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CAPÍTULO
12
I
DENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS EN SUEROS HUMANOS
231
IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS
EN SUEROS HUMANOS
TAMARA MENÉNDEZ1
1
Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.
Las bibliotecas de péptidos aleatorios, expuestos en la superficie de fagos
filamentosos, se han convertido en una herramienta poderosa para la identificación de epítopos reconocidos por diferentes moleculas de selección como
anticuerpos, receptores, enzimas, células, etc. El desarrollo de esta tecnología
se basa en la capacidad que tienen los fagos filamentosos de exponer en su
superficie secuencias peptídicas foráneas fusionadas a las proteínas de la cápsida
viral. Las proteínas virales más empleadas con este objetivo han sido PVIII, la
proteína mayoritaria de la cápsida, y PIII, una proteína minoritaria. Las secuencias
peptídicas expuestas en la superficie de la partícula viral son fácilmente accesibles y potencialmente capaces de unirse de manera específica a las moléculas
usadas para la selección, y por lo tanto pueden ser seleccionados sobre la base
de dicha afinidad. La secuencia de un péptido de una biblioteca escogido por
una determinada propiedad puede ser fácilmente deducida de la secuencia
nucleotídica del fago que lo expone [1-4].
Numerosos péptidos expuestos en fagos han sido seleccionados por su capacidad de unión a anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos lineales o
discontinuos de proteínas. En el primer caso, los residuos aminoacídicos se localizan de manera continua en la estructura primaria de la proteína y los péptidos
seleccionados generalmente presentan homología de secuencia con el antígeno
original. Para la identificación de los epítopos discontinuos es necesario poseer
información acerca de la estructura tridimensional del antígeno original, ya que
en este caso el epitopo esta formado por aminoácidos alejados en la estructura
primaria, pero cercanos en la estructura terciaria de la proteína.
Esta tecnología también ha posibilitado el aislamiento de mimotopos, o sea de
péptidos capaces de unirse a un anticuerpo dirigido contra algún ligando a pesar
de no presentar semejanzas con este último, ya sea porque el ligando no es de
naturaleza proteica o porque es una proteína pero no tiene homología con el
péptido. Por ejemplo, se pueden aislar mimotopos cuando se realiza el proceso
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CAPÍTULO 12
de pesquisa de una biblioteca con anticuerpos que reconocen epítopos
conformacionales o polisacáridos bacterianos [revisado en 5].
La habilidad de un péptido de simular el comportamiento de un antígeno natural debe considerarse en dos niveles: simulación antigénica y simulación
inmunogénica. Un péptido tiene la propiedad de simulación antigénica cuando
es reconocido por el sitio de unión al antígeno presente en el anticuerpo y es
capaz de competir con el antígeno natural por la unión a este sitio. Esto es lo
que permite que un péptido de una biblioteca sea seleccionado con un anticuerpo determinado. En este caso el péptido seleccionado es un mimotopo
antigénico del antígeno natural, capaz de simular o mimetizar las propiedades
de unión de un epítopo. Esta propiedad del mimotopo de simulación antigénica
es suficiente cuando, por ejemplo, se quiere determinar que secuencia es
reconocida por un anticuerpo de interés, como en el caso del mapeo epitópico
de una proteína. Un péptido tiene la propiedad de simulación inmunogénica
cuando adicionalmente simula o mimetiza el comportamiento inmunológico
del antígeno original, entonces se le llama mimotopo inmunogénico. Esta condición es necesaria cuando la finalidad del trabajo es la utilización del péptido
identificado como un candidato vacunal.
La vía para comprobar si un mimotopo antigénico de un antígeno determinado
es además un mimotopo inmunogénico es mediante la inmunización de animales
de experimentación con el péptido elegido y la evaluación de la respuesta inmune
que se induce contra el patógeno en estudio. Es posible la inmunización directa
de animales de experimentación con fagos que exponen péptidos. Se ha
demostrado que los fagos filamentosos son proteínas portadoras potentes,
capaces de presentar péptidos al sistema inmune de manera efectiva. Además,
no es necesario el uso de adyuvantes en la inmunización y los péptidos foráneos
expresados en fagos se comportan como antígenos dependientes de células T,
capaces de generar respuesta inmune funcional contra el patógeno en estudio
[6-12].
