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UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y SANIDAD ANIMAL
UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS
REGULACIÓN DE LA INDUCCIÓN DE ARGINASA EN
LEISHMANIOSIS EXPERIMENTAL MURINA Y SU PAPEL EN LA
INFECCIÓN IN VITRO E IN VIVO POR Leishmania spp.
VIRGINIA INIESTA OROZCO
CÁCERES, 2003
Edita: Universidad de Extremadura
Servicio de Publicaciones
c/ Pizarro, 8
Cáceres 10071
Correo e.: publicac@unex.es
http://www.pcid.es/public.htm
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y SANIDAD ANIMAL
UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS
REGULACIÓN DE LA INDUCCIÓN DE ARGINASA EN LEISHMANIOSIS
EXPERIMENTAL MURINA Y SU PAPEL EN LA INFECCIÓN IN VITRO E IN
VIVO POR Leishmania spp.
Vº Bº
Los Directores
Prof. Dra. Inés Mª Corraliza Generelo
Prof. Dr. Luis Carlos Gómez Nieto
Memoria de presentada por la Licenciada en Veterinaria
Virginia Iniesta Orozco para optar al grado de Doctor.
INÉS Mª CORRALIZA GENERELO, Profesora Asociada de Bioquímica, del
Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética, y LUIS CARLOS GÓMEZ
NIETO, Profesor Titular de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, del Departamento
de Medicina y Sanidad Animal, ambos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de
Extremadura
INFORMAN
Que la licenciada en Veterinaria VIRGINIA INIESTA OROZCO ha realizado en esta
Unidad, bajo nuestra dirección, el presente trabajo de investigación titulado “Regulación
de la inducción de arginasa en leishmaniosis experimental murina y su papel en la
infección in vitro e in vivo por Leishmania spp.”, con el que opta al título de Doctor en
Veterinaria.
Que en todo momento ha demostrado gran rigor científico en el desarrollo de esta
memoria, utilizando todos los medios puestos a su alcance para la consecución de los
objetivos marcados.
Por todo lo cual, y para que conste en su memoria de Doctorado, firmamos el presente
informe en Cáceres, a 6 de Junio de 2003.
Vº Bº
Los Directores
Prof. Dra. Inés Mª Corraliza Generelo
Prof. Dr. Luis Carlos Gómez Nieto
A mis padres, por enseñarme a ser feliz;
y a Miguel, por compartir su felicidad conmigo.
ÍNDICE
RESULTADOS
Ratón de la cepa resistente C57BL/6.
ÍNDICE
ÍNDICE
1.-INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................3
Objetivos del trabajo ....................................................................................................................5
2.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................9
2.1. Parásito ..........................................................................................................................9
2.1.1. Ciclo biológico .........................................................................................................................9
2.1.2. Clasificación de las especies de Leishmania .......................................................................12
2.2. Patogénesis de la leishmaniosis .........................................................................................14
2.2.1. Formas clínicas..................................................................................................................... 14
2.2.2. Respuesta inmune frente a Leishmania ............................................................................ 16
2.2.2.1. Respuesta immune humoral ..........................................................................................16
2.2.2.2. Respuesta immune celular .............................................................................................20
2.2.2.2.1. Linfocitos ..............................................................................................................21
2.2.2.2.1.1. Linfocitos Th (CD4+) ..................................................................................21
2.2.2.2.1.2. Linfocitos Tc (CD8+) ...................................................................................23
2.2.2.2.2. Células NK ............................................................................................................23
2.2.2.2.3. Células dendríticas ................................................................................................24
2.2.2.2.4. Macrófagos ...........................................................................................................25
2.2.2.2.4.1. Generalidades...............................................................................................25
2.2.2.2.4.1.1. Funciones generales.............................................................................25
2.2.2.2.4.1.2. Mecanismos de activación ..................................................................27
2.2.2.2.4.2. El macrófago en infecciones por Leishmania .........................................30
2.2.3. Susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania ............................................ 32
2.2.3.1. Modelo L. major /ratón ..................................................................................................32
2.2.3.1.1. Susceptibilidad y respuesta Th2 ........................................................................35
2.2.3.1.2. Importancia de la respuesta de IL-12 ...............................................................38
2.2.3.1.3. Desarrollo de las células Th1 y resistencia ........................................................39
2.2.3.1.4. Moléculas efectoras implicadas en la resistencia adquirida ..............................40
2.2.3.2. Modelos de leishmaniosis visceral murina (L. infantum - L. donovani)......................41
I
ÍNDICE
2.3. La enzima arginasa y su implicación en el sistema inmune ...................................42
2.3.1. Metabolismo de la L-arginina en mamíferos ...............................................................42
2.3.2. Regulación del metabolismo de la arginina en macrófagos ........................................43
2.3.2.1. Vía de la Óxido Nítrico Sintasa inducible (iNOS) ....................................................43
2.3.2.2. Vía de la Arginasa .....................................................................................................45
2.3.3. Papel de la arginasa en la respuesta inmune ................................................................48
3.-MATERIAL Y MÉTODOS .........................................................................................55
3.1. MATERIAL ................................................................................................................55
3.1.1. Material biológico ....................................................................................................55
3.1.1.1. Ratones y células murinas .................................................................................55
3.1.1.2. Parásitos ............................................................................................................56
3.1.2. Medios de cultivo .....................................................................................................56
3.1.2.1. Medio de cultivo completo para macrófagos diferenciados ..............................56
3.1.2.2. Medio de cultivo condicionado .........................................................................56
3.1.2.3. Medio de cultivo para aislamiento de Leishmania ............................................57
3.1.2.4. Medio de cultivo para mantenimiento de Leishmania ......................................57
3.1.3. Tampones .................................................................................................................57
3.1.3.1. Tampón fosfato (PBS) .......................................................................................57
3.1.3.2. Tampón citrato-fosfato ......................................................................................58
3.1.3.3. Tampón Tris-HCl ..............................................................................................59
3.1.3.4. Tampón de la muestra para electroforesis .........................................................59
3.1.4. Reactivos, citoquinas y otros productos ................................................................60
3.1.5. Material de laboratorio ...........................................................................................61
3.1.6. Aparatos ...................................................................................................................62
3.1.7. Soporte informático ................................................................................................64
II
ÍNDICE
3.2. MÉTODOS ..................................................................................................................65
3.2.1. ESTUDIOS IN VITRO ............................................................................................65
3.2.1.1. Obtención de macrófagos derivados de médula ósea .............................................65
3.2.1.2. Cultivo y activación de macrófagos ......................................................................66
3.2.1.3. Cultivo de las especies de Leishmania ...................................................................67
3.2.1.4. Infección de los macrófagos con Leishmania ........................................................67
3.2.1.5. Preparación de los cultivos para observación microscópica ..................................68
3.2.1.6. Contaje de la parasitación celular ...........................................................................68
3.2.1.7. Medida de la actividad arginasa .............................................................................68
3.2.1.8. Cuantificación de nitritos .......................................................................................69
3.2.1.9. Determinación de proteínas ...................................................................................70
3.2.1.10. Análisis de la viabilidad celular ...........................................................................70
3.2.1.11. Western blotting ...................................................................................................71
3.2.2. ESTUDIOS IN VIVO ..............................................................................................72
3.2.2.1. Infección de ratones con Leishmania major........................................................72
3.2.2.2. Recogida y procesado de datos y muestras .......................................................72
3.2.2.2.1. In vivo ............................................................................................................72
3.2.2.2.1.1. Evolución de los signos clínicos.............................................................72
3.2.2.2.1.2. Extracción y procesado de sangre ..........................................................73
3.2.2.2.2 Post mortem ....................................................................................................73
3.2.2.2.2.1. Procesado de extremidades infectadas ...................................................73
3.2.2.3. Técnicas de inmunodiagnóstico ..........................................................................74
3.2.2.3.1 Análisis de la respuesta inmune humoral (Técnica ELISA) .....................74
3.2.2.3.1.1. Obtención de los antígenos para tapizado ..............................................74
3.2.2.3.1.2. Desarrollo de la técnica ..........................................................................75
3.2.2.3.2. Análisis de la respuesta inmune celular: detección de citoquinas ...........77
III
ÍNDICE
3.2.2.4. Técnicas histológicas ............................................................................................77
3.2.2.4.1. Tinción Hematoxilina-Eosina .........................................................................78
3.2.2.4.2. Tinción Tricrómico de Masson.......................................................................79
3.2.2.5. Análisis de la actividad enzimática arginasa en tejidos infectados ..................80
3.2.2.5.1. Medida en homogeneizado de tejidos por el micrométodo ............................80
3.2.2.5.2. Detección por técnicas inmunohistoquímicas ...............................................80
4.- RESULTADOS ............................................................................................................85
4.1. ESTUDIOS IN VITRO ...............................................................................................85
4.1.1. Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes
al parásito ................................................................................................................85
4.1.1.1. Efecto de la activación con citoquinas Th1 .......................................................86
4.1.1.2. Efecto de las citoquinas Th2 en la proliferación intracelular de los
parásitos...................................................................................................................89
4.1.1.2.1. Inducción con IL-4 ..................................................................................92
4.1.1.2.2. Inducción con IL-10 ..............................................................................94
4.1.1.2.3. Inducción con TGF-β ..............................................................................95
4.1.2. Determinación de la isoforma de arginasa inducida en macrófagos infectados ............97
4.1.3. Efecto de la L-ornitina y de putrescina macrófagos infectados ...................................98
4.1.4. Análisis de la inhibición de la arginasa y de la iNOS sobre la parasitación
celular.......................................................................................................................100
4.1.4.1. Inhibición de la arginasa .........................................................................100
4.1.4.2. Inhibición del NO....................................................................................111
4.1.5. Caracterización de la enzima arginasa presente en promastigotes de Leishmania.....114
IV
ÍNDICE
4.2. ESTUDIOS IN VIVO ...............................................................................................115
4.2.1. Análisis de los signos clínicos: evolución de la lesión..........................................115
4.2.2. Análisis de la respuesta inmune ...........................................................................117
4.2.2.1.Respuesta inmune humoral ...................................................................................117
5.2.2.1.1. Respuesta inmune humoral frente a Proteína total (PT) de L. major............117
5.2.2.1.2.Respuesta inmune humoral frente al antígeno KMP-11
de L. infantum.................................................................................................120
5.2.2.1.3. Respuesta inmune humoral frente a Proteína Quimera (PQ) de L.
infantum.........................................................................................................121
4.2.2.2. Respuesta inmune celular .....................................................................................123
4.2.2.2.1. Determinación de los niveles de IL-4 en suero ...................................123
4.2.2.2.2. Determinación de los niveles de IL-12 en suero .................................125
4.2.3. Cuantificación de la inducción de la arginasa en las lesiones ....................................126
4.2.4. Estudio anatomopatológico de las lesiones..........................................................127
5.2.4.1. Infección en ratones sensibles BALB/c.....................................................127
5.2.4.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6.................................................132
5.2.4.3. Resumen del análisis histopatológico en ambas cepas..............................134
4.2.5. Estudio inmunohistoquímico de las lesiones para detección de arginasa ................135
5.2.5.1. Infección en ratones sensibles BALB/c.....................................................135
5.2.5.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6.................................................138
5.2.5.3. Resumen del análisis inmunohistoquímico en ambas cepas......................141
5.-DISCUSIÓN.............................................................................................................145
5.1. ESTUDIOS IN VITRO .............................................................................................145
5.1.1. Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes al
parásito.....................................................................................................................145
V
ÍNDICE
5.1.2. La arginasa I es la isoforma inducida en macrófagos infectados activados con
citoquinas Th2............................................................................................................150
5.1.3. La adición exógena de L-ornitina y putrescina favorece el crecimiento de amastigotes
intracelulares.........................................................................................................................150
5.1.4. La inhibición de la arginasa reduce la proliferación de Leishmania spp.............................151
5.2. ESTUDIOS IN VIVO ...............................................................................................158
5.2.1. Descripción de los signos clínicos y de las lesiones anatomopatológicas ............158
5.2.2. Evolución de la respuesta inmune humoral ...........................................................160
5.2.3. Influencia de la IL-4 e IL-12 en la progresión de la enfermedad ...........................166
5.2.4. Análisis de la inducción de la arginasa en las lesiones ..........................................169
6.- CONCLUSIONES.......................................................................................................177
7.- RESUMEN ..................................................................................................................181
8.- SUMMARY.................................................................................................................187
9.- BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................193
10.- LISTADO DE ABREVIATURAS...........................................................................237
11.- INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ......................................................................243
12.- PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS.................................................251
13.- AGRADECIMIENTOS ...........................................................................................255
VI
1.
INTRODUCCIÓN
1.
Promastigotes en cultivo.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.- INTRODUCCIÓN
La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria producida por protozoos flagelados
pertenecientes al género Leishmania. Estos parásitos afectan a numerosas especies de
mamíferos incluido el hombre, siendo sus reservorios principales el perro y algunos
roedores. Su transmisión en la naturaleza se debe a la picadura infectante de un insecto
vector, el flebotomo. En el caso del hombre, las leishmaniosis corresponden a un grupo de
enfermedades que presentan diferentes formas clínicas: la leishmaniosis visceral (LV) o
“kala-azar”, las leishmaniosis cutáneas localizadas (LCL o“botón de oriente”) o difusas
(LCD) y la leishmaniosis mucocutánea (LMC) (Dedet, 1995).
Estas enfermedades están presentes en cuatro de los cinco continentes, afectando a la
población de 88 países del mundo, 72 de los cuales son subdesarrollados o en vías de
desarrollo. La incidencia anual mundial de la leishmaniosis, comprendiendo todas sus
formas clínicas, está estimada entre millón y medio y 2 millones de casos (Desjeux, 1999)
siendo la prevalencia de unos 12 millones, y 350 los millones de personas que están en
riesgo de contraer la infección. Sólo de leishmaniosis visceral se estiman entre 75.000 y
80.000 fallecimientos al año, considerándose, por su repercusión mundial, como una de las
tres enfermedades parasitarias englobadas en la Categoría I (emergentes e incontroladas).
Desde el año 1976 la OMS la incluye en el Programa Especial PNUD/Banco Mundial/OMS
de Investigación y Enseñanza de las Enfermedades Tropicales.
El parásito, una vez se encuentra en el hospedador definitivo, se multiplica en las células
fagocíticas de la médula ósea, hígado, bazo, pulmón, piel, etc., condicionando la
degeneración y destrucción tisular, y provocando la consiguiente reacción inflamatoria y
alteración funcional de los órganos afectados. Además existen alteraciones inmunitarias que
afectan principalmente al número y función de las distintas subpoblaciones linfocitarias.
Los macrófagos, principales células hospedadoras de Leishmania, juegan un papel muy
destacado en la defensa del hospedador contra la invasión por una amplia variedad de
3
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
microorganismos, a los que destruyen mediante un proceso de fagocitosis y posterior lisis
intracelular. Además de poseer estas propiedades fagocíticas, desempeñan una importante
función como células presentadoras antígenos, intervienen en la activación de células T y
participan en la secreción de diversas sustancias, entre las que destacan las citoquinas por su
relevancia en el control de la respuesta inmune.
En el macrófago, el estado funcional y la capacidad para desarrollar una función efectora
vienen determinados en gran parte por el metabolismo de la L-arginina. Este aminoácido
puede metabolizarse en macrófagos por dos vías principales: la de la Óxido Nítrico Sintasa
Inducible (iNOS), que da lugar a la síntesis de Óxido Nítrico (NO) y citrulina, con un efecto
citostático y de inhibición de la proliferación de ciertos microrganismos intracelulares; y por
otra parte la vía de la Arginasa I, cuya función en los macrófagos no ha sido bien definida
hasta el momento. Esta enzima es conocida principalmente porque cataliza la última etapa
del ciclo de la urea en el hígado, hidrolizando la L-arginina a L-ornitina y urea. La
producción de esta sustancia es una forma de excrección de iones amonio derivados del
catabolismo de aminoácidos. El otro producto de la reacción, la ornitina, es un precursor de
la síntesis de aminoácidos como prolina y ácido glutámico así como de poliaminas, las
cuales juegan un papel importante en la división y diferenciación celulares.
El balance entre las dos enzimas (iNOS/Arginasa) en el macrófago es regulado
competitivamente por los linfocitos Th1 y Th2 a través de la secrección de citoquinas. Así,
una respuesta Th1 promueve la activación de la iNOS, mientras que una respuesta Th2
induce a la Arginasa I. Además, la inducción de cada una de estas enzimas va acompañada
de la supresión de la otra, lo cual es indicativo de dos estados competitivos en estas células.
En el presente trabajo nos proponemos analizar en profundidad el papel que desempeña
la inducción de la enzima Arginasa I en la capacidad defensiva de los macrófagos. Para ello
hemos tomado un modelo vivo de infección de estas células como es el protozoo
Leishmania, marcándonos en el estudio los siguientes objetivos:
4
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
OBJETIVOS DEL TRABAJO
1.- Estudio de la inducción de la Arginasa I en macrófagos infectados con las especies
Leishmania infantum y Leishmania major. Para ello se realizarán ensayos de activación
la enzima con citoquinas tipo Th2, y posteriormente se analizarán los parámetros de
infección con el parásito.
2.- Regulación de la infección vía inducción de la enzima Óxido Nítrico Sintasa inducible
(iNOS) con citoquinas activadoras e inhibidoras de esta ruta. Repercusión del
metabolismo del Óxido Nítrico (NO), producto de la reacción, sobre la supervivencia
de los parásitos.
3.- Ensayo de inhibidores enzimáticos de ambas rutas (Arginasa/iNOS) sobre la infección
in vitro de macrófagos con las dos especies de Leishmania.
4.- Análisis de la infección in vivo en ratones susceptibles (BALB/c) y resistentes
(C57BL/6) a la infección por Leishmania, con el fin de conocer el papel de la inducción
de la Arginasa y su relación con la sensibilidad/ resistencia a la enfermedad. Se
determinará en ambos casos la evolución de la infección, analizando tanto los cambios
patológicos como el desarrollo de la respuesta inmune humoral y celular. Para ello se
llevará a cabo un estudio seriado en el tiempo, determinando las subclases de IgG
frente a distintos antígenos del parásito a lo largo del curso de la enfermedad, y
relacionando esta respuesta con la inducción de citoquinas Th1 y Th2, así como
determinando la actividad de la arginasa I y las alteraciones histopatológicas de los
tejidos infectados.
5
2.
REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA
Cultivo de macrófagos infectados con Leishmania infantum.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. PARÁSITO
Los protozoos del género Leishmania son parásitos intracelulares que viven y se
multiplican en los macrófagos de mamíferos. Se transmiten por la picadura de un mosquito
de la subfamilia Phlebotominae, y son los causantes de una amplia gama de enfermedades
humanas y animales, que van desde situaciones que autocuran a múltiples formas
localizadas y diseminadas de la enfermedad.
2.1.1. Ciclo biológico
El ciclo de vida del parásito Leishmania es asexual y heteroxeno, es decir, tiene lugar en
dos hospedadores diferentes: uno intermediario (mosquito flebotomo), que actúa como
vector, y uno definitivo, que es un vertebrado casi siempre mamífero (roedores, cánidos y
hombre, principalmente).
A lo largo de su ciclo vital, el parásito presenta distintos tipos morfológicos que se
caracterizan por la posición relativa del kinetoplasto respecto al núcleo (Hoare y Wallace,
1966). Así, podemos encontrar en este género la forma promastigote en el intestino del
mosquito, caracterizándose morfológicamente por tener forma de huso y presentar un
flagelo en uno de sus extremos. El resto del ciclo se completa en los tejidos del mamífero,
donde se encuentra la forma amastigote, que carece de flagelo visible y tiene aspecto
redondeado.
El ciclo se inicia cuando el insecto vector ingiere, con su picadura, formas amastigote
de la piel del hospedador vertebrado. Los amastigotes se liberan en el intestino del
mosquito y se transforman en promastigotes. Estos, en su primera fase (estadio procíclico)
no son infectivos, tienen capacidad de dividirse y una alta adherencia a las células
epiteliales del tramo medio del tubo intestinal del insecto (Sacks y col., 1995). A partir de
los promastigotes procíclicos se desarrollan las formas maduras o promastigotes
9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
metacíclicos (estadio infectivo), sin capacidad de dividirse, que muestran muy poca
adherencia a las células epiteliales (Lawyer y col., 1990), lo que les permite migrar a la
trompa del mosquito (Changa y col., 1985 y Evans, 1993). Otros cambios que ocurren en
el paso de forma procíclica a estadío metacíclico infectivo es el desarrollo de una serie de
procesos que incrementan en la resistencia a los mecanismos microbicidas del hospedador.
Así, la superficie del promastigote se altera para evitar la inserción del complejo lítico
C5b-C9 de ataque a la membrana o MAC del complemento sérico (Puentes y col., 1990).
Esto se correlaciona con la expresión de un lipofosfoglicano (LPG) modificado, que puede
actuar como una barrera para la inserción del MAC en la superficie del parásito (Mc
Conville y col., 1992). Otro cambio que ocurre durante el desarrollo de las formas
metacíclicas es la síntesis incrementada de la proteína de superficie gp63, la cual puede
cortar la C3b del complemento a la forma inactiva C3bi, y así prevenir la deposición del
complejo lítico C5b-C9 (Brittingham y col., 1995). Estudios recientes han concluído que
LPG y gp63 son factores de virulencia, ya que cepas mutantes de L. major que no expresan
estas moléculas son más sensibles a la lisis mediada por complemento y muestran una
virulencia reducida en ratones BALB/c (Spath y col., 2000; Joshi y col., 2002).
Cuando el insecto vector pica al mamífero, las formas metacíclicas son liberadas en el
punto de inoculación y están transitoriamente expuestas a los componentes potencialmente
letales del suero. En ese momento se enfrentan a moléculas del complemento, anticuerpos
y células fagocíticas, que van a ser capaces de eliminar hasta el 80% de los parásitos
inoculados en la picadura (Lewis y Peters, 1997). Sin embargo, un porcentaje de los
promastigotes evade la lisis mediada por complemento, usando la activación de éste como
mecanismo para alcanzar la célula hospedadora. Así, éstos inactivan la forma C3b y ésta
pasa C3bi, la cual opsoniza los parásitos para la fagocitosis a través de los receptores del
complemento CR3 y CR1,
dirigiendo al parásito su célula hospedadora (Mosser y
Edelson, 1985).
Como los promastigotes carecen de la maquinaria necesaria para la invasión activa de
10
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
las células, están limitados a la acción de los fagocitos profesionales (principalmente
macrófagos y células dendríticas), con algunas excepciones como fibroblastos y neutrófilos
(Rittig y Bodgan, 2000). El reconocimiento entre éstos y los parásitos está mediado por
varios receptores de membrana (Handman, 1999). Una vez reconocidos, los promastigotes
son internalizados y se localizan en los fagolisosomas. Dentro de ellos se transforman en
amastigotes, y se mantienen y replican con esta forma en el interior del hospedador. Para
sobrevivir a los mecanismos potencialmente destructivos de los que está equipado el
macrófago (radicales del oxígeno, óxido nítrico, enzimas lisosomales...), los amastigotes de
Leishmania deben defenderse mediante factores que inhiban o reduzcan el impacto de los
mismos (Wright y El Amin, 1989). Si los parásitos no son controlados por el macrófago,
los amastigotes se reproducen dentro de él, rompen la célula y se diseminan por todo el
sistema mononuclear fagocítico, causando los síntomas y patología asociados a la
enfermedad. El ciclo se completa cuando un mosquito no infectado ingiere macrófagos de
un hospedador vertebrado con amastigotes intracitoplasmáticos.
Así, el ciclo biológico de Leishmania puede resumirse en un paso alternado del parásito
de un mamífero a otro por la picadura de un flebotomo vector. En realidad, este esquema
general se compone de mecanismos de interacción parásito/hospedador de gran
complejidad.
11
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1.2. Clasificación de las especies de Leishmania
Todas las especies del género Leishmania son en la práctica indistinguibles desde el
punto de vista morfológico y estructural, en cualquiera que sea su estado, promastigote o
amastigote. Ello ha dado lugar a que se hayan desarrollado numerosos sistemas de
identificación a lo largo del tiempo. Los primeros estuvieron tradicionalmente basados en
criterios poco fiables, como el aspecto clínico o la distribución geográfica. Más tarde se
propusieron distintas clasificaciones atendiendo al comportamiento tanto en cultivo como
en animales de laboratorio o vectores, igualmente poco satisfactorias.
Posteriormente se llevaron a cabo intensos estudios sobre quimiotaxonomía en este
parásito (Gardener y col., 1974), lo que llevó a la clasificación que es aceptada actualmente
por la mayoría de los autores: la electroforesis de isoenzimas. Ésta constituye hoy en día la
técnica de referencia para la clasificación automática de género y la identificación a nivel
específico o infraespecífico. Está basada en la determinación de los perfiles enzimáticos de
las distintas cepas; así, los parásitos de la misma especie que poseen idéntico patrón
enzimático pertenecen al mismo zimodema (Lumsden, 1977), denominado con el acrónimo
“MON” según la nomenclatura aceptada (Chance, 1982, 1986).
Tras la creación del género Leishmania por Ross en 1903, el número de especies
descritas no cesa de crecer. La organización sistemática éstas ha originado clasificaciones
regularmente revisadas y corregidas (Pratlong y Lanotte, 1999). En la práctica, el género
Leishmania está dividido en dos subgéneros:
•
Leishmania sensu stricto, presente en el Viejo y el Nuevo Mundo
•
Viannia, subgénero del Nuevo Mundo
De esta forma, y basándose en la caracterización de isoenzimas (Dedet, 1993; Rioux y
col., 1990, Thomaz-Soccol y col., 1993), la clasificación más reciente del género
Leishmania queda reflejada en el siguiente cuadro (Tabla 1):
12
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
SUBGÉNERO
Leishmania
(Ross, 1903)
ESPECIES
L. donovani, L. archibaldi
L. infantum (syn. L. chagasi)
L. tropica
L. killicki
L. major
L. gerbilli
L. mexicana (syn. L. pifanoi)
L. amazonensis (syn. L. garnhami), L. aristidesi
L. enrietti
L. hertigi, L. deanei
L. turanica*
L. venezuelensis*
L. braziliensis
L. peruviana
L. guyanensis, L. panamensis, L. shawi
Viannia
L. lainsoni
(Lainson y Shaw, 1987) L. naiffi
L. colombiensis*
L. equatorensis*
* Especies sometidas a reclasificación
Tabla 1: Clasificación del género Leishmania, basada en la electroforesis de isoenzimas (adaptada
de Alvar, 2001).
Los últimos avances están permitiendo el desarrollo de métodos de caracterización
intrínsecos aún más precisos, basados en el análisis del propio genotipo del parásito
mediante sondas de DNA y amplificación del genoma. Estas técnicas tienen la ventaja de
que actúan sobre un material que permanece invariable a lo largo de la vida del parásito, y
que es independiente de los cambios morfológicos del protozoo a lo largo de su ciclo
biológico y ajeno a la respuesta inmune del hospedador.
13
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2. PATOGÉNESIS DE LA LEISHMANIOSIS
2.2.1. FORMAS CLÍNICAS
La inoculación intradérmica de promastigotes metacíclicos de Leishmania induce, en el
sitio mismo de la picadura, una lesión que pasa generalmente desapercibida en el hombre,
pero que está bien descrita en el perro (Vidor y col., 1991).
Tras la multiplicación intracelular de amastigotes localizados en los macrófagos y las
células dendríticas en el sitio de inoculación, las reacciones celulares generadas y las
diversas citoquinas producidas dan lugar al desarrollo de una lesión cutánea localizada
(LCL). A partir de ahí, los parásitos pueden ser transportados a los ganglios linfáticos de
drenaje y difundirse a distintas zonas de la piel, dando lugar a una leishmaniosis cutánea
difusa (LCD) o a las mucosas de la cara, originando una leishmaniosis mucocutánea
(LMC). En otros casos, los parásitos se extienden a todos los órganos del sistema
mononuclear fagocítico, provocando una leishmaniosis visceral (LV).
De esta manera, la expresión clínica de las leishmaniosis depende de la localización del
parásito en los tegumentos o en otros órganos profundos del sujeto, lo cual está
directamente ligado al tropismo de la especie de Leishmania causante. A nivel práctico, las
leishmanias pueden ser agrupadas según su tropismo en tres grandes bloques (Tabla 2).
TROPISMO
ESPECIES
Visceral
L. donovani, L. infantum
Dérmico
Mucutáneo
L. major, L. tropica, L. killicki,, L. mexicana L. amazonensis,
L. peruviana, L. guyanensis, L. naiffi, L. lainsoni, etc.
L. braziliensis, L. panamensis
Tabla 2: Tropismo habitual de las especies de Leishmania (adaptada de Dedet, 2000).
14
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Sin embargo, este tropismo por un determinado órgano no es absoluto. Por ejemplo, en
el
caso
de
las
especies
indudablemente
viscerotropas,
existen
excepciones
independientemente del estado inmunitario del individuo, donde la población del parásito
causa lesiones cutáneas localizadas sin signo de alteración visceral. En el caso de la
especie L. infantum, por ejemplo, el zimodema MON-1 es claramente responsable de la
leishmaniosis visceral en la Cuenca Mediterránea, no sólo en el hombre sino también en el
perro. Pero el mismo zimodema puede provocar más raramente la leishmaniosis cutánea
localizada (Rioux, 1985). Otros zimodemas de L. infantum, como el MON-11, MON-24,
MON-29, MON-33 y MON-78, son calificados de dermotrópicos por ser responsables de
leishmaniosis cutánea localizada en pacientes inmunocompetentes (Pratlong, 1989;
Gallego y col., 2001).
En los modelos experimentales murinos de infección con L. major, también se ha
comprobado que la subcepa de Leishmania utilizada influye determinantemente en el
desarrollo de la enfermedad (Noben-Trauth y col., 1999), así como el tiempo que las
formas promastigote permanezcan en cultivo o el número de pases rutinarios en el mismo,
ya que largos periodos o elevado número de pases provocan que estas cepas puedan sufrir
variaciones espontáneas. Las más usadas en los ensayos laboratoriales pueden derivar de
aislados humanos o de roedores, y se clasifican generalmente en cuanto a su origen
geográfico. Algunas de las más comunes que se utilizan en el modelo murino son Friedin
(Jordan Valley, WHOM/IL/80/FN), IR173 (Irán, WHOM/IR/-173), LV39/Neal (Sur de
Rusia, MRHO/SU/59/P), NIH/Seidman (Oeste de África, MHOM/SN/74/S), World Health
Organization reference strain 5-ASKH (Turmenskaya, MHOM/SU/73/5-ASKH) y CC-1
(Irán, MHOM/IR/83/LT52).
Tras todos estos datos, se puede concluir que las formas clínicas de leishmaniosis
dependen fundamentalmente de dos factores: las características genéticas de los parásitos y
el estado inmunitario de los sujetos infectados.
15
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.2. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Leishmania
En la leishmaniosis destaca la importancia y complejidad de la respuesta inmunitaria del
hospedador frente al parásito. Aparecen procesos inmunológicos diferentes, tanto
humorales como celulares, y se observa también un amplio espectro de desórdenes y
alteraciones inmunitarias (Carvalho y col.; 1987).
Esta respuesta inmune se descubrió desde los primeros momentos en que se estudió la
enfermedad, y ha sido revisada en numerosas ocasiones (Maüel y Behin, 1981; Pearson y
col., 1983; Behin y Louis., 1984; Howard, 1985 y Liew y O´Donnel, 1993).
2.2.2.1. Respuesta inmune humoral
El tipo de respuesta humoral depende de la especie parásita y la forma de leishmaniosis.
En las formas viscerales se observa una elevada respuesta de anticuerpos, con altos niveles
de inmunoglobulinas y complejos inmunes circulantes (Liew y O´Donell, 1993), mientras
que en las afecciones cutáneas los títulos de anticuerpos séricos son normalmente bajos y
directamente relacionados con la gravedad del proceso (Howard, 1985; Liew y O´Donell,
1993).
La producción de anticuerpos específicos anti-Leishmania está determinada por la
sensibilización y activación de los linfocitos B, observándose, desde las primeras fases de
la infección, células plasmáticas productoras de anticuerpos en distintos órganos
(Moriearty y col., 1982; Ridley y Ridley, 1983). Diversas experiencias han demostrado que
esa activación en la leishmaniosis visceral se produce como una estimulación policlonal de
las células B (Ghose y col., 1980; Bunn-Moreno y col., 1985), que conduce a una elevada
producción de inmunoglobulinas específicas e inespecíficas. Parte de las imunoglobulinas
inespecíficas que aparecen son anticuerpos frente a ácidos nucleicos, tubulinas y factores
reumatoides (Carvalho y col., 1983; Galvao-Castro y col., 1984). Analizando los
anticuerpos específicos, se comprueba su reactividad frente a distintos componentes
16
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
antigénicos del parásito (Ray y Ghose, 1986; Santos y col., 1987).
En este sentido, cabe destacar la respuesta humoral detectable frente a distintos
antígenos recombinantes de Leishmania. En concreto, y para el caso de L. infantum,
señalaremos la Proteína Quimera (PQ). Se trata de un péptido de 38 KDa de peso
molecular con un punto isoeléctrico de 7.37,
constituido por diversos determinantes
antigénicos de distintos antígenos de L. infantum. Los epítopos seleccionados derivan de
las proteínas ribosomales LiP2a, LiP2b, LiP0 y de la histona H2A (Soto y col, 1998).
Todos los componentes antigénicos de la proteína Q son, por separado, reconocidos por un
alto porcentaje de sueros caninos provenientes de animales con leishmaniosis visceral
(Soto y col, 1995b). Esto hace de la PQ una molécula muy específica y apropiada para el
serodiagnóstico de la leishmaniosis visceral canina (Soto y col., 2002) fundamentalmente
dirigida al diagnóstico de la patología inducida por la infección, ya que varios de sus
componentes inducen inmunocomplejos y se depositan en tejidos como riñón, bazo e
hígado (Molano y col., 2003).
Otra proteína recombinante que debe ser mencionada es la Kinetoplastid Membrane
Protein o KMP-11, que ha sido utilizada con éxito en ensayos de protección frente al
protozoo Trypanosoma cruzi en ratones (Planelles y col., 2001). El análisis de su
antigenicidad ha sido llevado a cabo por varios autores y para distintos tipos de
leishmaniosis. En este sentido, se ha visto que la respuesta frente a KMP-11 en infecciones
experimentales con L. infantum en el modelo hámster (Mesocricetus auratus) muestra un
cierta asociación con el desarrollo de la infección (Requena y col., 2000), siendo
reconocida sólo por los sueros de hámsters que no mostraron ningún signo externo de
enfermedad hasta el final del estudio. Otros ensayos, llevados a cabo por Berberich y col.
en 1997, demuestran que este antígeno de L. infantum es reconocido por un 96% de perros
con leishmaniosis visceral, aunque se observa una gran variabilidad en la respuesta inmune
17
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
entre los diferentes animales. Más tarde se demostró de forma experimental en perro (Nieto
y col., 1999) que la proteína KMP-11 desarrolla una respuesta de anticuerpos de forma
muy precoz -a las pocas semanas de producirse la infección-, existiendo casos de
seroconversión en animales que no desarrollan la enfermedad. La alta reactividad que
aparece en el suero de algunos de los perros sugiere que la proteína puede también actuar
como un potente inmunógeno de células B durante la LV natural. Por otra parte, ensayos
realizados con sueros humanos (Berberich y col., 1997), indicaron que el 70% de los
sueros humanos con LV también reconocieron esta proteína, mostrando algunos de ellos
niveles muy elevados de anticuerpos anti-KMP-11. Esto apunta a que la KMP-11 puede
ser un buen marcador de infección, que complemente a otros antígenos específicos en tests
serológicos para LV tanto en humanos como en perros. Por el contrario, y para el caso de
L. braziliensis (Carmelo y col., 2002), el reconocimiento de la KMP-11 recombinante por
parte de los sueros de enfermos con LC y LMC es bajo, de acuerdo con la escasa respuesta
humoral que presentan estos pacientes.
La respuesta humoral frente a Leishmania está constituida básicamente por IgG, con
una pequeña proporción de IgM y en ocasiones de IgA (Ghose y col., 1980). Los niveles
de IgG circulantes se corresponden, por lo general, con la intensidad de la infección
(Morsy y col., 1987, Mimory y col., 1987), reflejando el grado y la duración de la
estimulación antigénica determinada por la carga parasitaria (Howard, 1985). De cualquier
forma se detectan, por gran variedad de técnicas serológicas, elevados títulos de
anticuerpos específicos (Martínez-Moreno, 1991; Nieto y col., 1992). En la leishmaniosis
visceral, el subtipo IgG2a -asociado a una respuesta Th1 (Germann y col, 1995)- es
mayoritario, aunque otros subtipos como la IgG1 (propio de un respuesta Th2) están
aumentados (Deplazes y col., 1995). En los trabajos que se han llevado a cabo hasta ahora
para intentar esclarecer el papel de cada una de las subclases de IgG en la respuesta
específica anti-Leishmania (Elassad y col.; 1994, Ulrich y col., 1995; Deplazes y col.,
18
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1995), los resultados son poco concluyentes.
Sin embargo, en estudios realizados en el modelo canino, con perros infectados tanto de
forma natural (Deplazes y col., 1995) como experimentalmente (Nieto y col., 1999), se
determinan que se produce una respuesta dual o dicotómica y se evidencia una correlación
entre los niveles de isotipos de IgG y la progresión de la enfermedad. Así, se observa que
la IgG1 es indetectable en animales regresivos u oligosintomaticos, mientras que es alta en
animales que desarrollan enfermedad activa. En estos mismos ensayos, se comprobó que la
aparición de anticuerpos anti-histonas estaba asociada a la progresión del estado de
infección al de enfermedad, y que el antígeno KMP-11 fue reconocido por el suero de
todos los perros infectados.
En el modelo de infección por L. major en ratón, existen dos cepas bien caracterizadas
de acuerdo a su susceptibilidad y resistencia: BALB/c y C57BL/6, respectivamente.
Honoré y colaboradores (1998) utilizaron estos dos modelos murinos para estudiar la
respuesta de IgG específica frente a la infección por L. infantum. En sus ensayos,
detectaron anticuerpos específicos frente a la Proteína Total soluble del parásito (PT) en
suero desde el día 22 post-infección en ambas cepas. En BALB/c,el isotipo predominante
fue la IgG1, cuya cinética corrió paralela a la de IgG total, mientras que los anticuerpos
IgG2a permanecieron indetectables. La respuesta de isotipos en C57BL/6, por el contrario,
se caracterizó por la producción de ambas IgG1 e IgG2a, cuya cinética fue paralela a la
respuesta de IgG total. Así, la distribución de anticuerpos muestra que la cepa BALB/c
tiene una respuesta predominantemente Th2, mientras que los ratones C57BL/6 presentan
una respuesta mixta Th1/Th2. Esta cinética de anticuerpos, en cambio, no ha sido
caracterizada aún en profundidad para el caso de la infección por L. major.
