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Electroforesis capilar
en el análisis de proteínas
con interés biofarmacéutico
sss%LDESARROLLODELASTÏCNICASDEINGENIERÓAGENÏTICAYLASTECNOLOGÓASDE
HIBRIDOMASHANPERMITIDOALAINDUSTRIAFARMACÏUTICAELDESARROLLODEPROTEÓNAS
YANTICUERPOSMONOCLONALESPARASUUSOTERAPÏUTICO,APRODUCCIØNDEESTOS
FÉRMACOSCONOCIDOSCOMOproductos biofarmacéuticosREQUIERENUEVASTÏCNICASANALÓTICASPARAELCONTROLDELASDIFERENTESETAPASDESUFABRICACIØN
José Carlos Diez-Masa.
Instituto de Química Orgánica
General (CSIC)
La electroforesis capilar es una
técnica analítica especialmente adecuada para el análisis de
proteínas, que empieza a jugar
un papel importante en el control de procesos y en el laboratorio de control de calidad de
productos biofarcaéuticos.
En este artículo se presentan
los fundamentos de la electroforesis capilar y se describen
sus diferentes modos utilizados para análisis de proteínas,
ilustrándolos con algunos
ejemplos de sus aplicaciones
en el campo de las proteínas
con interés biofarmaceútico.
Electroforesis capilar
La electroforesis capilar es una
técnica analítica de separación
que se basa en la diferente velocidad de desplazamiento que
tienen las distintas proteínas
en el seno de un medio líquido, contenido en un tubo capilar, al someterlas a la acción de
FARMESPAÑA INDUSTRIAL
Figura 1. Elementos esenciales de un instrumento de electroforesis capilar.
un campo eléctrico.
Los elementos esenciales de
un instrumento de electroforesis capilar se muestran en la
Figura 1. La separación se lleva
a cabo en un tubo capilar (diámetro interno, d.i., 10 - 75 µm,
longitud 20 - 100 cm), generalmente hecho de sílice fundida,
que se llena con el tampón que
constituye el medio de separación (BGE) a partir de los
viales situados en los extremos
del capilar. La muestra, contenida en otro vial, se introduce
por uno de los extremos del
capilar reemplazando en el
momento de la inyección uno
de los viales de tampón por el
vial de muestra y aplicando en
él una pequeña sobrepresión o
un pequeño voltaje. El campo
eléctrico necesario para llevar
a cabo la separación se consigue conectando una fuente de
alimentación de alto voltaje
(10.000 - 30.000 voltios, corrientes de 5 - 100 microamperios) a los extremos del capilar
de separación a través de los
viales de tampón. La monitorización de la separación se lleva a cabo en columna, es decir
colocando un detector en un
punto del capilar de análisis
situado generalmente antes del
extremo de salida de éste. En
los instrumentos comerciales,
un ordenador se encarga del
control de la instrumentación
y de la adquisición y tratamiento de los datos suministrados por el detector.
Algunas de las principales
características de esta técnica
son:
1. Elevada rapidez de análisis.
Los tiempos de separación
son generalmente de varias
decenas de minutos.
2. Elevada eficacia de separación. En los análisis de
proteínas suelen obtenerse eficacias en torno a los
10.000-100.000 platos teóricos por metro de columna,
dependiendo de la proteína
a analizar y de las condiciones de separación.
3. Pequeños volúmenes de
muestra. En cada separación de utilizan unos pocos (10 – 50) nanolitros de
muestra.
4. La total automatización del
análisis. Los instrumentos
de electroforesis capilar permiten llevar a cabo los análisis sin la constante atención
del operador.
El análisis de proteínas por
electroforesis capilar se puede
llevar a cabo utilizando tres
modos diferentes: electroforesis
capilar en zona libre, electroforesis capilar en geles e isoelectroenfoque capilar, que respectivamente permiten realizar la
separación de las proteínas en
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base a sus diferencias en carga
eléctrica, en tamaño molecular
y en punto isoeléctrico.
