Download FREE T4 Sistema de componentes de fase solida

Diagnostic Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
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FREE T4
Sistema de componentes
de fase solida para T4 Libre
Catalog Number:
06B-257214 (100 Tube Kit)
06B-257215 (500 Tube Kit)
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-437-1705
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ICN Pharmaceuticals offices.
Kundenberatung und technische informationen bei den ICN Pharmaceuticals Niederlassungen
erhältlich.
Pour toute aide et information techniques contactez votre agence locale de ICN
Pharmaceuticals.
Per qualsiasi informazione o esigenza si prega di rivolgersi agli uffici locali della ICN
Pharmaceuticals.
Para información y soporte técnico dirijase a las oficinas locales de ICN Pharmaceuticals.
SISTEMA DE COMPONENTES DE FASE SOLIDA
PARA T4 LIBRE
Para la determinación cuantitativa de Tiroxina Libre en suero o plasma
NE. de Catálogo 06B257230, Tubos Recubiertos de Anticuerpo anti-T4
NE. de Catálogo 06B257231, Solución de Trazador
NE. de Catálogo 06B262030, Juego de Estándares de T4
Resumen y explicación de la prueba
La forma dominante del yodo orgánico en suero es la tiroxina ó T4 (3,5,3',5'-tetrayodo-L-tironina).
Menos del 0,05% de la T4 circulante es libre, mientras más del 99,95% de la hormona se fija a
proteinas de transporte; alrededor del 70% lo hace a la globulina fijadora de tiroxina (TBG), 20%
a prealbúmina fija-dora de tiroxina (TBPA) y 10% a albúmina. La T4 fijada a proteínas portadoras
con constantes de afinidad elevadas, es metabólicamente inerte y no se encuentra disponible para
los tejidos.1 La acción fisiológica de la hormona se ejerce únicamente a través de la pequeñísima
proporción de T4 no fijada o libre (FT4).2 La conversión de T4 en T3 (triyodotironina) es un proceso
bioquímico importante1,2 y actualmente se cree que la tiroxina es una especie de pro-hormona de
la T3, siendo ésta la responsable del estímulo metabólico.3
Los niveles de T4 libre se mantienen constantes gracias a las interacciones de retrocontrol negativo
del eje hipotálamo-pituitaria-tiroides. Para mantener esos niveles constantes, la concentración de
T4 fijada o total debe variar en respuesta a las alteraciones en la composición de la proteína de
transporte, principalmente de la TBG, que puede elevarse como consecuencia de una gran variedad
de factores, como son el embarazo, deficiencia hereditaria de TBG, aumento genético de TBG,
tratamiento con estrógenos, esteroides anabólicos, prednisona y salicilatos.2,4,6 Las variaciones
totales de T4 en esas situaciones no van acompañadas de alteraciones del estado clínico del
tiroides.2 FT4 es independiente de la concentración de proteínas portadoras y representa el estado
tirometabólico real, tal y como se establece por el eje hipotalámico-pituitario-tiroideo.7
Fundamento de la prueba
El anticuerpo utilizado en un radioinmunoensayo debe tener igual afinidad por el estándar y el
ligando presente en el plasma o suero del paciente. El ligando no marcado compite con el marcado
por el número limitado de puntos de unión del anticuerpo disponibles, con lo que se reduce la
cantidad de ligando marcado fijado al anticuerpo. Por eso, el nivel de radiactividad fijada es
inversamente proporcional a la concentración del ligando en la muestra del paciente o en el
estándar. Tras un adecuado período de incubacion se separan las fracciones libre y fijada y se
mide la radiactividad.
1
En el radioinmunoensayo competitivo para T4 libre clásico, hay que minimizar la posibilidad de que
la tiroxina [125I] altere el equilibrio existente entre tiroxina libre y fijada. Esto se consigue utilizando
un derivado de la tiroxina que no se fija significativamente a las proteinas fijadoras endógenas, y
un anticuerpo de afinidad elevada que se fija tanto a la T4 como a su derivado. El resultado es que
la alteración del equilibrio T4 fijada/T4 libre es pequeña. El Sistema de Componentes de Fase Sólida
(SPCS) para T4 Libre de ICN Pharmaceuticals utiliza tubos recubiertos de anticuerpo anti-T4.
Reactivos
Para uso diagnóstico in vitro.