Se han demostrado diferentes mecanismos de actuación de estos anticuerpos. Por una
parte provocan la destrucción directa del parásito en conjunción con el complemento, al
19
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
unirse con las fracciones C3 y C5 a la membrana plasmática del parásito (DebonsGuillemin y col., 1986). También actúan como opsonizadores, promoviendo la fagocitosis
del parásito por macrófagos y neutrófilos (Reis y col., 1987) y su posterior destrucción
intracelular (Handman y Hocking, 1982; Madeira y col., 1985).
Aunque es innegable su papel en los mecanismos de acción contra el parásito, parece
ser que la función de los anticuerpos in vivo para promover protección es limitada (Howard
y col.,1987; Liew y O´Donell, 1993). Sin embargo, su presencia sí contribuye como
inmunomoduladora de la respuesta celular (Bourdeau, 1988). En este sentido, se ha
señalado una importante función de los linfocitos B sensibilizados, ya que intervienen en la
producción de linfocitos T, imprescindibles para la resolución del proceso como
mediadores de la respuesta inmune celular efectiva contra el parásito (Scott y col., 1986).
Los estudios sobre los mecanismos reguladores de la respuesta celular mediada por
anticuerpos, así como su participación en el control o patología de la enfermedad, son
todavía muy escasos, siendo necesarias, por tanto, nuevas investigaciones en este campo de
la inmunología.
2.2.2.2. Respuesta inmune celular
En la infección por Leishmania, una vez que los amastigotes se encuentran en el
interior de los macrófagos, la resolución de la infección depende predominantemente de
los mecanismos inmunes mediados por células (Pearson y col., 1983; Coutinho y col.,
1987; Kubba y col., 1988). La respuesta celular viene determinada por la acción conjunta
de macrófagos y células dendriticas, células Natural Killer (NK), células B, distintas
subpoblaciones de células T y las diferentes linfoquinas secretadas por todos ellos.
En humanos, la leishmaniosis visceral o kala-azar se caracteriza por una debilitada o
ausente respuesta celular, detectable tanto por la ausencia de hipersensibilidad retardada o
DTH (Turk y Bricesson, 1971), como por métodos de proliferación de células T incluso
frente a mitógenos como la concavalina A o fitohemaglutinina (Reiner y Finke, 1983;
20
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Martínez Moreno, 1991) e inhibición de la producción de IL-12 por parte de las células T
estimuladas (Reiner y Finke, 1983; Carvalho y col., 1985).
La respuesta inmune celular en la leishmaniosis cutánea es muy variable, pues va a
depender de su forma clínica de presentación. Así, en la más común o LCL, existe una
marcada respuesta mediada por células (Convit y col., 1993), detectable tanto in vivo
(pruebas de hipersensibilidad retardada o DTH) como in vitro. Sin embargo, en la LCD
aparece una anergia selectiva en la inmunidad celular (Convit y col., 1993; Castés y col.,
1988). Por último, la LMC se caracteriza por una exacerbada respuesta de base celular que
provoca lesiones destructivas (Convit y Pinardi, 1974; Castés y col., 1988).
2.2.2.2.1. Linfocitos
2.2.2.2.1.1. Linfocitos Th (CD4+)
En el modelo ratón, la población de linfocitos T (Fenotipo CD4+) es heterogénea y se
puede dividir al menos en dos subpoblaciones según las linfoquinas que producen
(Morsman y Coffman, 1987). Estas células, tal y como determinaron Liew y O´Donell en
1993, son esenciales en el desarrollo de inmunidad protectora de leishmaniosis cutánea
(subpoblación Th1), y al mismo tiempo pueden contribuir a la supresión de la misma
(subpoblación Th2), generando un modelo alternativo de respuesta favorable para
Leishmania.
Debido a que las subpoblaciones de células T CD4+ están implicadas en la resistencia
adquirida a L. major, su papel crucial en la infección ha sido un hallazgo consistente
(Belkaid y col., 2000). Así, los linfocitos T inducidos en ratones resistentes C57BL/6 o
ratones susceptibles BALB/c curados, son predominantemente del tipo Th1, mientras que
las células de BALB/c no curados son del tipo Th2 (Heinzel y col., 1991). En general, las
linfoquinas secretadas por estas células favorecen el desarrollo de la línea celular que las
produce y tienen un efecto antagónico en el desarrollo la subpoblación contraria (Reiner y
21
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Locksley, 1993). De esta manera, la IL-4 y la IL-10, producidas por las células Th2,
contribuyen a la progresión de la infección, favoreciendo el desarrollo de esta
subpoblación celular. Además, pueden actuar directamente sobre el macrófago impidiendo
su activación.
En ratones genéticamente resistentes, se ha observado que la ausencia de la expresión
de los genes para IFN-γ o su receptor (Swihart y col., 1995), CD40 o el ligando de CD40,
aumenta la susceptibilidad a la infección (Campbell y col., 1996; Kamanaka y col., 1996;
Soong y col., 1996). La interacción de CD40 y su ligando es necesaria para la producción
de IL-12. Esta citoquina, producida en estadíos tempranos de la infección, induce la
secreción de IFN-γ necesaria para dirigir la respuesta hacia el modo Th1. Los ratones con
una base genética resistente, que desarrollan una respuesta de este tipo, se transforman en
susceptibles si son deficientes en la expresión de IL-12, generando una respuesta Th2
(Mattner y col., 1996). Datos recientes sugieren también que la ausencia de IL-4 puede
evitar la respuesta Th2 (Guler y col., 1996).
Aunque en la leishmaniosis cutánea por L. major el papel de las subpoblaciones Th1
como protectora y Th2 como promotora de enfermedad parece bastante bien demostrado
(Liew y O´Donell, 1993), en la infección por L. donovani (leishmaniosis visceral) esta
relación no está tan claramente establecida (Kaye y col., 1991; Murray y col., 1992),
comprobándose que hay otras subpoblaciones de células T implicadas en el proceso (Liew
y O´Donnell, 1993), tales como los linfocitos T citotóxicos (CD8+). De todas maneras, las
investigaciones más recientes en el modelo L. major-ratón también están encaminadas
hacia el estudio del papel de otras células inmunes distintas de las CD4+ en la infección por
este parásito (Sacks y Noben-Trauth, 2002).
22
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.2.2.1.2. Linfocitos Tc (CD8+)
Las células T citotóxicas producen IFN-γ y TNF-α (Fong y Mosmann, 1990; Muller y
col., 1994), importantes en la activación de los macrófagos para la destrucción de
Leishmania (Liew y Dhaliwal, 1987; Liew y col., 1990b). Además, se ha comprobado
recientemente que, cuando se retan ratones con L. major usando un sistema que reproduce
dos hechos clave de la infección natural (baja dosis e inoculación intradérmica), el
resultado de dicha infección en animales tratados con anticuerpos anti-CD8+ o deficientes
en estas células muestra que las T CD8+, además de las T CD4+, son necesarias para el
control de la infección primaria de L. major en la piel (Belkaid y col., 2002).
Estudios clínicos en humanos han demostrado que existe un gran número de células T
CD8+ específicas de antígeno en lesiones y sangre periférica, durante el estadío agudo de la
formación de la lesión y durante el proceso de curación (Da-Cruz y col., 1994; Gaafar y
col., 1999).
Aunque se asume que la principal función protectora de estos linfocitos en el caso de la
infección por L. major es contribuir a la liberación de IFN-γ en la dermis, la citolisis que
producen en células hospedadoras infectadas incapaces de lisar los parásitos, contribuye a
liberar éstos y hacerlos disponibles para ser captados por células que respondan mejor a las
señales de activación.
2.2.2.2.2. Células NK
Es ampliamente conocido que los eventos responsables de la resistencia o
susceptibilidad a Leishmania ocurren en los primeros estadíos de la infección, y parecen
implicar a los elementos de la respuesta inmune innata, la cual precede al desarrollo de una
respuesta específica de células Th1 y Th2 (Sypek y col., 1993). Las células NK, activadas
por la IL-12 procedente de macrófagos o células dendríticas, son la fuente principal de la
secrección temprana de IFN-γ. Esta citoquina no sólo juega un importante papel en
23
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
controlar la resistencia inicial en las infecciones por L. major, sino que también influye en
el inicio de la diferenciación hacia Th1 en ratones resistentes (Scharton-Kersten y col.,
1995) y puede optimizar la producción de IL-12 por las células dendríticas y la expresión
de IL-12R por las células T activadas.
En concreto, y para el caso de L. major, el rápido desarrollo de una respuesta Th1 y el
control temprano de la infección en los ratones C3H, se asocia con una respuesta temprana
de las células NK, mientras que ratones C57BL/6 y BALB/c que carecen de esta respuesta
precoz de células NK tienen un desarrollo tardío o ausente de respuesta Th1,
respectivamente (Scharton y Scott, 1993).
Está claro, sin embargo, que aunque una actividad precoz de estas células puede
influenciar la cinética de la respuesta Th1, estas células no se requieren en ultima instancia
para la resistencia (Liew y O´Donell, 1993), ya que ratones que carecen selectivamente de
células NK tienen una producción eficiente de IL-12 independiente de IFN-γ por las
células T CD4+ y curan sus lesiones (Wakil y col., 1998; Satoskar y col., 1999).
Por otra parte, las células NK pueden desarrollar un papel importante en la respuesta
contra la leishmaniosis visceral, ya que se piensa que contribuyen a la eliminación del
parásito en la fase de resistencia adquirida tras la infección de L. donovani en el ratón
(Kirkpatrick y col., 1985).
2.2.2.2.3. Células dendríticas
Se sabe que las células dendríticas murinas (inclusive las de Langerhans epidérmicas),
y para el caso de la infección por L. major, captan los parásitos, adquieren el fenotipo
maduro y liberan IL-12 p40 in vitro (Konecny y col., 1999). Su papel en la producción de
IL-12 in vivo y en la promoción del desarrollo de respuesta inmune específica Th1 frente a
L. major ha sido también demostrada por varios autores (Moll y Flohe, 1997; Belkaid y
col., 2000).
24
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La capacidad de las células de Langerhans para transportar L. major de la piel infectada
hasta los nódulos linfáticos de drenaje (Moll y col., 1993) se piensa que se debe, al menos
en parte, a la expresión del receptor 2 de quimoquinas (CCR2), ya que ratones de fondo
resistente deficientes en CCR2 son altamente susceptibles a la infección por L. major, y la
migración de las células de Langerhans está marcadamente dañada en dichos animales
(Sato y col., 2000).
El papel clave de las células de Langerhans en el desarrollo de los diferentes tipos de
leishmaniosis cutánea, queda señalado en los estudios de Cáceres-Dittmar y col. (1992).
Según estos autores, la cascada de eventos que ocurren en la reacción inflamatoria de la
piel durante la LC, varía dependiendo de las diferentes formas clínicas de la misma. Así, y
tal como confirman Tapia y col. (1994), la LCL se caracteriza por la generación de una
respuesta Th1 y por presentar muchos de los componentes de un procesos inflamatorio
activo, entre los que destacan abundantes células de Langerhans. Estas células, por el
contrario, están ausentes en la LMC, y aparecen muy escasamente en la LCD.
2.2.2.2.4. Macrófagos
2.2.2.2.4.1.Generalidades
2.2.2.2.4.1.1. FUNCIONES GENERALES
Los macrófagos se originan en la médula ósea a partir de un progenitor denominado
Unidad Formadora de Colonias Granulocito-Macrofágicas, del cual se forman el
monoblasto, los promonocitos y los monocitos. Estos últimos, tras permanecer en la
médula un máximo de 24 h, pasan al torrente circulatorio. La migración de los monocitos
hacia los tejidos se efectúa a través de los endotelios vasculares, y una vez han llegado al
órgano diana se diferencian a macrófagos y no vuelven a la circulación, sino que
permanecen en los tejidos como “macrófagos residentes”. Éstos están ampliamente
distribuidos por todo el organismo, localizándose en órganos linfoides, hígado (donde se
25
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
denominan células de Kupffer), pulmón, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central,
huesos, líquido sinovial y piel.
Los macrófagos juegan un papel muy importante en la defensa del hospedador contra la
invasión por una amplia variedad de agentes patógenos, que incluyen bacterias, virus,
hongos y protozoos. Se trasladan hacia ellos guiados por un gradiente de moléculas
quimiotácticas que secretan los microorganismos. Después de la fagocitosis o
internalización, se inicia el proceso de destrucción microbiana. Sin embargo, existen
ciertos patógenos intracelulares que pueden replicarse dentro de él, como Listeria,
Salmonella, Mycobacterias, Toxoplasma o Leishmania (Nathan y col., 1980).
Ha sido ampliamente demostrado que los macrófagos, además de sus propiedades
fagocíticas, de presentación de antígenos y de activación de las células T, tienen una
extensa capacidad secretora. Se han descrito más de 100 sustancias secretadas por los
fagocitos mononucleares, con pesos moleculares que oscilan entre los 32 KD de los
radicales superóxido, hasta los 440.000 de la fibronectina (Nathan, 1987). La secrección
incluye tanto la liberación de estas sustancias al medio extracelular como la descarga de
estos materiales en la vacuola fagocítica. En base a lo afirmado por Henson y col. en 1988,
alguno de los productos como la lisozima, componentes del complemento y
apolipoproteína E, son sintetizados y secretados continuamente (secreción constitutiva),
mientras que otros sólo se secretan bajo un estímulo apropiado (secreción inducida o
regulada). De los productos de secreción de los macrófagos, hay que destacar las
citoquinas por su importancia en el control y en la especificidad de la respuesta inmune.
Entre ellas se encuentran el IFN-γ (Fairchild and Moorhead, 1985), así como la IL-1, IL-6,
IL-8, IL-10, IL-12, TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, PDGF, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, y el
inhibidor de la IL-1 (Adams y Hamilton, 1988).
Avances recientes en inmunología han reforzado la idea, ya bien establecida, de que los
26
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
macrófagos tienen una función esencial en el sistema inmune, como reguladores de la
homeostasis y como células efectoras en infección, crecimiento de tumores y reparación de
tejidos.
2.2.2.2.4.1.2. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN
Según la definición de Adams y Hamilton (1984), la activación del macrófago es el
resultado de la expresión aumentada y /o disminuida de varios genes que codifican para
proteínas clave en la función que está siendo activada. Es importante resaltar que esta
activación está regulada no sólo por señales inductoras, sino también por señales
supresoras.
La mayoría de las funciones llevadas a cabo por los macrófagos, incluyendo la
destrucción de parásitos intracelulares y de células malignas in vitro, están incrementadas
por la activación debida a citoquinas. La acción de cada una de estas moléculas sobre
dichas células queda reflejada en la Tabla 3.
Activación de macrófagos por células Th1
Los linfocitos Th1 producen citoquinas asociadas en muchos aspectos con la inmunidad
celular clásica, como son IFNγ , IL-12, IL-3, GM-CSF y TNFα y TNFβ.
El IFNγ es el factor activador más importante de los macrófagos, y también aumenta la
expresión de moléculas de clase II (CMH II); induce la producción de Radicales de
Oxígeno Inorgánico (ROI), de óxido nítrico (NO), y además tiene otras funciones
inmunorreguladoras como la de inducir en las células B la secrección de IgG2a, que es un
importante anticuerpo opsonizante. Finalmente, bloquea los efectos proliferativos de la IL4 sobre las células Th2, previniendo la expresión de esta subpoblación de células T (Suk y
col., 1993).
Los TNFα y β activan al macrófago para producir NO y ROI (aunque esto último no
está aceptado por todos los investigadores).
27
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La IL-3, por su parte, también tiene funciones activadoras de macrófago, que
principalmente se basan en incrementar la presentación y el procesamiento de antígenos,
aumentando la expresión de moléculas del MHC II y de interacción celular (Frendl y col.,
1990).
La IL-2 aumenta el crecimiento y la diferenciación de las mismas células Th1 que las
producen. El IFNγ y la IL-2 estimulan a los macrófagos para producir TNF-α, que a su vez
los activa.
Por último, el Factor Estimulador de Colonias Granulocito-Macrofágicas (GM-CSF),
una citoquina asociada principalmente con la estimulación y el crecimiento de las colonias
de macrófagos y neutrófilos, también activa a los macrófagos a niveles microbicidas en
conjunción con otras citoquinas, especialmente con el IFNγ (Sadick, 1992).
Activación de macrófagos por células Th2
La IL-4 y su homóloga la IL-13 provocan una estimulación alternativa en el macrófago
(Gordon, 2002), inhibiendo su activación mediada por IFNγ (Suk y col., 1993). Asimismo
produce un aumento de la expresión de CMH de clase II y de presentación de antígeno.
La IL-10 en el macrófago da lugar a una disminución de la expresión del CMH II,
reduce la endocitosis e inhibe la producción de las citoquinas proinflamatorias y la
generación de NO.
El TGF-β provoca una inmunosupresión que conlleva la desactivación del macrófago e
inhibe el desarrollo de otras células Th1.
En definitiva, el patrón de las interacciones entre los dos subtipos de células T es la
regulación recíproca; una respuesta inmune en la cual las Th1 están estimuladas
significaría una regulación negativa de la estimulación de las Th2 y viceversa.
28
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
CITOQ.
FUENTE
ACCIÓN SOBRE EL MACRÓFAGO
IL-1
Macrófagos
Liberación de IL-1, TNF, CSF
IL-3
Células T
Crecimiento y diferenciación
IL-4
IL-10
Células Th2,
Células NK
Macrófagos,
Células Th2
Activación alternativa, aumento de la expresión
de CMH de clase II, presentación de antígeno,
fusión
Disminución de CMHII, reducción de la
endocitosis, inhibición de la producción de
citoquinas Th1
Aumento de la expresión de CMH II,
IL-13
Células Th2
estimulación de la endocitosis y presentación de
antígeno
TNF-α
Macrófagos
M-CSF
Fibroblastos, Macrófagos
GM-CSF
CélulasT, macrófagos,
células endoteliales
Liberación de IL-1, FAP, PGE2, quimiotaxis
Crecimiento y diferenciación,
inducción uroquinasa
Crecimiento, diferenciación y activación
IFN-α
Leucocitos
Antiviral y activación
IFN-β
Fibroblastos
Antiviral y activación
IFN-γ
Células T, células NK
Antiviral y activación
TGF-β
Plaquetas, macrófagos
Quimiotaxis, liberación de factores de
crecimiento, desactivación de macrófagos
Tabla 3: Principales efectos de las distintas citoquinas sobre la actividad de los macrófagos
29
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3.2.4.2. El macrófago en infecciones por Leishmania
La captación de Leishmania por los macrófagos se lleva a cabo según la vía
convencional, es decir, fagocitosis mediada por receptor, que implica a una gran diversidad
de receptores opsonicos o del patrón de reconocimiento, como CR3, CR1 y receptores de
manosa-fucosa (Alexander y Russel, 1992), que son utilizados dependiendo de las especies
y estado de los parásitos y de la presencia o ausencia de suero fresco. Los promastigotes
metacíclicos y amastigotes de Leishmania no parecen remodelar el fagosoma en gran
manera, porque rápidamente (en 30 minutos) se fusionan con endosomas o lisosomas
(Courret y col., 2002), generando una vacuola parasitófora que mantiene un pH muy acido
y una gran actividad hidrolítica. Ha sido demostrado que las unidades repetidas de LPG
pueden transitoriamente inhibir la maduración del fagosoma, y que este retraso es
favorable para permitir a los promastigotes tener el tiempo suficiente para diferenciarse a
amastigotes, los cuales son más resistentes a las hidrolasas (Desjardins y Descoteaux,
1997; Dermine y col., 2000).
En el interior del macrófago, los amastigotes sobreviven a la digestión por las enzimas
lisosomales gracias a la expresión de glicoesfingolípidos en la superficie. La parasitación
también evita en el macrófago la puesta en marcha del estallido respiratorio, mediante la
inhibición de la actividad de la Proteína Quinasa C (Moore y col., 1993) y la eliminación
del radical O2- por parte de la superóxido dismutasa (SOD) presente en el parásito (Russell,
1995) completando así los mecanismos de escape de Leishmania a la digestión celular.
El macrófago parasitado procesa los antígenos de Leishmania y los expresa en su
superficie por un proceso mediado por el CMH-II, dado que los parásitos se encuentran en
los fagolisosomas y los antígenos no son mediados en su presentación por el retículo
endoplásmico. Leishmania es capaz de reducir en estas células los niveles del CMH
(Overath, 1999), e inhibir la apoptosis celular para prolongar su prevalencia en el
hospedador (Moore y Matlasheuwsky, 1994). Además, los parásitos regulan la síntesis de
citoquinas hacia aquéllas que suprimen la capacidad lítica de los macrófagos. En este
30
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
contexto, el mecanismo más importante analizado hasta la fecha parece ser la inhibición de
la síntesis de IL-12 en células infectadas por Leishmania, lo cual disminuye o bloquea la
secreción de IFN-γ (Carrera y col., 1996). Además, se ha demostrado que la infección por
Leishmania induce la síntesis de IL-10 y TGF-β, previniendo la activación del macrófago.
La acción sinérgica del IFN-γ y del TNF-α sobre los macrófagos infectados produce la
activación de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), generándose NO (Titus y col.,
1989; Green y col., 1990a; Liew y col., 1990a-1990b; Bodgan y col., 1990; Theodos y col.,
1991), responsable de la destrucción intracelular del parásito (Green y col., 1990b; Liew y
col., 1991; Assreuy y col., 1994). Esta activación de la producción de NO por parte del
macrófago se reproduce in vitro por adición de IFN-γ y lipopolisacáridos (LPS). En estas
condiciones, los macrófagos así estimulados son totalmente capaces de destruir L. major
(Cunha y col., 1993). Por otro lado, el IFN-γ inhibe la proliferación de las células Th2,
activa al macrófago mediando respuestas de hipersensibilidad retardada y estimula la
síntesis de TNF-α en las células infectadas (Green y col., 1990a).
Se ha demostrado que la IL-10 inhibe la síntesis de citoquinas Th1, especialmente del
IFN- γ (Fiorentino y col., 1991; Chatelein y col., 1992), y por tanto la producción de NO
en el macrófago (Cunha y col, 1992). Esto explica, en parte, el papel inmunosupresor y
potenciador de la enfermedad atribuido a esta citoquina (Ghalib y col., 1993; Holaday y
col., 1993).
De esta forma, parece ser que al menos en el modelo ratón, la activación de macrófagos
por las citoquinas derivadas de células T es un requerimiento imprescindible para controlar
la infección y la progresión de la enfermedad. Así, la inhibición de la división de
Leishmania está mediada por la producción de NO, inducida a su vez por el IFN-γ y otras
citoquinas que actúan sinérgicamente, como el TNF-α e IL-12 (Ding y col., 1988;
Belosevic y col., 1990).
31
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3. Susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania
2.2.3.1. Modelo L. major / ratón
La relación entre el sistema inmunitario y la evolución de la infección en leishmaniosis
está bien estudiada en el modelo experimental murino (Solbach, 1995). Este es, en efecto,
el caso de la infección experimental por L. major. En ella se determina que la evolución de
la leishmaniosis cutánea depende del balance de los fenotipos funcionales de los linfocitos
T CD4+. La respuesta de tipo Th1 corresponde a una lesión localizada, benigna y que se
resuelve espontáneamente; la respuesta Th2 implica una lesión severa, extensa y que no
cura de forma espontánea.
La transmisión natural de la leishmaniosis cutánea por L. major se lleva a cabo a través
del mosquito vector Phlebotomus papatasi, el cual inocula en la piel un pequeño número
(100 - 1000) de promastigotes metacíclicos en fase infectiva. L. major está ampliamente
distribuida en todo el norte de África, Oriente Medio y Asia Central. La infección de los
reservorios naturales roedores y hospedadores humanos, conlleva invariablemente al
desarrollo de lesiones cutáneas localizadas que eventualmente curan, y a la generación de
una inmunidad duradera frente a reinfecciones.
En el laboratorio, muchos genotipos murinos (cepas C57BL/6, C57BL/10, B10.D2,
C3H, A/J, DBA/1, AKR, CBA, NZB y STS/A) controlan también la infección por L.
major, la cual es iniciada típicamente por una inoculación de un gran número (104-107) de
parásitos en zonas subcutáneas, como la planta del pie o la base de la cola. Por otra parte,
ciertas estirpes (BALB/c y SWR/J) fallan en el control de la infección y desarrollan
lesiones progresivas y enfermedad sistémica.
Hay que precisar, sin embargo, que en este modelo experimental se han introducido
diversas variables que, en algunos casos, pueden alterar el resultado de la infección de una
u otra manera. Entre ellos se incluyen el estado de desarrollo de los parásitos utilizados
para la inyección -promastigotes metacíclicos purificados o bien poblaciones heterogéneas
32
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
de promastigotes en fase estacionaria (Sacks y col., 1985)-, la inyección de un bajo número
de parásitos (Bretscher y col., 1992), rutas alternativas de inoculación -incluyendo las vías
intravenosa, intradérmica e intranasal (Belkaid y col., 2000; Nabors y col., 1995; Constant
y col., 2000)- y formas naturales de infección usando el insecto vector (Kamhawi y col.,
2000). En este sentido, se ha podido comprobar que el sitio de distribución del antígeno
puede influenciar la preactivación de las células T. De esta manera, cuando los parásitos se
distribuyen intravenosamente o intranasalmente pueden provocar respuestas Th2
sostenidas y producir infecciones no curativas en ratones normalmente resistentes (Nabors
y col., 1995; Constant y col., 2000). También se ha podido observar que ratones BALB/c
desarrollan una resistencia estable a pequeños inóculos de parásitos en áreas subcutáneas
(Bretscher y col., 1992). Así, la administración de una baja dosis infectiva a estos ratones
parece mimetizar los eventos que normalmente ocurren en animales resistentes, en los
cuales no hay diseminación de parásitos más allá de los nódulos linfáticos de drenaje.
Aunque ciertos estudios han señalado que algunos antígenos de Leishmania dirigen la
respuesta hacia el tipo Th2 en ratones susceptibles (Scott y col., 1986), existe evidencia de
que la mayoría de las células T vírgenes pueden dar lugar hacia uno u otro tipo de
linfocitos Th, y que las citoquinas administradas o inducidas al tiempo de la infección
median esta diferenciación (Seder y Paul, 1994). Es muy probable que la susceptibilidad
genética de BALB/c a L. major se origine por un reconocimiento aberrante de epítopos del
parásito y generación de CD4+ Th2, tal que la IL-4 llega a ser tan abundante y temprana
que induce la pérdida de IL-12 (Locksley y col., 1999). De esta manera, la predisposición
genética para la susceptibilidad o resistencia a la infección por L. major, se correlaciona
con la dominancia de una respuesta Th2 dirigida por IL-4 que causa enfermedad, o una
respuesta dominante Th1 dirigida por IFN-γ que promueve curación y supresión de los
parásitos, respectivamente.
La manera en que se produce la diseminación de los parásitos desde el sitio de
inoculación hasta los nódulos linfáticos de drenaje y órganos viscerales es sustancialmente
33
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
diferente en ambas cepas. Así, en ratones susceptibles, la forma cutánea por L. major
provoca una enfermedad progresiva con rápida diseminación visceral (Laskay y col.,
1995), que está asociada a la aparición de células Th2 específicas del parásito. Como
resultado de esta diseminación, se pueden encontrar células T CD4+ que producen
espontáneamente IL-4 in vitro en nódulos linfáticos, hígado y bazo de BALB/c dos
semanas después de la infección, mientras que no aparecen en las vísceras de los C57BL/6
(Yamashita y col., 1999). Los ratones resistentes de esta cepa y de otras como la CBA o
C3H, controlan la infección y desarrollan una fuerte respuesta asociada a la aparición de
células Th1, observándose en ellos una contención temprana de los parásitos en la
almohadilla plantar del pie y nódulos linfáticos regionales (Laskay y col., 1995).
El hecho de que L. major sea secuestrada en fibroblastos (Bodgan y col., 2000) y
células dendríticas (Moll y col., 1995) se ha ofrecido como explicación al mantenimiento
de infecciones latentes después de la curación clínica en ratones resistentes (Aebischer y
col., 1993). A pesar de ser incapaces de alcanzar la esterilidad, los ratones curados
mantienen
una inmunidad duradera frente a reinfecciones. La presión inmunológica
durante la fase crónica es mantenida por las células T CD4+ y CD8+, y también por la IL12, IFN-γ y iNOS, pues ha sido demostrado que el deterioro de estas respuestas durante la
latencia promueve el crecimiento de los parásitos y la reaparición de lesiones (Stenger y
col., 1996; Stobie y col., 2000).
Estas diferencias inherentes a la cepa de hospedador, se corresponden con el dato de que
al menos seis loci genéticos murinos contribuyen a la resistencia frente a L. major (Beebe y
col., 1997; Lipoldova y col., 2000). Dichos genes operan sobre ciertas subpoblaciones de
macrófagos y sobre la programación precoz de linfocitos T y su modulación desde el
fenotipo 0 hacia los fenotipos Th1 o Th2 (Gorham, 1996).
34
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3.1.1. Susceptibilidad y respuesta Th2
La aparente resolución de la infección con L. major en ratones BALB/c tratados a lo
largo de la infección con anticuerpo monoclonal anti-IL-4 (Sadick y col., 1990; Chatelain
y col., 1992) o en ratones BALB/c deficientes en IL-4 (Kopf y col., 1996; Mohrs y col.,
1999), ayudó a establecer la idea de que la producción temprana de IL-4 conduce a una
respuesta polarizada Th2. Esta respuesta está estrictamente limitada a una población
oligoclonal de células T CD4+ con un receptor denominado Vβ4Vα8, que reconoce al
antígeno LACK -homólogo de los receptores para la kinasa C activada- de Leishmania
(Launois y col., 1997). Esta conclusión se basa en la observación de que tanto los BALB/c
deficientes en Vβ4 (Himmelrich y col., 2000) como los tolerantes a LACK (Julia y col.,
1996), elevan su respuesta Th1 más que la cepa salvaje de BALB/c y controlan sus
lesiones. Sin embargo, hay que añadir que estos ratones transgénicos a LACK (IE-LACK),
aunque presentan resistencia a L. major, son susceptibles a L. mexicana (Torrentera y col.,
2001).
La respuesta de IL-4 tras la infección con L. major en ratones resistentes, aunque
aparece de forma temprana y transitoria, ha sido un hallazgo claramente consistente
(Morris y col., 1992; Reiner y col., 1994; Heinzel y col., 1995; Scott y col, 1996; Belkaid y
col., 2000). Además, a pesar de que se ha visto que inyecciones de IL-4 (Chatelain y col.,
1992) o anticuerpos anti-IL-12 (Hondowicz y col., 1997) en el momento de la infección
promueven una fuerte respuesta Th2 en ratones C3H, la respuesta es momentánea y no
revierte el fenotipo resistente normal de estos animales a largo plazo. Tomando
conjuntamente estos datos, se deduce que la habilidad de redirigir la respuesta temprana de
Th2 es el determinante más probable de la resistencia en el modelo murino. Esta necesidad
de abolir la respuesta de citoquinas Th2 para efectuar la cura, ha sido mostrada usando
ratones originalmente resistentes pero transgénicos, que presentaban una expresión
constitutiva de IL-4 (Leal y col., 1993; Erb y col., 1996) o IL-10 (Groux y col., 1999). Los
ratones fallaron en el control de la infección, a pesar de generar una respuesta Th1
35
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
relativamente fuerte.
Hay estudios que indican, sin embargo, que el componente IL-4 de la respuesta Th2 no
es suficiente y, en algunos casos, no es necesario para determinar la susceptibilidad en las
cepas sensibles a L. major. En este sentido, se ha comprobado que ratones deficientes en
IL-4 controlan sólo parcialmente la infección, aunque este control es mucho más elevado
en ratones deficientes en el receptor de cadena α o IL-4Rα (Noben-Trauth y col., 1996).
Como el IL-4Rα es compartido entre los receptores para la IL-4 y la IL-13, estos
resultados indican un papel potencial de la IL-13 como mediador de la susceptibilidad a L.
major. Recientes estudios confirman que esta citoquina es un factor de susceptibilidad en
la infección, y que hay un efecto aditivo si se eliminan ambas IL-4 e IL-13 (Matthews y
col., 2000).
El TGF-β, bajo ciertas condiciones, se ha visto que suprime el desarrollo de las células
Th1 e inhibe la activación de los macrófagos.
En la infección por L. major, se ha
comprobado que ratones tratados durante la fase crónica de la enfermedad con TGF-β
exacerban sus lesiones, y, por otra parte, incrementan su resistencia tras la administración
de anticuerpos anti-TGF-β (Li y col., 1999). Aunque el tratamiento con anticuerpos no
alteró el patrón de producción de IL-4 o IFN-γ, sí incrementó la producción de óxido
nítrico por los macrófagos en las lesiones parasitadas.
Respecto al papel de la IL-10, inicialmente se pensó que no era relevante en el
desarrollo de la infección por L. major, pues el tratamiento de BALB/c con un anticuerpo
monoclonal anti-IL-10 tenía un efecto muy leve en revertir la progresión de la enfermedad
(Powrie y col., 1994; Chatelain y col., 1999). Sin embargo, la importancia de la IL-10 en la
susceptibilidad necesita ser reconsiderada a la vista de estudios recientes: los ratones
resistentes que expresan un transgen codificante para la IL-10 son más susceptibles a la
infección por L. major (Groux y col., 1999), y los ratones con fondo BALB/c cruzados
36
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
durante varias generaciones con animales deficientes en IL-10 son marcadamente más
resistentes a la infección por L. major que el tipo salvaje BALB/c (Kane y Mosser, 2001).
Como el tratamiento con los anticuerpos anti-CD4 inhibe la expresión de IL-10 en células
de ganglios linfáticos 4 días después de la infección (Reiner y col., 1994), es probable que
la fuente crucial de IL-10 in vivo sean las células T CD4+. Efectivamente, las T CD4+ de
BALB/c infectados expresan altos niveles de ARN mensajero para ambas IL-4 e IL-10
(Reiner y col., 1994). En este sentido, se ha observado que los ratones deficientes en IL4Rα no son tan resistentes como los doblemente deficientes en IL-4Rα e IL-10, o como los
deficientes en IL-4Rα tratados con anticuerpos anti-IL-10R, los cuales tienen un fenotipo
resistente comparable al de los ratones C57BL/6.
En el caso de la leishmaniosis humana, la sobreproducción de IL-10 detectada en
lesiones cutáneas crónicas (Melby y col., 1994), en tejidos lesionados procedentes de
pacientes con kala-azar (Karp y col., 1993) y en plasma de pacientes con leishmaniosis
dérmica post-kala-azar (Gasim y col., 1998), parece contribuir en mayor grado a la
susceptibilidad que la producción de IL-4.
Se ha comprobado que la IL-10 tiene un papel crucial en la cronicidad, por la
incapacidad del parásito para establecer una infección persistente después de la curación en
ratones C57BL/10 deficientes en esta citoquina, y por la inmunidad estéril alcanzada en
ratones de la cepa salvaje tratados durante la fase crónica con anticuerpos anti-IL-10
(Belkaid y col., 2001). Incluso en casos de curación, la IL-10 continúa siendo producida
conjuntamente con el IFN-γ (Louzir y col., 1998; Bosque y col., 2000), lo cual puede
explicar la incapacidad de estos individuos en alcanzar la cura estéril. Como contrapartida,
es importante resaltar que los ratones deficientes en IL-10 y los tratados con anticuerpos
frente al receptor de esta citoquina lograron la esterilización, pero no fueron, sin embargo,
inmunes a reinfecciones (Belkaid, 2003), lo cual indica que el mantenimiento de células T
efectoras de memoria requiere la persistencia del estímulo antigénico.
37
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3.1.2. Importancia de la respuesta de IL-12
La habilidad de la IL-12 exógena para reconducir la respuesta temprana Th2 en BALB/c
y para conferir resistencia está bien demostrada (Heinzel y col., 1993; Sypek y col., 1993),
así como el efecto de la disrupción genética de la IL-12 en la regulación positiva de la
expresión de IL-4, y el consecuente establecimiento de la enfermedad progresiva en
ratones normalmente resistentes (Belkaid y col., 2000). En este sentido, se ha observado
una respuesta Th2 más fuerte y sostenida y una exacerbación de la enfermedad en ratones
resistentes tratados con anticuerpos anti-IL-12 (Heinzel y col., 1993; Heinzel y col, 1995),
aunque a menos que el tratamiento se mantenga, la respuesta de IL-12 se recupera y la
infección es controlada.
La producción de IL-12 a lo largo de la infección por L. major se retrasa normalmente
hasta el día 7 post-infección (Heizel y col., 1995) incluso en ratones resistentes. La
incapacidad de L. major para desencadenar una respuesta temprana de IL-12 puede
explicar por qué la respuesta inicial en cepas murinas sensibles deriva hacia la vía Th2.
Así, la susceptibilidad de BALB/c parece estar basada en algún fallo en la producción de
IL-12 que impide redirigir la respuesta Th2 inicial. Como posible explicación a la
respuesta defectiva en IL-12 de estos ratones, se ha propuesto una pérdida selectiva de la
señalización debido a una baja expresión del receptor de cadena β2 (IL-12Rβ2) de esta
citoquina (Hondowicz y col., 2000). Se piensa que la inestabilidad de la expresión de este
receptor en BALB/c ocurre a través de un proceso dependiente de IL-4 (Himmelrich y col.,
1998) y de un mecanismo todavía poco definido y genéticamente controlado independiente
de dicha interleuquina (Guler y col., 1996). Sin embargo, los BALB/c que expresan
transgénicamente el IL-12Rβ2, mantienen un fenotipo no curativo a pesar de la estable
señalización de IL-12. En este sentido, se postula que el entorno inflamatorio o tisular en el
cual la respuesta temprana de Th2 está inducida podría también influir en el desarrollo de
la infección. Por ejemplo, los neutrófilos- que se mantienen varias semanas en una alta
proporción en el infiltrado inflamatorio de la pata inoculada de BALB/c, pero sólo
38
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
transitoriamente en C57BL/6 (Beil
y col., 1992)- pueden contribuir a la inducción
sostenida de la respuesta Th2, ya que la depleción de los neutrófilos en el momento de la
infección en BALB/c inhibe la respuesta de IL-4 y promueve resistencia parcial (TacchiniCottier, 2000).
Es necesario destacar que los efectos de ambas citoquinas IL-12 e IL-4 son paradójicos,
pues dependiendo del momento de su secrección el resultado puede ser protector o nulo
(Noormohammadi y col., 2001; Biedermann y col., 2001).
