Download RT-PCR para el diagnóstico etiológico de peritonitis asociada a

Concurso de Proyectos de Investigación 2013:
RT-PCR para el diagnóstico etiológico de
peritonitis asociada a diálisis peritoneal en
niños
Ceballos ML1, Cano F1, Farfán M2, Ibacache MJ.1
1. Unidad
Nefrología Infantil HLCM
2. Laboratorio Biología Molecular HLCM
Noviembre 2013
ANTECEDENTES
1. 
Peritonitis !principal complicación ! impacto
2. 
Sospecha: liq. peritoneal (LP) turbio, dolor abdominal, fiebre, nauseas,
vómitos, problemas drenaje
3. 
Confirmación diagnóstica: citoquímico, Gram y cultivo de LP
◦ 
>100 leuc x mm3, PMN >50%
4. 
Terapia antibiótica empírica
5. 
Cultivo LP
◦ 
S aureus (21%), S coagulasa negativo –S epidermidis (22%) y P aeruginosa
◦ 
20% puede tener cultivo (-)
! 
Alternativa: Siembra en botellas de hemocultivos
Total eventos HLCM
Nov 2011-2012
14
Cultivos (+) 6 (43%)
Cultivo (-) 8 (57%)
Rev Chil Pediatr 2008; 79 (5): 522-536.
Pediatr Nephrol 2010; 25:425–440
Peritoneal Dialysis International 2012; 32: S32-S86.
ANTECEDENTES
5. 
Tasa cultivo LP negativo <20% (meta <10%)
6. 
Estudios ! técnicas de PCR! método sensible para identificar
organismos causantes de peritonitis (complementarios)
◦ 
Yoo y cols: TR-PCR de 23S ribosomal con secuenciación: concordancia
78,9%, positividad 82,1 vs 70,9%, combinados 93%, E: 90%,
con uso ATB previo: 15,6 vs 53,1%
◦ 
Suvorova y cols: 20 pac. con peritonitis y cultivo (-) ! PCR con primers
para 16S rRNA para S.aureus, S.pyogenes, E.faecalis, E.coli, etc. En
11/20 muestras resultado (+) para DNA bacteriano
◦ 
PCR en tiempo real?
Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 31: 281-287.
Am J Nephrol 2006; 26: 115-120.
Trasplantation Proceedings 2006; 38: 411-412.
Nephron Clin Pract 2007; 105: C121-C125.
HIPOTESIS DE TRABAJO
" 
RT-PCR puede aumentar la identificación bacteriana de peritonitis
asociada a DP
OBJETIVO GENERAL
" 
Determinar el rol de la RT-PCR en la detección de bacterias causantes de
peritonitis asociada a DP
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1) 
Determinar la concordancia de resultados entre cultivo estándar y en
botellas de hemocultivo, con RT-PCR en la detección de las bacterias: S
aureus, S epidermidis y P aeruginosa
2) 
Estimar la sensibilidad y especificidad de RT-PCR en la detección de
bacterias (S aureus, S epidermidis y P aeruginosa)
METODOLOGIA
" 
Estudio prospectivo observacional (1año)
" 
C. Ingreso: Pacientes pediátricos con ERCT en DP crónica del HLCM
(Diálisis cíclica automatizada (Home Choice PD System – Baxter) en quienes se
sospeche peritonitis:
◦  2 o más de: LP turbio, fiebre (>38ºC axilar), dolor abdominal, vómitos, “quiebre”
técnica estéril de conexión
" 
C. Exclusión: uso de ATB una semana previa a ingreso del estudio, no firma
consentimiento informado
" 
Variables demográficas:
◦  Edad, sexo, etiología de ERC, edad inicio de DP y tiempo en DP
◦  Síntomas sugerentes de peritonitis
◦  Antibióticos y duración del tratamiento
" 
Variables bioquímicas:
◦  En sangre: Proteina C reactiva (mg/l), recuento de GB (mil/uL)
◦  En LP: Recuento de leucocitos (cels x mm3) y % PMN
METODOLOGIA
" 
Variables microbiológicas:
◦  Cultivo de LP (técnica estándar y en botellas de hemocultivos BacT/ALERT)
" 
Variables moleculares:
◦  Kit Extracción de DNA (bacteriano) en LP
◦  PCR en tiempo real: primers para S aureus, S epidermidis, P aeruginosa
" 
Análisis estadístico
◦  Se estimará sensibilidad y especificidad de RT-PCR
◦  Variables de distribución normal: promedios y DS. Aquellas con distribución no normal:
medianas y rangos.
◦  Las diferencias entre grupos de distribución normal: t tests, y las no normales: Wilcoxin
sign-rank tests. Un p< 0.05, se considerara significativo.
RESULTADOS ESPERADOS
A. 
Alta concordancia entre resultados de RT-PCR y cultivo
estándar para la detección de las bacterias mencionadas.
B. 
Buena sensibilidad del test
C. 
Mayor diagnostico etiológico en peritonitis, con el uso de
cultivo estándar y RT-PCR de manera individual Y
combinada
GRACIAS!!