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UNIVERSIDAD NACIONAL DE HUANCAVELICA
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. DE ZOOTE CN I
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ZOOTECNIA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:
Identificación y desarrollo de las potencialidades económicas de la zona de impacto
del Proyecto Camisea
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
EFICACIA DEL BACTERICIDA DE
EXTRACTO
ETANOLICO DE Passiflora edulis Y Pìper agustifolium
SOBRE BACTERIAS CAUSALES DE DIARREAS EN
ALPACAS, EN LA ZONA DE INFLUENCIA DEL
PROYECTO DE CAMISEA - PROVINCIA DE
HUANCAVELICA
TESISTA:
RESPONSABLE: CARHUAPOMA DELA CRUZ, Víctor.
Asesor: Dr. VALENCIA MAMANI, Nicasio. UNH
Co Asesor: Dr. CHAVEZ ARAUJO, Elmer. UNH
Co Asesor: Dr. HUNG CHAPARRO, Armando. UPCH
FECHA DE REGISTRO:
FECHA DE INICIO
: AGOSTO DEL 2014
FECHA DE CULMINACIÓN
: AGOSTO
HUANCAVELICA, JULIO DEL 2014
DEL 2015
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
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Indice
CAPÍTULO I………………………………………….…………………………….….……
1.1. Planteamiento del problema…………...…...…………………….….…..
1.2. Formulación del problema…………...….………...…………….…….......
1.3. Objetivo……………………………………………………...…….…….………...
1.3.1. Objetivo general…………………………………….……….……….……...
1.3.2. Objetivo especificos…………………………………….…….…….……...
1.4. Justificación………………………...…………..……….……….……….……..
CAPÍTULO II………………………………………………………………………………..
2. Marco teorico……………………………………………………………………...
2.1. Antecedentes………………………………………………………..…………...
2.2. Bases teóricas…………………………………………………………………...
2.3. Hipotesis……………………………..……………………………………………..
2.4. Definición de terminos………………….…………………………………….
2.5. Identificación de variables…………………………………………………
2.5.1. Variables independientes…………………………………………………………..
2.5.1. Variables dependientes………………………...…………………………………..
2.6. Operacionalidad de variables……………….………………...………......
CAPÍTULO III…………………………………………...…………………………………..
3.1. Tipo de investigación………………………...…………….…………………..
3.2. Nivel de investigación……………………...………………………………….
3.3. Método de investigación………………...…………………….……………..
3.4. Diseño de investigación…………………...………………………………….
3.5. Población, muestra………………………...………………………….………..
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos………………
3.7. Procedimiento de recolección de datos……………………………...
3.8. Técnicas de procesamiento y análisis de datos……...…………….
3.9. Ámbito de estudio………………………………………………………………..
CAPÍTULO IV………………………………………………………………………………..
4. 0.Aspecto administrativo…………………………………………………………….
4.1. Recursos humanos……………………………………………………………..
4.2. Recursos materiales………………………………………………………….
4.3. Presupuesto…………………………………………………………….…………
4.3.1. Cuadro de presupuesto de materiales de laboratorio…………………………..
4.3.2. Cuadro de presupuesto de reactivos e insumos de laboratorio……..…………
4.3.3. Cuadro de presupuesto de capacitación del investigador……………………..
4.3.4. Cuadro de presupuesto de alquiler de equipos e instrumentos………………..
4.3.5. Cuadro análisis, ensayos, pruebas y traducciones…………………………........
4.3.6. Movilidad y transporte……………………………………………………………….
4.3.7. Cuadro de asesoramiento…………………………….…………………………….
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4.3.8. Cuadro de publicación en revistas científicas…………………………………..
4.3.9. Cuadro de evaluación por Jurados……………………………………………….
4.3.10. Cuadro alimentos y hospedaje del investigador……………………………….
4.3.11. Cuadro de resumen de todos los gastos ………………………………………
4.4. Financiamiento……………………………………………………………………
4.5. Cuadro cronograma de actividades……………………………………
4.6. cadena de gastos por partidas…………………………………………..
Referencias Bibliograficas……………………………………………………..
Nombre y firma de tesista y asesor (S)…………………………………
Anexos…………………………………………………………………………………….
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Matriz de consistencia
Esquema de proceso de los extractos de Matico y Maracuyá
Cuadros de registro de recolección de datos
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
CAPÍTULO I
1. PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En las últimas tres décadas se han desarrollado investigaciones científicas sobre la
sanidad en camélidos sudamericanos pero no se ha logrado controlar la proliferación de
microorganismos patógenos causales de mortalidad y morbilidad de las crías de alpacas, varias
razones exigen que este conocimiento sea colectado e integrado en su sentido más amplio, en la
tarea de contribuir al bienestar de miles de campesinos de los andes para quienes los camélidos
son recursos indispensables. Existe la necesidad urgente de mejorar los sistemas de manejo
sanitario, preservando los recursos y la cultura nativa para las generaciones venideras
(Carbajal, 2013).
En la actualidad la explotación de camélidos sudamericanos se lleva a cabo bajo
sistemas tradicionales, no siempre eficaces agudizando los problemas de morbilidad,
mortalidad (Oha,2012); donde los porcentajes de mortalidad de las crías de alpacas anual en la
mayoría de explotaciones alpaqueras es del orden del 50% (Palacios et. al., 2010), causa por
microorganismos patógenos de clostridium, salmonella y Escherichia Coli que afectan el
sistema tracto digestivo, generando enfermedades infecciosas principalmente la enterotoxemia
y colibacilosis.( Carbajal, 2013), estos problemas sanitarios afectan principalmente a animales
menores de 3 meses de edad y esta situación no sólo tiene impacto económico sino que impide
el crecimiento sostenido de la actividad alpaquera al disminuir la producción neta de animales
hasta el 65 % ,además a conllevado menor cantidad de animales que contribuyan con la
variabilidad genética(Palacios et. al., 2010).
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
La práctica de la medicina moderna es alarmante debido a la generación de resistencia de los
microorganismos a distintos antibióticos en los tratamientos de las enfermedades tracto digestivos en
camélidos sudamericanos (Quinn, 2009), esto a generado una desconfianza del uso de antibióticos por
parte de los productores alpaqueras, Palacios, et. al., (2010) sostiene de que los antibióticos ha
generado resistencia a antimicrobianos debido a que la gran mayoría de bacterias hay modificado su
pared celular o su membrana y han acumulado genes de resistencia haciéndola impermeable a la
entrada del antibiótico. la OMS (2012) estableció la lucha contra la resistencia a los antimicrobianos
como el tema del Día Mundial de la Salud tanto en medicina humana como en veterinaria y destacó la
necesidad de establecer una estrategia común y coordinada y de buscar las causas relacionadas con la
emergencia y extraordinaria diseminación de bacterias multirresistentes; por ello crea la necesidad de
encontrar nuevos compuestos que puedan actuar de forma directa sobre la actividad antimicrobiana o
inhibiendo los mecanismos de resistencia de los microorganismos patógenos, a través del uso de
plantas medicinales (Palacios et. al., 2010).
La practica medicinal con plantas naturales, ha sido utilizada desde tiempos muy antiguos
dándole a ella una propiedad importante para su uso hasta en un 85 %, la cual está incluida la
población andina y amazónica de nuestro país. El Passiflora edulis (Maracuyá) y Piper angustifolium
(Matico)
tiene propiedades antimicrobianas
demostrada contra Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis (Abad, 2009). Orientados en salud publica pero
no existen estudios en tratamientos clínicos en salud animal como en el control de Clostridium sp,
Salmonella sp y Escherichia coli que son bacterias causales de diarreas en neonatos de alpacas. Por lo
que se planteó estudiar la acción antimicrobiano o como bactericidas de extractos de Passiflora
edulis y Piper angustifolium sobre bacterias causales diarreicas en alpacas con la finalidad de
encontrar las propiedades inhibidoras antibacterianas para ser utilizado como etnofarmacologico o
bactericida. En tal sentido el problema de investigación queda enunciado de la siguiente manera.
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Cuál
es la eficacia del bactericida
de extractos etanólico de Passiflora edulis y Piper
angustifolium Sobre bacterias causales de diarreas en neonatos de alpacas?
OBJETIVO
1.3.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la eficacia del bactericida de extracto etanólico de Passiflora edulis y
Piper angustifolium sobre bacterias causales de diarreas en neonatos de alpacas.
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
1.3.2. OBJETIVO ESPECIFICOS
 Obtener la bactericida del extracto etanólico a partir de Passiflora edulis y Piper
angustifolium.
 Determinar la concentración y dosis óptima del bactericida de extracto etanólico de
Passiflora edulis y Piper angustifolium para la acción inhibitoria antimicrobiana de
Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli en vitro.
 Comparar la capacidad inhibitoria antimicrobiana in vitro del bactericida de extracto
etanólico de Passiflora edulis y Piper angustifolium sobre Clostridium sp, Salmonella sp y
Escherichia coli.
1.3.JUSTIFICACIÓN
El Perú cuenta con mucha variedad de plantas medicinales que nuestros pueblos aborígenes
utilizan con fines medicinales. Durante siglos la fitoterapia han sido empleadas en forma empírica
y en la actualidad han llamado la atención de los investigadores a fin de descubrir los principios
activos que justifican
sus usos terapéuticos (Abad, 2009). Los remedios a base de plantas
medicinales presentan una inmensa ventaja con respecto a los fármacos químicos, debido que sus
principios activos se hallan siempre biológicamente equilibrados, de forma que en general no se
acumulan en el organismo y sus efectos indeseables están limitados como indica Ocares (2012).
Los estudios fitoquímicos de Passiflora edulis
y
Piper angustifolium nos demuestran
componentes de gran importancia en la Fito terapéutico como: aceites esenciales, ácido artánico,
resinas, taninos, quinolonas, alcaloides, saponinas, flavonoides rutina, triterpenoides, entre otros
componentes
y es usada en medicina tradicional como
antisépticos, antimicóticos,
desinflamantes, antibacterianos, cicatrizantes, relajante muscular, dolores estomacales, tumores
intestinales, fiebre, hipertensión y diuresisI (Herrera et. al., 2008), y no existiendo a la fecha
ninguna comunicación en la literatura científica sobre ensayos clínicos en el uso de medicina
veterinaria sobre estos componentes terapéutico, esencialmente orientados a animales de
producción como los camélidos sudamericanos (alpacas) que es el sustento de la población alto
andina.
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El proyecto se vuelve necesario de la búsqueda de alternativas de solución en reducir taza de
mortalidad de neonatos de alpacas en vista de que hasta la actualidad no se ha controlado la
proliferación de Clostridium sp, Salmonela sp y Escherichia coli que son bacterias causales de
diarreas en neonatos de alpacas a través del uso de productos veterinarios; por ello nace la necesidad
del uso de especialidades etnofarmacologico de extractos de Passiflora edulis y Piper angustifolium
como bactericidas sobre Clostridium sp, Salmonela sp y Escherichia coli que son causales directos
de diarreas
en alpacas , es decir validar científicamente la eficacia terapéutico de extracto de
Passiflora edulis y Piper angustifolium en vitro sobre Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia
coli con la finalidad de generar el uso popular
a bajo costo debido a que el tratamiento con
especialidades farmacéuticas ha llegado a tan altos costos que se vuelve inaccesible para los
productores alpaqueras de nuestro país y la región de Huancavelica, esencialmente en la comunidad
campesina de Santa Bárbara provincia de Huancavelica zona de intervención del proyecto.
Por ello la investigación proyecto será un importante aporte para los productores alpaqueras de
nuestra región andina y de la Comunidad Campesina de Santa Bárbara – Huancavelica, debido a que
utilizaran como terapéutico natural los extracto de Passiflora edulis y Piper angustifolium para
combatir y controlar las enfermedades diarreicas bacterianas en neonatos de alpacas y por ende
contribuirá a incrementar su producción y sostenibilidad de crianza alpaquera y sus condiciones socio
económicos, y nuestros resultados servirán como un aporte a la ciencia y como una información de
base para futuras investigaciones.
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
CAPITULO II
2.
MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
Estrada (2012). Actividad Antibacteriana In Vitro de los Extractos de Romero
(Rosmarinus officinalis) y Tomillo (Thymus vulgaris). Determinaron
la actividad
antibacteriana In Vitro de los extractos de Romero (Rosmarinus officinalis) y Tomillo
(Thymus vulgaris) para ello utilizaron tres concentraciones diferentes y la mezcla de los
extractos blandos frente a las distintas bacterias y
comprobaron
antimicrobianas utilizando el método de Mitscher que consistió
sus propiedades
en
determinar el
crecimiento de microorganismos en presencia de concentraciones crecientes de extractos, que
se encuentran diluidos en el medio de cultivo. Encontrando que los extractos de ambas
plantas presentan actividad antibacteriana destacándose la mezcla de los extractos hexánicos
a concentraciones de 10000 y 1000 μg / mL frente a Staphylococcus aureus, Candida
albicans y Pseudomonas aeruginosa debido a los compuestos fenólicos como el timol,
carvacrol y cineol presentes en el aceite esencial. Por lo que recomiendan la utilización de la
mezcla de los extractos de Romero y Tomillo en infecciones causadas por bacterias y
hongos.
Sulca (2012). Actividad antimicrobiana de los extractos de. Acmella repens (Botoncillo), Urtica
dioca (Ortiga negra) y Sonchus oleraceus (Kana yuyo) sobre Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans, causantes de enfermedades bucofaríngeas. Estudio la actividad
antimicrobiana de las especies vegetales: Acmella repens (Botoncillo), Urtica dioica var. leptophylla
(Ortiga negra) y Sonchus oleraceus (Kana yuyo)
sobre Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa y Candida albicans, para ello utilizaron extractos acuosos, etanólicos y hexánicos y
fueron empleados en antibiogramas utilizando sensidiscos húmedos y secos con soluciones al 0%,
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25%, 50%, 80% y 100% de los extractos. Los periodos de incubación fueron de 24h -48h para las
bacterias y de 48h – 72h para la levadura. Sus resultados demostraron que en Candida albicans el
extracto etanólico de Acmella repens al 50% de concentración con sensidisco húmedo y 48h de
incubación fue es más efectivo. Para Pseudomonas aeruginosa fue el extracto etanólico de Urtica
dioica var. leptophylla al 50% de concentración con sensidisco húmedo y 24h de incubación y para
Staphylococcus aureus, el extracto etanólico de Sonchus oleraceus al 80% de concentración con
sensidisco húmedo y 24h de incubación.
Maraví (2012). Efecto Antibacteriano y Antifúngico del Aceite Esencial de: Menta piperita
(Menta), Origanum vulgare (Orégano) y Cymbopogon citratus (Hierba Luisa) sobre Streptococcus
mutans ATCC 25175, Lactobacillus acidophilus ATCC 10746 y Cándida albicans ATCC
90028.Estudió con la finalidad de determinar el efecto antibacteriano y anti fúngico in vitro del aceite
esencial de: Menta piperita (Menta), Origanum vulgare (Orégano) y Cymbopogon citratus (Hierba
Luisa) mediante el método de difusión en agar con disco, sobre Streptococcus mutans ATCC 25175,
Lactobacillus acidophilus ATCC 10746 y Cándida albicans ATCC 90028. Sus resultados
demostraron de los tres aceites esenciales el que tuvo mayor efecto sobre Streptococcus mutans fue el
Orégano, frente a Lactobacillus acidophilus y Candida albicans fue la Hierba Luisa, además
encontrando que el aceite esencial de Orégano y Hierba Luisa tienen mayor efectividad antibacteriana
y anti fúngica que los controles positivos: Clorhexidina al 0,12% y Nistatina, a excepción de la Menta
piperita.
Borja (2012). Actividad Antibacteriana y Concentracion Minima Inhibitoria del Aceite
Esencial del Cymbopogon Citratus frente al Streptococccus mutans In Vitro. Obtuvieron la
actividad antibacteriana y la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial del Cymbopogon
citratus frente al Streptococcus mutans in Vitro, demostrando que la CMI del aceite esencial del
Cymbopogon citratos frente al Streptococcus mutans fue de 0,4%. Al evaluar la actividad
antibacteriana en 80 uL/mL y 160 uL/mL del aceite esencial del cymbopogon citratos encontraron una
media de los halos de inhibición de 21.8mm y 23 mm (p<0.05). En cuanto al tiempo no encontró
significancia estadística (p>0.05).
Velásquez
(2011) Actividad Antimicrobiana de Extractos Acuoso, Etanólico, Etéreo y
Diclorometánico de Rumex palustris (Qentu), Baccharis latifolia (Chillka), Piper asperifolium
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(Matico) y Cestrum parqui (Andres Huaylla), frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis. Estudio con la finalidad de encontrar la actividad
antimicrobiana de extractos acuoso, etanólico, etéreo y diclorometánico de las partes aéreas de Rumex
palustris (Qentu), la Baccharis latifolia (Chillka), la Franseria artemisioides (como altamisa), el Piper
asperifolium (Matico) y Cestrum parqui (Andres Huaylla), frente a Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis; Sus resultados demostraron que
el extracto diclorometánico de Rumex palustris presento
actividad antimicrobiana contra
Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis a concentración mínima inhibitoria de 500 μg/ml y
concentración mínima bactericida de 1000 μg/ml ,siendo inactivos frente a Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa y obtuvieron una concentración mínima inhibitoria de 125 μg/ml y una
concentración mínima bactericida de 250 μg/ml. para Enterococcus faecalis y el extracto etéreo de
Franseria artemisioides presento actividad frente a Staphylococcus aureus a una concentración
mínima inhibitoria de 500μg/ml.
Chávez (2011) Actividad Antimicrobiana In Vitro de seis plantas de uso Medicinal sobre las
principales cepas de Bacterias y Hongos que afectan piel y oído en Perros .Estudio con la finalidad
de generar información científica que respalde la fitoterapia como alternativa terapéutica en la clínica
de especies menores para ello evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de extractos de las plantas
Lippia graveolens, Piper jacquemontianum, Psidium guajava, Acalypha guatemalensis, Smilax
domingensis y Solanum americanum contra las bacterias Staphylococcus intermedius, Streptococcus
sp., Pseudomonas aeruginosa y Proteus mirabilis y los hongos dermatofitos Microsporum canis,
Microsporum gypseum y Tricophyton mentagrophytes aislados a partir de pioderma y otitis externa
canina. Para ello Utilizo el método de dilución de Mitscher et al. (1972) para evaluar la actividad
antibacteriana y
MacRae et al. (1988) para evaluar la actividad antimicótica. Sus resultados
demostraron actividad en todos los extractos, a excepción de Solanum americanum contra bacterias y
de Acalypha guatemalensis y Smilax domingensis contra hongos dermatofitos, donde los valores de
CIM más bajos contra Staphylococcus intermedius fue:CIM 15.6 mg/mL con el extracto
diclorometánico de Piper jacquemontianum contra Streptococcus sp. Y Proteus mirabilis con el
extracto etanólico de Psidium guajava (CIM 125 mg/mL y 250 mg/mL) y contra Pseudomonas
aeruginosa con el extracto metanólico de P. jacquemontianum (CIM 1,000 mg/mL). El extracto
etanólico de Lippia graveolens presentó los valores de CIM más bajos para la actividad antimicótica
(CIM 125 mg/mL).
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Tello (2011). Acción antimicrobiana del Anacardium occidentale sobre Candida albicans y
Staphylococcus aureus. Estudio in vitro. Obtuvo la acción anti fúngica y antibacteriana del aceite de
la cáscara de la nuez (Anacardium occidentale) sobre Candida albicans y Staphylococcus aureus.
Demostrando que el aceite del Anacardium occidentale no tiene actividad anti fúngica, pero sí
demostró tener gran actividad antibacteriana contra S. aureus, mucho mayor que la mostrada por la
clorhexidina.
Becerra (2010). Efecto Antibacteriano In Vitro de los Extractos Acuosos y Etanólico de
Eucallyptus Globulus L (Eucalipto) en diferentes concentraciones sobre Cepa de Lactobacillus sp.
Determino el efecto antimicrobiano del extracto etanólico y extracto acuoso de Eucalyptusglobulus L
(Eucalipto) sobre el Crecimiento de la cepa de Lactobacillus spp. Sus resultados muestran que
mediante la lectura de placas el extracto etanólico al 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25% y 3.13% de
concentración, presentaron inhibición en el crecimiento de Lactobacillus spp, siendo la concentración
mínima inhibitoria (CMI) al 3.13% y la concentración mínima bacteriana (CMB) al 6.25%. Sin
embargo el extracto acuoso no presenta efecto antibacteriano sobre la cepa de Lactobacillus spp.
Rojas et. al,. (2009) Efecto coadyuvante del Extracto Liofilizado de Passiflora
edulis
(maracuyá) en la reducción de la presión arterial en pacientes tratados con Enalapril, para ello se
plantearon el objetivo de Determinar el efecto coadyuvante antihipertensivo y la seguridad del jugo
del fruto de maracuyá en pacientes hipertensos en tratamiento con enalapril .Encontrado resultados de
que los grupos que recibieron enalapril más maracuyá tuvieron una mejor reducción de la presión
sanguínea en comparación con el grupo que recibió enalapril más placebo. El grupo tratado con
enalapril más 4 cápsulas de jugo liofilizado de maracuyá/día produjo al final del experimento una
reducción de la presión sistólica de 6,73 mmHg y de la presión diastólica de 5,33 mmHg (p<0,05), en
comparación con el grupo enalapril más placebo. No se observó efectos adversos por el tratamiento.
Base a sus resultados llegan a la conclusión: El jugo del fruto de P. edulis fue coadyuvante efectivo
del enalapril en la disminución de la presión arterial en pacientes con hipertensión estadio 1, y
demostró ser seguro.
Menéndez (2010) Efectividad del gel de Matico (Piper angustifolium) en la evolución de la
cicatrización de heridas de la mucosa bucal post exodoncia del tercer molar inferior incluido en el
Hospital Nacional Carlos Alberto Seguin Escobedo Arequipa 2010.Donde su objetivo fue determinar
la efectividad del gel de matico en la evolución de la cicatrización de heridas de la mucosa bucal post
exodoncia del tercer molar inferior incluido en el Hospital Nacional Carlos Alberto Seguin Escobedo
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Arequipa 2010.Donde su resultados les demostró la efectividad frente a los indicadores: sangrado,
edema y unión de los bordes de la herida operatoria frente a los grupos de control en los alvéolos de
terceros molares inferiores izquierdos extraídos previamente, en el mismo acto quirúrgico y llegan a la
conclusión de que el gel de matico se constituye en una herramienta útil para conseguir mejores
resultados en el post operatorio de exodoncias de piezas incluidas.
Rojas (2009) Estudio preclínico y clínico de la seguridad y actividad Antihipertensiva de
Passiflora edulis Sims (maracuyá). Para lo cual se plantearon el objetivo de determinar la seguridad y
eficacia antihipertensiva en animales y seres humanos del extracto etanólico de las hojas, jugo del
fruto y fracción metanólica del jugo de Passiflora edulis. Sus resultados indican de que una dosis
letal 50 (DL50) sobre 2000 mg/kg para el extracto de hojas y jugo del fruto de P. edulis por lo que son
sustancias no tóxicas; y en el ensayo de toxicidad a dosis repetidas, el extracto metanólico de las hojas
mostró cambios
ligeramente por encima de los valores permitidos de alanina aminotransferasa,
histológicamente la mayoría de órganos encontraron normales y sólo dos casos mostraron cambios en
hígado y riñón relacionados con proceso inflamatorio y congestión vascular; los productos de la
planta analizados disminuyeron hasta en 17% la presión arterial sistólica en ratas hipertensas, lo que
se explicaría por habersedemostrado efecto diurético (p<0.02), incremento de óxido nítrico (p<0.005)
y capacidad antioxidante (p<0.01); el jugo del fruto de P. edulis disminuyó en 6.73 mmHg y 5.33
mmHg la presión sistólica y la presión diastólica respectivamente en comparación al grupo placebo y
sin efectos adversos. Concluyéndose que en las condiciones experimentales el jugo del fruto de P.
edulisha evidenciado ser seguro y tener efecto antihipertensivo en ratas hipertensas y pacientes con
hipertensión estadio 1.
