Download Neurobiología de la hiperexcitabilidad Silvia Josefina López Pérez

Neurobiología de la hiperexcitabilidad
Silvia Josefina López Pérez (sjlopez@cucba.udg.mx), Laura Guadalupe Medina Ceja
(lmedina@cucba.udg.mx) y Alberto Morales Villagrán (amorales@cucba.udg.mx).
Laboratorio de Neurofisiología y Neuroquímica
Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad de Guadalajara
I. Sistema nervioso
El Sistema Nervioso (SN) se divide en dos grandes porciones, denominadas Sistema
Nervioso Central (SNC) y Sistema Nervioso Periférico (SNP), el primero constituido por el
cerebro y la médula espinal, y el segundo por los nervios periféricos que inervan todo el
organismo. Ambos sistemas establecen complejas relaciones que permiten a los organismos
obtener información del ambiente, modular su conducta en función de esa información, y
mantener la homeostasis.
El SNC se encuentra dentro de compartimentos óseos que proporcionan la protección
primaria del tejido nervioso: el cerebro está dentro del cráneo y la médula espinal está
dentro de la columna vertebral, de la cual salen los nervios periféricos asociados a la
médula espinal. Todo el tejido nervioso que conforma el SNC está constituidos por células,
las cuales pueden ser de dos tipos: células gliales o neuronas. Ambos tipos celulares se
compactan en una serie de núcleos cerebrales y regiones discretas que cumplen funciones
particulares. En la zona del cerebro se distinguen las regiones corticales, representadas por
una lámina delgada y plegada de tejido que recubre varios núcleos subcorticales, entre los
que se encuentran los ganglios basales (el núcleo caudado, el putamen, el globo pálido, el
tálamo, la sustancia negra, entre otros), los componentes del sistema límbico (como el
hipocampo y la amígdala), el cerebelo y el tallo cerebral. En estas regiones se distingue una
zona de color grisáceo (la sustancia gris), formada por los somas de las neuronas agrupadas
en núcleos, y una zona de color más claro (la sustancia blanca), formada por conjuntos de
axones (llamados tractos o haces nerviosos) que transcurren juntos para comunicar a los
núcleos cerebrales entre sí. El tracto principal que existe en el cerebro de los vertebrados es
el cuerpo calloso, que es la colección de todos los axones que comunican los hemisferios
cerebrales (Martin, 1998). A nivel de la médula espinal, la sustancia gris se concentra en la
parte interior, en una estructura en forma de H, rodeada por sustancia blanca, formada por
haces de fibras nerviosas que a su vez constituyen los nervios periféricos espinales que
conducen información bidireccional entre el cuerpo y el SNC.
Células gliales
Este tipo de células presenta una gran diversidad morfológica y funcional, se encuentran
en una relación numérica aproximada de 10 células gliales por cada neurona, y su
relevancia para la función nerviosa es cada vez más evidente. Las células gliales (Figura 1)
establecen complejas relaciones metabólicas y funcionales con las neuronas, participando
en vías metabólicas compartidas para el reciclo de neurotransmisores y otras moléculas,
para la segregación de depósitos metabólicos y sinápticos de diversos elementos celulares,
en la generación de la barrera hematoencefálica (BHE) por la cual se controla la entrada de
moléculas desde el torrente sanguíneo al cerebro, y en la vigilancia inmunológica del SNC
(Alcaraz, 2001). El Cuadro 1 resume las principales características funcionales de estas
células.
Figura 1. Células gliales y su relación con las neuronas.
Cuadro 1. Características de las células gliales.
Tipo
Ubicación Funciones principales
Astrocitos
SNC
Microglia
SNC
Oligodendrocitos
SNC
Células de Schwann
SNP
Soporte metabólico en la síntesis y degradación de
neurotransmisores, formación de la BHE (Parpura y
Verkhratsky, 2012).
Eliminación de neuronas dañadas, de restos
celulares y de elementos extraños y potencialmente
dañinos para el SNC (Wirenfeldt, et al., 2011).
Generación de la vaina de mielina para el
aislamiento de axones largos en el SNC (Beirowsky,
2013).
Generación de la vaina de mielina para el
aislamiento de axones largos en el SNP (Salzer,
2012).
La neurona
Las neuronas son células altamente especializadas en recibir y transmitir información,
en las cuales se distinguen tres regiones estructurales básicas (Valverde 2002) (Figura 2):
El soma, que contiene todos los elementos típicos de una célula (núcleo con ácidos
nucleicos, retículos endoplásmicos, aparato de Golgi, ribosomas, mitocondrias
y todos los elementos del citoesqueleto).
Las dendritas, prolongaciones finas y numerosas que rodean al soma, y que son las
encargadas de recibir información de neuronas vecinas. Las dendritas de
algunos tipos celulares presentan numerosas varicosidades denominadas
espinas dendríticas, cuya función es la de aumentar el área de recepción de
información.
El axón es una prolongación generalmente más larga o más ancha que las dendritas,
cuya función es transmitir información a otra célula, que bien puede ser otra
neurona dentro del mismo SNC, o células musculares o diversos tipos de
elementos receptores asociados a los sistemas sensoriales, fuera del SNC. Los
axones comúnmente se ramifican en su extremo más distal, originándose más
de un punto de contacto a partir de un solo axón.
Figura 2. Morfología y elementos básicos de una neurona.
