Download Aplicacion de la técnica análitica IRAM 29107-1 para el

La experiencia de Mar del Plata en
la Aplicación de la norma IRAM
29107‐1 para determinación de
Bacterias Coliformes y E.coli en
agua para consumo
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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSE
Mar del Plata‐Batán‐Est.Chapadmalal
Red de Agua
 Población con agua potable: 97 %
 Producción anual promedio de agua: 139.000.000 m3
 Radio servido de agua: 2.288,52 kilómetros de conductos
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3
SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSE
Red de Agua
ABASTECIMIENTO: 300 perforaciones
SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN: tres subsistemas:
 Sistema Acueducto Norte
 Sistema Acueducto Sur
 Sistema Impulsión directa
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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSE
Red de Agua
 1) Acueducto Norte
 Se abastece por medio de 96 pozos de extracción.
 Tiene una longitud de 24,5 Km.
 El pozo de extracción mas lejano se ubica en el límite con el Partido de Mar Chiquita,
 El agua de las perforaciones es captada e impulsada hacia el acueducto norte, luego es rebombeada desde 5 Estaciones Elevadoras.
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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSE
Red de Agua
2) Acueducto Sur
 Se abastece por medio de 26 pozos de extracción que
bombean al acueducto a presión.
 La longitud del acueducto es de 15 Km.
 Existen dos partes altas en la zona del Acueducto Sur
alimentadas por rebombeo.
 En el extremo del Acueducto Sur se ubica la Estación
Elevadora Mario Bravo que cuenta con un tanque
elevado y una cisterna, donde se almacena el agua no
consumida en el acueducto a través de sus derivadoras.
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SISTEMA DE ABASTECIMIENTO DE OSSE
Red de Agua
3) Pozos en red
 Aquellas zonas en las cuales no es posible su
alimentación desde las estaciones elevadoras se
abastecen desde pozos en red.
 El total de pozos en red en la ciudad de Mar del Plata
es de 97.
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PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS •
Asegurar la Calidad del Agua para consumo Humano. Sistema de abastecimiento
de OSSE.
Pozos
"Monitoreo de la calidad bacteriológica y físico ‐ química de los pozos de OSSE"
Red
" Monitoreo y control de la calidad bacteriológica y físico ‐ química de la red de distribución
de agua"
Asistencia a otras áreas de la empresa
"Asistencia a Recursos Hídricos en el control de calidad de nuevos pozos de OSSE y
perforaciones particulares".
"Atención a otras áreas de la empresa (Planta envasadora, Seguridad e Higiene, reclamos,
órdenes de trabajo, inspecciones, empalmes, arreglos, etc.)"
Plan de Promoción Social
"Monitoreo y control de la calidad del agua de consumo en dependencias municipales y
escuelas municipales y provinciales"
"Atención a solicitudes institucionales (hospitales, poder judicial, entidades sin fines de
lucro, convenios con entidades barriales, etc.)
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PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS Monitoreo Ambiental. Manejo Costero Integrado
Sistema cloacal: "Monitoreo y control de efluentes industriales, evaluación ambiental e
incidencia en el sistema cloacal"
"Caracterización del efluente cloacal de la ciudad".
• "Caracterización y monitoreo del efluente líquido"
• "Caracterización y monitoreo del efluente sólido"
• "Caracterización y monitoreo del potencial tóxico de los sólidos cloacales"
• "Análisis y evaluación del tratamiento del barro cloacal“
"Caracterización de los residuos transportados por camiones atmosféricos"
Sistema pluvial: "Monitoreo de los desagües pluviales de la ciudad"
Medio marino receptor:
"Calidad recreativa del litoral marítimo de Mar del Plata"
"Calidad del ecosistema"
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PROYECTOS LABORATORIO DE AGUAS Aseguramiento de la Calidad.
Desarrollo de acciones para el aseguramiento de la
calidad analítica del Laboratorio de Aguas, para
lograr la acreditación de ensayos seleccionados
Atención a requerimientos particulares
Servicio de análisis y asesoramiento a terceros.