2.2. BASES TEÓRICAS
2.2.1. Passiflora edulis Sims (maracuyá)
El uso de Passiflora como una medicina natural fue elogiado por primera vez por un
investigador español en el Perú en 1569 debido a que contiene
glucósidos; entre ellos
passiflorina. Glucósidos flavonoides: luteolina-6-C-chinovóside, glucósidos cianogénicos,
alcaloides: harman
triterpenos y saponinas; antocianinas, eugenol, γ lactonas, fenoles,
caroteno, ácido L-ascórbico, ésteres, aceites volátiles, aminoácidos, carbohidratos, tiamina,
riboflavina, ácido nicotínico, calcio, hierro y fósforo (Espinosa, 2010).
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAN
El género Passiflora, comprende cerca de 500 especies, siendo el más grande en la familia
Passifloraceae, las cuales están distribuidas en regiones cálidas y tropicales del Nuevo Mundo; son
mucho más raras en Asia, Australia y África tropical. Varias especies son cultivadas en los trópicos
por sus frutos comestibles, los más ampliamente cultivados son Passiflora edulis Sims (Lozano, 2012)
Passiflora edulis Sims es una planta originaria de la amazonía peruana, conocida con el nombre
común de maracuyá, parchita, calala, maracujá, yellow passion-fruit (Rojas, 2009). La palabra
maracuyá proviene del portugués-brasileño maracuya, de origen indígena que significa “Comida
preparada en Totuma” (Rojas, 2009).
Es una especie cultivada ampliamente en países tropicales y subtropicales y existen dos
variedades: Passiflora edulis Sims var. flavicarpa, cuyos frutos son amarillos, crece desde el nivel del
mar hasta 1000 msnm; y, Passiflora Edulis Sims var. Purpurea, con frutos color púrpura y que se
adapta a zonas altas por encima de 1200 msnm. (Ferreres, Sousa, Valentão, eta al., 2009). Se
caracteriza por ser una planta leñosa perenne de hábito trepador y de rápido desarrollo que puede
alcanzar hasta 10 m de largo; las hojas son simples, alternas, con estipulas y un zarcillo en la axila, con
márgenes aserrados; las flores son solitarias y axilares, fragantes y vistosas; el fruto es una baya
esférica, globosa o elipsoide que mide hasta 10 cm de diámetro y pesa hasta 190 g, de color amarillo o
purpúreo, con una pulpa muy aromática (Seabra, 2009).
Origen y taxonomía de maracuyá
Se considera que el centro de origen es Brasil, específicamente la región del Amazonas. Este país
es considerado el origen de unas 150-200 especies de las 465 existentes de Passiflora. La especie
Passiflora edulis (maracuyá morado), dio origen, a través de una mutación, a Passiflora edulis forma
flavicarpa (maracuyá amarillo).
Clasificación taxonómica
Nombre común: maracuyá amarillo, parchita, calala, maracujá, yellow passion-fruit.
Orden: Passiflorales
Familia: Passifloraceae
Género: Pasiflora
Especie: Passiflora edulis forma flavicarpa
Otras especies de importancia económica son:
Passiflora edulis: maracuyá morado.
P. alata: maracuyá grande, maracuyá dulce.
P. cuadrangulares: granadilla grande
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P. laurifolia: maracuyá naranja
P. caeruleo: ornamental
P. ligularis
P. maliformis (Dhawan, Kumar y Sharma, 2011)
Uso farmacológico de maracuyá
Las investigaciones farmacológicas realizadas con P. edulis han demostrado que posee diversas
propiedades. El extracto del fruto inhibió las enzimas que tienen actividad de endopeptidasas
dependientes de zinc, las metaloproteinasas de matriz extracelular MMP-2 y MMP-9 involucradas en
la invasión tumoral, metástasis y angiogénesis (Dhawan, 2011), así como también inhibió la
transformación neoplásica de células murinas 3T3 BALB/c tratadas con benzopireno (Seabra,2009); el
extracto de las hojas disminuyó la inflamación aguda y aumentó la proliferación fibroblástica, la
colagenización y la neoformación capilar en la cicatrización de la vejiga de ratas (Sharma, 2011);
también mostró una significativa actividad antiinflamatoria sobre pleuresía inducida por carragenina
en ratones (Ferreres F, Sousa C, Valentão P, Andrade P, Seabra R. 2009); además aumentó
significativamente el número de ratones protegidos contra convulsiones inducidas por estricnina, de
manera semejante al clonazepam (Sharma, 2011); y tuvo actividad antiviral contra herpes virus simple
tipo 1, HSV-1 (36). Por otra parte, se ha aislado un péptido antifúngico en las semillas de P. Edulis
(Seabra, 2009).
Respecto a la actividad de los extractos de P. Edulis sobre el SNC existe información
controversial. Algunos estudios demostraron efecto sedante (Barbosa, Valvassori, Bordignon, eta al.,
2008), ansiolítico (Seabra, 2009), tipo ansiolítico sin alterar la actividad motora, tipo ansiolítico sin
alterar el proceso de memoria y calmante tipo tranquilizante mayor (Sharma, 2011); sin embargo,
otros investigadores afirmaron que no posee efecto ansiolítico ni efecto hipnótico-sedante, más bien
mostró efecto depresor no específico del SNC (Barbosa, 2008).
Pizzeti (2008) menciona que La principal actividad en la P. Edulis (maracuyá), de acuerdo a las
dos fracciones que analizaron analizadas, presenta actividad anti- inflamatoria en extracto acuoso,
inhibiendo la migración de la célula, citoquina pro inflamatoria, enzimas y mediadores Por otra parte
Gagliotti, y Santos(2009) examinaron el efecto de tacrolimus administrado por vía oral de P. Edulis
(maracuyá) forma flavicarpa, sobre la inflamación provocada por carragenina; donde sus estudios
confirman
que el tratamiento previo en animales con tacrolimus inhibe la producción de citoquinas
proinflamatorias TNF-α y IL-1β que causan lesiones en las articulaciones, además el efecto depende
de la migración de los leucocitos a esto Sousa( 2008) coboran de que los especies con alto contenido
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de flavonoides demuestran eficacia en el tratamiento de los síntomas de la diarrea, efecto relacionado
con el flavoide quercitina.
Valor nutritivo de maracuyá
El fruto es una baya, de forma globosa u ovoide, con un diámetro de 0.04 0.08 m y de 0.06 0.08
m de largo, la base y el ápice son redondeados, la corteza es de color amarillo, de consistencia dura,
lisa y cerosa, de unos 0.003 m de espesor; el pericarpio es grueso, contiene de 200-300 semillas, cada
una rodeada de un arilo (membrana mucilaginosa) que contiene un jugo aromático en el cual se
encuentran las vitaminas y otros nutrientes mostrados en el siguiente cuadro.( Sharma, 2011)
Tabla Nº1. Valor nutritivo de 0.01 kg de jugo de maracuyá amarillo.
Componente
Valor energético
Humedad
Proteínas
Grasas
Hidratos de carbono
Fibra
Cenizas
Calcio
Hierro
Fósforo
Vitamina A activa
Tiamina
Riboflavina
Niacina
Ácido ascórbico
Cantidad
78 calorías
85%
0.8%
0.6 g
2.4 g
0.2 g
Trazas
5.0 mg
0.3 mg
18.0 mg
684 mg
trazas
0.1 mg
2.24 mg
20 mg
Fuente: Servicio de Información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera SIAP (2012)
Composición fotoquímica de maracuyá
Es rica en glicósidos, flavonósidos, passicapsina y passibiflorina, glucósidos cianogénicos,
vixentina, isovitexina, kampferol, crisina, quercetina, neohisperidina y otros, su concentración en hojas
y flores alcanza entre 1.5-2.1% dependiendo de la época de recolección. También contiene varios
derivados de fenol como 4-hidroxi-β-ionol, vomifoliol y dehidrovomifoliol, linalol y α-terpenol y
otros. Los alcaloides reportados son harmano, harmina, harmalina, y harmalol presentándose la mayor
concentración en las hojas (Sharma, 2011)
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Tabla Nº 02 .composición fotoquímico de maracuyá
METABOLITO SECUNDARIOS
HOJAS
FRUTO
PULPA
Compuestos fenólicos
Cumarinas
++
-
+
-
-
Leucoantocianidinas
-
-
-
Saponinas
-
-
-
++
+
-
+++
++
+
++
++
+
Quinonas
-
-
-
Alcaloides
-
+
-
Compuestos lactónicos
-
-
-
Taninos
Flavonoides
Triterpenos y/o esteroides
Fuente: Carvajal (2012).
Usos etnomédicos
Oralmente se usa en tratamiento de bronquitis, asma. Externamente se aplica en inflamaciones
hemorroidales. La hoja fresca se usa para el ratamiento de la hipertensión anterior o para inducir
diuresis. Las hojas en decocción son útiles como febrífugo. Las hojas se preparan en infusión como
relajante y sedante. (Barbosa et al., 2008)
El extracto acuoso de las partes aéreas se toma para tratamiento de tétanos, epilepsia, en casos de
insomnio, neurosis cardiaca, para regular la presión sanguínea. La planta entera se toma en decocción
para anemia. También es útil como antitusivo, antidiarreico, emético, antipalúdico. El fruto se usa para
problemas estomacales y tumores intestinales por vía oral y en homeopatía como remedio aplicado
sobre el oído. El jugo del fruto se toma como bebida refrescante y el fruto es comestible (Lozano,
2012)
Toxicología
Por lo general la pasiflora es muy bien tolerada, pero a dosis muy altas pueden provocar náuseas
y vómitos (por su sabor amargo), cefaleas, aquicardia, disminución del tiempo de reacción frente a
estímulos externos, pudiendo dar convulsiones y paro respiratorio. No se observa toxicidad guda
después de una administración intraperitoneal en ratones de extractos de pasiflora en dosis mayores de
500mg/Kg. y 900mg/Kg. de peso, temperatura rectal, coordinación motora, comparado con los
patrones. Así también un estudio realizado con ratas blancas a las que se administró un extracto en
dosis equivalentes el consumo diario de un adulto humano durante 15, 30, 90 días mostró ausencia de
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cambios significativos en cuando a peso, peso hepático y cerebral, volumen de líquido corporal y
comida ingerida.(Lozano, 2012)
Actividad antimicrobiana de maracuyá
Aún cuando no se conocían los antibióticos, la maracuyá era considerada como un eficaz
desinfectante, anti inflamatorios de forma empírica. Actualmente, está comprobado que sus
componentes fenólicos, Taninos
Flavonoides y Triterpenos y/o esteroides, tienen actividad antibacteriana frente a gérmenes gran
positivos y gran negativos. Este efecto se debe a su acción sobre la membrana bacteriana (Lozano,
2012).
Los Flavonoides es un producto extraído por la industria farmacéutica y ha sido extensamente
documentado por su acción antibacterial y fungicida sobre diferentes tipos de microorganismos aún
aquellos que ya son resistentes a la medicina tradicional (Lozano, 2012).
Flavonoides, taninos y Triterpenos componentes del aceite esencial presente en el maracuyá, se
emplean en la industria alimenticia como antibacterianos; estos aceites han mostrado un efecto frente a
bacterias Gram negativas y Gram positivas, con resultados similares a los dados por los antibióticos y
al compararlos con el efecto del ácido láctico sobre L. monocytogenes se ha encontrado una inhibición
superior al 50% por parte de ambos aceites (Rojas, 2009).
Dentro de la actividad antimicrobiana, los Flavonoides, taninos y Triterpenos han demostrado
exhibir el mayor espectro terapéutico comparativamente con el resto de los componentes del aceite
esencial. Investigadores de la Universidad de Montpellier (Francia) han identificado entre seis y siete
quimiotipos diferentes en ejemplares de tomillo europeos. En estudios de actividad antibacteriana se
ha visto, por ejemplo, que el quimiotipo 5 es el menos activo en función de la concentración
inhibitoria mínima de las cepas bacterianas, mientras que el quimiotipo 1 presenta la mayor actividad
antifúngica (Rojas, 2009).
Frente a S aureus y Helicobacter pylori resultó activo in vitro el extracto acuoso de las hojas de
maracuyá. Así como la propiedad inhibitoria del aceite esencia pero estos resultados solo fueron
promisorios (Rojas, 2009).
2.2.2. Piper angustifolium (matico)
Características del matico. Es una planta dicotiledónea semiarbustiva arbórea que presenta un
tallo cilíndrico, ramificado leñoso que a su vez presenta nudos prominentes y abultados, también
presenta hojas simples sésiles, estipuladas enteras alternas, penninervias de apariencia muy
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rugosa por el haz y con las nervaduras sobresalientes en forma de malla por el lado del envés.
Presenta inflorescencia en espiga simple densa o compuesta con flores pequeñas hermafroditas
aclamídeas desnudas acompañadas de una bráctea
que va a tener un ovario supero con dos
estambres. Su fruto va a ser una drupa y su semilla va a ser una semilla inseminal .no presenta
cáliz y corola (Matute, 2009).
El Piper angustifolium R & P o Piper aduncum, o Piper elongatum, es una planta conocida
como: matico, cordoncillo, moho-moho, hierba de soldado. Sus hojas y ramas contienen aceites
esenciales, ácido artánico, resinas, sustancias amargas (maticina), taninos, alcaloides, saponinas,
flavonoides triterpenoides. Los taninos contribuyen a su actividad cicatrizante, los flavonoides tienen
propiedades antioxidantes y protectoras de la membrana celular. Los estudios de Orjala y col (2008)
comprobaron la actividad antibacteriana de las dihidrochalconas que se hallan en el Piper aduncum
encontrando resultados muy eficientes como antibacterianas. En Haití las hojas de Piper aduncum, en
forma de cocimiento, son utilizadas para los golpes, así como también para dolores abdominales; en el
Perú es utilizada para infecciones e inflamaciones (Espinosa, 2010).
Habitad. Esta planta va a tener una habitad bastante amplio pero principalmente se les encuentra
en lugares donde el clima es templado tropical pero se ha encontrado ejemplares hasta a 3500
m.s.n.m. Abunda de manera especial en el Perú, Ecuador, Bolivia, Paraguay, Brasil y norte de
Argentina, prefiere los lugares húmedos en las orillas de los riachuelos, en los fangos, etc. Se adapta
fácilmente a cualquier clima (Matute, 2009).
Descripción química. El componente más importante, desde el punto de vista cuantitativo, y al
que se atribuye en parte sus virtudes cicatrizantes, es el tanino. Esta sustancia se encuentra en una
concentración de 5,7%.Otros constituyentes importantes son varios tipos de alcaloides, a los que se les
atribuye un efecto relajador de la musculatura lisa. Por último, se señala la presencia de numerosos
glucósidos, especialmente de tipo flavonoides (Matute, 2009).
En Piper angustiflium el compuesto principal es la Canfora (22,68%), el Canfene (21,18%),
Isoborneol (11,53%). Tan bien presenta alfa pineno, mirceno, limoneno, borneol y terpinol acetato. El
aceite esencial contiene 5-metoxi-6 (2′-propen) benzodioxole, dillapiol, etoxidillapiol, mirisicina y
piperitona. Sin duda, la principal propiedad medicinal de esta planta es la de ayudar en la cicatrización
de todo tipo de heridas, ya sea externas o internas. De aquí deriva su utilidad en el tratamiento de la
úlcera digestiva. Externamente, su efecto benéfico sobre heridas de lenta cicatrización es muy
sorprendente, lo que ha contribuido en mayor medida a su gran reputación. El Padre Zinn (1929) le
reconoce, además, bondades hemostáticas y un efecto benéfico en algunos trastornos de las vías
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urinarias. Sin embargo, la principal
que parece útil mantener en primer lugar es su propiedad
vulneraria, vale decir, cicatrizante de heridas (Matute, 2009)
DIVISIÓN TAXONÓMICA DEL MATICO.
División: Antophyta
Clase: Dicotiledónea
Orden: Piperales
Familia: Piperaceae
Genero: Piper
Especie: Piper angustifolium
N.V.: “matico” ó “mocco mocco”
Especie: Piper elongatum
N.V.: “matico” ó “mocco mocco”
Usos tradicionales de Piper angustifolium
a) Cocimiento.- El cocimiento de las hojas en lavajes es desinfectante y cicatrizante. Como remedio
para la inflamación de matriz y de próstata; así como las almorranas, se toman baños de asiento con el
cocimiento de las hojas de matico, se usa también el cocimiento en lavados para detener las
hemorragias y aceleración de cicatrización de heridas.
b) Infusión.- La infusión de un pedazo de la hoja de matico para un jarro de agua hirviendo, es
remedio probado para las úlceras del estómago, los desarreglos en el flujo menstrual, la hematuria y la
blenorragia o gonorrea, es incomparable contra las infecciones del estómago, riñones y matriz. La
infusión de las hojas mas un pedazo de la raíz de Khari khari es un poderoso remedio contra la
leucorrea o flujos vaginales. Para combatir a los parásitos se toma en ayunas mas tres dientes de ajo.
c) Cataplasma.-El cataplasma de las hojas cocidas y aplicadas a los lugares dañados, son un eficaz
remedio para heridas que no cicatrizan, las hojas molidas se aplican sobre heridas para contener las
hemorragias y acelerar la cicatrización.
Las hojas soasadas se aplican sobre las carachas o sarna. También se espolvorea el polvo que resulta
de moles las hojas secas mezcladas con una cucharilla de azufre y azúcar en polvo en llagas y heridas
que no cicatrizan
Para la hinchazón de los pies o cualquier otra parte del cuerpo se hace fricciones a las partes afectadas
con el alcohol en que se han macerado semillas del matico. (Menéndez, 2010).
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Antecedentes químicos y biológicos de Piper angustifolium
Se realizaron trabajos de investigación que nos muestran una actividad de extractos acuosos del
matico frente a Pseudomonas aeruginosa y de extractos orgánicos frente a Staphylococcus aureus.
(Menéndez, 2010)
Unos de los componente más importante, desde el punto de vista cuantitativo, y al que se
atribuye en parte sus virtudes cicatrizantes, es el tanino. Esta sustancia se encuentra en una
concentración de 5,7%. Otros constituyentes importantes son varios tipos de alcaloides, a los que se
les atribuye un efecto relajador de la musculatura lisa. Por último, se señala la presencia de numerosos
glucósidos, especialmente de tipo flavonoides. Sin duda, la principal propiedad medicinal de esta
planta es la de ayudar en la cicatrización de todo tipo de heridas, ya sea externas o internas. De aquí
deriva su utilidad en el tratamiento de la úlcera digestiva. Externamente, su efecto benéfico sobre
heridas de lenta cicatrización es muy sorprendente, lo que ha contribuido en mayor medida a su gran
reputación (Menéndez, 2010).
Fito constituyentes del matico
Aminas: Presentes en gran cantidad de compuestos orgánicos, muchas veces les confieren su
actividad fisiológica Alcaloides
Medicinal: Por su actividad fisiológica diversa constituyen materias primas para la fabricación de
medicamentos Esteroles y Forman parte de hormonas animales y vitaminas Triterpenos
Medicinal e industrial: Constituyen los llamados aceites esenciales, útiles en perfumería, farmacia y
en la preparación de determinados alimentos Glicósidos cardiotónicos, estimulan la función cardíaca,
son los llamados venenos del corazón Saponinas de igual forma precursores de hormonas esteroidales
y corticosteroides. Por su actividad tensoactiva son útiles como emulgentes y hemolizantes.
Fenoles simples: Poseen actividad antifúngica, desinfectante y aromatizante Flavonoides de igual
forma reducen fragilidad capilar, protegen frente a estados tóxicos, antiinflamatorios y colorantes
Taninos. Presenta propiedades astringentes y antisépticas. Útiles en la fabricación de tintas y otros
colorantes, para curtir pieles.
Cumarinas. Medicinal e industrial: Anticoagulante y aromatizante (Menéndez, 2010)
Acciones farmacológicas de los flavonoides del matico.
En su relación con el hombre, estas sustancias presentan una serie de actividades farmacológicas,
dependiendo de ciertas características de su molécula, entre las que se destaca su actividad sobre el
sistema circulatorio, que conduce a una disminución de la fragilidad capilar y previene la formación de
varicosidades mejorando la circulación periférica, lo cual es la primera manifestación en los procesos
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inflamatorios. La inflamación se conoce que está acompañada por la liberación de prostaglandinas, las
cuales atraen a los leucocitos al punto de invasión por quimiotaxis, provocando dolor local y después
los transporta en la sangre hacia el cerebro, por lo que se eleva la temperatura corporal por
desplazamiento del balance del centro de regulación térmica. La causa del dolor puede ser por
inflamación o por una tensión nerviosa: en el primero de los casos la explicación es la misma que la
anterior y en el último una razón lógica puede ser la relajación por los flavonoides de los músculos
lisos, los cuales han sido encogidos por calambres a través de la acción de las prostaglandinas, que son
compuestos que estimulan la concentración de los músculos de fibra lisa (Matute, 2009).
Existen otras enfermedades relacionadas con los procesos inflamatorios que han sido tratadas
con flavonoides, entre los que se pueden mencionar la parodentosis en la que se produce inflamación y
destrucción del tejido conectivo y las inflamaciones de las articulaciones, que normalmente suelen ser
tratadas con corticoides para disminuir el dolor, pero frecuentemente provocan sangramientos. El
mecanismo de acción de los flavonoides en ambos casos puede ser una combinación de la inhibición
de la síntesis de prostaglandinas y la estimulación de la lisina y la prolina, que son dos sustancias que
intervienen en la síntesis del colágeno, donde se ha comprobado que los flavonoides favorecen su
solubilidad y estabilidad así como la formación de muchos precursores de enlaces entre las fibrillas, lo
que pudiera explicar la fortificación del tejido conectivo. Las flavonas presentan acción
antimicrobiana, aunque a concentraciones muy elevadas en comparación con los antibióticos. No
obstante, se han encontrado que algunas flavanonas de cítricos y de matico presentan actividad frente
al Staphylocus aureus, Escherichia coli y Bacillus typhosus (Matute, 2009).
Mecanismo de acción de matico y maracuyá.
Los mecanismos por los cuales los principios activos de las plantas medicinal de matico y
maracuyá pueden causar la destrucción o inhibición de los microorganismos se han atribuido a los
metabolitos antimicrobianos que actuarían en los siguientes puntos: degradación de la pared celular,
daño a la membrana citoplasmática, daño a las proteínas de membrana, filtración del contenido celular,
coagulación del citoplasma y el agotamiento de la fuerza motriz de protones (Matute, 2009).
Los taninos precipitan las proteínas, fenómeno que, al ocurrir en la membrana citoplasmática
bacteriana, altera la permeabilidad de la misma provocando, el intercambio de sustancias nutritivas y
de desecho llevando finalmente a la muerte celular (Menéndez, 2010). Los compuestos esteroidales
pueden interferir en determinados procesos de síntesis vitales en la célula bacteriana y los triterpenos,
por su parte, pueden actuar siguiendo diversos mecanismos, dependiendo de su naturaleza química, los
de naturaleza hidrocarburica, por ejemplo, tienen generalmente acción depresora sobre la tensión
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superficial lo cual, cuando tiene lugar en el entorno de la célula bacteriana, altera la selectividad de la
membrana citoplasmática para el intercambio de sustancias. Los triterpenos de naturaleza alcohólica
alterarían la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula provocando su muerte (Menéndez, 2010).
La información disponible actualmente respecto al mecanismo de acción de los aceites esenciales
es escasa, sin embargo en lo reportado se coincide que el carácter hidrofóbico de los aceites esenciales
les permite incorporarse en los lípidos de las membranas bacterianas perturbando su estructura y
consecuentemente su permeabilidad, dando lugar a las fugas de iones y otros contenidos celulares
vitales, conduciendo finalmente a la muerte de la célula. Los aceites esenciales también podrían actuar
sobre las proteínas de la membrana citoplasmática alterando la interacción lipido-proteina y afectando
la actividad de enzimas como la ATPasa, disminuyendo la producción de energía requerida para el
funcionamiento celular, otra posible acción seria la interacción directa de los componentes lipofílicos
con las partes hidrofóbicas de la molécula de proteína (Menéndez, 2010). Sin embargo, según Burt
(2009), se requiere de más investigación para elucidar los mecanismos de acción e interacciones que
pueden ocurrir tanto en el microorganismo, como en el alimento que se pretende conservar con
extractos como aceites esenciales individuales o en mezclas, lo que conllevará a establecer su
inocuidad como bioconservadores, su potencial uso y la mejor forma de aplicación.