Las neuronas se clasifican de acuerdo a su patrón morfológico en tres tipos básicos
(Schwartz y Westbrook, 2000): neuronas unipolares, que presentan una sola
prolongación que surge del soma, y que funciona como axón, el soma es la región que recibe
la información proveniente de otras neuronas. Estas son comunes en las raíces dorsales de
la médula espinal, en donde el soma se ubica en la sustancia gris de la médula y el axón sale
del SNC y se dirige hacia músculos de diversas partes del cuerpo o hacia diversos elementos
receptores de la dermis. Las neuronas bipolares presentan sus dendritas y axón con algún
grado de arborización, y proyectan estas prolongaciones hacia direcciones contrarias con
respecto del soma. Este tipo es característico de las neuronas de la sustancia negra del tallo
cerebral. Las neuronas multipolares presentan arboles dendríticos y axones muy
ramificados y extendidos, con numerosas espinas dendríticas. Ejemplos de este tipo son las
células de Purkinje del cerebelo y las neuronas piramidales de varias regiones corticales
(Figura 3).
A)
B)
C)
Figura 3. Tipos básicos de neuronas. A) Neurona unipolar; B) Neurona bipolar; C)
Neurona multipolar.
Sinapsis
El sitio de contacto entre dos neuronas recibe el nombre de sinapsis. En estos sitios, la
neurona que transmite la información se denomina neurona pre-sináptica, y la que la
recibe se llama neurona post-sináptica. La sinapsis regularmente se establece entre el
axón de una neurona y las dendritas de otra neurona, en cuyo caso se denomina sinapsis
axo-dendrítica, aunque también es común el contacto entre un axón y el soma (sinapsis axosomática) o entre un axón y una región de otro axón previa a la terminal (sinapsis axoaxónica). Una sola neurona puede establecer miles de contactos sinápticos con otras
neuronas, de tal manera que una neurona en particular puede funcionar como pre-sináptica
en algunas sinapsis, y como post-sináptica en otras. De esta manera se establecen redes
neuronales de densidad neuronal y extensión variable, que participan en todas la actividad
fisiológica y patológica del SNC (Emes y Grant, 2012).
La neurona pre-sináptica almacena en su citoplasma vesículas que contienen moléculas
químicas denominadas neurotransmisores, que se utilizan para transmitir información a la
neurona post-sináptica en los sitios de sinapsis; estas moléculas se sintetizan en las propias
neuronas, a través de rutas metabólicas ya bien conocidas para la mayoría de los
neurotransmisores. De estos, existen dos modalidades básicas: los neurotransmisores
excitadores (como el glutamato y la acetilcolina) y los inhibidores (como el ácido gamaaminobutírico, GABA, y la glicina). Los excitadores favorecen que el mensaje químico se
propague por una red neuronal, mientras que los inhibitorios impiden tal propagación
(Holz y Fisher, 2011).
Para que los neurotransmisores cumplan su función en la sinapsis, se requiere la
presencia de ciertas proteínas integrales bastante complejas en la membrana postsináptica, denominadas receptores de membrana. Estos receptores son específicos para
cada neurotransmisor, expresan en sus dominios extracelulares sitios de unión para los
neurotransmisores y responden de dos formas generales de acuerdo a si son de tipo
ionotrópico o metabotrópico. Una vez que un neurotransmisor interactúa con su sitio de
unión en un receptor ionotrópico, se abre un canal o poro en la estructura del receptor,
facilitando la entrada de iones al interior del citoplasma de la neurona; el tipo de ion que
entra dependerá del tipo de neurotransmisor y del tipo de receptor que participen en la
sinapsis (Hille y Catterall, 2011); así por ejemplo, en una sinapsis glutamatérgica, donde el
neurotransmisor es el ácido glutámico (glu) e interactúa con receptores que contienen
canales para cationes, los iones que fluyen son Na+ y K+, en una sinapsis típicamente
excitadora (Figura 4). En cambio, en una sinapsis GABAérgica, en la que el neurotransmisor
es el GABA y sus receptores son canales para aniones, el ión que se moverá será Cl - y es una
sinapsis típicamente inhibidora. Estas sinapsis son de acción rápida, pues los efectos postsinápticos del flujo de iones se miden en la escala de los milisegundos.
Por otro lado, los receptores metabotrópicos median respuestas neuronales más lentas
y duraderas, que se miden en escalas de minutos, horas y aún días. Es estos casos, la unión
de un neurotransmisor con su receptor desencadena una respuesta post-sináptica que
involucra la activación de proteínas G, producción de segundos mensajeros, activación
intracelular de cinasas de diferentes tipos, y aún la activación de genes específicos
(Zachariou et al., 2011). El glu y el GABA, así como otros neurotransmisores como la
dopamina y la acetilcolina, pueden generar este tipo de respuestas cuando se unen a
receptores particulares de tipo metabotrópico (Figura 4).
Potencial de acción
Cuando en una sinapsis se liberan los neurotransmisores y estos contactan con
receptores de tipo ionótropico en la membrana post-sináptica, se verifica un fenómeno de
transducción, que se caracteriza por la conversión del estímulo químico que representan
los neurotransmisores, en un fenómeno eléctrico que recorre toda la membrana postsináptica hasta el siguiente contacto sináptico con otra neurona. Tal fenómeno eléctrico se
denomina potencial de acción, y básicamente es un fenómeno que ocurre a nivel de la
membrana de las neuronas.
