Download Desarrollo de un biosensor electroquímico de lectura directa

Desarrollo de un biosensor electroquímico de lectura directa de
hibridaciones de ADN
1
1
2
José Bernardo Cotero-Ochoa , Esteban Martínez-Guerrero , Enrique J. Herrera-López ,
1
1
1
Alejandro Cortez-Ibarra , César A. Sánchez-Martínez , José L. Chávez Hurtado ,
2
Ericka Flores-Berrios
1
Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente (ITESO), Departamento de Electrónica,
Sistemas e Informática. 45604.
2
Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A.C. (CIATEJ),
Departamento de Biotecnología, 44270, Guadalajara, Jalisco, México.
bcotero@iteso.mx, emguerrero@iteso.mx, eflores@ciatej.net.mx
Abstract
In this work we present the design of a biosensor based on a semiconductor device (CMOS) for real
time hybridization detection of ssDNA process. The sensor is a CMFET (Charge Modulated FET) type
device which generates a small current during a hybridization event. A conditioning and processing
signal stages were added to this sensor in order to send this data to a computer for save and display
data. The mask design of sensor, and the processing electronics was made in 0.5µm technology from
AMIS (a manufacturer of integrated circuits). A specific DNA probe is designed based on sequence of
Escherichia coli. These ingle-stranded probes were immobilized on a carboxy-methil-dextran surface.
The probes were hybridized with the complementary target sequences at the sensor.
Keywords: Biosensor, CMFET (Charge Modulated FET), DNA, CMOS integrated circuits.
Introducción
célula) en contacto con un sistema de
traducción que permite transformar la señal
bioquímica producida por la interacción en una
señal cuantificable [2]. Los principios de la
detección electroquímica molecular se basan la
característica inherente a los elementos
biológicos (células, proteínas, ADN, virus, etc.)
de poseer propiedades eléctricas, por ejemplo,
el ADN posee carga eléctrica, las células son
dieléctricas, los nervios conducen pulsos
eléctricos, etc. Por otra parte, los elementos
biológicos pueden unirse a moléculas o
partículas artificiales con pronunciado carácter
eléctrico, óptico o magnético lo que se aplica
para propósitos de reconocimiento molecular
[3]. En este contexto la capacidad del ADN de
poseer una carga eléctrica y de hibridar con
cadenas complementarias ha posibilitado la
detección de microorganismos basados en el
reconocimiento de secuencias de ADN.
La mayoría de los biosensores reportados
en la literatura están basados en el uso de
etiquetas, requieren plataformas sofisticadas y
condiciones
controladas
para
realizar
mediciones y su costo es aun elevado
[4,5,6,7,8,9,10,11], lo que limita su aplicación
para mediciones rápidas a bajo costo. Es por lo
tanto deseable diseñar biosensores que puedan
Los
alimentos
contaminados
con
organismos patógenos son los principales
responsables
de
producir
generalmente
enfermedades
gastrointestinales
en
los
humanos. El análisis microbiológico ha sido la
principal herramienta para la detección de
microorganismos patógenos en los alimentos,
sin embargo, este procedimiento implica
periodos largos de manipulación y baja
especificidad en matrices complejas. La
industria alimenticia actual requiere un
diagnóstico del estado de los alimentos de
manera rápida, exacta y fácil de realizar [1].
Gracias al avance de la tecnología en la última
década
se
han
realizado
diversas
investigaciones involucrando diferentes áreas
como la microbiología, la nanotecnología y la
microelectrónica en el desarrollo de prototipos
portátiles de biosensores, de lectura directa y de
bajo costo, lo que permitirá en un futuro cercano
responder a las demandas de la industria de
alimentos.
Un biosensor se define como una
herramienta o sistema analítico compuesto por
un elemento de reconocimiento biológico (ácido
nucleico, enzima, anticuerpo, receptor, tejido,
430
ser utilizados en aplicaciones fuera de los
laboratorios y que utilicen un área mínima de
trabajo. Bajo esta tendencia se ha reportado el
uso de una gran variedad de dispositivos de
estado sólido como transductores para
interacción electroquímica, los dispositivos
semiconductores basados en silicio han
emergido como los más prometedores para el
desarrollo
de
sensores
electroquímicos
portátiles y de bajo costo. Recientes trabajos
reportados en la literatura sobre depósito de
muestras de ADN en superficies de SiO2 [12,13]
o Al [14] muestran la factibilidad de integrar
biosensores con circuitos electrónicos en un
proceso compatible con tecnología CMOS
(Complementary Metal Oxide Semiconductor);
es decir, desarrollar biosensores en circuito
integrado.