Efecto sobre bacterias Gram negativas y Gram positivas.
La mayoría de los estudios que investigan la acción de extractos vegetales contra los
microorganismos patógenos causantes de las ETA y del deterioro de productos alimenticios han
concordado, en general, que dichos extractos presentan una mayor actividad antimicrobiana frente a
bacterias Gram positivas que a bacterias Gram negativas (Mayrhofer, Paulsen, Smulders, et al.,
2008). El hecho que los microorganismos Gram negativos sean menos susceptibles a la acción de
antibacterianos, se debe a que estos poseen una membrana externa que rodean la pared celular que
restringe la difusión de compuestos hidrofóbicos a través de los lipopolisacárido que la cubren
(Mayrhofer, 2008). Como se puede observar en la Figura 1 en bacterias Gram positivas de los géneros
Staphylococus, Streptococus, Bacillus y Lactobacillus, la pared se encuentra inmediatamente accesible
y constituye un blanco ideal, sin embargo, en bacterias Gram negativas (Enterobacterias,
Pseudomonas, Salmonella, Serratia etc.), el grosor de la pared es mucho menor y se encuentra entre 2
membranas, lo que dificulta e impide el acceso directo de la sustancia antimicrobiana hacia el interior
de la célula ((Mayrhofer,2008).
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Figura. 2. Pared celular de bacterias Gram negativas y Gram positivas.
Fuente: Sánchez (2010).
2.3.BACTERIOLOGIA EN CAMÉLIDOS SUDAMERICANOS
Lopardo (2008) sostiene que los camélidos sudamericanos especialmente las alpacas y
llamas son animales susceptibles a sufrir enfermedades infecciosas, pudiendo ser de diversa
naturaleza. El riesgo es alto, pero factible de ser prevenida con adecuada tecnología, cualquier
enfermedad, disminuye la producción, y reproducción, afecta la confianza del criador y produce
grandes pérdidas de dinero, la crianza de alpacas se orienta a consolidarse como una producción
en base a aspectos técnicos de manejo, alimentación y mejoramiento genético; por lo tanto urge
la necesidad de poseer un adecuado programa sanitario estricto y riguroso que dé seguridad a las
otras actividades.
2.3.1.LAS ENTERAS BACTERIAS
Características generales de las enterobacterias.- La familia Enterobacteriaceae
(bacterias entéricas), se encuentra dentro de las “Gamma-proteobacterias” (Lopardo et al.,
2008), y pertenece al orden XIII de Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del
Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100
especies (Hernández, 2002) está formada por bacilos gramnegativos de 0.3-3 μm, no
esporulados, anaerobios facultativos y quimiorganotróficos. Todas las especies fermentan
la glucosa, son oxidasa negativa y reducen los nitritos a nitratos.
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Pueden ser móviles por flagelos perítricos o inmóviles como Klebsiella o Shigella. Distribuidos
en todo el mundo, las enterobacterias se encuentran en suelo, agua, frutas, vegetales, granos, plantas
florales y árboles, en gusanos, insectos y humanos y pueden ser patógenos potenciales para humanos,
animales, insectos y plantas. Algunas especies causan enfermedades diarreicas incluyendo fiebre
tifoidea y disenteria bacilar. Muchas especies no asociadas con enfermedades diarreicas son referidas
como patógenos oportunistas (Silvera ,2012).
El 99% de los aislamientos clínicos pertenecen únicamente a 23 especies. De acuerdo a su poder
patógeno se dividen en dos grupos:
Entero bacterias patógenas:
Escherichia coli, productora de diarrea, Salmonella, Shigella, Yersinia
y clostridium son
microorganismos que por lo general no forman parte de la microbiota intestinal, pero que pueden dar
lugar a procesos diversos en hospederos normales, en su mayoría en el tubo digestivo (enteritis).
Entero bacterias Oportunistas:
E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Citrobacter, Edwarsiella, Proteus, Morganella,
Providencia. Son microorganismos que forman parte de la microbiota comensal del tubo digestivo o
que se encuentran como saprofitos en el medio externo que normalmente no se comportan como
patógenos, pero cuando se presentan factores predisponentes, pueden dar lugar a cuadros clínicos
diversos por lo general fuera del aparato digestivo (infecciones urinarias, supuraciones de diversa
localización y sepsis). En su mayoría son cepas resistentes o multirresistentes a los antibióticos, que
generalmente son necesarios para la curación del proceso (Salazar, 2009).
Volqué (2012), manifiesta que el descubrimiento de la transferencia de genes por conjugación y
transducción en el grupo entérico ha permitido estudiar en detalle a alguno de sus integrantes. Se
puede conseguir genóforos híbridos de Y. pseudotuberculosis con especies de salmonella y de shigella,
los cual es indicativo de que estas bacteria comparten un grado notable de homología a nivel genético.
Subdivisión taxonómica del grupo entérico
Prado (2012), indican que la composición de base del DNA, junto con algunos caracteres
bioquímicos y fisiológicos, permiten el reconocimiento de cuatro sub grupos principales:
Grupo I: Escherichia-salmonella-Shigella y los clostridium, los miembros de este grupo son
habitantes del tracto intestinal del hombre y otros vertebrados.
Grupo II: Enterobacter-Serratia-Erwinia, Enterobacter aerogenes, el prototipo de este grupo es común
en suelo y agua, y algunas veces aparece en el tracto intestinal. Bacteria similares, distinguibles de
Ecoli aerogenes por su inmovilidad permanente y la posesión de capsulas aparece en el tracto
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respiratorio. Una propiedad bioquímica que distingue a algunas de las cepas de Entero bacter (aunque
no a todas) de otras bacterias entéricas es la capacidad de fijar nitrógeno. Esta propiedad se manifiesta
en condiciones anaeróbicas de crecimiento, ya que la nitrogenasa de estas bacterias se desnaturalizan
rápidamente por la presencia de oxigeno.
Grupo III: Proteus; los miembros del grupo proteus son probablemente habitantes del suelo, aunque
se les encuentra con particular abundancia en materiales de animales en descomposición, contenido
relativamente bajo en Guanina más cistina de su DNA, diferencia a la mayor parte de sus especies de
los grupos estudiados hasta ahora, al igual que ocurre en las propiedades fisiológicas. Estas incluyen
una intensa una intensa capacidad proteolítica (la gelatina) y de hidrolización de la urea.
Grupo IV: Yersinia, este género incluye dos o tres especies patógenas de roedores. La Yersinia pestis
puede transmitirse por pulgas, a partir de roedores, al hombre; es el agente causal de la peste bubónica,
enfermedad que a aparecido con caracteres epidémicos y mortalidad muy elevada a lo largo de la
historias de la humanidad. El contenido de guanina más cistina de su DNA es significativamente más
bajo que el del grupos Escherichia – Salmonella – Shigella y clostridium. Una característica de su
cultivo que las distingue del resto de las enteras bacterias es su crecimiento relativamente lento en
medios complejos (Volqué et .al. 2012)
2.5. BACTERIAS CAUSALES DE DIARREAS EN ALPACAS
Los agentes causales de diarreas en alpacas son las bacterias de Escherichia
coli,
clostridium y la salmonella que generan la enfermedad infecciosa más importante que afecta a
las alpacas, ya que ocasiona elevadas tasas de mortalidad neonatal, pudiendo llegar hasta el 70%
en algunos centros de crianza alpaquera del Perú (Silvera 2012); provoca, por lo tanto, una
disminución de la población y por consiguiente interfiriere con programas de Mejoramiento
genético, y que se encuentra ampliamente distribuido en el suelo y en la flora intestinal
microbiana de animales y humanos (Perales ,2012). A esto ratifica Volqué (2012) que las
diarreas pueden ser causadas por una diversidad de microorganismos, pero los principales a
mencionar son coccidios (parásitos) y Escherichia coli, Clostridium y Salmonella entre las
bacterias.
2.5.1. Escherichia coli.
E. coli, fue descubierta en 1800 por un hombre llamado Theodor Escherich fue un
científico bacteriólogo alemán que estudió las bacterias y encontró que la bacteria vivía en el
colon humano, y en eventuales ocasiones E. coli podría ser responsable de diarreas causadas por
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la ingesta de alimentos, además de otros trastornos digestivos. Hoy en día E. coli es nombrada
así, en reconocimiento al Dr. Escherich (Palacios, 2010).
Características Generales de E. coli
Del género Escherichia, E. coli es un bacilos Gram-negativo (Bettelheim, 1994), es un
microorganismo anaerobio facultativo predominante en la flora intestinal humana y representa
aproximadamente el 1% de las bacterias intestinales de un individuo sano (Palacios, 2010). Este
microorganismo normalmente coloniza el tracto gastrointestinal de los bebés en las primeras cuatro
horas de vida, obteniendo beneficios tanto el hospedero como el microorganismo; permanece sin
causar daño ya que se encuentra como saprófito en el intestino del humano. Sin embargo, en
hospederos debilitados o inmunosuprimidos o cuando la barrera gastrointestinal se encuentra dañada,
lo cual no es normal, cepas no patógenas pueden causar daño.
E. coli se puede recuperar fácilmente a partir de muestras clínicas en los medios de rutina o
selectivos a 37°C. En medios de agar MacConkey o Agar EMB crecen de forma selectiva los
miembros de la familia Enterobacteriaceae y permiten la diferenciación de microorganismos entéricos
con base en la morfología (Perales, 2010). E. coli se identifica por las características fenotípicas
siguientes: bacilos coliformes móviles, catalasa positivos, oxidasa negativos, fermentan glucosa y
lactosa con producción de gas y ácidos diversos por fermentación mixta, son anaerobios facultativos.
Es un microorganismo inocuo, juega un papel vital en la digestión y ayuda al cuerpo a absorber
importantes vitaminas a partir de los alimentos (Moro, 2010). Generalmente se considera que el
habitat “normal” de Escherichia coli es el colon de organismos de sangre caliente (aves y mamíferos),
y que aunque se pueden localizar estas bacterias en el medio externo, tradicionalmente se consideraba
que su presencia representaba contaminación fecal, ya que se sospechaba que no se podía reproducir
en el medio exterior. Sin embargo, resultados recientes indican que esto es falso (Palacios, 2010).
Existen E. coli que viven en otras partes del tracto digestivo, como las E. coli patógenas que
pueden habitar en la sangre y en el tracto urogenital. Adicionalmente, es posible encontrar poblaciones
de E. coli en vertebrados de sangre fría. Por otro lado, también se han encontrado cepas particulares en
ambientes acuáticos, especialmente los que son ricos en compuestos orgánicos como en el desagüe. La
densidad de E. coli en intestino grueso es de uno a diez millones de células por gramo de colon. Esto
hace de E. coli un componente menor de la flora predominantemente anaerobia de esta parte del
intestino, donde la densidad bacteriana total es de unas 10 11 células por gramo. E. coli es una de las
primeras especies que coloniza al mamífero recién nacido, adquiriendo las primeras cepas del canal de
parto y de las heces de su madre. Las colonizaciones posteriores se deben por lo general a la ingestión
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de alimentos contaminados. Usualmente hay una cepa dominante de E. coli por hospedero, sin
embargo la aparición de nuevos genotipos, ya sea por mutación o por ingestión, hace que esta
dominancia sea sólo temporal y que la dinámica este dictada por procesos tanto aleatorios (deriva
génica) como adaptativos (Palacios, 2010).
Se distinguen varios tipos:
 E. coli enteropatogénica (EPEC)
 E. coli enterotoxigénica (ETEC)
 E. coli enteroinvasora (EIEC)
 E. coli enterohemorrágica (EHEC)
 E. coli enteroagregativa (EAEC)
 E. coli difusamente adherente (DAEC)
Etiología. Especies de importancia: E. coli: Se distinguen varios serotipos en base a la presencia de
antígenos somáticos (0), capsulares (K) y flagelares (F), el Hábitat: Tracto intestinal de animales y
hombre, los factores de virulencia son Síndrome enterotoxigénico y pili o fimbria que produce entero
toxinas: ST, LT. Con respecto a los patógenos, la virulencia de estos es el grado de poder de una cepa
determinada de una especie bacteriana causante de la enfermedad. Esta será más o menos virulenta
dependiendo de dos factores, como la capacidad de generar toxinas, y La capacidad de invasibilidad,
las toxinas bacterianas se dividen en dos:
Exotoxinas: son toxinas excretadas por las bacterias durante el transcurso de su reproducción y
aparecen en el medio circundante, desplazándose a menudo hasta los órganos que afectan como
hígado, riñón, cerebro, etc., situados a menudo a distancia de las bacterias.
Endotoxinas: forman parte de la bacteria y no se liberan hasta destrucción de la célula
Patogénesis-. Dentro de las bacterias causantes de enfermedades gástricas importantes, se encuentra
Escherichia coli, la cual puede ser responsable de diarreas y de enfermedades que llegan a ser muy
graves, como la colitis hemorrágica y síndrome urémico. Sin embargo, existen varias maneras de
interaccionar con el epitelio intestinal y de causar diarrea por E. coli. (Palacios, Perales y López, 2010)
Las cepas enterotoxigénicas (ETEC). Son consideradas el prototipo de la cepa diarréica. El
mecanismo principal de la ECET es la liberación de las enterotoxinas termolábil y termoestable, que
produce una diarrea acuosa Se parece mucho a V. cholerae no hay cambios histológicos en las células
de la mucosa y muy poca inflamación. Estos organismos colonizan la superficie de la mucosa del
intestino delgado por medio de fimbrias. Estas fimbrias tienen una regulación compleja, una vez
adheridas, las cepas ETEC elaboran las toxinas LT y/o ST, las cuales son transportadas al interior de la
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célula del hospedero causando una diarrea osmótica. Es una causa frecuente de diarrea del viajero. Las
cepas de E. coli tipo enteropatogénicas (EPEC) causan un patrón característico de lesión localizada,
donde las bacterias interaccionan con las células epiteliales produciendo una lesión histopatológica
característica conocida como “adherencia / destrucción” o lesión A/E (attaching and effacing). La
adherencia inicial está relacionada a la producción de la fimbria BFP (Bundle Forming Pilus), el cual
se requiere para la producción de diarrea por EPEC. La expresión de la fimbria BFP de Escherichia
coli Enteropatógena (EPEC), responde positiva o negativamente a señales ambientales que pudieran
encontrarse en el hospedero y determinar la adherencia bacteriana a la superficie de las células del
epitelio intestinal. La regulación coordinada de estos genes involucrados en la patogénesis es una
necesidad importante para la adaptación de las bacterias patógenas a los diferentes ambientes
encontrados dentro del hospedero durante la infección (Palacios, Perales y López, 2010).
E.coli enterohemorrágicas (EHEC). Es considerado como una enfermedad emergente, ya que hasta
1993 no se había reconocido como un peligro para la salud pública. En su patogenia intervienen
citotoxinas codificadas por fagos que recibieron inicialmente el nombre de verotoxinas, porque
actuaban a nivel de las células vero; actualmente se denominan toxinas Shiga símil I o II (shiga-like)
porque se parecen a las toxinas de la Shigella. Como estas toxinas están codificadas por fagos, basta
que este fago pueda lisogenizar, es decir, adherirse al cromosoma de algún otro tipo de coli, para
conferirle la capacidad de producir esta toxina, de modo que ella no es exclusiva del O157/H7. La
enfermedad causada por esta cepa es especialmente virulenta, ya que induce una toxemia generalizada
con diarrea hemorrágica y en los casos más graves, la muerte, la cual se debe a un síndrome urémico
hemolítico y el púrpura trombocitopénico trombótico. Las cepas EHEC tienen el mismo mecanismo de
adhesión y la misma "isla de patogenicidad" que las EPEC, sin embargo, debido a la presencia de un
plásmido de 60M daltones, estas cepas producen una toxina hemolítica. Las EHEC son capaces de
invadir la célula eucarionte, entrar en la corriente sanguínea y secretar toxinas similares a las de
Shigella (Prehn, 2007).
Las cepas de E. coli enteroagregativas (EAEC). Causan diarrea persistente en niños. Al igual que
las cepas ETEC, estas células producen toxinas ST y hemolisinas y se adhieren al intestino delgado y
no son invasivas. Sin embargo a diferencia de las ETEC, estas cepas están típicamente cubiertas por
estructuras fibrilares delgadas que se suponen son estructuras adhesivas que les permiten agregarse en
cúmulos. Estos filamentos delgados son muy similares a los observados en Salmonella. Sin embargo,
varios estudios sugieren que las cepas EAEC son genética y fenotípicamente heterogéneas. Los
estudios realizados sobre la capacidad adherente de la E. coli a células heteroaploides (HEp-2)
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muestran que, además de la adherencia localizada, existen otros 2 mecanismos: uno llamado difuso,
que se produce cuando las bacterias se unen al citoplasma celular, y otro agregativo, que se forma
cuando las bacterias se acumulan en forma de empalizada tanto en la superficie celular como en el
vidrio de la preparación (Sáez, 2007)
Estudios recientes han definido algunas características de estas cepas, como es el fenómeno de la
autoagregación, que está determinado por una fimbria de adherencia, un lipopolisacárido uniforme y
una nueva enterotoxina termoestable (TE) denominada toxina enteroagregativa estable (TEAE). Se
han detectado algunas cepas que elaboran una segunda toxina termolábil antigénicamente relacionada
con la hemolisina de E. coli, la cual puede causar necrosis de las microvellosidades, acortamiento de
las vellosidades intestinales e infiltración mononuclear de la submucosa. La capacidad de las cepas de
E. coli enteroagregativa para sobrevivir largo tiempo en el intestino humano y la producción de una o
más de las toxinas descritas, pudiera explicar la persistencia de las diarreas por ellas producidas (Prehn
y Arraigada, 2007).
Las cepas de E. coli patógenas más difíciles de clasificar son las difusamente adherentes
(DAEC). Estas cepas causan estructuras como dedos en las células epiteliales del intestino, las cuales
embeben a la bacteria Estas cepas son causantes de diarrea líquida, principalmente en neonatos (Prehn,
2007).
Las cepas de E. coli enteroinvasivas (EIEC) son muy similares a Shigella Sp. En su bioquímica y
patogénesis, ya que como esta especie son lactosa negativa (todas as otras cepas de E. coli son Lac+),
no son móviles y son negativas en la prueba de lisina decarboxilasa. Libera el calcio en grandes
cantidades impidiendo la solidificación ósea, produciendo artritis y en algunos casos arterioesclerosis.
Las EIEC son capaces de causar diarrea líquida, similar a la causada por ETEC y ocasionalmente (al
igual que Shigella), pueden invadir las células del intestino del hospedero y causar disentería. Las
EIEC causan epidemias relacionadas a la contaminación de agua y alimentos. La versatilidad
bioquímica de E. coli le permite no sólo invadir el tracto digestivo, sino también el sistema urogenital,
causando infecciones. Las cepas uropatogénicas (UTI) son dispersadas en las comunidades. Las
infecciones causadas por estas bacterias causan normalmente cistitis, aunque en ocasiones pueden
llegar a causar pielonefritis al invadir el riñón (Prehn y Arraigada, 2007)
Tratamiento.- No se dispone de terapéutica específica única. Sulfamidas, ampicilinas, cefalosporinas,
fluoroquinolonas y aminoglucósidos muestran efectos antibacterianos notables. Para la prevención de
la diarrea del viajero se ha propuesto la ingestión diaria de suspensión de subsalicilato de bismuto ya
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que este puede inactivar in vitro las enterotoxinas de E. coli. El mecanismo de resistencia esta bajo el
control de plásmidos transmisibles (Prehn y Arraigada, 2007).
Reportes científicos sobre Escherichia Coli
Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) es un agente zoonótico emergente de gran impacto a
nivel mundial Silvera E. (2012) que causa serias enfermedades en el humano como la colitis
hemorrágica (CH) y el síndrome urémico hemolítico (SUH). Dentro de esta especie se encuentra como
serogrupo más importante la E. coli O157 debido a los serotipos O157:H7 y O157: H- (Silvera y
Perales, 2012).
E. coli O157 se transmite por vía fecaloral y tiene una dosis infectiva muy baja (menos de 100
bacterias por gramo) (Ramírez, 2008). Los vehículos más frecuentes para la infección humana son los
alimentos y el agua, pero se ha demostrado la transmisión de persona a persona, la transmisión en el
laboratorio y por contacto directo con animales (Ramírez, 2008).
Según sus estudios Quinn, (2009) menciona que los rumiantes son el reservorio de EHEC O157,
siendo el ganado bovino la principal especie implicada. Este serogrupo también ha sido aislado de
varias especies de mamíferos, aves y animales silvestres. Silvera , Perales (2012) menciona de que en
camélidos sudamericanos solo se ha reportado la presencia de E. coli enterohemorrágica O26:H11 en
un guanaco (Lama guanicoe) de dos meses de edad, que presentaba una severa diarrea acuosa.
2.6. BACTERIAS DEL GÉNERO SALMONELLA
En el Perú la salmonelosis afecta a miles de personas, y aunque puede ser causada por los
casi 2500 serotipos que actualmente existen, los que se aíslan con mayor frecuencia son
Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. (Rivera, y Ramírez, 2007). Desde la década de
los
ochenta,
la
incidencia
de
salmonelosis
de
origen
alimentario
ha
aumentado
considerablemente en el mundo industrializado y ha alcanzado proporciones epidémicas en
varios países (OMS, 2010). Las notificaciones de casos por salmonelosis registraron un
incremento de 100 342 casos en el 1994 a 215 155 en 2010 (tasa de 111,21 y 223,53 por 100 000
habitantes, respectivamente), con una mayor incidencia en los grupos de 14 a 24 años, de 25 a 44
años y de 45 a 64 años, siendo el segundo el grupo más afectado (OMS, 2010).
La falta de higiene, sanidad, o como se le denomina actualmente; bioseguridad, es la causa
que algunas casos clínicos en la salud animal, por lo que la enfermedad se transmite
verticalmente a toda la descendencia, por otro lado la globalización comercial ha diseminado
horizontalmente enfermedades que durante décadas se habían mantenido aisladas.
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La falta de bioseguridad y la sobrepoblación de granjas en una sola región ha provocado que
algunos patógenos muten y o se activen, provocando cepas variantes (Pérez, 2010). Así, la
diseminación de enfermedades contagiosas puede ser por aves de combate, palomas, aves silvestres,
mercados de aves vivas, animales de otras especies, movimientos de personas, traslado de equipo
contaminado, productos y subproductos avícolas, desechos (pollinaza, gallinaza), por el agua, y
alimento contaminado (Pérez, 2010).
Salmonella Sp. El género Salmonella es miembro de la familia Enterobacteriaceae. Es una bacteria
Gram negativa, anaerobia facultativa, no formadora de esporas, que no requiere condiciones estrictas
de crecimiento. Las bacterias de Salmonella Sp. Son móviles (excepto S. Pullorum y S. Gallinarum) y
desarrolla flagelos periferales. Pueden crecer en un rango de temperatura de 5-45ºC con una
temperatura óptima entre 35-37ºC. Pueden crecer a pH bajos y son generalmente sensibles a altas
concentraciones de sal. Son capaces de proliferar y sobrevivir en diversos ecosistemas tal como la
producción de alimentos e instalaciones de procesamiento (Rivera y Ramírez, 2007). Existen más de
2.400 serotipos de la bacteria Salmonella, siendo las más comunes Salmonella entérica sero variedad
Typhimurium y Salmonella entérica serovariedad enteritidis (Pérez, 2010).
Mecanismos de transmisión de las enfermedades
 Transmisión biológica: Es cuando el agente patógeno se multiplica en un huésped, el cual lo
transmite cuando se encuentra en contacto con una parvada susceptible.
 Transmisión mecánica: Es cuando el agente patógeno viaja en una superficie contaminada o
reservorio a una parvada susceptible a través de personal contaminado, equipo, insectos, roedores y
aves de vuelo libre (Pérez, 2010).