La posibilidad de inmunizar directamente con fagos filamentosos es importante,
ya que los péptidos expuestos en fagos se encuentran en un ambiente particular
o “contexto fágico” que influye sobre sus propiedades, las que pueden variar si
se separan los péptidos de este contexto [7, 13], de hecho se emplea el término
fagotopo para designar a los péptidos expresados en fagos que han sido seleccionados con un anticuerpo determinado.
Entre las aplicaciones, en el campo del diseño de vacunas, de la pesquisa de
bibliotecas de péptidos expuestos en fagos filamentosos con anticuerpos
monoclonales, está la identificación de epítopos de antígenos de patógenos
involucrados en el desarrollo de una enfermedad.
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En 1994, Motti y colaboradores [14], describieron la identificación de varios
fagotopos durante la pesquisa de una biblioteca con 2 anticuerpos monoclonales
dirigidos contra el virus de la hepatitis B (VHB). Uno de los péptidos fue capaz
de inducir anticuerpos murinos que reconocieron el antígeno de superficie del
VHB (AsVHB). A partir de este trabajo se han descrito péptidos seleccionados
de manera similar utilizando anticuerpos dirigidos contra varios antígenos virales,
bacterianos y de malaria, que han sido capaces de inducir respuesta inmune
contra el antígeno original [15-21].
También es posible realizar la pesquisa de las bibliotecas de péptidos con sueros
policlonales. El empleo de sueros de individuos afectados por alguna enfermedad o inmunizados con algún preparado vacunal eficaz, permite la identificación
de epítopos específicos de enfermedades o de epítopos responsables de la protección conferida por dicha vacuna, respectivamente.
La posibilidad del empleo de sueros policlonales para estos propósitos se podía
deducir de los experimentos de Kay y colaboradores en 1993 [22]. Ellos utilizaron un suero policlonal de carnero inducido contra inmunoglobulinas G (IgG) de
ratón para pesquisar una biblioteca de péptidos de 38 aminoácidos expuestos
como fusión a la proteína III del fago filamentoso M13. Después de tres ciclos de
pesquisa de la biblioteca con las inmunoglobulinas específicas del suero del carnero, purificadas por afinidad, aislaron 4 fagotopos cuyas secuencias coincidieron
con la secuencia de la región Fc de las cadenas pesadas g-2 y g-3 de ratón.
El primer trabajo de este tipo empleando sueros humanos fue llevado a cabo
ese mismo año por Dybway y colaboradores [23]. Ellos realizaron tres ciclos de
pesquisa de una biblioteca de nonapéptidos fusionados a la proteína VIII del
fago filamentoso f1 [24]. Los dos primeros ciclos de pesquisa se hicieron con
una mezcla de sueros de 84 pacientes aquejados de artritis reumatoidea y se
seleccionaron los fagos que reaccionaron con las inmunoglobulinas presentes
en dichos sueros. Para el tercer ciclo de pesquisa emplearon una mezcla de
sueros de 40 individuos sanos y eligieron en este caso los fagotopos no reactivos.
Los fagos seleccionados fueron reconocidos con mayor frecuencia por sueros
de individuos enfermos que por sueros de individuos sanos, al ser enfrentados a
un panel de sueros individuales. La especificidad del reconocimiento fue confirmada en experimentos de competencia usando los fagos aislados y péptidos
sintéticos. Se demostró que para la unión de los anticuerpos específicos era
necesario el tripéptido GGA. Coincidentemente, la secuencia AGGGA es reconocida por autoanticuerpos dirigidos contra citoqueratinas y colágeno, presentes en el suero de los individuos enfermos de artritis reumatoidea. El antígeno
nuclear del virus Epstein-Barr, considerado uno de los candidatos más fuertes a
ser el agente etiológico de la enfermedad, tiene homología con citoqueratinas y
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colágeno. Este trabajo demostró que es posible, por un lado, el aislamiento de
mimotopos de antígenos implicados en una determinada enfermedad a partir de
bibliotecas de péptidos expuestos en fagos filamentosos empleando sueros humanos y por otro lado, que no es necesario tener información previa acerca del
agente causante de la enfermedad para aplicar esta tecnología. Esto abrió las
puertas para la identificación de los posibles autoantígenos involucrados en las
enfermedades autoinmmunes.