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METODOLOGÍA DE TRABAJO MONITOREO EN LA RED
Muestreo: 42 zonas de muestreo:
31 zonas de muestreo que incluyen puntos de red y pozos
que abarcan todo el radio servido de agua. Este
esquema es actualizado en forma permanente a
medida que se incorporan nuevas redes de agua al
mismo
11 zonas de muestreo en áreas rurales y periféricas a la
ciudad (sólo pozos)
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IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1
Ventajas
Tiempos de respuesta mucho menores: 3 a 5 días con NMP vs 24‐48 hs con FM con M Cromogénicos
Mayor capacidad analítica: Nº Mtras red 2014: 1505
Nº Mtras red 2015: 1899
Menor cantidad de horas hombre para procesar las muestras
Alerta Temprana de riesgo sanitario : Mejor capacidad de reacción ante un evento
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IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1
COSTO DE INSUMOS POR MUESTRA
MÉTODO DE ENSAYO
TUBOS MÚLTIPLES
CHROMOCULT
$ 37,10
$ 32,50
3- 5 días
24- 48 hs
Resultado final
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IMPLEMENTACIÓN DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA‐ NORMA IRAM 29107‐1
• Puesta a punto de la técnica
1. Participación en el comité iram
2. Participación reuniones RELAS
3. Capacitación en AySA
• Plan de trabajo para puesta a punto y validación
preliminar
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VALIDACIÓN PRELIMINAR
PRIMERA ETAPA
Objetivo:
• Identificación
y reconocimiento de la morfología y
características generales y bioquímicas de las colonias con los
medios de cultivo ensayados. Ensayo con cepas target y no
target (controles + y ‐)
• Capacidad de cada método para diferenciar precisamente la
bacteria de interés en presencia de los demás componentes
que se espera estén presentes en la matriz de la muestra
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METODOLOGÍA
Recuperación de cepas de referencia target y no target:
• Escherichia coli ATCC 25922
• Klebsiella pneumoniae ATCC 13833
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Se preparó una solución de trabajo realizando diluciones
con dichas cepas para lograr una mejor identificación de las
colonias
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METODOLOGÍA
Obtención de cepas de trabajo target y no target
Desarrollo de cepas de trabajo en Caldo TSA
Desarrollo de cepas de trabajo en Agar TSA
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 13833
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
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METODOLOGÍA
Equipamiento
Tren de filtración de acero inoxidable marca Sartorius
Bomba Sartorius para análisis microbiológico Mod. 166MP‐3: •Veloc flujo cte: 3,5 L/min
•Max Vacio: 0,2 bar
•Max Presión: 1,0 bar
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Equipamiento completo de Filtración bajo campana de flujo laminar OBRAS SANITARIAS Mar del Plata
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PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR
PRIMERA ETAPA
Norma de referencia ‐ medios de cultivo utilizados
• IRAM 29107‐1: 2006: Agar m‐ENDO LES, Marca Merck
• Nueva versión ISO 9308‐1 / IRAM 29107‐1:
Medios Cromogénicos: Agar Chromocult para coliformes
Merck más suplemento selectivo para Ecoli/Coliformes Merck
• Filtros de membranas utilizados: Esteres de celulosa de
0.45um tamaño poro y 47 mm diámetro, Marca PALL
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Metodología para la confirmación de las colonias según Norma IRAM 20107‐1: 2006
• Medio de Cultivo utilizado: Agar m‐ENDO LES
• Confirmación: Pruebas de oxidasa e indol.
• Criterio: Se transfieren un mínimo de 10 colonias típicas de la placa de agar m‐ENDO LES a Agar no selectivo (TSA) y Caldo Triptofano, respectivamente, para la posterior realización de las pruebas bioquímicas confirmatorias.
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Metodología para la confirmación de las colonias según medios cromogénicos – Chromocult Coliform Agar SEGÚN NORMA IRAM 29107‐1 (2° edición)
• Medio de Cultivo utilizado: Chromocult Coliform Agar +
suplemento selectivo E. coli/Coliformes
• Confirmación: Prueba de oxidasa para coliformes no E.coli. • CRITERIO: Se transfieren “n” colonias a confirmar, (según norma), a un Agar no selectivo, para su posterior confirmacón.