Etiología.-
Al igual que la mayoría de los microorganismos patógenos, la Salmonella pierde
rápidamente su patogenicidad cuando es cultivada en medios artificiales, pero es capaz de recuperarla
por medio de pasajes in vivo sucesivos en los animales portadores. La patogenicidad de los cultivos se
conserva exitosamente mediante la congelación, o de preferencia la liofilización (Pérez, 2010).
Epidemiología y Transmisión.-
Los individuos infectados constituyen la forma más común y
significativa de diseminación y perpetuación de la Tifoidea animal, la cual, puede ocurrir por medio de
diferentes mecanismos:
1.- Trasováricamente: Este mecanismo de infección, es considerado la manera más significativa de
propagación, y que se origina por la colonización e infección del estroma ovárico. Este órgano es uno
de los sitios predilectos de implantación de la Salmonella.
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2.- Horizontalmente: De animal a animal, por el estrecho contacto entre los animales infectadas y los
individuos susceptibles. Esto ocurre sobre todo en sitios de producción con edades múltiples.
3.- Fómites: Introducción de material contaminado con Salmonella, a los sitios de producción, lo cual
ocurre fácilmente en granjas con sistemas de bioseguridad deficientes. Hace algunos años, se
empleaban harinas de pescado y harinas de origen animal, preparadas a partir de carne de ave,
vísceras, sangre, pluma, etc., para la formulación del alimento. Dichas harinas fueron un mecanismo
de transmisión de Salmonella y otras salmonellas. Asimismo, las aves de libre vuelo, moscas, y
algunos mamíferos como roedores y perros, pueden diseminar mecánicamente o sistémicamente a
numerosas salmonellas y otros gérmenes principalmente enterobacterias (Rivera y Ramírez ,. 2007)
Patogenia.- El periodo de incubación de la Salmonella varía de 4 a 5 días, aunque en la práctica,
determinar el periodo de incubación resulta difícil de establecer, pues la infección puede iniciar
silenciosamente y provocar sus efectos semanas o meses más tarde. En la forma aguda se produce una
anemia hemolítica severa con pérdida de más del 70% de los hematíes circulantes, debido a que las
endotoxinas de la Salmonella, provocan una modificación de los eritrocitos in vivo y éstos son
destruidos por el sistema reticuloendotelial. A continuación ocurre una supresión de las funciones de
eritrofagocitosis y eliminación de las endotoxinas, con lo que se incrementa la susceptibilidad del
hospedador a ésta, produciéndose rápidamente la muerte del individuo. (Rivera y Ramírez, 2007).
Infecciones causadas por Salmonella.- los principales síndromes originados por Salmonella son:
(Rivera y Ramírez, 2007)
1.- Gastroenteritis: consecuencia de la ingestión de células viables de origen alimentaría. El periodo
de incubación varia desde 5 horas a 5 días; los signos y síntomas empiezan 12-36 horas después de la
ingestión de un alimento contaminado y son: diarrea, nauseas, dolor abdominal, fiebre ligera y
escalofríos. El síndrome solo dura 2-5 días.
2.- Fiebre tifoidea: únicamente afecta a la especie humana. El agente etiológico es casi siempre
Salmonella Typhi, cuando no está producida por la Salmonella Typhi, se habla de fiebre paratifoidea,
provocada por Salmonella Paratyphi. El periodo de incubación varía desde 7-28 días. Los síntomas
son: malestar cefalalgia, fiebre alta persistente, dolor abdominal, dolores en el cuerpo y debilidad,
generalmente acompañados de una diarrea parecida al puré de guisantes o de estreñimiento. A veces,
en el tronco, en el dorso y en el tórax, aparecen manchas de color rosa. Otras veces se observan con
ritmo cardiaco lento, abdomen sensible y dilatado, aumento del tamaño del bazo y en ocasiones
hemorragia intestinal o nasal. La convalecencia es lenta de 1- 8 semanas.
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3.- Bacteriemia con metástasis sépticas o sin ellas: La bacteriemia o septicemia es causada por la
presencia de Salmonellas en la sangre. Esta puede aparecer por metástasis cuando el sitio inicial de la
infección es el tracto intestinal u otros focos. Los síntomas son fiebre alta y persistente, dolor en el
dorso, abdomen y en el tórax, escalofríos, sudoración, malestar, anorexia y perdida de peso. El estado
puede ser pasajero o crónico. Las secuelas identificadas incluyen: apendicitis, artritis, colecistitis,
endocarditis, abscesos locales, meningitis, osteomielitis, osteoartritis, pericarditis, peritonitis, pleuritis,
neumonía e infección de las vías urinarias.
4.- Portador asintomático: Se define con la persistencia de Salmonella spp. En heces, durante mas de
un año. La incidencia de portador fecal después de una enteritis por Salmonella Sp. Es del 0,2-0,6% el
foco crónico de infección suele ser el árbol biliar. La dificultad de erradicarla reside en la presencia de
cálculos biliares. Algunos serotipos se relacionan con mayor frecuencia con un determinado síndrome.
Así, S. Newport y S. Anatum ongman predominantemente gastroenteritis; S. typhi y S. paratyphi A, 8,
C son los responsables de la fiebre tifoidea; S. choleraesuis causa a menudo bacteriemia (Rivera y
Ramírez, 2007).
La vigilancia de Salmonella en todas las etapas de la cadena de procesamiento de los alimentos
constituye un elemento importante en la investigación de la epidemiología de la salmonelosis
transmitida por alimentos y en el desarrollo e implementación de estrategias eficientes de control de la
misma. En programas de monitoreo y control es esencial contar con métodos de laboratorio eficientes
para el aislamiento, identificación y tipificación de Salmonella (Rivera, 2007).
Estudio microbiológicos de las Salmonella.- El método microbiológico utilizado para la detección
de Salmonella en alimentos describe cinco fases principales que son:
1.- Pre-enriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no
selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.
2.- Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.
3.- Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que· restringen el
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias
sospechosas
4.- Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos Salmonella
y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
5.- Serotipificación, que permite la identificación especifica de Salmonella mediante el empleo de
sueros específicos (Ortiz, 2011).
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2.7. CLOSTRIDIUM SP
La enterotoxemia es la enfermedad de mayor impacto sanitario y económico en la
producción alpaquera del Perú (Ramírez, 2010, 1990; Ameghino y DeMartini, 2008). La
enterotoxemia, denominada también diarrea bacilar, es una infección aguda ocasionada por los
diferentes tipos de el Clostridium, afectando principalmente a crías entre la segunda y novena
semana de edad (Ramírez et al., 2012). El cuadro patológico es consecuencia de un cuadro
infeccioso primario a nivel intestinal (yeyuno e íleon), que deriva posteriormente en una toxemia
generalizada producto de las exotoxinas del C. perfringens tipo A o tipo Aβ2 (Pérez, 2008).
Estas toxinas ocasionan daños irreversibles en el endotelio vascular y sistema nervioso que se
traducen en manifestaciones clínicas intestinales finalizan con la muerte súbita del animal (Ortiz
, 2011).
La enfermedad es endémica en el Perú, y con ocurrencia de brotes o epizootias con altas
mortalidades que pueden eliminar hasta el 50% de las crías nacidas en un hato (Ramírez et al.,
2012). La presentación de brotes estacionales o cíclicos, al parecer, es producto de las
interacciones entre la capacidad inmunológica de la cría, dependiente de la presencia de
anticuerpos maternales, y su habilidad de respuesta inmune al agente causal (Ortiz, 2008 y
Ramírez , 2012); así como de las condiciones de manejo, factores climáticos (años lluviosos), y
posibles interacciones patológicas con otros agentes infecciosos con capacidad de exacerbar o a
la aseveración de que la presentación de la enfermedad estaba principalmente asociada a la
producción de una endotoxina (enterotoxina) durante la fase de esporulación del C. perfringens
(Ramírez,2012).
Estudios moleculares recientes indican que la mayoría de C. perfringens aislados de casos
fatales de la enfermedad poseen mayoritariamente genes codificantes de exotoxinas (α, β y β2) y
escasamente el gen de la enterotoxina (Pérez, 2006 y Rosadio et al., (2008) potenciar la infección
clostridial (Rosadio et al., 2010). La prevención de la enterotoxemia en el Perú, se basa en el uso
de adecuadas medidas de higiene y manejo y, sobre todo, en asegurarse que el neonato ingiera el
calostro dentro de las primeras 12 horas de vida (Moro, 2008); sin embargo, estos programas
preventivos raramente involucran el uso de vacunas (Ameghino y DeMartini, 2008). A pesar que
inicialmente se ensayó una vacuna anticlostridial convencional para la prevención de la
enfermedad en alpacas (Moro, 2008), el uso masivo de biológicos en el país fue dejado de lado
debido, entre otras cosas, a la aseveración de que la presentación de la enfermedad estaba
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principalmente asociada a la producción de una endotoxina (enterotoxina) durante la fase de
esporulación del C. perfringens (Ramírez, 2012).
Estudios moleculares recientes indican que la mayoría de C. perfringens aislados de casos fatales
de la enfermedad poseen mayoritariamente genes codificantes de exotoxinas (α, β y β2) y escasamente
el gen de la enterotoxina (Pérez, 2006; Rosadio et al., 2010).
Origen.- C. perfringens fue aislado y descrito adecuadamente, por primera vez, en 1892 por Welch y
Nutball a partir de muestras obtenidas de un cadáver humano en descomposición, siendo llamado
Bacillus aerogenes capsulatus, termino que no fue aceptado por las reglas de nomenclatura y por lo
tanto, invalidado. Luego, en 1898, Veillon y Zuber lo denominan Bacillus perfringens. Pero, en 1900,
Migula se refiere a este organismo
como Bacillus welchii, denominación preferida por los
investigadores americanos (Ramírez, 2008). Sin embargo, la denominación de Moro, (2008) tuvo más
trascendencia, siendo reemplazado,
en 1939, el nombre Clostridium welchii por Clostridium
perfringens en la quinta edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistémica (Rosadio, Londoñe,
Pérez, Castillo, Véliz, Llanco, Yaya y Maturrano, 2010).
Hábitat.- Algunos tipos de C. perfringens (tipo A) se encuentran ampliamente distribuidos como
flora normal del suelo y tracto intestinal de animales de sangre caliente; mientras que otros (tipo
B, C, D y E) son menos comunes en el tracto intestinal y pueden ocasionalmente ser
en
el ambiente,
en
encontrados
áreas donde enfermedades producidas por estos microorganismos son
enzooticas (Gutierrez,2008).
Morfología.- Microscópicamente, C. perfringens se presenta como un bacilo Gram positivo grueso,
recto, solitario o en pares, rara vez en cadena (Lee, Kwon, Kang, 2009). Las dimensiones de este
microorganismo son de 0.8–1.5 µm de ancho por 4–8 µm de largo (Lee, 2009). La longitud varía de
acuerdo al estado de proliferación, así como la composición iónica y nutricional del medio. Así, los
cultivos jóvenes que proliferan con rapidez pueden tener forma casi cocoide o cúbica, mientras en
cultivos viejos se observan células más elongadas (Kang, 2009).
A diferencia de los otros clostridios patógenos, C. perfringens es inmóvil y la presencia de una
cápsula puede ser evidenciada en frotis directo de fluidos corporales y tejidos, pero no siempre
son demostrables en cultivos (Gómez, 2010). El C. perfringens forma esporas, que pueden ser
centrales o subterminales, de forma ovalada, y lo suficientemente pequeñas para no causar
ensanchamiento del bacilo (Rosadio y Véliz, 2012). Además, algunas cepas de C. perfringens
varían
en su habilidad para esporular, necesitando generalmente de medios especiales para
hacerlo (Rosadio,2012).
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Macroscópicamente, C. Perfringens desarrolla colonias de superficie larga, redonda, lisa,
irregular y ligeramente opaca. Otros tipos de colonias observadas, incluyen algunas con centro
opaco, levantado y de borde plano transparente, que es radialmente estriado (Dushesnes, 2013).
Fisiología.- C. perfringens es un microorganismo anaerobio tolerante, y puede sobrevivir e incluso
proliferar con tensiones de oxigeno que son inhibitorios para otros clostridios, que son anaerobios
estrictos (Dushesnes, 2013). Los clostridios no producen catalasa y sólo sintetizan niveles bajos de
superoxido dismutasa. Se cree que una de las causas que sean anaerobios es porque no tienen otra
manera de liberarse de H2O2 y O2•- que son tóxicos para ellos (Rosadio, 2012).
C. perfringens carece del sistema de citocromo y de un mecanismo para la fosforilación por
transporte de electrones (ciclo del ácido tricarboxílico); por tanto, obtienen ATP sólo mediante la
fosforilación a nivel del substrato (constituido básicamente por azúcares) (Rosadio,2012). En las
rutas
de
fermentación, piruvato es
convertido
en acetyl-CoA
por la
piruvato ferredoxin
oxidoreductasa, produciendo CO2 y ferredoxina reducida. Los electrones de la ferredoxina reducida
son transferidos a protones por hidrogenasas, resultando en la formación de moléculas de
hidrogeno que son liberados de la célula junto con CO2. Esta típica producción de gases podría
contribuir a la ventaja en el crecimiento y sobrevivencia en tejidos del hospedador, generando un
ambiente anaeróbico preferido. El piruvato, también,
es convertido a lactato por la lactato
deshidrogenasa, mientras la acetyl CoA es convertida a etanol, acetato, y butirato a través de
varias reacciones enzimáticas (Aguilar, 2013) .
C. perfringens fermenta una variedad de azúcares tales como glucosa, lactosa, maltosa, sucrosa
(Aguilar, 2013), levulosa, galactosa, manosa, xylosa, trehalosa, raffinosa, almidón, glucogeno e
inositol produciendo gas y ácido (principalmente ácido acético y butírico). Algunas cepas también
hidrolizan glicerol e inulina (Aguilar, 2013).
C. perfringens puede proliferar en: un rango de pH de 5.5 a 8.0, una actividad acuosa para crecimiento
mínimo de 0.95, y un espectro de temperatura de 20 a 50ºC, con un óptimo de 45ºC, teniendo un
tiempo de germinación tan corto como ocho minutos (Aguilar, 2013).
Genoma.- Los genomas clostridiales generalmente consisten de un cromosoma circular de doble
hebra, con un tamaño entre 3,5 a 7,0 Mb, y frecuentemente acompañadas de bacteriófagos integrados y
episomales, transposones y plásmidos de tamaños entre 3 a 200 kb (Prehn, 2007).
Ramírez, (2008) secuenciaron y analizaron el ADN del genoma completo de una cepa de C.
perfringens tipo A (cepa 13), el cual poseyó un cromosoma de 3,03 Mbp con un contenido G+C
(28,6%) pronunciadamente bajo y un plásmido (pCP13) de 54.3 kb con un contenido G+C (25,5%)
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ligeramente más bajo al cromosomal. El cromosoma presentó 2660 ORF que representan el 83,1%
de la secuencia cromosomal completa, y el plásmido pCP13 poseyó 63 posibles ORF. El genoma
contuvo secuencias para las enzimas típicas de fermentación anaeróbica y para varias enzimas
sacarolíticas, pero ninguna para el ciclo de ácido tricarboxílico o cadena
respiratoria. Asimismo,
muchos genes codificantes de enzimas para la biosíntesis de aminoácidos estuvieron ausentes.
Sin embargo, fueron detectados
varios genes
codificantes
de proteínas
importadoras
ABC,
potencialmente envueltos en el transporte de aminoácidos, así como nuevos posibles factores de
virulencia para C. perfringens entre ellos: cinco genes que codifican hemolisinas, además de las
toxinas a y 8; cuatro genes cuyos productos son similares a la enterotoxina de Bacillus cereus;
dos genes que codifican posibles proteínas de unión a fibronectina con similitudes a los de Listeria
monocitogenes y Bacillus subtiliis. Además, en el plásmido PCP13 se encontró
el gen
cpb2 (codificante de la toxina þ2) y otro gen (CpCna) asociado a virulencia, cuyo posible producto
mostró similitud a una adhesina de colágeno de Sthaphylococcus aureus. El CpCna podría estar
envuelto en el adosamiento de C. perfringens al colágeno del hospedero y funcionar como un factor de
colonización (Prehn, 2007).
La localización de los genes codificantes de toxinas es muy variable. Los genes cpa (toxina a),
pfoA (toxina 8), colA (toxina n) y nagH (toxina µ) se localizan en regiones variables del cromosoma
cerca al origen de replicación. Sólo los genes nanH (neuraminidasa H) y nanI (neuraminidasa I)
están localizados en regiones conservadas del cromosoma. En contraste, los genes cpb (toxina þ),
cpb2 (toxina þ2), etx (toxina ‹), IAP y IBP (toxina ı), lam (toxina ß) y ureA-C (ureasa) están
localizados en plásmidos de varios tamaños (Palacios ,2010). Por otro lado, el gen cpe puede ser
encontrado o en una región variable del cromosoma o en un plásmido de gran tamaño (Oha,
2012). Así, los cinco tipos de C. perfringens tienen una organización genómica muy similar y la
habilidad para producir diferentes toxinas resulta de la perdida o adquisición de genes de toxinas
específicos (Ortiz , 2011). Interesantemente, estos genes de virulencia no se encuentran agrupados,
ni forman islas de patogenicidad (Oha, 2012).
C. perfringens parece contar con cerca de 10 operones rRNA que contribuyen a su rápido
crecimiento. Un operón rRNA, operón rrnA, es asociado a genes de ADN girasas, gyrA y gyrB, siendo
estos arreglos en B. subtilis y S. aureus asociados con los orígenes cromosomales de replicación,
oriC. Intercalando con los RNA operones están muchos genes tRNA, cuyas familias de genes están
confinadas a un área. Este arreglo compacto es altamente benéfico para una bacteria esporulante,
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asegurando un inmediato suministro de componentes para el aparato transcripcional seguida a la
germinación de la espora (Oha, 2012).
La regulación de síntesis de toxinas extracelulares esta dada básicamente por el sistema de
transducción de señales de dos componentes denominado VirR/VirS, que regula la expresión de los
genes cromosomales codificantes de las toxinas a, 8 y n, y
de los genes extracromosomales
codificantes de la toxina þ2 y la proteína de adhesión a colágeno (Brüggemann, 2005). Por otra parte,
la regulación de la producción de CPE podría ser o dependiente de factores sigma esporulaciónespecifica (Rodríguez, Correa y Suárez, 2011) o por el activador transcripcional CcpA necesario para
la esporulación eficiente (Rodríguez ,2011).
Identificación.- C. perfringens crece bajo condiciones de anaerobiosis, teniendo un óptimo
desarrollo a 45ºC (Hatheway, 1990). La morfología de la bacteria. El crecimiento en caldo carne es
rápido, con producción de ácido y gas, teniendo el cultivo un olor hediondo y mostrando la carne
sin digestión y enrojecida (Rodríguez ,2011). Las colonias de C. perfringens crecidas sobre
medio agar sangre usualmente muestran una característica zona de doble hemólisis alrededor de la
colonia: una zona interna clara (hemólisis completa o tipo þ) debido a la toxina 8; y una zona externa
nublosa (hemólisis incompleta o tipo a) debido a la toxina a. En medio agar yema de huevo, las
colonias son rodeadas por una ancha zona opaca circular, reconocida como la reacción de lecitinasa
(Reacción de Nagler) debido a la toxina a. En los medios enriquecidos con leche, casi todas las
cepas de C. perfringens producen una “Fermentación Tormentosa”, debido a la fermentación de la
lactosa, producción de gas, y coagulación, pero no a la digestión de caseína (Rodríguez ,2011).
Las características bioquímicas complementarias son: motilidad negativa, licuefacción de
gelatina, reducción de nitrato, producción de H2S, reducción de sulfito, indol negativo, lipasa
negativo, ureasa negativo, catalasa y oxidasa negativo, y fermentación de una gran cantidad de
azucares (Palacios, 2010).
Toxinas principales.
Toxina alfa (a).- La toxina a o fosfolipasa C del C. perfringens fue la primera toxina
bacteriana que mostró tener actividad enzimática. El gen codificante de la toxina a (gen cpa) está
presente en todos los tipos (A-E) de C. perfringens, y está situado cromosomalmente cerca al
posible origen de replicación, entre dos operones rRNA (Reyes, 2007).
La toxina a es una zinc-metalofosfolipasa que hidroliza exclusivamente fosfatidilcolina
y
esfingomielina, responsable de su actividad citotóxica, necrótica y hemorrágica (Reyes, 2007).
Posee un peso molecular de 43 kDa y un pH isoeléctrico de 5.4 (Titball et al., 1999), y para su
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actividad requiere la presencia de iones de Zn++ y Ca++ (Lizcano y Vergara, 2008). La toxina a está
conformada por dos dominios: un dominio amino-terminal (dominio N) compuesto de hélices a y otro
dominio carboxi-terminal (dominio C) compuesto de hojas þ-plegadas. Estos dominios están unidos
por una región común flexible (Reyes, 2007). El dominio N contiene el sitio activo de la fosfolipasa C
esencial para todas las actividades; mientras, el dominio C sugiere tener un rol clave en la interacción
con la membrana fosfolipídica (Pérez, 2010).
La capa externa de la membrana celular eucariota es rica en fosfatidilcolina y esfingomielina,
substratos preferidos de la toxina a, que al ser hidrolizadas generan diacylglicerol y ceramide,
respectivamente (Pérez, 2010). El diacylglicerol es un importante segundo mensajero, activando
proteinkinasa C (PKC), el cual activa fosfolipasas eucariotas, especialmente fosfolipasas A2, C y D.
Los productos de fosfolipasa A2 proveen de substrato a la cascada de ácido araquidónico, resultando
en la producción de tromboxanos,
leucotrienos y prostaglandinas. La PKC también estimula la
producción en células endoteliales del factor activador plaquetario (PAF) y prostaciclinas. Todo
esto, resulta en constricción de vasos sanguíneos, incremento de la permeabilidad vascular,
agregación plaquetaria y disfunción miocardial, todos los cuales contribuyen a manifestaciones
locales y sistémicas caracterizadas por un profundo shock y muerte (Pérez, 2010).
Toxina beta (þ).- La toxina þ es una exotoxina, presente en cepas C. perfringens del tipo A y C, que
induce inflamación, necrosis de mucosa intestinal y es letal en ratones (Pérez, 2010). La toxina þ
purificada posee un peso molecular entre 28 y 40 kDa (Palacios,2010) y un pH isoeléctrico de 5.6, el
gen de la toxina þ (gen cpb) se encuentra localizado en un plásmido (Pérez, 2010), el cual revela un
ORF codificante de un polipéptido de 336 aminoácidos que incluye una secuencia señal de 27
aminoácidos que es cortada para producir una toxina activa ,la toxina þ, secretada durante la última
fase de crecimiento logarítmico (Dushesnes, 2013), es termolábil y sensible a proteasas (Mainil,
2013). El mecanismo de acción de la toxina þ es poco conocido. Sin embargo, la toxina þ muestra
una significativa homología, a nivel de aminoácidos, con la toxinas a, toxina y
Staphylococcus aureus,
las
cuales
oligomerizan
eucariotas, sugiriendo que la toxina þ podría
y forman
poros en
leucocidin de
membranas
celulares
tener una actividad similar, resultando en
alteración de la permeabilidad de la membrana, y consecuente muerte celular (Dushesnes, 2013).
Toxina epsilon (c).- La toxina ‹ es una exotoxina producida por cepas de C. perfringens del tipo B y
D, que posee actividad letal, necrotizante y edematizante. El gen de la toxina ‹ (gen etx), encontrado
en un plásmido de gran tamaño, codifica una protoxina relativamente inactiva constituida de 311
aminoácidos y un peso molecular de 35.25 kDa. La protoxina es activada por acción de proteasas
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intestinales, tales como tripsina y quimiotripsina, y así como también, por proteasas propias (toxina ß)
del C. perfringens (Gutiérrez y Acosta, 2008), mediante remoción proteolítica en los residuos 13
aminoterminal y 22 carboxiterminal formando una toxina activa de 283 aminoácidos . La toxina ‹
activada interactúa con receptores apropiados (probablemente proteínas glicosiladas) en la membrana
celular (Dushesnes, 2013). La toxina ‹ no es internalizada; sino se une fuertemente a la membrana
celular, formando un largo complejo (155 kDa) por interacción con una sola clase de proteínas de
membrana. Este largo complejo es un heptámero que actúa como un poro no selectivo, alterando la
permeabilidad de la membrana celular (Dushesnes, 2013).
