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Rev Panam Infectol 2010;12(4):18-21.
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Aplicación de un algoritmo sero-virológico en el
diagnóstico de la infección crónica por el virus de
hepatitis C en Venezuela*
Application of a sero-virological algorithm for diagnosis of chronic hepatitis C
virus infection in Venezuela
Aleidy Coromoto Trómpiz Araque1
María del Pilar Fortes Soto2
Berta Vargas-Lovelle3
Irma Victoria Machado Bártoli4
Licenciada en Bioanálisis con Maestría en Inmunología Básica. Bioanalista de las Secciones de
Serología y Molecular, Laboratorio Clínico Especializado Intediag-HV, Caracas, Venezuela. 2 Médico
Pediatra con Maestría en Inmunología Clínica.
Cursante de Doctorado en Inmunología Clínica,
Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina,
Universidad Central de Venezuela. Asesora Sección Molecular, Laboratorio Clínico Especializado
Intediag-HV, Caracas, Venezuela. 3 Farmacéutica
con Maestría en Mercadeo Integral. Gerente General, Laboratorio Clínico Especializado Intediag-HV,
Caracas, Venezuela. 4 Médico Internista, Gastroenterólogo con Maestría en Inmunología de Enfermedades Digestivas y del Hígado. Director Médico,
Laboratorio Clínico Especializado Intediag-HV;
Profesor Titular, Instituto de Inmunología, Facultad
de Medicina, Universidad Central de Venezuela,
Caracas, Venezuela. * El presente trabajo se presentó, en parte, en el XXX Congreso de la Sociedad
Venezolana de Gastroenterología, Septiembre
17-20, 2009, Caracas, Venezuela, otorgándosele
el Premio Nacional de Gastroenterología “Dr. Joel
Valencia Parpacén” 2009 y el Premio Nacional de
Hepatología 2009.
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Resumen
El abordaje diagnóstico integral de la hepatitis C no siempre se cumple en los países de América Latina. Para contribuir
al entendimiento e interpretación clínica del algoritmo serovirológico recomendado internacionalmente para el diagnóstico
de infección crónica por el virus de hepatitis C realizamos un
análisis de la aplicación de este algoritmo en Venezuela. Se evaluaron 858 sueros referidos con reporte positivo para anticuerpos
anti-virus de hepatitis C (anti-VHC). Cuando fue necesario por
resultados dudosos, se practicó una segunda determinación de
estos anticuerpos. En todas las muestras reactivas para antiVHC se investigó ARN-VHC empleando reacción en cadena de
la polimerasa anidada con transcripción reversa (RT-PCR). A los
sueros que mostraron ARN-VHC se les realizó genotipificación
y carga viral mediante RFLP y PCR cuantitativo en tiempo real,
respectivamente. De los 321 sueros en los que hubo que repetir
anti-VHC, 244 (76%) se concluyeron reactivos incluyéndose en
los siguientes pasos mientras que los 77 casos (24%) negativos fueron excluidos. Seiscientos-un sueros (77%) de las 781
muestras con anti-VHC positivo mostraron ARN-VHC detectable
cualitativamente. En este grupo el genotipo predominante fue
el 1, con cargas virales altamente variables. Finalmente, 180
muestras (23%) con anti-VHC reactivo no mostraron ARN-VHC
detectable cualitativamente. Corroboramos que este algoritmo
facilita la identificación precisa y el manejo clínico del paciente
crónicamente infectado por el VHC definiendo además aquellos
casos infectados que sólo necesitan seguimiento. Su aplicación
e interpretación ajustada se hace perentoria para todo médico
que decida abordar pacientes con hepatitis C.
Palabras clave: Hepatitis C, diagnóstico, algoritmo, anti-VHC,
genotipos, carga viral.
Rev Panam Infectol 2010;12(4):18-21.
Conflicto de intereses: ninguno
Recibido en 13/2/2010.
Aceptado para publicación en 30/4/2010.