En 1994, un grupo de investigadores italianos desarrolló una metodología que
facilita la selección en estas bibliotecas de los ligandos reconocidos por los
sueros de individuos aquejados de una determinada enfermedad y que no son
reconocidos por los sueros de individuos sanos. La metodología citada se validó
por la identificación de epítopos específicos de patógenos y de autoantígenos
característicos de algunas enfermedades autoinmunes, lo cuál ha sido publicado
en varios artículos científicos [25-31].
Esta metodología consta de tres pasos:
1. Selección a partir de la biblioteca de péptidos expuestos en fagos de los
fagotopos reconocidos por el suero de un enfermo.
2. Inmunoidentificación con el suero de otro enfermo de los clones de fagos
seleccionados.
3. Enfrentamiento, mediante inmunoensayo, de los fagos seleccionados contra
un panel de sueros de individuos enfermos y de individuos sanos. De esta
manera se seleccionan un número restringido de clones, reconocidos
específicamente por los sueros de las personas afectadas por la enfermedad
bajo estudio [25].
Para desarrollar estos trabajos los investigadores utilizaron dos bibliotecas de
nonapéptidos fusionados a la proteína VIII del fago f1. La primera expresa los
péptidos en forma lineal [24], y la segunda incluye dos cisteínas flanqueando los
péptidos, lo cual conduce a la disposición de los péptidos en la superficie del
fago en forma cíclica [32]. La metodología seguida para la construcción de
ambas bibliotecas fue similar y se utilizó el vector PC89 [24].
Folgori y colaboradores, en 1994 [25], pesquisaron la biblioteca de nonapéptidos
cíclicos con sueros de individuos inmunizados con el AsVHB e identificaron
dos fagos que exponían péptidos reconocidos específicamente por estos sueros. Estos dos fagos se enfrentaron en ELISA a un panel de 20 sueros positivos y 18 negativos al AsVHB. Ninguno de los dos fagos fue reconocido por
ninguno de los sueros negativos y fueron reconocidos por 14 y 13, respectivamente, de los 20 sueros positivos. La secuencia aminoacídica de uno de los
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péptidos expresados por los fagos mostró homología con una región de la
secuencia del AsVHB, mientras que el otro péptido no mostró homología, o
sea, se identificó un epítopo lineal y un mimotopo, respectivamente. Estos dos
fagos fueron capaces de inducir en ratones la producción de anticuerpos que
reconocieron al AsVHB. En los sueros de todos los ratones se detectaron niveles de anticuerpos específicos de 3 a 12 veces mayores que los niveles de
anticuerpos detectados en el suero de ratones inmunizados con el fago nativo.
El reconocimiento del AsVHB por parte de los anticuerpos presentes en el
suero de los ratones inmunizados se inhibió completamente al agregar el fagotopo
homólogo. Estos experimentos demostraron que se habían seleccionado
mimotopos antigénicos e inmunogénicos del VHB.
En 1996, Prezzi y colaboradores [26], empleando sueros de individuos infectados con el virus de la hepatitis C (VHC) seleccionaron de una mezcla de las dos
bibliotecas de nonapéptidos lineales y cíclicos un conjunto de péptidos que
mimetizaban diferentes determinantes antigénicos del VHC. Con estos péptidos
se detectó la presencia de anticuerpos contra el VHC en sueros de individuos
infectados. Los sueros fueron obtenidos de centros de donantes y de departamentos de enfermedades infecciosas de diferentes hospitales, en los cuales se
había determinado la presencia de anticuerpos contra el VHC mediante los
sistemas de diagnóstico de este virus que existen comercialmente. Esto demostró la alta sensibilidad de estos péptidos como marcadores de diagnóstico. Cuatro de los fagotopos fueron utilizados para inmunizar ratones. Los sueros murinos
reconocieron en ELISA la proteína de la cápsida del VHC. El reconocimiento
de esta proteína, por parte de los sueros de los animales después de la inmunización, fue desde 4 hasta 42 veces mayor que el reconocimiento que mostraron
los sueros preinmunes de los propios animales. Los sueros de los ratones también reconocieron la proteína nativa expresada en células eucariotas. Los datos
obtenidos confirmaron que estos fagotopos son también mimotopos
inmunogénicos del VHC, que pueden considerarse como candidatos potenciales para el desarrollo de una vacuna contra este virus.