Toxina iota (ı).- La toxina ı es una exotoxina producida por cepas de C. perfringens del tipo E. Posee
actividad dermonecrótica, causa alteración de la permeabilidad y es letal en ratones (Acosta,
2008). La toxina ı esta
compuesta
por dos componentes
que son
inmunológicamente
y
biológicamente distintos: un componente enzimático (IA) y un componente de unión (IB). La
presencia de ambos es necesaria para la actividad citotóxica (Dushesnes, 2013). La toxina ı es
codificada por dos genes ubicados en un plásmido. El componente IA, codificado por el gen IAP,
con un peso molecular de 47.5 kDa posee actividad ADP-ribosiltransferasa-actina específica. El
componente IB, codificado por el gen IBP (Rood, 1998; Petit et al., 1999), con un peso molecular de
100 kDa (Acosta, 2008) y un pH isoeléctrico de 4.2, reconoce un receptor de superficie celular para
la internalización de ambos componentes por endocitosis mediada por receptor y translocación del
componente IA dentro del citoplasma (Acosta, 2008). Los componente IA y IB (toxina ı) son
sintetizados durante la fase de crecimiento exponencial y secretados como proteínas no activas,
protoxinas
. Ambos componentes son proteolíticamente activados por: remoción de un péptido N-
terminal de 20 kDa en el componente IB (80 kDa) y remoción de 9 a 11 residuos N-terminales en el
componente IA. El componente IA actúa intracelularmente catalizando ADP-ribosa, la cual
unida al sitio de actina previene la nucleación y polimerización de monómeros de actina
ADP- ribosilada. El resultado es la depolimerización de filamentos de actina y acumulación de
actina en forma de polímeros (Dushesnes, 2013).
Enterotoxina del C. perfringens.- La enterotoxina del C. perfringens (C. perfringens enterotoxin;
CPE) es una endotoxina sintetizada sólo durante la fase de esporulación, la cual induce una
significativa secreción de agua e iones en enterocitos, provocando descamación y acortamiento de las
microvellosidades intestinales (Dushesnes, 2013). La CPE no posee actividad necrotizante. La CPE es
producida por menos del 5% de la población de C. perfringens, principalmente por cepas tipo A,
aunque también por cepas tipo C y D y sólo pocas cepas tipo D y E han mostrado producirla
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(Gutiérrez y Acosta, 2008). El gen que codifica la CPE (gen cpe) puede ser encontrado en una región
variable del cromosoma (cepas aisladas de casos de intoxicación de origen alimentario) o en un largo
plásmido (cepas aisladas de casos de gastroenteritis humana no asociadas a intoxicación de origen
alimentario y de casos entéricos en animales) (Dushesnes,
2013). El gen cpe, localizado
cromosomalmente, es un transposon de 6,3 kb que comprende dos copias flanqueantes de secuencias
de inserción IS1470 y una copia de IS1469 ; mientras el gen cpe localizado extracromosomalmente
es encontrado en un gran plásmido de 100 a 120 kb, donde es flanqueado por la secuencia de
inserción IS1469 y, en algunos cepas, por otra secuencia de inserción, IS1151. Además, el gen
cpe plasmídico ha demostrado ser transferido por mecanismos conjugativos (Dushesnes, 2013).
La CPE consiste de un péptido de 309 aminoácidos con un peso molecular de 35 kDa con un
pH isoeléctrico de 4.3 y una solubilidad de 3.44 mg/ml. La CPE consta de un dominio N-terminal
con actividad citotóxica y un dominio C-terminal con actividad de receptor. La tripsina y
quimiotripsina provocan
remoción
proteolítica
de
10-44
aminoácidos
N-terminales,
incrementando, en dos a tres veces, la actividad citotóxica (Dushesnes, 2013).
La biosíntesis de CPE ocurre después de la activación del gen CPE por factores transcripcionales
(SigE y SigK), los cuales también controlan los genes de esporulación, acumulándose la CPE
grandes
cantidades
y
formando
cuerpos de inclusión en
en
el compartimiento de la célula
madre de la espora de C. perfringens, y siendo liberado al lumen intestinal sólo cuando la célula
madre lisa y libera su espora (Ocares, 2012).
La CPE se une a un receptor proteínaceo (posiblemente un claudin-4) presente en la
membrana citoplasmática del borde en ribete del enterocito. Los claudines son una gran familia de
proteínas que juegan importantes roles en estructura y función de “tight junction”. Después de la
unión de la CPE con su receptor forman el “complejo pequeño” de un peso molecular de 90 kDa,
que se inserta en la membrana celular, este complejo per se no es suficiente para inducir citotoxicidad.
Por lo que, inmediatamente el “complejo pequeño” se une a otra proteína de membrana (70 kDa) para
formar el “gran complejo”, complejo hidrofóbico de un peso molecular
de 160 kDa. El “gran
complejo”, aparentemente, tiene propiedades tipo poro, permitiendo el libre pasaje de pequeñas
moléculas a través de la membrana, y conduciendo a la alteración de su permeabilidad. Finalmente,
causa un colapso coloidosmótico y la muerte celular (Ocares, 2012).
Toxina beta dos (þ2).- Una nueva toxina del C. perfringens, la toxina þ2, ha sido descrita (Gibert et
al., 1997) y su gen (gen cpb2) asociado a la presentación de enfermedades entéricas en animales
(Ocares, 2012).
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El gen cpb2 es localizado en un plásmido de 59 a 100 kb y su expresión es positivamente
regulada por el sistema regulatorio transcripcional VirR/VirS , alcanzando su máximo nivel
durante la fase logarítmica tardía . Este gen ha sido encontrado en todos los tipos de C. perfringens,
aunque, su expresión no ha sido demostrada en todas las cepas cpb2 positivas. El gen cpb2
codifica
un péptido de 31 kDa,
el
cual es
procesado transcripcional a una toxina
biológicamente activa, toxina þ2, con un peso molecular de 28 kDa y un pH isoeléctrico de 5.01. La
toxina þ2 es altamente susceptible a acción proteolítica. Así, tratamientos con tripsina escinden a la
toxina þ2 en dos péptidos (13 y 15 kDa), resultando
en una completa perdida de citotóxicidad
(Dushesnes, 2013).
La toxina þ2 no tiene significativa homología con la toxina þ (15% de similitud de aminoácidos)
y sólo existe un bajo nivel de reacción inmunológica cruzada entre estas posee actividad letal para
ratones (dosis de 3 µg) ,la actividad citotóxica para algunas líneas celulares por otra parte también
provoca necrosis hemorrágica en mucosa intestinal en pruebas de intestino ligado (Ocares, 2012).
La actividad específica de la toxina þ2 aún no está totalmente clara, pero posiblemente sea la
formación de un poro u otro mecanismo que conduzca a una disrupción de la membrana celular
(Ocares, 2012).
2.8. RELACIÓN ENTRE EL USO DE ANTIBIÓTICOS EN ANIMALES Y LA APARICIÓN
DE RESISTENCIAS EN HUMANOS
Cuando se usan antibióticos en medicina veterinaria, se puede producir un fenómeno de
selección de cepas resistentes de entre la población intestinal habitual de los animales y también
de entre las bacterias patógenas objeto de dicho tratamiento. Al cesar la presión selectiva ejercida
por el antimicrobiano, estas cepas seleccionadas en el intestino animal, comienzan a ser
reemplazadas por bacterias susceptibles aportadas por el alimento y por el ambiente. Sin
embargo, investigaciones recientes están demostrando que la resistencia adquirida durante el uso
de antibióticos en ocasiones puede persistir más allá del período de supresión de dicho
antibiótico (Cruz, 2009). Por ejemplo, cuando aves que durante su producción han sido tratadas
con antimicrobianos llegan al matadero para su carnización, portan en su piel y plumas una gran
cantidad de bacterias que pueden haber adquirido resistencia a los antimicrobianos que fueron
utilizados durante su producción. Estas bacterias pueden contaminar las superficies de trabajo del
establecimiento en el cual son procesadas y pueden, a partir de las mismas, contaminar por
contacto otras carnes y de este modo, las cepas resistentes presentes en la carne podrían causar
en el hombre la aparición de infecciones o la transferencia de resistencias a la microbiota
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presente en el consumidor, ya sea por reemplazo de su microbiota habitual o mediante la
transferencia de determinantes genéticos portadores de resistencia a antimicrobianos.
Por otra parte Montes (2010), menciona que no es esta la única vía por la cual estas bacterias
pueden llegar a los humanos, dado que también pueden ser transferidas mediante el contacto directo
con los animales, caso típico de granjeros y matarifes, del mismo modo, estas bacterias resistentes
originadas durante los tratamientos antimicrobianos, pueden llegar por medio del estiércol al medio
ambiente y así contaminar otros animales (domésticos y silvestres).
Otra vía de llegada a las personas de bacterias resistentes a los antimicrobianos la constituyen los
vegetales. Éstos pueden ser contaminados por las heces de animales utilizadas como abonos y así
finalmente llegar a transmitir estas bacterias resistentes a los consumidores (Cruz, 2009).
2.8.1. PRINCIPIOS DE ANTIBIOTERAPIA
La primera cuestión que se debe de abordar antes del comienzo de la terapia es si ésta es
realmente necesaria, ya que, por ejemplo, muchas veces el hecho de que haya presencia de
fiebre o leucocitosis puede llevar a pensar en la presencia de una infección bacteriana cuando
en realidad no la hay. Hay que tener en cuenta que la aplicación de una terapia inapropiada por
la administración de fármacos antibióticos innecesarios, provoca gastos económicos
superfluos, y lo que es más peligroso y objeto de este trabajo, puede conducir a la aparición de
resistencias bacterianas y efectos secundarios asociados a la alteración de la flora normal del
huésped.
Así pues, el objetivo fundamental de la terapia es proveer una concentración de fármaco
efectiva, en el sitio de infección, durante un tiempo suficiente para obtener una cura tanto
clínica como bacteriológica, evitando al mismo tiempo, tanto como sea posible, la aparición de
efectos indeseables, tales como:
 La toxicidad del fármaco en el animal huésped.
 El desarrollo de resistencia microbiana al fármaco administrado.
 En animales de consumo humano, la presencia de residuos de estos fármacos en tejidos
comestibles.
 La selección del fármaco más apropiado para el tratamiento depende del microorganismo
causal. El conocimiento de éste puede basarse o derivar de:
 La experiencia histórica o la clínica.
 De exámenes de frotis, mediante morfología de la bacteria, tinciones o diversas
bioquímicas de resultados rápidos.
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 Cultivos del microorganismo.
 Pruebas in vitro de la actividad antimicrobiana.
Por ello, la elección del fármaco y diseño del tratamiento debe depender del conocimiento del
microorganismo causante de la enfermedad, de las acciones del fármaco sobre el microorganismo
(farmacodinámica), de las acciones del fármaco sobre el huésped (toxicidad), y de la absorción, el
destino y la eliminación del fármaco del huésped (farmacocinética), junto con las consideraciones de
resistencia, residuos, bienestar animal y económicas (Cruz, 2009).
2.8.2. METODOS PARA EVALUAR ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Los métodos para evaluar actividad antimicrobiana han sido ampliamente utilizados en
todo el mundo, durante muchos años ya que son técnicas cómodas, fáciles, económicas y
mantiene una fiabilidad alta, la cual les ham, permitido continuar en el mercado (Bauer y col.,
1996). De acuerdo con la farmacopea el método de difusión en agar y el método turbidimétrico
son los dos métodos de referencia utilizados para determinar la potencia del antibiótico
(Lizcano, 2008).
a). Método de difusión en agar
Se basa en la difusión del compuesto desde el punto de aplicación, a través de una
superficie de agar inoculado con el microorganismo de prueba. La difusión origina zonas de
inhibición del microorganismos, cuyo tamaño (diámetro) esta en relación con la concentración
del antibiótico (Vergara, 2008).
Este método fue modificado en 1947 por Bondi y colaboradores incorporando el agente
antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso adelante gigantesco ya que el uso de los
discos de papel permitía preparar un gran número de pruebas idénticas y almacenarlas para uso
futuro. En 1966, después de los estudio realizados por Bauer, Kirby, Sherris y Turk, ensayando
diferentes cepas bacterianas, el empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas de
sensibilidad fue estandarizado y correlacionado definitivamente con las CMI correspondientes
(Lizcano, 2008).
Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente cualitativa, el método de
difusión por disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre todo de su comodidad, economía
y fiabilidad, ha sido, y aún es, uno de los más utilizados en los laboratorios de todo el mundo
Vergara (2008).
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El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se
disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a
35° C y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de
inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas
por el NCCLS. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o
Resistente (S,
1, R) a cada uno de los antibióticos ensayados en las placas (Lizcano y Vergara. 2008)
b).Método turbidimétrico
Este método se efectúa en un medio de cultivo líquido inoculado con el microorganismo de
prueba, al que se le agrega concentraciones crecientes del antibiótico. Después del periodo de
incubación, se determina la turbiedad producida por el crecimiento microbiano, el cual está en función
de la concentración del compuesto (Sulca, 2010).
Método de e-test.- Es una modificación del método de difusión en agár. Se trata de una técnica
cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras
plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada
sobre la propia tira (Vergara, 2008).
Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un método ideal para estudiar
cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o
los que tengan requerimientos especiales para crecer. El microorganismo a investigar se inocula en una
placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación de1624 horas a 35° C, se observan las placas y se valora la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor
de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente
crecimiento (Vergara, 2008)
Métodos automatizados.- La mayoría de estos novedosos métodos utilizan sistemas de micro
dilución en medio líquido sobre micro placas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento
bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un auto analizador (mediciones por turbidez o
fluorescencia) o, en el caso de los sistemas más sencillos, por simple lectura óptica del técnico a través
de un visor invertido de espejo. Su manipulación suele ser fácil y rápida, generalmente automatizada o
semi automatizada, lo que los convierte en métodos ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de
sus grandes limitaciones es que sólo ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento
rápido y que no tengan requerimientos especiales (Lizcano, 2008).
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2.8.3. CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) Y CONCENTRACIÓN MÍNIMA
BACTERICIDA (CMB).
El diseño de regímenes de dosificación óptimos implica la selección de un agente con
actividad inhibitoria en las concentraciones que se obtienen in vitro tras la administración de
dosis terapéuticas. Sin embargo, la potencia de los fármacos antimicrobianos se determina
normalmente por pruebas in vitro (Cosco ,2010).
La potencia puede expresarse a través de una variedad de mediciones de actividad, siendo
las más útiles y comúnmente utilizadas la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Bactericida (CMB). Debe remarcarse que ambas medidas son
marcadores teóricos de la actividad antibacteriana, utilizadas porque es imposible cuantificar la
actividad antibacteriana en sus receptores dentro de la célula bacteriana(Cosco ,2010).
La CMI.- se define como la concentración más baja del fármaco que inhibe el crecimiento
bacteriano (bacteriostasis) cuando un inóculo bacteriano estandarizado se expone al
antimicrobiano durante un período fijo de tiempo. La CMB.- se define como la concentración
del fármaco más bajo que reduce el recuento bacteriano en un 99,9% cuando un inóculo
estandarizado se expone al fármaco durante un período fijo de tiempo. Estos 2 marcadores de
actividad pueden variar dependiendo del tamaño del inóculo, la duración del período de
incubación y la composición del medio de cultivo, razón por la cual es de máxima importancia
la más precisa estandarización de los procedimientos utilizados (Cosco ,2010) .
Asimismo, los antimicrobianos que son ácidos o bases débiles podrán variar su actividad
dependiendo del pH del medio. La mayoría de los fármacos son activos en su forma no
ionizada, siendo la ionización menor en medios alcalinos (para bases débiles) o ácidos (para
ácidos débiles) (Cosco, 2010)
2.8.4. Administración y absorción de los antimicrobianos
Los fármacos antimicrobianos pueden ser administrados de diversas maneras.
a) Administración tópica, por ejemplo, en infecciones dérmicas, oculares u óticas.
b) Localmente en el interior de un compartimiento corporal como en el caso de las mamitis en
rumiantes.
c) Por administración oral con absorción subsiguiente desde el tracto alimentario.
d) Por administración parenteral subcutánea o intramuscular con absorción desde los
diferentes lugares de administración.
e) Por administración directa al torrente circulatorio.
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Los fármacos con suficiente liposolubilidad se absorben bien tras la administración oral, con una
biodisponibilidad cercana al 100%. Por otro lado, las moléculas con una liposolubilidad baja ofrecen
una pobre distribución tras la administración oral, sin embargo, estas moléculas son eficaces tras la
administración oral para el tratamiento de infecciones localizadas en el tracto gastrointestinal, con la
ventaja de reducir los efectos indeseables del fármaco sobre el huésped (Cosco, 2010)
La administración tópica o local de los antimicrobianos tiene el objetivo de provocar
concentraciones importantes del fármaco para el tratamiento de infecciones localizadas en el sitio de
aplicación o la cavidad corporal en la que se inyecta.
Esto es preferible a la exposición de todo el organismo a concentraciones efectivas de los
fármacos, especialmente los poco liposolubles, en el sitio de infección (Cobian, 2007). La
administración intravenosa tiene la ventaja de conseguir concentraciones altas de forma instantánea, lo
que es fundamental en el tratamiento de infecciones que ponen en riesgo la vida del animal. Una
ventaja adicional de esta vía se observa para los antimicrobianos cuya actividad depende de la
concentración, debido a que las altas concentraciones iniciales facilitan la penetración a los tejidos y
sitios de infección (Cobian, 2007).
2.8.5. DISTRIBUCIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
Los antimicrobianos liposolubles tienen generalmente una amplia distribución en el
organismo, alcanzando concentraciones significativas en el interior de las células, al igual que
en el fluido transcelular, en cambio los compuestos de características hidrosolubles, tienen una
distribución restringida especialmente al líquido transcelular ,esta distribución restringida no es
necesariamente una desventaja, ya que la mayoría de las infecciones bacterianas están
confinadas al líquido extracelular (Hofacre, 2008).
La distribución de los fármacos en el organismo también depende de sus características
ácidas o básicas, así los fármacos, ya sean ácidos o bases débiles, poseen dos propiedades
clave. En primer lugar, comúnmente se encuentran parcialmente disociados a pH fisiológico y
en segundo, la fracción no ionizada usualmente lipófila, atraviesa fácilmente las membranas
biológicas. Así por ejemplo, las fluoroquinolonas son altamente liposolubles y se comportan
como bases débiles. Las sulfamidas, en cambio, son ácidos orgánicos débiles y penetran
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pobremente en aquellos fluidos de pH ácido en relación al plasma (líquido intracelular, leche y
líquido prostático).
En contraste, los fármacos que son bases débiles (excepto los aminoglucósidos) penetran
fácilmente en estos fluidos, sufriendo secuestro iónico en medios ácidos (Hofacre, 2008).
Una vez que los antimicrobianos han llegado al lugar de la infección, hay una barrera más que
deben atravesar, la pared bacteriana. Para la mayoría de los antimicrobianos la penetración es más fácil
en bacterias aerobias Gram positivas que en bacterias aerobias Gram negativas, debido a la diferente
conformación de la pared bacteriana.
Los microorganismos anaerobios estrictos poseen mecanismos bioquímicos diferentes de las
bacterias aerobias, por lo cual algunos antimicrobianos muy efectivos frente a bacterias aerobias o
anaerobias facultativas (consideradas difíciles de combatir), como las fluoroquinolonas y los
aminoglucósidos, son totalmente ineficaces frente a este tipo de microorganismos (Hofacre, 2008).
2.8.7. ELIMINACIÓN DE LOS ANTIMICROBIANOS
Los antimicrobianos de características hidrófilas (y usualmente polares) se excretan en
altas concentraciones por la orina. Considerando que alrededor del 99% del agua filtrada en el
glomérulo se reabsorbe durante todo el proceso de formación de orina, la proporción
orina/plasma para fármacos que no experimenten reabsorción a nivel tubular será de 100:1
(Hofacre, 2008).
Clínicamente, la excreción rápida de los antimicrobianos en la orina tiene dos
consecuencias importantes para su selección y dosificación:
a) en infecciones generalizadas implica dosificaciones frecuentes, especialmente si el
antimicrobiano tiene cinética de muerte bacteriana dependiente del tiempo y se administra por
vía endovenosa.
b) y por otra parte, las altas concentraciones en orina son una ventaja para combatir infecciones
en el tracto urinario.
Otra vía importante de excreción para algunos antimicrobianos es la secreción activa en
la bilis. En el caso de los antimicrobianos liposolubles, esta secreción puede estar seguida de
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una reabsorción intestinal, conformando la llamada circulación enterohepática, que disminuye
el aclaramiento de los fármacos (Hofacre, 2008).
Otro de los mecanismos más importantes es la biotransformación. Esta puede tener lugar en las
células de la mucosa del tracto gastrointestinal y en el riñón, aunque las enzimas más versátiles para el
metabolismo de los fármacos se encuentran en los hepatocitos. Los antimicrobianos liposolubles se
metabolizan rápidamente por esta vía dando lugar a compuestos inactivos de excreción rápida. Pero
los compuestos hidrosolubles no pueden penetrar en las células, y por ende, en los sitios de
biotransformación; en consecuencia, son excretados en orina (en algunos casos en la bilis) en altas
concentraciones (Hofacre, 2008).
2.8.8. EFECTOS SECUNDARIOS DE LOS ANTIMICROBIANOS
En la selección del antimicrobiano a utilizar en cada caso debemos tener en cuenta que
éstos también presentan efectos adversos para el huésped, como son (Bager, Emborg y Heder,
2009).
a) Efectos tóxicos dependientes de la dosis sobre las células y los tejidos del huésped.
b) La toxicidad idiosincrásica, que es impredecible.
c) Efectos adversos que surgen en situaciones especiales, como la interacción con otros
fármacos, en animales viejos, hembras gestantes, o enfermedades preexistentes.
d) Posible aparición de fenómenos de tipo alérgico o de hipersensibilidad.
e) Promoción de resistencia a los antimicrobianos.
f) Interferencia en la microbiota normal del huésped.
g) Aparición de residuos en los tejidos comestibles para el ser humano.
2.8.9. RESISTENCIA BACTERIANA
En principio y como norma general, el empleo de los agentes antimicrobianos no sería la
principal causa de la aparición de resistencias, sino que más bien suprime las bacterias
sensibles existentes en el hospedador y respeta las resistentes (Bager, 2009).Hasta el momento,
se conocen varios mecanismos por los que se producirían las bacterias resistentes:
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a) Inactivación de los antibióticos por enzimas.
b) Impermeabilización de las bacterias.
c) Alteración de los receptores de la célula bacteriana a los que se unen los antibióticos.
d) Desarrollo de mecanismos de retroinhibición en las vías metabólicas.
e) Aparición de enzimas con escasa afinidad por los fármacos.
f) Expulsión del antibiótico al exterior de la célula bacteriana.
La posibilidad de que las bacterias intercambien su material genético, unido al hecho de que su
tiempo de generación es corto, son factores que favorecen enormemente la posibilidad de aparición de
esas resistencias. Existe la posibilidad de que las bacterias sean resistentes a los antibióticos porque
carezcan de los mecanismos celulares propios para que estos agentes ejerzan su acción (resistencia
natural). Además, se da el caso de que bacterias que in vitro son sensibles a la vez resultan ser
resistentes in vivo (Bager, Emborg, y Heder, 2009).
La resistencia adquirida, de base genética, puede aparecer como consecuencia de mutaciones
cromosómicas, o lo que es más importante, por la adquisición de material genético transmisible
(Figura 1), existiendo de este modo varios mecanismos mediante los cuales las bacterias pueden
adquirir resistencia (Heder, (2009).
Figura 1. Mecanismos de captación de resistencias adquiridas mediante material genético.
Las mutaciones cromosómicas que originan la resistencia contribuyen a producir cambios en la
pared bacteriana, mientras que la resistencia transmisible contribuye a codificar enzimas que
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metabolizan los antibióticos (Bager, 2009).La resistencia cromosómica suele ser un fenómeno de
aparición gradual, mientras que la resistencia transmisible es con frecuencia un fenómeno de aparición
brusca.