El presente trabajo describe el desarrollo de
un biosensor en circuito integrado en tecnología
CMOS de 0.5µm para la detección de ADN de
E. coli en matrices alimenticias mediante
hibridación de una sonda con el ADN blanco en
el microorganismo. Las variables de diseño que
se han considerado en este desarrollo son (a) la
relación entre el área activa del sensor y la
intensidad y forma de la señal que se obtiene
del biosensor (corriente eléctrica); (b) el diseño
de la estructura del biosensor compatible con
tecnología CMOS; (c) el diseño de los circuitos
de adquisición y procesamiento de señal para
lectura en tiempo real; (d) la plataforma de
caracterización eléctrica y biológica y (e) la
caracterización del bioelemento.
Figura 1. Diagrama a bloques del circuito integrado del
biosensor. Las conexiones externas son para las
alimentaciones (Vdd = 5V y Vss = 0), la señales de control
de la circuiteria digital, y las conexiones entrada salida (I/O)
de señal del circuito integrado.
definidas en función del límite de tamaño del
bioreceptor manejable en nuestro laboratorio
2
(en este caso, 10,000µm ). Las dimensiones del
transistor pMOS se ajustan para mayor
sensitividad, es decir, para obtener niveles de
corriente legibles y minimizar el ruido de fondo.
El número de sensores queda determinado por
el área de silicio disponible en tecnología de
0.5µm para proyectos académicos de MOSIS
[16].
Resultados preliminares del modelo del
biosensor han arrojado una variación de
corriente del orden de 200µA (ver Fig. 3)
cuando la carga sobre al área activa varía de
-12
3.20435292×10 Coulombs a 6.40870584×10
12
Coulombs (equivalente a depositar una gota
6
de bioreceptor que contiene alrededor de 10
tiras de ADN de un tamaño de 20 pares de
bases por cada tira).
Se prevé que la señal que se obtendrá del
prototipo real del biosensor será de la misma
magnitud pero más ruidosa, razón por la cual se
incorpora una etapa de acondicionamiento de la
señal que consiste de un amplificador de
transresistencia de ganancia grande y un filtro
pasabajas de ganancia unitaria y frecuencia de
corte a -3dB de 100Hz para producir una señal
de voltaje de amplitud (~ 5V) manejable por la
circuiteria electrónica de acondicionamiento y
control.
Desarrollo del circuito integrado
La figura 1 presenta el diagrama a bloques
del biosensor en circuito integrado actualmente
en proceso de desarrollo. Éste puede dividirse
en dos partes: la primera contiene el arreglo de
sensores con su circuito de acondicionamiento
de señal, la segunda parte contiene toda la
electrónica necesaria para controlar el
funcionamiento del circuito integrado, la
comunicación externa y su polarización.
Para
propósitos
de
funcionalidad
(capacidad para realizar mediciones separadas
o simultáneas), se diseña el circuito integrado
con una matriz de 4 sensores del tipo CMFET
(Charge Modulated FET) [15]; cada sensor
consiste básicamente de un área activa formada
por una cavidad con paredes y fondo de SiO2 en
donde se depositan las tiras ssDNA y un
transistor
pMOS
del
tipo
compuerta
capacitivamente controlada o compuerta
flotante FGMOS (Floating Gate MOS) (ver Fig.
2). Las dimensiones del área activa quedan
431
VCG
sondas son cuantificadas y depositadas
mediante un sistema de microinyección en la
superficie del circuito.
Área activa
Capacitor de control
Carga ADN
-
-
-
-
-
Spacer
Resultados
IDS
Compuerta flotante
FET
El funcionamiento del biosensor se basa en
el principio de la interacción electroquímica que
ocurre al depositar el bioreceptor en la
superficie del área activa del sensor
VDS
(a)
Inicialmente (cuando no se tiene presencia
del analito en la superficie del área activa) se
tiene una carga residual mínima que permite
determinar, a partir de un voltaje determinado
de drenador a fuente VDS, un valor de referencia
de corriente de saturación ID en el sensor. Dado
que el ADN contenido en el bioreceptor posee
carga eléctrica, al momento de depositarlo, se
induce una carga de signo opuesto a la de las
tiras de ssDNA en la capa adyacente al área
activa lo cual modifica el voltaje de encendido
(VTH) del transistor MOS generando un ligero
incremento en el flujo de corriente ID. Cuando se
tiene un evento de hibridación o ensamble de
tiras ssDNA, la carga en el biorecepetor se
duplica y consecuentemente se produce un
incremento en la carga en la capa adyacente
del área activa, esto se manifiesta como un
incremento en el flujo de corriente ID en el
transistor. El comportamiento de la corriente del
FET obedece al modelo matemático de un
dispositivo de este tipo que se puede escribir
de la manera mostrada en las ecuaciones (1) y
(2) para la región de triodo y para la región de
saturación respectivamente:
(b)
Figura 2. Estructura del biosensor compatible con tecnología
CMOS: (a) corte transversal de la estructura del biosensor,
(b) layout de las mascaras del biosensor en circuito
integrado.