1. Tubos recubiertos de Anticuerpo anti-T4 NE. de Catálogo 06B257230, tubos de plástico
recubiertos de antisuero (conejo) anti-T4, 100 tubos/envase. Conservación: Mantener los tubos
a temperatura ambiente (18 a 25EC). No mezclar tubos recubiertos de lotes diferentes.
Estabilidad: Consultar la fecha de caducidad en el envase.
2. Estándares A-F de T4, NE. de Catálogo 06B262030, que contienen L-tiroxina en suero
humano*, con azida sódica** al 0,1% y otros conservantes; 1,5 ml/vial (volumen mínimo).
Un vial de cada estándar. Los valores figuran en las etiquetas de los viales (T4 Libre en unidades
SI: pmol = 12,87 x ng/dl). Conservación: Refrigerar a 2-8EC. Evitar la exposición a la luz o el
calor extremado. Estabilidad: Consultar la fecha de caducidad en los viales.
3. Solución Trazadora de T4, NE de Catálogo 06B257231, contiene menos de 10 uCi (370 kBq)
por frasco de derivado de L-Tiroxina [125I] en tampón Tris salino con albúmina bovina, EDTA y
0,5% de azida sódica** y otro conservante. Un frasco contiene 110 ml y es suficiente para
100 tubos. Conservacion: Refrigerar a 2-8EC. Evitar su exposición a la luz solar o el calor
extremado. Estabilidad: consultar la fecha de caducidad en la etiqueta.
* PRECAUCION: MANIPULAR COMO POSSIBLE TRANSMISOR DE INFECCIONES: El material original del que se ha obtenido este producto no reaccionaba frente a HBsAg y era negativo en
anticuerpos anti-HIV cuando se analizó con reactivos autorizados. No se conoce ningún método
que asegure que los productos derivados de sangre humana no sean infecciosos. Consultar
CDC/NIH Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Publicación HHS NE (CDC
84-8395).
**
PRECAUCION: Los reactivos contienen azida sódica, puede reaccionar con el plomo y cobre
de las cañerías y formar azidas metálicas explosivas. Utilizar agua abundante cuando se
eliminen, para evitar la acumulación de dichas azidas. Muito tóxico em caso de ingestao.
Em contacto com ácido liberta um gaz muito tóxico. Após contacto com a pele, lavar
imediata e abundantemente com de agua.
2
ADVERTENCIA: CONTIENE MATERIAL RADIACTIVO
Este Sistema de Componentes de Fase Solida ICN Pharmaceuticals contiene menos de 10
microcuries (370 kBq) de [125I] por frasco de marcador.
Este material radiactivo sólo pueden recibirlo, adquirirlo, poseerlo y utilizarlo los médicos,
laboratorios clínicos u hospitales, y sólamente para pruebas clínicas o de laboratorio in vitro, que
no impliquen la administración interna o externa del producto, o de sus radiaciones, a los seres
humanos o animales. Su recepción, adquisición, posesión, utilización y transferencia, estan
sometidas a las normas y regulaciones de la legislación española.
ICN Pharmaceuticals y Compañia
El cumplimiento de las normas básicas para seguridad de las radiaciones proporcionará una
protección adecuada. Dichas normas pueden obtenerse de la Junta de Segunidad Nuclear, Madrid.
A continuación recogemos un resumen del mismo: Ë No comer, beber, fumar o aplicarse
cosméticos donde se utilicen materiales radiactivos. Ë No pipetear soluciones radiactivas
oralmente. Ë Evitar el contacto directo con todo material reactivo, utilizando artículos protectores
tales como batas de laboratorio y guantes desechables. Ë Todo trabajo radiológico se realizará en
zonas especiales, que no sean de paso. Ë Los materiales radiactivos deben conservarse en sus
envases originales en una zona especial. Debe llevarse un libro de registro en que se anoten las
entradas y salidas de todos los materiales radiactivos. Ë El equipo de laboratorio y material de
vidrio sujeto a contaminaciones debe estar separado del resto, para evitar contaminaciones
cruzadas de los diferentes radioisótopos. Ë Cualquier contaminación radiactiva será inmediatamente
tratada de acuerdo con las normas establecidas. Ë Todos los materiales radiactivos serán
desechados de acuerdo con las regulaciones y normas vigentes de las agencias que ejercen
jurisdicción sobre el laboratorio. Ë Los envases no contaminados se deben desechar con el material
de desecho no radiactivo, siempre que se tome la precaución de destruir sus etiquetas.