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Abstract
The integral diagnosis approach to C hepatitis is not always
accomplished in Latin American countries. To contribute to the
understanding and clinical interpretation of the internationally
Trómpiz Araque AC, et al • Aplicación de un algoritmo sero-virológico...
recommended sero-virological algorithm for the diagnosis of chronic hepatitis C infection we performed an
analysis of this algorithm application in Venezuela. We
evaluated 858 serum samples referred as positive for
anti-HCV antibodies (anti-HCV). When it was required
due to uncertain results, a new antibodies determination was made. HCV-RNA was investigated by nested
polymerase chain reaction with reverse transcription
(RT-PCR) in whole positive anti-HCV samples. Sera
with detectable HCV-RNA were assessed for HCV
genotypes and viral load employing RFLP and quantitative real-time PCR, respectively. 244 out of 321
sera which anti-HCV test was repeated were concluded
as reactive and were included in the next steps, while
77 negative sera (24%) were excluded. HCV-RNA was
qualitatively detected in 601 (77%) sera out of 781
positive samples for anti-HCV. Genotype 1 was predominant in this group with highly variable viral loads.
Finally, 180 samples (23%) anti-HCV positive did not
show qualitatively detectable HCV-RNA. We corroborated that precise identification and optimal clinical
management of the patient chronically infected with
HCV is facilitated by this algorithm defining further
those infected cases whose only need is following-up.
Adjusted application and interpretation of this algo­
rithm by physicians who decided to approach hepatitis
C patients is urgent.
Key words: Hepatitis C, diagnosis, algorithm, antiHCV, genotypes, viral load.
pacientes quienes requerían completar la investigación
de probable hepatitis crónica por virus C. Los sueros
fueron referidos por cada médico tratante y provenían
de diferentes estados venezolanos, predominando el
área capital (ciudad de Caracas).
Métodos. El algoritmo sero-virológico aplicado se
diagrama en la figura 1. Tanto la prueba serológica
de anti-VHC como las pruebas virológicas o de ácidos
nucleicos se realizaron en el Laboratorio Intediag-HV.
Cada suero fue almacenado y congelado a -20oC hasta
su análisis.
Figura 1. Algoritmo sero-virológico aplicado para el
diagnóstico de hepatitis crónica C.
Introducción
El abordaje diagnóstico de la hepatitis C no siempre se logra cumplir apropiadamente en los países de
América Latina y Venezuela no es la excepción.(1,2)
Desde el descubrimiento del virus de la hepatitis C
(VHC) la pesquisa diagnóstica de esta infección se
basa en la exploración serológica de anticuerpos antiVHC (anti-VHC) como requisito primario para evaluar
al paciente por posible hepatitis crónica C.(3) Posteriormente, con la adición sistemática de pruebas de
ácidos nucleicos empleando tecnologías moleculares
cada vez más precisas, se establecen pautas mediante
consensos internacionales que recomiendan cuando
indicar cada prueba diagnóstica.(4-6) Para contribuir
al entendimiento e interpretación clínica de este
algoritmo sero-virológico realizamos un análisis de su
aplicación en nuestro país.
Prueba serológica:
Anticuerpos específicos para VHC. Anti-VHC fueron
determinados mediante ELISA de tercera generación
(Abbott Laboratories, Chicago,Il,USA).
Pruebas virológicas:
Viremia cualitativa. Se practicó la amplificación
de genomas del VHC (ARN-VHC) mediante reacción
en cadena de la polimerasa anidada con transcripción
reversa (RT-PCR) como ha sido ampliamente descrito.(7)
Genotipos del VHC. La tipificación del virus se
llevó a cabo mediante análisis de polimorfismos de
restricción (RFLP: Restriction Fragments Length
Polymorphism) utilizando como blanco la región 5’
no codificante, altamente conservada (5’ NCR) del
genoma del VHC.(8,9)
Cuantificación de viremia (carga viral). La cuantificación de cargas virales se realizó mediante PCR en
tiempo real (Qiagen, Hamburgh, Alemania; Rotor-Gene
3000™, Corbett Research, Sydney, Australia).(7)
Material y métodos
Muestras de suero. Analizamos 858 muestras de
suero obtenidas de igual número de pacientes, referidas al laboratorio clínico especializado Intediag-HV.
Ninguno de los casos se encontraba en fase aguda de
la infección por lo que todas las muestras provenían de
Resultados
De los 858 sueros referidos con anti-VHC positivo en su lugar de origen, 321 se consideraron
dudosos por lo que fueron re-evaluados. Verdaderamente reactivos resultaron 244 casos que se
incluyeron en los siguientes pasos del algoritmo,
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excluyéndose 77 muestras (24%) que mostraron
ser negativas.
La investigación de ARN-VHC mediante RT-PCR
fue necesaria entonces en 781 muestras (figura 2).