Separación de proteínas en
zona libre
En este modo de separación, el
capilar contiene sólo un tampón que permite fijar el pH
del medio de separación y, por
tanto, la carga eléctrica global
de las proteínas. Al aplicar el
campo eléctrico, cada proteína se moverá a una velocidad
diferente dependiendo de su
carga global.
La Figura 2 esquematiza los
fenómenos que ocurren en el
interior del capilar durante la
separación. Las proteínas, en el
ejemplo una con carga global
positiva y otra con carga global
negativa, se mueven debido a
dos fenómenos que tiene lugar
simultáneamente: 1) el desplazamiento que sufre la proteína
debido al campo eléctrico, y
que depende de una propiedad
de la proteína que se denomina
movilidad electroforética, y 2) al
desplazamiento global del tampón en el interior del capilar,
el denominado flujo electroosmótico, que puede expresarse
cuantitativamente mediante la
movilidad electroosmótica. El
flujo electroosmótico se origina
Figura 2. Fenómenos que ocurren en el interior del capilar durante la separación y controlan
el desplazamiento de las proteínas. El círculo con signo + representa una proteína con carga
eléctrica global positiva y el círculo con signo –, una con carga eléctrica global negativa. µ ef
representa la movilidad electroforética de la proteína y µ representa la movilidad electroosmótica del tampón. Se esquematizan también la superficie interna del capilar, con sus cargas
negativas, y la doble capa eléctrica formada sobre esta superficie interna.
como consecuencia de la interacción entre los cationes del
tampón de separación y los iones negativos que existen en la
superficie interna del capilar de
sílice fundida en contacto con
el tampón, lo que origina una
ligera acumulación de cationes
en la zona próxima a la pared
del capilar (doble capa eléctrica). En presencia de campo
eléctrico, este exceso de cationes es atraído hacia el cátodo y
arrastran con ellos a las moléculas de agua que los solvatan,
originando el desplazamiento
de todo el líquido contenido
en el capilar hacia el cátodo.
La velocidad y el sentido del
desplazamiento efectivo de las
proteínas vienen determinados
por la movilidad aparente de
éstas, que es la suma algebraica
de la movilidad electroforética
y la movilidad electroosmótica.
En la separación de proteínas,
la movilidad electroforética de
éstas es generalmente mayor
que la movilidad electroosmítica del medio de separación, por
lo que la velocidad de desplazamiento de las proteínas se verá
considerablemente
afectada
(incrementada o disminuida)
por la movilidad electroosmótica del tampón.
Durante la separación de
proteínas en zona libre, si no
se toman precauciones especiales, éstas pueden adsorberse sobre la pared interior del
capilar, lo que conduce a una
Figura 3. Electroforegrama del patrón europeo (PBR lote 3) para eritropoyetina. Condiciones analíticas: capilar de sílice fundida no recubierto,
longitud 100 cm, d.i. 50 µm; tampón de separación: 0,01 M tricina, 0,01 M acetato sódico, 7 M urea y 2,5 mM 1,4-diamino butano; temperatura separación 25ºC; voltaje de separación 15 kV; detección UV 214 nm. (Tomada de prospecto de la EDQM para eritropoyetina lote 3, con
autorización).
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mala separación de los componentes de la muestra, falta
de repetibilidad en los análisis
y bajas recuperaciones. Esta
adsorción se debe a la interacción de las cargas negativas en la superficie del capilar
con los aminoácidos cargados
positivamente de la cadena
polipeptídica de la proteína.
Se han desarrollado diferentes estrategias para evitar esta
adsorción. Uno de los procedimientos más efectivos es la
adición al tampón de separación de sustancias orgánicas
cargadas positivamente que
puedan fijarse sobre la pared
del capilar impidiendo la adsorción de las proteínas. Las
aminas catiónicas divalentes,
tales como 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano o
1,3-diaminopropano, se emplean en múltiples métodos de
separación de proteínas para
conseguir buenas separaciones. Así por ejemplo, utilizando un tampón de separación
conteniendo entre otros componentes 1,4-diaminobutano,
se ha conseguido la separación
de diferentes isoformas de
eritropoyetina recombinante
(rh-EPO) (Figura 3) [1] en un
método aprobado por la Farmacopea Europea como parte
del ensayo de identificación de
esta proteína biofarmacéutca.