Las mutaciones que originan la resistencia a los antibióticos suelen ser acontecimientos
espontáneos que implican modificaciones de las secuencias denucleótidos de los cromosomas, que
normalmente nada tienen que ver con la presencia de los antibióticos. Suelen además ir acompañadas
de otras modificaciones que aparecen en células bacterianas, de forma que en numerosas ocasiones las
bacterias que presentan resistencia de origen cromosómico a los antibióticos son menos viables que las
células bacterianas de las cuales proceden, pudiendo desaparecer paulatinamente de la población
bacteriana incluso sin que haya ningún antibiótico que las seleccione. No obstante, algunas mutantes
son tan viables como las células bacterianas de las cuales proceden (Avrain, 2010).
Los mecanismos por los cuales las mutaciones cromosómicas originan la resistencia a los
antibióticos incluyen la modificación de los sitios de unión de los antibióticos a las células bacterianas,
por ejemplo la modificación de ribosomas (estreptomicina), la modificación de la permeabilidad
celular (Como en el caso de la penicilina y las tetraciclinas), la mayor producción de enzimas
inactivantes, y la mayor producción de metabolitos competitivos (Figura 2).
Figura 2: Principales mecanismos de resistencia bacteriana
Los antibióticos frente a los cuales aparecen resistencias de este tipo con mucha facilidad, como
la eritromicina o la estreptomicina, se utilizan normalmente asociados con otros antibióticos, ya que la
posibilidad de que en una misma bacteria tengan lugar dos mutaciones al mismo tiempo, es la suma de
las posibilidades de que cada mutación aparezca de forma aislada. Asimismo, las mutantes resistentes
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a antibióticos aparecen con menor frecuencia in vivo que in vitro, debido a que las propias defensas
del hospedador eliminan muchas de ellas (Avrain y Humbert, 2010).
2.8.7.1. Interferencia en la microbiota normal
La microbiota característica de la piel, aparato gastrointestinal, etc., coexiste de forma
armónica y hasta sinérgica, con el hospedador. De todos los antimicrobianos son muy pocos
los que no suprimen en grado alguno esta microbiota. Los efectos supresores pueden variar,
desde efectos secundarios temporales y mínimos, como diarrea leve, hasta la proliferación de
patógenos que ponen en peligro la vida del animal. En general, se ha demostrado que los
fármacos activos contra los microorganismos anaerobios como las penicilinas producen
mayores efectos que por ejemplo las sulfamidas o fluoroquinolonas. También se ha
observado que la aparición de este tipo de fenómenos es más frecuente tras la administración
oral que en las administraciones parenterales (Avrain, 2010).
2.9. RESIDUOS DE LOS ANTIMICROBIANOS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS DE
ORIGEN ANIMAL
El comité para productos médicos y veterinarios, ha determinado un LMR para la mayoría de
los fármacos autorizados en los diferentes tejidos diana. Estos límites han sido establecidos en
función de estudios de toxicidad crónica a partir de los llamados “límite sin efecto observable” y
“límite sin efecto microbiológico”. La determinación del primero, exige mediciones de las más
bajas concentraciones del fármaco que no provocan efecto farmacológico en los animales de
laboratorio y en el segundo caso, consiste en determinar las concentraciones de antimicrobiano
que no provocan ningún efecto sobre las bacterias más sensibles, en particular las del tracto
gastrointestinal. Posteriormente, se determina el “nivel de ingesta diaria admisible”, a través de
la aplicación de factores de seguridad de 100 a 1000 veces en el primer caso y de 10 veces en el
segundo (Terceros, 2008).
El período de supresión o de retirada, es el tiempo que debe transcurrir desde la
administración del fármaco en dosis terapéuticas, hasta el momento en que el alimento puede ser
consumido sin riesgo durante períodos prolongados, es decir, que se cumpla con los valores de
LMR en los diferentes tejidos animales (Quelca, 2008).
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2.10. ANTIMICROBIANOS UTILIZADOS EN LA PRODUCCIÓN ANIMAL
Actualmente, los antimicrobianos más utilizados
la producción animal
son las
tetraciclinas, las fluoroquinolonas y las sulfamidas potenciadas (Terceros,Quelca y Solares,
2008). Las tetraciclinas son en la actualidad los antimicrobianos más utilizados en pollos y
pavos (Quelca, 2008), dadas las propiedades favorables de esta familia de fármacos como son
su amplio espectro, la posibilidad de administración oral, que permite tratar fácilmente grandes
cantidades de animales, la ausencia de efectos adversos importantes, y su bajo precio (Drieux,
Brossier y Sougakoff , 2008), aunque económicamente resulta contraproducente, se destaca la
utilización de fluoroquinolonas, cuando aún no se ha agotado la posibilidad del empleo de
tetraciclinas y sulfamidas potenciadas, pero su uso se ha ido generalizando en medicina animal
desde que la enrofloxacina fue aprobada para su utilización en aves de corral. Actualmente, en
los países europeos en los cuales su uso en animales de producción está permitido es una de las
familias de antimicrobianos con un mayor consumo (Quelca, 2008).
2.10.1. QUINOLONAS
Las Quinolonas son compuestos químicos que constituyen una amplia familia de agentes
antibacterianos. Su desarrollo comenzó en la década de los 60, con la síntesis del ácido
nalidíxico (ácido 1-etil-1,4-dihidro-7-metil-4-oxo-1,8-naftiridina-3- carboxílico) (Chopra y
Roberts, 2011)
Actividad antimicrobiana de las quinolonas.- Su espectro es bastante amplio e incluye a
bacterias Gram negativas y algunos microorganismos Gram positivos, aunque tienen capacidad
limitada frente a Streptococcus y Enterococcus y solo una actividad débil frente a bacterias
anaerobias estrictas. Este grupo tiene en particular una excelente actividad contra bacterias
aerobias Gram negativas y una de sus ventajas es que no destruyen los enterococos intestinales
comensales. Asimismo, tienen una actividad entre moderada y buena frente a Chlamydia,
micobacterias, micoplasmas, ureaplasmas y rickettsias, siendo también activas frente a
microrganismos intracelulares (Chopra y Roberts, 2011).
Su potencia es alta frente a algunos microorganismos sensibles con valores de CMI de 0,01
μg/ml o menores. La actividad frente a bacterias Gram negativas es mayor a pH alcalino,
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mientras que la actividad frente a bacterias Gram positivas no se modifica con cambios en el
pH (Chopra, 2011).
Mecanismos de acción de las quinolonas.- El cromosoma bacteriano comprende una doble cadena de
ADN que es una molécula continua miles de veces más larga que la célula bacteriana. Esta cadena
tiene una disposición de doble hélice (Chopra, 2011).
Las fluoroquinolonas basan su mecanismo de acción en que inhiben la enzima ADN girasa
(topoisomerasa de tipo II). Esta es una enzima compuesta de 4 subunidades cuya función incluye el
desenrollamiento, corte y resellado del ADN. La ADN girasa también interviene en el plegamiento y
enrollamiento del ADN bacteriano alrededor delcentro de ARN, otorgándole la apariencia de bucles o
lazos. Cada lazo se enrolla después negativamente mellando ambas cadenas de ADN, pasando la
cadena rota alrededor de la cadena acompañante y resellando la doble muesca. Estas funciones son
inhibidas por las fluoroquinolonas, que se unen a la subunidad A de la ADN girasa. En los mamíferos,
existe una enzima similar a la ADN girasa que interviene en los cortes dobles del ADN; sin embargo,
ésta no superenrolla el ARN y no se ve afectada por las fluoroquinolonas (Chopra, 2011).
Las fluoroquinolonas son bactericidas y tienen un inicio de acción rápido, lo cual es muy
importante en el tratamiento de animales inmunodeprimidos. Los cationes bivalentes como el calcio y
el magnesio antagonizan la acumulación de fluoroquinolonas en el interior de la bacteria,
probablemente por un efecto quelante (Chopra, 201).
Se ha descrito en algunas bacterias un sistema de transporte de salida paradójicamente, a
concentraciones muy altas (40 x CMI), la acción bactericida de algunas fluoroquinolonas disminuye.
Esto puede resultar de la síntesis de ARN, lo que parece ser necesario para el efecto bactericida y la
resistencia se produce principalmente por la reducción de la penetración a través de la pared de la
célula bacteriana. Sólo raramente aparecen formas mutantes de la ADN girasa, mientras que hasta la
fecha no se han identificado enzimas bacterianas capaces de degradar las fluoroquinolonas (Chopra,
201)
La resistencia mediada por plásmidos es extremadamente rara. La resistencia cruzada entre
fluoroquinolonas es posible, aunque mantienen la actividad frente a bacterias resistentes a otros grupos
de fármacos, como aminoglucósidos, macrólidos y β-lactámicos (Endzt, Ruijs, Van Klingeren y
Jansen, 2007).
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Farmacocinética de las quinolonas.- El grado de ionización de estas moléculas es bajo y todas ellas
se comportan in vivo como moléculas altamente liposolubles. En solución, se comportan como bases
débiles. Su carácter lipófilo determina sus propiedades farmacocinéticas. Se absorben bien
porvariando entre los diferentes compuestos y las características intestinales animales, como por
ejemplo la presencia de iones bivalentes. (Endzt, Ruijs, Van Klingeren y Jansen, 2007).
Las fluoroquinolonas se distribuyen ampliamente por el organismo. Esto indica que se
distribuyen a través del líquido extracelular y pasan fácilmente al líquido transcelular, incluyendo la
leche, el líquido sinovial, el líquido prostático, el semen, fluidos uterinos y el líquido cefalorraquídeo,
alcanzando también altas dosis en el medio intracelular. Las concentraciones tisulares generalmente
igualan o exceden a las concentraciones plasmáticas, y también se han descrito altas concentraciones
en el hueso. La excelente penetración de las fluoroquinolonas al interior de las células y a los tejidos es
consecuencia de su carácter lipófilo, pero también se ve facilitado por el bajo grado de unión a
proteínas plasmáticas (Endzt, 2007).
Las fluoroquinolonas se metabolizan en el hígado, donde el grado de biotransformación depende
del compuesto y de la especie. Generalmente sufren reacciones de hidroxilación y de oxidación, que
las transforma en oxoquinolonas, las cuales se someten posteriormente a reacciones de fase 2,
consistentes en la conjugación con ácido glucurónico. Los glucuronoconjugados sintetizados son
excretados en la orina y la bilis (Ruijs, 2007).
Algunas fluoroquinolonas sufren circulación enterohepática, probablemente tras la conjugación
de betaglucuronidasa sobre los conjugados. Las concentraciones urinarias de las fluoroquinolonas se
mantienen altas durante 24 horas o más. Algunos compuestos son secretados en el túbulo proximal
renal a traves del sistema transportador de ácidos orgánicos. La vida media de estos compuestos está
en el intervalo 2-7 horas, dependiendo del compuesto y la especie. Algunos metabolitos tienen
actividad antimicrobiana, asi, la enrofloxacina se convierte en ciprofloxacina, y ésta ultima se utiliza
en humanos como medicamento madre. La conversion de enrofloxacina en ciprofloxacina es muy
importante en cánidos y muy escasa en équidos, aves y camélidos sudamericanos (Jansen, 2007).
Uso clínico de las quinolonas.- Debido a su alta potencia, amplio espectro, actividad dependiente de
la concentración, óptimas características farmacocinéticas y baja toxicidad, las fluoroquinolonas se
utilizan ampliamente para un numero importante de infecciones, como las neumonías típicas de
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terneros y lechones, infecciones urinarias en animales de compañía, infecciones dérmicas en cánidos y
félidos e infecciones intestinales en porcinos, bovinos y aves (Jansen, 2007).
Entre las indicaciones más comunes se encuentran las salmonelosis agudas en terneros y la
colibacilosis en aves y porcino. También es frecuente su uso para combatir infecciones en lugares de
difícil acceso, como son las osteomielitis y las prostatitis. Dado su mecanismo de actuación, la
dosificación recomendada para su uso clínico debe apuntar a conseguir concentraciones máximas altas
(con respecto a la CMI) en lugar de mantener las concentraciones plasmáticas por encima de la CMI.
Las dosis altas administradas con intervalos prolongados producen mejores resultados que la
administración frecuente de un régimen fraccionado. Para la medicación de aves y peces se
recomienda la administración en intervalos prolongados en el agua o el alimento ((Jansen, 2007).
Desarrollo de resistencias bacterianas a quinolonas.- Se ha detectado un aumento en la tasa de
resistencia bacteriana en personas no expuestas a estos agentes, la cual podría ser causada por su uso
en producción animal. Al mismo tiempo, se ha detectado un incremento en la aparición de cepas
bacterianas con menor susceptibilidad e incluso resistentes en animales destinados al consumo. Se ha
registrado resistencia a la enrofloxacina en Escherichia coli y distintas especies de Campylobacter y
Salmonella (Pitout, Thomson y Ehrhardt ,2008).
Así, los mecanismos de resistencia bacteriana a las quinolonas pueden dividirse en 3 grupos:
1- Resistencias de tipo cromosómico que dan lugar a mutaciones en segmentos definidos de los genes
que codifican la DNA girasa y la Topoisomesara IV.
2- Resistencias por alteraciones en la membrana externa bacteriana que disminuyen la penetración
intracelular del fármaco. Estas modificaciones se originan en alteraciones de los genes que codifican
los canales por los cuales los antimicrobianos penetran normalmente en la célula (porinas), lo que
impide la entrada del quimioterápico en la bacteria.
3- Resistencias basadas en la expulsión del antibacteriano desde el medio intracelular al expulsar por
acción de transportadores endógenos activos. Sin embargo, no se han descrito enzimas bacterianos
capaces de degradar o inactivar a las quinolonas en el medio intracelular (Pitout J., Thomson D.,
Ehrhardt E. (2008).
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2.10.2. TETRACICLINAS
Las primeras tetraciclinas (clortetraciclina y oxitetraciclina) fueron descubiertas a finales
de la década de los 40 a partir de Streptomyces aureofaciens y S. rimosus, respectivamente. Otras
tetraciclinas fueron descubiertas posteriormente, tanto moléculas naturales producidas a partir de
Streptomyces, o productos semisintéticos como los casos de la metaciclina, doxiciclina (6desoxi-5-hidroxi-tetraciclina) y minociclina (Pitout, Thomson y Ehrhardt, 2008).
Todas las tetraciclinas tienen la misma estructura básica, 4 anillos unidos en línea, y a partir
de ellos la unión de diferentes grupos funcionales en distintos carbonos origina los diferentes
compuestos. El más sencillo con actividad antimicrobiana es la 6-desoxi- 6-demetil-tetraciclina
(Ruijs, 2007)
Actividad antimicrobiana de las tetraciclinas.- Las tetraciclinas son antibióticos de amplio
espectro por definición, ya que son efectivas contra bacterias Gram negativas, tanto aerobias
como anaerobias, así como contra Gram positivas, microorganismos atípicos como clamydias,
micoplasmas, ricketsias e incluso contra algunos protozoos. También son usadas en medicina
humana como profiláctico en la prevención de la malaria causada por Plasmodium falciparum
resistente a la mefloquina. Actualmente el aumento en las resistencias aparecido en los últimos
años por la utilización de estos antibióticos como promotores del crecimiento, actividad
prohibida actualmente en la UE pero de uso corriente en paises como USA, ha limitado en cierta
medida su uso terapéutico (Ruijs, 2007).
Su mecanismo de acción es un efecto bacteriostático basado en la inhibición de la síntesis
de proteínas bacterianas. Dicha inhibición la llevan a cabo evitando la asociación entre el
aminoacil-ARNt y el ribosoma, uniéndose las tetraciclinas específicamente a la subunidad 30 S
del ribosoma. El resultado es que se impide la adición de aminoácidos a la cadena peptídica en
formación, lo que impide la enlongación de la cadena. Algunas tetraciclinas inhiben también la
síntesis de proteínas en células eucariotas, lo cual es de utilidad para combatir algunos protozoos.
Se ha sugerido que el mecanismo de actuación en este caso estaría relacionado con la presencia
de ribosomas de tipo bacteriano en las mitocondrias, aunque actualmente no existe una
explicación molecular satisfactoria para este efecto. Además, se ha demostrado que en altas dosis
inhiben de igual forma la síntesis de proteínas de mamíferos (Ruijs, 2007), aunque esto ocurre a
concentraciones mucho más elevadas que las utilizadas como antimicrobianos.
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Farmacocinética de las tetraciclinas.- Las tetraciclinas son normalmente administradas por vía oral,
aunque en algunas está indicada la vía parenteral. La absorción tras la administración oral tiene lugar
en el estómago y la porción proximal del intestino delgado y está muy influenciado por la presencia de
comida, leche o cationes divalentes. En particular, es especialmente importante la presencia de calcio,
el cual inhibe la absorción de las tetraciclinas mediante la formación de quelatos (Huguet, Huapaya y
Salazar, 2012).
Los niveles alcanzados en suero sanguíneo después de una dosificación oral normal se
encuentran normalmente en el rango 2-5 μg/ ml, y en la mayor parte de las tetraciclinas son necesarias
4 tomas diarias para poder mantener estos niveles de concentración en suero. No obstante, la larga
vida media de la doxiciclina y la minociclina permite alcanzar estos niveles con una o dos dosis
diarias, lo cual es de una gran aplicación especialmente en la clínica veterinaria de aves de corral, en
donde el gran número de animales a tratar hace que la administración sea dificultosa (Salazar ,2012).
Toxicidad y efectos secundarios de las tetraciclinas.- Aunque las tetraciclinas son fármacos
relativamente seguros, no están exentos de efectos adversos, estando en general relacionados con:
1. Efectos irritantes (vómitos después de su administración o daños tisulares en el punto de inyección).
2. Capacidad de alteración de la flora intestinal, con su capacidad para fijar el calcio (efectos
cardiovasculares y depósito en el tejido óseo).
3. Nefro y hepatotoxicidad, siendo el efecto nefrotóxico especialmente peligroso cuando se
administran productos caducados o inadecuadamente conservados (Salazar, 2012).
Además de lo mencionado, en el caso de las tetraciclinas más lipófilas, como la doxiciclina, es
posible la aparición de alteraciones digestivas, y están contraindicadas en hembras gestantes y durante
el período reproductor de los animales (Salazar, 2012). Debido a su amplio espectro de acción, las
tetraciclinas provocan inevitablemente una alteración importante de la microbiota intestinal, siendo
frecuente la aparición de diarreas durante el tratamiento. Tampoco son infrecuentes las
sobreinfecciones por levaduras, hongos, o bacterias resistentes (Salazar, 2012).
Uso clínico de las tetraciclinas.- En los últimos años, el uso de las tetraciclinas ha descendido en
muchos países en clínica humana debido al desarrollo de nuevos fármacos con mayor vida media, más
activos y con mejor tolerancia (Salazar, 2012). No obstante, las tetraciclinas siguen siendo utilizadas
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para combatir infecciones como las causadas por Brucella o las infecciones gastrointestinales causadas
por Helicobacter pylori, además de ser utilizada como profiláctico contra la malaria gracias a su acción
contra Plasmodium falciparum (Huguet ,2012).
En el caso de la medicina veterinaria son especialmente utilizadas para el tratamiento de diversas
infecciones en aves de corral, rumiantes, suidos y animales de compañía (Huapaya et al., 2010). Las
tetraciclinas son una de las familias de antibióticos más baratas, y su coste de producción ha
descendido enormemente debido a las mejoras en la tecnología de fabricación (Huapaya et al., 2010).
Estas características las hacen especialmente atractivas para su uso en naciones en vías de desarrollo
(Huapaya, 2010).
Desarrollo de resistencias.- Hoy en día es frecuente encontrar resistencias en bacterias causantes de
zoonosis aisladas de animales como Salmonella, Campylobacter spp. Yersinia spp. y en bacterias
comensales como Escherichia coli o Enterococccus spp., las cuales tienen una gran importancia ya que
además de poder provocar infecciones clínicas en los animales, pueden ocasionar también infecciones
en el hombre ya sea por contacto directo con los animales vivos o por ingestión de los productos
animales obtenidos a partir de los mismos (Silvera y Perales, 2012)
La resistencia a las tetraciclinas es un ejemplo de resistencia transmitida por plásmidos
portadores de genes capaces de transferir resistencia (llamados tet genes). En la actualidad se conocen
más de 20 tet genes diferentes capaces de transferir resistenciaa tetraciclina u oxitetraciclina (Silvera,
2012). Estos tet genes aportan a las bacterias receptoras capacidad de resistencia mediante diferentes
mecanismos:
1- Resistencia por alteraciones en la membrana externa bacteriana que disminuyen la penetración
intracelular del fármaco. Esta resistencia se basa en la producción por parte de la bacteria de proteínas
capaces de asociarse a la membrana que participan en la expulsión de tetraciclinas de la bacteria, lo
cual reduce la concentración intracelular de tetraciclinas y protege por tanto a los ribosomas de su
acción.
2- Resistencia por protección de los ribosomas. Esta resistencia se basa en la producción por parte de
las bacterias de proteínas citoplásmicas que protegen a los ribosomas de la acción de las tetraciclinas.
3- Resistencia por inactivación enzimática. Esta resistencia se basa en la producción por parte de las
bacterias de enzimas capaces de inactivas las tetraciclinas dentro del citoplasma.
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2.10.3. SULFAMIDAS
Las sulfamidas o sulfonamidas son fármacos antimicrobianos de amplio espectro, que
se utilizan solos o en combinación con otros fármacos en el tratamiento de infecciones por
organismos aerobios Gram positivos y Gram negativos en casi todas las especies domésticas.
Son el primer ejemplo de sustancia química con acción bactericida sintetizada por el hombre
(Silvera, 2012).
Actividad antimicrobiana de las sulfamidas.- Tienen un amplio espectro que inhiben el
crecimiento de bacterias Gram positivas, Gram negativas y ciertos protozoos, como los
coccidos. Se consideran ineficaces frente a la mayoría de anaerobios obligados, por lo que no
se recomienda su uso para este tipo de infecciones. Entre los microorganismos habitualmente
susceptibles se incluye algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae, así como otros
agentes como Streptococcus, Bacillus, Brucella, Cryptosporidium, Listeria, Erysipelothrix,
Chlamydia, Toxoplasma, coccidios y Pneumocystis carinii. Otros microorganismos como
Pseudomonas, Enterococcus, Mycoplasma, Mycobacterium y Bacteroides, son habitualmente
resistentes tanto a la acción de las sulfamidas solas como a la combinación de sulfamidas
con diaminopirimidinas (Silvera y Perales, 2012).
Todas las sulfamidas comparten en su estructura el grupo p-aminobenceno
sulfonamida. Este grupo es esencial en la acción antimicrobiana de las mismas, ya que tiene
enormes similitudes con el acido p-aminobenzoico, precursor del ácido fólico y de los ácidos
nucleicos en las bacterias. Las modificaciones de este grupo fueron encaminadas a reducir su
toxicidad y mejorar su farmacocinética. La actividad antibacteriana de las sulfamidas es
similar, por lo que el resultado de un análisis de susceptibilidad en un miembro de este grupo
suele ser válido para todas las sulfamidas (Silvera y Perales, 2012).
Mecanismo de acción de las sulfamidas.- El mecanismo de acción de las sulfamidas se basa
en la inhibición de la enzima dihydropterato sintetasa (DHPS), la cual cataliza la formación
de dihidrofolato a partir del ácido p-aminobenzoico (PABA) y del dihidro-6hidroximetilpterin-pirofosfato (DHPPP) (Silvera, 2012), los cuales son utilizados por las
bacterias para la síntesis del ácido fólico. A través de una serie de reacciones, el PABA se
convierte en ácido dihidrofólico (ácido fólico) con la participación secuencial de las enzimas
DHPS y dihidrofolato reductasa (DHFR). Es en este nivel donde actúan las sulfamidas, ya
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60
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que debido a su gran similitud engañan literalmente a la enzima DHPS, que incorpora la
sulfamida en lugar del PABA (Luzzaro, 2008). Esta acción de bloqueo del ácido fólico es
competitiva, por lo que se puede invertir aumentando la concentración del PABA en el medio
interno bacteriano (Silvera, 2012).