La metodología también ha sido empleada en el estudio de la Diabetes mellitus
insulino-dependiente. Esta es una enfermedad autoinmune causada primariamente por la destrucción, mediada por células, de las células B productoras de
insulina de los islotes de Langerhans del páncreas. Aunque aún no se han descifrado bien los eventos primarios que conducen al desarrollo de esta enfermedad en individuos susceptibles, varios virus se han asociado a su aparición. La
enfermedad tiene un largo período asintomático que precede el debut como
enfermo, el cual se caracteriza por la aparición de autoanticuerpos contra varios antígenos, por ejemplo: insulina, descarboxilasa del ácido glutámico y la
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tirosina fosfatasa IA-2. Estos autoanticuerpos son normalmente los marcadores más frecuentemente usados para predecir la aparición de la enfermedad,
aunque algunos de ellos no tienen valor pronóstico ya que pueden también estar
presentes en el suero de individuos que no desarrollan diabetes clínica. Por lo
tanto en esta enfermedad es importante la identificación de autoantígenos nuevos que puedan contribuir a un diagnóstico precoz. En 1996 y 1997, Mennuni y
colaboradores [27,31], publicaron dos trabajos donde utilizaron sueros de individuos pre-diabéticos y no diabéticos para pesquisar una mezcla de las dos bibliotecas de péptidos lineales y cíclicos e identificaron 2 fagotopos. Uno de ellos se
enfrentó a un panel de sueros de individuos diabéticos o pre-diabéticos y de
individuos no enfermos. La frecuencia de reconocimiento del fagotopo por los
sueros positivos fue significativamente mayor que la frecuencia observada con
los sueros controles. Este mismo fago fue empleado para purificar mediante
cromatografía de afinidad las inmunoglobulinas presentes en el suero de dos
individuos, uno diagnosticado como diabético y otro como de alto riesgo. Las
inmunoglobulinas purificadas reaccionaron específicamente en experimentos
de inmunohistoquímica con cortes de páncreas humanos, lo cual sugirió que
este fagotopo era un mimotopo de un autoantígeno de los islotes del páncreas.
Adicionalmente, el suero de un conejo inmunizado con ese fagotopo también
reconoció cortes de páncreas humanos y mostró un patrón de reactividad similar al observado cuando se emplearon las inmunoglobulinas humanas para el
ensayo. Resultados similares se obtuvieron al realizar el ensayo con cortes de
páncreas de rata. El suero del conejo no reconoció otros tejidos de la rata como
estómago, hígado y riñones. Estos resultados indicaron que este fagotopo mimetiza
las propiedades tanto antigénicas como inmunogénicas de un epitopo natural.
Con el objetivo de determinar si la secuencia expuesta por este fago se relacionaba con la de alguno de los autoantígenos que se han identificado como implicados en esta enfermedad, se realizaron ELISAs de competencia en placas
recubiertas con un péptido multi-antigénico de ocho brazos cuya secuencia se
correspondía con la del péptido expuesto en el fago seleccionado y se incubó el
suero del conejo con diferentes cantidades de insulina y proinsulina. No hubo
inhibición de la reactividad, lo que demostró que el suero del conejo tiene una
especificidad diferente. Experimentos similares fueron llevados a cabo con la
carboxipeptidasa humana H, la descarboxilasa de ácido glutámico de rata y los
autoantígenos ICA69 e ICA512 y se obtuvieron resultados similares.
Adicionalmente, no encontraron homología entre la secuencia del mimotopo y
la de estos autoantígenos ya descritos como asociados a diabetes, lo que indicó
que el péptido expuesto por el fago seleccionado en este trabajo mimetiza un
autoantígeno desconocido.