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Resultados
Comparación e identificación de Colonias target de Escherichia coli
en Agar ENDO‐LES y Agar Chromocult
AGAR ENDO‐LES: Colonias típicas con brillo metálico, (E.coli)
Colonias rojas sin brillo metálico (Coliformes no E.coli)
AGAR CHROMOCULT:
Colonias típicas azul‐
violetas, (E.coli)
Colonias rosadas (Coliformes
no E.coli)
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Resultados
Comparación colonias típicas target Escherichia coli en diversas diluciones
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Resultados
Identificación Bioquímica de las colonias típicas coliformes no E.coli
en AGAR CHROMOCULT : Etapa confirmatoria
Colonias típicas color salmón a rojo
Confirmación bacterias coliformes: reacción oxidasa negativa (‐)
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Resultados
Identificación Bioquímica de las colonias típicas en AGAR ENDO LES
Primer paso etapa confirmatoria: Repiques simultáneos de cada colonia típica en Caldo Triptofano y en Agar TSA
La turbidez en el medio indica el desarrollo de las colonias
Crecimiento de las colonias en Agar TSA
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Resultados Identificación Bioquímica de las colonias típicas en AGAR ENDO LES
Segundo paso etapa confirmatoria: Reacción confirmatoria de Indol y Oxidasa Reacción Indol: presencia de anillo color rojo, reacción Indol (+) Reacción Oxidasa: Coloración violeta, reacción oxidasa (+)
Coloración marrón o sin color, reacción oxidasa (‐)
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RESULTADOS
Criterio para expresión de los resultados
• A partir del recuento de colonias confirmadas en ambas
metodologías ensayadas, se calcula el número de bacterias
coliformes no E.coli y de E. coli presentes en 100 ml de la
muestra, de acuerdo a la siguiente fórmula:
• UFC de coliformes totales/100ml = (N° colonias coliformes no E.coli + N° colonias E.coli) x 100
volumen de muestra filtrada
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RESULTADOS CON CEPAS NO TARGET:
No se observó desarrollo en ninguno de los medios ensayados de las muestras inoculadas con Klebsiella pneumoniae ATCC 13833 y
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
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PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR
SEGUNDA ETAPA
Objetivos
• Cuantificación de las bacterias target en distintas matrices
reales (evaluación de la proporción de muestras negativas y
positivas correctamente identificadas) para los medios
ensayados de membrana filtrante y comparación con el
método de NMP.
• Establecimiento de los límites de trabajo en término de número de colonias
• Dilución adecuada de las muestras de rutina
• Rango de aplicación y limitaciones
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METODOLOGÍA VALIDACIÓN PRELIMINAR: segunda etapa
Nº Muest
ra
1
2
3
Descripción
Objetivos/ Observaciones
Muestra de efluente cloacal diluido
Comparación de la capacidad de cada
método para diferenciar precisamente
las bacterias target en una muestra de
efluente cloacal diluida (caso extremo)
Agua de red
Comparación de los resultados obtenidos
por las técnicas propuestas en una
muestra real de rutina
Agua subterránea‐ Pozos OSSE Comparación de los resultados obtenidos
por las técnicas propuestas en una
muestra real de rutina
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RESULTADOS PRELIMINARES
Muestra 1: Efluente cloacal diluido
UFC/100ml
MATRIZ ENDO LES
CHROMOCULT
EFLUENTE CLOACAL
Colif. E. Coli
Colif. E. Coli
Totales
Totales
NMP/100ml
Colif. Totales
E. coli
1
2.1 x10 5
2.5 x10 5
8.5 x10 5
1.5 x10 5
2.0 x10 5
1.0 x10 5
2
1.8 x10 6
8.0 x10 5
1.3 x10 6
1.0 x10 5
4.0 x10 5
2.0 x10 5
3
3.0 x10 4
1.0 x10 4
5.0 x10 4
2.0 x10 4
4.5 x10 5
2.4 x10 5
4
1.8 x10 5
1.0 x10 5
7.3 x10 4
8.0 x10 4
2.8 x10 5
5.4 x10 4
5
4.7 x10 5
1.3 x10 5
2.6 x10 5
5.2 x10 5
8.0 x10 5
3.0 x10 5
Resultados:
Comparación método filtración por membrana vs NMP, se observan resultados del mismo orden en las 5 muestras ensayadas.