2.2.3.1.3. Desarrollo de células Th1 y resistencia
De acuerdo con el concepto de que las citoquinas inflamatorias tipo Th1 son mediadoras
de protección, la supresión genética de éstas (IL-12, IFN-γ y TNF), sus receptores (IFNγR) y factores de transcripción (T-bet y STAT4) o moléculas co-estimulatorias (CD40CD40L) que están implicadas en el desarrollo funcional de las células Th1 conduce a la
susceptibilidad frente a L. major. Para los ratones deficientes en IL-12 (Mattner y col.,
1996), IFN-γ (Wang y col., 1994) o en las interacciones CD40-CD40L (Campbell y col.,
1996; Kamanaka y col.,1996), la respuesta inmune hacia L. major gira hacia la vía Th2, la
cual está asociada con la producción defectiva de esta citoquina. En el caso de ratones
deficientes en IFN-γR (Swihart y col., 1995) o STAT4 (Stamm y col., 1999), no se observa
giro hacia respuesta Th2, lo cual indica que la producción o actividad deteriorada de las
citoquinas efectoras (Th1), y no la regulación positiva de la expresión de las citoquinas
desactivadoras (Th2), es la responsable de la incapacidad de curar.
Es interesante destacar que el IFN –γ aparentemente no altera el curso de la infección en
ratones susceptibles, pero que la producción temprana de IL-12 suprime la transcripción de
IL-4, mientras que la activación de IFN–γ (Heinzel y col., 1993) y la persistencia de IL-12
endógena se requiere para el sostenimiento de la respuesta Th1 y el control a largo plazo de
la infección (Stobie y col., 2000).
39
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Alternativamente, en ausencia de señalización para la IL-12, otras citoquinas Th1 como
la IL-18 pueden inhibir el giro hacia una respuesta Th2. En efecto, se ha visto que la
respuesta de IL-4 se incrementa en ratones deficientes en IL-18 (Monteforte y col., 2000),
así como la proliferación temprana de parásitos en estos animales. Está claro, sin embargo,
que en ausencia de IL-12, la IL-18 no es suficiente para conducir la inmunidad a L. major,
y no es requerida en ratones competentes para la IL-12, ya que los ratones C57BL/6
deficientes en IL-18 son capaces de curar en última instancia y extinguir la respuesta de
IL-4 inducida tras la infección (Monteforte y col., 2000).
Aunque algunos factores alternativos pueden cooperar con la IL-12 para redirigir la
respuesta temprana Th2 e influir en los estadios tempranos de
infección en ratones
resistentes, la señalización IL-12 / IL-12R es esencial para establecer y mantener la vía
curativa Th1. En concreto, las lesiones de los C57BL/6 curados que contienen parásitos
persistentes se reactivan tras el tratamiento con anticuerpos anti-IL-12 (Stobie y col.,
2000), y las células Th1 de ratones curados no son capaces de transferir inmunidad a
ratones deficientes en IL-12 (Park y col., 2000).
2.2.3.1.4. Moléculas efectoras implicadas en resistencia adquirida
Se sabe que los animales deficientes en moléculas efectoras implicadas en la activación
de los macrófagos y vías de respuesta microbicida son susceptibles a L. major. Así, los
ratones carentes de iNOS (Wei y col., 1995) o TNF (Wilhelm y col., 2001) no pueden
controlar la infección. Curiosamente, animales deficientes en los receptores TNFR1 y
TNFR2 pueden controlar la replicación parasitaria, a pesar de que fallan en la resolución
de las lesiones (Nashleanas y col., 1998).
La inducción de iNOS y producción de NO parece no ser suficiente en la función
microbicida, ya que ratones deficientes en Fas (CD95) o ligando del Fas (FasL) no son
capaces de eliminar L. major a pesar de la incrementada producción de NO (Huang y col.,
40
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1998). En base a estos hallazgos, se puede concluir que la apoptosis de los macrófagos
infectados a través de la vía Fas-FasL parece contribuir a la resistencia del hospedador.
2.2.3.2. Modelos de leishmaniosis visceral murina (L. infantum- L. donovani)
El estudio de las leishmaniosis experimentales en líneas murinas consanguíneas ha
mostrado la existencia de un control genético de la infección a través del sistema inmune.
En el modelo ratón/L. donovani, el gen de la susceptibilidad/ resistencia precoz a la
infección visceral está localizado en el gen Nramp1, localizado en el locus LSH en el
sistema H2. El alelo “r” de este gen codifica 2 moléculas transmembranales que están
presentes en el compartimento endosomal de los macrófagos (Blackwell, 1996).
La respuesta inmune originada por la infección de L. donovani o L. infantum en ratón es
similar a la observada por L. major. Sin embargo, los ratones BALB/c no muestran una
susceptibilidad igual a estos parásitos, puesto que la inyección intravenosa de las formas
viscerales da como resultado una infección crónica que tiende a curar espontáneamente y
controlar la diseminación de la infección. Además, los fenotipos de citoquinas que se
inducen tras la infección con formas viscerotrópicas no son las típicas de una respuesta
Th2 (Kaye y col., 1991).
41
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.3. LA ENZIMA ARGINASA Y SU IMPLICACIÓN EN EL SISTEMA INMUNE
2.3.1. METABOLISMO DE LA L-ARGININA EN MAMÍFEROS
La arginina es un aminoácido denominado semi-ensencial, que puede tener, como se
aprecia en la Fig.1, distintos destinos metabólicos. Además de la clásica y bien conocida
función en el ciclo de la urea (se hidroliza a L-ornitina mediante la acción de las
arginasas), es requerida para la síntesis de creatinina y también es sustrato para las NO
sintasas, que producen NO (Stuehr y col., 1989), de efectos citostáticos y microbicidas. La
L-ornitina, por su parte, puede salir del ciclo de la urea y ser sustrato para la ornitina
descarboxilasa (ODC), enzima limitante en la síntesis de poliaminas, o bien ser sustrato de
la ornitina aminotransferasa (OAT) para la síntesis de prolina, que es la etapa limitante en
la formación de colágeno (Albina y col., 1989). La actividad ODC y la síntesis de
poliaminas aumentan durante la proliferación celular, y la síntesis de colágeno a partir de
prolina, durante la cicatrización de las heridas y reparación tisular. Por tanto, los factores
que determinen las velocidades relativas de flujo de la L-arginina entre la arginasa y la
iNOS son importantes en la regulación del mantenimiento y reparación de los tejidos
(Hibbs, 1991).
iNOS
L-OH-ARGININA
(LOHA)
CITRULINA+NO
CITOTOXICIDAD
CITOSTASIS
L-ARGININA
ARGINASA I
UREA + L-ORNITINA
ODC
OAT
SÍNTESIS
DE
PROTEÍNAS
SÍNTESIS
DE
CREATINA
SÍNTESIS DE
POLIAMINAS
SÍNTESIS DE
PROLINA
Proliferación y
diferenciación
Formación de
colágeno
REPARACIÓN
DE TEJIDOS
Figura 1: Principales destinos metabólicos de la L-arginina y enzimas implicadas.
42
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.3.2. REGULACIÓN DEL METABOLISMO DE LA ARGININA EN MACRÓFAGOS
En los macrófagos, el metabolismo de la L-arginina determina en gran parte su estado
funcional y capacidad para desarrollar una función efectora. Los macrófagos murinos
activados, metabolizan la arginina por dos vías alternativas que incluyen las enzimas iNOS
y arginasa (Modolell y col., 1995).
Se ha demostrado que el balance entre las dos enzimas es regulado competitivamente
por las células Th1 y Th2 a través de la secreción de citoquinas (Fig. 2). Así, una
respuesta Th1 induce a la iNOS, mientras que una respuesta Th2 induce a la arginasa I.
Además, la inducción de cada una de estas enzimas va acompañada de la supresión de la
otra, indicativo de dos estados competitivos en macrófagos murinos (Corraliza y col.,
1995; Modolell y col., 1995). Esta competición también ocurre a otros niveles: la arginasa
reduce la síntesis de NO por depleción de sustrato (Modolell y col., 1995; Gobert y col.,
2000) y la LOHA, intermediario en la síntesis de NO, es el inhibidor fisiológico más
potente de las arginasas (Daghigh y col., 1994).
2.3.2.1. Vía de la Óxido Nítrico Sintasa inducible (iNOS)
De la enzima NO sintasa existen tres isoformas: una es inducible por citoquinas y otros
agonistas que activan al macrófago (NOS II o iNOS), las otras dos (I y III) son
constitutivas y producidas por muchos tipos celulares. El flujo de arginina a través de
iNOS (Fig. 1) tiene como consecuencia la producción de altos niveles de NO y citrulina,
que producen una acción citostática y otros efectos metabólicos (Hibbs y col., 1988;
Marletta, 1989; Stuehr y col., 1989).
En los macrófagos, el NO se produce por la conversión de arginina y oxígeno a citrulina
y NO por la iNOS. Esta enzima cataliza la conversión en dos pasos (tal y como se observa
en la Fig. 1). En el primero, la arginina es hidroxilada hacia Nϖ-hidroxy-L-arginina
(LOHA) y, en el segundo, la LOHA es oxidada hacia citrulina y NO (Stuehr y col., 1991).
Sin embargo, este aminoácido oxidado (LOHA) no es meramente un intermediario
43
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
inestable en la síntesis de NO. Varios estudios han demostrado que puede ser secretado por
células y está presente en el plasma humano y de rata (Wigand y col., 1997). Además, ha
sido publicado que la LOHA es una diana de varios radicales inorgánicos como el
superóxido (Vetrovsky y col., 1996), además de sustrato de otras oxidasas aparte de la
iNOS (Boucher y col., 1992), dando lugar a derivados alternativos del nitrógeno. Sin
embargo, la conversión de arginina a LOHA permanece como característica exclusiva sólo
de la iNOS.
Esta vía metabólica es inducida en macrófagos y otras células somáticas como
mecanismo para controlar la proliferación de células normales y neoplásicas, así como de
gran variedad de microorganismos, especialmente de parásitos intracelulares (Hibbs,1991;
Bodgan y col.,2000), ya que la producción de NO en concentraciones micromolares, es
citotóxica tanto para los organismos microbianos como para células tumorales. Una
consecuencia de la alta producción de NO por la iNOS es la formación de complejos ferronitrosos, con la inhibición de muchas enzimas dependientes de hierro y el bloqueo de la
replicación de DNA (Lancaster y Hibbs, 1990).
Los niveles de iNOS en macrófagos activados están regulados mediante complejos
mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales (Bodgan y col., 2000; Taylor y
Geller, 2000). La lista de agentes capaces de aumentar la expresión de la iNOS en
macrófagos a nivel transcripcional o transduccional, y normalmente en sinergismo con
IFN-γ (que estabiliza el mRNA de la enzima), sigue en continuo crecimiento. Las
moléculas del sistema inmune activadoras de la iNOS están representadas en la Fig. 2.
Hay que apuntar que la producción incontrolada de NO también puede ser perjudicial,
provocando daño tisular y disfunción o muerte celular (Murphy, 1999).
Se ha demostrado que al menos 11 productos naturales bloquean la expresión de la
enzima. El LPS, por ejemplo, tiene un efecto supresor si se añade en muy pequeñas
concentraciones y a partir de las 8 horas anteriores a la adición del IFN-γ (Bodgan y col.,
1993), pero no se sabe todavía si la inhibición es a nivel transcripcional o post44
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
transcripcional. Los corticosteroides como la dexametasona, por otra parte, pueden
bloquear su transcripción y parecen también suprimir la iNOS a nivel post-transduccional.
Por último, se conocen tres grandes tipos de citoquinas que juegan un importante papel
en la regulación negativa de la producción de NO por los macrófagos activados: La IL-10,
el TGF-β y el grupo de la IL-4/ IL-13 (Fig. 2). La IL-10, por su parte, es un inhibidor
relativamente débil de los niveles de iNOS. Bloquea la transcripción indirectamente,
impidiendo que los macrófagos produzcan TNF-α, que sinergiza con el IFN-γ en la
inducción de la iNOS. El TGF-β, por otro lado, regula negativamente los niveles de iNOS
mediante múltiples mecanismos (Vodovotz y col., 1993): desestabiliza su mRNA,
disminuye su traducción y favorece la degradación de la proteína. Estudios con ratones
carentes de IL-10 o TGF-β1, han mostrado que ambas citoquinas juegan papeles
esenciales, aunque diferentes, en la regulación negativa de la iNOS (Vodovotz y col.,
1996; Murray y Young, 1999). El tercer grupo incluye la IL-4 y la IL-13, citoquinas
relacionadas entre sí que son poderosos inhibidores de la producción de NO de los
macrófagos activados (Bodgan y col., 1994, 1997).
2.3.2.2. Vía de la Arginasa
Los macrófagos tienen un ciclo de la urea completo (Hoffman y col., 1978), lo que
supone que existe una producción constitutiva de ornitina y urea a partir de la arginina, por
acción de las arginasa.
Estas células son capaces de expresar dos isoformas de la enzima: arginasa I y arginasa
II. Las dos son inducibles, aunque los macrófagos no tratados poseen siempre una
actividad basal de las mismas. Ambas pueden ser activadas por sustancias farmacoactivas
como análogos del AMP cíclico o prostaglandina E2 (Corraliza y col., 1995). La arginasa
I es inducida por citoquinas Th2 (Fig. 2) como la IL-4 y la IL-10 (Corraliza y col., 1995 b;
45
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Louis y col., 1999), además del factor de crecimiento TGF-β (Boutard y col., 1995),
siendo la IL-4 y su homóloga la IL-13 los mayores inductores de esta isoforma (Munder y
col., 1998).
La arginasa I y la ODC están ambas localizadas en el citosol celular, facilitando la
síntesis de poliaminas a partir de la L-ornitina. La arginasa II, por su parte, es una enzima
mitocondrial que fundamentalmente parece incrementar la síntesis de L-prolina o Lglutamato a partir de la L-ornitina, porque la ornitina aminotransferasa (OAT) está también
localizada en la mitocondria. Sin embargo, se ha comprobado que la L-prolina puede ser
convertida en L-ornitina, la cual puede ser transportada de la mitocondria al citosol (Wu y
Morris,1998). De esta forma, ha sido demostrado que ambas arginasas I y II regulan la
síntesis de poliaminas (Li y col., 2001).
En contraste con el bien documentado papel de la iNOS en los macrófagos, hasta la
fecha no existen apenas datos sobre las funciones de la arginasa en los mismos. Así, la
acción precisa de la inducción de esta enzima en asociación con moléculas del sistema
inmune está poco definida (Fig. 2).
46
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
L-ARGININA
Th1
Th2
IL-1
TNF-α
IFN-γ
IL-12
IL-18
IL-4
IL-10
IL-13
TGF-β
iNOS
LOHA
Citrulina + NO
M1
ACTIVACION
CITOTOXICIDAD
INHIBICIÓN
ARGINASA I
L-Ornitina + urea
POLIAMINAS
M2
DESACTIVACION
¿...?
Figura 2: Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos. Influencia de la acción de
los distintos tipos de citoquinas sobre la actividad arginasa y iNOS y sus consecuencias.
47
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.3.3. PAPEL DE LA ARGINASA EN LA RESPUESTA INMUNE
Desde su descubrimiento en los macrófagos por Kung y colaboradores en 1977, a la
arginasa se le han atribuido múltiples funciones. Estos autores mostraron que en cultivos
mixtos de leucocitos, la adición de macrófagos peritoneales suprimía la generación de
linfocitos citotóxicos, y ese efecto estaba asociado con una desaparición de la arginina en
el medio de cultivo y un concomitante aumento de la actividad arginasa.
La primera evidencia de la participación de la arginasa en la respuesta citotóxica de los
macrófagos fue la demostración de Currie (1978), por la cual los macrófagos activados con
LPS producían una inhibición de la proliferación celular y la lisis de varias líneas
diferentes de tumores (más dependientes de este aminoácido que las células normales, para
su constante crecimiento y síntesis de DNA). Los sobrenadantes de estos macrófagos
activados tenían el mismo efecto, pero su actividad se restablecía añadiendo arginina a los
cultivos.
A partir de estos descubrimientos, en los años sucesivos se publicaron varios trabajos
que hacían referencia al papel de la arginasa en las infecciones por microorganismos. Así,
se detectaron altos niveles de esta enzima en fluído ascítico de ratones infectados con
Corynebacterium parvum (Currie y Cifuentes, 1979).
También se describió un efecto de la arginasa en la replicación viral, debido al hecho de
que muchos virus requieren del aminoácido arginina para su replicación (Archard y col.,
1971). Currie y col. (1979) especularon que la arginasa podría estar implicada en la
limitación del crecimiento de algunos virus dependientes de arginina. Esta hipótesis fue
soportada por Widly y col. (1982), quienes demostraron que macrófagos activados con
proteasa peptona podían depleccionar suficiente arginina del medio como para abortar la
replicación del virus del herpes simplex in vitro, y a la vez detectaron actividad arginasa
tanto intracelularmente como en los sobrenadantes.
Schneider y Dy (1985b) fueron los primeros que intentaron estudiar la regulación de
esta enzima por citoquinas. Postularon que podría ser la IL-3, pero sus resultados fueron
48
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
poco concluyentes.
Es decir, en casi todos los trabajos detallados hasta esa fecha parecía existir un efecto
supresor de la arginasa de macrófagos sobre la proliferación, tanto de células tumorales
como de parásitos o virus. Ello se debía fundamentalmente al hecho de que durante los
años en que se publicaron estos experimentos aún no había sido descubierto el óxido
nítrico, y en consecuencia, no se sabía que la iNOS utiliza también la arginina como
sustrato, y que al inducirse en los macrófagos activados podría estar contribuyendo
igualmente a la depleción de este aminoácido.
En 1987, Hibbs y colaboradores empiezan a describir que la citotoxicidad de los
macrófagos contra células tumorales es dependiente de L-arginina, e inhibible por Nmonometil-L-arginina o NMMLA (lo que después se descubriría que es la vía de la iNOS),
y apuntaron ya a una posible inhibición por la arginasa de este mecanismo efector
dependiente de arginina que descubrieron en los macrófagos.
Posteriormente, Granger y col. (1990) analizan el destino metabólico de la arginina y su
relación con la capacidad microbicida de los macrófagos y describen que, de toda la
arginina que se metaboliza, tan sólo una tercera parte se transforma en citrulina y NO,
mientras que los dos tercios restantes son metabolizados a ornitina y urea, proponiendo un
posible papel de la arginasa en controlar la síntesis de NO.
Paralelamente a estos estudios, Albina y col. (1990) analizaron la expresión temporal de
arginasa y de iNOS en curación de heridas, y encontraron que al principio de la
inflamación el fluido analizado contenía preferentemente citrulina y NO. La expresión de
la iNOS en las primeras fases provocaba microbiostasis y favorecía la citotoxicidad. Pero a
medida que la herida comenzaba a cicatrizar, sin embargo, aparecía un incremento de la
actividad arginasa, produciendo un ambiente favorable para el proceso de reparación
tisular. Por tanto postularon que la arginasa podría sintetizada para la producción de
ornitina requerida en la síntesis de colágeno y/o incrementendo la proliferación celular vía
generación de poliaminas a partir de ornitina (Albina y col., 1993).
49
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
En 1992, Mills y colaboradores demostraron que la capacidad del sistema inmune para
eliminar un tumor o permitir su
crecimiento, era estrechamente dependiente de la
capacidad dual de los macrófagos intratumorales para metabolizar la arginina por la vía
iNOS o por la vía de la arginasa. En el modelo murino, si los ratones estaban
preinmunizados antes de infiltrarle el tumor, éste sufría una regresión a los pocos días, y
los macrófagos intratumorales mostraban una elevada síntesis de NO y citrulina. Por el
contrario, los macrófagos encontrados en animales no inmunizados, en los que el tumor
estaba creciendo, producían localmente ornitina y urea, con lo que se concluyó que la vía
metabólica por la que los macrófagos degradan la arginina puede influenciar el tipo de
respuesta inmune del hospedador contra los tumores. En este sentido, ha sido también
descrito recientemente que la arginasa está inducida en el cáncer de mama humano (Buga y
col., 1998), sugiriéndose que esta enzima desempeñe un papel crucial en el crecimiento y
proliferación de las células neoplásicas.
También se ha comprobado que la arginasa está inducida en otras patologías humanas
como la gromerulonefritis (Waddington y col., 1998), y que está altamente sobreexpresada
en la epidermis afectada de psoriasis hiperproliferativa (Bruch-Gerharz y col., 2003) y en
pacientes con distintas formas de artritis (Corraliza y Moncada, 2002). En este último caso,
el NO es considerado un inhibidor clave en la proliferación celular de los queratinocitos, y
la arginasa actúa compitiendo por el sustrato con la iNOS y limitando la actividad de esta
última.
La actividad arginasa por tanto parece estar íntimamente ligada con el crecimiento
celular y la producción de colágeno, y ambas actividades son parámetros llave en la
generación de respuestas inflamatorias.
Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral, han aparecido nuevas investigaciones que
avalan la demostración de que la arginasa está muy directamente implicada en los
fenómenos de proliferación celular, pero además numerosos trabajos demuestran que en
50
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
tejidos o en estadios temporales de procesos inflamatorios, en los cuales las dos enzimas
estan inducidas, la arginasa mediada por citoquinas Th2 podría servir para regular el
potencial destructor de tejidos de la producción excesiva de NO (Rutschman y col., 2001).
Este escenario también es probable que sea significativo en aquellas áreas orgánicas
donde la arginina puede llegar a ser limitante (Chang y col., 1998), como en granulomas,
infecciones por mycobacterias y Schistosoma, enfermedades autoinmunes, tejidos en
reparación, hiperinflamación de las vías inflamatorias, tumores sólidos (Curie y col., 1979)
o regiones del cerebro. En estos ejemplos, la generación de NO puede estar
significativamente reducida, incluso aunque los niveles de iNOS sean elevados. Así, la
detección inmunológica de iNOS como marcador para la concentración de NO puede tener
un valor limitado si las mismas células o tejidos expresan niveles significativos de
arginasa.
51
3.
MATERIAL
Y MÉTODOS
Unidad de Parasitología. Laboratorio.
MATERIAL Y MÉTODOS
3.- MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. MATERIAL
3.1.1. Material Biológico
3.1.1.1. Ratones y células murinas
Para la realización de los estudios in vitro se utilizaron macrófagos de ratón (Mus
musculus) de las cepas BALB/c (susceptible a la infección por Leishmania), C57BL/6
(resistente a la infección por Leishmania), así como la variante iNOS-Knock Out de esta
última.
Las cepas murinas BALB/c y C57BL/6 proceden de Janvier España, S.L. y fueron
mantenidas en el Servicio de Animalario de la Universidad de Extremadura en Cáceres,
mientras que las células pertenecientes a la cepa iNOS-Knock Out fueron cedidas por el
Max-Plack-Institut für Immunobiologie de Freiburg (Alemania). Durante todo el ciclo vital
de los ratones, se aplicaron las medidas necesarias para garantizar las condiciones
sanitarias idóneas en estudios con células inmunes como los
macrófagos.
Los
animales
fueron
sacrificados
por
1
dislocación cervical a una edad comprendida entre la seis y
las ocho semanas.
Para los estudios in vivo se utilizaron ratones adultos de
ambos sexos de las mismas cepas BALB/c y C57BL/6,
los cuales se mantuvieron también en condiciones de
2
aislamiento y libres de patógenos, y se sacrificaron de
igual manera al finalizar los ensayos.
Figuras 1 y 2: Ratones de las cepas consanguíneas BALB/c (1) y C57BL/6 (2)
55
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.1.2. Parásitos
Las dos especies de Leishmania utilizadas en los estudios fueron:
- Leishmania infantum, con código de la OMS M/ CAN/ ES/ 96/ BCN 150, tipificada
como zimodema 1 en el Laboratorio de Parasitología de
la Facultad de Farmacia (U.A. Barcelona), y aislada en
3
nuestro laboratorio a partir de un perro con leishmaniosis
visceral.
- Leishmania major, con código M/ IR/ -/ 173, cedida por
el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (Madrid).
Figura 3: Promastigotes en cultivo
3.1.2. Medios de cultivo
3.1.2.1 Medio de cultivo completo para macrófagos diferenciados
Constituido por RPMI 1640 (Sigma), que se suplementa con:
•
10% suero fetal bovino inactivado (Sigma)
•
2 mM de glutamina (Sigma) disuelta en PBS estéril
•
100 unidades/ ml de penicilina-estreptomicina (Sigma)
3.1.2.2. Medio de cultivo condicionado
Se utilizó para diferenciar las células precursoras de la médula ósea hasta macrófagos, y
tiene los mismos componentes que el medio completo pero añadiendo:
•
30% de sobrenadante de la línea de fibroblastos murinos L929 (fuente del Factor
estimulador del Crecimiento de Colonias Granulocito-Macrófagicas o GM-CSF)
•
56
5% de suero de caballo inactivado (Sigma)
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.2.3. Medio de cultivo para aislamiento de Leishmania
•
Schneider´s Insect Medium (Sigma)
•
10% suero fetal bovino inactivado por calor (Sigma)
•
100 unidades/ ml de penicilina y 0,1 mg de estreptomicina (Sigma)
3.1.2.4. Medio de cultivo para mantenimiento de Leishmania
•
RPMI 1640 modificado con tampón HEPES (Sigma)
•
10% suero fetal bovino inactivado por calor (Sigma)
•
100 unidades/ ml de penicilina/estreptomicina (Sigma)
3.1.3. Tampones
3.1.3.1. Tampón fosfato (PBS)
PBS 10x
El tampón fosfato o Phosphate Buffered Solution (PBS) fue el utilizado como base para
la realización de las técnicas ELISA e inmunohistoquímica. En su preparación se empleó:
-
NaCl (Scharlau)..................................................174 g
-
Na2HPO4. 2H2O (Scharlau)...............................32,28 g
-
NaH2PO4. 1H2O (Scharlau)......................................6 g
-
Agua destilada..........................................c.s.p. 2000 ml
Así se obtiene PBS 10 veces concentrado, con el fin de prevenir la contaminación
bacteriana y fúngica. Se conserva a 4ºC. En el momento de su uso se diluye con agua
destilada en una proporción 1:9, obteniendo un PBS 0.01 M de pH 7,2.
PBS 1x/ Tween® –20 al 0,05%
Se utiliza para la dilución de sueros y lavados en ELISA e inmunohistoquímica. Se
prepara de la siguiente forma:
57
MATERIAL Y MÉTODOS
-
PBS 10x .............................................................100 ml
-
Agua destilada ....................................................900 ml
-
Tween®-20 (Merk) ..................................c.s.p. 1000 ml
PBS 1x para uso en cultivos
Fue elaborado disolviendo tabletas preparadas (Buffered Phospate Tablets, Sigma) en
agua destilada Milli-Q según las proporciones indicadas por el fabricante, y posteriormente
autoclavado para su completa esterilización.
3.1.3.2. Tampón citrato-fosfato pH 5
Se usa para la disolución del sustrato o-phenilendiamine (OPD) en la técnica ELISA.
-
Ácido cítrico monohidrato (Sigma)......................5,85 g
-
Na2HPO4. 2H2O (Scharlau)................................11,07 g
-
Agua destilada..........................................c.s.p. 1000 ml
Se ajusta el pH y se conserva a 4ºC.
3.1.3.3. Tampón Tris-HCl
Tris-HCl 200 mM pH 7,4
Se utiliza en la determinación de la actividad arginasa en cultivos celulares o tejidos.
Se prepara a partir de Tris-HCl (Sigma) a una concentración de 200 mM en agua
destilada, ajustando a continuación el pH con NaOH hasta 7,4. Conservar a 4º C.
Tris-HCl 500 mM pH 6.8
Se utiliza para la preparación del tampón de la muestra de electroforesis.
Se prepara a partir de Tris-HCl (Sigma) a una concentración de 500 mM en agua
destilada, ajustando a continuación el pH con NaOH hasta 6,8. Conservar a 4º C.
58
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.3.4. Tampón de la muestra para electroforesis
Se usa en el desarrollo de la técnica de Western Blotting.
-
Agua destilada .............................................3,8 ml
-
Tris-HCl 500 mM pH 6,8 ...............................1 ml
-
SDS (Sigma) al 10% en agua destilada........1,6 ml
-
Glicerol (Scharlau) ......................................0,8 ml
-
β-mercaptoetanol (Merk) ............................0,4 ml
-
Azul de bromofenol (BioRad) 0,05 %.........0,4 ml
3.1.4. Reactivos, citoquinas y otros productos
A) Ensayos in vitro
•
Citoquinas, agonistas e inhibidores enzimáticos
-
IL-4, IL-10 y IFN-γ murinas recombinantes de PeproTech.
-
LPS de Salmonella minessota y L-Ornitina de Sigma-Aldrich.
-
Superóxido dismutasa (SOD) libre de endotoxina de Roche Molecular Bichemicals.
-
Carboxy-PTIO (2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazol-3-oxido-1-oxil) de
ICN Biomedicals
-
NG-monometil-L-arginina (NMMLA), L-OH-Arginina (LOHA) y Nϖ-OH-Nor-LArginina (Nor-LOHA) de Alexis Corporation.
•
Análisis de la viabilidad celular
-
Azul de Tripán de Sigma-Aldrich.
-
Dimetiltiazol-difeniltetrazolium bromide (MTT) y dimetil sulfóxido (DMSO) de
Sigma-Aldrich.
•
Montaje y tinción de macrófagos en portaobjetos
-
Fijador Eukitt® de Panreac.
-
Tinción Panóptico Rápido de QCA.
59
MATERIAL Y MÉTODOS
•
Determinación de proteínas
-
•
Reactivo Bradford: Coomasie ® Plus Protein Assay Reagent Kit de Pierce.
Medida de actividad arginasa
- Tritón X-100, Cloruro de Manganeso, L-Arginina e Isonitropropiofenona (ISPF)
de Sigma-Aldrich.
-
•
Ácidos Sulfúrico (H2SO4) y Ortofosfórico (H3PO4), y Etanol absoluto de Panreac.
Determinación de nitritos (Método de Griess)
- Sulfanilamida
(p-aminobencene-sulfonamida)
y
Naftiletilendiamina
Naphthyletilendiamina) de Sigma-Aldrich.
•
-
Ácido ortofosfórico (H3PO4) de Panreac.
-
Nitrito sódico de Scharlau.
Western Blotting
-
Geles Criterion precast (10-20%) de Biorad.
-
Marcador de pesos moleculares (patrón de proteínas) de Sigma.
-
Anticuerpo monoclonal antiratón para Arginasa I deTransduction.
-
Conjugado IgG total anti-ratón peroxidado de Nordic.
-
Kit de quimioluminiscencia de Pierce.
B) Ensayos in vivo
•
•
Técnica ELISA para detección de anticuerpos
-
Leche desnatada en polvo Molico® de Nestlé.
-
Conjugados anti-ratón (anti-IgG1 y anti-IgG2 peroxidados) de Nordic.
-
O-Phenylendiamine (OPD) de Sigma.
-
Peróxido de hidrógeno (10 volúmenes) de Cuve.
-
Ácido sulfúrico (H2SO4) de Panreac.
Kit ELISA para detección de citoquinas
-
60
Mouse ELISA Set para IL-4 e IL-12 de Bender MedSystems.
(N-1-
MATERIAL Y MÉTODOS
•
Técnicas histológicas
-
Formaldehído 3,7- 4 % tamponado de Panreac.
-
Parafina de bajo punto de fusión (51-53º C) de Panreac.
- Kit de tinción Hematoxilina-Eosina (H&E) de Isokit  Bio-Optica (Milano, Italia).
- Tinción Giemsa: Solución Giemsa de Merk, Ácido acético de Panreac.
- Tricrómico de Masson: Fucsina ácida de Merk; Ácido Fosfomolíbdico y Verde
Brillante de Panreac.
•
Inmunohistoquímica
-
Kit comercial de inmunohistoquímica Masvision Universal MLINK, para
anticuerpos monoclonales y policlonales, de Anacron Diagnósticos.
-
Anticuerpos anti-ratón para Arginasa I (monoclonal) y iNOS (policlonal) de
Transduction.
3.1.5. Material de laboratorio
A) Ensayos in vitro
•
Material quirúrgico (para extracción de médula ósea) AESCULAP® de B.Braun
•
Jeringuillas y agujas estériles (20G Sterican® ) de B.Braun.
•
Catéteres Abbocath®-T 18G de Venisystems.
•
Cámara Neubauer doble Zuzi.
•
Contador automático de células de 4 dígitos, modelo H102-4 .
•
Filtros de 0,20 y 0,40 µm de diámetro de poro de Millipore.
•
Puntas para micropipeta Eppendorf.
•
Microtubos de centrífuga tipo Eppendorf de Daslab ®.
•
Sacos de teflón para la diferenciación in vitro de los macrófagos de médula:
-
De polistar 305 SD (Rische und Herfurth, Hamburg, Alemania), cedidos por el
Max-Plack-Institut für Immunobiologie de Freiburg.
-
Saco comercial VueLifeTM Teflon ® de AFC (Cellgenix).
61
MATERIAL Y MÉTODOS
•
•
Material estéril de un solo uso para cultivos, de Costar®:
-
Tubos para centrífuga de propileno o poliestireno de 50 y 12 ml.
-
Pipetas 10 ml.
-
Flask de cultivo de 25 ml.
-
Placas de petri de 20 x 200 cm.
-
Placas de cultivo celular de 24 y 96 pocillos.
Material microscopía óptica
-
Portaobjetos de Menzel-Glaser y de extremo esmerilado de Knittel-Glaser..
-
Cubreojetos redondos (22 cm) de Marienfeld y cuadrados (24x24 y 24x60) de
Menzel-Glaser.
B) Ensayos in vivo
-
Jeringas insulina con aguja (0,5 ml) Micro-Fine TM de Becton Dickinson.
-
Pipetas pasteur cristal (230 mm) de Normax.
-
Tubos de hematología Venojet con interior cubierto de silicona, de Terumo.
-
Tubos de polipropileno de 1,2 ml en soportes (“racks”) de 98 unidades, de Costar ®,
para almacenamiento y congelación de sueros.
-
Placas ELISA poliestireno de alta afinidad de 96 pocillos y fondo plano, de Costar.
3.1.6. Aparatos
62
-
Autoclave P-Selecta modelo Presoclave 75.
-
Agitador magnético Hanna instruments.
-
Agitador orbital Certomat ® HK de B.Braun-Biotech.
-
Agitador vortex Reax 2000 de Heidolph.
-
Balanza analítica electrónica modelo 5022 de Nahita (precisión de 10 mg).
-
Baño de ultrasonidos modelo 1510 de Branson.
MATERIAL Y MÉTODOS
-
Bidestilador Millipore modelo millipack 40 acoplado al sistema de producción de
agua de calidad reactivo Milli-Q.
-
Calibrador digital (medidas de lesión plantar en ratones) de Stahlwille.
-
Cámara de flujo laminar vertical Telstar modelo AV-100.
-
Centrífuga refrigerada Kubota modelo 5800.
-
Centrífuga de microtubos modelo 5415D de Eppendorf.
-
Congelador de –80ºC Revco Giralt.
-
Estufa refrigerada (cultivo de Leishmania) Jouan Mini Artic.
-
Estufa calor seco (desparafinación de cortes histológicos) modelo 210 de P-Selecta.
-
Frigorífico Balay con congelador de –20ºC incorporado, modelo 3FS3632.
-
Homogenizador eléctrico de tejidos Drehzal-heger (Kinemática GmbH) de LittauLuzern.
-
Incubador de CO2 Forma Scientific Inc., modelo 3862.
-
Lector ELISA MRX II de Dynex Technologies.
-
Lavador ELISA MRW de Dynex Technologies.
-
Lupa binocular (extracción de ganglios murinos) SMZ-1 de Nikon.
-
Micropipetas automáticas Eppendorf de 10, 100 y 1000 :l.
-
Microscopio Nikon HFX Optiphot, con cámara de fotográfica Nikon FX-35A
incorporada.
-
Microscopio invertido (observación de cultivos) CK2 de Olympus.
-
Pipeteador PIPETBOY de Integra Biosciences.
-
Placa inductora de calor modelo 203 de HJM.
-
pHmetro digital modelo 510 de Oakton®.
-
Procesador automático de muestras histológicas Tissue-Tek VIP, Miles Scientific.
-
Sonicador VibracellTM de Sonics and Material.
-
Termobloque Tembloc de P-selecta.
63
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.7. Soporte informático
•
PC con procesador Pentium III 1000 Mhz
•
Impresora Color Canon S400
•
Escáner diapositivas CanoScan FS 2710 de Canon
•
Cámara digital DSC-S70 Cyber Shot 3,3 megapixels de Sony
•
Software:
-
Procesadores de texto: Microsoft® Word 97, Adobe® Acrobat versión 5.1
-
Análisis y representación de datos: Graph Pad Prism versión 2.01
- Tratamiento de imágenes: Microsoft® Power Point 97, Microsoft Paint® 97, MGI
PhotoSuite versión 8.06, Corel Draw versión 8.0.
64
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2. MÉTODOS
3.2.1. ESTUDIOS IN VITRO
3.2.1.1. Obtención de macrófagos derivados de médula ósea
A) Extracción de las células de la médula ósea
En primer lugar, una vez sacrificado el animal, se desinfecta totalmente la superficie
corporal con etanol al 70% y se coloca bajo la cámara de flujo laminar. Allí se le extraen
los fémures con material quirúrgico estéril, procurando que los extremos (epífisis)
permanezcan cerrados, y después se reservan en una placa de petri, sumergiéndolos en
medio RPMI sin suplementar.
Cuando se han extraído los dos fémures, se abren por ambos extremos y se perfunden
atravesándolos con una aguja de 20G adosada a una jeringa que contiene 10 ml de medio
RPMI. El contenido se deposita en tubos estériles que se centrifugan durante 10 minutos a
1800 r.p.m. y a temperatura ambiente.
Finalmente se decanta el sobrenadante, las células se resuspenden en medio
condicionado y se cuentan en cámara de Neubauer.
B) Diferenciación de los macrófagos in vitro
Las células de la médula ósea se siembran en sacos de teflón hidrofóbicos de 85 cm2
(Polistar 305 SD) o de 35 cm2 (VuelifeTM de AFC) a una concentración de 3x106 células/50
ml de medio condicionado, y se diferencian manteniéndolas durante 10 días a 37 ºC y 5 %
de CO2.
Los sacos de teflón (polifluor etilen propileno) poseen una membrana permeable que
permite a las células realizar un perfecto intercambio gaseoso, asegurando que el pH del
medio interno y la presión de oxígeno permanezcan constantes.
Es importante resaltar que la diferenciación y proliferación desde células precursoras de
65
5
MATERIAL Y MÉTODOS
la médula ósea a macrófagos, se lleva a cabo debido a la composición del medio
condicionado, que contiene el factor estimulante de colonias GM-CSF (factor
diferenciador de colonias granulocito-macrofágicas). Este factor se obtiene del
sobrenadante de la línea de fibroblastos L929, que se añade al medio de cultivo en una
concentración final del 30% (V/V). Además, el medio condicionado contiene un 5% del
suero de caballo, cuya función es impedir la diferenciación de los granulocitos. Por tanto,
después de 10 días, se obtiene una población pura y homogénea de macrófagos que no han
estado en contacto con ningún antígeno.
4
5
Figuras 4 y 5: Cultivo de macrófagos a partir de células de médula en sacos de teflón VuelifeTM
(4) y Polistar 305 SD (5).