Figura 4. Elementos básicos de una sinapsis. Se muestran los elementos pre-sinápticos y
los post-sinápticos básicos.
Como en todas las células del organismo, la membrana plasmática de las neuronas está
constituida por una dobla capa de fosfolípidos con la presencia de una variedad de
proteínas de membrana de todos los tipos. Considerando la carga de los principales iones
que se encuentran del lado extracelular (LE) e intracelular (LI) de la membrana neuronal de
los mamíferos, se observa una polarización de las cargas (McCormick, 1999): el LE contiene
concentraciones altas de Na+ y Cl-, mientras que el LI está más concentrado en K+ y Ca2+;
esta situación se puede expresar como una medida del voltaje que resulta de la diferencia
de cargas entre el LE y el LI, que es de alrededor de -60mV, y que se conoce como el
potencial de reposo de la membrana neuronal, mantenido por una serie de bombas
iónicas y transportadores de membrana que exigen un gasto energético muy importante
para el organismo. Cuando se verifica la liberación de neurotransmisores y la unión de estos
con sus receptores post-sinápticos, los receptores abren sus canales iónicos de acuerdo a la
explicación previa. En el caso de las sinapsis excitadoras, en donde los receptores contienen
canales para cationes, estos se moverán de acuerdo a su gradiente de concentración, es
decir, de donde están más concentrados a donde lo están menos. En estas condiciones será
el Na+ el que preferentemente se moverá del LE al LI, moviendo el potencial de reposo hacia
lo positivo. Dependiendo de la cantidad de receptores que reciban el estímulo químico y de
la cantidad de Na+ que fluya hacia el citoplasma, el potencial de la membrana puede
cambiar desde -60mV hasta cerca de los +40mV; esta situación se conoce como
despolarización, y en la visualización gráfica del voltaje de la membrana se observa como
una subida rápida de la línea de voltaje. El flujo de Na+ hacia el LI se contrarresta pronto con
un flujo en dirección contraria de cargas positivas (representadas por iones K+) hacia el LE,
mediante la apertura de canales iónicos activados por el cambio en el voltaje de la
membrana, que rápidamente la regresan a su condición de reposo, en un proceso llamado
repolarización. La sucesión de una despolarización seguida de una repolarización es lo que
se conoce como potencial de acción, sucede en unos milisegundos y es la base de la
capacidad de respuesta de las neuronas (Koester y Siegelbaum, 2000) (Figura 5). Una vez
generado el potencial de acción en un punto determinado de la membrana neuronal, este se
propagará por la misma membrana, debido a la apertura de canales de Na+ y de K+ en los
puntos subyacentes a la región de inicio, hasta la terminal axónica más cercana, que además
de presentar los canales de Na+ y K+ que mantienen el potencial de acción, también
presentan canales de Ca2+ sensibles al voltaje, que al abrirse generan una corriente entrante
de Ca2+ (el gradiente de concentración de Ca2+ va del LE al LI) que impulsa la liberación de
neurotransmisores en ese punto, repitiéndose el ciclo de liberación pre-sináptica y
despolarización post-sináptica. Este ciclo de retroalimentación permanece por un tiempo
(algunos minutos) y luego se extingue espontáneamente al retirar el estímulo inicial
(Schneggenburger et al., 2012).
Ahora bien, cuando el neurotransmisor es un inhibidor, entonces se abrirán canales para
aniones y el flujo será preferentemente de Cl-, que se moverá también a favor de su
gradiente de concentración desde el LE hacia el LI, haciendo aún más negativo el LI,
llevando el voltaje de -60mV a valores de hasta -100mV. Cuando esto sucede se denomina
hiperpolarizacion, e implica la no generación de potenciales de acción y por ende la
terminación de la comunicación sináptica.
Figura 5. Potencial de acción. Se muestra la dinámica de apertura y cierre de canales de
Na+ y K+ para la generación del potencial de acción.
II. Hiperexcitabilidad
El SN funciona mediante una regulación precisa de la inhibición y la excitación neuronal,
y cualquier desbalance produce alteraciones funcionales en los individuos. Algunas
situaciones que conllevan alteraciones fisiológicas progresivas, o cambios anatómicos
importantes en alguna región del cerebro, puede producir alteraciones en la excitabilidad
de neuronas independientes, o de grupos de neuronas interconectadas, favoreciendo la
excitación por sobre la inhibición, generando así hiperexcitabilidad nerviosa (Rudolph, et
al., 2007; Yizhar, et al., 2011). Después de un tiempo, las neuronas sincronizan sus
potenciales de acción, que se vuelven más rápidos (mayor frecuencia) y generan más
voltaje (mayor amplitud). Este fenómeno se puede registrar mediante electrodos que se
colocan bien en la superficie del cerebro en los humanos, o bien dentro del tejido nervioso
en modelos animales, conectados a un aparato llamado polígrafo. De esta forma se obtiene
un registro denominado potencial de campo, que se puede visualizar como un gráfico que
representa la actividad sumada de un número determinado de neuronas (un
electroencefalograma, o EEG), el cual se compone de espigas de frecuencia y amplitud
variables (Figura 6). En algunas ocasiones la hiperexcitabilidad es un fenómeno pasajero
que se extingue de manera espontánea después de algunos minutos sin tener consecuencias
posteriores para el funcionamiento de la red neuronal donde se originó; bajo ciertas
circunstancias, esta actividad permanece y además se disemina reclutando neuronas
adyacentes a la red donde se originó, generando descargas de mayor frecuencia y amplitud
que pueden derivar en la formación de un foco epiléptico en el cerebro.
