deben alimentarse con las sustancias orgánicas sintetizadas por otros organismos • Hidrofílica: Sustancias que presentan afinidad por el agua • Hidrofóbica: Sustancia no afín con el agua • Metabolismo: Conjunto de modificaciones que sufre una sustancia desde su entrada en el interior de un organismo hasta su transformación final. • Metabolito: Sustancias originadas por la transformación metabólica de sustancias en el interior de las células o de los seres vivos. • Péptido: Pequeñas cadenas de aminoácidos. • Procariota: Es un organismo vivo cuyo núcleo celular no está envuelto por una membrana, en contraposición con los organismos eucariotas, que presentan un núcleo verdadero o rodeado de membrana nuclear. • Sucrosa: Disacárido compuesto por glucosa y fructosa. • Surfactante: Son sustancias que influyen por medio de la tensión superficial en la superficie de contacto entre dos fases (p.ej. dos líquidos insolubles uno en otro). Se componen de una parte hidrofóbica o hidrófuga y un resto hidrofílica, o soluble en agua. • Taxonomía: Es la parte de la biología que estudia la clasificación de los seres vivos, los taxa (o taxones)