3.2.1.2. Cultivo y activación de macrófagos
Pasado el tiempo de diferenciación, los macrófagos se extraen de los sacos. Para ello se
frota suavemente la superficie del mismo con los dedos con el fin de despegar las células,
que sólo están débilmente adheridas al teflón debido a su naturaleza hidrofóbica. Se les
cambia el medio condicionado centrifugándolas a 1800 r.p.m. durante 10 min. A
continuación se cuentan en cámara de Neubauer con una gota de Azul de Tripán,
contabilizando sólo las células vivas (aquellas que su membrana no ha dejado penetrar el
colorante), y se resuspenden en RPMI completo a una concentración de 106 células /ml.
Posteriormente se siembran en placas de 24 pocillos, colocando previamente
cubreobjetos redondos estériles en aquellos destinados al contaje de parasitación celular en
66
MATERIAL Y MÉTODOS
microscopio óptico. La activación se realiza añadiendo las dosis apropiadas de citoquinas,
inhibidores y otros productos durante el tiempo ensayado en cada experimento (24-48 h).
3.2.1.3. Cultivo de las especies de Leishmania
Los parásitos se aislaron a partir de biopsias ganglionares de perro (en el caso de L.
infantum) o de biopsias de las lesiones cutáneas de ratones infectados (en el caso de L.
major). Para su diferenciación se utilizó medio Schneider´s completo, cultivándose en
flask de 25 ml a 26º C. Las formas amastigote (inmóviles) pasan a promastigote (flageladas
y móviles) entre las 24 h para L. major y las 48-72 h para L. infantum. En ese momento,
los cultivos se centrifugan a 2500 r.p.m. y 22º C durante 10 min, tras lo cual se desecha el
sobrenadante y el sedimento se resuspende en un pequeño volumen de medio
de
mantenimiento (RPMI completo), sembrando de nuevo en flasks. Al cabo de 3-4 días (L.
major) o 6-7 días (L. infantum), conviene doblar los volúmenes de medio de cultivo o bien
centrifugar y cambiar el medio por otro fresco. La saturación de los cultivos se observa
mediante el cambio de coloración (de rojo a amarillo) que se produce en los mismos,
debido a la acidificación del pH ocasionado por el acúmulo de productos del metabolismo
del parásito.
3.2.1.4. Infección de los macrófagos con Leishmania
Los macrófagos se infectan con promatigotes en fase estacionaria de L. major o L.
infantum, en una relación 1:3 (parásitos/ macrófagos). En el caso de L. major, las placas se
colocan directamente a 37º C en la estufa de CO2 y se incuban durante los tiempos
indicados en cada experimento (ver sección Resultados). En los ensayos con L. infantum,
las placas se mantienen previamente a 26 ºC durante dos horas para favorecer la infección,
tras lo cual se introducen definitivamente en el incubador de CO2 a 37 ºC.
67
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.1.5. Preparación de los cultivos para observación microscópica
Los cubrebjetos con los macrófagos tratados e infectados
6
con Leishmania se extraen del fondo de cada uno de los
pocillos con ayuda de un palillo de madera y unas pinzas.
Seguidamente se pegan a portaobjetos con EUKITT®, se
dejan secar y se tiñen con panóptico rápido.
Figura 6: Montaje y tinción de portaobjetos para observación microscópica de cultivos de
macrófagos
3.2.1.6. Contaje de la parasitación celular
Las células se observan a 100 aumentos con el objetivo de inmersión del microscopio
para poder realizar el contaje de formas amastigote intracelulares.
Se realizaron triplicados de cada uno de los experimentos, y en todos ellos se cuantificó
tanto el porcentaje de células infectadas como el número total de amastigotes en 100
células. Para ello se contaron 100 células por cubreobjetos y el número de parásitos que
aparecieron en cada una, eligiendo varios campos al azar.
3.2.1.7. Medida de la actividad arginasa
La actividad arginasa en macrófagos se determinó por un micrométodo (Corraliza y col,
1994), que es una modificación del método de Schimke (1970). En él se mide
colorimétricamente la urea formada en la reacción catalizada por la arginasa sobre el
sustrato, L-arginina. Para ello se procede de la siguiente manera:
-
Primero se retira el sobrenadante de las placas y las células se lisan añadiendo en cada
pocillo 50 µl de una solución de Tritón X-100 al 0,1% en agua y otros 50 µl de Tris–
HCl 200 mM (pH 7,4).
-
Después se despegan las células con el émbolo de una jeringuilla de 1 ml y se recoge el
lisado celular de cada pocillo, pasándose a tubos eppendorff.
68
MATERIAL Y MÉTODOS
-
A cada uno de los tubos se añade 5 µl de MnCl2 (la coenzima de la arginasa) 1M, y 25
µl de arginina (sustrato de la arginasa) 0,5 M pH 9,7, y se incuba a 37ºC durante 60
minutos. La reacción se para con 400 µl de una mezcla ácida compuesta por H2SO4,
H3PO4 y H2O, en proporciones 1:3:7.
-
Por último, para cuantificar colorimétricamente la urea formada, se añaden 25 µl de
ISPF al 3% en etanol absoluto, y los tubos se hierven a 100º C durante 30 minutos. La
absorbancia se mide a 540 nm en un lector de ELISA en microplacas de 96 pocillos,
añadiendo alícuotas de 200 µl a cada pocillo.
Para cada experimento se realizó paralelamente una curva de calibrado, usando
cantidades crecientes de urea en el rango de 1,5 a 30 µg. En este caso, a 50 µl de una
solución de urea a las concentraciones apropiadas, se añadieron 400 µl de mezcla ácida y
25 µl de ISPF, y el procedimiento continuó como se indica anteriormente.
La actividad enzimática se expresó en miliunidades (mU), teniendo en cuenta que una
unidad arginasa es la cantidad de enzima que produce un µmol de urea por minuto a 37ºC
y por millón de células.
3.2.1.8. Cuantificación de nitritos
El óxido nítrico, producto de la reacción de la iNOS, se mide en forma de nitritos en el
medio de cultivo de los macrófagos activados, según la reacción de Griess (Ding y col.,
1988). Así, a 100 µl de medio se añade un volumen equivalente del reactivo de Griess,
constituido por 0,1% de naftiletilendiamina en agua + 1% de sulfanilamida en ácido
ortofosfórico al 5%.
La cantidad de nitritos producida se manifiesta mediante una reacción colorimétrica,
midiéndose la
absorbancia en un lector de ELISA a 540 nm. Para determinar la
concentración de NO2- se usó NaNO2 como estándar.
69
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.1.9. Determinación de proteínas
Se realizó según el método de Bradford (1976), utilizando como estándar albúmina de
suero bovino. El procedimiento es el siguiente:
- Las muestras se depositan en tubos de ensayo, completando el volumen hasta 100 µl
con agua bidestilada en caso necesario.
- A continuación se añaden 5 ml de reactivo de Bradford
- Los tubos se agitan vigorosamente y se dejan reposar 15 minutos a temperatura
ambiente.
- Se depositan 200 µl de cada muestra por pocillo en una placa de ELISA
- Por último se determina la absorbancia a 595 nm.
3.2.1.10. Análisis de la viabilidad celular
Para determinar la viabilidad celular con las concentraciones máximas de los agonistas
presentes en cada experimento, se utilizó el método cuantitativo del MTT. Éste fue
diseñado por Mosmann en 1983, y se basa en la capacidad que tienen algunas enzimas
mitocondriales de las células vivas de reducir la sal de tetrazolio (color amarillo) en MTT
formazán (azul). Para ello se procedió como sigue:
-
Se prepara una disolución de 5 mg/ml de MTT en PBS 1x, y se pasa a través de un
filtro de 0,22 µm de diámetro de poro.
-
Se añaden 50 µl de esta disolución a cada pocillo de las placas (5· 105 células/ 500 µl
de medio) y se incuba a 37 ºC durante 1 hora.
-
Pasado este tiempo, se despegan los macrófagos de los pocillos con el émbolo de una
jeringuilla de 1 ml, y el contenido de cada pocillo (células y sobrenadante) se transfiere
a un tubo eppendorff. Éstos se centrifugan a 1800 rpm durante 10 minutos, y a
continuación se elimina el sobrenadante.
70
Se añade a cada tubo 50 µl do DMSO, y se agita vigorosamente para disolver los
MATERIAL Y MÉTODOS
cristales azul oscuro formados.
-
Por último se mide la absorbancia a 570 nm utilizando un lector ELISA. Los resultados
se expresan en porcentaje respecto al control.
3.2.1.11. Western blotting
Mediante esta técnica inmunológica se detectó la inducción de la arginasa I en
macrófagos infectados e inducidos con citoquinas. Para ello se retiraron los sobrenadantes
de los cultivos y las células fueron lavadas dos veces con PBS 1x. A continuación, las
muestras se lisaron hirviéndolas 5 minutos en el tampón de la muestra de electroforesis, y
la concentración de proteínas se cuantificó por el método Bradford. Las muestras se
sometieron a SDS-PAGE, añadiendo, en cada pocillo, cantidades equivalentes de 15 µg
proteína. Después de una electrotransferencia semiseca, la membrana de difluoridio de
polivinilo fue bloqueada con PBS-0.1%Tween 20, suplementado con 2% de BSA, e
incubada con el anticuerpo monoclonal antiratón de la arginasa I a una dilución 1:1000,
seguida de una incubación con conjugado IgG anti-ratón peroxidado a 1:3000. Las bandas
se detectaron con un kit de quimioluminiscencia.
71
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.2. ESTUDIOS IN VIVO
3.2.2.1. Infección de ratones con Leishmania major
A cada uno de los animales retados de ambas cepas (BALB/c y
7
C57BL/6) se les inyectaron 106 promastigotes de L. major en fase
estacionaria, vehiculados en 25 µl de PBS 1x estéril. La punción
se realizó subcutáneamente en la zona plantar de la extremidad
posterior derecha.
Figura 7: Infección de BALB/c con L. major en la almohadilla plantar
3.2.2.2. Recogida y procesado de datos y muestras
3.2.2.2.1. In vivo
3.2.2.2.1.1 Evolución de los signos clínicos
A lo largo de todo el periodo de infección, se comparó la progresión de las lesiones en
los distintos grupos de animales infectados de ambas cepas. Para ello se midió, con una
frecuencia de 3 a 7 días dependiendo del ensayo, el
grosor de ambas almohadillas plantares de cada animal
8
con un calibrador digital (Foto 8). Una vez anotadas las
medidas, el grado de inflamación se obtuvo realizando la
diferencia entre los valores de la extremidad infectada y
su homóloga sana. Se anotó también la aparición de
ulceraciones y necrosis en la zona.
Figura 8: Medida de la inflamación plantar con calibrador
72
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.2.2.1.2. Extracción y procesado de sangre
Las muestras de sangre se tomaron con una periodicidad
9
semanal del seno venoso retroorbitario, mediante punción del
mismo con una pipeta pasteur estéril (Fotos 9 y 10). La
sangre fue depositada en tubos siliconados, y posteriormente
éstos se centrifugaron para obtención del suero a 2000 rpm y
4º C durante 10 minutos. El suero se almacenó congelado a -
10
80º C, hasta el momento de su uso para el análisis de
citoquinas y anticuerpos circulantes mediante la técnica
ELISA.
Figuras 9 y 10: Extracción de sangre del seno retroorbitario
3.2.2.2.2. Post mortem
La toma y procesado de muestras post mortem se llevó a cabo una vez los animales se
sacrificaron por dislocación cervical.
3.2.2.2.2.1. Procesado de extremidades infectadas
Con ayuda de unas tijeras, se seccionaron ambas
extremidades posteriores a nivel de la articulación
11
tibiotarsiana. A continuación, se corta sagitalmente de la
almohadilla plantar infectada, y con la superficie de corte se
realizan improntas en portaobjetos para la visualización y
confirmación de amastigotes en las lesiones.
Figura 11: Frotis de una extremidad infectada.
Presencia masiva de formas amastigote en macrófagos (
).
73
MATERIAL Y MÉTODOS
Cada uno de los dos fragmentos obtenidos se procesó de la siguiente forma:
-
Uno de ellos se reservó y procesó para estudios histológicos e imunohistoquímicos,
tal y como se detalla en el apartado 3.2.2.4.
-
El otro fragmento se pesó y se congeló a –20º C, para su posterior homogenización
y medida de las actividades enzimáticas específicas (puntos 3.2.6.1. y 3.2.6.2.).
3.2.2.3. Técnicas de inmunodiagnóstico
3.2.2.3.1. Análisis de la respuesta inmune humoral (Técnica ELISA)
Mediante la técnica ELISA se llevó a cabo la determinación de las subclases de IgG
(IgG1 e IgG2a) frente a distintos antígenos, como son la Proteína Total soluble (PT), y las
proteínas recombinantes Kmp11 y multicomponente Quimera (PQ).
3.2.2.3.1.1. Obtención de los antígenos para tapizado
El antígeno o proteína total soluble de Leishmania (PT), se obtiene a partir del cultivo
masivo de formas promastigote. Para ello se centrifuga una determinada cantidad de medio
de cultivo a 2500 r.p.m. durante 15 minutos a 4º C. Se elimina el sobrenadante y se
resupende en una cantidad semejante de PBS estéril pH 7,2. Esta operación de lavado se
repite hasta que el sobrenadante aparece transparente (aproximadamente 3 veces). El botón
resultante se resuspende en agua destilada estéril, y se somete a sonicación directa (187
watios) con micro-tip durante 15 minutos en ciclos alternos para provocar la total ruptura
de las células. Posteriormente se lleva a cabo la determinación de proteínas por el método
de Bradford (punto 3.2.9.), ajustándose para el tapizado de las placas a una concentración
de 8 µg/ml, que es considerada idónea en la estandarización de la técnica. El antígeno total
es finalmente congelado a –80ºC hasta el momento de su utilización.
74
MATERIAL Y MÉTODOS
Los antígenos recombinantes utilizados en nuestro estudio (proteína multicomponente
Quimera o PQ y de superficie Kmp11) han sido cedidos por el profesor Dr. Carlos Alonso
Bedate, siendo aislados, caracterizados, purificados y clonados por el equipo de
investigación del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” de Madrid, como
describen Soto Álvarez (1994) y Quijada Arteaga (1997). Estos antígenos se ajustaron a
una concentración de 2 µg/ml, y al igual que la Proteína Total, se conservaron a –80ºC
hasta el momento de su uso.
3.2.2.3.1.2. Desarrollo de la técnica
Para el desarrollo de la técnica se emplea el método de micro-ELISA indirecto de
dobles anticuerpos. Se utilizan placas de poliestireno de 96 pocillos, de fondo plano y unos
350 µl de capacidad por pocillo.
En cada pocillo se depositan 100 µl de antígeno disuelto en PBS 1x. A continuación se
incuban las placas durante toda la noche a 4º C para permitir la adsorción del antígeno a las
paredes del pocillo.
Tras este periodo, el exceso de antígeno no fijado es arrastrado por una solución de
PBS-Tween 20, utilizando para ello un equipo automático que realiza tres lavados de unos
40 segundos cada uno. Seguidamente las placas son sacudidas enérgicamente sobre un
papel de filtro, para eliminar las gotas de líquido de lavado que pudieran permanecer en los
pocillos.
Con el objeto de tapizar perfectamente las zonas de los pocillos que no han sido
recubiertas por antígenos y evitar adsorciones inespecíficas de inmunoglobulinas, se
depositan 200 µl de leche desnatada al 5% en PBS-Tween, incubándose las placas a 37º C
durante media hora. Inmediatamente después se someten a un nuevo proceso de lavado.
Estas placas son introducidas en bolsas de plástico herméticamente selladas y congeladas a
–80ºC hasta el momento de su uso.
Una vez descongeladas las placas a temperatura ambiente, cada pocillo es rellenado con
75
MATERIAL Y MÉTODOS
100 µl de suero diluido a la concentración adecuada en PBS-Tween. Dichas diluciones
fueron seleccionadas durante la estandarización de la técnica, ya que con ellas se obtiene
una mayor diferenciación entre los valores positivos y negativos.
Para comprobar al final que todos los pasos de la técnica han sido realizados
correctamente, es necesario reservar unos pocillos en cada placa para los controles de
conjugado, positivos y negativos.
-
Control de conjugado: se utiliza una columna de ocho pocillos sin suero problema,
siendo éste sustituido por PBS-Tween y continuando los demás pasos rutinariamente.
Este control nos puede dar información sobre numerosos errores de procedimiento
(procesos de lavado inadecuados, reactivos en mal estado, etc.).
-
Control positivo: se utiliza como referencia un suero positivo conocido (de un animal
infectado), que es introducido en cuatro pocillos para garantizar que la técnica está bien
realizada.
-
Control negativo: Se utiliza un suero negativo en otros cuatro pocillos. Al igual que el
control positivo, la repetitividad de su lectura garantiza la correcta realización de la
técnica.
Tras la incubación a 37º C durante 30 minutos y posterior lavado, se añaden 100 µl de
conjugado anti-ratón a una concentración de 1/1000 para IgG1 y 1/500 para la IgG2. Se
somete a una nueva incubación de 30 minutos a 37 ºC y después a un nuevo lavado para
eliminar las inmunoglobulinas que no hayan reaccionado con el complejo antígenoanticuerpo.
Posteriormente se añaden 100 µl de sustrato. Éste se elabora como máximo 15 minutos
antes de ser utilizado (debido a la poca estabilidad del preparado), con una proporción de
60 mg OPD/ 30 ml de tampón citrato, y agregando 40 µl H2O2 justo en el momento de su
uso. El sustrato, incoloro o ligeramente amarillento, en presencia de peroxidasa toma un
color anaranjado fuerte o rojizo, con una intensidad proporcional a la cantidad de
anticuerpos fijados al antígeno. La reacción se detiene aproximadamente a los 30 minutos,
76
MATERIAL Y MÉTODOS
añadiendo a cada pocillo 50 µl de H2SO4 3N.
La lectura se realiza a A490 después de haber observado a simple vista si existen errores
o coloraciones anormales.
El umbral de positividad se fijó en todas las pruebas sumando el triple de la desviación
estándar al valor medio de los sueros negativos.
3.2.2.3.2. Análisis de la respuesta inmune celular: detección de citoquinas
La presencia de citoquinas circulantes se determinó en suero a lo largo de la infección
mediante Sets de ELISA comerciales (refernciados en el punto 3.1.4.). Las interleuquinas
objeto de análisis fueron tanto de tipo Th1 (IL-12) como Th2 (IL-4 ).
Todo el material necesario para el desarrollo de la técnica (anticuerpos de captura,
estándares, conjugado y sustrato) fue proporcionado en el mismo kit. Como protocolo de
trabajo, se siguieron las instrucciones incluidas en el mismo y recomendadas por el
fabricante.
3.2.2.4. Técnicas histológicas
El material obtenido en las necropsias de los animales fue fijado en formalina 4%
tamponada, tallado en pequeños bloques tras varios días de fijación, e incluido en parafina
en un procesador automático, siendo almacenados hasta su uso.
Se realizaron cortes con microtomo de 4µm de espesor, se depositaron en portaobjetos y
se sometieron a un calentamiento suave para provocar su adherencia. Más tarde se
desparafinaron de la siguiente forma:
77
MATERIAL Y MÉTODOS
-
Calentamiento en estufa a 50º C durante 20 minutos.
-
Rehidratación mediante tres baños sucesivos de xilol de 10 min. cada uno, y
sucesivos baños de etanol de 5 min cada uno a concentración decreciente (tres
baños en etanol al 100% y tres en etanol al 96% ).
-
Por último se sumergen en agua destilada hasta realizar la técnica de tinción
correspondiente.
Una vez teñida la muestra, se realiza este mismo proceso pero en sentido contrario para
lograr la deshidratación absoluta del tejido, y tras el último baño de xilol, se cubre la
preparación con medio de montaje permanente.
3.2.2.4.1. Tinción Hematoxilina-Eosina
Se utiliza el kit de H&E Isokit , con el siguiente protocolo:
-
Hemalumbre de Hematoxilina de Mayer.........................................6 min
-
Tampón ácido para diferenciación...................................................1 min
-
Tampón básico de viraje..................................................................2 min
-
Eosina G...........................................................................................5 min
-
Tampón neutro de diferenciación.....................................................5 min
Entre cada paso hay un lavado con agua destilada.
Con esta tinción se observan los núcleos celulares en color azul oscuro, mientras que el
citoplasma aparece en distintas tonalidades de rosa. Es la tinción más básica que se emplea
en histología, y cualquier estudio debe comenzar por la observación de al menos un corte
teñido con esta técnica.
78
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.2.4.2. Tinción Tricrómico de Masson
La técnica de tinción es la siguiente:
-
Hemalumbre de Hematoxilina de Mayer ......................................... 20 min
-
Lavar con agua destilada .....................................................................1 min
-
Solución A .......................................................................................... 3 min
Agua destilada ------------------------ 99 ml
Fucsina ácida ------------------------- 0,5 g
Ácido acético
----------------------- 0,5 ml
-
Lavar con agua destilada .................................................................... 5 min
-
Solución B .......................................................................................... 5 min
Agua destilada ---------------------- 99 ml
Ácido Fosfomolíbdico ------------- 1ml
-
Escurrir (sin lavar)
-
Solución C ........................................................................................ 20 min
Agua destilada ---------------------- 100 ml
Ácido acético ------------------------ 2,5 ml
Verde Brillante -----------------------1g
-
Solución D ........................................................................................ 30 min
Ácido acético ------------------------ 1ml
Agua destilada ------------------------100 ml
-
Solución E .......................................................................................... 5 min
Ácido acético ------------------------ 0,1ml
Alcohol absoluto --------------------100 ml
-
Deshidratar y montar
Con esta técnica histológica se tiñen de verde las fibras reticulares y de colágeno, el
cartílago hialino y la sustancia intercelular. El resto del tejido adquiere una coloración en
tonos marrones y rojizos.
79
MATERIAL Y MÉTODOS
3.2.2.5. Análisis de la actividad enzimática arginasa en los tejidos infectados
3.2.2.5.1. Medida en homogeneizado de tejido por el micrométodo
Se toma una cantidad exacta (por ejemplo, 50 mg) del tejido a analizar, se trocea en
una placa de Petri con una hoja de bisturí y se añade 1ml de Tris 200 mM y 10µl de Mn. A
continuación se vierte todo en un tubo de ensayo, y se tritura en un homogenizador
eléctrico hasta que no queden grumos. Con el fin de que no se desnaturalice la enzima
debido a la elevación de la temperatura, las muestras se mantienen dentro de un recipiente
con hielo picado durante la homogeneización. Por último se centrifuga a 3500 rpm durante
15 min. y se extrae el sobrenadante, que se usa para determinar la actividad arginasa por el
método descrito en el punto 3.2.1.7. Los resultados se expresan en mU/mg de tejido.
3.2.2.5.2. Detección por técnicas inmunohistoquímicas
Se utilizó un kit comercial Biotina-Streptavididna-Peroxidasa, con todos los reactivos
excepto el anticuerpo primario. Éste fue, en cada caso, el anticuerpo monoclonal frente
arginasa I y el policlonal frente a iNOS, respectivamente, a una concentración de 1/100. En
cada ensayo se empleó uno de los cortes como control negativo, sustituyendo el anticuerpo
comercial por suero de conejo sano no inmunizado (diluido 1/100).
Una vez desparafinada la muestra (punto 3.2.2.4.), se siguieron los siguientes pasos:
1.- Se hace un lavado de 5 minutos a los portas con PBS-Tween, en agitación suave.
2.- Inhibición de la peroxidasa endógena que pueda encontrarse en el tejido: Se limpian
cuidadosamente las áreas alrededor de la sección sobre el portaobjetos para quitar el
exceso de solución, y se cubre el tejido con una solución de peróxido de hidrógeno al
3% en agua durante 10-15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Se aclaran
los portaobjetos 3 veces como se explica en el punto 1.
3.- Bloqueo de uniones inespecíficas: este paso es necesario, sobre todo, si utilizamos
como anticuerpo primario un suero completo o un anticuerpo policlonal. Consiste en
80
MATERIAL Y MÉTODOS
cubrir las secciones con suero de caballo al 10% en PBS y dejar actuar 30 minutos a
37º C. A continuación se realizan 3 lavados como en el punto 1.
4.- Adición del anticuerpo primario: Se limpian cuidadosamente las áreas alrededor de la
sección, y se aplican dos gotas (100 µl) de anticuerpo primario sobre el corte. Se
incuban a 37º C durante 1 hora, se hacen 3 lavados como en el punto 1.
5.-Adición del anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa): Se limpian
cuidadosamente las áreas alrededor de la sección, y se aplican dos gotas (100 µl) del
conjugado a cada una de las muestras. Se incuban a 37 ºC durante 30 min., y se lavan 3
veces como en el punto 1. Se secan con cuidado las zonas alrededor de cada sección.
6.- Preparación y adicción del sustrato cromógeno (AEC): En un tubo eppendorff se
dispensan las cantidades indicadas de los tres reactivos: 1 ml de agua destilada y una
gota de la solución tamponada, se mezcla bien y se añade una gota del cromógeno
(Amino Etil Carbazol o AEC, 20x) y otra de peróxido de hidrógeno al 0,6%. Se vuelve
a mezclar y se aplican 2 gotas de la mezcla a cada una de las secciones. Se incuban 10
min. a temperatura ambiente y se hacen 3 aclarados de 5 minutos con agua destilada.
7.- Tinción de contraste: Se secan los bordes de la muestra y se añade la hematoxilina,
dejando actuar 10 min. Lavar bien con agua del grifo y aclarar.
8.- Montaje (semipermanente): Se extiende el líquido de montaje en un cubreobjetos y se
coloca encima el portaobjetos con la muestra, procurando que no queden burbujas. Las
preparaciones son estables aproximadamente 7 días si se guardan en el frigorífico (en
un recipiente cerrado, para que no estén en contacto con humedad).
81
4.
RESULTADOS
Leishmaniosis cutánea. Tricromico de Masson.
RESULTADOS
4.-RESULTADOS
4.1. ESTUDIOS IN VITRO
4.1.1. Regulación del metbolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes al
parásito
Está generalmente aceptado que uno de los principales mecanismos efectores de los
macrófagos es la producción de NO vía inducción de la iNOS, lo que da lugar a la muerte
de Leishmania en células activadas con citoquinas tipo Th1 como el interferón, o con
productos bacterianos como el LPS (Assreuy y col., 1994).
Por otra parte, la inducción de arginasa mediada por citoquinas Th2 es otra de las vías
alternativas en el metabolismo de la L-arginina (Corraliza y col., 1995). Sin embargo, a
diferencia de la iNOS, la función de la arginasa en macrófagos estaba aún sin determinar.
Debido a que en leishmaniosis murina los modelos de resistencia y susceptibilidad se
muestran claramente determinados por el balance Th1/Th2, nuestra primera aproximación
experimental fue la comparación entre los niveles de NO y arginasa en macrófagos
infectados procedentes de ratones de las cepas sensible BALB/c y resistente C57BL/6.
85
RESULTADOS
4.1.1.1. Efecto de la activación con citoquinas Th1
La activación de macrófagos con citoquinas inflamatorias promueve el metabolismo de
la arginina vía iNOS, con la consiguiente producción de NO, el cual puede detectarse en
forma de nitritos por el método de Griess. Para inducir NO se utilizó el clásico modelo de
activación con IFN-γ +LPS.
Los resultados se representan en la Fig. 1, donde se comparan los niveles de NO (Fig.
1A) y de parasitación (Fig. 1B) entre macrófagos de las ambas cepas.
Como se puede apreciar en la Fig. 1A, existe una enorme diferencia en la capacidad de
producción de NO en macrófagos procedentes de BALB/c y C57BL/6. Así, estos últimos
generan casi el doble de NO cuando son inducidos con IFN+LPS, pues las concentraciones
alcanzan valores de aproximadamente 70 µM, en comparación con el máximo de 35 µM
observado en la cepa sensible.
Los niveles de nitritos detectados en los sobrenadantes de cultivo pueden perfectamente
correlacionarse con los resultados de parasitación celular. En este sentido, y como se
observa en la Fig. 1B, los macrófagos control de ambas cepas muestran,
sorprendentemente, una desigual permisividad a la infección por Leishmania. Los
procedentes de ratones BALB/c alcanzan un mayor porcentaje de infección (más del 70%)
y un número total de amastigotes mayor (aprox. 160/100 células) que los resistentes
C57BL/6, en los que el porcentaje de parasitación fue del 65%. Además, el número de
amastigotes totales en C57BL/6 fue también menor (unos 80/100 células, lo que equivale a
menos de 1 amastigote por macrófago).
Cuando las células se activaron con IFN+LPS, fueron capaces de destruir gran parte de
los parásitos intracelulares, reduciéndose en casi un 50% el porcentaje de macrófagos
infectados respecto a los controles en ambas cepas. Asimismo, el número total de
amastigotes descendió a 60 para los BALB/c y 40 en el caso de los C57BL/6.
86
RESULTADOS
B
A
Nitritos (µM)
BALB/c
C57BL/6
50
25
0
Control
Nº Amastigotes/100
células
200
75
76%
BALB/c
C57BL/6
100
IFN + LPS
65%
39%
36%
0
Control
IFN + LPS
Figura 1: La susceptibilidad/resistencia a la infección por Leishmania spp. es correlativa a la
inducción de iNOS en macrófagos de ambas cepas.
Las células se pretrataron con 5 ng/ml de IFN-γ y 0,1 µg/ml de LPS de Salmonella
minnesota, y después fueron infectadas con formas promastigotes de L. infantum. Tras
48 h., se usaron para determinar:
A: Amastigotes/100 células (barras) y media de los porcentajes de macrófagos
infectados (números)
B: Concentración de nitritos en sobrenadantes de cultivo.
Estos datos se corroboran con las imágenes de la Fig. 2, en la que puede apreciarse que
los niveles internos de parasitación son mayores en los macrófagos control BALB/c (Fig.
2A versus 2C), y que asimismo los resistentes tienen una mayor capacidad de respuesta
frente a los parásitos cuando la iNOS está inducida (Fig. 2B versus 2D).
La activación enzimática la iNOS se confirmó también por inmunohistoquímica, como
se muestra en la Fig. 3.
87
RESULTADOS
B
A
C
D
Figura 2: Micrografías de macrófagos pertenecientes ambas cepas tras 48 h de infección con L.
infantum. Tinción panóptico. 100x.
A: Macrófagos BALB/c control.
B: Macrófagos BALB/c activados con 5 ng/ml IFN+ 0,1 µg/ml LPS
C: Macrófagos C57BL/6 control.
D: Macrófagos C57BL/6 activados con 5 ng/ml IFN+ 0,1 µg/ml LPS
A
B
C
Figura 3: Inmunocitoquímica de un cultivo de macrófagos BALB/c pretratados con IFN, para la
detección de la enzima iNOS en su citoplasma.
A: Tinción positiva. Macrófagos estimulados con 5 ng/ml de IFN-γ. 20x.
B: Tinción positiva. Detalle a mayor aumento (100x).
C: Tinción negativa. Macrófagos control. 20x.
88
RESULTADOS
4.1.1.2. Efecto de las citoquinas Th2 en la proliferación intracelular de los parásitos
Como ya ha sido descrito, la activación de macrófagos con citoquinas anti-inflamatorias
y con TGF-β promueve en ellos la inducción de la arginasa. También se conoce que los
ratones BALB/c producen una respuesta predominante Th2 frente a la infección por
Leishmania, mientras que la cepa resistente C57BL/6 desarrolla preferentemente una
respuesta de tipo Th1.
De esta manera, el segundo de nuestros objetivos fue determinar los niveles de
infección celular en presencia de citoquinas Th2.
En concordancia con estos datos, y como puede observarse en la Fig. 4, los resultados
fueron opuestos a los obtenidos al inducir la iNOS: los niveles constitutivos de arginasa
frente a infección son ya, en principio, en macrófagos BALB/c que en C57BL/6.
Además, la inducción de la enzima por IL-4, IL-10 y TGF-β genera casi el doble de
urea y ornitina en los macrófagos susceptibles (Fig. 4A).
En un experimento replicado en el que se determinaron los niveles de parasitación
celular (Fig. 4B), se observó que, sorprendententemente, éstos mimetizan a los
encontrados para la inducción de arginasa. Es decir, en los macrófagos activados con
citoquinas Th2 se produce un aumento espectacular de la replicación intracelular de
Leishmania (Fig 4A), que es paralelo a un fuerte incremento de la inducción de la enzima
(Fig. 4B).
En resumen, podemos destacar que los macrófagos BALB/c son mayores
respondedores para la arginasa I y más permisivos a la infección que aquellos procedentes
de la cepa C57BL/6, ya que, como se aprecia en las gráficas (Fig.4), las diferencias entre
cepas son estadísticamente significativas (p<0.05) en cuanto a los niveles constitutivos de
arginasa, a su inducción con citoquinas antiinflamatorias y conjuntamente al grado de
parasitación celular. Estos datos sugieren, por tanto, que existe una estrecha correlación
entre la inducción de la enzima y el crecimiento del parásito en su célula hospedadora.
89
Amastigotes/100 células
RESULTADOS
BALB/c
C57BL/6
A
600
**
400
*
200
0
control
IL-4
IL-10
TGF-β
Arginasa (mU)
250
200
BALB/c
C57BL/6
B
**
150
100
*
50
0
control
IL-4
IL-10
TGF-β
Figura 4: La susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania en BALB/c y C57BL/6 se
correlaciona con los diferentes grados de inducción de arginasa por IL-4, IL-10 y TGFβ entre cepas murinas.
Los macrófagos BALB/c y C57BL/6 fueron infectados en presencia de 2,5 ng/ml de
IL-4, 20 ng/ml de IL-10 y 10 ng/ml de TGF-β durante 48h. Los resultados representan:
A: Grado de parasitacion celular (amastigotes totales en 100 células)
B: Nivel de inducción de arginasa
*P<0,05 por el test T-de Student.
90
RESULTADOS
De las tres citoquinas utilizadas, la IL-4 se mostró en todos los casos como el inductor
más potente de la arginasa y de la replicación parasitaria, alcanzando valores de
parasitación de hasta 600 amastigotes/ 100 células (Fig. 4A) y concentraciones de la
enzima de más de 200 mU (Fig. 4B) en el caso de los BALB/c. En la cepa murina
resistente, la IL-4 también produce un gran aumento del número de amastigotes
intracelulares respecto al control, si bien este incremento es menor que en el caso de la
cepa sensible, lo que está en concordancia con un aumento menos acusado de la inducción
de arginasa.
Por último, los efectos de la IL-10 y del TGF-β son bastante similares entre sí dentro
del mismo fenotipo murino, provocando también un incremento de los niveles de
parasitación e inducción enzimática, que es asimismo mayor que en los macrófagos
BALB/c.
En resumen, estos datos apuntan fuertemente a una dependencia de la proliferación de
Leishmania por la inducción de la arginasa del MO. Por ello, para analizar en mayor
profundidad este efecto, se realizaron una serie de ensayos infectando los macrófagos en
presencia de dosis crecientes de IL-4, IL-10 y TGF-β. Los resultados obtenidos son los que
se describen a continuación.
91
RESULTADOS
4.1.1.2.1. Inducción con IL-4
Los datos presentados en la Fig. 5 muestran la acción que tuvo la adición de dosis
crecientes de IL-4 sobre cultivos de macrófagos infectados con Leishmania spp. En un
experimento replicado se midió también la inducción de arginasa en lisados celulares.
Como puede observarse, a medida que aumenta la actividad enzimática en los
macrófagos
el
número
de
amastigotes
intracelulares
también
se
incrementa
proporcionalmente a la concentración de IL-4, hasta alcanzar un máximo con sólo 1,5
1000
200
750
150
500
100
amastigotes
arginasa
250
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
arginasa (mU)
Amastigotes/100 células
ng/ml de citoquina.
50
0
Concentración de IL-4 (ng/ml)
Figura 5: Efecto de la concentración de IL-4 sobre la inducción de la arginasa y la proliferación
de Leishmania major en macrófagos BALB/c.
Tras 48 h de infección, se determinó el numero de parásitos intracelulares (azul) y la
actividad arginasa (rojo).
92
RESULTADOS
Corroborando a los anteriores datos numéricos, y observando las imágenes de la Fig. 6,
se aprecia un importante incremento de la presencia de formas amastigote –tanto de L.
major como de L. infantum- en el interior de los macrófagos tratados con IL-4 (6B y 6D),
cuando los comparamos con sus respectivos controles (6A y 6C).
A
B
C
D
Figura 6: Micrografías de macrófagos infectados con y sin pretratamiento con IL-4. Tinción
panóptico. 100 x.
A: Macrófagos BALB/c infectados durante 48 h con L. infantum.
B: Macrófagos BALB/c infectados con L. infantum en presencia 2,5 ng/ml de IL-4.
C: Macrófagos BALB/c infectados durante 48 h con L. major.
D: Macrófagos BALB/c infectados con L. major en presencia con IL-4.
93
RESULTADOS
4.1.1.2.2. Inducción con IL-10
Cuando las células se activaron con dosis crecientes de IL-10 y fueron infectadas (Fig.
7), se observó un significativo incremento del número de parásitos intracelulares, junto a
un notable aumento en la actividad arginasa.
Sin embargo, y comparando con lo observado para la IL-4 (Fig. 5), el efecto de la IL-10
no es tan llamativo, ya que el número total de amastigotes intracelulares no superó los 500/
100 células, frente a los aproximadamente 850 que aparecen con de IL-4 (2,5 ng/ml). De
forma paralela, la actividad arginasa rondó las 125 mU, nivel sensiblemente inferior al de
las células preactivadas con IL-4, la cuales alcanzaron las 180 mU.
Los datos sugieren que la diferencia en el número de parásitos entre los macrófagos
tratados con IL-4 e IL-10, podrían ser debidos a diferencia entre los niveles de L-ornitina
producidos por la inducción de arginasa, que es mayor en el primer caso.
150
125
450
100
75
300
amastigotes
arginasa
150
50
arginasa (mU)
Amastigotes/100 células
600
25
0
0
0
10
20
30
40
50
60
Concentración de IL-10 (ng/ml)
Figura 7: Efecto de dosis crecientes de IL-10 en macrófagos BALB/c infectados con L. major.
Tras 48 h de infección, las células se cultivaron por duplicado para hacer contaje de
parásitos intracelulares (azul) y para determinar la actividad enzimática arginasa (rojo).
94
RESULTADOS
En concordancia con los datos obtenidos, en la Fig. 8 puede observarse el aumento de la
parasitación intracelular provocado por la adición de IL-10 a los cultivos de macrófagos
infectados.
A
B
Figura 8: Micrografías de macrófagos infectados con L. infantum con (B) y sin (A) pretratamiento con
IL-10. Se observa un aumento apreciable del número de amastigotes presentes en las células
inducidas con esta citoquina frente al control. Tinción panóptico, 100x.
4.1.1.2.3. Inducción con TGF- β
Para definir mejor el efecto de la arginasa en las células infectadas, se utilizó el TGF-β,
molécula que es también un potente inductor de la enzima en macrófagos murinos. Esta
citoquina tiene una función supresora en el sistema inmune, incluyendo la inhibición de la
activación de los macrófagos. Es inducida en células infectadas, actuando como uno de los
mecanismos efectores de Leishmania para evitar la capacidad lítica de los macrófagos, y
está reconocido como un promotor de enfermedad en leishmaniosis.