Figura 6. Segmento de un EEG. Obtenido de una rata en condición experimental que
presenta actividad epileptiforme. En el lado derecho se observan espigas de alta frecuencia
y amplitud. Abreviaciones: HL: hipocampo derecho; HR: hipocampo izquierdo.
III. Hiperexcitabilidad neuronal y epilepsia
Las enfermedades cerebrales asociadas a la hiperexcitabilidad neuronal son aquellas que
se desencadenan por una lesión inicial, la cual puede deberse a: a) infecciones del sistema
nervioso central, b) accidentes cerebrovasculares, c) traumas craneales, d) malformaciones
congénitas e) deficiencias metabólicas y f) eventos de hipoxia-isquemia. La epilepsia es una
de las principales enfermedades de este tipo y la abordaremos en este capítulo, ya que se
considera que la actividad epiléptica es el resultado de un desequilibrio entre la actividad
excitadora e inhibidora, la primera debido a un incremento del neurotransmisor glu y la
segunda por una disminución de los niveles de GABA, (Rowley, et al., 1995; Tapia, et al.,
1999; Medina-Ceja et al., 2000), lo que genera este estado de hiperexcitabilidad neuronal.
La incidencia de la epilepsia en grupos poblacionales correspondientes a países
industrializados occidentales es consistente con un rango de 25 a 50 casos por 100, 000
personas/año
(Kotsopoulos,
et
al.,
2002).
No
obstante
se
observa
una
tasa
considerablemente mayor en países en vías de desarrollo como la presente en áreas rurales
de Chile donde existe una incidencia de 114 casos por 100, 000 personas/año (Lavados, et
al., 1992). En Latinoamérica se estima que al menos 5 millones de personas sufren de esta
enfermedad, de los cuales se calcula que 1 millón se encuentran en nuestro país (Ávila,
2004). En los estudios de incidencia por edad
se ha observado que en los países
industrializados la epilepsia predomina en los extremos de la vida, con 50% de los casos
iniciando antes de la adolescencia y 25% posterior a los 60 años de edad. En cambio en los
países en vías de desarrollo, la mayoría de la población epiléptica está constituida por
adultos jóvenes (Lavados, et al., 1992; Rwiza, et al., 1992; Tekle-Haimanot, et al., 1997). Dicha
disociación se ha relacionado con la naturaleza y origen de las crisis en los diferentes
contextos.
La liga Internacional contra la epilepsia (ILAE, 1981), es una asociación ampliamente
reconocida por investigadores y clínicos que estudian la epilepsia a nivel global y ha
clasificado esta enfermedad en dos grupos principales y un tercer grupo de convulsiones no
clasificadas. En las crisis parciales o focales la descarga excesiva se restringe a un área
específica del cerebro y las manifestaciones clínicas dependen de la representación
funcional de esta área. Cuando una crisis parcial no produce alteración de la conciencia se
denomina crisis parcial simple, si la conciencia está alterada se denomina crisis parcial
compleja. Mientras que las crisis generalizadas involucran todo el cerebro y su principal
manifestación son las convulsiones generalizadas. El tercer grupo son de difícil clasificación.
Respecto al origen, las epilepsias se dividen en tres grandes grupos: las idiopáticas a las
cuales se les puede atribuir un origen genético, las sintomáticas que se consideran
adquiridas y en donde es posible reconocer un factor causante, y las criptogénicas donde no
se conoce el factor causante (Dreifuss, et al., 1994; Berkovics y Scheffer, 2001).
Otra clasificación de la ILAE (1989) contempla cuatro grupos. En el primero se
encuentran las epilepsias focales y en el segundo grupo se establecen las epilepsias
generalizadas. Ambos grupos comparten criterios similares de clasificación, incluyendo los
elementos de orden idiopático, sintomático y criptogénico. En tanto que el tercer grupo
contempla las epilepsias sin determinar y en el cuarto grupo se encuentran los síndromes
especiales (Cuadro 2).
Dentro de las epilepsias focales sintomáticas, la epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es la
más frecuente y resistente a fármacos (Engel, et al., 1993), afecta al menos 20% de todos los
pacientes con epilepsia (Babb, 1999). El hipocampo es la estructura cerebral más asociada a
la generación de descargas en la ELT,
sin embargo,
existe evidencia de que otras
estructuras también participan, como el caso particular de la corteza entorrinal (CE), ya que
presenta extensas conexiones recíprocas entre la propia CE, el hipocampo y otras áreas
cerebrales, lo que la hacen un candidato potencial para la generación y propagación de
descargas en este tipo de epilepsia (Bartolomei, et al., 2005). Se ha sugerido que las capas
profundas de la CE son las responsables del inicio de la actividad epileptiforme, a este
respecto existe evidencia donde se ha encontrado pérdida neuronal en la capa III de la CE
tanto en pacientes con ELT, como en el modelo animal de este tipo de epilepsia (Fountain,
et al., 1998; Tolner, et al., 2005).