Equipo y reactivos necesarios no suministrados
1. Tubos de Vidrio con Vacío Marca (con EDTA si se desea analizar el plasma).
2. Baño metabólico de 37±lEC.
3. Aspirador.
4. Pipetas semiautomáticas con puntas desechables, para dispensar cantidades de 50 Fl y 1,0 ml
o un pipeteador-diluidor automático.
5. Contador gamma para medir [125I].
6. Jeringa con Punta de 2 ml y Soporte Metálico.
7. Papel adecuado para gráficas (lineal, semilog o logit-log).
3
Obtención de muestras
No es preciso preparar al paciente de un modo especial.
Preparación de la muestra para análisis: Recoger la sangre en un Tubo de Vidrio con Vacío Marca
de 5 ml. Utilizar EDTA como anticoagulante si se desea analizar plasma. Si se recoge suero, dejar
que se coagule la sangre a temperatura ambiente. Centrifugar durante 10 min y recoger el suero
o plasma.
Transporte de muestras: El suero, cuidadosamente envasado, se debe transportar a 2-8EC. Si el
tiempo de transporte supera las 48 horas, las muestras deberán congelarse.
Conservación de muestras: El suero se puede conservar refrigerado (2-8EC) si se va a realizar el
ensayo en los 2 días siguientes a su obtención. Si se espera un período superior a las 48 horas,
se debe congelar la muestra (-20EC).
Evitar exponer las muestras a ciclos repetidos de congelado-descongelado, que son comunes en
los congeladores con des-congelación automática. El suero congelado debe llevarse a temperatura
ambiente de forma gradual, y se mezclará cui-dadosamente antes de pipetearlo. No utilizar
muestras muy lipémicas o hemolizadas, ni muestras obtenidas de pacientes tratados con yodo
radiactivo.
Procedimiento del ensayo
Llevar los reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de utilizarlos, pero, para que su
deteriodo sea mínimo, evitar dejarlos a esa temperatura más tiempo del necesario. No utilizar más
reactivos que los que se suministran juntos para cada ensayo. Si se utiliza una pipeta automática,
se puede pipetear simultáneamente los estándares/muestras y la solución trazadora; evitar el
arrastre de las muestras.
Los sueros de control deben analizarse a la vez que las muestras de pacientes. La preparación de
la curva estándar y las determinaciones clínicas deben ser simultáneas.
1. Numerar una cantidad de tubos recubiertos de anticuerpo para la curva estándar y muestras de
los pacientes.
2. Añadir 50 Fl de estándares de T4 Libre o muestras de pacientes (suero, plasma u orina) a los
Tubos Recubiertos de Anticuerpo, según el esquema siguiente.
3. Añadir 1,0 ml de Solución de trazador de T4 Libre a cada tubo. Mezclar los tubos (Vortex)
durante 3-5 segundos.
4. Incubar en un baño metabólico a 37±1EC durante 90 minutos. Colocar todos los tubos,
estándares y muestras en el baño al mismo tiempo. El nivel del agua del baño debe estar por
encima del nivel de líquido de los tubos, sin dejar que éstos floten.
4
5. Al final del tiempo de incubación necesario, aspirar o decantar.
6. Añadir 1,0 ml (o más) de agua destilada a todos los tubos, que se vierte resbalando por sus
paredes. Puede utilizarse una jeringa y soporte metálico con adaptador de aguja desechable de
calibre 18 y el accesorio de llenado o un pipeteador-diluidor.
7. Volver a aspirar o decantar todos los tubos.
8. Contar la radiactividad en los tubos, secuencialmente, durante un minuto con un contador
gamma. Para instrumentos de poca eficacia se necesitarán tiempos más prolongados. El tiempo
de recuento necesario para unas cuentas acumuladas nivel de trazador de 15.000 indicará el
tiempo necesario para todos los ensayos con el contador gamma del usuario.