Este tipo de aditivos ha sido
también utilizado en el análisis
otras proteínas recombinantes tales como el Factor VIIa
[2]
y el factor estimulante de
las colonias de granulocitos
(rh-GCSF) [3]. Algunos polímeros hidrófilos, tales como
polibreno [4] o derivados de
poliacrilamida [5], se han utilizado también como aditivos
al tampón para separación de
rhEPO [6,7] en medios de separación que permiten el acoplamiento de la electroforesis capilar con la espectrometría de
masas. Además de la elevada
eficacia y resolución que estas
sustancias proporcionan en la
separación de proteínas, los
FARMESPAÑA INDUSTRIAL
métodos electroforéticos que
los emplean tienen la ventaja
de la facilidad de su puesta a
punto, ya que basta con disolver estos aditivos en el tampón
de separación para disminuir
la adsorción de las proteínas
durante el análisis.
Separación de proteínas por
tamaño molecular
Este modo de electroforesis capilar está sustituyendo a algunos métodos de dodecil sulfato
sódico–electroforesis en geles
de poliacrilamida (SDS-PAGE) en muchos laboratorios
para el control de calidad de
productos biofarmacéuticos.
Los tampones de separación
utilizados hoy en día en este
modo de electroforesis capilar
contienen, además de las sustancias para control de pH, un
polímero hidrófilo, tal como
polivinil alcohol, óxido de polietileno o diferentes derivados
de celulosa. La función de este
polímero es la formación de
redes poliméricas que, debido
a las interacciones de las cadenas del polímero en solución,
permiten la separación de proteínas por tamaño.
Para la preparación de este
medio basta con disolver el
polímero a una determinada
concentración en el tampón.
Esto facilita enormemente
el desarrollo de los métodos
analíticos y la repetibilidad del
análisis, ya que el medio de separación puede ser regenerado
dentro del capilar después de
cada análisis.
Este modo de separación
requiere, en la mayoría de los
casos, el uso de capilares recubiertos interiormente con un
polímero unido a la pared del
capilar de forma permanente (unión covalente). De esta
forma, se disminuye o anula el
flujo electroosmótico del capilar y se mejora la resolución de
las proteínas.
Al igual que en las técnicas
de SDS-PAGE, las proteínas
deben estar complejadas con
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Figura 4. Separación por tamaño molecular de muestras de un anticuerpo monoclonal reducido, alquilado con diferentes agentes de alquilación
y derivatizado con una sustancia fluorescente. NGHC cadena pesada no glicosilada, LC cadena ligera, HC cadena pesada; IAA acido iodoacético,
IAM iodoacetamida. Condiciones analíticas: capilares de sílice fundida no recubiertos, longitud 30 cm, d.i. 50 mm; tampón de separación:
Bio-Rad SDS; temperatura de separación 20ºC; voltaje de separación 18 kV; detección por fluorescencia inducida por láser: argón ionizado 3,5
mW, excitación 488 nm, emisión 560 nm (Tomada de O. Salas-Solano, B. Tomlinson, S. Du, M. Parker, A. Strahan, S. Ma, Anal. Chem. 78 (2006)
6583, con autorización) © 2006 American Chemical Society.
un tensioactivo. Para ello,
es necesario desnaturalizar
previamente las proteínas calendándolas (normalmente a
90ºC durante 5 min) en una
solución de un agente reductor
de puentes disulfuro (mercaptoetanol o ditiotreitol son usados frecuentemente).