Modelos experimentales de Epilepsia
Para poder investigar y conocer con mayor detalle esta patología es necesario trabajar con
modelos experimentales por obvias razones de ética profesional. Aunque los modelos
animales de epilepsia no explican todas las etiologías complejas y la variedad de síndromes
que han sido identificados en humanos, si han permitido la determinación de los mecanismos
celulares y moleculares básicos de la epileptogénesis y su relación con el daño cerebral
(Figura 7).
Cuadro 2. Clasificación de las epilepsias, síndromes epilépticos y desórdenes relacionados
con crisis, propuesta por la Liga Internacional Contra la Epilepsia (ILAE, 1989).
1. Focal, local, parcial
2. Generalizada
3. Epilepsias sin
4. Síndromes especiales
determinar
Idiopática (primaria)
1.1
Epilepsia infantil benigna con
espigas centrotemporales.
Idiopática (secundaria)
2.1
Convulsiones infantiles
benignas
Epilepsia infantil con
paroxismos occipitales
Epilepsia mioclónica
benigna de la infancia
Epilepsia de lectura primaria
Epilepsia de ausencia
infantil
Epilepsia de ausencia
juvenil
Epilepsia mioclónica
juvenil (petit mal)
Epilepsia con crisis gran
mal en estado vigilia
3.1
4.1
Con crisis ficales y
generalizadas
Crisis relacionadas a la
situación
Crisis neonatales
Convulsiones febriles
Epilepsia mioclónica severa de
la infancia
Epilepsia con continuas
espigas-ondas durante el sueño
Afasia epiléptica adquirida
(Síndrome de Landau-Kleffner)
Sin características inequívocas
focales o generalizadas
Crisis aisladas o estatus
epilepticus aislado
Crisis que ocurren solo cuando
hay un evento agudo o tóxico
debido a factores como alcohol,
drogas, eclampsia.
Epilepsia de los reflejos.
Otras epilepsias idiopáticas
generalizadas
Sintomática (secundaria)
1.2
Epilepsia del lóbulo temporal
Epilepsia del lóbulo occipital
Epilepsia progresiva crónica
Criptogénica
1.3
Definido por:
Tipo de Crisis
Características clínicas
Etiología
Localización anatómica
Criptogénica o sintomática
2.3
Síndrome de West (espasmos
infantiles,
Blitz-Nick-Salaam Krampfe
Síndrome de Lennox-Gestaut
Epilepsia con crisis (astática)
Epilepsia con ausencia
mioclónica
Existen dos tipos de modelos animales, agudos y crónicos, en los primeros se utilizan
drogas como la picrotoxina, la bicuculina y la 4-aminopiridina (4-AP), y se les considera
modelos de convulsión más que de epilepsia. Los modelos crónicos por su parte deben
cambiar la estructura y función del cerebro para hacerlo genuinamente epiléptico, es decir,
capaz de presentar descargas epilépticas espontáneas, recurrentes y sin necesidad del
estímulo original. Entre los modelos crónicos está el denominado “kindling” estimulación
eléctrica periódica de ciertas regiones del cerebro, la aplicación de toxina tetánica
intracerebral, el modelo de ácido kaínico, pilocarpina y el de estimulación eléctrica sostenida.
Otros modelos de gran utilidad que no entran dentro de los grupos anteriores por no llevarse
a cabo en el cerebro intacto del animal, son los modelos in vitro, en los cuales se utilizan
rebanadas de cerebro de alguna área específica y los modelos de simulaciones
computacionales denominados in silico (Simon, et al., 2014; Ben-Ari y Cossart, 2000).
Figura 7. Modelos de animales de epilepsia y crisis convulsivas (Lösher, 2011).
Abreviaciones: DBA cepa genética de epilepsia de ausencia, MES electroshock máximo, PTZ
pentilentetrazol; SE status epilepticus, AK ácido kaínico.
En particular, dos de los modelos que más se aproximan a la ELT en humano y los más
utilizados por investigadores, son el de la administración intracerebral de ácido kaínico (AK)
y pilocarpina en ratas (Bragin, et al., 1999a; Bragin, et al., 2004). Está demostrado que la
pilocarpina actúa en los receptores muscarínicos tipo M1 y M2 de la vía colinérgica (Figura
8), y que la activación del receptor M1 por la pilocarpina produce diacil-glicerol (DG) y
trifosfato de inositol (IP3) por la activación de la fosfolipasa C, lo que resulta en una
alteración de las corrientes de Ca2+ y K+ así como un incremento en la excitabilidad cerebral
(Segal, 1988). Las altas concentraciones de Ca 2+ promueven la liberación de glu, induciendo
hiperexcitabilidad neuronal y un estado epiléptico (SE) (Klan, et al., 1999; Smolders, et al.,
1997). Por otra parte, la activación de los receptores tipo NMDA por este glu liberado
promueve el incremento en la expresión de la proteína GAP-43, que se encuentra asociada a
la propagación de las fibras musgosas y a la generación de plasticidad del hipocampo,
características morfológicas encontradas en la ELT (McNamara, et al., 1995).
Figura 8. Mecanismo de acción de pilocarpina en los receptores muscarínicos tipo
M1 y M2 (Scorza, et al., 2009). Abreviaciones: R-NMDA receptor de glutamato tipo Nmetil-D-aspartato, R-AMPA receptor de glutamato tipo acido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil4-isoxazolpropionico.