ARN VHC resultó detectable en la primera determinación en 601 sueros (77%) y no detectable en 180
muestras (23%). En los pacientes con ARN-VHC
logramos identificar el genotipo en 564 (94%), correspondiendo 343 pacientes a genotipo 1 (61%) y 221
casos a genotipo 2 (39%). Estas muestras mostraron
cargas virales altamente variables con rangos entre
3,9 log10 UI/mL (> 7.000UI/mL) a 6,8 log10 UI/mL
(> 6.000.000 UI/mL). En los restantes 37 pacientes
(6%) no se logró identificar el genotipo del VHC.
Figura 2. Resultados obtenidos en cada fase del algoritmo
sero-virológico aplicado. Expresados en porcentaje
n = número de muestras evaluadas ni = no identificable.
Discusión
La identificación inicial de un paciente infectado
por el VHC se realiza generalmente por hallazgos fortuitos como incremento de los valores de aminotrasferasas y/o por la detección de anticuerpos específicos
para este virus. En el último caso la investigación de
estos anticuerpos se debe llevar a cabo mediante la
utilización de estuches inmunoenzimáticos de tercera
generación cuya sensibilidad y especificidad puede
llegar a un 99%.(10) Una prueba reactiva de anticuerpos
anti-VHC lo que indica es exposición pasada, es decir,
no implica la existencia de infección activa por este
virus pero a partir de esta identificación múltiples consensos y expertos recomiendan algoritmos de diferente
amplitud que incluyen parámetros epidemiológicos,
clínicos, serológicos, moleculares e histopatológicos
para el manejo del paciente.(4-6)
La secuencia de pruebas diagnósticas descrita
en esta comunicación como algoritmo sero-virológico
seguramente ya es empleada por muchos de nuestros
expertos que manejan esta infección. Nosotros la aplicamos en muestras de suero de pacientes referidos por
presentar anti-VHC positivo y en quienes se requería
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completar el diagnóstico para posterior manejo por
cada médico tratante. No obstante, se ha demostrado
que la posibilidad de “falso reactivo” o “falso negativo”
es extremadamente baja cuando se utilizan ensayos de
comprobada calidad, encontramos que por lo menos
un 24% de más de un tercio de las muestras referidas
que evaluamos por segunda vez para anti-VHC, eran
“falsas positivas” o “falsas reactivas”. Este hallazgo
señala que, en Venezuela, tanto en algunos laboratorios
clínicos como en Bancos de Sangre los estuches utilizados a nivel nacional para la detección de anti-VHC
no siempre cumplen con el requisito de alto grado de
especificidad.
El segundo paso que investiga la presencia de infección activa mediante RT-PCR-cualitativa identificó
que 23% de los pacientes no presentaba ARN-VHC detectable, es decir, viremia. Este porcentaje es bastante
similar al considerado indicativo de infección resuelta.
Así, se estima que 20% de los sujetos con anti-VHC
positivo puede tener ARN VHC cualitativamente no
detectable, calificándose como “infección resuelta”.(11)
Sin embargo, independientemente del valor de ALT,
la demostración que la viremia en hepatitis crónica C
puede ser intermitente o de muy bajo dintel obliga a
la re-investigación de este parámetro en un período
igual o menor a 6 meses para verificar que, ciertamente, no existe ARN-VHC en sangre.(11) Es por ello que,
actualmente, a pesar de la disponibilidad en países
industrializados de pruebas cualitativas automatizadas
con límites de detección muy bajos (< 50 UI/mL de
ARN-VHC) y alta especificidad (98%), los consensos
recomiendan sustituir la detección cualitativa de ARNVHC por la detección cuantitativa mediante PCR en
tiempo real.(11,12)
La siguiente prueba del algoritmo la constituyó la
tipificación del VHC. Los genotipos del VHC varían en
su secuencia de nucleótidos hasta en un 30% y son
clasificados del 1 al 6.(9) Nuestros resultados confirman
lo que ya demostramos tanto en la década de los 90
como 15 años después que, en Venezuela, el genotipo
del VHC que predomina y se mantiene es el 1 y el segundo en frecuencia es el genotipo 2.(13,14) La mayoría
de los ensayos para tipificación, incluyendo la RFLP
utilizada por nosotros, tiene como blanco la 5’NCR del
genoma del VHC.(9) Debido a la repercusión clínica y
de manejo que tiene el genotipo del VHC es pertinente
hacer notar que cualquiera de estos ensayos, incluyendo los comerciales que tienen mayor sensibilidad que
la RFLP, puede errar en la identificación estimándose
que, en 5 a 8% de los casos, se identifica un genotipo
erróneo, por ejemplo un aislado 1a por 2a.(11)
Por último, procedimos a la cuantificación de ARN
VHC encontrando, como ha sido descrito,(11,12,14) alta
variabilidad en las cargas virales, independientemente
Trómpiz Araque AC, et al • Aplicación de un algoritmo sero-virológico...
