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ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFLUENZA INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DEPARTAMENTO DE VIROLOGIA LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS 191 CONDICIONES PARA LA RECEPCIÓN DE MUESTRAS Toma de muestra Material 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm de poliestireno o vidrio, con tapa de rosca (estériles), conteniendo 2.5 ml de medio de transporte viral o solución salina estéril al 0.85% y gradilla (para exudados faríngeos y nasofaríngeos). Hisopos con mango de plástico estériles (con punta de rayón o dacrón) y abatelenguas estériles (para exudados faríngeos). Hisopos con mango de alambre flexible estériles (con punta de rayón o dacrón) (para exudados nasofaríngeos). Hielera conteniendo hielo o una bolsa refrigerante para mantener las muestras a 4°C. Formato de la solicitud de procesamiento de muestras (anexo No. 4). Guantes, cubrebocas, batas, tela adhesiva y bolígrafo. Procedimiento 1. 2. Antes de tomar las muestras es indispensable llenar con los datos que se solicitan el formato de solicitud de laboratorio (ver anexo). Las muestras deben ser tomadas tan pronto como sea posible en la fase aguda de la enfermedad, de preferencia durante las primeras 96 horas de iniciado el cuadro clínico del paciente. Para limitar la el posible contagio del tomador de muestras, todas estas deberán tomarse asépticamente (usar bata, guantes y cubrebocas). Las muestras deben mantenerse sobre hielo o en refrigeración, hasta su procesamiento. Exudado faríngeo El exudado faríngeo se recomienda para niños y adultos y la forma adecuada para tomarlo y obtener una buena muestra para la detección de virus respiratorios es la siguiente: 1. Se sujeta la lengua del paciente con el abatelenguas y se frota con firmeza la pared posterior de la garganta (orofaringe) con el hisopo con mango de plástico estéril (con punta de rayón o dacrón) al frotar obtenemos células infectadas por el virus; se debe tener cuidado de no tocar la úvula para no provocar el vomito en el paciente. 2. El hisopo se introduce en el tubo de ensayo (que contiene medio de transporte viral o solución salina estéril), la parte del hisopo que contiene la muestra se mantiene dentro del tubo, el resto se corta y se desecha, el tubo se cierra perfectamente y se mantiene a 4ºC. 3. Cada tubo se marca colocando una tela adhesiva (evitar papel engomado, masking-tape o “diúrex”), en la cual se escribe el nombre del paciente y la fecha de la toma. 4. Los tubos con las muestras deben mantenerse en refrigeración o en la hielera con la bolsa refrigerante si van a ser transportadas, (ver transporte de las muestras), hasta su procesamiento en el laboratorio. 192 4-8°C Exudado nasofaríngeo 1. 2. El éxito del diagnóstico virológico depende principalmente de la calidad de la muestra, de las condiciones de su transporte y del almacenamiento de la muestra antes de procesarla en el laboratorio. Las muestras para aislamiento de Influenza en cultivo celular o embrión de pollo, igual que las muestras para la detección directa de antígenos virales o de ácidos nucleicos, deben tomarse dentro de las primeras 96 horas del comienzo de los síntomas clínicos (durante la etapa febril). Procedimiento Antes de tomar las muestras es indispensable llenar con los datos que se solicitan el formato de solicitud de laboratorio (ver anexo SISVEFLU). El exudado nasofaríngeo se recomienda para bebés y niños muy pequeños; la forma adecuada para tomarlo y obtener una buena muestra para la detección de virus respiratorios es la siguiente: 1. Recostar al paciente y elevar un poco su cabeza, introducir suavemente el hisopo con mango de alambre flexible estériles (con punta de rayón o dacron), paralelo al paladar, casi en su totalidad hasta llegar a la nasofaringe (aproximadamente 2.5 cm en adulto y un poco menos en niños); una vez ahí, rotar suavemente el hisopo para frotar la pared de la nasofaringe (al frotar obtenemos células infectadas por el virus) y retirarlo cuidadosamente sin dejar de rotar. Esto se hace para ambas narinas con diferente hisopo. 2. Introducir la punta del hisopo en el tubo de ensayo (que contiene medio de transporte viral estéril o solución salina al 0.85% estéril), el resto se corta y se desecha, el tubo se cierra perfectamente y se mantiene a 4ºC. 3. Cada tubo se marca colocando una tela adhesiva (evitar papel engomado, masking-tape o “diúrex”), en la cual se escribe el nombre del paciente y la fecha en que se hizo el exudado faríngeo. 