El daño excitotóxico que desencadena la inducción del SE por pilocarpina, conduce a un
daño inmediato celular, que puede durar de minutos a horas, y resulta en un proceso de
neurodegeneración que varía de semanas a meses. La propagación axonal de las fibras
musgosas representa un cambio morfológico característico de una respuesta reactiva del
organismo a la pilocarpina (Spigelman, et al., 1998). Estos eventos inmediatos o a largo
plazo, pueden modificar el ambiente celular a través de cambios en el gradiente iónico,
alteraciones en la expresión génica (como receptores, factores tróficos, enzimas, proteínas
del citoesqueleto y proteínas de la matriz), así como la fosforilación de macromoléculas.
Además, las crisis inducidas por pilocarpina pueden provocar una gliosis reactiva generada
por la muerte celular inducida por las convulsiones durante el periodo crónico. Estas
modificaciones promueven el remodelamiento sináptico, el cual puede cambiar la
excitabilidad de las neuronas de las estructuras temporales, llevando a la aparición de un
daño cerebral y una hiperexcitabilidad continua. La ELT ha sido relacionada con una
excitabilidad excesiva en estructuras límbicas y una baja función de las vías inhibidoras,
como consecuencia, se presentan alteraciones en la neurotransmisión, modificando la
transducción de señales, que cambian el metabolismo neuronal y la expresión génica
(Cavalheiro, et al., 2006).
Patrones de actividad eléctrica cerebral asociados a la epilepsia
En pacientes con ELT, así como en modelos crónicos de ELT inducidos por pilocarpina o
AK se han observado dos patrones de actividad eléctrica cerebral, las oscilaciones de alta
frecuencia de 250 a 500 Hz llamadas en inglés “fast ripples” (FRs), (Bragin, et al., 1999b,
2004), (Cuadro 3, Figura 9) que ocurren particularmente en giro dentado, región CA1 y
CA3 del hipocampo, así como en el subículo y la corteza entorrinal; en el caso de los
modelos, esta actividad solo se presenta
en ratas que exhiben crisis espontáneas-
recurrentes, y no en aquellas que han sido sometidas a SE sin presentar crisis espontáneas
(Bragin, et al., 1999a). El segundo patrón es una actividad de alta frecuencia que oscila en el
rango de frecuencias de 80-250Hz, llamadas en inglés “ripples” (Buzsaki, et al., 1992), y que
se han observado en regiones cerebrales donde no se presentan en condiciones fisiológicas
como es el caso del giro dentado (Buzsaki, et al., 1992), no obstante algunos trabajos han
mostrado que puede haber ondas patológicas menores de 200Hz (Worrell, et al., 2004) y
ondas fisiológicas mayores de 600 Hz (Baker, et al., 2003).
Estudios electrofisiológicos han demostrado que las FRs reflejan potenciales de campo
generados por ráfagas hipersincrónicas de espigas poblacionales de las neuronas epilépticas
(Bragin, et al., 1999a, 2002; Staba, et al., 2002). Recientemente se detectó que estos
potenciales de campo corresponden a corrientes postsinápticas glutamatérgicas (EPSCs)
(Menendez y Trevelyan, 2011) y que también contribuyen las corrientes postsinápticas
inhibidoras (IPSCs) GABAérgicas provenientes de células piramidales e interneuronas,
respectivamente (Bragin, et al., 2011). Se sabe que el volumen promedio de tejido que genera
las FRs es de 1.0 mm3 donde se localizan grupos pequeños de neuronas interconectadas
patológicamente (GPNP) (Bragin, et al., 2000) y formadas tempranamente para generar esta
actividad hipersincrónica anormal (Bragin, et al., 1999a, 2002a).
Existen al menos cuatro mecanismos que pudieran explicar la formación de este GPNP:
las uniones comunicantes (McVicar, et al., 1982; Traub, et al., 1999), el deterioro local de la
transmisión inhibidora (Prince, 1997), la fusión celular y el reforzamiento de las conexiones
excitadoras locales (Schwartzkroin, 1983). De estas, la transmisión sináptica excitadora
recurrente y las uniones comunicantes axo-axonales son sumamente importantes para la
generación de FRs (Le Van Quyen, et al., 2006).
La importancia de este tipo de patron de actividad electrica denominada FRs asociada a la
epilepsia se basa en el hecho de que es una actividad interictal patologica que se presenta
antes y durante la fase cronica en el hipocampo y la CE en modelos animales con AK y
pilocarpina, así como en el foco epileptico de pacientes con ELT. Las FRs juegan un papel
importante en la epileptogenesis del hipocampo, al actuar como generadoras de
modificaciones sinapticas patologicas en areas específicas del cerebro. De esta manera, las
FRs se consideran una actividad interictal patologica que causa las crisis epilepticas y el
mecanismo neuronal responsable de la ELT en humanos y en los modelos experimentales.
Por tal motivo se ha estudiado el potencial de las FR como biomarcador para detectar las
zonas epileptogenicas, debido a su presencia interictal y su relacion posterior con la
presencia de focos epilepticos solo en aquellas regiones cerebrales donde se observan.
Ademas, la actividad de FRs es estudiada principalmente en regiones hipocampicas y
comprobada tanto en modelos experimentales como en pacientes con ELT.
Cuadro 3. Principales características electroencefalográficas de las FRs en ratas y pacientes
con ELT (Bragin, et al., 1999 a y b).
