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PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria Javier Raso Food Technology University of Zaragoza jraso@unizar.es PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria TECNOLOGÍAS EMERGENTES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA o Aplicaciones o Limitaciones PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: FUNDAMENTOS PROCESOS COMBINADOS CON TECNOLOGÍAS EMERGENTES oAltas Presiones Hidrostáticas oPulsos Eléctricos de Alto Voltaje CONCLUSIONES Demandas de los consumidores que influyen en el desarrollo de tecnologías emergentes de procesado •Elevada calidad sensorial y nutritiva •Más adecuados a sus nuevos hábitos •Frescos •Naturales •Saludables •Seguros Buscando el “Método Ideal” de Conservación de los Alimentos • Garantizar la estabilidad y seguridad de los alimentos mediante la inactivación enzimática y microbiana • Mantener las características nutritivas y sensoriales • No residuos ni generación de sustancias tóxicas • Barato y fácil de aplicar • No objeciones de los consumidores ni de los legisladores Desnaturalización protéica Pardeamiento no enzimático Pérdida de vitaminas Pérdida de componetes aromáticos Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Irradiación (IR) Luz Ultravioleta (UV) Altas Presiones Hidrostáticas(HHP) Ultrasonidos (US) Pulsos Eléctricos Alto Voltaje (PEF) Mejora calidad de los alimentos Reducción costes energéticos Nuevos productos Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Algunos agentes de alteración de los alimentos son bastante resistentes a estas tecnologías •Esporos bacterianos •Enzimas Tratamientos necesarios para garantizar la estabilidad y seguridad de los alimentos son demasiado intensos •No pueden aplicarse a escala industrial •Pueden modificar las propiedades de los alimentos Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados • Aplicación de diferentes métodos de conservación con objeto de reducir su intensidad, manteniendo o mejorar el efecto conservador obtenido y evitando los efectos adversos sobre las propiedades de los alimentos Sucesivamente (Pasterización de la leche) Simultáneamente (Altas presiones y calor) Simultánea y sucesivamente (Acidificación de conservas vegetales) Nonthermal Processing Technologies Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Homeostasis microbiana Métodos de conser vación Respuesta homeostática Reducción de la actividad microbiana - Bajas temperaturas: Refrigeración Congelación Síntesis de ácidos gr asos insatur ados Síntesis de pr oteínas Síntesis de solutos compatibles - Descenso de la aw Síntesis de solutos compatibles - Fermentación/acidificación Eliminación de pr otones - Conservantes químicos Síntesis de de pr oteínas del choque ácido - Atmósferas modificadas Inactivación de microorganismos - Calor Síntesis de de pr oteínas del choque tér mico Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Mecanismo de acción Disfunciones fisiológicas Modificaciones estructurales Destrucción membrana Altas Presiones Homogeneización Altas Presiones Ultrasonidos Irradiation Pulsos eléctricos Alteracion en el ADN Alteración en Agregación Proteíca los ribosomas Modifición permeabilidad membrana Inactivación enzimas metabólicos Tecnologías no-térmicas de conservación de los alimentos Daño subletal Celulas vivas Se multiplican en medios de cultivo selectivos y no selectivos Celulas muertas Celulas dañadas No se multiplican en medios de cultivo selectivos y no selectivos Se multiplican en medios de cultivo no selectivos pero no en medios selectivos 106 supervivientes Medio no selectivo Medio selectivo 105 104 103 Tiempo Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Tratamiento individual Efecto aditivo Tratamiento individual