Cada uno de los sensores pueden operarse
en paralelo o seleccionar solo uno de ellos
según se requiera, por esta razón el diseño
contempla un multiplexor de 16:1 y un
demultiplexor 1:4 para redirigir las señales de
control a los sensores. Para dar mayor
funcionalidad al circuito integrado, se contempla
la digitalización de la señal del sensor por medio
de un convertidor analógico a digital (ADC) con
salida paralelo, 10 bits de resolución, y
velocidad de 1MHz.
W
(VGS − VTH )VDS − 1 VDS2  (1)

2
L

1
W
2
I D = µ n Cox (VFGS − VTH ) (1 + λVDS ) (2)
2
L
I D = µ nCox
Plataforma de medición
El parámetro de control en este modelo es
el voltaje de umbral VTH. Este voltaje es una
función no lineal de la carga que se induce en el
área activa y la carga en la compuerta flotante.
Sin embargo, si el “spacer” (ver figura 2) se
hace suficientemente delgado, la variación de
VTH puede aproximarse a la siguiente expresión
[15]:
La señal de salida del ADC es introducida a
otro circuito integrado de procesamiento digital
de señales o DSP que sirve de interfase hacia
el monitor de una PC o laptop para su
despliegue en formato digital. Ambos circuitos
(biosensor y DSP) con su respectiva
alimentación y puertos de entrada/salida se
montan en una tarjeta de circuito impreso de
tamaño no mayor a 8cm x10cm para la
realización de mediciones.
Para
propósitos
de
caracterización
biológica, se seleccionaron cuatro secuencias
genéricas obtenidas mediante GeneBank y
específicas para la detección de Escherichia
coli, las sondas poseen una longitud de 20pb en
cadena simple. Estas fueron inmobilizadas en
una matriz flexible de carboximetil-dextran. Las
VTH ≈ VTH 0 −
QF 0 + Qs
(3)
CCF + C FB
en donde QF0 es el valor de la carga inicial del
dispositivo sin el componente biológico; Qs es el
valor de la carga del componente biológico; CCF
y CFB son los valores de los capacitores de
432
control y del área activa respectivamente y VTH0
es el voltaje de umbral del pMOS propio de la
tecnología 0.5µm.
Durante la etapa de modelado se utilizó
TM
Matlab usando las ecuaciones reportadas en
[15] para generar una corriente de referencia y
emular variaciones en VTH proporcionales a las
variaciones de carga en el área activa. De la
curva ID = f(VDS, VTH) se obtuvo un circuito
electrónico equivalente del CMFET. El circuito
equivalente consta de un transistor pMOS con
ancho de canal L = 0.8µm y largo W = 5µm y un
arreglo de dos capacitores (el capacitor de
control y el capacitor del sensor) de 75.75pF. Se
realizaron simulaciones SPICE del circuito
equivalente usando el módulo VIRTUOSO de
TM
Cadence . La Fig. 3 presenta la curva de
variaciones de la corriente ID en función de VDS
para varias concentraciones de carga en el área
activa.
Como puede observarse de la figura 3, la
variación de carga es de alrededor de 200µA en
el rango de variación de carga anteriormente
definido. Esta corriente es introducida al
amplificador de transresistencia para obtener un
voltaje de salida en el rango de 1.6V a 4.5V (Ver
Fig. 4), es decir, de valor manejable por los
circuitos electrónicos diseñados en tecnología
de 0.5µm.
La implementación de los circuitos de
control así como la plataforma de medición esta
en proceso de diseño y será presentada durante
el congreso.
5
Vsalida [Volts]
4
3
2
1
0
2
2.5
3
3.5
Isensor [Amps]
4
4.5
5
-4
x 10
Figura 4. Voltaje de salida obtenido en el amplificador de
transresistencia. Este voltaje es digitalizado en la siguiente
etapa por el convertidor de datos.
Conclusiones
Presentamos el diseño de un biosensor del
tipo CMFET compatible con la tecnología
CMOS. Resultados del modelado del dispositivo
muestran un incremento en la señal eléctrica
generada por este sensor. Basados en los
resultados de modelado, se diseña el biosensor
y sus circuitos de acondicionamiento de señal
en tecnología CMOS de 0.5µm. Los resultados
de simulación SPICE de los circuitos diseñados
hasta el momento muestran la viabilidad de
implementación de este biosensor.
-4
4.5
x 10
4
3.5
Agradecimientos
Isensor [Amps]
3
2.5
2
Carga =
Carga =
Carga =
Carga =
Carga =
1.5
1
Este trabajo fue apoyado por el fondo
sectorial SAGARPA – 2006 (Secretaría de
Agricultura, Ganadería, Desarrollo rural, Pesca).
Clave 11946. Desarrollo de un biosensor
basado en ADN para el análisis de inocuidad de
alimentos mediante su incorporación en
empaques activos.