FRs en ratas:
FRs en humanos con ELT:
Frecuencia: 200-600 Hz
Frecuencia: 250-500Hz
Promedio: 1-6/min
Promedio: 0.5-6/min
Amplitud: 0.2 y 1.5 mV
Amplitud: 100-400 μV
Duración: 15-100 ms
Duración: 15-100 ms
Localización: Giro dentado, CA1 y CE
Localización: Hipocampo y CE
A
B
C
Figura 9. Fast Ripples (FRs) espontáneas de 400 Hz, registradas en el giro dentado de
una rata con crisis crónicas inducidas por la inyección unilateral intrahipocámpica
de ácido kaínico. En A se muestran las espigas interictales que contienen a las FRs dentro
de una actividad en el EEG; en B se muestran los trazos en forma extendida y en C, se
presenta la actividad con un filtro de 80 Hz. Los tiempos de la derecha en cada trazo
corresponden a la línea de calibración horizontal, al final de la figura y la línea vertical
corresponde a 1.0 mV para los trazos en A, 0.5 mV para B y 0.2 mV para C (Medina-Ceja, et
al., 2003).
Finalmente, existen trabajos clínicos en los que se ha considerado a las FRs como
biomarcador de la zona epileptogenica para la reseccion de tejido cerebral en pacientes con
ELT obteniendo muy buenos resultados en cuanto a la desaparicion de las crisis o su
disminucion (Akiyama, et al., 2011).
IV. Métodos de estudio de la hiperexcitabilidad nerviosa
Con el objeto de conocer mejor el funcionamiento del SNC tanto en el estado normal, así
como patologico, existen diversas estrategias metodologicas, la cuales van desde la obtencion
de signos y síntomas de alguna alteracion nerviosa por un profesional de la salud, hasta
estudios mas elaborados en los que se incluyen el uso de metodologías sumamente
sofisticadas para la obtencion de imagenes, actividad electrofisiologica y alteraciones
bioquímicas relacionadas con alguna patología que involucre un estado de hiperexctabilidad.
Estos metodos de estudio, tambien se utilizan en modelos de experimentacion para tratar de
entender mejor los principios basicos de las diversas alteraciones neurologicas. En esta
seccion y dado nuestro campo de estudio se mencionaran brevemente los metodos
electrofisiologicos y neuroquímicos y su relacion conductual como herramientas importantes
del estudio de la hiperexcitabilidad.
La actividad conductual se basa en la observacion directa de un sujeto de estudio bajo
condiciones controladas de laboratorio y si se trata de estudiar la hiperexcitabilidad existen
diversos modelos de induccion. En la comunidad científica, Racine (1972) establecio una
escala de alteracion conductual en animales de experimentacion ampliamente reconocida
para valorar el nivel de excitabilidad del sistema nervioso central.
El estudio de la actividad electrofisiologica se puede llevar a cabo de manera no invasiva
y/o invasiva, dependiendo del estudio que se desee realizar. En el caso del ser humano
regularmente se colocan electrodos de superficie en el cuero cabelludo para obtener la
diferencia de potencial (voltaje) que resulta de la actividad cerebral, tanto en condiciones
normales como patologicas. En el caso de animales de experimentacion es posible colocar
electrodos de superficie en el craneo, así como en regiones mas profundas del SNC y obtener
informacion electrofisiologica sumamente relevante. Para la determinacion de las
alteraciones bioquímicas a traves de la medicion de neurotransmisores, existe el gran
inconveniente de la resolucion temporal, ya que las actividades conductuales y
electrofisiologicas se pueden obtener en tiempo real, mas no así las alteraciones bioquímicas,
ademas que a la fecha es requisito indispensable la obtencion de: tejido, fluido biologico
(líquido cefalorraquídeo, dializado cerebral, sangre u orina). Igualmente, se debe de tomar en
cuenta que la medicion de neurotransmisores o sus metabolitos a nivel periferico no
necesariamente reflejaran una relacion directa entre los estados de hiperexcitabilidad y las
alteraciones bioquímicas a nivel central. Para la medicion de neurotransmisores y sus
metabolitos, la tecnica de microdialisis intracerebral se ha utilizado como herramienta
principal, que a su vez esta acoplada principalmente a la cromatografía de líquidos de alta
resolucion, la cual incluye diversos metodos de separacion y deteccion, como pueden ser la
fluorescencia, densidad optica y electroquímica principalmente, lo que depende del grupo de
sustancias a separar y a analizar (Morales y Tapia 1996; Parrot et al., 2004). Para este
procedimiento se requiere de un equipo sofisticado, gran entrenamiento y el analisis
consecutivo de muestras que se colectan de manera periodica, lo que proporciona la
resolucion temporal, es decir, si cada colecta de dializado dura 15 minutos, entonces se estara
monitoreando el promedio de los eventos bioquímicos cerebrales por el mismo lapso. A pesar
de esta enorme desventaja de resolucion temporal, los procesos cromatograficos continuan
siendo el punto de referencia para la implementacion de otras metodologías.
Nuestro grupo de trabajo interesado en encontrar una mejor relacion entre las actividades
conductuales, electrofisiologicas y su relacion con las alteraciones bioquímicas durante la
hiperexcitabilidad ha implementado metodologías alternas para acercarse mas al tiempo real
con que suceden los cambios bioquímicos. Para lograr este objetivo, se han implementado el
uso de biosensores y reactores enzimaticos que a traves de reacciones acopladas pueden
identificar y medir un neurotransmisor de manera específica, ya sea colectando muestras a
alta velocidad o bien mediante la deteccion “en línea” del compuesto de interes con
mediciones cercanas al tiempo real, es decir, 200 milisegundos. La gran ventaja de estos
nuevos metodos es que no se necesita la separacion de los componentes presentes en una
muestra, ya que la especificidad la proporcionan las enzimas y por lo tanto se ahorra mucho
tiempo en el proceso de analisis.