El tensioactivo más empleado en este modo de separación es el SDS, que confiere a
todas las proteínas la misma
relación carga/masa independientemente de la longitud de
su cadena polipeptídica. Este
modo de electroforesis capilar,
además de su uso para obtener información sobre la masa
molecular de las proteínas [8],
ha sido empleado para el análisis de bajas concentraciones
de cadenas pesadas desglicosiladas (Figura 4) y otras alteraciones sufridas por los anticuerpos monoclonales durante
su producción por métodos
recombinantes [9]. Un estudio
colaborativo ha demostrado
la utilidad de un método comercial de electrofororesis capilar basado en este modo de
separación para el control de
calidad de anticuerpos monoclonales recombinantes [10]. Un
método de electroforesis capilar que termite separar las proteínas por tamaño en tiempos
de análisis muy cortos (menos
de 5 min), ha sido desarrollado
para el control de procesos en
el cultivo de hibridomas y en la
purificación de los anticuerpos
obtenidos [11].
Separación de proteínas por
punto isoeléctrico
Las técnicas de isolectroenfoque en geles de poliacrilamida
son técnicas de separación clásicas ampliamente empleadas
en los laboratorios de control
de calidad del sector biofarmaceútico para caracterizar
proteínas. En estas técnicas se
lleva cabo la separación de las
proteínas en función de su punto isoeléctrico en un gradiente
de pH formado a lo largo del
gel por medio de anfolitos.
La separación de proteínas
por punto isoeléctrico se puede realizar también en formato
capilar. El modo de isoelectroenfoque capilar combina
las ventajas del alto poder de
resolución del isoelectroenfoque en geles con la velocidad,
eficacia y automatización de
la electroforesis capilar. En
isoelectroenfoque capilar las
proteínas se separan también
en un gradiente de pH formado por los anfolitos en el interior del capilar.
Los anfolitos son sustancias
anfóteras (generalmente ácidos
poliaminocarboxílicos)
que bajo la acción del campo
eléctrico son capaces de distribuirse a lo largo del capilar,
estableciendo un gradiente de
pH en su interior. En este gradiente de pH, las proteínas de
la muestra migran hasta que
alcanzan una región del capilar en la que el pH es igual a su
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pI. En este punto, las proteínas
adquieren carga cero y dejan
de moverse bajo la acción del
campo eléctrico. A este fenómeno se le denomina enfoque
de las proteínas. Cada proteína se enfoca, por tanto, en un
punto distinto del capilar.
Las separaciones se llevan a
cabo generalmente en capilares con la pared interior recubierta con un polímero unido
a ella de forma covalente. De
esta manera se disminuye o se
suprime el flujo electroosmótico que podría dificultar el enfoque de las proteínas.
Para llevar a cabo la separación se llena el capilar con una
mezcla compuesta por los anfolitos, una solución de un polímero hidrófilo y la muestra.
El vial que se conecta al ánodo
de la fuente de alto voltaje contiene una solución diluida de
un ácido (generalmente ácido
fosfórico) y el que se conecta
al cátodo, una solución diluida de una base (habitualmente
hidróxido sódico). Al aplicar
el campo eléctrico, se produce
la migración de las proteínas
hasta que se inmovilizan en su
punto de enfoque.
Para detectar las proteínas,
una vez que éstas se han inmovilizado, es necesario desplazarlas al punto de la columna
donde se encuentra el detector
(movilización). Existen varios
procedimientos para llevar a
cabo esta movilización. El procedimiento más simple es aplicar una ligera sobrepresión de
gas en el vial situado en el lado
opuesto al detector mientras
se mantiene conectado el campo eléctrico en el capilar para
evitar el ensanchamiento de
las bandas de las proteínas una
vez que éstas se han enfocado.
El isoelectroenfoque capilar como técnica de caracterización, control de procesos
y control de calidad, no están
todavía ampliamente introducidas en la industria biofarmacéutica. Esta situación
puede cambiar con la comer68
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cialización creciente de los
anticuerpos
monoclonales.