Mecchia y colaboradores en 1996 [28], hicieron un trabajo muy interesante
donde pesquisaron la biblioteca de nonapéptidos cíclicos con
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inmunoglobulinas M (IgM) purificadas del suero de individuos afectados
por una enfermedad autoinmune llamada crioglobulinemia mixta tipo II, que
se asocia frecuentemente a la infección con el VHC. La enfermedad se caracteriza por la presencia en el suero de los individuos afectados, de
immunocomplejos precipitables por frío y que contienen IgM con actividad
reumatoidea. Sus manifestaciones clínicas van desde púrpura vascular, artralgia
y debilidad, hasta daño neurológico, hepático o renal que pueden llevar a insuficiencias severas o incluso a la muerte. Mas del 80% de los individuos afectados por esta enfermedad han sufrido infecciones con el VHC y por esto se
considera a este virus como el principal agente desencadenante de la enfermedad. En esta investigación se emplearon para la pesquisa IgM purificadas
a partir de inmunocomplejos presentes en los crioprecipitados de pacientes
aquejados de la enfermedad que habían sufrido infección con el VHC. Una
población dominante de los fagos aislados exponía la secuencia péptidica
HPLAP. Uno de los fagotopos que exponía esta secuencia, se enfrentó a un
panel de 22 sueros de individuos sanos y de 78 sueros de individuos afectados
por la enfermedad. La diferencia en la frecuencia de reconocimiento de unos
u otros sueros fue estadísticamente significativa, lo que llevó a la conclusión
de que el fago exponía un epítopo específico de la enfermedad. Para reafirmar esta conclusión, se demostró que el fagotopo seleccionado fue reconocido con muy baja frecuencia, o no reconocido, por los sueros de individuos
afectados por otras enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas. Algunos
experimentos sugirieron que la molécula blanco de las IgM que reaccionaron
durante el proceso de pesquisa de la biblioteca con los fagotopos que exponían la secuencia HPLAP, no era ninguna proteína del VHC. Esto los llevó a
hacer una búsqueda en las bases de datos, de secuencias homólogas a la
identificada por ellos. Encontraron que la secuencia peptídica obtenida mostró alta homología con un lazo expuesto del primer dominio del producto del
gen 3 para la activación de linfocitos humanos (LAG 3), el cuál se expresa de
manera selectiva en la membrana de linfocitos T y de células asesinas naturales activadas, pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se relaciona de manera estructural y funcional con el CD4. Un suero de conejo
inducido contra un péptido sintético con la secuencia LAG 3 reconoció
eficientemente los fagos seleccionados. De manera similar los sueros de conejos inmunizados con dicho fagotopo reconocieron en ELISA la secuencia
correspondiente al LAG 3. Las IgM purificadas de los sueros de individuos
enfermos reaccionaron específicamente con el péptido LAG 3 en ELISA y
esta unión fue inhibida por los fagotopos seleccionados. La conclusión de este
trabajo fue que, aun cuando el fagotopo seleccionado no exponía una secuencia peptídica relacionada con el VHC, es probable que los anticuerpos que
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reconocen la secuencia HPLAP, presente en LAG 3, se inducen en respuesta
a la estimulación antigénica por parte de este virus.
La importancia de esta metodología radica en que para su aplicación no se
requiere disponibilidad y ni siquiera información acerca del agente patógeno,
que puede, incluso, ser desconocido. Esta característica representa un avance
con respecto a los métodos empleados para el desarrollo de vacunas y de sistemas de diagnóstico basados en las técnicas de ADN recombinante, para los
cuales es necesario tener una información detallada acerca del agente causal
de la enfermedad de interés, factor limitante en el estudio de las enfermedades,
infecciosas, alérgicas o autoinmunes, de agente etiológico desconocido.
El desarrollo de tecnologías que permitan descodificar la información dejada,
en forma de respuesta inmune específica, en el suero de los individuos afectados ofrece enormes posibilidades en el campo del diagnóstico y la prevención
de estas enfermedades. Incluso en el caso de enfermedades infecciosas, cuyo
agente causal es bien conocido, no es posible obtener la información dejada por
el mismo en la memoria inmunológica del individuo afectado mediante el estudio
de la estructura del patógeno, porque el sistema inmune reacciona con el antígeno
de una forma compleja y difícil de predecir. De la misma manera, si en el proceso de pesquisa se emplean sueros de individuos inmunizados con algún preparado vacunal eficaz pueden identificarse los epítopos responsables de la protección
conferida por dicha vacuna.
Los péptidos que se seleccionan de acuerdo con esta metodología son imagenes
positivas del antígeno natural y pueden ser inmunógenos sustitutos de este
aun cuando sean completamente distintos del antígeno natural. Las bibliotecas de péptidos expuestos en fagos constituyen, por lo tanto, una fuente alternativa de antígenos que permiten la disección de la respuesta inmune, aspecto
particularmente importante en aquellos casos en los cuales el agente patológico es desconocido. Nuevas perspectivas se abren en el desarrollo de reactivos
de nueva generación, de uso potencial en el diagnóstico o la prevención de
varias enfermedades.
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