El uso de biosensores ofrece una buena alternativa para la cuantificacion de ciertos
neurotransmisores, como acido glutamico y acetilcolina. Estos metodos se basan en la
inmovilizacion de un grupo de enzimas sobre un alambre de platino que funciona como un
electrodo de trabajo de una celda electroquímica en la que se genera una corriente producida
por la oxidacion de peroxido de hidrogeno generado por la accion de oxidasas dirigidas a
estos dos neurotransmisores, esto es, glutamato oxidasa y acetilcolinesterasa y colina oxidasa
para la deteccion de estos dos neurotransmisores. Con esta metodología se ha logrado
identificar la participacion de estos neurotransmisores durante la actividad convulsiva con
una mejor resolucion que la normalmente se obtiene con procedimientos cromatograficos, es
decir de alrededor de 20 segundos (Morales-Villagran, et al., 2008). Otra alternativa
recientemente implementada por nuestro grupo de trabajo es la utilizacion de reactores
enzimaticos, con lo cual se tiene la oportunidad de identificar neurotransmisores con incluso
una mayor resolucion temporal, ya que a diferencia de los biosensores, las enzimas
contenidas en las mezclas de reaccion estan en solucion por lo que su actividad se preserva
de mejor manera que en un biosensor, esto por no estar inmovilizadas. Las enzimas que se
utilizan son basicamente las mismas, es decir oxidadas para la produccion de peroxido de
hidrogeno, el que se mide ahora con un metodo fluorescente, mediante la utilizacion del
metodo AMPLEX RED, compuesto que genera el derivado fluorescente “resorufina” producto
de la oxidacion del peroxido de hidrogeno por accion de la enzima peroxidasa. En la Figura
10 se muestra los principios enzimaticos utilizados para identificacion y cuantificacion de
acido glutamico y acetilcolina
paraDEelMEDICIÓN
uso de biosensores
y reactores
enzimaticos.
PRINCIPIOS
DE ACIDO GLUTÁMICO
Y
ACETILCOLINA POR PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DE
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Ácido glutámico
Ace lcolina
Glutamato oxidasa
Ace l
colinesterasa +
colina oxidasa
1.- Oxidación sobre superfic
i
e de pla no
Biosensores y detección electroquímica
Alfa ceto glutarato + NH3
Betaina +
H2O2
TRES ALTERNATIVAS DE
MEDICIÓN DEL PERÓXIDO:
2.- Detección quimioluminiscente (Luminol)
3.- Detección fluorescente (AMPLEX RED)
(La oxidación del H2O2 se realiza en
presencia de peroxidasa)
Figura 10. Principios de medición de ácido glutámico y acetilcolina por producción
enzimática de peróxido de hidrógeno.
Mediante el proceso de microdialisis acoplado a esta metodología se ha logrado
monitorear la actividad bioquímica cerebral con un alto grado de resolucion temporal
cercano al tiempo real, con lo que se logra establecer mejor la relacion conductual y
electroencefalografica
con
las
alteraciones
bioquímicas
durante
periodos
de
hiperexcitabilidad. En la Figura 11 se muestran resultados obtenidos con estos metodos
alternos, con lo que se puede observar que la hiperexcitabilidad puede relacionarse
directamente con un aumento en la concentracion extracelular de acido glutamico.
Figura 11: Relación entre la cuantificación de neurotransmisores y la actividad
eléctrica en un modelo animal de inducción de hiperexcitabilidad. Abreviaciones: UA:
unidades arbitrarias; LC: corteza izquierda; RC: corteza derecha; LH: hipocampo izquierdo;
RH: hipocampo derecho.
Esta composicion muestra la relacion entre la concentracion de acido glutamico y la
actividad electroencefalografica, ambas actividades fueron monitoreadas simultaneamente;
los cambios en la concentracion de acido glutamico se realizaron mediante la implantacion de
una sonda de dialisis en el hipocampo derecho con una resolucion temporal de 200
milisegundos por muestra, antes durante y despues de la administracion de soluciones
control de potasio alto y del convulsivante 4-aminopiridina (a, b y c). La actividad
electroencefalografica se monitoreo en las cortezas frontales izquierda y derecha (LC y RC) y
los hipocampos izquierdo y derecho (LH y RH). Se pueden observar claramente que los
cambios en la concentracion de acido glutamico estan relacionados con alteraciones en la
actividad electroencefalografica.
En conclusion, los metodos de estudio evolucionan de manera continua y no existe una
tecnica o metodo que sea definitivo para el estudio de las funciones cerebrales durante la
hiperexcitabilidad. Las perspectivas que se manejan a futuro son la utilizacion de tecnicas no
invasivas para la medicion de neurotransmisores, así como para el registro de la actividad
funcional. Los metodos basados en la espectroscopia de sustancias de interes in vivo,
pudieran resolver este objetivo, sin embargo por el momento tienen muchas limitaciones en
lo que se refiere a la especificidad de un compuesto en particular, como podría ser un
neurotransmisor.
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