4. Los tubos con las muestras deben mantenerse en refrigeración (o en la hielera con la bolsa refrigerante si van a ser transportadas, ver transporte de las muestras), hasta su procesamiento en el laboratorio. Nota: Las muestras para aislamiento viral deberán refrigerarse inmediatamente después de tomarlas y se deberán inocular lo antes posible, ya sea en embrión de pollo o en cultivo celular. De no poder procesarse las muestras en las próximas 48 a 72 hrs, se mantendrán entre 4-8ºC. Evitar mantener las muestras por mas de 5 días en refrigeración (muestra en medio de transporte viral) o más de 24 horas si las muestras fueron recolectadas en solución salina, para que el virus no pierda infectividad. 193 4-8°C Hisopo de rayón o dacron Medio de transporte Para preparar 100 ml 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Albúmina bovina al 5 %............................................................ 10 ml Gentamicina (4 mg/ml) ............................................................ 2.5 ml Penicilina / estreptomicina (50,000 U/50,000 µg ..................... 1.0 ml Fungizona (l mg/ml) ................................................................0.25 ml NaHCO3 al 7.5 % .................................................................0.4 – 0.7 ml Solución balanceada de Hank’s........................................... . 85.5 ml Ajustar el pH de 7.0 a 7.2 y esterilizar por filtración. Envasar 2.5 ml en tubos estériles. Solución salina balanceada de Hank´s: Componentes g/litro 1. NaCl......................................................................................... 8.0 g/l 2. KCl........................................................................................... 0.4 g/l 3. MgSO47H2O.............................................................................. 0.2g/l 4. CaCl2H2O............................................................................ 0.185g/L 5. Na2HPO4.............................................................................. 0.046g/l 6. KH2PO4................................................................................. 0.06g/l 7. Glucosa................................................................................... 1.0g/l 8. NaHCO3.................................................................................. 0.35g/l 9. Rojo de fenol........................................................................ 0.02g/l Albúmina bovina al 5% 5 g de albúmina bovina fracción V en 100 ml de agua. Esterilizar por filtración. 194 Muestras para control de calidad 1. 2. Envio de laminillas (teñidas mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta y sin teñir con su correspondiente hoja de trabajo) para llevar acabo aseguramiento de la calidad en el InDRE. Envió de sobrenadantes de muestras positivas y negativas al InDRE para llevar a cabo el aislamiento del virus (se deberán enviar congeladas y en un lapso no mayor de 48 horas de haber procesado la muestra). HOJA DE TRABAJO PARA CONTROL DE CALIDAD DE VIRUS DE INFLUENZA SERVICIOS DE SALUD EN ______________ LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PUBLICA Fecha__________________________ No. de Placa:_____________ No. DE POZO 1 No. DE MUESTRA DIAGNOSTICO A 2 B 3 A 4 B 5 A 6 B 7 A 8 B RESULTADO Observaciones: ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ Realizo:_______________________________ Vo.Bo. ______________________ 195 Transporte de las muestras clínicas Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Es importante tener en cuenta que los virus requieren de células vivas para replicarse, consecuentemente la cantidad de virus no se incrementará después de ser tomada la muestra, sino al contrario, declinará dependiendo de la temperatura y de otras condiciones. Por lo tanto es importante que el tiempo en tránsito sea lo más corto posible: antes de 24 horas, si las muestras están en solución salina y máximo 5 días si el medio de transporte contiene alguna proteína estabilizadora, las muestras siempre se transportan entre 4-8 ºC. En el caso de haber sido tratada en el laboratorio los sobrenadantes se congelaran a -20ºC transportándose rodeados de refrigerantes y hielo seco, los sedimentos se fijaran en laminillas para inmunofluorescencia con teflón y se enviaran