RADIOINMUNOENSAYO DE FASE SOLIDA DE T4 LIBRE
Tubo
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
Paciente
Muestra
T4
Estándares Muestras
de T4
pacientes
50 Fl A
50 Fl B
50 Fl C
50 Fl D
50 Fl E
50 Fl F
--------------50 Fl
Solución
trazador
Incubar
Aspirar
Agua
Aspirar
o
destilada o
o
decantar desionizada decantar
Añadir 1 ml Incubar
Aspirar o
Añadir 1
Apirar o
a todos los todos los decantar mL a todos decantar
tubos.
tubos a
todos los los tubos todos los
Mezclar
37 ± 1EC
tubos
tubos
(Vortex)
durante
durante 3-5 90 min.
segundos
-Contar la radiactividad en todos los tubos.
-Calcular.
-Trazar la Curva estándar y determinar los valores del ensayo.
Cálculo de resultados
Nota: No es obligatorio que los datos del recuento se expresen como cuentas por minuto (cpm),
pero la unidad de tiempo debe ser constante para todos los tubos contados.
1. Promediar las cuentas de los tubos 1 y 2 para obtener el "Recuento de Nivel de trazador" del
ensayo.
2. Dividir las cuentas en cada tubo por el Nivel de cuentas del trazador para obtener el tanto por
ciento de Nivel de trazador en cada tubo.
5
Nota: Obtener un valor separado para cada duplicado.
3. Puede trazarse una Curva estándar como sigue: Utilizando un papel logit-log, comparar los %
de Nivel de trazador vs. ng/dl de estándar de T4 libre en la escala log. La Tabla 1 muestra unos
datos típicos de recuento y los % calculados. La Curva estándar trazada para esos datos se
muestra en la Figura 1.
4. La concentración de T4 libre en el suero de un paciente se determina por interpolación en la
Curva estándar del % de Nivel de trazador frente a ng/dl de T4 libre (Figura 1 ).
5. Se pueden utilizar otros métodos para trazar la curva estándar.
Cálculo ejemplo para suero de un paciente
Recuento (encontrado)
= 8858
Nivel de cuentas del Trazador = 19134
% nivel de trazador
= 8858 x 100 = 46,3%
19134
La curva estándar Logit-log del % de Nivel de trazador (Figura 1) muestra que el 46,3%
corresponde a una concentración de T4 libre de 0,91 ng/dl. El promedio de este valor y el valor
para la determinación duplicada se refleja como concentración de T4 libre en ng/dl para la muestra
del paciente.
Limitaciones del procedimiento
Debido al tipo de equilibrio T4/proteína, las muestras con concentraciones elevadas de T4 libre no
pueden ser diluidas con suero o tampón y volver a ser analizadas para obtener valores más
precisos de T4 libre.
La terapia tiroidea debe suspenderse un mes antes de la prueba, si se va a utilizar un nivel basal
real de T4 libre. La medición de tiroxina libre en pacientes eutiroideos, con enfermedad severa no
tiroidea, puede ser de limitado valor diagnóstico. Las muestras clínicas que contengan tiroxina
radiactiva endógena pueden dar resultados erroneos.
Valores esperados
Se analizó la tiroxina libre en la sangre de 135 individuos normales, con el Sistema RIA de T4 libre
de ICN Pharmaceuticals. Hasta que el laboratorio haya analizado suficiente número de muestras
como para establecer su propia gama de referencia, se puede utilizar como orientación la gama
normal de 0,7-1,7 ng/dl (frecuencia normal de distribución) obtenida en ese estudio.
El diagnóstico del estado del tiroides no se debe basar exclusivamente en el resultado de una única
prueba, como la de tiroxina libre. Cualquier paciente que presente síntomas de hipertiroidismo pero
tenga un resultado de T4 libre normal o elevado (en el límite)8 debe ser analizado con el RIA para
T3. Si da un resultado elevado, apoyará el diag-nóstico de hipertiroidismo. En los pacientes
clínicamente hipo-tiroideos, la confirmación del hipotiroidismo se debe hacer con un análisis de
6
TSH, que tendrá que dar valores altos.
Se ha comunicado un descenso de los valores normales durante el embarazo.9 Un estudio clínico
que utilizó el sistema RIA para T4 libre de ICN Pharmaceuticals, así como las determinaciones de
TSH y T4 total, demostró la utilidad de desplegar todo un panel de pruebas cuando se trate de
evaluar el estado tirometabólico. Los resultados se resumen a continuación:
Hipertiroidismo: muestras de 18 pacientes diagnosticados clínicamente, presentaban una gama de
T4 libre de 1,7-11,4 ng/dl (21,9-147 pm/l). Un paciente con hipertiroidismo dudoso, límite (1,7
ng/dl, 21,9 pm/l) dió resultados de T3 y T4 total ligeramente elevados, 192 ng/dl (2,96 nm/l) y 13,4
Fg/dl (172 nm/l) respectivamente.