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RESULTADOS PRELIMINARES
Muestra 3: Agua de red
UFC/100ml
MATRIZ ENDO LES
AGUA DE RED Colif. E. Coli
Totales
NMP/100ml
CHROMOCULT
Colif. E. Coli
Totales
Colif. Totales
E. coli
1
6
1
1
1
2.2; (0.26-8.1)
1.1; ( 0.03-5.9)
2
28
<1
6
<1
9.2; (3.1-21.1)
<1.1 (0-3.0)
3
180
<1
198
<1
>23.0; (13.5- ∞)
<1.1 (0-3.0)
4
6
<1
4
<1
3.6; (0.69-10.6)
<1.1 (0-3.0)
5
S/D*
S/D*
>200
2
>23.0; (13.5- ∞)
12.0; (4.3-27.1)
6
29
<1
1
<1
12.0; (4.3-27.1)
<1.1 (0-3.0)
7
60
2
4
<1
2.2; (0.26-8.1)
<1.1 (0-3.0)
8
<1
<1
<1
<1
<1.1; (0-3.0)
<1.1 (0-3.0)
9
39
<1
6
<1
<1.1; (0-3.0)
<1.1 (0-3.0)
*S/D: Sin determinar
Resultados:
Comparación método filtración por membrana vs NMP, se observan resultados del
mismo orden en las 9 muestras ensayadas.
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RESULTADOS PRELIMINARES
Muestra 4: Agua subterránea‐ Pozos OSSE
MATRIZ UFC/100ml
AGUA SUBTERRANEA ENDO LES
CHROMOCULT
PERFORACION Colif. E. Coli Colif. E. Coli
ES OSSE Totales
Totales
NMP/100ml
Colif. Totales
E. coli
35 POZOS
<1
<1
<1
<1
<1.1; (0-3.0)
<1.1; (0-3.0)
1
66
<1
22
<1
3.6; (0.69-10.6)
<1.1; (0-3.0)
2
25
<1
15
<1
9.2; (3.1-21.1)
<1.1; (0-3.0)
3
>200
<1
200
<1
>23.0; (13.5-∞)
<1.1; (0-3.0)
4
133
16
20
5
6.9; (2.1-16.8)
3.6; (0.69-10.6)
5
175
6
78
1
>23.0; (13.5-∞)
3.6; (0.69-10.6)
Resultados:
Comparación método filtración por membrana vs. NMP, se observan resultados del mismo orden en las 40 muestras ensayadas.
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RESULTADOS PRELIMINARES
Resumen resultados de los ensayos realizados
MATRIZ
N° DE MUESTRAS ANALIZAD
AS
N° DE COLONIAS E. coli Tipicas
N° DE COLONIAS E. coli Confirmadas
ENDO LES CHROMOCULT ENDO LES CHROMOCULT
% de Colonias de E. coli Presuntivas (+) Confirmadas
ENDO LES
CHROMO
CULT
EFLUENTE CLOACAL DILUIDO
5
56
20
37
14
25
70
AGUA DE RED (muestras de rutina)
9
34
10
3
10
29
100
AGUA SUBTERR POZOS OSSE (muestras de rutina)
40
22
6
16
6
27
100
TOTALES
54
112
36
56
30
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35
RESULTADOS PRELIMINARES
TIEMPOS DE RESPUESTA
TIEMPOS DE RESPUESTA DESDE LA SIEMBRA DE LA MUESTRAS
ETAPA
TUBOS MÚLTIPLES
ENDO LES
CHROMOCULT
Presuntiva
24 -48 hs
24 hs
24 hs
Confirmatoria para E coli
48-72hs hs
24 hs
3 seg – 1 min
Resultado final
3- 5 días
48 hs
24 hs
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Observación de diferentes tipos de colonias desarrolladas de diversas
matrices reales con y sin Suplemento Selectivo
Mezca de antibióticos liofilizados: Vancomicina: inhibe crecimiento bacterias GRAM (+) Cefsulodina: inhibe el desarrollo de Pseudomonas y Aeromonas
Sin agregado de suplemento. Proliferación de flora acompañante
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Con suplemento selectivo Bacterias Coliformes típicas fácilmente identificables
37
RESULTADOS CON Y SIN USO DEL ANTIBIOTICO Experiencia propia. Matriz Agua Subterránea. Perforaciones OSSE
N° muestra
1
2
3
4
5
N° y Tipo de colonia observada
Con suplemento
Sin suplemento
3 col. colif. No E.coli
<1 col. E.coli
25 col. Traslucidas
<1 col. Colif No E.coli
< 1 col. E.coli
<1 col. Naranjas
3 col. Amarillentas
<1 col. Colif No E.coli
< 1 col. E.coli
10 col. Traslucidas