a temperatura de refrigeración. Nota: Los laboratorios de la red que tienen la capacidad de realizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta y han sido liberados por el InDRE, enviaran todos los sobrenadantes (en hielo seco) acompañados de una copia de su correspondiente solicitud de laboratorio y sus resultados de inmunofluorescencia, para llevar acabo el aislamiento viral. Los laboratorios de la red que tienen la capacidad de realizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta y no han sido liberados por el InDRE enviaran todas sus laminillas para llevar acabo el aseguramiento de la calidad, acompañados de una copia de su correspondiente solicitud de laboratorio y su hoja de trabajo con los resultados de sus lecturas de inmunofluorescencia, así como los sobrenadantes (en hielo seco) para realizar el aislamiento viral. Una vez que las muestras han sido colocadas en el interior del recipiente térmico, ésta se cierra y debe sellarse perfectamente con tela adhesiva. El recipiente térmico debe rotularse de la siguiente forma: Nombre del Centro de Salud, Clínica u Hospital que envía las muestras Se debe enviar a: Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) Dirigido a: Q.B.P. Miguel Iguala Vidales, Jefe del Laboratorio de IRA’s virales, Tel. directo 01 55 53410404, conmutador 0155 53427550 ext. 372 miiguala@salud.gob.mx 196 SISTEMA NACIONAL DE S ALUD Sistema de Vigilancia Epidemiológica de la Influenza (SISVEFLU) Solicitud de procesamiento de muestra para casos de influenza I. Datos del paciente No. folio Nombre Dirección Municipio o delegación Ocupación No. lab estatal Edad años meses días Sexo Teléfono Estado II. Síntomas (1=SI ó 2=NO) Fecha de inicio de los signos y síntomas de la enfermedad Inicio súbito Cefalea Fiebre ( ? 39' C indic. temp.) Dolor de garganta Tos Disfonía Malestar general Dolor abdominal (niños) Mialgias Conjuntivitis Postración Disnea Rinorrea hialina Cianosis Otros (especifique) Escalofrío Congestión nasal Si ¿Hubo contacto con otros casos de influenza? ¿Presenta alguna enfermedad crónica? No Si Se ignora Cual Se ignora ¿Tuvo contacto con pollos, otras aves o cerdos en los últimos 5 días antes de iniciados los síntomas? Si No día/mes/año En caso de respuesta afirmativa indicar lugar y fecha de contacto ¿Viajó 5 días antes de iniciada la enfermedad? Si No día/mes/año Si la respuesta afirmativa indicar lugar y fecha ¿Vacunación antiinfluenza? Si No Fecha ¿Tratamientos individuales? Si No Fecha III. Estudio de laboratorio Tipo de muestra: Ex. Faríngeo Ex. Nasofaríngeo Lavado BronqueoAlveolar Suero 1 Suero 2 Fecha de tom a Nombre del médico Institución Domicilio Teléfono 197 Bibliografía 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 198 Hanson C.V. 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IRL press. 301 pp. New York, U.S.A. 199 ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE IRAS VIRALES INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DEPARTAMENTO DE VIROLOGIA LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS 200 Bibliografía 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Ballew H.C., Lyerla H. C., Forrester F.T. (1984) Laboratory Methods for Diagnosing Respiratory Virus Infections. Center for Disease Control, U.S. Department of Health and Human Services; Atlanta Georgia, E.U. pp. 40. Hanson C.V. (1985) Immnunofluorescence and Related Procedures. En: Laboratory Diagnosis of Viral Infections (Lennette E.H. ed.)Marcel Dekker Inc. E.U. pág.119. Negroni G. (1964) Tissue Culture Techniques. En: Techniques in Experimental Virology Harris R.J.C. (editor). Academic Press. E.U. pp. 450. Harris R.J.C. editor (1964) Techniques in Experimental Virology. Academic Press. E.U. pp. 4 201 ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE IRAS VIRALES INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DEPARTAMENTO DE VIROLOGIA LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS 202 CONDICIONES PARA LA RECEPCIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNOSTICO DE ADENOVIRUS SE UTILIZAN MUESTRAS FARINGEAS ANTES DESCRITA LA METODOLOGIA, ADEMAS EN CASO DE CONJUNTIVITIS SE UTILIZARA LA SIGUIENTE METODOLOGIA: EXUDADO DE CONJUNTIVA Este procedimiento tiene como finalidad unificar la forma adecuada para la toma de muestras clínicas para diagnóstico de conjuntivitis por Influenza. Va dirigido a todo el personal involucrado con la toma de