Como puede apreciarse en la Fig. 9, el tratamiento de las células infectadas con TGF- β
aumenta la proliferación del parásito, y al mismo tiempo está induciendo un incremento
dependiente de la dosis en la actividad específica de la arginasa en los macrófagos. Así, el
número de amastigotes intracelulares casi llegó a quintuplicarse a la máxima dosis de esta
citoquina (20 ng/ml) respecto a los controles, pasando de una media de 100 amastigotes a
un número de parásitos próximo los 500/ 100 células.
De forma paralela, la arginasa aumentó su concentración más de 5 veces en células
inducidas con 20 ng/ml de la citoquina, en comparación con los niveles alcanzados por las
95
RESULTADOS
células control, es decir, un incremento de 15 mU a casi 100 mU.
Como puede observarse, el patrón obtenido con el TGF-β es similar al de las otras dos
citoquinas utilizadas: un aumento de la actividad arginasa -que da lugar a la generación de
ornitina- paralelo a una proliferación intracelular de los parásitos.
125
400
100
300
75
200
am asti g o tes
arg i nasa
100
0
0
5
10
15
50
arg i nasa (m U)
am asti g o tes/10 0 cél ul as
150
500
25
0
25
20
Figura 9: Efecto de la concentración de TGF-β en macrófagos BALB/c infectados con L. major.
Tras 48 h de infección, las células se utilizaron para hacer contaje de parásitos intracelulares
(azul) y, en cultivos duplicados, para determinar la actividad enzimática (rojo).
Los datos de la Fig. 9 se completan e ilustran con las imágenes de la Fig. 10, en las que
se observa una proliferación clara de los amastigotes intracelulares cuando los macrófagos
son inducidos con esta citoquina (10 B y D), tanto en la cepa murina sensible (10 A y B)
como en la resistente (10 C y D)
A
B
C
D
Figura 10: Micrografias de macrófagos BALB/c y C57BL/6 tras 48 h de infección con L. major.
Tinción panóptico. 100x.
A y B: Macrófagos BALB/c. A: control. B: Preinducidos con 20 ng/ml de TGF-β.
C y D: Macrófagos C57BL/6. A: control. B: Preinducidos con 20 ng/ml de TGF-β.
96
RESULTADOS
4.1.2. Determinación de la isoforma de arginasa inducida en macrófagos infectados
Estudios previos llevados a cabo por Louis y col. (1999) han demostrado que los
macrófagos murinos expresan arginasa I en respuesta a las citoquinas Th2. Basándonos en
este hecho, y de la misma manera que se hizo para la enzima la iNOS (Fig. 3), quisimos
comprobar si en los macrófagos infectados con Leishmania la isoforma inducida por
citoquinas Th2 era también la I. Para ello se realizó un inmunoblotting en el que se
comparó la activación de la enzima en macrófagos infectados con L. major, tras su
incubación durante 48 h con IL-4, IL-10 o TGF- β.
Los resultados que se presentan en la Fig. 11 muestran claramente que es la arginasa I
citosolica (con un peso molecular de 35 KDa) la isoforma inducida por estas citoquinas,
siendo la IL-4 (calle 3) la que produce mayores niveles de proteína. Así, como se aprecia,
las cantidades generadas por la IL-4 son cercanas a las encontradas en hígado de ratón
(calle 1), en el cual esta isoforma es constitutiva y tiene los más altos niveles de actividad
específica encontrada en tejidos.
En cuanto a la IL-10 (calle 4) y al TGF-β (calle 5), muestran unas bandas muy similares
entre sí, y algo más tenues que en el caso de la IL-4, corroborando los datos encontrados
con la medida de esta enzima mediante el micrométodo (Fig. 5, 7 y 9).
Figura 11:Western blotting de lisados de cultivos de macrófagos inducidos con citoquinas Th2 e
infectados con L. major durante 48 h.
Calle1: Control positivo (homogenizado de hígado de ratón).
Calle 2: Macrófagos control.
Calle 3: Macrófagos pretratados con 25 ng/ml de IL-4.
Calle 4: Macrófagos pretratados con 20 ng/ml de IL-10.
Calle 5: Macrófagos pretratados con 10 ng/ml de TGF-β
97
RESULTADOS
4.1.3. Efecto de la adición de L- ornitina y putrescina a macrófagos infectados
Los resultados anteriores sugieren que la inducción de la arginasa en los macrófagos,
modulada por una respuesta predominante tipo Th2, es la que favorece el crecimiento y
multiplicación de los parásitos a nivel intracelular.
Con el fin de demostrar que la proliferación de Leishmania es debida a la generación de
ornitina por las células -que es usada por el parásito para la síntesis de poliaminas-, se
añadieron directamente a los cultivos de macrófagos C57BL/6 infectados, dosis crecientes
de ornitina y de la poliamina putrescina.
Como se observa en la Fig. 12, la adición de estas dos sustancias provoca un aumento
significativo del número de amastigotes totales. Así, queda demostrado que el crecimiento
de los parásitos intracelulares se incrementa de forma dosis dependiente por ambas, Lornitina y putrescina, debido a que estas permiten la generación de poliaminas esenciales
Amastigotes/100 células
para la proliferación de Leishmania.
600
ornitina
putrescina
500
400
300
200
100
0
0
50
100
150
200
250
Concentración de ornitina / putrescina
(µ M)
Figura 12: Efecto de la adición de cantidades crecientes de ornitina y putrescina sobre
macrófagos C57BL/6 tras 48 h de infección con L. major.
98
RESULTADOS
Estos datos se complementan con las imágenes microscópicas presentadas en la Fig. 13,
donde se aprecia un importante incremento de las formas amastigote intracelulares en el
interior de los macrófagos tratados con L-ornitina repecto a las células control infectadas.
A
B
C
Figura 13: Micrografías de macrófagos C57BL/6 tras 48 h de infección con L. major. Tinción
panóptico. 100x.
A: Macrófagos C57BL/6 control.
B: Macrófagos C57BL/6 pretratados con 250 µM de ornitina. Incremento notable del
número de amastigotes intracelulares.
C: Detalle de un macrófago C57BL/6 procedente de un cultivo pretratado con 250
µM de ornitina. Presencia de abundantes formas amastigote en su citoplasma.
99
RESULTADOS
4.1.4. Análisis de la inhibición de la arginasa y de la iNOS sobre la parasitación
celular
Como se ha podido comprobar en los ensayos mostrados previamente, la susceptibilidad
y resistencia a la infección por Leishmania refleja diferencias intrínsecas expresión de la
arginasa I y iNOS en macrofagos activados.
Una vez determinada la diferencia de inducción de ambas enzimas en macrófagos de
las dos cepas murinas, quisimos demostrar el efecto que causaría su inhibición sobre la
infección por Leishmania.
4.1.4.1. Inhibición de la arginasa
Los datos obtenidos hasta el momento sugerían que la inducción de la arginasa era
utilizada por los parásitos para la proliferación. Si esto era así, por tanto, la inhibición de
esta enzima debería revertir los niveles de parasitacion celular.
Para demostrar esta hipótesis, se añadió a los cultivos L-Hydroxy-Arginina (LOHA), el
inhibidor competitivo más potente de la arginasa. Tal y como puede observarse en la Fig.
14, el efecto antiproliferativo de LOHA sobre el crecimiento en ambas cepas murinas fue
muy significativo cuando los macrófagos se activaron previamente con citoquinas Th2,
como IL-4, IL-10 o TGF-β.
Pero también apareció una inhibición significativa del número de amastigotes
intracelulares en las células sin tratamiento, donde la arginasa del macrófago no está
inducida. Esto puede explicarse en base al hecho de que el parásito también posee una
arginasa capaz de ser inhibida por la LOHA, se apunta mas adelante en esta sección.
La acción de la LOHA se manifiesta especialmente en células BALB/c activadas con
IL-4, donde la disminución del número de amastigotes intracelulares fue mas drástica: pasó
de una media de 725 parásitos/ 100 células a menos de 100. El descenso de la parasitación
también fue notable en macrófagos estimulados con IL-10 y TGF-β, donde el número total
de amastigotes se redujo a una cuarta parte.
100
RESULTADOS
En el caso de las células C57BL/6, el efecto inhibidor de LOHA consiguió disminuir los
niveles de infección a aproximadamente a la mitad, tanto en macrófagos control
(pasando de 70 amastigotes totales a unos 30) como en aquellos tratados con IL-10 y TGFβ (donde el número de parásitos por 100 células varió de 200 a aproximadamente 100). Sin
embargo, la reducción del número de parásitos fue aun más significativa para las células
tratadas con IL-4, en las cuales el nivel de infección disminuyó a un tercio, pasando de un
valor medio de 200 hasta unos 70 amastigotes/100 células.
Amastigotes/100 células
750
BALB/c -control
BALB/c -LOHA
C57BL/6-control
C57BL/6-LOHA
500
250
0
Control
IL-4
IL-10
TGF
Figura 14: Número total de amastigotes en macrófagos de las cepas BALB/c y C57BL/6,
activados con distintas citoquinas Th2 en presencia o ausencia de 100 µM de LOHA
e infectados durante 48 h con L. infantum.
101
RESULTADOS
Un hallazgo sorprendente que también se observó en estos ensayos fue el de que la
LOHA por si sola fuese capaz de inhibir hasta un 50% del número total de amastigotes y el
porcentaje de infección en las dos cepas, en las que la arginasa no estaba inducida.
Con el fin de analizar más en profundidad este efecto antiparasitario o antiproliferativo
de LOHA sobre células control infectadas, en primer lugar se tomaron macrófagos
BALB/c y se infectaron tanto con L. major como con L. infantum, en presencia de
concentraciones crecientes de LOHA (Fig. 15) durante 48h. A continuación se realizó un
estudio de la infección a lo largo del tiempo con una cantidad fija (100 µM) de este
producto (Fig. 16). Los resultados demostraron en ambos casos un significativo descenso
tanto del número de amastigotes intracelulares como del porcentaje de células parasitadas,
mientras que la viabilidad de los macrófagos no se vio afectada, como pudo comprobarse
por el ensayo de reducción del MTT (Fig. 18).
Como se aprecia en la Fig. 15, la disminución de parásitos fue proporcional a la dosis
de LOHA, alcanzándose, en el caso de L. major, un nivel de infección para la
concentración máxima casi 4 veces inferior al observado en el control. Asimismo, el
porcentaje de macrófagos parasitados disminuyó drásticamente, pasando de un 72% en
células sin tratamiento con el inhibidor, a un 18% en macrófagos con 100 µM de LOHA.
Para el caso de L. infantum, el descenso de parasitación también fue muy significativo,
aunque no tan acusado como en el caso de L. major (Fig. 15). Como puede comprobarse,
el número total de amastigotes descendió paulatinamente con la dosis, pasando de una
media de 115 a un número aproximado de 40/100 macrófagos. Paralelamente, el porcentaje
de células parasitadas bajó de un 78% en los controles a un 23% en células con la máxima
dosis del inhibidor.
102
RESULTADOS
En la Fig. 15 están incluidos los niveles de nitritos medidos en los sobrenadantes de
cultivo. Esto se realizó porque al ser LOHA un intermediario en la síntesis de NO, se
podría estar generando esta molécula a partir de la LOHA, mediante radicales como O2- u
otras oxidasas distintas a la iNOS. Sin embargo, los datos demuestran que, al menos en las
condiciones de nuestros experimentos, los efectos antiproliferativos de la LOHA son
300
Ama stigotes L. infantum
72
Ama stigotes L. major
Nitritos L. major
200
Nitritos L. infatum
62
50
40
48
78
51
0
0
20
40
100
25
18
36
50
35
75
-
30
NO2 (µM)
Amastigotes/100 células
independientes de la producción de NO.
10
23
100
0
LOHA (µ M)
Figura 15: La LOHA es capaz de inhibir el crecimiento de los parásitos en dos especies
Leismania, L. infantum y L. major. Los macrófagos BALB/c fueron infectados con
promastigotes en presencia de concentraciones decrecientes de LOHA durante 48 h.,
y se utilizaron para determinar el número total de amastigotes (círculos azules), el
porcentaje de infección (números), y la cantidad de nitritos en los sobrenadantes del
cultivo (círculos verdes).
103
amastigotes/100 células
RESULTADOS
300
72
68
65
250
200
59
150
56
LOHA
control
51
43
100
34
50
0
0
6
12
18
24
30
36
42
48
Tiempo (h)
Figura 16: La LOHA es capaz de inhibir el crecimiento de los parásitos a lo largo del tiempo.
Los macrófagos BALB/c fueron infectados con promastigotes de L. major en
presencia de 100 µM de LOHA (gris), usándose para determinar el número de
parásitos intracelulares (círculos) y el porcentaje de infección (números) a distintos
tiempos, en relación a células control infectadas (azul).
Estos resultados de inhibición sobre los parásitos por parte de la LOHA quedan también
claramente reflejados en las micrografías presentadas en la Fig. 17. En ellas se puede
contemplar una espectacular reducción del numero de formas amastigote intracelulares en
cultivos de macrofagos de ambas cepas BALB/c (17 A, B, C y D) y C57BL/6 (17 E y F).
Asimismo se comprueba, corroborando los datos numéricos, que el efecto
antiproliferativo de la LOHA es eficaz para reducir la parasitación tanto en macrófagos
infectados con la especie L. infantum (17 A y B) como con L. major (17 C, D, E y F).
104
RESULTADOS
A
C
B
D
E
F
Figura 17: Micrografías de macrófagos de ambas cepas, en presencia o ausencia de 100 µM de
LOHA. Tinción panóptico. 100x.
A: Macrófagos BALB/c control tras 48 h de infección con L. infantum.
B: Macrófagos BALB/c infectados con L. infantum en presencia de LOHA.
C: Macrófagos BALB/c control tras 48 h de infección con L. major.
D: Macrófagos BALB/c infectados con L. major en presencia de LOHA.
E: Macrófagos C57BL/6 control tras 48 h de infección con L. major.
F: Macrófagos C57BL/6 infectados con L. major en presencia de LOHA.
105
RESULTADOS
Para confirmar realmente que la LOHA estaba inhibiendo de forma eficaz la arginasa de
nuestros cultivos, se midieron los niveles de inducción enzimática en macrófagos durante
el curso de la infección celular. Los datos revelaron cambios significativos en la actividad
de la enzima, pasando de un valor medio de 25,67 ± 1,24 en los controles a 1,23 ± 0.08 en
las células incubadas en presencia de 100 µM de LOHA.
Además comprobamos que las diferentes dosis del inhibidor no afectaban al viabilidad
de los macrófagos, al menos hasta la concentración máxima de 100µM usada en nuestros
ensayos (Fig. 18). Esto significa que esta molécula esta actuando específicamente contra
Leishmania, penetrando en las células presumiblemente por los mismos transportadores
usados por el aminoácido L-arginina.
D.O. (570nm)
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0
25
50
75
100
Concentración de LOHA (µM)
Figura 18: Análisis de viabilidad celular a concentraciones crecientes de LOHA por el método
de reducción del MTT.
Las densidades ópticas de los distintos cultivos se midieron a 570 nm,
comprobándose que no existen diferencias significativas entre las células control
(0,75 ± 0.02) y las tratadas con una concentración máxima de 100µM de LOHA
(0,078 ± 0.03).
106
RESULTADOS
Debido a que la LOHA es producto de la reacción de la iNOS, parte de la destrucción
parasitaria que siempre se ha observado por tratamiento con IFN+LPS podría ser debido no
solo a la producción de NO, como estaba hasta el momento aceptado, sino también, al
menos en parte, a la producción de LOHA vía iNOS.
Para confirmar nuestra hipótesis, llevamos a cabo un ensayo utilizando tres tipos de
macrófagos: BALB/c, C57BL/6 y la variante iNOS-Knock out de esta última cepa,
deficiente en dicha enzima.
Como se observa en la Fig. 19, en los macrófagos activados con IFN+LPS sólo las
células con una iNOS funcional, es decir, las procedentes de ratones C57BL/6 (19A) o
BALB/c (19C) son capaces de reducir de manera notable el número de amastigotes
intracelulares. Por el contrario, como era esperable, en las células iNOS-Knock out (19B),
el número total de parásitos y el porcentaje de células infectadas en presencia de IFN+LPS
fueron similares a los controles. Es decir, que la inducción de la enzima iNOS es la
responsable de la muerte de los parásitos.
En presencia de este inhibidor, el número de parásitos fue reducido aproximadamente
un 75% en todas las células infectadas, inclusive las iNOS-KO (19B), tanto en controles
como en las activadas con IFN+LPS.
Sin embargo, cuando añadimos a los cultivos L-ornitina, esta molécula fue capaz de
incrementar significativamente el número de parásitos intracelulares en los tres tipos de
macrófagos, y casi restauró los niveles de infección en presencia de LOHA exógena (75%)
y de la producida con una iNOS funcional cuando las células se activan con IFN+LPS
(68%).
107
RESULTADOS
A
Amastigotes/100 células
300
Sin tratamiento
86
Con 250 µM de Ornitina
Con 100 µM de LOHA
200
60
54
100
57
28
19
Amastigotes/ 100 células
B
300
Sin tratamiento
Con 250 µM de Ornitina
Con 100 µM LOHA
79
*
82
200
75
68
65
100
26
27
10
0
Control
LOHA
0
IFN+LPS
Control
LOHA
IFN+LPS
Amastigotes/100 células
C
Sin tratamiento
83
300
Con 250 µM Ornitina
Con 100 µM LOHA
200
79
62
100
65
25
0
Control
LOHA
34
16
IFN+LPS
Figura 19: La L-ornitina revierte el efecto inhibitorio de la LOHA tanto exógena como producida
endógenamente.
Macrófagos procedentes de ratones C57BL/6 (A), su variante iNOS-Knock Out (B) y
BALB/c (C), con o sin pretratamiento con 100µM LOHA o IFN+LPS en ausencia o
presencia de 250 µM de L-Ornitina durante 48 h. Los resultados representan el
número de amastigotes en 100 células (barras) y el porcentaje de macrófagos
infectados (números). *P< 0,05 por el test T de Student.
108
RESULTADOS
Pero la LOHA, al ser añadida a los macrófagos murinos, puede ser diana del superóxido
y producir NO como producto de la reacción de forma no enzimática (Modolell y col.,
1997). Aunque estudios previos han demostrado que la muerte de los parásitos por NO es
independiente de la formación de superóxido o peroxinitritos, se quiso descartar la posible
implicación de estos radicales en la actividad antiparasitaria observada con la LOHA. Para
ello, se realizó un ensayo añadiendo superóxido dismutasa (SOD) en concentraciones
crecientes a distintos cultivos tratados con 100 µM de LOHA. Los resultados,
representados en la Fig. 20, muestran que la adición de esta enzima no modifica la muerte
de parásitos en presencia del inhibidor, y demuestran así que los mecanismos efectores de
la LOHA ocurren independientemente de la generación de superóxido.
Amastigotes/100 células
250
Sin LOHA
Con LOHA
200
75
72
76
73
150
100
30
25
27
23
50
0
Control
100
250
500
SOD (mU / ml)
Figura 20: Efecto de la SOD en la inhibición de parasitaria producida por LOHA.
Los macrófagos BALB/c se infectaron con promastigotes de L. infantum en presencia
de cantidades crecientes de SOD sóla (barras verdes) o conjuntamente con 100 µM de
LOHA (barras grises). Después de 48 h., se realizó el contaje del número de parásitos
intracelulares (barras) y del porcentaje de células infectadas (números).
109
RESULTADOS
Con el objetivo de atribuir directamente el crecimiento de los parásitos a la inducción
de la arginasa I mediada por citoquinas Th2, diseñamos un nuevo experimento adicional
utilizando nor-LOHA, el inhibidor competitivo de esta enzima más específico existente
hasta el momento. La diferencia fundamental con la LOHA es que la Nor-LOHA no es
sustrato de la iNOS y, por tanto, no puede generar NO.
Como se observa en la Tabla 1, la Nor- LOHA fue capaz de inhibir todo el crecimiento
producido en presencia de IL-4, IL-10 y TGF-β. Además resultó efectiva reduciendo la
proliferación de los parásitos en células control infectadas, debido al hecho de que, como
también se ha comprobado (ver punto 5.1.2.), Leishmania presenta actividad arginasa. En
ningún caso se produjo un incremento del NO en los sobrenadantes de los cultivos,
demostrando claramente que la inhibición de la arginasa de la célula hospedadora es
necesaria y suficiente para revertir el crecimiento inducido en presencia de citoquinas Th2.
Amastigotes/ 100 células
Nitritos (µM)
Tratamiento
Sin Nor-LOHA
Nor-LOHA
Sin Nor-LOHA
Nor-LOHA
Control
122 ± 20.4
46 ± 10.7
1.24 ± 0.15
1.21 ± 0.26
IL-4
431 ± 37.9
75 ± 8.6
1.45 ± 012
1.30 ± 0.08
IL-10
245 ± 27.3
60 ± 15.2
1.17 ± 0.09
1.22 ± 0.22
TGF-β
289 ± 18.2
71 ± 5.8
1.32 ± 016
1.28 ± 0.12
Tabla 1: Efecto de la Nor-LOHA sobre el crecimiento de parásitos intracelulares en macrófagos
BALB/c, tras 48 h de infección con L. major. Las células se utilizaron para determinar
el número medio de parásitos intracelulares y la concentración de nitritos en los
sobrenadantes de cultivo.
110
RESULTADOS
4.1.4.2. Inhibición del NO
Como habíamos demostrado anteriormente, la producción endógena de LOHA vía
iNOS es responsable de la muerte de parásitos intracelulares en células activadas con
IFN+LPS, ya que su efecto es reversible por ornitina. Sin embargo, quisimos profundizar
más en los efectos de LOHA en ausencia de NO. Para ello se añadió a los cultivos
Carboxy-PTIO, una molécula que oxida el radical NO· conforme se va produciendo y lo
transforma en NO2- en una proporción mol a mol. Esta molécula se utiliza para
incrementar la sensibilidad de la reacción de Griess, ya que genera niveles más altos de
nitritos en los sobrenadantes de los cultivos, al estar secuestrando el NO.
Además, para corroborar esta teoría, se utilizó un inhibidor enzimático específico de la
iNOS, la N-monometil-L-arginina o NMMLA.
Los resultados presentados en la Fig. 21 demuestran que la retirada del NO del medio
de cultivo por el carboxy-PTIO, no es capaz de revertir los efectos parasiticidas obtenidos
con la inducción de la iNOS por IFN+LPS. La ausencia de efecto fue similar en células de
las dos cepas de ratón.
Sin embargo, este hallazgo se modificó cuando el carboxy-PTIO se añadió en presencia
de NMMLA, observándose entonces un aumento notable de la supervivencia de los
parásitos intracelulares. Así, y para ambas cepas, las células tratadas con IFN+LPS y
NMMLA alcanzan cotas de infección muy cercanas a las de los macrófagos control.
Por otra parte, en este mismo ensayo, la adición exógena de LOHA disminuyó en gran
medida el número de parásitos intracelulares, tanto en células sin tratar como cuando se
añadió conjuntamente con IFN+LPS, ratificando los datos obtenidos previamente (Fig.
19).
111
RESULTADOS
250
Amastigotes/100 células
A
200
Sin tratamiento
Con LOHA
78
76
80
72
Con PTIO
Con PTIO+NMMLA
150
100
24
30
50
34
10
0
Control
IFN+LPS
Amastigotes/100 células
B
200
Sin tratamiento
Con LOHA
150
58
66
Con PTIO
60
Con PTIO+NMMLA
55
100
20
50
0
31
33
18
Control
IFN+LPS
Figura 21: La retirada del NO por carboxy-PTIO no modifica la infección celular.
Los macrófagos BALB/c (A) y C57BL/6 (B) fueron infectados con L. infantum y
tratados con 100µM de LOHA o 100µM de carboxy-PTIO, este último con o sin
(concentración de NMMLA), en ausencia o presencia de IFN+LPS durante 48 h. Los
resultados representan el número de amastigotes intracelulares en 100 células (barras)
y el porcentaje de células infectadas (números).
112
RESULTADOS
Los sobrenadantes de estos cultivos fueron extraídos para la determinación de nitritos, y
los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2. Aunque los niveles de nitritos no
resultan modificados por la LOHA exógena, incluso en presencia de una inducción de la
iNOS, el Carboxy-PTIO casi duplicó las concentraciones de nitritos, siendo este efecto
proporcional a la dosis de dicha sustancia. Estos resultados sugieren que el NO no es el
principal responsable de la destrucción de Leishmania en presencia de IFN+LPS.
Nitritos (µM)
Tratamiento
Pre-tratamiento
Control
IFN-γ + LPS
Sin inhibidores
1,79 ± 0,21
33,56 ± 2,92
LOHA
1,74 ± 0,23
33,58 ± 2,22
Carboxy-PTIO
1,81 ± 0,19
65,13 ± 3,01
NMMLA
1,73 ± 0,25
3,75 ± 0,29
NMMLA+ Carboxy-PTIO
1,78 ± 0,2
12,03 ± 1,78
Tabla 2: Concentración de nitritos en los sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados con
IFN+LPS e infectados con L. infantum en presencia de LOHA y Carboxy-PTIO.
113
RESULTADOS
4.1.5. Caracterización de la enzima arginasa presente en promastigotes de Leishmania
En primer lugar se quiso medir, en ambas especies del parásito, L. major y L. infantum,
la actividad arginasa que contienen las formas promastigote. Para ello se tomaron lisados
de cultivos de ambas especies y se midió en ellos la actividad enzimática, tal y como se
detalla en el apartado 3.2.1.7. de Material y Métodos. Los resultados quedan reflejados en
la Tabla 3.
Con el fin de confirmar que la urea medida en el ensayo se derivaba de la arginasa y no
de otras enzimas productoras de esta sustancia, se determinaron también ambas actividades
en presencia de su inhibidor especifico, LOHA. Como puede observarse en la tabla, la
LOHA redujo la actividad enzimática aproximadamente un 98%.
Todos estos resultados demuestran que ambas especies de Leishmania contienen una
arginasa funcional que es eficientemente inhibida por LOHA.
ACTIVIDAD ARGINASA
ESPECIE DE
ACTIVIDAD ARGINASA
LEISHMANIA
(mU/ 107 parásitos)
L. major
11,34 ± 1.80
0,3
L. infantum
9,8 ± 0,5
0,15
EN PRESENCIA DE LOHA
(mu/107 parásitos)
Tabla 3: Actividad arginasa de promastigotes de Leishmania y efecto inhibidor de la LOHA sobre
la enzima del parásito.
114
RESULTADOS
4.2. ESTUDIOS IN VIVO
4.2.1. Análisis de los signos clínicos: evolución de la lesión
En un primer ensayo se llevó a cabo la infección experimental de 5 ratones de cada
cepa, con el fin de determinar el desarrollo normal de la lesión cutánea tanto en los
animales sensibles (BALB/c) como en los resistentes (C57BL/6).
Los resultados se presentan en la Fig. 22. Como puede observarse, en los ratones
sensibles la lesión progresa paulatinamente, llegando alcanzar incrementos en el grosor de
la almohadilla plantar de hasta 5,5 mm respecto a su homóloga sana al día 50 postinfección. A partir del día de los 28 d.p.i., sin embargo, las medidas obtenidas comienzan a
ser más variables, debido a la aparición de úlceras cutáneas que conllevan una pérdida y
retracción tisular.
En el caso de la cepa resistente C57BL/6, la inflamación alcanza niveles inferiores (1,5
mm de máximo a los 28 d.p.i.), y a partir de ese momento comienza a descender, hasta que
desaparece (autocuración) alrededor de las 8 semanas post-infección.
Como complemento a estos datos, en la Fig. 23 se pueden comparar claramente las
diferencias entre ambas cepas cuando la infección ya se encuentra en un estadio avanzado.
Como se aprecia, a los 50 d.p.i. los ratones sensibles BALB/c (23 A) han desarrollado una
importante inflamación de tipo necrótico acompañada de ulceración del estrato córneo,
mientras que en los C57BL/6 (23 B), la lesión prácticamente ha desaparecido, siendo el
aspecto de la extremidad infectada casi normal.
115
Incremento de la lesi ón de l a pata
(mm)
RESULTADOS
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
BALB/c
C57BL/6
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Días post-i nfecci ón
Figura 22: Desarrollo lesional a lo largo del tiempo en 5 ratones de cada cepa, infectados con 106
promastigotes en la zona plantar de la extremidad posterior derecha.
En el caso de los ratones BALB/c, el ensayo se interrumpió a los 52 días postinfección por razones humanitarias.
A
B
Figura 23: Fotografías de ratones pertenecientes a ambas cepas, tras 50 días de infección con 106
promastigotes de L. major.
A: Animal susceptible BALB/c.
B: Animal resistente C57BL/6.
116
RESULTADOS
4.2.2. Análisis de la respuesta inmune
4.2.2.1. Estudio de la respuesta inmune humoral
El estudio de la respuesta humoral se realizó mediante la técnica inmunoenzimática
ELISA, enfrentando los sueros de las dos cepas murinas utilizadas (BALB/c y C57BL/6) a
tres tipos de antígenos: la proteína total soluble (PT) de L. major y las proteínas
recombinantes quimera (PQ) y KMP-11. Asimismo, el análisis se llevó a cabo
diferenciando dos subclases de IgG (IgG1 e IgG2a) en cada uno de los ensayos y para
ambas cepas.
4.2.2.1.1. Respuesta inmune humoral frente a Proteína Total (PT) de L. major
Para el estudio de la evolución de la respuesta inmune humoral en los ratones, el primer
paso fue analizar la reactividad de ambas cepas frente a la totalidad de los antígenos del
parásito Leishmania major.
Mediante el uso de la Proteína Total soluble, y tal como se aprecia en la Fig. 24, se
demuestra que los animaless susceptibles BALB/c desarrollan una respuesta muy elevada
de ambas subclases de IgG a partir de los 14 d.p.i., y hasta el final de la experiencia (60
d.p.i.). Estos niveles de anticuerpos son sensiblemente superiores a los C57BL/6 a lo largo
de la infección, siendo las diferencias mucho más acusadas a partir de los 28 d.p.i.
El análisis de las subclases de IgG para la PT de L. major ofreció unos resultados muy
acordes con el trasfondo genético de cada una de las cepas. Así, como se aprecia en la
figura, los BALB/c presentan una respuesta dicotómica, prevaleciendo, aunque de forma
bastante sutil, la IgG1. Los C57BL/6, por el contrario, presentan unos niveles
predominantes de la subclase IgG2a, mientras que la IgG1 sólo se muestra débilmente
positiva entre los días 28 y 42 post-infección.
117
RESULTADOS
1.5
BALB/c-IgG1
BALB/c-IgG2a
C57BL/6-IgG1
C57BL/6-IgG2a
D.O.
1.0
0.5
0.0
0
10
20
30
40
50
60
70
Días post-infección
Figura 24 : Análisis de la respuesta humoral en las cepas murinas BALB/c y C57BL/6 frente
Proteina Total soluble, a lo largo de la infección con 106 promastigotes de L. major en
la almohadilla plantar. Se ha diferenciado entre las dos subclases de IgG (IgG1,
IgG2a) . Los sueros se diluyeron 1/50 y la lectura de las placas se realizó a 490 nm.
Con el fin de determinar la carga de anticuerpos específicos de una forma cuantitativa,
se realizó una titulación haciendo diluciones dobles seriadas del suero. Se escogió el punto
42 post-infección, por ser en el cual de veían mayores diferencias a piori entre las
densidades ópticas alcanzadas por ambas cepas.
Como se observa en la Fig. 25, a los 42 d.p.i. los ratones BALB/c respondieron con
unos niveles muy elevados de IgG, estableciéndose el título de anticuerpos entre 1/12.800
y 1/25.600 para la subclase IgG2a y entre 1/3.200 y 1/6400 para la subclase IgG1. La
predominancia de la IgG2a en BALB/c para este ensayo en concreto puede ser debida a la
proximidad de sus niveles de respecto a la IgG1 en el punto escogido para la titulación (42
118
RESULTADOS
d.p.i.), que junto con el hecho de que se ha trabajado con pool de sueros en cada uno de las
determinaciones, pueden hacer que las diferencias de valores entre una y otra subclase no
sean estrictamente tan marcadas como se refleja en la Fig. 26
Los ratones C57BL/6, por el contrario, presentaron con unos niveles de anticuerpos
comparativamente mucho menores, fijándose el límite de positividad del suero en 1/200
para la subclase IgG2a y de 1/50 para la IgG1, corroborando así que su respuesta Th1 es,
de forma muy clara, predominante sobre la Th2.
Estos resultados reflejan que la respuesta humoral en ratones resistentes C57BL/6 es del
orden de 100 veces menor que la observada para la cepa susceptible BALB/c. Es decir,
que los animales que son capaces de controlar la infección, responden con una producción
moderada de anticuerpos, mientras que los ratones sensibles desarrollan una exacerbada
inmunidad de tipo humoral.
D.O. (490 nm)
1.5
BALB/c IgG1
BALB/c IgG2a
C57BL/6 IgG1
C57BL/6 IgG2a
1.0
0.5
0.0
1/50
1/100
1/200
1/400
1/800
1/1600
1/3200
1/6400
1/12.800 1/25.600
Titulación
Figura 25: Titulación de anticuerpos en las cepas murinas BALB/c y C57BL/6 frente Proteina
Total soluble, en el día 42 post-infección, y para las dos subclases IgG1 e IgG2a.
La lectura de las placas se realizó a 490 nm , y el umbral de positividad se situó en
0.18.
119
RESULTADOS
4.2.1.1.2. Respuesta inmune humoral frente al antígeno KMP-11 de L. infantum
Para profundizar en el análisis de la respuesta inmune humoral, enfrentamos los sueros
de los ratones al antígeno recombinante KMP-11 de L. infantum. Esta proteína de
membrana presenta características compartidas con el antígeno LPG, y se ha mostrado
como un excelente marcador de los primeras fases de la infección en el modelo canino,
siendo ampliamente reconocida en la mayoría de los animales infectados tanto natural
como experimentalmente (Nieto y col., 1999).
En nuestro caso, al analizar la respuesta de subclases en ambas cepas, observó que los
ratones C57BL/6 no reconocieron el antígeno para ninguna de ellas a lo largo de toda la
infección. Los BALB/c, por el contrario, y tal como se aprecia en la Fig. 26, mostraron una
elevada respuesta IgG1 frente al antígeno a partir del día 21, que se mantuvo a unos niveles
muy elevados hasta el día 36 post-infección, momento a partir del cual desciende
bruscamente. En cuanto a la subclase IgG2a, se comprobó que los valores no superaron en
ningún momento el umbral de positividad. En BALB/c, el título de anticuerpos para la
subclase IgG1 frente a este antígeno recombinante fue de 1/200 a los 28 d.p.i.
1.50
BALB/c-IgG1
BALB/c-IgG2a
1.25
C57BL/6-IgG1
C57BL/6-IgG2a
D.O.
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0
10
20
30
40
50
60
Días post-infección
Figura 26: Análisis de la cinética de anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG2a frente a KMP-11 y para
ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6 . Los ratones se infectaron con 106 promastigotes de
L. major. Los sueros se testaron a una dilución 1/50 y las placas fueron leídas a 490 nm.
120
RESULTADOS
4.2.1.1.3. Respuesta inmune humoral frente a Proteína Quimera (PQ) de L. infantum
Para finalizar el analisis de la respuesta inmune humoral, se estudió la reactividad de los
sueros al enfrentarlos a la proteína quimera (PQ) de L. infantum. Este antígeno ha
demostrado ser un excelente marcador de enfermedad, tanto en el modelo canino (Soto y
col., 1996b ) como en hamster (Soto y col., 2002 ) ya que sólo reaccionan con él los sueros
de animales que desarrollan una leishmaniosis patente o sintomática, mientras que no lo
hacen aquellos con formas asintomáticas prolongadas o regresivas.
En base a estos hechos, se quiso comprobar si esta misma proteína funcionaba como
marcador de resistencia/ susceptibilidad en el modelo murino y para la infeccion con la
especie L. major. Para ello se testaron los sueros de ratones BALB/c y C57BL/6 a lo largo
del experimento, y se analizaron las subclases IgG1 e IgG2a.
Como se aprecia en la Fig. 27, la proteína Q se reveló como un excelente marcador de
enfermedad en el modelo L. major/ ratón, ya que sólo los animales susceptibles BALB/c
respondieron a este antígeno. Los C57BL/6, por el contrario, mantuvieron sus niveles de
anticuerpos por debajo del umbral de positividad a lo largo de todo el ensayo.
Los ratones BALB/c desarrollaron una fuerte respuesta IgG1 e IgG2a anti PQ, aunque
con una cinética diferente a la observada contra PT, siendo de aparicion bastante mas
tardia. Asi, los niveles de anticuerpos comienzan a detectarse de forma intensa a partir del
dia 28 post-infeccion, coincidiendo con el incremento mas acusado que se produce en la
inflamacion de las patas (Fig. 22) y con el inicio de la aparicion de ulceras y necrosis en
las lesiones. Aunque los niveles comienzan a ser positivos a partir del día 7 post-infección
para la subclase IgG2a -que resulta ser de aparicion mas precoz que la IgG1 para este
antigeno-, la subida mas intensa se produce a partir del 28 post-infección en ambos
subtipos, momento a partir del cual la IgG1 empezó a ser predominante frente a la IgG2a y
121
RESULTADOS
se mantuvo así hasta el final del experimento.
1.25
BALB/c-IgG1
BALB/c-IgG2a
C57BL/6-IgG1
C57BL/6-IgG2a
D.O.
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0
10
20
30
40
50
60
70
Días post-infección
Figura 27: Cinética de anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG2a en ratones de ambas cepas
BALB/c y C57BL/6 infectados con 106 promastigotes de L. major, al enfrentar los
sueros a la Proteína Quimera (PQ). Las muestras se diluyeron 1/50, y la lectura de
las placas se realizó a 490 nm.
Al realizar diluciones seriadas de suero para titularlos frente a las dos subclases, se pudo
observar que la respuesta específica anti-PQ se mantiene positiva hasta 1/200 los 54 dpi
para la cepa BALB/c, siendo, por tanto, una respuesta mucho más restringida, como era
esperable, que la que aparecio frente a PT (Fig. 27).
En el caso de la cepa C57BL/6 no se llevó a cabo la titulación, pues la dilución del
suero a 1/50 tuvo una reactividad sólo basal, considerándose por tanto negativa.
122
RESULTADOS
4.2.2.2. Estudio de la respuesta inmune celular
Como complememto al analisis comparativo de la respuesta inmune humoral en ambas
cepas, quisimos determinar la cinetica en suero de las dos citoquinas que, según la
bibliografia revisada hasta la fecha, desempeñan un papel determinante en la generacion de
una respuesta protectiva (Th1) o no protectiva (Th2) frente a la infeccion por el parasito: la
IL-12 y la IL-4, respectivamente.