La biodisponibilidad de las sulfamidas es generalmente alta. Su eliminación es una combinación
de excreción renal y biotransformación hepática aunque también pueden ser metabolizadas en otros
tejidos, por lo que las diferencias entre especies son muy amplias. Su biotransformación es saturable y
tiene lugar por acetilación, glucuronización e hidroxilación aromáticas (Luzzaro, 2008).
Toxicidad y efectos secundarios de las sulfamidas.- Las sulfamidas pueden producir una serie de
efectos secundarios típicamente reversibles, algunos de los cuales son de naturaleza tóxica, y otros, de
carácter alérgico. Con la posología habitual la toxicidad es mínima para los animales domésticos con
todas las sulfamidas excepto la sulfaquinoxalina. Cuando existe toxicidad, ésta consiste habitualmente
en alteraciones del tracto urinario, de la hematopoyesis o reacciones de hipersensibilidad, aunque de
forma mucho más casual se han observado otras alteraciones como hepatitis, alteraciones tiroideas,
alteraciones causadas por su antagonismo con el ácido fólico (muy raro a las dosis habituales) o
queratoconjuntivitis seca (Luzzaro, 2008).
Uso clínico de las sulfamidas.- La aparición de resistencias después de tantos años de utilización ha
llevado a un progresivo abandono de su uso que actualmente es prácticamente total en medicina
humana y muy acusado en medicina veterinaria, aunque dentro de ésta última sigue utilizándose sobre
todo en forma de sulfamidas potenciadas. De forma general se utilizan para combatir infecciones en el
sistema genitourinario y en menor medida en infecciones del aparato digestivo (Luzzaro, 2008).
En los animales se utilizan diversas combinaciones de sulfamidas y diaminopirimidinas y en
menor medida sulfamidas solas en el tratamiento y profilaxis de coccidiosis, pasteurelosis y
colibacilosis en gallináceas. Las combinaciones de pirimetamina y sulfaquinoxalina se utilizan
también en el tratamiento de la coccidiosis tanto en pollos y en otros animales domésticos (Luzzaro,
2008).
Desarrollo de resistencias.- La resistencia a las sulfamidas es bastante frecuente, y debido a la
similitud de acción entre los diversos miembros de este grupo, esta resistencia suele ser cruzada, por lo
que no es recomendable cambiar de una sulfamida a otra para evitar la aparición de resistencias, sino
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para mejorar la toxicidad y la farmacocinética. La resistencia puede ser cromosómica o transmitida por
plásmidos o transposones, siendo esta última la más frecuente e importante desde el punto de vista
clínico. Los mecanismos por los cuales puede estar causada esta resistencia son:
1. Alteraciones en la permeabilidad de la pared celular que impide la entrada de las sulfamidas al
interior de la célula.
2. Expulsión del antibacteriano desde el medio intracelular al expulsar por acción de transportadores
endógenos activos.
3. Cambios en el grupo p-aminobenceno sulfonamida por la enzima sobre la que actúa como falso
sustrato, la dihidropteroato sintetasa (Nys, Okeke y Kariuki, 2007).
2.3. HIPÓTESIS
Ho. El extractos etanólico de Passiflora edulis y Piper angustifolium no son bactericida eficas
in vitro sobre bacterias causales de diarreas en neonatos de alpacas.
Ha. El extractos etanólico de Passiflora Edulis y Piper angustifolium son bactericida eficas in
vitro sobre bacterias causales de diarreas en neonatos de alpacas.
2.4. DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
Antibacteriano: Relativo a una sustancia que destruye las bacterias o inhibe su crecimiento y
reproducción.
Aeróbio: Microorganismo que vive y crece en presencia de oxigeno libre. Los aerobios se
dividen en aerobios facultativos y aerobios obligados.
Bactericida: Que mata las bacterias./ Poder bactericida: La más débil concentración de una
sustancia capaz de provocar la destrucción definitiva de la vitalidad de un microbio.
Bacteriostático: Concentración mínima de una sustancia capaz de impedir el desarrollo de una
bacteria sin llegar a destruirla.
Carbohidrato: Grupo de compuestos orgánicos entre los que se hallan la glucosa, la fructuosa,
el almidón, la celulosa y la goma.
Coagulasa: Enzima producida por bacterias en especial Escherichia coli y clostridium, que
desencadena la coagulación.
Enzimas: Proteína producida por las células vivas que cataliza las reacciones químicas en la
materia orgánica.
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Eficacia: Es la capacidad de lograr un efecto deseado o esperado.
Fagocitosis: Proceso por el cual determinadas células engullen y desechan microorganismos y detritus
celulares.
Protrombina: Proteína plasmática precursora de la trombina. La transformación de protrombina en
trombina para la formación de coagulo.
Fibrina: Proteína filamentosa insoluble que proporciona su carácter semisólido al coagulo sanguíneo
y esta producida por la acción de la trombina sobre el fibrinógeno en el proceso de la coagulación.
Gram positivo: Que conservan el color violeta de la tinción que se utiliza en el método de Gram. Para
teñir microorganismos.
Gramnegativo: que posee la coloración rosada de la contra tinción que se utiliza en el método de
Gram. Para teñir microorganismos.
Hialuronidasa: Enzima que hidroliza el acido hialuronico.
IgG.: Uno de los 5 tipos de anticuerpos hormonales producido por el organismo. Es una proteína
especializada que se sintetiza como respuesta a la invasión de bacterias, hongos y virus.
Interacción: Modificación del efecto de un fármaco que se produce cuando este se administra con
otro. El efecto puede consistir en el aumento o disminución de la acción.
Lisis: Sufijo que significa degradación o destrucción.
Microorganismos: También llamado microbio, es un ser vivo que sólo puede visualizarse con el
microscopio.
Necrotizante: Muerte de una porción de tejido consecutiva a enfermedad o lesión.
Pigmentos: Cualquier material colorante orgánico producido en el organismo, como la melanina.
Proteína: Compuesto nitrogenado natural de carácter orgánico complejo, constituido por muchos
aminoácidos
Patógeno: Cualquier microorganismo capaz de producir una enfermedad.
Toxinas: Veneno o toxico, generalmente producido por una planta o microorganismo.
Quimiotaxis: respuesta que supone un movimiento positivo, hacia un estimulo químico, o negativo
alejándose del mismo.
Virulencia: capacidad de un microorganismo para producir una enfermedad.
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2.5. IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
2.5.1. Variables independientes
Bactericida de Extracto etanólico de Passiflora Edulis y Piper Angustifolium
2.5.2. Variables dependientes
Bacterias causales de diarrea en alpacas (Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia
coli)
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2.6. DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES E INDICADORES
VARIABLES
DIMENSIONES
INDICADORES
INSTRUMENTOS
DE MEDICION
Dependiente
HALOS DE INHIBICION
Bacterias
diarrea
causales
en
de
alpacas
(
Clostridium sp, Salmonella
sp y Escherichia Coli )
CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (
Clostridium Sp
CMI)
Salmonella Sp
Clostridium sp,
Cámara de cuenta
R ≤ 14,I 15 ≥ 18,S ≥ 19
Escherichia Coli
colonias
Espectrofotometría
Salmonella sp,
Escherichia coli
CARGA MICROBIANA
Clostridium Sp
CONCENTRACION
MINIMA
BACTERIANA
(CMB)
Clostridium Sp,
Salmonella Sp
S ≤ 250 μg /ml
Escherichia Coli
Salmonella Sp,
Escherichia Coli
Independiente
Bactericida de extractos
etanólico
Edulis
de
Passiflora
y
Piper
Angustifolium
Bactericida extractos etanólico:
Passiflora Edulis
Piper Angustifolium
Concentraciones
Equipo
extractor
0%, 15%, 25%, 50%
solventes etanolicos
de
Dosis
15, 25 y 50μL
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CAPÍTULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
El proyecto de investigaciones esta orientado al tipo de investigación aplicado debido a que
tiene propósitos prácticos inmediatos bien definidos como menciona carrasco (2006) por
ello los resultados que se obtendrán al concluir esta investigación servirán para ponerlos en
práctica y de esta manera solucionar el problema de diarreas neonatales en alpacas.
3.2. NIVEL DE INVESTIGACIÓN
La Investigación esta orientado al nivel de investigación experimental porque se conocerá las
características del fenómeno o hecho que se investiga en la variable de estudio y las causas
que han determinado la variable en estudio (carasco,2006) por ello se realizarán ensayos
sobre la Capacidad inhibitoria antimicrobiana de la bactericida de extracto etanólico
de
Passiflora edulis y Piper angustifolium sobre Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia
coli ,en muestras de heces provenientes de neonatos de alpacas con casos clínicos de diarreas.
3.3. MÉTODO DE INVESTIGACIÓN
Método Científico.
Se aplicará el método científico debido que es el camino planeado o la estrategia que se
tendrá en cuenta para descubrir o determinar las propiedades del objeto de estudio (Mejía,
2008), lo cual nos permitirá para la adquisición y elaboración de nuevos conocimientos que
pretendemos en nuestro trabajo, bajo este contexto está orientado nuestro trabajo de
investigación con la finalidad de lograr nuestros objetivos planteados.
Inductivo deductivo. El uso de este método nos permitirá deducir sobre los hechos
ocurridos sobre la capacidad inhibitoria antimicrobiana del bactericida de extractos etanólico
de Passiflora edulis y Piper angustifolium sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y
Escherichia Coli.
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Método descriptivo y analítico. Se describirá, analizará e interpretará los resultados obtenidos según
la variable en estudio del presente trabajo.
Método estadístico. Los datos obtenidos se ingresaran a un sistema estadístico y los resultados
obtenidos se analizaran través del ANVA y la contrastación de hipótesis.
3.4. DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
Utilizaremos el diseño factorial de 2x3 con 6 repeticiones por tratamiento y la prueba de Tukey
para las comparaciones de medias.
El método del diseño es como se muestra de la siguiente manera
Yijk= μ + F1i + F2j + F1ixF2j + Єijk
Donde:
Yijk: Valor estimado o respuesta de la variable en estudio
μ: Media general
F1i: Efecto de los niveles de extracto de Matico frente bacterias a las de Clostridium sp,
Salmonella sp y Escherichia coli (15, 25 y 50µL)
F2j: Efecto de los niveles de extracto de Maracuyá frente a las bacterias de Clostridium sp,
Salmonella sp y Escherichia coli (15,25 y 50%)
F1ixF2j: Efecto de la interacción de los niveles de extracto de maracuyá y matico frente a las
bacterias de Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli.
Eijk: Error experimental
3.5. POBLACIÓN, MUESTRA Y MUESTREO
Población: Se tomará como una población referencial de 120 neonatos de alpacas de ambos sexos
(60 machos y 60 hembras) nacidos durante el año 2015.
Muestra: como tamaño de muestra se tomarán como mínimo 60 casos clínicos de neonatos de
alpacas con presencia de diarreas por ser muestra no probalistica y se tomarán muestras de heces
con 10 repeticiones por caso clínico que hacen un total de 600 muestras de heces.
Muestreo:
Se realizará un muestreo no probabilístico debido a que los casos clínicos en los neonatos de
alpacas se presentan progresivamente.
3.5.1. Criterios de inclusión
 Se incluirá en el trabajo neonatos con presencia de casos de diarreas
 Serán consideras en el proyecto neonatos nacidos en el año 2015
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3.5.2. Criterios de exclusión.
 Neonatos que no presenten casos clínicos de diarreas
3.6. TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS
Técnicas:
La técnica de observación.- Es una técnica que nos permitirá
a identificar las diferentes
características de hecho o fenómeno que ocurrirán en el proceso de la experimentación y para la
recopilación de información (Mejía, 2008), por ello utilizaremos esta técnica por que
nos
permitirá a identificar y observar los diferentes fenómenos que ocurrirán en nuestra variable en
estudio.
Técnicas de evaluación.- Las fichas de evaluación es una técnica que permite la recopilación de
datos significativos par el investigador (carrasco,2006) por ello utilizaremos esta técnica porque
nos permitirá obtener datos de todos los procesos de las pruebas bioquímicas como el método
antibiograma disco-placa para poder determinara la concentración mínima inhibitoria (CMI) y
las
densidades ópticas (650 nm) /espectrofotometría para poder evaluación le concentración
mínima bacteriana (CMB) como se adjunta en el A.
Instrumento:
Cuenta colonias.- este instrumento nos permitirá cuantificar la concentración mínima inhibitoria
(CMI) de microorganismos patógenos bacterianos a través de la difusión en agar descrito por
Yasneidi Aldana Pérez (2007) que es conocido por otros autores como el método antibiograma
disco-placa
Lectura por espectrofotometría. El espectrofotometría es un instrumento muy sofisticado que
determina las densidades ópticas (650 nm)/ la concentración
mínima bacteriana (CMB) de
microorganismos patógenos bacterianos.
3.7. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS (bactericida)
a). Secado y pulverización.- Las hojas de Piper angustifolium y Passiflora edulis serán
deshidratados aproximadamente 20kg/ 8 días a temperatura ambiente en una área fresca y seca
resguardada de la luz hasta que las hojas se quebranten al tacto, se cortaron de forma manual
hasta un largo aproximado de 1,0 cm y posteriormente se trituraron con una máquina de uso
doméstico, Minipimer, marca Electrocom (Claussen, 2009)
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b). Extracción.- Para la obtención de los extractos vegetales se empleará el método de extracción de
lípidos Bligh and Dyer (1945), citado por Muñoz (2011) para esto, se pesaran 300 gramos de hojas
secas pulverizadas en un frasco schott de 250 ml y se le agregaran los 3 solventes a utilizar: etanol
(97%), cloroformo (97%) y agua ultra puro en la proporción: 200ml de etanol, 50ml de cloroformo y
40ml de agua ultra puro en una proporción inicial de (2:1:0,8). Los frascos schott que contenían los
solventes más el material vegetal pulverizado, se mantendrán en agitación con un agitador Orbitral
Shaker / 1h a 180 rpm. Luego de 1 hora de agitación se agregaron nuevamente las siguientes
cantidades de solventes: 25ml de cloroformo y 20ml de agua ultra puro Proporción final: (2:2:1,8).
Luego de cambiar la proporción de los solventes se formaron claramente 2 fases: la superior:
metanol+agua y la inferior: cloroformo. Ambas fases serán coladas para remover el material grueso
y centrifugado a 5000 rpm / 10 min para obtener una mejor separación de fases. Finalmente ambas
fases serán filtradas con papel filtro Whatman Nº1 sobre embudos, recolectando en un frasco limpio
cada fase para posteriormente eliminar el solvente.
c). Eliminación del solvente. Los solventes de ambas fases serán eliminados a través de un sistema
artesanal que consiste en eliminar el metanol y el cloroformo a baño maría (temperatura no mayor a
45ºC) bajo ventilación dirigida con bomba de pecera en una campana de extracción (Claussen, 2009).
d). Re suspensión de los extractos. Los extractos serán
re suspendidos al 40%, los extractos
etanólico se disolvieron en agua ultra pura y los clorofórmicos en etanol.
e). Esterilización de los extractos. Los extractos se esterilizaran a través de filtración por membrana,
utilizando filtros Millipore de 0,22μm y se almacenaran en refrigeración en tubos falcón estériles
cubiertos con papel aluminio durante 24 horas, hasta su utilización. Cabe señalar que los extractos
estériles pueden ser almacenados por un periodo máximo de 1 mes a -20º C sin alterar sus
componentes activos (Aboaba et al., 2006), como se muestra en el anexo A.
INCLUSIÓN DE NEONATOS DE ALPACAS CON CASOS CLÍNICOS.
Para el estudio se utilizaran 60 neonatos de alpacas de raza huacaya de ambos sexos con
presencia de casos clínicos de diarrea, los cuales serán identificados con collares enumerados y serán
distribuidos en dos grupos de estudio como se detalla a continuación:
Grupo A. Constara de 20 neonatos de alpacas de ambos sexos( 10 machos y 10 hembras) de los
cuales se tomaran 10 muestras de heces / animal /semana por un periodo de 2 meses, serán reportadas
al laboratorio central de investigación a la área de sanidad animal estrictamente identificadas y
conservadas en un refrigero portátil a una temperatura de 10ºc para ser los estudios de pruebas
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bioquímicos o la prueba de antibacterecidas a concentración de 10% a dos de 10 µ litros de extractos
de Piper Angustifolium y pasiflora Edulis .
Grupo B. Constara de 20 neonatos de alpacas de ambos sexos10 (machos y 10 hembras) de los cuales
se tomaran 10 muestras de heces / animal /semana por un periodo de 2 meses, serán reportadas al
laboratorio
central de investigación a la área de sanidad animal estrictamente
identificadas y
conservadas en un refrigero portátil a una temperatura de 10ºc para ser los estudios de pruebas
bioquímicos o la prueba de antibacterecidas a concentración de 5 % a dosis de 5 µ litros de
bactericida de extractos de Piper angustifolium y pasiflora edulis .
Grupo C. Constara de 20 neonatos de alpacas de ambos sexos (10 machos y 10 hembras) de los cuales
se tomaran 10 muestras de heces / animal /semana por un periodo de 2 meses, serán reportadas al
laboratorio
central de investigación a la área de sanidad animal estrictamente
identificadas y
conservadas en un refrigero portátil a una temperatura de 10ºc para ser los estudios de pruebas
bioquímicos o la prueba de antibacterecidas a este grupo por ser como testigo solo se le agregar agua
ultra pura la
dosis de 10 y 5 µ litros para las diferentes pruebas con la finalidad de encontrar la
actividad Inhibitoria sobre Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli, para ello se realizaran
pre y pos prueba .
OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE CEPAS.
a). Preparación de suero fisiológico.- Se prepara 100 ml de solución salina al 0.9% y se repartirán de
10 ml en tubos de ensayo tapa rosca 150 x 15. Se auto clavaran a 121 ºC por 15 minutos, serán
almacenados en refrigeración a 8ºC hasta el momento de usar.
La cepas de Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli, serán obtenidas de muestras de heces
de neonato con presencia de diarrea para ello se realizaran soluciones con agua ultra pura a una
concentración de 10% ,posteriormente
se realizara los cultivos
agregando 100 μl de solución
obtenida , mediante una siembra a través de la técnica de estrías múltiple en placas Petri (Pyrex®) con
Agar caldo de Tioglicolato para microbiología ,Agar SS y Agar Macconkey.
b). Aislamiento de Clostridium Sp.-Se disolverá 40 gramos de Tioglicolato para Microbiología en
un litro de agua ultra pura. Esta cantidad es suficiente para 100 placas Petri. Se auto clavaran a 121ºC
por 15 minutos y se conservará a 8ºC, para hacer lo cultivos se llevara al proceso de baño María a
45ºC, se realizara la siembra en las placas Petri utilizando la técnica de estrías múltiple para su
aislamiento agregando 100 μl de solución de heces de neonatos de alpacas, incubadas en condiciones
anaeróbicas (atmósfera de 95% nitrógeno, 5% dióxido de carbono), en una jarra Gaspack (Difco) con
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su respectivo sobre generador de anaerobiosis y su indicador, a una temperatura de 45ºC durante 45
horas.
c). Aislamiento de Escherichia Coli..-Se disolverá 60g de Agar Macconkey en un litro de agua
ultra pura. Esta cantidad es suficiente para 100 placas Petri. Se auto clavaran a 121oC por 15 minutos
y se conservará a 8ºc, para hacer lo cultivos se llevara al proceso de baño María a 45ºC, se realizara la
siembra en las placas Petri utilizando la técnica de estrías múltiple para su aislamiento agregando 100
μl de solución de heces de neonatos de alpacas, incubadas en condiciones anaeróbicas (atmósfera de
95% nitrógeno, 5% dióxido de carbono), en una jarra Gaspack (Difco) con su respectivo sobre
generador de anaerobiosis y su indicador, a una temperatura de 37ºC durante 72 horas.
d). Aislamiento de Salmonella sp.-Se disolverá 60g de Agar SS, en un litro de agua ultra pura; Esta
cantidad es suficiente para 100 placas Petri. Se auto clavaran a 121ºC por 15 minutos y se conservará
a 8ºc, para hacer lo cultivos se llevara al proceso de baño María a 45ºC, se realizara la siembra en las
placas Petri utilizando la técnica de estrías múltiple para su aislamiento agregando 100 μl de solución
de heces de neonatos de alpacas, incubadas en condiciones anaeróbicas (atmósfera de 95% nitrógeno,
5% dióxido de carbono), en una jarra Gaspack (Difco) con su respectivo sobre generador de
anaerobiosis y su indicador, a una temperatura de 37ºC durante 72 horas.
IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS.
Para la identificación específica de las cepas de Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli
se realizará las siguientes pruebas:
a). Prueba de Kligler TSI (Triple Sugar Iron).- Para ello se utilizará el agar hierro triple azúcar es
un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la
producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de entero bacterias. Para ello se utilizará
en la siguiente composición.
TSI composición
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
Proteosa peptona
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Cloruro de sodio
Sulfato ferroso
Tiosulfato de sodio
Cantidades
3,0 g
3,0 g
15,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
1,0 g
5,0 g
0,2 g
0,3 g
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Agar
Rojo fenol
Agua destilada
pH
12,0 g
0,024 g
1L
7,4 ± 0,2
Fuente: Aboaba et al., (2006)
Para realizar la prueba se Inocularan en los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso
introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico
con un movimiento hacia uno y otro lado, serán incubados 35°C durante 24 horas. Luego se hará la
identificación de la presencia de Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli atreves de las
coloraciones que presente las pruebas.
b). Prueba de LIA (Lysine Iron Agar).- Este ensayo nos permitirá a
diferenciar los
microorganismos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina, muy particular a ello nos
permitirá a detectar la producción de H2S y la sensibilidad al TSI para la detección de H2S. Para esta
prueba utilizaremos los siguientes componentes.
LIA composición
Peptona
Extracto de levadura
Glucosa
L-Lisina.HCl
Citrato férrico amónico
Tiosulfato de sodio
Púrpura de bromocresol
Agar
Agua
pH
Cantidades
5g
3g
1g
10 g
0.5 g
0.04 g
0.02 g
15 g
1L
6,7 +/- 0,2
Fuente: Aboaba et al., (2006)
c). Inuculidad de los microorganismos.- Se purificara los microorganismos a ensayar (Clostridium
sp, Salmonella sp y Escherichia coli) inoculándolos en cajas de Petri con 15 mL de Agar caldo de
Tioglicolato para microbiología, Agar SS y Agar Macconkey e incubando a 37°C durante 24 horas
para bacterias, se inoculara una asada del cultivo puro de bacteria en un tubo con 5 ml de caldo de
Tioglicolato para microbiología (Clostridium Sp) , un tubo con 5 ml de caldo de selenito selenito –
cistina (Salmonella sp)
y otro tubo con 5 ml de caldo de Tioglicolato para microbiología
(Escherichia coli) , e incubar a 37°C durante 24 horas. Diluir 0.05 ml de la suspensión anterior en
4.95 ml (5ml) de agua solución salina estéril (dilución 1:100) sembrar en caja de Petri para hacer las
pruebas de antibiograma (pruebas de sensibilidad) y la concentración de carga microbiana a través del
espectrofotometría.
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72
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
PRUEBAS ANTIMICROBIANAS
Técnica de antibiograma disco placa (Observación Directa).- Para la determinación de acción
antimicrobiana
se procederá realizando el antibiograma en el agar caldo de selenito –
cistina(Salmonella sp), caldo de Tioglicolato para microbiología (Escherichia coli y Clostridium sp)
en el cual se colocaran los discos de sensibilidad preparados y se les proporcionará las distintas
concentraciones del extracto etanólico de maracuyá y maticos (25,50% ) a una dosis de 25 y 50 µl y
como de comparación ( testigo) se utilizara el suero fisiológico, se incubarán a 37°C por 24 horas
,luego serán evaluados la medición del halo inhibido de los extractos frente a las bacterias de
Escherichia coli Clostridium sp y Salmonella sp
Medición del halo inhibición.- Las muestras será evaluadas a los 24 horas pos incubación, se realiza
las mediciones correctamente estipuladas de los halos de inhibición con una regla flexible milimetrada
para determinar con una escala categórica de sensible de: R ≤ 14, I 15 ≥ 18, S ≥ 19.