muestras en los diferentes Centros de Salud, Hospitales, el Departamento de Recepción de muestras. Material: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Tubos de ensayo de 13X100 mm de poliestireno o vidrio, con tapa de rosca (estériles), conteniendo 2.5 ml de medio de transporte viral o solución salina estéril. Gradilla Hisopos de Rayon o Dacron con mango de plastico estériles. Hielera conteniendo hielo o una bolsa refrigerante para mantener las muestras a 4ºC. Formato para el envío de muestras Guantes, cubrebocas, bata y goggles o anteojos. Tela adhesiva, bolígrafo. Antes de tomar las muestras es indispensable llenar el formato de envío de solicitud de laboratorio, en el cual se registra la fecha y el nombre de la persona a quien se debe enviar el resultado, el nombre de la institución a la que pertenece, el domicilio y el teléfono en el que se le puede localizar; los datos del paciente como su nombre completo, edad, fecha de nacimiento, sexo (masculino o femenino), dirección, ocupación, fecha de inicio de la enfermedad (es importante saberlo para un mejor diagnóstico), la sintomatología. También es necesario saber si la persona tuvo contacto con casos semejantes, si ha efectuado algún viaje y a dónde (de esta manera es posible detectar la presencia de brotes nuevos o es posible saber si la persona estuvo en algún donde se sabe con anterioridad de la existencia de un brotes o epidemia). Debe anotarse el tipo de muestra que se tomó (en este caso exudado de conjuntiva). Para limitar la contaminación y el posible contagio del tomador de muestras, todas las muestras deben tomarse asépticamente (usar bata, guantes, gogles o anteojos y cubrebocas); asi como lavarse las manos inmediatamente después de tomar las muestras. Las muestras deben mantenerse siempre sobre hielo o en refrigeración (4ºC) hasta su procesamiento. Procedimiento 1. 2. 3. Elevar un poco la cabeza del paciente, pedirle que vea hacia arriba, exponer la conjuntiva inferior (jalando ligeramente el párpado inferior hacia abajo con el dedo índice) y la superior e introducir el hisopo de Rayon o Dacron raspando vigorosamente ambas superficies conjuntivales, rotando el hisopo durante el proceso de muestreo para asegurar que toda la superficie de la conjuntiva se está muestreando, de tal forma que se puedan obtener células infectadas por el virus. Introducir el hisopo en un tubo de ensayo (con medio de transporte viral o solución salina estéril, el tubo se cierra perfectamente y se mantiene a 4ºC. Cada tubo se marca colocando una tela adhesiva (evitar papel engomado, "masking-tape" o "diurex"), en la cual se escribe el nombre del paciente y la fecha en que se hizo la toma de muestra. 203 4. Los tubos con las muestras deben mantenerse en refrigeración (o en hielera con bolsas refrigerantes si van a ser transportadas), hasta su procesamiento en el laboratorio. Girar el hisopo 4 a 8°c Hisopo de Rayon o Dacron Bibliografia 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 204 Ballew H.C., Lyerla H. C., Forrester F.T. (1984) Laboratory Methods for Diagnosing Respiratory Virus Infections. Center for Disease Control, U.S. Department of Health and Human Services; Atlanta Georgia, E.U. pp. 40. Hanson C.V. (1985) Immnunofluorescence and Related Procedures. En: Laboratory Diagnosis of Viral Infections (Lennette E.H. ed.)Marcel Dekker Inc. E.U. pág.119. Negroni G. (1964) Tissue Culture Techniques. En: Techniques in Experimental Virology Harris R.J.C. (editor). Academic Press. E.U. pp. 450. Harris R.J.C. editor (1964) Techniques in Experimental Virology. Academic Press. E.U. pp. 4 Adhikary, A.K., Inada, T., Banik, U., Numaga, J. Okabe, J. (2004). Identification of subgénero C Adenovirus by Fiber-Based Multiplex PCR. J. Clin. Micribiol. Vol. 42, No.2 p-670-673. Direct Detection of Respiratory Syncytial Virus, Parainfluenza Virus, and Adenovirus in Clinical Osiowy, C. (1998). 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E.U. pág.119. Negroni G. (1964) Tissue Culture Techniques. En: Techniques in Experimental Virology Harris R.J.C. (editor). Academic Press. E.U. pp. 450. Harris R.J.C. editor (1964) Techniques in Experimental Virology. Academic Press. E.U. pp. 4 Stocjton, J., Ellis, J. S., Saville, M., Clewley, J. P., Zambon, M. C. (1998). Multiplex PCR for Typing and Subtyping Influenza and Respiratory Syncitial Viruses. J. Clin. Microbiol. Vol. 36, No. 10 p. 2990-2995.