4.2.2.2.1. Determinación de los niveles de IL-4 en suero
Al determinar los niveles de IL-4 en suero representados en la Fig. 28, observamos que
en ambas cepas existen niveles sericos de esta citoquina, siendo cuantitativamente mayores
en los BALB/c que en los C57BL/6 a lo largo de todo el experimento.
El patron o cinetica, sin embargo, fue similar o paralelo en los dos fenotipos murinos.
De forma general, aparecio un pico de induccion desde el dia 2 post-infeccion, que alcanzo
su maximo a los 7 d.p.i. en el caso de los C5/BL/6 y al 14 dpi para los BALB/c, siendo la
concentracion en este punto maxima casi cuatro veces superior a en los sensibles que en
los resistentes (37 pg/ml y 10 pg/ml, repectivamente).
Tras un descenso brusco en los niveles sericos (que precede a la disminucion paulatina
de los Ac anti-KMP11 representada en la Fig. 26), a partir de los 21 d.p.i. se aprecia una
subida progresiva de la concentracion de ambas cepas murinas, siendo en todo momento
mayor para los BALB/c. Esta subida es paralela en el tiempo a la aparicion de un segundo
tipo de respuesta humoral en los ratones BALB/c, la respuesta anti-PQ (Fig. 27).
123
Concentración de IL-4 en suero
(pg/ml)
RESULTADOS
40
BALB/c
C57BL/6
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Días post-infección
Figura 28: Niveles de IL-4 en suero a lo largo de la infección con L. major para un pool de
sueros de ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6. Las muestras fureon diluidas
½, y las placas se leyeron a 450 nm.
124
RESULTADOS
4.2.1.2.2. Determinación de los niveles de IL-12 en suero
El análisis de IL-12 sérica, representado en la Fig. 29, nos permitió detectar su
presencia en ambas cepas durante prácticamente toda la infección. Esta citoquina muestra
niveles oscilantes a lo largo del tiempo, alcanzando máximos de concentración cercanos a
los 3000 pg/ml a los días 21 y 42 en los ratones resistentes y al día 28 post-infección en los
sensibles.
Sin embargo, es un hallazgo llamativo que a partir de los 28 d.p.i., y superponiéndose a
la segunda subida pico de IL-4, los niveles de IL-12 descienden drásticamente en los
Concentracion de IL-12 en
suero (pg/ml)
BALB/c, mientras que se mantienen en los C57BL/6.
3000
BALB/c
C57BL/6
2000
1000
0
0
10
20
30
40
50
Días post-infección
Figura 29: Niveles de IL-12 en suero a lo largo de la infección con L. major para un pool de
sueros de ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6. Las muestras fureon diluidas
½, y las placas se leyeron a 450 nm.
125
RESULTADOS
4.2.3. Cuantificación de la inducción de arginasa en las lesiones
Una vez procesadas las muestras conforme al apartado 3.2.2.5.1. de Material y
Métodos, se cuantificó en ellas la actividad arginasa a lo largo de la infección.
Tal y como se aprecia en la Fig. 30, existió un incremento en la inducción de la enzima
a partir de los 7 d.p.i. y hasta el final del ensayo para los BALB/c, mientras que en los
C57BL/6 la actividad descendió bruscamente a partir del 28 d.p.i. y hasta el final de la
experiencia. Estos valores son paralelos a los obtenidos en las medidas de la inflamación
plantar (Fig. 22) y coinciden con los resultados de los estudios inmunohistoquímicos
(Apartado 5.2.5. de Resultados)
Hay que apuntar que el análisis de la arginasa en las extremidades sanas, mostró que los
niveles de la enzima se mantuvieron en valores constitutivos para ambas cepas a lo largo
Arginasa (mU/mg)
de toda la infección.
BALB/c
60
C57BL/6
40
20
0
0
7
14
21
28
35
42
49
Días post-infección
Figura 30: Medida de la actividad arginasa en extremidades sanas e infectadas a distintos puntos
de la infección y para ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6.
126
RESULTADOS
4.2.4. Estudio anatomopatológico de las lesiones
4.2.4.1. Infección en ratones sensibles BALB/c
El estudio lesional en esta cepa murina se llevó a cabo a lo largo de todo el ensayo,
tomando como referencia los días 2, 7, 14, 21, 28 y 42 post-infección.
A los 2 d.p.i. se observó un edema de localización subepidérmica (Fig. 31A),
acompañado de una moderada infiltración de polimorfonucleares en la dermis,
fundamentalmente de localización perivascular (Fig. 31B).
31 A
31 B
Figura 31: Lesión plantar en BALB/c, 2 d.p.i. Dermatitis subepidérmica. H&E, 10x (A) y 20x (B)
A los 7 d.p.i. ya se detectó una dermatitis subepidérmica de desarrollo considerable. El
edema fue de menor cuantía que al día 2; sin embargo, el componente inflamatorio celular
alcanzó proporciones importantes (Fig. 32A). Se observó una masiva infiltración a nivel de
la dermis, fundamentalmente constituida por polimorfonucleares y, en menor medida, por
mononucleares (Fig. 32A y B).
El proceso inflamatorio, inicialmente de distribución perivascular (Fig. 32B),
evolucionó hacia difuso, con interacción de la dermis y la hipodermis, desarrollándose un
proceso de paniculitis hipodérmica. La epidermis, sin embargo, conservó una total
integridad.
127
RESULTADOS
32A
32B
Figura 32: Lesión plantar en BALB/c, 7 d.p.i. H&E.
A: Dermatitis subepidérmica. 10x
B: Infiltrado perivascular en dermis.40x.
A los 14 días postinfección se siguió detectando una dermatitis subepidérmica. El grado
de infiltración celular, tanto de polimorfo como de mononucleares, fue de mayor cuantía
que en el día 7 (Fig. 33A y B).
A nivel de la dermis se inicia el proceso de desectructuración de la morfología tisular,
llegando incluso a alcanzar a la hipodermis (Fig. 33B). Se observaron zonas dérmicas e
hipodérmicas donde no se evidenciaron componentes de la arquitectura del tejido, siendo
sustituido por una masiva infiltración piocitaria y de mononucleares. La epidermis
conservo la integridad, si bien fueron detectados aislados fenómenos de acantolisis.
33 A
33 B
Figura 33: Lesión plantar en BALB/c, 14 d.p.i. H&E.
A: Dermatitis subepidérmica. 20x.
B: Necrosis y abundante infiltrado piocitario en dermis e hipodermis. 10x.
128
RESULTADOS
A los 21 d.p.i. la dermatitis subepidérmica avanzó con respecto a estadios anteriores.
Además, se detectó una dermatitis intradérmica. Los fenómenos de acantolisis apreciados
en el día 14, evolucionaron hacia un edema intercelular (Fig. 34A), a causa de la
desaparición de los puentes intercelulares, la consecuente espongiosis y el inicio de la
degeneración vacuolar de las células del estrato basal.
34A
Figura 34A: Lesión plantar en BALB/c, 21 d.p.i. Edema intracelular epidérmico. H&E. 100x.
Existió una total sustitución de los componentes dérmicos y epidérmicos por infiltrado
piocitario, mononuclear (Fig. 34B), y macrófagos con una considerable carga parasitaria
(Fig. 34C).
34B
34C
Figura 34 B y C: Lesión plantar en BALB/c, 21 d.p.i. . H&E.
B: Necrosis y abundante infiltrado piocitario en dermis e hipodermis. 10x.
C: Macrófagos en la dermis con abundante carga parasitaria. 40x.
129
RESULTADOS
Al dia 28 post-infección, se apreció en la epidermis una dermatitis intradérmica focal,
con infiltración mononuclear leve (Fig. 35A). Los fenómenos de acantolisis y espongiosis
fueron generalizados, y se evidenció una considerable degeneración vacuolar de los
estratos germinativo y espinoso.
La dermis mostró un proceso inflamatorio difuso y una necrosis más avanzada que en el
día 14, con un componente celular representado por
mononucleares (Fig. 35B) y
macrófagos con una abundante carga parasitaria (Fig. 35C). Los fenómenos de paniculitis
visualizados a partir del día 7 post-infección se observaron con mayor extensión,
alternando con zonas de necrosis de desarrollo considerable.
41 C
35A
35B
35C
Figura 35: Lesión plantar en BALB/c, 28 d.p.i. H&E
A: Dermatitis intradérmica. 100x.
B: Abundante infiltrado piocitario en dermis e hipodermis. 40x.
C: Macrófagos en la dermis con numerosos amastigotes de Leishmania en su interior.
100x
130
RESULTADOS
Al día 42 post-infección la dermatitis intradérmica evolucionó hacia la cronicidad (Fig.
36A y 36B). El proceso intraepidérmico no fue generalizado, pues las zonas necróticas y/o
ulcerativas se alternaron con zonas acantolíticas y espongióticas similares a las observadas
en el estadio anterior. A nivel de la dermis y de hipodermis existió una total sustitución de
los constituyentes del tejido por una necrosis masiva con formación de abcesos, y una
desaparición total de la morfología tisular (Fig. 36C y 36D).
36A
36C
36B
36D
Figura 36: Lesión plantar en BALB/c, 42 d.p.i. H&E.
A: Úlcera y necrosis en epidermis. 10x.
B: Úlcera y necrosis en epidermis. 20x
C: Necrosis en dermis e hipodermis. 10x.
D: Necrosis en dermis e hipodermis. 10x.
131
RESULTADOS
4.2.4.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6
El estudio lesional en esta cepa se llevó a cabo a lo largo de todo el ensayo, y al igual
que en los ratones BALB/c, se seleccionaron los puntos 2, 7, 14, 21, 28 y 42 postinfección.
A los 2 d.p.i. se inició una infiltración y dermatitis subepidérmica, inicialmente con
exudación plasmática y, ulteriormente, a los 7 días, con infiltrado de piocitos,
polimorfonuclearas y mononuceares (Fig. 37 y 38, respectivamente). El proceso afectó a
dermis e hipodermis, evolucionando a los 14 días hacia una infiltración piocitaria y de
mononucleares masiva en ambas zonas, acompañada de intensos fenómenos de necrosis
(Fig. 39A y 39B).
37
Figura 37: Lesión plantar en C57BL/6, 2 d.p.i. Tricrómico de Masson, 20x.
Dermatitis subepidérmica.
38
Figura 38: Lesión plantar en C57BL/6, 7 d.p.i. Tricrómico de Masson, 10x.
Masiva infiltración dérmica.
132
RESULTADOS
39A
39B
Figura 39 A y B: : Lesión plantar en C57BL/6, 14 d.p.i. H&E. 20x.
Dermatitis subepidérmica. Necrosis.
A los 21 días se inició la regresión del cuadro lesional,
40A
de tal modo que la dermatitis subepidérmica detectada
(Fig.40A) se configuró por un moderado infiltrado
neutrofílico y linfoplasmocelular (Fig.40B).
40B
Figura 40: Lesión plantar en C57BL/6, 21 d.p.i. Dermatitis
subepidérmica A: H&E, 40x. B: Tricrómico de Masson, 20x.
.
La evolución regresiva de las lesiones condujo a la presencia de una infiltración muy
escasa a los 28 días y casi ausente a los 42 (Fig. 42 A y B). La epidermis conservó su
integridad estructural desde los 2 hasta los 42 dpi.
41A
41B
Figura 41 A y B: Lesión plantar en C57BL/6, 42 d.p.i. Escasa exudación plasmática y celular.
A: : H&E, 20x.
B: Tricrómico de Masson, 20x.
133
RESULTADOS
4.2.4.3. Resumen del análisis histopatológico en ambas cepas
En los ratones sensibles BALB/c se inicia un proceso de dermatitis subepidérmica a los
2 d.p.i., que evoluciona en intensidad y gravedad hacia los 14 d.p.i. Hasta ese día existió
una integridad total de la epidermis.
A los 21 d.p.i. de evidenció alternancia de infiltración celular (piocitaria y mononuclear)
con fenómenos de necrosis. Comienza en este periodo la alteración del epitelio con un
edema intercelular, que evolucionó hacia una dermatitis intradérmica a los 28 días y hacia
la presencia de un proceso ulcerativo y necrótico de la epidermis a los 42 d.p.i.
La dermis e hipodermis a los 28 y 42 días mostraron una necrosis masiva, con
desestructuración de la arquitectura tisular, como evolución del proceso observado a los 21
días.
En los ratones resistentes C57BL/6 se observa idéntico proceso al detectado en ratones
sensibles, cualitativamente hablando. Sin embargo, cuantitativamente encontramos
diferencias significativas, ya que la lesión (dermatitis subepidérmica) es inicialmente de
menor cuantía. Pero lo que es absolutamente concluyente es la evolución, ya que a partir
de los 21 días, y de manera determinante a los 28 días, existió una regresión lesional, que
condujo a la presencia escasa o ausencia de lesiones a los 42 d.p.i.
134
RESULTADOS
4.2.5. Estudio inmunohistoquímico de las lesiones para detección de arginasa
4.2.5.1. Infección en ratones sensibles BALB/c
De modo genérico, en los ratones BALB/c sacrificados a los 2 (Fig. 42) y 7 (Fig. 43)
días postinfección con Leishmania major, existió ausencia de inmunoreacción para la
arginasa, si bien ocasionalmente se detectaron aisladas inmunoreacciones positivas de
localización subepidémica.
42
Figura 42:Lesión plantar en BALB/c, 2 d.p.i. Ausencia de inmunorreacción biotinaestreptavidina-peroxidasa para detección de arginasa I. 20x.
43
Figura 43: Lesión plantar en BALB/c, 7 d.p.i. Negatividad en la inmuntinción. Biotinaestreptavidina-peroxidasa para detección de arginasa I. 10x.
A los 14 días postinfección (Fig. 44) comienza una
44
inmunoreacción de localización dérmica, con tropismo sobre
el conectivo intercelular y el infiltrado mononuclear y
fagocitario. La inmunotinción podríamos catalogarla de
moderada.
Figura 44: Lesión plantar en BALB/c, 14 d.p.i. Inmunotinción positiva en el infiltrado
mononuclear dérmico y en el conectivo intercelular. Biotina-estreptavidinaperoxidasa para detección de arginasa I. 100x.
135
RESULTADOS
Sin embargo, a los 21 días comienza a incrementarse la inmunorreacción, estando
también presente en dermis, con localización intracelular y adyacente -en el espacio
intercelular- a los macrófagos parasitados (Fig. 45A), en el conectivo perivascular (Fig.
45B) y de amplia difusión en el espacio subepidérmico (Fig. 45C).
45A
45B
45C
Figura 45: Lesión plantar en BALB/c, 21 d.p.i. Biotina-estreptavidina-peroxidasa para detección
de arginasa.
A: Inmunorreacción positiva en macrófagos parasitados y en el espacio intercelular de
la dermis. 100x.
B: Inmunopositividad en el conectivo perivascular de la dermis. 100x
C: Inmunopositividad en el conectivo perivascular e intersticial de la dermis, y
en el infiltrado celular. 20x
46
Al 28 d.p.i. la inmunotinción empieza a ser profusa, de
idéntica localización a las del día 21 pero afectando también
al tránsito dermo-hipodérmico, con una intensa reacción en
el conectivo intersticial (Fig. 46).
Figura 46: Lesión plantar en BALB/c, 28 d.p.i. Inmunotinción positiva de arginasa
de
localización intracelular, en macrófagos, e intercelular en el tránsito dermohipodérmico. Biotina-estreptavidina-peroxidasa, 100x.
136
RESULTADOS
La difusión, amplitud e intensidad de la reacción a la arginasa aumentan
considerablemente a los 42 d.p.i., con idéntica localización a la descrita (Fig. 47).
47
Figura 47: Lesión plantar en BALB/c, 42 d.p.i. Inmunodeteción positiva para la arginasa
intracelular, en macrófagos, e intercelular, en el tránsito dermo-hipodérmico. Biotinaestreptavidina, 100x.
A los 47 d.p.i., salvo la epidermis, toda la dermis e hipodermis aparecen
inmunomarcadas, y la maraña de la inmunotinción enmascara toda la arquitectura tisular
necrótica o en vias de necrosis (Fig. 48).
48
Figura 48: Lesión plantar en BALB/c, 47 d.p.i. Masiva inmunotinción arginasa positiva en la
subepidermis y la dermis. Biotina-estreptavidina , 20x.
137
RESULTADOS
4.2.5.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6
En estos animales se observó negatividad en la inmunodetección para la arginasa tanto a
los 2 (Fig. 49) como a los 7 (Fig. 50) días post-infección.
49
Figura 49: Lesión plantar en C57BL/6, 2 d.p.i. Ausencia de inmunorreacción biotinaestreptavidina para la detección de arginasa. 10x.
50
Figura 50: Lesión plantar en C57BL/6, 7 d.p.i. Negatividad en la inmunodeteción. Biotinaestreptavidina para la detección de arginasa,100x.
A los 14 d.p.i. comienza la inmunoreacción que se presenta de leve a moderada (Fig.
51) y que se continúa a los 21 d.p.i. (Fig. 52). La reacción positiva a la arginasa afectó al
conectivo e infiltrado perivascular (Fig. 51) y al conectivo intersticial de la dermis (Fig.
52), siempre circundada de una infiltración celular muy moderada, de idéntica intensidad
que el inmunomarcaje.
138
RESULTADOS
51
Figura 51: Infección en C57BL/6, 14 d.p.i. Reacción arginasa positiva en la dermis, con
inmunotinción en el conectivo y el infiltrado perivascular. Biotina-estreptavidinaperoxidasa, 40x.
52
Figura 52: : Infección en C57BL/6, 21 d.p.i. Moderada inmunorreacción arginasa positiva en el
conectivo intersticial dérmico. Biotina-estreptavidina-peroxidasa, 100x.
53
A los 28 d.p.i. comienza a disminuir la intensidad y
amplitud de la inmunotinción, quedando circunscrita a
una escasa reacción arginasa positiva, localizada
fundamentalmente en el estrato subepidérmico (Fig.
53).
Figura 53: Infección en C57BL/6, 28 d.p.i. Moderada inmunorreacción arginasa positiva en el
conectivo intersticial dérmico. Biotina-estreptavidina-peroxidasa, 100x.
139
RESULTADOS
Idéntica localización, intensidad y amplitud se detecta para los días post-infección 42
(Fig. 54) y 47 (Fig. 55).
54
Figura 54: Infección en C57BL/6, 42 d.p.i. Escasa inmunorreacción arginasa positiva en el
conectivo intersticial dérmico. Biotina-estreptavidina-peroxidasa, 20x.
55
Figura 55: Infección en C57BL/6, 47 d.p.i. Escasa inmunorreacción arginasa positiva en el
conectivo intersticial dérmico. Biotina-estreptavidina-peroxidasa, 10x.
140
RESULTADOS
4.2.5.3. Resumen del análisis inmunohistoquímico en ambas cepas
Los resultados del análisis de la inmunorreacción para la arginasa en ambas cepas y a lo
largo del tiempo aparecen reflejados en la Tabla 4.
2 d.p.i. 7 d.p.i. 14 d.p.i. 21 d.p.i. 28 d.p.i. 42 d.p.i. 47 d.p.i.
BALB/c
-
+/-
+
++
+++
+++
+++
C57BL/6
-
-
+
++
++
+
+
Tabla 4: Análisis semicuantitativo de la inmunoreacción para la arginasa en almohadilla plantar de
ratones BALB/c y C57BL/6 experimentalmente infectados con Leishmania major.
-
Ausencia de inmunotinción
+/-
Presencia ocasional de inmunotinción
+
Inmunotinción escasa
++
Inmunotinción moderada
+++ Inmunotinción abundante
141
5.
DISCUSIÓN
Cultivo de macrofagos infectados con L. major
DISCUSIÓN
5.-DISCUSIÓN
5.1. ESTUDIOS IN VITRO
5.1.1. Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes al
parásito
En el presente trabajo se ha pretendido, como objetivo fundamental, esclarecer la
función que la arginasa I desempeña en la respuesta inmune frente al protozoo Leishmania.
Para ello, el primer paso a seguir fue el estudio de dicha enzima en la propia célula
hospedadora del parásito, el macrófago. Con este fin, se realizaron una serie de ensayos de
activación celular mediante distintas citoquinas de tipo Th1 y Th2, para posteriormente
determinar los parámetros de infección con las especies Leishmania infantum y
Leishmania major, y la regulación de dicha infección según la ruta metabólica del
aminoácido L-arginina. Así, la primera parte del estudio consistió en analizar la respuesta
de los macrófagos infectados con Leishmania bajo condiciones en las cuales las células
estaban inducidas para presentar una actividad funcional arginasa I o iNOS.
Está bien establecido que hay diferencias entre cepas murinas en lo que se refiere a la
resistencia/susceptibilidad a la infección por Leishmania: los ratones BALB/c desarrollan
una respuesta dominante Th2 y se vuelven susceptibles, mientras que los C57BL/6
controlan la infección debido a que su respuesta inmune es predominantemente de tipo Th1
(Russel, 1995).
Según lo descrito por Modolell y col. en 1995, los macrófagos murinos activados
metabolizan la arginina por dos vías alternativas, que implican a las enzimas iNOS
(inducida por citoquinas Th1) o arginasa (estimulada por citoquinas Th2). Tomando
conjuntamente estos datos, podríamos presumir que los ratones C57BL/6, con un
transfondo genético principalmente de tipo Th1, en principio tenderían a desarrollar la vía
iNOS, mientras que los BALB/c, que por su naturaleza genética presentan una respuesta
Th2 mucho más fuerte, se inclinarían a desarrollar una mayor inducción de la arginasa en
145
DISCUSIÓN
respuesta a la infección y frente a distintos estímulos de citoquinas.
Efectivamente, nuestros resultados lo han confirmado. Al comparar la capacidad de los
macrófagos de ambas cepas para controlar la infección, los datos han mostrado que las
células procedentes de los ratones BALB/c alcanzan, en todos los ensayos, un nivel de
parasitación más alto y un mayor número de amastigotes intracelulares que los de la cepa
resistente C57BL/6. Este hecho puede correlacionarse con el dato, también reflejado en
nuestros resultados, de que los macrófagos BALB/c, constitutivamente, derivan más su
metabolismo de la arginina hacia la vía de la arginasa, mientras que los C57BL/6 tienen
una mayor predisposición a la inducción de la enzima iNOS cuando son estimulados con
citoquinas Th1 como el IFN-γ.
Al contrario de lo que ocurre cuando en las células se induce la enzima arginasa, si la
L-arginina es metabolizada vía iNOS, los macrófagos C57BL/6 presentaron más altos
niveles de nitritos que las células BALB/c. De acuerdo con esto, la muerte de los parásitos
fue más acusada en células de ratones resistentes, en comparación con las células
procedentes de la cepa susceptible.
Resultados similares han sido obtenidos recientemente por Mills y col. (2000) en
macrófagos de cepas murinas distinto grado de respuesta al balance Th1/Th2, las cuales
difieren también en su habilidad para dirigir el metabolismo de la L-arginina. Estos autores
observan que existen diferencias entre los niveles de inducción de arginasa I en
macrófagos dependiendo del transfondo genético de los ratones. Así, aquellos que
desarrollan una respuesta predominante Th1 cuando son inducidos con LPS (como los
C57BL/6) producen menos actividad arginasa I y generan NO, mientras que los que
desarrollan una respuesta fundamentalmente de tipo Th2 (como los procedentes de ratones
BALB/c), producen principalmente L-ornitina en respuesta al producto bacteriano. Estas
células han sido denominadas macrófagos M1 y M2 respectivamente (Mills y col., 2000).
Estos datos también han corroborado las hipótesis previas de que el metabolismo de la
L-arginina hacia arginasa I o iNOS, podría determinar diferentes estados funcionales en el
146
DISCUSIÓN
macrófago (Modolell y col., 1995). En esta ocasión se ha utilizado por primera vez a un
patógeno intracelular de estas células para demostrar la función de la arginasa I,
confirmando que el destino final de la L-arginina regula el crecimiento de Leishmania
dentro de los macrófagos.
En referencia al efecto de las citoquinas Th2 sobre la proliferación de los parásitos,
partimos del hallazgo previamente descrito de que Leishmania es capaz de inducir en el
hospedador las citoquinas anti-inflamatorias IL-4, IL-10 y TGF-β (Mosser y Karp, 1999).
Como estas moléculas son a su vez inductoras de arginasa (Corraliza y col., 1995; Boutard
y col., 1995), nuestra hipótesis consistió en establecer una relación entre los niveles de
inducción de la enzima y el crecimiento de amastigotes intracelulares, en presencia de
estos tres tipos de moléculas.
Los resultados mostraron claramente que en presencia de interleuquinas tipo Th2,
cuando sólo la arginasa está inducida, ambas cepas murinas responden con un alto
incremento en la proliferación parasitaria. Sin embargo, al comparar los niveles de
parasitación y actividad enzimática en presencia de IL-4, IL-10 y TGF-β, se apreciaron
diferencias significativas entre BALB/c y C57BL/6. El hecho de que los macrófagos
BALB/c respondan con niveles más altos de arginasa I e infección que aquellos
procedentes de la cepa C57BL/6, sugiere que existe una estrecha correlación entre los
niveles de inducción de la enzima y el crecimiento de Leishmania en el hospedador, puesto
que la diferencia en la actividad arginasa específica entre cepas fue aproximadamente
paralela a la diferencia en el número total de amastigotes que se replicaron.
Hay que partir de la base de que los niveles constitutivos de actividad arginasa e
infección fueron ya más altos en células control susceptibles en comparación con las
resistentes. Estas diferencias en inducción de arginasa y proliferación parasitaria se
apreciaron más claramente cuando las células de ambas cepas se trataron con idénticas
dosis de citoquinas Th2, respondiendo las procedentes de BALB/c con mayores niveles de
147
DISCUSIÓN
infección que aquellas de ratones C57BL/6. De esta manera, el grado de permisividad a la
infección de macrófagos observado in vitro entre las dos cepas puede explicar las
diferencias observadas in vivo, donde los ratones C57BL/6, con una respuesta Th2 mucho
menor, presentan menor carga parasitaria en las lesiones en comparación con los BALB/c
(Beil y col., 1992).
Al analizar en profundidad la acción de cada una de las tres citoquinas testadas en los
ensayos, comprobamos que el efecto de la IL-4 fue el más significativo. Así, las células
activadas con IL-4 presentaron unos niveles de infección que llegaron incluso a
cuadruplicar los observados en los controles. Paralelamente, este incremento en la
parasitación celular se acompañó de una fuerte inducción de la actividad arginasa.
Se sabe que la IL-4 es el más potente inductor de la arginasa I (Corraliza y col., 1995).
De esta forma, la explicación más razonable de nuestros datos es que la inducción de la
arginasa I por los macrófagos permite un incremento en el pool de ornitina, que después es
metabolizado por la ornitina decarboxilasa (ODC) de Leishmania a putrescina, requerida
para la síntesis de ADN y proliferación parasitaria.
Estos datos están en consonancia con hallazgos previos que indican que
la
preactivación temprana de una respuesta de células T hacia una subpoblación polarizada
Th2 determina el crecimiento de Leishmania dentro de los macrófagos (Kane y Mosser,
2000). De hecho, en ratones BALB/c, la producción temprana de IL-4 es necesaria y
suficiente para conducir a un desarrollo de células Th2 (Himmelrich y col, 2000). Más
aún, ratones con una disrupción selectiva para el gen de la IL-4, contienen la infección y
no desarrollan enfermedad progresiva (Kopf y col., 1996), mientras que la amplia
producción de IL-4 en ratones C57BL/6, debido a la presencia de un transgen, provoca un
fenotipo susceptible (Leal y col., 1993). La contribución de la inducción de la IL-4 en la
enfermedad ha sido recientemente confirmada por la demostración de que los ratones con
una disrupción del gen para la transcripción de STAT 6, el cual media en la señalización
para la IL-4, llegan a ser resistentes a la infección por Leishmania (Stamm y col., 1998), y,
148
DISCUSIÓN
coincidentemente, macrofagos procedentes de estos ratones no indujeron arginasa en
respuesta a la IL-4 como era esperable (Rutschman y col., 2001). Todos estos hallazgos,
junto con nuestros resultados, apuntan hacia un nuevo rol de la IL-4 en las células
infectadas: el de mantener el crecimiento de Leishmania a través de la inducción de la
arginasa.
Los ensayos con la IL-10 nos han permitido observar que la estimulación con esta
molécula también provoca un considerable incremento de la actividad arginasa y del
número de parásitos intracelulares, si bien ambos parámetros son menores que en el caso
de la IL-4. En base a nuestra hipótesis, estas diferencias podrían deberse a que la IL-10 es
un inductor de la arginasa bastante menos eficaz que la IL-4, y por tanto produce menores
niveles de ornitina que el parásito pueda aprovechar para proliferar.
Respecto a la función de esta citoquina en la infección por Leishmania, ha sido
demostrado recientemente que los macrófagos procedentes de ratones BALB/c infectados
in vitro con amastigotes de L. major producen IL-10, la cual reduce la producción de IL-12
y TNF-α. Esto previene la muerte de los parásitos por células activadas e incrementa la
supervivencia de los mismos (Kane y Mosser, 2001). En adición a esto, nuestros resultados
demuestran que la IL-10 también contribuye a la progresión de la enfermedad por la
inducción de la arginasa I, la cual favorece la proliferación de los parásitos intracelulares.
El TGF-β es un potente inductor de la arginasa en macrófagos de roedores, y tiene
variadas funciones desreguladoras en el sistema inmune, incluyendo la inhibición de la
activación de los macrófagos. Esta molécula está inducida en macrófagos infectados,
probablemente actuando como uno de los mecanismos de escape desarrollados por
Leishmania para evitar la capacidad lítica de estas células. Ha sido reconocido, además,
como un promotor de enfermedad en leishmaniosis (Barral y col., 1995).
En nuestros ensayos, hemos comprobado que el tratamiento con TGF-β de las células
149
DISCUSIÓN
infectadas incrementa la proliferación de los parásitos, a la vez que induce un incremento
dosis-dependiente en la actividad arginasa específica en macrófagos. Así confirmamos el
mismo patrón obtenido para la IL-4 y la IL-10: Leishmania aprovecha la generación de
ornitina por el efecto del TGF-β en las células hospedadoras para multiplicarse dentro de
ellas.
5.1.2. La arginasa I es la isoforma inducida en macrófagos infectados activados con
citoquinas Th2
Otro de los datos que hemos confirmado por nuestros experimentos es que la isoforma
de arginasa inducida en macrófagos infectados, al tratarlos con citoquinas Th2, es la
arginasa I. Aunque tanto la arginasa I como la II son capaces de regular la síntesis de
poliaminas (Li y col., 2001), parece lógico pensar que sea la primera, de localización
citosólica, la responsable en última instancia de la producción de poliaminas para la
proliferación de los amastigotes de Leishmania, también ubicados en el citoplasma del
macrófago. Nuestro hallazgo reafirma lo descrito previamente por Modolell y
colaboradores en 1995, quienes demuestran que la isoforma I es la inducida en cultivos de
macrófagos murinos procedentes de médula osea en respuesta al estímulo de citoquinas
Th2.
5.1.3. La adición exógena de L-ornitina y putrescina favorece el crecimiento de
amastigotes intracelulares
Nuestra hipótesis fundamental se basa en que el crecimiento de Leishmania mediante la
inducción de la arginasa I se lleva a cabo por la generación de poliaminas, que como ya
han citado otros autores, son esenciales para la proliferación del parásito (Jiang y col.,
1999). Los resultados han mostrado que, efectivamente, el número de parásitos
intracelulares se incrementa de forma dosis-dependiente en presencia de ambas L-ornitina
150
DISCUSIÓN
y putrescina.
Este efecto se vio comprobado también cuando se añadió ornitina exógena a cultivos de
macrófagos BALB/c, C57BL/6 o iNOS-KO, en los cuales fue capaz de restaurar los
niveles de infección en presencia tanto de IFN+LPS como de LOHA.
El requerimiento de ornitina y poliaminas para el crecimiento de Leishmania ha sido
estudiado hasta la fecha de forma extensa. Se sabe que la síntesis de poliaminas es esencial
para el normal crecimiento y diferenciación de las especies de Leishmania (Mukhopadhyay
y Madhubala, 1995). Uno de los principales intereses de investigación en parasitología
molecular de este protozoo está focalizado en la expresión genética y actividad de la
ornitina decarboxilasa (ODC). En contraste con la enzima de mamíferos, la ODC de estos
parásitos es mucho más estable (Mukhopadhyay y Madhubala, 1995).
En este sentido, el metabolismo de las poliaminas en protozoos parásitos ha atraído una
atención considerable, pues es una importante diana para la acción de los fármacos. Así,
cabe destacar que la difluorometilornitina, un inhibidor de la ODC, está siendo usado para
el tratamiento de la leishmaniosis (Van Boris, 1990), y la pentamidina, un inhibidor del
transporte de la arginina y poliaminas (Kandpal y col., 1995), es actualmente la principal
sustancia utilizada en el tratamiento de la leishmaniasis humana resistente a antimoniales
(Basselin y col., 2000).
Así, puesto que los parásitos con una arginasa funcional son sensibles a la depleción de
ornitina, los inhibidores específicos de la enzima también podrían constituir sustancias
potenciales de interés farmacológico para el tratamiento de la leishmaniosis.
5.1.4. La inhibición de la arginasa reduce la proliferación de Leishmania spp.
Una vez asentada la idea de que la inducción de la arginasa I en el macrófago era capaz
de favorecer en gran medida la proliferación de Leishmania en el hospedador, el siguiente
paso en los ensayos fue comprobar el efecto que la inhibición dicha enzima tendría sobre la
151
DISCUSIÓN
replicación parasitaria.
Como efectivamente podríamos suponer en un principio, la adición del inhibidor LOHA
a los cultivos resultó tener un efecto significativo sobre la multiplicación de las formas
amastigote intracelulares, reduciendo los niveles de parasitación a lo largo del tiempo, y
sugiriendo así una acción citotóxica de la molécula sobre los parásitos.
Ha sido descrito que la LOHA induce apoptosis en las líneas celulares tumorales
dependientes de la síntesis de poliaminas para la proliferación (Chénais y col., 1993; Singh
y col., 2000). De esta manera, parece ser que lo mismo ocurre en cultivos infectados,
donde el crecimiento de los parásitos se previene por la inhibición del aporte de ornitina.
Los macrófagos, una población estable y diferenciada, no son dependientes de poliaminas
para crecer, y por ello permanecen viables, tal y como mostró el ensayo realizado con
MTT.
Por otra parte, nuestros resultados están en concordancia con los niveles de afinidad de
L- arginina y LOHA para iNOs y arginasa I, recientemente publicados (Moali y col.,
2000). La iNOS tiene mayor afinidad por la L-arginina que por LOHA. Por el contrario, la
arginasa I tiene mucha mayor afinidad por su inhibidor, LOHA, que por su sustrato.
Entonces, a pesar de las concentraciones de L-arginina presentes en los cultivos (1mM en
el medio RPMI), la LOHA puede inhibir la arginasa de los parásitos y también la isoforma
I inducida en macrófagos.
En este aspecto, y corroborando el hallazgo de Camargo y col. en 1978, hay que señalar
que nuestros resultados también confirmaron la presencia de actividad arginasa funcional
tanto en L. infantum como en L. major, siendo ésta, además, eficazmente inhibida in vitro
en presencia de LOHA.
El resultado de la inhibición de arginasa de Leishmania puede explicar el efecto
antiparasitario observado en las células control infectadas, mientras que inhibiendo la
arginasa I inducida en el macrófago, la LOHA es capaz de prevenir el crecimiento
observado en presencia de citoquinas Th2 como la IL-4. Por lo tanto, los resultados
152
DISCUSIÓN
apuntan a una dependencia del crecimiento de los parásitos a una inducción eficiente de la
arginasa I del macrófago; esta isoforma, inducida en el contexto de una respuesta inmune
tipo Th2, puede mantener óptimamente el crecimiento de Leishmania.
En definitiva, lo que nuestros datos sugieren es que la inhibición de la arginasa de los
parásitos es responsable de los efectos de la LOHA exógena. Además, en células activadas,
su producción endógena vía iNOS puede también desempeñar un papel en la muerte de
Leishmania, debido a la reversión observada en presencia de la L-ornitina.
Como ha sido señalado por otros autores, la LOHA es un intermediario estable en la
reacción de iNOS, y puede también ser metabolizada hacia otros intermediarios reactivos
del nitrógeno (RNI´s), inclusive NO por otras oxidasas celulares (Boucher y col., 1992), o
reaccionar con otros radicales, como el H2O2 (Holm, 1999), dando lugar a productos
alternativos. Por esta razón, tuvimos que asegurarnos que su efecto citotóxico no se debía a
la generación de NO. Midiendo la producción de nitritos en los ensayos de dosis-respuesta,
no se observó en ningún momento positividad por el método de Griess, pudiéndose a
priori excluir al NO como responsable del efecto inhibidor de la LOHA.
Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que parte de los mecanismos
efectores de LOHA puedan también deberse a la generación de radicales, incluyendo NO
gas no detectable mediante la reacción de Griess. Hay que destacar, en este sentido, que el
potencial tóxico de este radical, cuando se aplica exógenamente en forma de donadores de
NO, se ha mostrado eficaz en contra Leishmania, in vitro (Assreuy y col., 1994; Mauel y
col., 1991) y útil para el tratamiento de la leishmaniosis cutánea (López-Jaramillo y col.,
1988).
Como ya ha sido reportado previamente por Moali y col. (2000), la LOHA es tanto
sustrato de la iNOS como producto de la enzima. En referencia a esto, ha sido descrito que
la inducción de la iNOS en macrófagos genera un 20% de productos totales de la reacción
como LOHA (Meyer y col., 1997). Esto puede definirse como aproximadamente de 10 a
153
DISCUSIÓN
30 µM de este aminoácido secretado al medio de cultivo.
Por ello, también nos propusimos demostrar que la LOHA generada endogenamente vía
iNOS, cuando las células eran activadas con IFN+LPS, podría ser, al menos en parte, la
responsable de la muerte de Leishmania en estos macrófagos.
Al añadir a los cultivos activados el carboxy-PTIO, molécula secuestrante del NO
ampliamente utilizada por otros autores como Amano y Noda (1995), comprobamos que la
muerte de los parásitos se mantuvo en los macrófagos de ambas cepas. Sin embargo, el
efecto sí fue revertido por el inhibidor de la iNOS NMMLA, como se ha descrito
previamente (Assreury y col., 1994). De esta manera, cuando agregamos NMMLA, y por
tanto bloqueamos no solo la producción de NO, sino también la de LOHA, vimos que se
anuló casi totalmente el efecto producido por el IFN+LPS, y que el número total de
amastigotes se vio notablemente incrementado.
En concordancia con estos datos, ha sido demostrado recientemente que la respuesta in
vivo a la infección por Leishmania depende de una iNOS funcional, pero puede ser
controlada en ausencia de estallido respiratorio (Murray y Nathan, 1999). En este sentido,
nuestros resultados confirman que una inducción de la iNOS es esencial para contener la
infección por Leishmania, pero apuntando a LOHA como una nueva molécula, junto con
los RNIs, directamente implicada en los efectos de inducción de esta enzima.