Medición de concentración mínima bacteriana (CMB) / espectrofotometría.- Para medir la
concentración mínima de bacterias (carga microbiana) se utilizara a través de
lectura/
espectrofotometría, empleando una densidad óptica de 650 nm (macrodilución en tubo), la cuál
consiste
en disponer en 10 tubos de ensayo con medio de cultivo que corresponde a cada
microorganismo que corresponde(Escherichia coli , Clostridium sp y Salmonella sp ), y sobre el cual
se le adicionaron las diluciones seriadas del extracto de matico y maracuyá a diferentes concentración
y dosis ( 25y 50% ,dosis 25 y50µl). El inoculo de Escherichia coli, Clostridium sp y Salmonella sp
será obtenido previamente de un cultivo de noche (overnight), del que se suspenderán 4 ml del
cultivo de noche en
16 ml del medio de cultivo agar caldo de selenito – cistina y caldo de Tioglicolato para microbiología.
A partir de este cultivo se distribuirán 100 μl en cada uno de los tubos antes mencionados. El sistema
de tubos de ensayo será incubado por 72 horas a 37º C y, luego se efectuó la lectura de cada tubo en el
espectrofotómetro a través de las cubetas diluidas con agua ultra pura con una proporción de 1:100. Él
cuál sirve para realizar mediciones mediante la longitud de onda que absorba más energía, a lo que se
llama absorbancia (densidad óptica); en este estudio la absorbancia utilizada será de 650 nm. Los
resultados obtenidos serán llevados a una gráfica para una mejor caracterización de la concentración
mínima inhibitoria.
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73
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
3.8. TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS
Para el análisis y procesamiento de datos se utilizará el paquete estadístico SPSS Vers. 22,0 y los
resultados se analizará a través de análisis de ANVA para verificar la existencia del nivel de
significancia entre los diferentes tratamientos y la
prueba de Tukey para las comparación de
medias y desviación estándar entre los diferentes tratamientos con un margen de error de nivel
de significancia (p< 0.01).
3.9. ÁMBITO DE ESTUDIO
Trabajo de laboratorio.- Se realizará en los ambientes del laboratorio central de la
Universidad Nacional de Huancavelica (Laboratorio de Sanidad Animal y Microbiología) donde
se hará los diferentes estudios de procesos de experimentación de la Capacidad inhibitoria
antimicrobiana del Extractos etanólico de Passiflora edulis y Piper angustifolium sobre
Clostridium sp, Salmonella sp y Escherichia coli.
Trabajo de campo.- El trabajo de campo para la identificación y selección de las unidades
experimentales como los neonatos de alpacas con casos clínicos de diarrea y la toma de muestras
para los diferentes estudios se realizarán en la granja comunal de la Comunidad Campesina de
Santa Bárbara de la región de Huancavelica. Dentro del marco general el proyecto esta
intervenida en la zona de influencia del proyecto de Camisea-Provincia de Huancavelica.
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74
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
CAPÍTULO IV
ASPECTO ADMINISTRATIVO
4.1. RECURSOS HUMANOS
Se cuenta con los siguientes recursos humanos que colaboraran con el proyecto, quienes
muestran el compromiso de trabajar en el presente proyecto:
Tesista:
 Víctor Carhuapoma Dela cruz. Responsable del proyecto de investigación alumno de la EAP
Zootecnia de la Universidad Nacional de Huancavelica.
Asesor:
 Dr. Nicasio Valencia Mamani. En calidad de asesor, docente de la Universidad Nacional de
Huancavelica. Responsable del Laboratorio de Sanidad Animal.
Coasesores:
 Dr. Elmer Chávez Araujo. En calidad de Co Asesor especialista en el área de la Cátedra de
biología y biotecnología molecular de la Universidad Nacional de Huancavelica.
 Dr. Armando Hung Caparro. En calidad de Co Asesor, especialista en el área de Sanidad
Animal y biología molecular de la Universidad Peruana Cayetano Heredia-Lima.
4.2. RECURSOS MATERIALES
Se cuenta con instalaciones y material de laboratorio de Sanidad Animal para realizar parte
experimental y la toma de datos, y para asegurar la homogeneidad de actividades que permitan
obtener resultados precisos y confiables se financiara con los recursos que aportaría la presente
convocatoria, mediante FOCAM.
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75
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
4.3. PRESUPUESTO
4.3.1. Cuadro de presupuesto de materiales de laboratorio
Cuadro de presupuesto de materiales de laboratorio
Producto
Microtubos con tapa de 1500 μl
(Isolab)
Puntillas para micropipeta de 0.510 μl
Puntillas para micropipeta de 20 –
100 μl
Unidad de medida y
cantidad
Precio
Unitario s/.
Precio Total
S/.
Bolsa x 50 (02)
40.00
80.00
Bolsa x 1000 (04)
65.00
260.00
Bolsa x 1000 (02)
70.00
140.00
Algodón
Paquete(03)
14.00
42.00
Placa petri 100 x 15 mm
Cajas x 500 unid (01)
402.38
402.38
Jeringas de 20 ml
caja x 100 (1)
250.00
250.00
Papel toalla rollo
Unidad. (5)
5.00
25.00
Guantes quirúrgicos
Caja x 100 (2)
18.00
36.00
Mascarillas quirúrgicas
Caja x 100 (01)
40.00
40.00
Gorras quirúrgicas
Caja x 100 (01)
52.00
52.00
Tubos de vacotaners
Pack *100 unid(01)
280.00
280.00
Tubos para muestras de heces
Pack x100 unid(01)
120.00
120.00
Matraz Erlenmeyer 100ml
Paq. x10 (1)
94.40
94.40
Matraz Erlenmeyer 250ml
Paq. x10 (3)
106.20
318.60
Espátula drigalski
Unidad ( 3)
17.00
51.00
Mangos de kohle
Unidad(5)
5.00
25.00
Tubos de ensayo 10x75mm
Cajax100 unid.(2)
25.00
50.00
Equipo de disección
Juego x 09 piezas (01)
50.00
50.00
Tubos para cultivos con rosca
Caja x100 (01)
248.98
248.98
Vaso precipitación con pico ,100ml
Paq. x10 (1)
82.60
82.60
Vaso precipitación con pico ,250ml
Paq. x10(1)
94.40
94.40
Set de micro pipetas Nichipet Exil
Set (1)
1500.00
1500.00
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Guantes de late ,microflex
Paq.x12 (1)
Contador de colonias (EF4967A)
UNIDAD (1)
Agujas estériles para inoculación
Caja x 250unid.
Cajas de almacenamiento
(VWREI89214-762)
Marcador resistente (VWRI95042566)
Tubos de Centrifuga Con Tapón
Cónico (VWRI89039-660)
Giradisco inoculación(vwri50809022)
Hidrómetro digital 2595%(VWRI35519-045)
Alambres bastidores para tubos de
ensayo
Rudimentaria
Matraz fondo redondo
100ml(DUAN217212402)
Matraz fondo redondo
250ml(DUAN217212402
Recipiente de Anaerobios 2,5L(
1.16387.0001)
Papel filtro
76.70
76.70
2650.00
2650.00
120.36
120.36
Unidad ( 5)
49.56
247.8
Paq.x12 (1)
215.94
215.94
Caja x 500
440.14
440.14
Unidad (1)
572.30
572.30
Unidad (1)
247.80
247.80
Unidad ( 2)
127.44
248.88
Unidad (2)
40.00
80.00
Paq.x12 (2)
107.38
214.76
Paq.x12 (2)
112.10
224.20
Unidad ( 1)
657.38
657.38
Paq. x12 (1)
132.44
132.44
SUB TOTAL
10371.01
4.3.2. Cuadro de presupuesto de reactivos e insumos de laboratorio
Reactivo (código sigma)
Etanol absoluto para análisis Emsure
ACS ISO(1.00983.2500)
Agua
ultra pura EMSURE(P.A
1.16754.9010)
Acetona para análisis ESURE (G-3632)
Acido clorhídrico fumante 37%
EMSURE (1.00317.2500)
Reactivo
del
indol
según
Kovacs(1.09293.0100)
Violeta Cristal para Microscopia
(1.15940.0025)
Unidad de medida y
cantidad
Precio
Unitario
Precio Total
S/.
S/.
Liquido x 2.5 litro (01)
195.87
195.87
Bidon x 10L. (02)
313.76
627.52
Frasco x 2.5 L. (1)
113.99
113.99
Frasco x 52.5L(01)
103.60
103.60
Frasco x 100ml.(01)
113.75
113.75
Frasco x 25gr. (01)
110.09
110.09
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77
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Safranina
en
solución
Gram(1.09217.0500)
tensión
Frasco x 500 ml (01)
135.82
135.82
Yodo sublimado (1.04761.0100)
Frasco x 100gr (01)
202.13
202.13
Potasio yoduro (1.05043.0250)
Frasco x 250gr(01)
263.26
263.26
Frasco x 500 gr. (01)
229.51
229.51
Frasco x 15gr (01)
370.05
370.05
Frasco x 500gr (01)
257.12
257.12
Frasco x500gr(01)
452.56
Frasco x 500gr (01)
303.61
303.61
Frasco x 500gr (01)
501.74
501.74
Frasco x 500 Gr (01)
410.17
410.17
Agar urea base (1.08492.0500)
frasco x 500gr. (01)
496.66
496.66
Caldo triptosa para enriquisimiento
(1.10676.0500)
Frasco x 500 Gr (01)
576.43
576.43
Caldo glucose 2%(1.08339.0500)
Frasco x 50 Mg (01)
278.13
278.13
Agar muller –hintin (1.05437.0500)
Frasco X 500gr (01)
290.28
290.28
Etanol 96% EMSURE
FRASCO X 5OOML
295.38
295.38
Hielo para biología molecular
Unidad (10)
30.00
300.00
Agar Macconkey aislamiento
salmonella (1.05465.0500)
de
Caldo enriquecimiento selenito
07709.0500)
(1.
Agar
SS
aislamiento(1.07667.0500)l
para
Caldo Tioglicolato (1.08190.0500)
Agar
hierro-tres
(1.03915.0500)
Agar
Lisina
(1.11640.0500)
Agar
citrato
(1.02501.0500)
azucares
-TSI
–Hierro
LIA
de
simmons,
452.56
SUB TOTAL
6627.67
4.3.3. Cuadro de Capacitación a vinel nacional del investigador
Viaje de capacitación y perfeccionamiento para el fortalecimiento del
proyecto de investigación
Unidad
Med.
Cantidad
Precio Uni. S/.
Pasajes lima Ida y vuelta
Mes
2
150.00
300.00
Pasajes Puno Ida y Vuelta
Pasajes Abancay Ida y
Vuelta
Mes
2
280.00
560.00
Mes
2
350.00
700.00
Viáticos (Nacionales)
Mes
6
180.00
1080.00
Ítem/Descripción
Precio
total S/.
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78
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Pago congreso
Mes
3
230.00
690.00
SUB TOTAL
3330. 00
4.3.4. Cuadro de presupuesto de alquiler de equipos e instrumentos
Alquiler De Equipos e Instrumentos de Investigación
Descripción
Alquiler por 11
meses (01)
Alquiler por 11
meses (01)
Salidas de campo
(08)
Item/Descripción
Laptop Toshiba
Cámara filmadora
Alquiler de movilidad
Precio unit. S/.
Precio Total S/.
320.00
3520.00
64.00
704.00
97.00
776.00
5000.00
SUB TOTAL
4.3.5. Cuadro análisis, ensayos, pruebas y traducciones
Análisis, Traducciones y ensayos
Item/Descripción
Traducción de artículos
científicos
Descripción
Precio unit. (n.s)
Precio Total S/.
Traducción (02)
750.00
1500.00
Análisis estadístico
Análisis ( 2)
250.00
500.00
Ensayos de campo
Ensayos( 8)
500.00
4000.00
SUB TOTAL
6000.00
4.3.6. Movilidad y transporte
Movilidad y transporte
2013
A S
Viaticos
Huancavelica
lima
Pasajes
Huancavelica
ida y
vuelta
Imprevistos
O
2014
N
D
E
F
M
A
M
J
J
A
Total
360,00
180,00 180,00 720,00
200,00
100,00 100,00 400,00
255,00 255,00 255,00 255,00 255,00 255,00
255,00 255,00 255,00 255,00 2295,00
Gasto total
3670,00
4.3.7. Cuadro de asesoramiento
Asesoramiento
Ítem/Descripción
Conocedor del tema
Descripción
Asesor (02)
Precio unit. (n.s)
2.500.00
Precio Total s/.
5000.00
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79
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4.3.8. Cuadro de publicación en revistas científicas
Publicación
Item/Descripción
Descripción
Publicación
Revistas (02)
Servicio
de
impresiones y tipeos
Impresión (05)
Servicio
encuadernación y
empastado
Encuadernación y
empastado (05)
Servicios diversos
Servicio por atención
en sustentación de
tesis
Precio Total s/.
Precio unit. S/.
1300.00
2600.00
80.00
400.00
50.00
250.00
1750.00
1750.00
Sub Total
5000.00
4.3.9. Cuadro de evaluación por Jurados
Evaluación
Item/Descripción
Descripción
Incentivo Economico
Precio unit. S/.
Jurados
Evaluadores
(03)
Precio Total s/.
833.33
2500.00
4.3.10. Cuadro alimentos y hospedaje del investigador
Alimentos y hospedaje del investigador
Item/Descripción
Unidad
Cantidad
Filete de atún
Unidad
Caja x 48 unid. (05)
Galleta Integral
Unidad
Gaseosa
Litro
Paquete x 06 (35)
Paquete x 04 x 03 litros
(14)
Azucar rubia
Unidad
Arroz cholo
Precio Uni. S/.
Precio total
S/.
208.00
1040.00
2.54
89.0
27.50
384.00
Bolsa x50 kilos (1)
110.00
110.00
Uinidad
Bolsa x50 kilos(1)
130.00
130.00
Toffi
Bolsa
20
5.60
112.00
Yogurt
Litro
30
5.50
165.00
Fideos don victorio
Unidad
Bolsa x10kg (1)
40.00
40.00
Pionono
Bolsa
Bolsa x 12 unid. (30)
5.0
150.00
Hospedaje
Unidad
Habitacion x 2 dias (2)
60
120.00
Alimentacion
Unidad
Refrigerio x 2 dias (2)
80
160.00
Sub Total
2500.00
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80
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4.3.1. Cuadro de resumen de todos los gastos
Resumen de todos los gastos
Descripción
Precio sub total S/.
Presupuesto de materiales y reactivos de laboratorio
%
16998.68
33.9
Viaje de
capacitación y perfeccionamiento para el
fortalecimiento del proyecto de investigación
3330.00
6.7
Alquiler de Equipos e Instrumentos de Investigación
5000,00
10
Movilidad y transporte
3.670,00
7.3
Análisis, Ensayos, Pruebas y Traducciones
Asesoramiento
6000,00
5.000,00
12.0
10
Publicación (Servicios)
5.000,00
10
Evaluación por jurados
2.500,00
5
Alimentos y hospedaje del investigador
2.500,00
5
50.000,00
100
Total
4.4. FINANCIAMIENTO
El proyecto de tesis será financiado por la dirección universitaria de investigación a través
del fondo de desarrollo socio económico de camisea (FOCAM).
4.5. CUADRO CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividades
A
Elaboración y presentación del proyecto
de investigación.
Aprobación del Plan de Investigación
X
Toma de muestras y Análisis de
Laboratorio
Viaje de capacitación y
perfeccionamiento para el fortalecimiento
del proyecto de investigación
Análisis de datos
Redacción del Informe técnico y
económico intermedio
Año 2014
Meses
S O N D E
F
M
X
X
Año 2015
Meses
A M
J
J
A
X X
X X
X
X
X
X
X
X
Sustentación y Publicación del Proyecto
de Investigación
Redacción del Informe Técnico y
económico final
FACULTAD DE CIENCIS DE INGENIERIA –E.A. P. DE ZOOTECNIA
x
X
81
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
4.6. CADENA DE GASTOS POR PARTIDAS
Será por parte de la Universidad Nacional de Huancavelica, mediante recursos de FOCAM.
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82
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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83
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
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Universidad Privada Antenor
Orrego .Facultad de Medicina Human .Escuela Profesional de Estomatología .Trujillo –Perú
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
NOMBRE Y FIRMA DEL ASESOR Y TESISTAS
---------------------------------
--------------------------------
Asesor de Investigación
Investigador Responsable
Dr. Valencia Mamani, Nicasio
Carhuapoma Dela cruz, Víctor
Dr. Ruiz Béjar, Jaime
FACULTAD DE CIENCIS DE INGENIERIA –E.A. P. DE ZOOTECNIA
95
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
ANEXOS
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96
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
Esquema del Proceso de obtención de los extractos vegetales de matico y maracuyá.
fuente : Elaboración propia ( 2014)
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97
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
MATRIZ DE CONSISTENCIA
TÍTULO: “EFICACIA DEL BACTERICIDA DE EXTRACTO ETANOLICO DE Passiflora edulis Y Piper angustifolium SOBRE BACTERIAS CAUSALES DE DIARREAS EN ALPACAS EN
LA ZONA DE INFLUENCIA DEL PROYECTO DE CAMISEA - PROVINCIA DE HUANCAVELICA”
PROBLEMA
OBJETIVOS
HIPÓTESIS DE
VARIABLES
DIMENSIONES
INDICADORES
METODOLOGÍA
INVESTIGACIO
N
OBJETIVO GENERAL :
¿Cual es la
eficacia del
bactericida de
extractos
etanólico de
Passiflora edulis
y Piper
angustifolium
Sobre bacterias
causales de
diarreas en
neonatos de
alpacas?
OBJETIVO ESPECÍFICO:
Comparar
la
capacidad
inhibitoria antimicrobiana in
vitro
extracto
del
bactericida
de
etanólico
Passiflora edulis
de
y
angustifolium
POBLACION:
H. A
Determinar la eficacia del
bactericida de extracto
etanólico de Passiflora edulis
y Piper angustifolium sobre
bacterias causales de diarreas
en neonatos de alpacas.
Piper
El extractos
etanólico de
CONCENTRACION
Passiflora edulis y
MINIMA
Piper
Bacterias causales
bactericida eficaz
( Clostridium sp,
Salmonella Sp,
in vitro sobre
Salmonella sp y
Escherichia Coli
bacterias causales
Escherichia Coli )
Clostridium Sp,
clínicos de neonatos de alpacas con presencia
de diarreas y se tomaran muestras de heces con
10 repeticiones por caso clínico.
MINIMA
La investigación pertenece a la investigación
de tipo aplicado
BACTERIANA
CARGA MICROBIANA
(CMB)
Clostridium Sp,
extracto
etanólico de
Escherichia Coli
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli
Piper
inhibitoria antimicrobiana de
angustifolium no
Clostridium Sp, Salmonella Sp
son bactericida
y Escherichia Coli en vitro.
eficaz in vitro
Obtener
sobre bacterias
extracto etanólico a partir de
causales de
Passiflora edulis
diarreas en
NIVEL DE INVESTIGACION:
La investigación está orientado al nivel
S ≤ 250 μg /ml
experimental
MÉTODO DE INVESTIGACIÓN:
MÉTODO GENERAL; Método científico,
descriptivo ,analítico deductivo y estadístico
INDEPENDIENTE
Passiflora edulis y
angustifolium para la acción
Piper
debido se tomara como mínimo 60 casos
alpacas.
El extractos
y
19
TIPO DE INVESTIGACION:
dosis optima del bactericida de
la bactericida del
La muestra tomada es de tipo no proba listico
R ≤ 14,I 15 ≥ 18,S ≥
neonatos de
H.O
Piper
Salmonella Sp
NUESTRA:
CONCENTRACION
Determinar la concentración y
y
Clostridium Sp
Escherichia Coli
Salmonella Sp,
de
HALOS DE INHIBICION
de diarreas en
y Escherichia Coli.
angustifolium.
INHIBITORIA ( CMI)
angustifolium son
sobre
etanólico
de alpacas de ambos sexos nacidos en el
periodo 2015.
de diarrea en alpacas
Clostridium Sp, Salmonella Sp
Passiflora edulis
La población está constituida por 120 neonatos
DEPENDIENTE
DISEÑO ESPECIFICO: Diseño de la
investigación es el arreglo factorial 2x3
Bactericida extracto
etanólico:
Bactericida
extractos
Passiflora Edulis
etanólico:
Piper Angustifolium
Passiflora Edulis
Piper Angustifolium
TECNICAS E INTRUMEDNTOS
Concentraciones
0%, 15%, 25%, 50%
Dosis
15, 25 y 50μL
TÉCNICA: Observación y evaluación
INSTRUMENTO:
Cuenta colonias
Lectura por espectrofotometría
neonatos de
alpacas.
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
ANEXO 01.
Cuadro de registro para el efecto antibacteriano in vitro de los extractos etanólico de Passiflora Edulis y Piper Angustifolium
en diferentes
concentraciones sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
I. Lectura de los diferentes extractos en el espectrofotómetro.
a. esquema para obtener datos por espectrofotometría (650 nm) de los extractos etanólico de Passiflora Edulis y Piper Angustifolium en
diferentes concentraciones sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
Tipos de bacterias
Evolución de efecto bactericida de extractos etanólico de Passiflora Edulis a concentración de 25% sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y
Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
Tipos de bacterias
Evolución de efecto bactericida de extractos etanólico de Passiflora Edulis a concentración de 50% sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y
Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
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99
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
Tipos de bacterias
Evolución de efecto del suero fisiológico (testigo) sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
Tipos de bacterias
Evolución de efecto bactericida de extractos etanólico de Piper Angustifolium a concentración de 25% sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y
Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
Tipos de bacterias
Evolución de efecto bactericida de extractos etanólico de Piper Angustifolium a concentración de 50% sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y
Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
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100
PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
Tipos de bacterias
Evolución de efecto del suero fisiológico (testigo) sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
2º Rep.
3º Rep.
4º Rep.
5º Rep.
6º Rep.
7º Rep.
8º Rep.
9º Rep.
10º Rep.
Promedio
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
II. Lectura de los halos de inhibición (CMI) a diferentes concentraciones de los extractos a través del método de disco –placa.
a. Cuadros para obtener datos por disco –placa de los extractos etanólico de Passiflora Edulis y Piper Angustifolium
en diferentes
concentraciones sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
Tipos de bacterias
Evolución del Diámetro del halo de inhibición (mm) del extractos etanólico de Passiflora Edulis a concentración de 50% sobre Clostridium Sp,
Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
R
I
S
2º Rep.
R
I
S
3º Rep.
R
I
S
4º Rep.
R
I
5º Rep.
S
R
I
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Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
FACULTAD DE CIENCIS DE INGENIERIA –E.A. P. DE ZOOTECNIA
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
Tipos de bacterias
Evolución del Diámetro del halo de inhibición (mm) del extractos etanólico de Passiflora Edulis a concentración de 25% sobre Clostridium Sp,
Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
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9º Rep.
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10º Rep.
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Promedio
S
Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
Tipos de bacterias
Evolución del Diámetro del halo de inhibición (mm) del extractos etanólico de Piper Angustifolium a concentración de 25% sobre Clostridium Sp,
Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
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Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
FACULTAD DE CIENCIS DE INGENIERIA –E.A. P. DE ZOOTECNIA
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PROYECTO DE INVESTIGACION FINANCIADO CON RECURSOS DE FOCAM
Tipos de bacterias
Evolución del Diámetro del halo de inhibición (mm) del extractos etanólico de Piper Angustifolium a concentración de 50% sobre Clostridium Sp,
Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
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2º Rep.
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9º Rep.
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10º Rep.
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Promedio
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Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
Tipos de bacterias
Evolución del Diámetro del halo de inhibición (mm) del suero fisiológico (testigo) sobre Clostridium Sp, Salmonella Sp y Escherichia Coli.
1º Rep.
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2º Rep.
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Promedio
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Clostridium Sp
Salmonella Sp
Escherichia Coli.
Promedio
FACULTAD DE CIENCIS DE INGENIERIA –E.A. P. DE ZOOTECNIA
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