<1 col. Colif No E.coli
< 1 col. E.coli
<1 col. Marron/ocre
<1 col. Colif No E.coli
3 col. Turquesa
15 col. Traslucidas
39 col. Amarillentas
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3 col. colif. No E.coli
<1 col. E.coli
70 col. Traslucidas
<1 col colif. No E.coli
< 1 col. E.coli
3 col. Naranjas
15 col. Amarillentas
<1 col. Colif No E.coli
< 1 col. E.coli
39 col. Traslucidas
<1 col. Colif No E.coli
< 1 col. E.coli
7 col. Marron/ocre
<1 col colif. No E.coli
22 col. Turquesa
>50 col. Traslucidas
Saturado col. amarillentas
38
PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR
Conclusiones preliminares Parte 1
• Se lograron identificar claramente tanto las colonias de
coliformes no E.coli como las E.coli en los medios de cultivo
ensayados.
• Se comenzó con la comparación del recuento de bacterias
target en distintas matrices reales obteniéndose resultados
comparables en técnicas de membrana filtrante y el método
de NMP.
• Se evaluaron los tiempos de respuesta utilizando cada técnica
y la eficiencia en términos de % de Colonias de E. coli
Presuntivas (+) Confirmadas para las técnicas evaluadas
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39
PLAN DE VALIDACIÓN PRELIMINAR
Conclusiones preliminares Parte 2
• De los ensayos realizados con y sin agregado de Suplemento
Selectivo para Coliformes/ E.coli
se logran observan
diferencias tanto en el número como en la variedad de flora
acompañante en ambos casos.
• El agregado del suplemento, según nuestra experiencia,
facilita la identificación y el recuento de las colonias típicas
al inhibir el desarrollo de otras bacterias
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40
RESULTADOS PRELIMINARES ‐ Limitaciones
Muestras con abundantes sedimentos en suspensión
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41
RESULTADOS PRELIMINARES ‐ Limitaciones
Sobresaturación de la membrana filtrante
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42
Implementación Técnica de Filtración por Membrana
para la determinación de Pseudomonas aeruginosa
Fase experimental
Metodología para la confirmación de las colonias según Norma IRAM 29108 ‐ 1:2006
 Medio de Cultivo utilizado: Agar Cetrimide Marca Merck
 Observación de las colonias típicas color verde
 Confirmación: fluorescencia de las colonias típicas
bajo luz
ultravioleta a 365 nm y desarrollo de las mismas en agar PCA a
42°C
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43
METODOLOGÍA
Equipamiento
Aspecto de las colonias típicas Color verde azulado
Cabina o gabinete cerrado de visualización UV
Longitud de onda 365 nm
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Confirmación
Fluerescencia
44
ACCIONES FUTURAS
• Culminar con la segunda etapa de la validación preliminar
• Diseño del plan de verificación y sesgo por analista sobre
las muestras de rutina.
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45
INTEGRANTES DEL GRUPO DE TRABAJO
Gerencia de Calidad ‐ Obras Sanitarias Mar del Plata
Laboratorio de Bacteriología (Potabilidad y Medio Receptor)
Lic. Mariana Cerdá Gilbert
Téc. Ana María Caldararo
Téc. Carlos Samite
Calidad y Evaluación de Proyectos
Lic. Ana Paula Comino
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46