Hay que volver a señalar que los niveles de nitritos no se modificaron por la adición
exógena de LOHA, incluso cuando las células fueron tratadas con IFN+LPS y por tanto la
iNOS estuvo inducida. Estos resultados sugieren que LOHA no estuvo siendo
metabolizada por dicha enzima, por lo menos para incrementar la secreción de nitritos.
En conclusión, nuestros datos apuntan que la inducción de iNOS en células activadas
puede tener doble efecto parasiticida: por una parte, la producción de LOHA endógena y
su consecuente inhibición de la arginasa de los parásitos, por otra parte, la producción de
RNIs que se ha comprobado que son tóxicos para Leishmania. El hecho de que la muerte
de este protozoo no pueda ser revertida retirando el NO, no invalida el papel de otros RNIs
154
DISCUSIÓN
no secuestrados por el carboxy-PTIO (Amano y Noda, 1995). Más aún, pensamos que el
NO tiene un papel indudable en determinar la respuesta temprana a la infección,
induciendo a las células T para su modulación hacia respuestas protectivas (Bodgan y col.,
2000).
Es un hecho constatado que la LOHA, según autores como Vetrovsky y col. (1996),
puede ser también diana del superóxido cuando es añadida a los macrófagos murinos, Sin
embargo, el estallido respiratorio y la generación del radical O2- por las células infectadas
con Leishmania parece no ser eficiente para destruir al parásito, ya que éste posee su
propia SOD para evadir el ataque del hospedador (Russell, 1995). Más aún, trabajos
previos han demostrado que la muerte de Leishmania por el NO es independiente de la
formación de superóxido o peroxinitritos (Assreury y col., 1994).
A pesar de ello, y constituyendo el eslabón final del análisis de los mecanismos
inhibidores de la LOHA, quisimos descartar la posible implicación de estos radicales en la
actividad antiparasitaria de dicha molécula. Para ello hicimos un ensayo añadiendo SOD a
los cultivos, comprobándose que la adición de este producto no causó ninguna
modificación de la muerte de los parásitos en presencia del inhibidor, y demostrando así
que los mecanismos efectores de LOHA también ocurren independientemente de la
generación de superóxido.
Como complemento a los ensayos realizados con la LOHA, y para corroborar una vez
más que la actividad antiparasitaria de esta molécula era independiente de la generación de
NO, probamos un nuevo producto, la Nor-LOHA, el inhibidor competitivo de la arginasa
más específico disponible (Tenu y col. 1999).
Los macrófagos, como ya ha sido descrito anteriormente, son capaces de producir
LOHA, el inhibidor fisiológico de la enzima, cuando son activados por citoquinas Th1 que
inducen iNOS. La LOHA es un intermediario estable en la reacción y puede ser
155
DISCUSIÓN
posteriormente metabolizada hacia NO y citrulina (Stuehr y col., 1991). En contraste con la
LOHA, la Nor-LOHA no es ni un sustrato ni un inhibidor de la iNOS (Moali y col., 1998;
Tenu y col. 1999).
En estas condiciones, nuestros datos se pueden interpretar destacando que sólo el
metabolismo de la L-arginina a través de la arginasa está implicado en el efecto inhibidor
o antiparasitario de este producto. Como se puede comprobar en los resultados, la NorLOHA fue capaz de inhibir todo el crecimiento alcanzado en presencia de IL-4, IL-10 y
TGF-β, además de ser efectiva en la reducción del crecimiento de los parásitos en células
control infectadas, debido al hecho de que Leishmania posee actividad arginasa (Camargo
y col., 1978). Por otra parte, tampoco produjo ningún incremento de NO en los
sobrenadantes de cultivo, demostrando que la inhibición de la arginasa del hospedador es
suficiente para revertir el crecimiento alcanzado en presencia de estas citoquinas Th2. De
esta forma, los resultados volvieron a mostrar que la inducción de arginasa I en macrófagos
es necesaria para permitir el crecimiento de las formas amastigote intracelulares de
Leishmania.
Por todo ello, nuestros datos apuntan a que estos inhibidores específicos de la arginasa
podrían resultar una posible alternativa terapéutica para el control de las infecciones
protozoarias. Adicionalmente, el desarrollo de vacunas que mitiguen las respuestas
desequilibradas Th2 y prevengan, por tanto, la inducción de arginasa en los macrófagos,
pueden ayudar en gran medida a impedir la proliferación parasitaria dentro del hospedador.
La conclusión fundamental de nuestros ensayos in vitro es que la activación en el
macrófago de la vía de la arginasa I tiene como consecuencia la generación de un estado de
permisividad a la infección en dicha célula. Ello es debido a que esta ruta metabólica da
lugar a la producción de poliaminas, moléculas imprescindibles para el crecimiento de
Leishmania, que son utilizadas por el parásito para su proliferación y posterior
diseminación dentro del hospedador (Fig. 1).
156
DISCUSIÓN
L-ARGININA
Th1
Th2
IL-1
TNF-α
IFN-γ
IL-12
IL-18
IL-4
IL-10
IL-13
TGF-β
iNOS
LOHA
Citrulina + NO
M1
CITOTOXICIDAD
INHIBICIÓN
ARGINASA I
L-Ornitina + urea
POLIAMINAS
M2
PROLIFERACIÓN
Figura 1: Implicaciones del metabolismo de la L-arginina en macrófagos. Consecuencias de la
inducción de las enzimas iNOS y arginasa sobre la proliferación intracelular de
Leishmania.
157
DISCUSIÓN
5.2. ESTUDIOS IN VIVO
El estudio del papel que la arginasa desempeña en la infección por Leishmania in vitro
fue completado con una serie de ensayos in vivo llevados a cabo mediante un análisis
comparativo en las cepas murinas BALB/c y C57BL/6, atendiendo al desarrollo lesional,
anatomopatológico e inmunitario de ambas, para finalmente correlacionar todos los datos
con los niveles de inducción de la arginasa a lo largo de la infección y demostrar así la
implicación de esta enzima en la evolución de la leishmaniosis murina por L. major.
Los resultados obtenidos en este modelo ratón-Leishmania major han puesto de
manifiesto nuevos datos sobre esta enfermedad, y sobre los mecanismos inmunológicos
que intervienen en la progresión y control de la infección.
5.2.1. Análisis de los signos clínicos y de las lesiones anatomopatológicas
La relación entre el sistema inmunitario y evolución de la infección en leishmaniosis
está bien estudiada en el modelo experimental murino (Solbach, 1995). En la infección
experimental por L. major, la evolución de la leishmaniosis cutánea depende del balance
de los linfocitos T CD4+. De esta forma, la respuesta Th1, predominante en ratones
resistentes C57BL/6, corresponde a una lesión localizada, benigna y que se resuelve
espontáneamente; la respuesta Th2, mayoritaria en ratones susceptibles BALB/c, implica
una lesion severa, extensa y que no cura de forma espontánea.
En concordancia con los estudios previos realizados por numerosos autores, en nuestros
ensayos pudimos comprobar grandes diferencias en cuanto a la progresión de las lesiones
en ambas cepas. Así, en los ratones sensibles, el tamaño de la lesión plantar aumentó hasta
prácticamente el final de la experiencia, conllevando la aparición, a partir de la cuarta
semana, de úlceras cutáneas y necrosis. En los ratones C57BL/6, la inflamación alcanzó
niveles bastante menores, comenzando a descender a partir del día 30 hasta presentar un
aspecto normal al final del ensayo.
158
DISCUSIÓN
A nivel histológico, los estudios en diferentes momentos de la patocronia determinaron
la existencia de dos fases claramente diferenciadas durante la infección por L. major en la
cepa murina sensible. En el primer periodo, que comprende hasta la cuarta semana postinfección, aparece una masiva infiltración celular, acompañada de multiplicación
parasitaria en el interior de macrófagos. En la segunda fase, que empieza a ser visible
alrededor del día 30, se observa una destrucción masiva de parásitos y de los tejidos
infectados, debido a un intenso fenómeno de necrosis dérmica que limita la progresión de
la lesión.
Leishmania major en el hombre es el causante de la leishmaniosis cutánea del Viejo
Mundo, desarrollándose su ciclo en ambientes rurales. Las lesiones únicas o múltiples,
dependiendo del número de picaduras, presentan una evolución muy constante y similar a
la que se desarrolla en el modelo ratón: una primera fase inflamatoria aguda durante las
primeras cuatro-seis semanas, apareciendo posteriormente una costra superficial que
precede a la ulceración de la piel y necrosis hasta su curación espontánea.
Los resultados obtenidos a través de la reproducción experimental realizada en las dos
cepas de ratón, han mostrado claramente la similitud lesional con la leishmaniosis humana
y reproductibilidad de la leishmaniosis cutánea en BALB/c. Así, en este fenotipo murino
se observan, a raíz de la primoinfección, macroscópica e histológicamente las dos fases
inflamatorias de la piel descritas en nuestros resultados, las cuales han sido analizadas y
comparadas con el resto de parámetros estudiados durante el curso de la enfermedad.
En los ratones con base genética resistente, por el contrario, la primoinfección nunca
llega progresar de forma tan intensa, apareciendo una ligera elevación eritematosa de la
piel, que oculta un proceso de necrosis de presentación más precoz y sólo apreciable
microcópicamente.
159
DISCUSIÓN
5.2.2. Evolución de la respuesta inmune humoral
El análisis de la respuesta inmune humoral en ratones susceptibles y resistentes nos
aportó datos bastante novedosos acerca del comportamiento -claramente diferente- de
ambas cepas cuando su sistema inmune se activa para hacer frente a la infección por el
parásito.
El primer dato sorprendente con el que nos encontramos fue, al determinar la cinética de
las subclases de anticuerpos frente a PT a lo largo de la infección, que los ratones
susceptibles desarrollaron una respuesta muy elevada y de tipo dicotómico a partir de la
segunda semana de infección y hasta el final de la experiencia, alcanzando los sueros unos
niveles de reactividad superiores a 1/12.800. Por el contrario, la respuesta en ratones
resistentes a L. major fue prácticamente exclusiva de la subclase IgG2a, y con niveles de
anticuerpos sólo se detectables hasta diluciones del suero de 1/200.
Así, los datos demuestran que la dominancia de la respuesta Th2 propia de BALB/c
determina niveles de anticuerpos cien veces mayores que en C57BL/6, y equiparables a la
de cualquier forma de leishmaniosis, y que la inducción de una respuesta inmune
hipereactiva en esta primera fase de la infección es la causante de la incapacidad de un
correcto control y lisis de las formas amastigote de Leishmania.
Nuestros hallazgoss difieren en parte a los encontrados por otros autores para el modelo
ratón/ L. infantum (Honoré y col., 1998). Ellos detectan anticuerpos específicos anti-PT a
partir de día 22 post-infección tanto en BALB/c como en C57BL/6. En la cepa sensible, y
en concordancia con nuestro hallazgos para L. major, observan claramente la presencia del
isotipo IgG1, pero no son capaces de detectar Ac de la subclase IgG2a, es decir, en
BALB/c sólo observan una respuesta de tipo Th2. En el caso de los ratones C57BL/6, la
respuesta que observan es dicotómica, detectando anticuerpos tanto IgG1 como IgG2a, a
diferencia de lo encontrado en nuestros ensayos para la infección con la especie L. major.
Recientemente, otros autores como Gonzalo y col. (2001) han llevado a cabo estudios
en los que analizan la respuesta humoral frente a L. major, observando, a las 7 semanas
160
DISCUSIÓN
post-infección, una respuesta dicotómica con niveles de IgG1 que doblan a los de IgG2a, si
bien las densidades ópticas obtenidas son bajas en comparación con nuestros datos, debido
a la mayor dilución del suero utilizada por estos autores en la estandarización de la técnica
ELISA.
En consonancia con nuestros resultados, otros trabajos, como el publicado por Stacey y
Blackwell en 1999, reportan la existencia de una respuesta dicotómica frente al Antígeno
Soluble de Leishmania (SLA) en BALB/c, a partir de las dos semanas y media después de
la infección. En este caso, la respuesta de tipo IgG1 fue claramente superior a la detectada
para la IgG2a.
En lo referente al título de anticuerpos observado en nuestros ensayos para ambas cepas,
hemos de apuntar que, hasta la fecha, no hemos encontrado ningún estudio que analice en
profundidad la carga de anticuerpos específica en ratones C57BL/6. En BALB/c, autores
como Satoskar y col. (1999) observan títulos de anticuerpos superiores a 1/10.000 para
ambas subclases al día 60 post-infección, apoyando nuestros datos y corroborando la idea
de que la respuesta frente a L. major siempre es hipereactiva en los hospedadores
susceptibles (padecedores de la enfermedad), en contraposición a la respuesta más
moderada y específica que aparece en individuos resistentes (como es el caso de los
ratones C57BL/6). Esta hipótesis contrasta claramente con la clásica afirmación, mantenida
desde los primeros estudios sobre la enfermedad, de que las formas cutáneas de
leishmaniosis cursan con títulos de anticuerpos séricos normalmente bajos (Howard, 1985;
Liew y O´Donell, 1993). En base a nuestros hallazgos, apoyamos la idea de que la
aparición de seropositividad en especies susceptibles infectadas también puede depender
del factor tamaño/peso del sujeto.
Relacionando estos datos con los obtenidos de la evolución lesional en ambas cepas de
ratón, comprobamos cómo en resistentes C57BL/6, Leishmania major, a pesar de infectar
macrófagos, no consigue a través de sus mecanismos de evasión y resistencia multiplicarse
como en los ratones sensibles. Tampoco induce la respuesta Th2 desorbitada y
161
DISCUSIÓN
desequilibrante propia de los BALB/c. Es decir, la multiplicación parasitaria e inflamación
vienen acompañadas de niveles de anticuerpos de 1/10.000 en sujetos susceptibles, frente
débiles inflamaciones y restringida respuesta humoral en resistentes.
Este análisis cuantitativo de las IgGs entre estirpes de ratón, sólo aportó información
relativa de las diferencias de magnitudes de respuesta a lo largo del tiempo frente a los
antígenos totales del parásito. La aplicación mediante la técnica ELISA de otros antígenos
de Leishmania, reflejó nuevos datos a tener en cuenta sobre la respuesta inmune que se
genera en los estados de susceptibilidad y resistencia frente al desarrollo de la infección.
En lo referente a la respuesta frente al antígeno recombinante KMP11, hay que
puntualizar que sólo se detectó en ratones BALB/c, y únicamente de la subclase IgG1. Su
cinética mostró una apariencia de meseta, en la cual la subida se produjo a partir del día 21,
manteniéndose los niveles elevados hasta el día 36 post-infección y descendiendo de forma
drástica a partir de ese momento, hasta hacerse negativos a los 42 d.p.i.
Ciertos estudios han señalado que algunos antígenos de Leishmania dirigen la respuesta
hacia el tipo Th2 en ratones susceptibles (Scott y col., 1988). En este sentido, la respuesta
Th2 frente a antígenos de membrana parece ser un mecanismo de evasión momentáneo
pero decisivo, que permite la multiplicación parasitaria en el interior de macrófagos
inactivados durante la fase de invasión de la leishmaniosis. Los antígenos de superficie
como KMP11, LPG o Gp63 inducen este tipo de respuesta en ratones susceptibles.
Así, nuestro razonamiento se basa en que la presencia de anticuerpos anti-KMP11
coincide con una primera fase proliferativa en las áreas infectadas, que se caracteriza por
una multiplicación masiva de los parásitos en el tejido y un amplio reconocimiento de los
antígenos de superficie por parte del sistema inmune del hospedador. A partir de los 28
d.p.i., las lesiones comienzan a presentar focos de necrosis y lisis, tanto tisular como de las
formas amastigote, descendiendo drásticamente el grado de parasitación y con él la
respuesta frente a antígenos de membrana como la proteína KMP11. Estos fenómenos
162
DISCUSIÓN
están siendo la antesala de una segunda respuesta humoral, más tardía, frente a las
proteínas internas de Leishmania, como son los determinantes antigénicos presentes en la
PQ.
Según estudios llevados a cabo por Nieto y colaboradores (1999) en el modelo canino,
la proteína de superficie KMP11 desarrolla un respuesta de anticuerpos de forma muy
precoz (a las pocas semanas de producirse la infección), existiendo casos de
seroconversión en animales que controlan la multiplicación de Leishmania y que no
desarrollan la enfermedad. Este último dato parece estar en consonancia con nuestro
hallazgo de la nula presencia de respuesta anti-KMP11 en los sueros de ratones resistentes
C57BL/6, que controlan eficazmente la replicación parasitaria y el progreso subsiguiente
de la infección .
Así, la imposibilidad de Leishmania para engañar, evadir y resistir a la respuesta
inmunitaria generada en ratones resistentes es una constante, siendo en ellos la expresión
de este antígeno de membrana mínima, por lo que no se han detectado anticuerpos antiKMP11 en nuestros análisis.
El interés del uso de este antígeno se debe a que es uno de los componentes
mayoritarios de la membrana celular de Leishmania, y que junto a otros como el
lipofosfoglicano, con el que se encuentra muy relacionado, o la Gp63, juegan un papel
muy importante en el desarrollo de los mecanismos de evasión y resistencia frente al
sistema inmune (Spath y col., 2000; Joshi y col., 2002).
En nuestro caso parece existir una total correlación entre multiplicación de amastigotes
y respuesta anti-KMP11 durante el primer periodo de la infección, ya que como hemos
descrito en el apartado de resultados, este tipo de respuesta no es estable y tiende a
desaparecer a lo largo del tiempo. Su descenso coincide con la necrosis tisular subsiguiente
y la aparición de una nueva respuesta inmune hasta ese momento no detectada, y que se
dirige contra proteínas internas de los parásitos, como son los determinantes antigénicos de
la PQ, que a continuación comentamos.
163
DISCUSIÓN
El uso de la proteína recombinante de 38 KD multicomponente Quimera o PQ (Soto
y col., 1989) permitió analizar la respuesta humoral durante la infección, pero con
importantes diferencias entre ambas cepas y respecto a los resultados obtenidos al emplear
otros antígenos. Los ratones susceptibles desarrollaron una fuerte respuesta IgG1 e IgG2a
anti-PQ, aunque con una cinética de aparición diferente a la observada contra PT: es más
tardía, ya que comienza a detectarse a partir de los 28 d.p.i., y también más restringida, ya
que el límite de seropositividad se estableció a una dilución del suero de 1/200. La
aparición de la respuesta anti-PQ en BALB/c coincide con el descenso y desaparición de
anticuerpos anti-KMP11 y con el inicio de la fase lítica o necrótica de las lesiones, que es
la que favorece la presentación de antígenos del parásito y su reconocimiento por el
sistema inmune. Así, el reconocimiento de estos antígenos internos (nucleosomales y
ribosomales) parece asociarse a un estado de citotoxicidad tardío que consigue la
destrucción masiva de parásitos y de los tejidos infectados.
En los ratones C57BL/6, los niveles de anticuerpos anti-PQ permanecieron en todo
momento por debajo del umbral de positividad a las diluciones de suero utilizadas, si bien
pensamos que esta respuesta frente a antígenos internos, aunque difícilmente detectable por
su menor magnitud, también debería estar presente en esta cepa murina.
Estos resultados ponen de manifiesto la utilidad de la PQ como marcador
immunológico de diagnóstico y de valor pronóstico, por cuanto permite la detección de
seropositividad en infección por L. major (equiparable a la de otros antígenos) pero
únicamente en ratones en los que progresa la infección y desarrollan la enfermedad.
Hay que añadir, en concordancia con nuestros datos, que este antígeno recombinante ya
ha sido mostrado como una molécula muy específica y apropiada para el serodiagnóstico
de la leishmaniosis visceral canina (Soto y col., 1996b), fundamentalmente dirigida al
diagnóstico de la patología inducida por la infección. Asimismo, estudios recientes de Soto
y col. (2002) en los modelos experimentales ratón y hámster frente a la especie L.
164
DISCUSIÓN
infantum, corroboran la afirmación de que esta proteína es un excelente marcador del
estado patológico en leishmaniosis. En ellos se observó que la reactividad contra la
proteína Q en ratones BALB/c (que no resisten de forma total la infección, aunque sí la
controlan sin desarrollar la enfermedad) es muy tardía, y de muy baja intensidad en
comparación con la alta reactividad frente a PT. Los hámsters, animales susceptibles que
no resisten ni la infección ni la enfermedad, presentan, por el contrario, unos niveles muy
elevados de reactividad frente a PQ a las pocas semanas de infección, antes incluso de
manifestar los primeros síntomas. La confirmación final de que la reactividad frente a la
PQ sólo se presenta en estados asociados a enfermedad, es el hecho de que cuando
hámsters y ratones se retan con una cepa de Leishmania no infectiva, sus sueros no
reaccionan frente a la PQ, a pesar de que lo hacen de forma muy elevada frente a PT (Soto
y col., 2002).
Resulta, por lo tanto, sumamente interesante la evidencia de que el uso individual de
diferentes antígenos de Leishmania, permite un mejor análisis cronológico de las
respuestas inmunes desarrolladas y de sus consecuencias en cuanto al grado de
susceptibilidad y resistencia de los individuos infectados.
Los análisis de la respuesta de base celular y de la inducción de arginasa, han permitido
también una descripción más pormenorizada de este modelo de experimentación
clásicamente utilizado para la leishmaniosis cutánea, y el conocimiento de los mecanismos
defensivos puestos en marcha en los hospedadores infectados.
165
DISCUSIÓN
5.2.3. Influencia de IL-4 e IL-12 en la progresión de la enfermedad
El análisis de la respuesta celular mediante la detección de citoquinas en suero nos
ofreció una información complementaria muy útil para contrastar los hallazgos obtenidos
en el análisis de la respuesta humoral y en concordancia con la evolución de la infección.
Según autores como Locksley y col. (1999), es muy probable que la susceptibilidad
genética a L. major se origine por el reconocimiento aberrante de epítopos del parásito y la
generación de CD4+ Th2, de tal manera que la IL-4 llega a ser tan abundante que induce la
pérdida de IL-12. De esta forma, la predisposición genética para la susceptibilidad o
resistencia a la infección por L. major se correlaciona con la dominancia de una respuesta
Th2 dirigida por IL-4 que causa enfermedad, o una respuesta dominante Th1 dirigida por
IFN-γ que promueve curación y supresión de los parásitos, respectivamente.
Según nuestros datos, la respuesta de IL-4 es detectable en suero de forma bastante
precoz en ambas cepas BALB/c y C57BL/6. Este hecho está en concordancia con el dato,
ya apuntado por varios autores (Morris y col., 1992; Reiner y col., 1994; Belkaid y col.,
2000) de que la respuesta temprana de IL-4 es detectable tanto en ratones sensibles como
en resistentes, si bien en estos últimos aparece de forma transitoria.
La cinética observada en suero fue similar o paralela en ambas cepas, pero de mucha
menor cuantía en ratones resistentes, los cuales en ningún momento presentan una fuerte
inducción Th2 primaria como en el caso de los BALB/c. En general, apareció un pico de
inducción desde el día 2 post-infección, que alcanzó su máximo a los 7 d.p.i. en el caso de
los C57BL/6 y a los 14 d.p.i. para los BALB/c (siendo la concentración en este punto
máximo casi cuatro veces superior que la observada en ratones resistentes). Tras un
descenso brusco en los niveles séricos, que precede a la disminución paulatina de los
niveles de anticuerpos frente al antígeno de membrana KMP-11, a partir del 21 d.p.i. se
aprecia una subida progresiva de la concentración en ambas cepas murinas, siendo en todo
momento mayor para los BALB/c.
Se sabe que una de las funciones llevadas a cabo por la IL-4 es la activación de
166
DISCUSIÓN
linfocitos B para la producción de anticuerpos. Así, podemos llegar a concluir que los dos
picos de IL-4 en la cepa murina sensible van a ser determinantes para mediar los dos tipos
de respuesta humoral que, a lo largo de la infección , hemos comprobado que se producen:
•
Primero una respuesta frente a los antígenos de membrana del parásito como la
proteina recombinante KMP-11, que comienza a partir de la segunda semana postinfección, y que coincide con la fase de proliferación o invasión parasitaria.
•
Finalmente una segunda respuesta, más tardía, que se empieza a detectar alrededor
del día 30 post-infección, que coincide con la fase lítica o de necrosis, y que va
dirigida frente a los antígenos internos del parásito (en concreto, los determinantes
antigénicos de la PQ), desarrollándose y manteniéndose hasta el final de nuestros
ensayos.
Por otra parte, la cinética obtenida para los C57BL/6, en la que la IL-4 se mantiene
dentro de unos niveles moderados o bajos (según punto de la infección que analicemos),
concuerda a la perfección con los resultados obtenidos en el análisis de la respuesta
humoral. De esta manera, los niveles de anticuerpos en esta cepa son menos detectables
tanto cuantitativa como cualitativamente, implicando, por tanto, una activación menor y
más selectiva de las células B debida a una producción más restringida de IL-4, tal y como
apuntaban Locksley y colaboradores en 1999.
La otra citoquina analizada en nuestro estudio, la IL-12, mostró niveles oscilantes a lo
largo de toda la infección, siendo determinante el hecho de que a partir de los 28 d.p.i., y
superponiéndose al segundo pico de IL-4, los niveles de IL-12 caen en picado en los
BALB/c, mientras que se mantienen en los C57BL/6.
Según lo descrito por otros autores como Heinzel y col. (1995), la producción de IL-12
a lo largo de la infección por L. major se retrasa normalmente hasta el día 7 post-infección,
tanto en la cepa sensible como en la resistente. Este dato puede compararse con lo
observado en la cinética de esta citoquina en suero, donde ambas cepas parten de unos
167
DISCUSIÓN
valores basales al día 7 post-infección, los cuales suben progresivamente hasta alcanzar un
pico cercano a los 3000 pg/ml, de forma algo más tardía en los ratones BALB/c (30 d.p.i.)
que en C57BL/6 (21 d.p.i.).
Es un hallazgo significativo que los ratones sensibles mantengan unos niveles elevados
de esta citoquina detectables en suero, ya que se ha establecido que la susceptibilidad de
estos ratones está basada en una respuesta defectiva en IL-12 que resulta ineficaz para
redirigir la respuesta temprana Th2 hacia Th1. Sin embargo, es posible que esta falta de
efecto de la IL-12 se deba, según lo reportado por Hondowicz y col. (2000), a una
inestabilidad en la expresión del receptor de cadena β2 de esta citoquina (IL-12Rβ2), y no
a una falta de producción de la misma, o a la abundancia de IL-4 como describen Locksley
y colaboradores (1999).
En cualquier caso, nuestros datos demuestran que los niveles de IL-12 son detectables
en C57BL/6 hasta los 42 d.p.i, mientras que en los BALB/c la concentración desciende
bruscamente a partir del día 28 post-infección.
La funcion fundamental de la IL-12 es dirigir la respuesta inmune hacia Th1 (Trinchieri,
1993), por una parte activando a los linfocitos T y a las células NK para la producción de
IFN-γ (D´Andrea y col., 1992) y por otra estimulando a los linfocitos B para la generación
de anticuerpos de las subclases IgG2a, IgG2b e IgG3 (Germann y col., 1995). En base a
esto, parece razonable la idea de que los ratones C57BL/6, con un fenotipo predominante
Th1- que se refleja en una respuesta de anticuerpos de tipo IgG2a- mantengan a lo largo de
la infección unos niveles altos de esta citoquina, con la consecuente producción de IFN-γ y
la eficaz activación celular que conduce al control de la enfermedad.
168
DISCUSIÓN
5.2.4. Análisis de la inducción de la arginasa en las lesiones
Al llevar a cabo el estudio de la activación de la enzima arginasa a lo largo de la
infección en las dos cepas, observamos su inducción desde los 14 d.p.i., tanto por medida
directa en homogeneizado del tejido como en las preparaciones inmunohistoquímicas.
La inducción se mantiene a lo largo de toda la infección en los BALB/c, que tienen un
máximo de actividad específica a partir del día 28 post-infección, coincidiendo con los
datos inmunohistoquímicos. En los C57BL/6, por el contrario, los niveles de la enzima
decrecen de forma drástica a partir de los 28 d.p.i., comprobándose también que la
inmunotinción del tejido pasa de ser moderada a escasa a los 42 y 47 días post-infección.
Esta inducción de arginasa está perfectamente respaldada en los ratones sensibles
BALB/c por una producción muy elevada de IL-4, que como ya ha sido descrito
previamente, es la molécula que activa más eficazmente a la enzima (Corraliza y col.,
1995). Sin embargo, tampoco descartamos su posible coindución por otras citoquinas Th2
inducidas en esta cepa a lo largo de la infección por Leishmania.
Hay que resaltar que la actividad arginasa está íntimamente ligada al crecimiento celular
y producción de colágeno, siendo ambas actividades parámetros clave en la generación de
respuestas inflamatorias. Se sabe que los macrófagos desempeñan un papel fundamental en
la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas. En este sentido, cabe señalar que
ciertos estudios en el modelo murino (Rutchman y col., 2001) concluyen que, dependiendo
de la respuesta inflamatoria específica en cuestión, el exceso de activación de arginasa I o
iNOS puede ser tanto protectora como destructiva para los tejidos. En base a ello, se ha
establecido la hipótesis de que el control de la actividad arginasa mediante la inducción de
las citoquinas Th2 podría servir para regular el potencial de destrucción tisular de la
producción excesiva de NO (Chang y col., 1998).
Concordando con nuestros datos, recientemente estan apareciendo trabajos en los que se
demuestra que la inducción de la arginasa puede también favorecer la supervivencia de
otros patógenos, limitando la capacidad de los macrófagos infectados para destruir a dichos
169
DISCUSIÓN
organismos (Gobert y col., 2000).
Se sabe que los parásitos han elaborado una gran variedad de estrategias para invadir el
hospedador y escapar de la respuesta inmune. Basándose en nuestros resultados, los
últimos estudios coinciden en proponer un mecanismo común mediante el cual los
diferentes parásitos escapan de la toxicidad del NO y sus derivados, a los cuales ciertas
especies son altamente sensibles (Mossalayi y col., 1999; Bodgan y col., 2000). Este
mecanismo consiste en la activación de arginasa del macrófago, modulada por el agente
patógeno, la cual conduce a una depleción de L-arginina (sustrato de la iNOS, resultando
en niveles más bajos de NO citotóxico) y una producción incrementada de poliaminas
(necesarias para el crecimiento y diferenciación de los parásitos).
Las arginasas, que constituyen una familia primordial de enzimas, están altamente
conservadas en todos los reinos. Se ha comprobado su presencia, por ejemplo, en parásitos
como Leishmania y Trypanosoma (Camargo y col., 1978) aunque no se ha podido
demostrar en otros protozoos como Sarcocystis (Gupta y col., 1993). La actividad arginasa
de los patógenos interfiere y compite en las rutas de la L-arginina del hospedador. De esta
manera, la arginasa de Helicobacter pylori inhibe la producción de NO por las células
eucariotas (Gobert y col., 2001).
En este sentido, autores como Abdallahi y colaboradores (2001) han comprobado
recientemente el papel de la enzima arginasa durante la infección por el helminto
Schistosoma mansoni en el modelo murino, observando la inducción de esta enzima (junto
con una ausencia de expresión de la iNOS) en macrófagos peritoneales de ratones
infectados con el parásito, asociándose esta actividad con un incremento en diez veces de
la concentración de las poliaminas circulantes.
Haciendo referencia a otras enfermedades parasitarias, hay que apuntar que las
poliaminas derivadas de
la actividad arginasa son esenciales para el crecimiento y
diferenciación de todos los tripanosomátidos; tanto es así, que la inhibición de su síntesis
es un arma terapéutica establecida para el tratamiento de las enfermedades que estos
170
DISCUSIÓN
protozoos provocan (Van Voorhis, 1990). En un reciente estudio que se refiere a la
regulación de la inducción de la arginasa in vivo en tripanosomosis experimental, se
demuestra que la muerte de Trypanososma brucei por inducción de iNOS es restaurada por
la inducción temprana de arginasa, que compite con la NOS por la disponibilidad de
sustrato (Gobert, 2000). Asimismo, por otra parte, y acorde con lo afirmado por Fairlamb y
Cerami en 1992, el giro en el metabolismo de L-arginina hacia L-ornitina ofrece ventajas
adicionales a los tripanosomas porque conduce, a través de la enzima ODC, hacia la
síntesis de poliaminas, además de tripanotiona (el equivalente al glutation en mamíferos,
esencial en el mantenimiento del sistema redox intracelular y una defensa contra el stress
oxidativo producido por peróxido y radicales libres). Comparada con la ODC de los
mamíferos, la ODC de los tripanosomátidos tiene un turnover bajo y constituye una diana
potencial (Ghoda y col, 1990). La ODC y el aumento de poliaminas son regulados
negativamente por el NO; por lo tanto, es una razón adicional para que el parásito inhiba la
producción temprana de NO (Satriano y col., 1999).
Asimismo, en el caso de Trypanososma cruzi, está ampliamente comprobado que la
presencia de poliaminas favorece del crecimiento del parásito (Piacenza y col., 2001).
Recientemente se ha demostrado también que la cruzipaína, un antígeno de esta especie,
induce una respuesta Th2 y estimula la activación de la ruta metabólica de la arginasa en el
macrófago, junto con una disminución de la producción de NO en el mismo (Giordanengo
y col., 2002). De esta forma, en la Enfermedad de Chagas, la inducción de la vía de la
arginasa puede ser usada por T.cruzi para proliferar dentro del hospedador (Giordanengo y
col., 2002).
En concordancia con estos estudios, la inducción de la arginasa observada en nuestros
ensayos tendría un efecto estimulador del crecimiento de los parasitos en el tejido,
favoreciendo su replicación mediante la producción de poliaminas. En los ratones
resistentes C57BL/6, y de acuerdo con esto, los niveles de la enzima son menores que en
los BALB/c, y además descienden bruscamente a partir de los 28 d.p.i, coincidiendo con
171
DISCUSIÓN
la regresión de las alteraciones macroscópicas e histológicas y concomitantemente al
control de la infección parasitaria.
Nuestros resultados también se apoyan en el hecho, ya apuntado por autores como
Mosser y Karp (1999), de que la infección por Leishmania induce en el macrófago la
producción de TGF-β. Esta citoquina tiene la capacidad de estimular a los fibroblastos del
tejido circundante para que sinteticen prolina, precursor del colágeno requerido para la
reparación tisular.
En los ratones C57BL/6, los fenómenos de necrosis son más tempranos y limitados, por
lo que la función de la arginasa en la reparación del tejido tendría sentido sólo durante las
primeras fases, como se demuestra en el análisis de la inducción de la enzima. Por tanto,
junto a resolución de las lesiones y al restablecimiento de la arquitectura tisular normal, los
niveles de arginasa, tras alcanzar su máximo alrededor de los 28 d.p.i., descienden de
forma acusada hasta presentar niveles basales o constitutivos al final de la infección.
De esta manera, podemos concluir que la enzima arginasa I desempeña una función
clave en la permisividad y desarrollo de la infección por Leishmania en el modelo murino,
pudiendo considerarse su inducción como un posible “marcador” de proliferación
parasitaria en leishmaniosis. Asimismo, podemos sugerir que la inducción de la enzima en
la fase final o resolutiva de la infección cutánea, puede presentarse con el objetivo de
apoyar los fenómenos de cicatrización y reparación tisular que aparecen tras necrosis y
desestructuración de los tejidos parasitados.
172
DISCUSIÓN
En base a los datos obtenidos a partir de los ensayos in vivo, podríamos resumir la
evolución conjunta de todos los parámetros analizados en nuestro estudio en la gráfica
representada a continuación (Fig. 2).
Figura 2: Cronología de la leishmaniosis cutánea. Modelo BALB/c- Leishmania major.
173
6. CONCLUSIONES
Ratón de la cepa susceptible BALB/c..
CONCLUSIONES
6- CONCLUSIONES
1.- En macrófagos infectados con Leishmania, la inducción de la arginasa por citoquinas
Th2 dirige el metabolismo de la L-arginina hacia la producción de urea y ornitina. En
estas condiciones se promueve la proliferación intracelular de los parásitos.
2.- La ornitina y la putrescina añadidas a cultivos de macrófagos infectados aumentan la
parasitación intracelular, lo que significa que la ornitina generada por la arginasa está
siendo derivada hacia la síntesis de poliaminas, que son esenciales para la
proliferación de Leishmania.
3.- La inhibición de las arginasas por adición de L-Hidroxi-Arginina tiene un efecto
citotóxico sobre los parásitos, que no es dependiente de la generación de NO y que es
revertido por ornitina, lo cual demuestra que esta enzima es esencial para la
supervivencia intracelular de Leishmania.
4.- En macrofagos activados con IFN+LPS, la destrucción de Leishmania podría ser
dependiente no sólo de la generación de radicales reactivos del nitrógeno, sino de la
inhibición de la arginasa por la generación interna de Hidroxi-Arginina via iNOS.
5.- Las lesiones producidas in vivo a lo largo de la infección fueron muy diferentes en
ambas cepas: en los ratones BALB/c progresan de forma rápida, permitiendo
distinguir dos periodos claramente diferenciados: uno proliferativo, con intensa
infiltración celular y aumento de la parasitación del tejido, y otro resolutivo, a partir de
la cuarta semana, con desectructuración de la arquitectura tisular por necrosis que
acompaña a la lisis parasitaria. Por el contrario, los C57BL/6 muestran una
177
CONCLUSIONES
inflamación muy leve y finalmente resolutiva, siendo el proceso histopatológico
similar al detectado en BALB/c pero más precoz y cuantitativamente muy inferior.
6.- La magnitud de la respuesta inmune mediada por anticuerpos frente al antígeno total de
Leishmania en la cepa murina sensible, es aproximadamente 100 veces mayor que en la
resistente, siendo en ésta casi exclusiva de la subclase IgG2a. La respuesta de
anticuerpos frente al antígeno de membrana KMP11 se produce sólo en ratones
sensibles y en las primeras fases de la infección, desapareciendo bruscamente durante la
fase de necrosis tisular. Los anticuerpos anti-PQ se detectan exclusivamente en ratones
susceptibles BALB/c, coincidiendo con la aparición de los fenómenos de lisis y necrosis
del tejido inflamado.
7.- Los resultados obtenidos en la infección experimental por L. major en ratones
susceptibles y resistentes confirman la función de la arginasa I en el desarrollo de la
enfermedad, ya que la inducción de esta enzima dirigida fundamentalmente por IL-4 se
correlaciona con la severidad de las lesiones a lo largo del tiempo, disminuyendo
drásticamente en los ratones resistentes cuando estos resuelven la infección.
178
7.
RESUMEN
7.
Macrófagos infectados con L. major.
RESUMEN
7.-RESUMEN
En el presente trabajo se ha pretendido realizar un estudio en profundidad de la función
de la enzima arginasa en el modelo experimental Leishmania-ratón. Para ello hemos
utilizado dos cepas murinas que representan el paradigma de susceptibilidad (BALB/c) y
resistencia (C57BL/6) al desarrollo de la infección por estos parásitos.