Hipotiroidismo: Las muestras de 25 pacientes hipotiroideos conocidos tenían una gama de T4 libre
de 0,1-0,7 ng/dl (1,3-9,0 pm/l). Dos diagnósticos en el límite (T4 libre, 0,7 ng/dl, 9,0 pm/l) fueron
confirmados por los resultados elevados de TSH.
Embarazo: Una población de 94 embarazadas de distintos tiempos de gestación, se encontraba
dentro de la gama de referencia con gamas de T4 libres entre 0,5 y 1,8 ng/dl (6,4-23,2 pm/l).
Píldoras anticonceptivas: Trece mujeres que tomaban píldoras para control de la natalidad dieron
valores de T4 libre que iban desde 0,6 a 2,0 ng/dl (7,7-25,7 pm/l).
Características específicas del ensayo
Precisión
1. Precisión intraensayo:
Muestras clínicas
NE muestra
NE de determinaciones
Media, ng/dl
D.S.
% CV
1
20
1,14
0,05
4,4
2
20
1,53
0,06
3,9
Controles comerciales
1
20
0,62
0,05
8,1
2
20
1,84
0,07
3,8
3
20
3,19
0,09
2,8
2. Precisión inter-ensayo:
Muestras clínicas
NE muestra
NE de determinaciones
Media, ng/dl
D.S.
% CV
3
21
1,32
0,11
8,3
4
21
1,28
0,08
6,3
7
Controles comerciales
1
21
0,68
0,05
7,4
2
21
1,79
0,16
8,9
3
21
3,17
0,14
4,4
8
Sensibilidad
0,045 ng/dl, determinada por la concentración
a fijación
de trazador
-2 SD (n=20).
Exactitud
Se hicieron estudios comparativos del sistema de T4 libre de ICN Pharmaceuticals, y la diálisis de
equilibrio en muestras de una población mixta de 98 individuos eutiroideos, anormales y
embarazadas. El análisis de regresión lineal mostró:
(diálisis de equilibrio = 0,934 FT4 -0,22.) El coeficiente de correlación era 0,914.
Especificidad
A continuación se muestran los datos de reactividad cruzada del anticuerpo utilizado en este kit,
para el análogo de tiroxina derivado y para la tiroxina nativa, respectivamente. El procedimiento
utilizado fue un estudio clásico de reactividad cruzada en el que el marcador se disolvía en tampón
conteniendo el agente bloqueante de la proteína de transporte, el ácido 8-anilino-l-naftalensulfónico
(ANS). Los
resultados se expresan como porcentajes del desplazamiento de tiroxina, divididos por el
reaccionante cruzado al 50% de fijación de trazador.
% Reactividad cruzada
Compuesto
L-tiroxina [125I]
derivada
L-Tiroxina [125I]
nativa
100,0
108,5
3,33
10,17
0,03
<0,03
<0,01
<0,02
<0,03
<0,01
<0,01
100,0
91,95
3,05
7,92
0,05
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
L-Tiroxina
D-Tiroxina
3,3',5-triyodo-L-tironina T3)
3,3',5'-triyodo-L-tironina (rev.T3)
3,5-diyodo-L-tironina
3,5-L-diyodo-L-tiroxina
3-yodo-L-tiroxina
5,5-difenilhidantoína
Salicilato sódico
Acido acetilsalicílico (Aspirina)
Fenilbutazona
9
TABLE 1
Free T4 SOLID PHASE RADIOIMMUNOASSAY [125I]
Tube No.
Trace
Level
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Counts per Minute
A
Average
Counts
B
% of Trace
Level
A x 100
B
19439
18829
12734
13021
10291
10178
7506
7221
3953
3793
1932
2006
19134
----66.6
68.1
53.8
53.2
39.2
37.7
20.7
19.8
10.1
10.5
10
FIGURE 1
TYPICAL STANDARD CURVE
WITH LOGIT LOG TRANSFORMATION
11
REFERENCES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
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