Tratamiento combinado Tratamiento individual Tratamiento individual Tratamiento combinado Efecto sinérgico Tratamiento individual Tratamiento individual Tratamiento combinado Efecto antagónico Efecto conservante Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados • Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación • Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva • Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Mecanismos de acción Protein aggregation E. coli stationary phase 200 MPa 8 min Fluorescent dye: Fluorescein isothiocyanate (FICT) Protein staining DNA alterations E. coli stationary phase 200 MPa 8 min Fluorescent dye: 4´,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA staining Mañas and Mackey, 2004, AEM, 70: 1545. Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados • Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación • Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva • Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Microbiología Predictiva Inactivación de L. monocytogenes 5672 por PEF a distintas temperaturas en presencia de nisina 0 nisina -EXPERT Plot DESIGN-EXPERT Plot Response 1 X = A: ph Y = B: T Actual Factor C: nisina = 100.00 cycles of inactivation LogLog cycles of inactivation Response 1 3.43126 2.42034 1.40942 0.398504 -0 . 6 1 2 4 1 5 3.94957 Actual Factor C: nisina = 200.00 3.06273 2.17589 1.28904 0.402203 1 LogResponse cycles of inactivation Response 1 X = A: ph Y = B: T Logcycles cycles inactivation Response 1 Log ofofinactivation 200 ppm nisina DESIGN-EXPERT Plot se 1 h actor a = 0.00 100 ppm nisina 4.16063 3.06159 1.96255 0.863516 -0 . 2 3 5 5 2 3 3.50 3.50 50.00 50.00 50.00 4.38 38.50 38.50 4.38 38.50 5.25 27.00 5.25 pH A: ph pH 3.50 4.38 27.00 6.13 15.50 7.00 4.00 Temperature B: T Temperature pH A: ph pH pH 5.25 27.00 6.13 15.50 7.00 4.00 B: T Temperature Temperature A: ph pH 6.13 15.50 B: T Temperature 7.00 4.00 Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados • Mejor conocimiento de los mecanismos de acción de los métodos de conservación • Desarrollo experimentado por la microbiología predictiva • Posibilidades que ofrece la conservación de los alimentos por procesos combinados para superar algunas de las limitaciones que presentan las tecnologías emergentes de conservación Conservación de los Alimentos por Procesos Combinados Altas Presiones Pulsos Eléctricos Temperaturas Moderadas Refrigeración Simultáneamente Simultáneamente Sucesivamente Sucesivamente Simultáneamente Ultrasonidos Irradiación Simultáneamente Simultáneamente Sucesivamente Sucesivamente Sucesivamente Sucesivamente Atmósferas modificadas Acidificación Antimicrobianos Sucesivamente Sucesivamente Simultáneamente Simultáneamente Sucesivamente Sucesivamente Simultáneamente Simultáneamente Simultáneamente Sucesivamente Irradiación Descenso aw Altas Presiones Simultáneamente Sucesivamente Simultáneamente Simultáneamente Simultáneamente Sucesivamente Simultáneamente Simultáneamente Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas •Aplicación al alimento de presiones hidrostáticas comprendidas en el rango de 100 a 1000 MPa durante un periodo de tiempo (1-30 min) MPa 0,03 0.1 100 1000 36000 Objetivos •Incrementar el efecto inactivador de las altas presiones •Conseguir el mismo efecto inactivador con una menor presión o con un menor tiempo de tratamiento •Inhibir o retrasar la multiplicación de microorganismos supervivientes al tratamiento los Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor Log supervivientes 6 5 4 3 2 1 10 20 30 40 Temperatura (ºC) 50 60 Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor Combinaciones de altas presiones hidrostáticas y calor que permiten obtener una inactivación de ≥ 6 ciclos logarítmicos Microorganismo Serratia