0C
3.2 pC
6.4 pC
9.2 pC
12.2 pC
0.5
0
0
1
2
3
4
5
6
Vds [Volts]
7
8
9
10
Figura 3. Curva de comportamiento de la corriente ID del
FET en presencia de variaciones de carga en el área activa
del sensor.
[1] Sh. Bhattacharya, J. Jang, L. Yang, D. Akin and R.
Bachir, Biomems And Nanotechnology-Based Approaches
for Rapid Detection Of Biological Entities. Journal of Rapid
Methods of automation and Microbiology, 15(2007) 1-32
[2] Nakamura, H y Karube, I. (2003) Current research
activity in biosensors. Analytical & Bioanalytical Chemistry,
377, 446-468.
[3] D. Ham, R. W. Westervelt, The Silicon that Moves and
Feels Small Living Things, Solid State Circuits Society
News. Vol. 12, No. 4. pp 4 – 9, 2007.
[4] F.K. Perkins, S. J. Fertig, K. A. Brown, D. McCarthy, L.M.
Tender, and M.C. Peckerar, An active microelectronic
transducer for enabling label-free miniaturized chemical
sensors, IEEE IEDM00, pp. 407 – 410, 2000
433
[5] Parshant Mali, Rakesh K. Lal, The dnaSET: A Novel
Device for Single Molecule DNA Sequencing, IEEE
Transaction on Electron Devices, vol 51, No. 12, December
2004, pp. 2004 – 2012.
[6] Erik Lauwers, Jan Suls, Walter Gumbrecht,
[7] Franz Hofmann, Alexander Frey, Brigit Holzapafl,
Meinrad Schienle, Christian Paulus, Petra Shindler – Bauer,
Dirk Kulhmeier, Jürgen Krause, Rainer Hintshe, Eric
Nebling, Joerg Albers, Walter Gumbrecht, Kurt Plehgnert,
Gerald Eckstein, Ronald Thewews, Fully Electronic DNA
Detection on a CMOS Chip: Device and process Issues,
IEEE, 2002.
[8] Yong-Taek Jeong, Dong-Sun Kim, Hong-Kun Lyu, HeyJung Park, Hyoung Sik Kim, Jang-Kyoo Shin, Pyung Choi,
Jong-Hyun Lee Lim, and G.Ishida M., Fabrication and
characteristics of an FET-type charge sensor for detecting
DNA sequence, Microprocesses and Nanotechnology
Conference 2002, pp. 288 – 289, 2002.
[9] A Campifelli, C. Bartic, J-M.F riedt, K. De Keersmaecker,
W. Laureyn, L. Francis, F. Frederix, G. Reekmans, A.
Angelova, J. Suls, K. Bonroy, R. De Palma, Z. Cheng, and
G. Borghs. Development of Microelectronic based
biosensors, Integrated Circuit Conference, IEEE 2003, pp.
505 – 512.
[10] Claudio Stagni, Carlotta Guiducci, Luca Benini, Bruno
Riccò, Sandro Carrara, Bruno Samorí, Christian Paulus,
Meinrad Schienle, Marcin Augustyniak, Ronald Thewes,
CMOS DNA Sensor Array with Integrated A/D Conversion
Based on Label-Free Capacitance Measurement, IEEE
Journal of Solid State Circuts, Vol. 4, No. 12, December
2006.
[11] P. M. Levine, Ping Gong, K. L. Shepard, and R.
Levicky, Active CMOS Array for Electrochemical Sensing of
Biomolecules, IEEE CICC-2007, pp. 825 – 828, 2007.
[12] A. Alessandrini, V. De Renzi, L. Berti, I. Barak, and P.
Facci, Chemically homogeneous, silylated surface for
effective DNA binding and hybridization, Surf. Sci., Vol. 582,
1 – 3, pp. 202–208, 2005
[13] J.P. Cloarec, N. Deligianis, J.R. Martin, I. Lawrence, E.
Souteyrand,
C.
Polychronakos,
M.F.
Lawrence,
Immobilization of homooligonucleotide probe layers onto
Si/SiO2 substrates: characterization by electrochemical
impeDNAce measurements and radiolabelling, Biosensors &
Bioelectronics 17, pp. 405–412, 2002.
[14] A. Hassibi and, T. H. Lee, A programmable
electrochemical biosensor array in 0.18um standard CMOS,
IEEE ISSCC-2005, Displays and Biosensors, pp. 564 – 565,
2005
[15] M. Barbaro, A. Bonfiglio, L. Raffo, A. Alessandrini, P.
Facci, and I. Barak, A CMOS, Fully Integrated Sensor for
Electronic Detection of DNA Hybridization, IEEE Electron
Device Letters, Vol. 27, No. 7, pp.595-597. 2006
[16] http://www.mosis.com/
434