Durante la producción y almacenamiento de éstos, pueden
sufrir alteraciones tales como
desamidación, variaciones en
la lisina C-terminal y alteraciones en la glicosilación, que
pueden conducir a cambios
en la carga eléctrica global de
las diferentes isoformas de los
anticuerpos, modificando su
actividad. Es necesario, por
tanto, un cuidadoso seguimiento de estas alteraciones
y el isoelentroenfoque capilar
es una técnica adecuada para
ello. Un reciente estudio colaborativo [12], llevado a cabo en
doce laboratorios utilizando
diferentes lotes de anfolitos y
diferentes instrumentos, ha
puesto de manifiesto que el
valor del pI de cada una de
las variantes de carga eléctrica
pudo determinarse con buena
precisión (RSD ≤ 0.5%) entre
laboratorio, y que la precisión
en el porcentaje de área de picos de las diferentes variantes
también fue aceptable (RSD ≤
4%). Estos resultados muestran que el isoelectroenfoque
capilar puede ser una técnica
analítica valida en el control
de calidad de los anticuerpos
monoclonales.
Detección de proteínas en
electroforesis capilar
El detector más empleado en
electroforesis capilar es el basado en la absorción de luz
ultravioleta por la muestra
(detectores de UV). La detección se lleva a cabo en el
propio capilar de separación,
evitando así el ensanchamiento de la banda de las proteínas
durante su monitorización. En
el detector de UV más simple,
la luz producida por una lámpara de deuterio, después de
pasar por un filtro óptico o un
monocromador, es colimada a
través del diámetro interno del
capilar. Al otro lado de éste, un
fotosensor mide la cantidad de
luz que deja pasar la muestra.
Puesto que el diámetro interno del capilar es muy pequeño
(10 – 75 µm) el camino óptico a través de la muestra será
muy corto y el límite de detección será 10-20 veces peor que
el que se tiene con este mismo
tipo de detector en otras técnicas de separación, tal como la
HPLC. En electroforesis capilar con detectores UV, el límite
de detección para las proteínas
es del orden de 10-6 M.
Cuando se necesita un mejor
límite de detección, se puede
emplear el detector de fluorescencia. Este tipo de detector
utiliza la luz de un láser, habitualmente con emisión en la
región visible del espectro, o
de un diodo electroluminiscente (LED) para excitar la
fluorescencia de la muestra en
el propio capilar de separación.
La fluorescencia emitida por la
muestra es colectada utilizando
un sistema óptico y medida con
ayuda de un fotomultiplicador
o un diodo de avalancha.
Muy pocas proteínas pueden
producir fluorescencia al ser
excitada con luz visible. Por eso
se recurre frecuentemente a la
derivatización de las proteínas
con una sustancia fluorescente para conseguir detectarlas
cuando su contenido en la
muestra es bajo (< 10-6 M).
La derivatización de las proteínas contenidas en la muestra
a éstas concentraciones, como
es el caso de muchas muestras
biológicas, no es sencilla de llevar a cabo, debido a la formación de múltiples derivados de
las proteínas con la sustancia
fluorescente y por la lenta velocidad de reacción de éstas a
bajas concentraciones. En algunos casos, la derivatización de
la muestra en el interior del capilar de separación (derivatización en-capilar) puede dar buenos resultados [13]. Utilizando
esta técnica de derivatización
se pueden detectar algunas proteínas que se encuentran a una
concentración de 10-11-10-12 M
en la muestra [13].
Conclusiones
En este artículo se han presentado brevemente los modos de
electroforesis capilar que pueden ser aplicables a la separación de proteínas. Los ejemplos presentados muestran que
la electroforesis capilar tiene
interés en el control de procesos y en el control de calidad
en la fabricación de proteínas
con aplicaciones biofarmacéuticas.
Agradecimientos
El autor agradece al MINECO
por la ayuda económica (Proyecto CTQ2009-09399) y a R.
Garrido-Medina por ceder la
Figura 1 para este trabajo Referencias
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