del genotipo. Cuando se evalúa a un paciente con probable infección crónica por VHC, algunos autores en los
países industrializados sugieren cuantificar la carga viral desde un principio sobre todo si esta cuantificación
se puede hacer mediante PCR en tiempo real.(11,12)
Esta propuesta es ciertamente efectiva ya que permite
verificar la existencia de suficiente material genético
viral para la identificación del genotipo. Así mismo,
la cuantificación anticipada de la carga viral es fundamental para el monitoreo de la respuesta virológica
durante la terapia. Este monitoreo es actualmente
considerado como el factor primordial que predice
esta respuesta y en el cual se basan los cambios que,
individualmente, puede necesitar cada paciente durante el período terapéutico.(15)
En conclusión, corroboramos que este algoritmo
facilita la identificación precisa y el manejo clínico del
paciente crónicamente infectado por el VHC definiendo
además aquellos casos infectados que sólo necesitan
seguimiento. Su aplicación e interpretación ajustada se
hace perentoria para todo médico que decida abordar
pacientes con hepatitis C.
Referencias
1. Strauss E. Barriers to care of chronic hepatitis patients in Latin
America. Arch Med Res 2007;38:711-5.
2. Dehesa-Violante M, Nuñez-Nateras R. Epidemiology of hepatitis
B and C. Arch Med Res 2007;38:606-11.
3. Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory
testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus.
Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm
Rep 2003;52:1-13.
4. Consensus Statement. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. J Hepatol 1999;30:956-61.
5. National Institutes of Health Consensus Development Conference. Management of Hepatitis C: 2002-June 10-12, 2002.
Hepatology 2002;36 (Suppl1): S3-S20.
6. American Gastroenterological Association Technical Review on the Management of Hepatitis C. Gastroenterology
2006;130:231-64.
7. Pawlotsky JM. Molecular diagnosis of viral hepatitis. Gastroenterology 2002;122:1554-68.
8. Chan S.-W, McOmish F, Holmes EC, Dow B, Peutherer JF,
Follet E et al. Analysis of a new hepatitis C virus type and
its phylogenetic relationship to existing variants. J Gen Virol
1992;73:1131-41.
9. Smith DB, Mellor J, Jarvis LM, Davidson F, Kolberg J, Urdea
M et al. Variation of the hepatitis C virus 5’ non-coding region:
implications for secondary structure, virus detection and typing.
J Gen Virol 1995;76:1749-61.
10. Colin C, Lanoir D, Touzet S, Meyaud-Kraemer L, Bailly F, Trepo
C. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus
antibody detection assays: an analysis of the literature. J Viral
Hepat 2001;8: 87-95.
11. Scott JD, Gretch DR. Molecular Diagnosis of Hepatitis C Virus
Infection. A Systematic Review. JAMA 2007;297:724-32.
12. Ghany MG, Strader DB, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update. Hepatology
2009;49:1335-74.
13. Machado IV, Deibis L, Risquez E, Tassinari P, Zabaleta ME, Toro
FI et al. Abordaje inmunoclínico, molecular e inmunopatológico
de la hepatitis crónica viral. Consideraciones terapéuticas. GEN
1994;48:124-32.
14. Fortes MP, Trómpiz A, Canónico Y, Vargas-Lovelle B, Machado
IV. La frecuencia del genotipo 1 del virus de hepatitis C no ha
variado en Venezuela. Rev Col Gastroenterol 2009;24:256-58.
15. Lok ASF. Hepatitis C: Tailoring Therapy to Improve Outcomes.
Syllabus, AGA Institute Postgraduate Course. Applying New
Evidence to Clinical Practice. 2009; p. 283-88.
Correspondencia:
Dra. Irma V. Machado
Avenida Libertador, Edificio Libertador 75, Piso 8,
Oficina 8D, La Campiña. Caracas 1050, Venezuela.
e-mail: intediag@movistar.net.ve
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