liquefaciens a Leuconostocmesenteroides Lactobacillus sake a a Escherichia coli O157:H7 a Medio Presión ( MPa) Temperatura Tiempo (ºC) (min) 0,l % peptona 207 50 5 0,l % peptona 138 50 5 0,l % peptona 345 50 15 0,l % peptona 207 50 10 Salmonella typhimurium a 0,l % peptona 207 50 5 Listeria monocytogenes a 0,l % peptona 207 50 5 Leche UHT 500 50 15 Carne de pollo 400 50 15 Staphylococcusaureus b Escherichia coli O157:H7 b Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor 8 7 6 5 4 3 2 1 0 •(Alpas et al. 1999. Appl. Environ. Microbiol.), 345 MPa, 5 min, 50ºC Ciclos logar ítmicos de inactivación Ciclos logar ítmicos de inactivación 345 MPa, 5 min, 25ºC 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y calor Mbr plamática y pared celular Mbr externas Germinación Protoplasto Inactivación Esporo germinado Cortex Esporo latente Esporo inactivado Germinación 1x10 8 l 1x10 7 l l l 1x10 6 l 5 1x10 l l 1x10 4 1x10 3 l 1x10 2 l 1x10 1 1x10 0 l l 0 l 20 ºC l 30 ºC l l 2 4 l 6 8 10 12 14 16 Tiempo (min) Inactivación 690 MPa 60 ºC Supervivientes (UFC/ml) Esporos sin germinar (UFC/ml) Bacillus cereus 1x10 8 lllll l 1x10 7 l l l l 1x10 6 1x10 5 l 1x10 4 l 1x10 3 l l 1x10 2 l 1x10 1 l 1x10 0 0 l 5 10 15 20 25 Tiempo (min) 30 Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y antimicrobianos •Lisozima • Nisina Peptidoglicano de la pared celular Membrana citoplasmática Gram - Gram + Par ed celular Membr ana exter na Par ed celular Membr ana citoplasmática Membr ana citoplasmática Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y antimicrobianos Escherichia coli AP: 270 MPa, 15 min, 25 °C N: Nisina (100 UI/ml) L: Lisozima (10 µg/ml) 7 6 Lisozima 5 Nisina 4 3 Membrana externa 2 Pared celular 1 Membrana citoplasmática 0 AP AP+N AP + L AP+N+L Combinaciones con Altas Presiones Hidrostáticas Altas presiones hidrostáticas y bajas temperaturas Objetivos •Inhibir la actividad enzimática y el crecimiento de los microorganismos supervivientes al tratamiento •Mantener las propiedades sensoriales del alimento tras el tratamiento Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje citoplasma Membrana citoplasmátia Medio Externo •Aplicación de pulsos de alto voltaje (kV) y corta duración (µs) a un material biológico colocado entre dos electrodos Electroporación Reversible - Transformación de células Introducción de sondas moleculares Introducción de medicamentos Irreversible - Inactivación microbiana Mejora transferencia de masa Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Mecanismo de inactivación -Captación colorantes fluorescentes -Salida de material intracelular (260-280 nm) -Pérdida de la capacidad de plasmólisis en medio hipertónico -Liberación de ATP E Electroporación Outer membrane Cell wall Gr am + bacter ia Cytoplasmatic membrane Gr am - bacter ia Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Microorganismo vivo Microorganismo inactivado REVERSIBLE Microorganismo dañado Membrana citoplasmática Microorganismo vivo reparación Microorganismo inactivado No reparación Membrana externa Cortex Esporo bacter iano PERMANENTE Microorganismo inactivado Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Pasteurización por PEF: definición Tratamiento de pulsos electricos de alto voltaje que aplicado a un alimento reduce las células vegetativas de los microroganismos patógenos hasta un nivel que no presenta riesgo para la salud del consumidor durante la distribución y almacenamiento del producto Requerimientos Identificar los microorganismos patógenos más resistentes a los PEF Establecer las condiciones de tratamiento por PEF que reduzcan la población de los microorganimos patógenos a un nivel que no supongan un riesgo para la salud Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Factores que afectan la inactivación