Basándonos en este objetivo fundamental, en primer lugar se llevaron a cabo una serie
de estudios in vitro, en macrófagos diferenciados de la médula ósea y procedentes de
ratones de ambas cepas. Una vez maduros, los macrófagos fueron sometidos a diferentes
estados de activación mediante citoquinas de tipo Th1 y Th2, al objeto de dirigir de forma
diferencial el metabolismo del aminoácido L-arginina hacia la inducción de la iNOS o
arginasa, respectivamente.
Los datos mostraron que de forma constitutiva, los macrófagos BALB/c presentan unos
mayores niveles de expresión de arginasa que los C57BL/6, los cuales, por el contrario,
produjeron mayor cantidad de nitritos por activación de la iNOS. Estos resultados se
correlacionan con una mayor permisividad a la infección en la cepa susceptible que en la
resistente en todos los ensayos.
Cuando los macrófagos fueron activados con citoquinas tipo Th2, inductoras de
arginasa, y posteriormente infectadas tanto con L. major como L. infantum, ambas cepas
respondieron con un alto incremento de la proliferación parasitaria de forma dosisdependiente, siendo este aumento proporcional al de la actividad enzimática. De todas las
citoquinas, la IL-4 fue la que proporcionó mayores niveles de inducción de arginasa y de
replicación de los parásitos.
Mediante la técnica inmunológica de Western Blotting se confirmó que la isoforma de
arginasa inducida en macrófagos infectados y tratados con IL-4, IL-10 y TGF- β es la
arginasa I. El análisis semicuantitativo de las bandas reflejó, una vez más, la mayor
eficacia de la IL-4 para la inducción de esta enzima.
Nuestra hipótesis fundamental de que las poliaminas generadas por la actividad arginasa
181
RESUMEN
son la que sostienen y permiten el crecimiento de Leishmania, se vio confirmada por la
adición exógena a los cultivos tanto de ornitina, producto de la reacción de la arginasa,
como de la poliamina putrescina. En ambos casos se observó un incremento de
multiplicación de amastigotes intracelulares, y proporcional a la dosis utilizada.
Los ensayos con el inhibidor específico de la arginasa, la LOHA, resultaron tener un
efecto citotóxico significativo sobre los amastigotes intracelulares. Su acción se apreció
tanto en células activadas con citoquinas Th2, en las cuales fue capaz de revertir casi
totalmente la proliferación parasitaria por la inhibición de la arginasa del macrófago, como
en células control infectadas, explicándose este último dato como un efecto inhibitorio
sobre la enzima del parásito. En este sentido, la presencia de actividad arginasa en
promastigotes de ambas especies de Leishmania, que es capaz de ser inhibida in vitro por
LOHA, ha sido otro de los hallazgos derivados de este estudio.
El último apartado de nuestros ensayos in vitro, consistió en demostrar que la
generación de LOHA endógena vía inducción de la iNOS por citoquinas Th1, es la
responsable, a menos en parte, del descenso de la parasitación celular observada en
presencia de estas moléculas. Los datos mostraron que el efecto citotóxico de LOHA, tanto
añadida exógenamente como producida de forma endógena, fue en todo caso
independiente de la generación de Oxido Nítrico, ya que no se detectó en ningún caso
positividad a la reacción de Griess en los sobrenadantes de cultivo. Además, se comprobó
que el efecto parasiticida producido en presencia de IFN+LPS no se modificó cuando se
“secuestró” el NO del medio con Carboxy-PTIO. Nuestros resultados también permitieron
descartar que el efecto de la LOHA se debiese a una generación de radicales derivados del
superóxido, puesto que la adición de la enzima SOD mostró claramente una ausencia de
efecto en los cultivos.
Los estudios in vivo se realizaron utilizando también ratones BALB/c y como C57BL/6,
e infectando con la especie L. major - causante de una leishmaniosis cutánea- inoculada en
la almohadilla plantar. El objetivo fue desarrollar un completo estudio cronológico para
182
RESUMEN
establecer fielmente los diferentes cambios acontecidos desde la primoinfeccion, tanto a
nivel local como sistémico, y su relación con el metabolismo e implicaciones de la enzima
arginasa en esta parasitosis.
El análisis de las lesiones en cuanto a su desarrollo a lo largo de la infección y su
histopatología nos permitió establecer la evolución normal en cada una de las dos cepas.
Así, en ratones BALB/c, la lesión progresó de forma rápida y paulatina, y terminó
provocando una pérdida de la estructura tisular y resolución por necrosis. Las imágenes
histológicas permitieron distinguir dos periodos claramente diferenciados: uno
proliferativo, caracterizado por dermatitis subepidérmica, infiltración celular cada vez más
intensa y aumento de la parasitación del tejido, y otra fase resolutiva o necrótica, a partir
del día 28-30 post-infección, con dermatitis intradérmica, presencia de un proceso
ulcerativo y necrosis masiva con desectructuración de la arquitectura tisular y lisis
parasitaria.
Por el contrario, los C57BL/6 presentan escasos signos de inflamación, que
prácticamente desaparecen a los 55 días post-infección. El proceso histopatológico fue
similar al detectado en ratones sensibles pero cuantitativamente más leve. Los fenómenos
de necrosis aparecieron de forma controlada y algo más precoz, y a partir del día 28 postinfección comenzó una regresión lesional que condujo a la presencia de escasas
alteraciones al día 42 post-infección.
A lo largo de la infección in vivo también se llevó a cabo el estudio de la inmunidad
humoral en las dos cepas murinas, apareciendo notables diferencias entre ambas en cuanto
a cantidad y calidad de la respuesta de anticuerpos. El análisis se realizó mediante la
técnica inmunoenzimática ELISA para las subclases IgG1 e IgG2a, y frente a tres tipos de
antígenos del parásito: el antígeno total soluble (PT) y las proteínas recombinantes KMP11 y multicomponente Quimera (PQ). Para la proteína total los ratones BALB/c
respondieron de forma precoz (a partir de los 15 d.p.i.) y muy elevada en ambas subclases
de IgG hasta el final de la experiencia, estableciéndose su título de anticuerpos en un nivel
183
RESUMEN
100 veces superior al de la cepa resistente C57BL/6. En estos últimos ratones, la respuesta
fue casi exclusiva de la subclase IgG2a. El uso de la proteína quimera permitió establecer
importantes diferencias entre cepas. La respuesta frente a la PQ sólo se produjo en
BALB/c, y su aparición fue mucho más tardía (a partir de los 28 d.p.i.), coincidiendo con
la fase lítica o de necrosis del tejido observada histológicamente. En C57BL/6 los niveles
de anticuerpos anti-PQ permanecieron en todo momento por debajo del umbral de
positividad a las diluciones de suero analizadas. La respuesta frente al antígeno KMP11 fue
detectable únicamente en BALB/c, siendo exclusiva de la subclase IgG1, y su cinética
coincidió con la fase proliferativa de los parásitos y de masiva infiltración celular (hasta los
28 d.p.i.). Con el comienzo de la necrosis y lisis celular, la respuesta de anticuerpos antiKMP11 decreció bruscamente hasta desaparecer a los 42 d.p.i.
El análisis de la inducción de la arginasa en las patas se realizó por homogeneizado del
tejido
y
medida
de
la
actividad
enzimática,
así
como
mediante
técnicas
inmunohistoquímicas. En BALB/c, la inducción progresiva de la enzima se correlacionó
con la severidad de las lesiones a lo largo del tiempo, mientras que en C57BL/6 disminuyó
progresivamente a medida que se redujeron las alteraciones tisulares.
Las medidas de IL-4 en suero realizadas mediante ELISA, indicaron que las diferencias
entre los niveles de inducción de la arginasa están mediados por una producción sostenida
y aumentada de esta citoquina en los ratones susceptibles frente a los resistentes. La IL-12,
por su parte, mostró niveles oscilantes a lo largo de todo el ensayo, descendiendo
bruscamente su concentración a partir de los 28 d.p.i. en los BALB/c y manteniéndose en
los C57BL/6, en concordancia con su función ya establecida en la protección contra la
infección.
Como conclusión final de este estudio, podemos afirmar que la enzima arginasa I
presente en lo macrófagos desempeña un papel fundamental en la permisividad y
desarrollo de la infección por Leishmania en el modelo murino.
184
8.
SUMMARY
Detalle de un macrófago infectado con L. major.
SUMMARY
8.-SUMMARY
The main aim of the present work have been to analyze the role of the enzyme arginase
I in the experimental mouse model of L. major infection. For this purpose, we have used
the two classical strains of susceptibility (BALB/c) and resistance (C57BL/6) to this
parasite.
In base of this fundamental objective, first of all we performed in vitro studies with
bone-marrow-derived macrophages from both strains. Once maturated, they were
alternatively activated with Th1 or Th2-derived cytokines to drive the L-arginine
metabolism towards the induction of a functional iNOS or arginase I, respectively.
The data presented show that BALB/c macrophages had constitutively higher levels of
arginase that those from C57BL/6. In contrast, cells from resistant mice produced higher
amounts of nitrites by iNOS activation than those from suceptible´s. These data were
consistent with a superior permissively to infection in susceptible versus resistant strains.
When Th2-activated macrophages were infected with L. major or L. infantum
promastigotes, both strains responded in a dose-depended form with a high increase of
parasite proliferation and a proportional arginase activity, being IL-4 the most efficient
inducer of arginase and parasite replication.
We also studied by Western blotting the relative amounts of arginase I protein
expressed in infected macrophages induced by IL-4, IL-10 or TGF-β. The analysis
confirmed that IL-4 was the cytokine which produces the higher levels of enzyme.
The hypothesis that the L-ornithine generation via arginase induction could be used by
Leishmania to growth using the polyamine pathway, was confirmed because exogenous
addition of ornitine or putrescine to infected cultures, produced a dose-dependent increase
in parasite proliferation.
Moreover, when intracellular arginases were inhibited by LOHA, surprisingly we
obseved a cytotoxic effect not only in Th2 activated cells –in which almost reverted the
parasite replication by inhibition of macrophage´s arginase- but also in control infected
187
SUMMARY
cells, due to an inhibition of arginase from parasites. The presence of a functional arginase
efficiently inhibited by LOHA in both Leishmania species, is other of the findings derived
from this study.
As LOHA could be an stable product released, together with nitric oxide and citrulline,
in iNOS-induced cells, we thought that perhaps the killing observed in the presence of a
functional iNOS could be due, not only to the generation of NO, but also to the
endogenous produced LOHA. To probe this, we used also macrophages from iNOS knockout mice. Our results probed that the effect of both exogenous or endogenously-produced
LOHA was independent of NO generation, measured as nitrites, because when we
scavenged the nitric oxide with Carboxy-PTIO, we could not significantly reversed the
killing observed in the presence of IFN+LPS. Our data also discard that the cytotoxic
effect of LOHA was due to the generation of superoxide-derived radicals, because in the
presence of SOD we could not revert the killing of parasite
The In vivo studies were performed also with BALB/c and C57BL/6 mice strains.
Animals were infected with L. major in the footpad, to make a whole chronological study,
in order to establish the different changes showed from the beginning of the infection. We
analyzed local but also systemic parameters, to obtain the higher amount of information
used to compare between the two strains.
The analysis of the lesions during the development of the infection and its
histopathological study allow us to establish the normal evolution in both mice strains.
Thus, in BALB/c animals, lesions progressed rapidly and finally produced a loss of tissular
structure and a necrotic resolution. Histological pictures allowed to distinguish two
different periods: first of all, a period of massive proliferation, with subepidermal
dermatitis, intense cellular infiltrate and increases in tissue parasitation. After that we could
distinguish a second resolutive period, starting approximately from 28 days post-infection,
characterized by intradermal dermatitis, presence of an ulcerative process and massive
necrosis with a loss of tissue structure and parasite lysis.
188
SUMMARY
In contrast, C57BL76 mice although also started with a moderate inflammation, it
almost disappear at day 55 post-infection. The histopathological processes were similar to
the one detected in susceptible mice, but significantly lower. Necrosis appeared before and
were more restricted. Since 28 d.p.i., lesions suffered an important and progressive
regression, that finished with the nearly complete resolution from day 42 post-infection.
During the in vivo infection, the study of humoral immune response in both mice strains
was performed. We could observe notable differences between BALB/c and C57BL/6 with
respect to quantity and quality of antibody response. The analysis was performed by
measurement of the IgG1 and IgG2a suclasses by ELISA, and against three different
parasite antigens: Total Soluble antigen (PT) and recombinant proteins KMP11 and
Multicomponent Chimeric Protein (PQ).
The results with PT revealed that susceptible mice responded early and with very high
levels of both subclasses until the end of the experience. The antibody titers were 100
times higher in BALB/c than in C57BL/6. Moreover, in resistant mice, the response was
almost exclusive of IgG2a subclass.
The use of PQ allowed us to establish important differences between both strains. The
Anti-PQ response was produced exclusively in BALB/c, and appeared late (up to 28 d.p.i.),
together with the lytic or necrotic phase observed by histological analysis. In contrast, the
anti-Q antibody levels in the resistant mice remained always below the cut-off at least in
the sera dilutions analyzed.
The results using KMP11 showed that the response to this antigen was only detectable
in BALB/c, being exclusively of the IgG2a subclass, and its kinetic was coincident with
the proliferative phase of parasite and massive cellular infiltration (until 28 d.p.i.). The
anti-KMP11 antibody levels strongly decreased with the beginning of the lytic phase, and
finally disappeared at 42 d.p.i.
The analysis of arginase induction in footpads was performed in homogenates from the
infected tissue as well as by inmunohistochemical techniques. In BALB/c, the progressive
189
SUMMARY
induction of enzyme was correlative with the severity of lesions along the time, whereas in
C57BL/6 the levels decreased together with the resolution of tissue alterations.
The measurements of IL-4 in sera indicated that the differences between arginase
induction levels are mediated by a sustained and increased production of this cytokine in
susceptible versus resistant mice. On the other hand, the IL-12 levels in sera showed an
oscillation pattern along the time up to day 28, where its concentration significantly
decreased in BALB/c, whereas remained high in C57BL/6. This is coincident with the
second IL-4 increase, and it is in concordance with the well established function of this
cytokine in the protection against Leishmania infection.
The final conclusion of this study is that macrophage´s arginase I have a fundamental
role in the permissively an development of Leishmania infection in the mouse model, and
its induction could be considered as a possible “marker” parasite proliferation that
accompanies the tissue invasion.
190
9. BIBLIOGRAFÍA
Leishmaniosis cutánea. Inmunotinción positiva para la arginasa I.
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234
10.
LISTADO DE
ABREVIATURAS
Cultivo de promastigotes de L. infantum.
LISTADO DE ABREVIATURAS
10.- LISTADO DE ABREVIATURAS
Ac: Anticuerpo
Ag: Antígeno
Carboxy-PTIO: 2-(4-carboxyfenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazol-3-óxido-1-oxil
CCR2: Receptor 2 de las citoquinas
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido Desoxiribonucleico
D.O.: Densidad óptica
D.p.i.: Días post-infección
DTH: Prueba de hipersensibilidad retardada (Test de Montenegro)
ELISA: Técnica inmunoenzimática de dobles anticuerpos
GM-CSF: Factor Estimulador de Colonias Granulocito-Macrofágicas
H&E: tinción Hematoxilina-Eosina
IFN: Interferón
IL: Interleuquina
ISPF: Isonitropropiofenona
iNOS: Óxido Nítrico Sintasa inducible
KDa: Kilodalton
KMP 11: Proteína de 11 KD de la membrana del kinetoplasto de Leishmania
237
LISTADO DE ABREVIATURAS
LACK: Antígeno de Leishmania homólogo al receptor de la Quinasa C
LC: Leishmaniosis Cutánea
LCD: Leishmaniosis Cutánea Difusa
LCL: Leishmaniosis Cutánea Localizada
LMC: Leishmaniosis Mucocutánea
LOHA: L-Hidroxi-Arginina
LPG: Lipofosfoglicano
LPS: Lipopolisacárido
LV: Leishmaniosis Visceral
MAC: Complejo de Ataque a la Membrana
MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad
MTT: Dimetiltiazol difeniltetrazolium bromide
NK: Células Natural Killer
NMMLA: N-Monometil-L-Arginina
NO: Óxido Nítrico
OAT: Ornitina Aminotransferasa
ODC: Ornitina descarboxilasa
OMS: Organización Mundial de la Salud
OPD: O-Phenilendiamina
PBS: Solución Tampón Fosfato
PQ: Proteína multicomponente Quimera
PT: Proteína Total soluble de Leishmania
238
LISTADO DE ABREVIATURAS
RNI: Intermediario reactivo del Nitrógeno
ROI: Intermediario reactivo del Oxígeno
R.p.m.: Revoluciones por minuto
SOD: Superóxido Dismutasa
S.s: Suero sanguíneo
Tc: Linfocitos T citotóxicos
Th: Linfocitos T colaboradores
TGF: Factor Transformador del Crecimiento
TNF: Factor de Necrosis Tumoral
239
11.
INDICE DE TABLAS
Y FIGURAS
Leishmaniosis cutánea. Tricromico de Masson.
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Tabla 1: Clasificación del genero Leishmania (Pag. 13).
Tabla 2: Tropismo habitual de las especies de Leishmania (Pag. 14).
Tabla 3: Principales efectos de las distintas citoquinas sobre la actividad de los
macrófagos (Pag. 29).
Figura 1: Principales destinos metabólicos de la L-arginina y enzimas implicadas (Pag.
42).
Figura 2: Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos (Pag. 47).
MATERIAL Y METODOS
Figuras 1 y 2: Ratones de la cepas consanguíneas BALB/c y C57BL/6 (Pag. 55).
Figura 3: Promastigotes en cultivo (Pag. 56).
Figuras 4 y 5: Cultivo de macrófagos en sacos de teflón (Pag. 66).
Figura 6: Montaje y tinción de portaobjetos para observación microscópica de cultivos de
macrófagos (Pag. 68).
Figura 7: Infección de BALB/c en la almohadilla plantar (Pag. 72).
Figura 8: Medida de la inflamación plantar con calibrador (Pag. 72).
Figuras 9 y 10: Extracción de sangre del seno retroorbitario (Pag. 73).
Figura 11: Frotis de una extremidad infectada (Pag. 73).
Figura 8: Medida de la inflamación plantar con calibrador (Pag. 72).
243
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
RESULTADOS
Tabla 1: Efecto de la Nor-LOHA sobre el crecimiento de parásitos intracelulares en
macrófagos BALB/c, tras 48 h de infección con L. major (Pag. 110).
Tabla 2: Concentración de nitritos en los sobrenadantes de cultivo de macrófagos
activados con IFN+LPS e infectados con L. infantum en presencia de LOHA y
Carboxy-PTIO (Pag. 113).
Tabla 3: Actividad arginasa de promastigotes de Leishmania y efecto inhibidor de la
LOHA sobre la enzima del parásito (Pag. 114).
Tabla 4: Análisis semicuantitativo de la inmunoreacción para la arginasa en almohadilla
plantar de ratones BALB/c y C57BL/6 experimentalmente infectados con
Leishmania major (Pag. 145).
Figura 1: La susceptibilidad/ resistencia a la infección por Leishmania spp. es correlativa
a la inducción de iNOS en macrófagos de ambas cepas (Pag. 87).
Figura 2: Micrografías de macrófagos pertenecientes ambas cepas tras 48 h de infección
con L. infantum (Pag. 88).
Figura 3: Inmunocitoquímica de un cultivo de macrófagos BALB/c pretratados con IFN,
para la detección de la enzima iNOS en su citoplasma (Pag. 88).
Figura 4: La susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania en BALB/c y
C57BL/6 se correlaciona con los diferentes grados de inducción de arginasa por
IL-4, IL-10 y TGF-β (Pag. 90).
Figura 5: Efecto de la concentración de IL-4 sobre la inducción de la arginasa y la
proliferación de Leishmania major en macrófagos BALB/c (Pag. 92).
Figura 6: Micrografías de macrófagos infectados con y sin pretratamiento con IL-4 (Pag.
93).
244
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 7: Efecto de dosis crecientes de IL-10 en macrófagos BALB/c infectados con L.
major (Pag. 94).
Figura 8: Micrografías de macrófagos infectados con L. infantum con y sin pretratamiento
con IL-10 (Pag. 95).
Figura 9: Efecto de la concentración de TGF-β en macrófagos BALB/c infectados con L.
major (Pag. 96).
Figura 10: Micrografias de macrófagos BALB/c y C57BL/6 tras 48 h de infección con L.
major, en ausencia o presencia de TGF-β (Pag. 96).
Figura 11: Western blotting de lisados de cultivos de macrófagos inducidos con citoquinas
Th2 e infectados con L. major durante 48 h (Pag. 97).
Figura 12: Efecto de la adición de cantidades crecientes de ornitina y putrescina sobre
macrófagos C57BL/6 tras 48 h de infección con L. major (Pag. 98).
Figura 13: Micrografías de macrófagos C57BL/6 tras 48 h de infección con L. major en
ausencia o presencia de L-ornitina (Pag. 99).
Figura 14: Número total de amastigotes en macrófagos de las cepas BALB/c y C57BL/6,
activados con distintas citoquinas Th2, en presencia o ausencia de 100 µM de
LOHA e infectados durante 48 h con L. infantum (Pag.101).
Figura 15: La LOHA es capaz de inhibir el crecimiento de los parásitos en dos especies
Leishmania, L. infantum y L. major (Pag. 103).
Figura 16: La LOHA es capaz de inhibir el crecimiento de los parásitos a lo largo del
tiempo (Pag. 104).
Figura 17: Micrografías de macrófagos de ambas cepas, en presencia o ausencia de 100
µM de LOHA (Pag. 105).
Figura 18: Análisis de viabilidad celular a concentraciones crecientes de LOHA por el
método de reducción del MTT (Pag. 106).
Figura 19: La L-ornitina revierte el efecto inhibitorio de la LOHA tanto exógena como
producida endógenamente (Pag. 108).
245
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 20: Efecto de la SOD en la inhibición de parasitaria producida por LOHA
(Pag.109).
Figura 21: La retirada del NO por carboxy-PTIO no modifica la infección celular (Pag.
112).
Figura 22: Desarrollo lesional a lo largo del tiempo en 5 ratones de cada cepa, infectados
con 106 promastigotes en la almohadilla plantar (Pag. 116).
Figura 23: Fotografías de ratones pertenecientes a ambas cepas, tras 50 días de infección
con 106 promastigotes de L. major (Pag. 116).
Figura 24 : Análisis de la respuesta humoral en las cepas murinas BALB/c y C57BL/6
frente Proteina Total soluble, a lo largo de la infección con 106 promastigotes
de L. major en la almohadilla plantar (Pag. 118).
Figura 25: Titulación de anticuerpos en las cepas murinas BALB/c y C57BL/6 frente
Proteina Total soluble, en el día 42 post-infección, y para las dos subclases
IgG1 e IgG2a (Pag 119).
Figura 26: Análisis de la cinética de anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG2a frente a
KMP-11 y para ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6 (Pag. 120).
Figura 27: Cinética de anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG2a en ratones de ambas
cepas BALB/c y C57BL/6 infectados con 106 promastigotes de L. major, al
enfrentar los sueros a la Proteína Quimera (PQ) (Pag. 122).
Figura 28: Niveles de IL-4 en suero a lo largo de la infección con L. major para un pool
de sueros de ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6 (Pag. 124).
Figura 29: Niveles de IL-12 en suero a lo largo de la infección con L. major para un pool
de sueros de ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6 (Pag. 125).
Figura 30: Medida de la actividad arginasa en extremidades sanas e infectadas a distintos
puntos de la infección y para ambas cepas murinas BALB/c y C57BL/6 (Pag.
126).
246
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 31: Lesión plantar en BALB/c, 2 d.p.i. H&E (Pag. 127).
Figura 32: Lesión plantar en BALB/c, 7 d.p.i. H&E (Pag. 128).
Figura 33: Lesión plantar en BALB/c, 14 d.p.i. H&E (Pag. 128).
Figura 34: Lesión plantar en BALB/c, 21 d.p.i. H&E (Pag. 129).
Figura 35: Lesión plantar en BALB/c, 28 d.p.i. H&E (Pag. 130).
Figura 36: Lesión plantar en BALB/c, 42 d.p.i. H&E (Pag. 131).
Figura 37: Lesión plantar en C57BL/6, 2 d.p.i. Tricrómico de Masson (Pag. 132).
Figura 38: Lesión plantar en C57BL/6, 7 d.p.i. Tricrómico de Masson (Pag. 132).
Figura 39: Lesión plantar en C57BL/6, 14 d.p.i. H&E (Pag. 133).
Figura 40: Lesión plantar en C57BL/6, 21 d.p.i. A: H&E. B: T. de Masson (Pag. 133).
Figura 41: Lesión plantar en C57BL/6, 42 d.p.i. A: H&E. B: T. de Masson (Pag. 133).
Figura 42: Lesión plantar en BALB/c, 2 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 135).
Figura 43: Lesión plantar en BALB/c, 7 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 135).
Figura 44: Lesión plantar en BALB/c, 14 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 135).
Figura 45: Lesión plantar en BALB/c, 21 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 136).
Figura 46: Lesión plantar en BALB/c, 28 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 136).
Figura 47: Lesión plantar en BALB/c, 42 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 137).
Figura 48: Lesión plantar en BALB/c, 47 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 137).
247
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 49: Lesión plantar en C57BL/6, 2 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 138).
Figura 50: Lesión plantar en C57BL/6, 7 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 138).
Figura 51: Lesión plantar en C57BL/6, 14 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 139).
Figura 52: Lesión plantar en C57BL/6, 21 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 139).
Figura 53: Lesión plantar C57BL/6, 28 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 139).
Figura 54: Lesión plantar en C57BL/6, 42 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 140).
Figura 55: Lesión plantar en C57BL/6, 47 d.p.i. Inmunohistoquímica para detección de
arginasa I (Pag. 140).
DISCUSIÓN
Figura 1: Implicaciones del metabolismo de la L-arginina en macrófagos. Consecuencias
de la inducción de las enzimas iNOS y arginasa sobre la proliferación
intracelular de Leishmania (Pag. 157).
Figura 2: Cronología de la leishmaniosis cutánea. Modelo BALB/c- Leishmania major
(Pag. 173).
248
12.
PUBLICACIONES
DERIVADAS
DE LA TESIS
Leishmaniosis cutánea. Ausencia de inmunotinción para la arginasa a los 2 d.p.i.
PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS
Una parte de los resultados que aparecen en la presente memoria han sido publicados o
comunicados previamente:
A.-Artículos
1. Iniesta ,V; Gómez-Nieto, C. y Corraliza, I. (2001).
The inhibition of arginase by Nw-Hydroxy-L-Arginine controls the growth of
Leishmania inside macrophages.
Journal of Experimental Medicine, Vol. 193 (6): 777-783.
2. Iniesta, V.; Gómez-Nieto, C.; Molano, I.; Mohedano, A.; Carcelén, J; Mirón, C.;
Alonso, C. y Corraliza I. (2002).
Arginase I induction in macrophages, triggered by the Th2–Type cytokines, support
the growth of intracellular Leishmania parasites.
Parasite Immunology, Vol. 24: 113-118.
B.- Comunicaciones a Congresos
1.- Regulación de la síntesis de arginasa y óxido nítrico sintasa por citoquinas tipo Th1 y
Th2 en macrófagos murinos infectados con Leishmania infantum. (1999). Iniesta, V.;
Gómez-Nieto, L.C. y Corraliza, I. VI Congreso Ibérico de Parasitología, Córdoba
(España), Septiembre de 1999.
2.- The inhibition of arginase by Nw-Hydroxy-L-Arginine controls the growth of
Leishmania inside macrophages (2001). Iniesta, V.; Gómez-Nieto, L.C., Molano, I.,
Carcelén, J., Mirón, C. y Corraliza, I.
II Congreso Mundial de Leishmaniosis
(WORLDLEISH II). Hersonissos (Grecia), Mayo de 2001.
251
PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS
3.- La inducción de la arginasa I mediada por citoquinas promueve la proliferación de
Leishmania major en macrófagos. (2001). Iniesta, V; Molano, I; Mirón C; Carcelén,
J; Gómez-Nieto, C; Corraliza, I. VII Congreso Ibérico de Parasitología. Oporto
(Portugal), Septiembre de 2001.
4.- Modulación de la inducción de la arginasa I en leishmaniosis experimental murina.
Correlación entre los niveles de inducción de la enzima y la susceptibilidad a la
infección. (2003). Corraliza, I.; Iniesta, V.; Molano, I.; Carcelén, J.; Fajardo, A.;
Gómez-Nieto, L.C. XXVI Congreso de la SEBBM, La Coruña (España), Septiembre
de 2003.
5.- Utilización de la proteína Multicomponente Quimera como “marcador” inmunológico
de la susceptibilidad y resistencia para el modelo ratón-Leishmania major. Iniesta, V;
Molano, I.; Carcelén, J.; Fajardo, A.; Corraliza, I.; Alonso, C.; Gómez-Nieto, C. XXVI
Congreso de la SEBBM, La Coruña (España), Septiembre de 2003.
252
13.
AGRADECIMIENTOS
Ratón de la cepa susceptible BALB/c.
AGRADECIMIENTOS
No sé si seré capaz de expresar la enorme gratitud que siento por la cooperación de
todas aquellas personas gracias a las cuales este trabajo es hoy una realidad. Sé que las
frases se quedan siempre cortas, y que las palabras a veces no transmiten todo lo que uno
quisiera manifestar con ellas, pero de todas maneras intentaré que el lenguaje no me limite,
y en todo caso, puedo afirmar que todo lo que aquí voy a escribir me sale directamente del
corazón.
En primer lugar me gustaría dar las gracias a mis compañeros del grupo Leishmania, y
decirles que espero que este trabajo nuestro, pues es de todos nosotros, esté a la altura del
equipo al que estoy tan orgullosa de pertenecer. Quiero que sepáis lo mucho que os
aprecio, y que trabajar con vosotros es lo mejor que me ha podido pasar nunca.
Debo manifestar el más sincero agradecimiento a mis directores de Tesis, a los cuales
admiro profundamente. Ambos han sabido mostrarme lo mejor de la ciencia, cada uno en
su ámbito, y han logrado transmitirme la ilusión por descubrir y la pasión por investigar.
Muchísimas gracias a los dos, por formarme como científica, por orientarme y por
ayudarme a crecer como persona.
Gracias a tí, Inés, por prepararme para ser rigurosa, exigente y autocrítica con mi
trabajo. Te agradezco enormemente que me hayas animado a superarme cada día, que te
hayas volcado siempre en enseñarme tus conocimientos y que hayas sacrificado tanto
tiempo trabajando codo con codo conmigo para que lográsemos nuestro objetivo. Gracias
por tu dinamismo, por guiar mis pasos, y por aportarme tus ideas y tus valiosos puntos de
vista sobre las cosas. Gracias, sobre todo, por haber sido, durante todos estos años,
compañera y amiga además de directora.
Gracias, Carlos, por darme el mejor ejemplo profesional y personal que uno pueda
seguir. Por estar constantemente dispuesto a brindarme parte de tu enorme sabiduría, por tu
entusiasmo contagioso, por tu paciencia, tus consejos, por haber aportado siempre luz a
todas mis dudas científicas. Pero, sobre todo, gracias por tu excepcional generosidad, por
el apoyo incondicional que he recibido de ti día a día, y por todas y cada una de tus
255
AGRADECIMIENTOS
palabras de aliento, que tanto me han animado a seguir adelante hasta en los momentos
más duros.
Mil Gracias, Isabela, en primer lugar por ofrecerme tu amistad, que para mí es el mejor
regalo que he podido recibir de ti. Gracias también por tu compañerismo, por el cariño y
apoyo que me demuestras cada día. He aprendido infinidad de cosas buenas de ti, y espero
que me sigas permitiendo hacerlo, porque para mí es un orgullo tenerte de compañera.
A tí, Jesu, te estaré eternamente agradecida por cada uno de los momentos que has
compartido conmigo. Gracias por todo lo que me has enseñado, que es mucho más de lo
que te imaginas, y por tantas veces que me abriste los ojos y me pusiste los pies sobre la
tierra. Gracias por tu complicidad, por haberme protegido y consolado en los días más
tristes, por saber hacerme sonreír y, sobre todo, por haberme demostrado tu amistad
incondicional siempre y por encima de cualquier cosa.
Alicia, gracias por tu serenidad, por estar siempre dispuesta a ayudarme, por ser tan
encantadora, por hacerme reír a carcajadas cuando las tensiones me tenían agotada, y por
haber sido mi confidente y amiga desde el primer momento .
A Isabel Monroy tengo que agradecerle enormemente su ayuda con la Bibliografía de
esta Tesis, su espíritu trabajador, su alegría. Espero tenerte de compañera por muchos años,
porque eres una persona extraordinaria.
A la Dra. Eva Frontera, a la que admiro en todos los sentidos, tengo que agradecerle no
sólo su ayuda desinteresada y su asesoramiento científico, sino también su amistad.
He de manifestar también mi más sincero agradecimiento a todos los profesores que
integran la unidad de Parasitología. Muy especialmente tengo que darle las gracias a
Ignacio Navarrete, por haber depositado su confianza en mí desde el primer momento, y
por abrirme las puertas de la que hoy es mi segunda casa. Muchas gracias también a
Enrique Pérez, Francisco Serrano, David Reina y Miguel Ángel Habela, por haber
contribuido a mi formación parasitológica y por prestarme su ayuda siempre que la
precisado.
256
AGRADECIMIENTOS
También quiero dar las gracias al técnico especialista D. Manuel Gómez, y a mis
compañeros, el Dr. Javier Sánchez, María, Alonso, Eva López, Ana Grajera, Rafa y Juan
Peña, y a todos los alumnos internos que colaboran en la Unidad de Parasitología, así como
al Prof. Dr. José Luis Domínguez. Muchas gracias a todos por contribuir a que estos años
de mi vida hayan sido tan fructíferos como agradables.
Agradezco enormemente la ayuda brindada por Dª. Pilar Parra y por el Dr. Eloy
Redondo, de la Unidad de Anatomía Patológica, pues su colaboración ha sido
imprescindible en los estudios histológicos de esta Tesis.
He de agradecer también a Juan Luis Rodríguez su ayuda con la iconografía; y a Luis,
del Servicio de Inmunología del Hospital San Pedro de Alcántara, por tener la gentileza de
cederme las muestras de suero humano que precisé para el análisis de las citoquinas.
También estoy muy agradecida a Carlos Fernández de la Unidad de Química, por su
amabilidad e inestimable asesoramiento con los archivos informáticos.
Muy en especial quisiera dar las gracias a todos los investigadores del laboratorio 203
de CBM “Severo Ochoa” de Madrid, por haberme brindado la oportunidad de aprender
tanto de todos ellos. Estoy muy agradecida a los doctores D. Carlos Alonso Bedate, José
María Requena, Manuel Soto, Juan Manuel y Luis Quijada, así como a Ruth, Salva y
Cristina, por sus enseñanzas y por los buenos momentos que compartimos juntos.
Muchísimas gracias, Nuria, por ser tan cariñosa conmigo, y porque nunca he tenido una
maestra que me enseñase con tanto glamour. Y a tí, Javier, no tengo palabras para
agradecerte que me brindaras tu valioso tiempo de forma tan desinteresada. Te debo
prácticamente todo lo que sé de manejo de ratones. Mil gracias por tus conocimientos, tu
ayuda y tu amistad.
Vaya mi más sincera gratitud para el Dr. Manuel Carlos López del Instituto LópezNeyra de Granada, y a todos los integrantes de su laboratorio, en especial para Lourdes
Planelles. Gracias por todo lo que aprendí durante los días que tuve la suerte de estar con
vosotros, y por acogerme con tanto cariño y hospitalidad.
257
AGRADECIMIENTOS
Gracias mamá, por ser la mejor madre del mundo, porque tus consejos han sido lo más
importante, y me han servido y me servirán siempre para guiar mis pasos. Gracias por ser
mi ejemplo, por transmitirme tu espíritu positivo ante la vida, tu manera de afrontar las
cosas, por enseñarme a que todo puede tener solución y que a lo malo siempre hay que
saber encontrarle el lado bueno. Sé perfectamente que soy lo que soy gracias a ti, y quiero
que sepas cuanto te admiro, y que me considero la persona más afortunada del mundo por
ser tu hija.
Gracias, papá, porque de tí nació mi vocación como veterinaria. Porque me dejaste
unos recuerdos maravillosos: tu buen humor, tu gran corazón, tu generosidad, tu afecto, tu
gran inteligencia, tu tesón, tu amor por el estudio. Porque sé que has seguido a mi lado
todo este tiempo. Aunque la vida no te dio oportunidad para verme llegar a conseguir mis
ilusiones, creo que serías muy feliz si pudieras compartir conmigo estos momentos. Por
eso te dedico esta Tesis con todo el cariño de mi corazón. Te quiero, y ahora más que
nunca, te echo muchísimo de menos.
Muy especialmente quiero dar las gracias a mi hermana Teresa, y al resto de mi
familia, por haberme mostrado siempre su afecto y su interés, y por haberme hecho tan
feliz en todos los momentos que hemos compartido juntos. Gracias a todos por hacerme
sentir que puedo contar con vosotros, ahora y siempre.
A María, Melchy, Noelia y Vanessa quiero agradecerles cada uno de los instantes en
los que me han apoyado y animado. Gracias por tantos años de alegría y amistad, que me
habéis demostrado sobradamente a pesar del tiempo y de las distancias.
Estoy en deuda con Felipa y su familia, Beli, J. Javier y Enrique, por el cariño que me
han manifestado y por haberme prestado altruistamente su ayuda en todo momento. Es
una autentica suerte haberos conocido.
También quiero dar las gracias a todos mis compañeros del gimnasio Los Fratres, por
la simpatía y amabilidad con la que me han tratado desde el primer momento; y por
ayudarme a descargar, a base de carreras, las tensiones acumuladas durante la escritura de
258
AGRADECIMIENTOS
esta Tesis. Gracias también a ti, Álvaro, por ser como eres. El mundo sería un lugar
maravilloso si existieran más personas como tú.
Estoy profundamente agradecida a Sebas, por haberse preocupado de mi bienestar, por
haberse deshecho en favores conmigo y por procurar hacerme siempre la vida más fácil.
Sinceramente, no sé qué haría sin tu ayuda. De corazón, gracias.
Gracias a mis dos soles, Lobo y Duende, por aportar tanta alegría a mi vida, por
hacerme sonreír con vuestros juegos, y por demostrarme a diario vuestro amor
incondicional.
Terminaré dándole las gracias a la persona más importante en mi vida. Gracias,
Miguel, porque esta Tesis debes sentirla tan tuya como mía, ya que sin ti jamás hubiera
sido posible nada de lo que ahora mismo ves. Mil gracias por compartir tu vida conmigo,
por hacerme partícipe de tus ilusiones, tus deseos y tus sueños, y por permitirme ser yo la
afortunada que los convierte en realidad. Gracias por quererme y por hacerme tan feliz.
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