microbiana por PEF Parámetros de procesado Características del medio de tratamiento Características de los microorganismos •Especie y cepa •Intensidad campo eléctrico •pH •Tamaño y morfología •Tiempo de tratamiento •Actividad de agua •Temperatura •Composición •Forma del pulso •Conductividad •Condiciones de crecimiento •Fase de crecimiento •Temperatura de crecimiento •Medio de crecimiento •Frecuencia •Energía específica •Condiciones de recuperación •Medio de recuperación •Temperatura de recuperación •Tiempo de recuperación Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Identificación de las cepas más resistentes a los PEF pH 4,0 5 4465 BJ4L1 471 4466 E. coli O157:H7 443 3 BJ4L1 932 976 4459 4032 5366 4031 4630 4465 722 976 878 4590 880 4 30 kV/cm, 100 µs pH7,0 880 443 BJ4 4466 878 L. monocytogenes 5672 4590 4630 722 Salmonella Typhimurium 878 4459 W3110 S. aureus 4459 2 O 157:H 7 BJ4 1 5672 932 5366 471 4032 O157:H7 0 W3110 5672 4031 Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Identificación de las cepas más resistentes a los PEF -4 -6 -2 -4 -6 S. typhimurium -2 -4 -6 500 100015002000 Time (µs) 0 500 1000 1500 Time (µs) -2 -3 -4 -5 -6 0 0 250 500 750 1000 500 100015002000 Time (µs) Time (µs) S. senftenberg Y. enterocolitica 0 0 -2 -4 -6 -2 -4 -6 0 500 1000 1500 Time (µs) -2 -4 -6 -8 -8 -8 -8 -8 -4 0 Log10 Nt/N0 Log10 Nt/N0 Log10 Nt/N0 -6 -3 S. enteritidis 0 -4 -2 Time (µs) 0 -2 -1 500 100015002000 Time (µs) E. coli -1 -6 0 500 100015002000 0 Log10 Nt/N0 0 0 -5 -8 -8 S. cerevisiae 11034 Log10 Nt/N0 Log10 Nt/N0 Log10 Nt/N0 -2 Log10 Nt/N0 0 0 0 S. cerevisiae 1172 L. monocytogenes Log10 Nt/N0 E. faecium 0 500 100015002000 0 500 100015002000 Time (µs) 2.5 kV/cm (), 4 kV/cm (), 5.5 kV/cm (), 9 kV/cm (), 12 kV/cm (), 15 kV/cm (▲), 19 kV/cm (), 22 kV/cm (), 25 kV/cm () y 28 kV/cm () Time (µs) Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Modelos Predictivos Y = α X1 + β X2+ δ X3 + λ X4 +.......... •Establecer las condiciones de tratamiento que permitan obtener alimentos seguros y estables. •Establecer los requerimientos de los equipos para poder aplicar los tratamientos a escala comercial •Realizar análisis de costes Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Definición de las condiciones de tratamiento Ciclos logarítmicos inactivación 100 µs; tª 20-30ºC pH 3,5 4 3 2 1 E. coli O157:H7 L. monocytogenes 5672 0 15 25 30 20 Intensida de campo eléctrico (kV/cm) 35 pH 4,5 4 3 2 1 0 15 Salmonella Typhimurium 878 25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm) 35 5 S. aureus 4459 5 pH 5,5 pH 7,0 Ciclos logarítmicos inactivación Ciclos logarítmicos inactivación Ciclos logarítmicos inactivación 5 5 4 3 2 1 4 3 2 1 0 0 15 15 25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm) 35 25 30 20 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm) 35 Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Definición de las condiciones de tratamiento 100 µs; tª 20-30ºC pH 3,5 Log cycles of inactivation 4 3 2 1 0 E. coli O157:H7 pH 4,5 4 3 2 1 Applicación de PEF a temperaturas moderadas L. monocytogenes 5672 15 25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm) 35 15 Salmonella Typhimurium 878 25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm) 35 5 pH 7,0 Ciclos logarítmicos inactivación pH 5,5 4 3 0 S. aureus 4459 5 Log cycles of inactivation Ciclos logarítmicos inactivación 5 5 4 Combinación de PEF con antimicrobianos 2 1 3 2 1 0 0 15 15 25 30 20 Electric Field Strength (kV/cm) 35 25 30 20 Electric Field Strenght (kV/cm) 35 Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con temperaturas moderadas Escherichia coli O157:H7 ZumoApple de manzana juice -2 30ºC -3 35ºC -4 40ºC 45ºC -5 -6 0 25 50 Time (µs) Tiempo (µs) 75 100 20ºC 30ºC 35ºC -1 -2 -3 -4 40ºC -5 45ºC 10 20ºC -1 Log cycles inactivation Ciclos logarítmicos inactivación 0 0 10 CiclosLog logarítmicos inactivación cycles inactivation pH 3.5 30 kV/cm -6 0 25 50 Time (µs) Tiempo (µs) 75 100 Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con antimicrobianos PEF: 30 kV/cm, 100 µs Nisina: 100 ppm Temperatura: 4-50ºC Nisina 30 kV/cm, 100 μs Combinaciones con Pulsos Electricos de Alto Voltaje Combinaciones con antimicrobianos PEF: 30 kV/cm, 100 µs LAE: 50 ppm Temperatura: 4-50ºC Etil lauroil arginato (LAE) Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Tratamiento en flujo continuo Cámara de tratamiento estática E. coli O157:H7 en zumo de naranja Intensidad de campo eléctrico: 20, 25, 30 kV/cm Tiempo de tratamiento: 0-140 µs Anchura de pulso: 3 μs Energía específica: 80-180 KJ/kg Temperatura de entrada: 20, 30, 40ºC Temperatura de salida: 50, 55, 60ºC Tiempo de residencia: 0.8 sec Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Tratamiento en flujo continuo 20 kV/cm 25 kV/cm 30 kV/cm -1 -2 -3 -4 55ºC (163 kJ/kg) 54 ºC (180 kJ/kg) 56ºC (179 kJ/kg ) -5 -6 -7 0 100 50 150 Tin 30ºC 0 -1 -2 -3 55 ºC (134 kJ/kg) 56ºC (131kJ/kg) 55ºC (126 kJ/kg) -4 -5 -6 -7 0 50 100 150 Ciclos logarítmicos de inactivación Tin 20ºC 0 Ciclos logarítmicos de inactivación Ciclos logarítmicos de inactivación E. coli O157:H7 en zumo de manzana Tin 40ºC 0 -1 -2 54ºC (90 kJ/kg) -3 56ºC (94 kJ/kg) 55ºC (88 kJ/kg) -4 -5 -6 -7 0 Tiempo de tratamiento (µs) Tiempo de tratamiento (µs) 50 100 150 Tiempo de tratamiento (µs) E. coli O157:H7 en zumo de manzana + 50 ppm LAE Tin 20ºC -1 -2 -3 -4 -5 188 kJ/kg -6 170 kJ/kg 180 kJ/kg -7 0 100 150 50 Tiempo de tratamiento (µs) 0 -1 Tin 30ºC -2 -3 -4 -5 142 kJ/kg -6 -7 130kJ/kg 150 100 0 133 kJ/kg50 Tiempo de tratamiento (µs) Ciclos logarítmicos de inactivación 0 Ciclos logarítmicos de inactivación Ciclos logarítmicos de inactivación in 20 kV/cm 25 kV/cm 30 kV/cm 0 Tin 35ºC -1 -2 -3 -4 -5 85 kJ/kg -6 72 kJ/kg 83 kJ/kg -7 0 50 100 Tiempo de tratamiento (µs) 150 Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Optimización Tiempo de tratamiento (µs) 5 log10 ciclos de inactivacíón E. coli O157:H7 in zumo de manzana + 50 ppm LAE 100 80 60 20 kV/cm, 50 µs 20ºC 25ºC 30ºC 35ºC 40 20 25 kV/cm, 30 µs 0 20 22 24 Energía específica (kJ/kg) 120 30 kV/cm, 20 µs 26 28 30 Intensidad de campo eléctrico (kV/cm) Intensidad de campo eléctrico (kV/cm) Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Validación 25 kV/cm; Temperatura de entrada 35ºC Zumo de manzana + 50 ppm LAE Temperatura de salida: 50ºC 25 kV/cm, 38 µs 8 7 Log 10 inactivación Log 10 inactivación 5 4 3 2 1 0 EC ST SA LM EC ST SA LM Temperatura de salida: 65ºC Temperatura de salida: 60ºC Temperatura de salida: 55ºC 6 25 kV/cm, 63 µs 25 kV/cm, 50 µs 8 8 7 7 6 6 Log 10 inactivación 25 kV/cm, 30 µs Zumo de manzana 5 4 3 5 4 3 2 2 1 1 0 0 EC ST SA LM EC: E. coli O157:H7 SA: S. aureus 4459 ST: Salmonella Typhimurium 878 LM: L. monocytogenes 5672 EC ST SA LM Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje Condiciones de tratamiento para pasteurización por PEF Zumo de manzana Zumo de manzana + LAE Intensidad campo eléctrico 25 kV/cm 25 kV/cm Temperatura entrada 35ºC 35ºC Tiempo de tratamiento 63 µs 38 µs Temperatura de salida 65ºC Energía específica 125 kJ/kg 55ºC 83 kJ/kg Tiempo de residencia 0.8 sec 0.8 sec Combinaciones con Pulsos Eléctricos de Alto Voltaje CONCLUSIONES PROCESOS COMBINADOS DE CONSERVACIÓN: Una estrategia para la implantación de tecnologías emergentes en la industria alimentaria •Prolongar el tiempo de conservación y la calidad sanitaria de los alimentos refrigerados •Desarrollo de nuevos productos 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food and Environmental Technologies September 6-10, 2015 Portoroz, Slovenia ...we will all be there.