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Práctica de laboratorio N° 2
Preparación de medios de cultivo, aislamiento bacteriano,
métodos de siembra
Docente: Maria Teresa Naranjo T.
Bacterióloga – Especialista en Salud Pública
Objetivos
 Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento bacteriano en
medios de cultivo solido y líquido para la obtención de cultivos puros de bacterias..
 Que el alumno prepare medios de cultivo de uso general, diferencial y selectivo
para el cultivo de diferentes especies de bacterias.
 El alumno conozca los diferentes métodos de siembra.
Introducción
Los medios de cultivo en microbiología
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias
alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se
han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de
cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en
composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación
de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya
que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales
de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo,
la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras
(el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido.
La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría
de las bacterias Gram-positivas).
Desarrollo
1. Recordar principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio
y medios de cultivo de uso común en análisis de microorganismos y normas de
bioseguridad. Aplicación de diversos medios de desinfección y esterilización como son
el calor seco y húmedo. Utilización del mechero para esterilizar asas y material de
vidrio. Utilización de autoclave – calor húmedo para esterilizar medios de cultivo
soluciones y cultivos bacterianos – 15 lbs de presión, 121°C de temperatura y 15’ de
tiempo, requisitos para la destrucción de endosporas que son las estructuras
bacterianas mas resistentes al calor.
2. Preparación de medios:
Agar – Agar: En la balanza de triple brazo pesar 2 grs de agar-agar y disolver en
erlemeyer que contiene 30 ml de agua destilada, colocar en la estufa de calor y
mezclar suavemente hasta que el medio se vea transparente. Envasar en frasco
microbiológico con tapa y llevar al autoclave por 15´. Preparar la caja de petri con 10
ml aproximadamente de agar y dejar solidificar.
Agar Maconckey: En la balanza de triple brazo pesar 2 grs de agar maconckey y
disolver en erlemeyer que contiene 30 ml de agua destilada, colocar en la estufa de
calor y mezclar suavemente hasta que el medio se vea transparente. Envasar en
frasco microbiológico con tapa y llevar al autoclave por 15´. Preparar la caja de petri
con 10 ml aproximadamente de agar y dejar solidificar.
Caldo de Tioglicolato: En la balanza de triple brazo pesar 1.5 grs de caldo de
tioglicolato y disolver en erlemeyer que contiene 30 ml de agua destilada, colocar en la
estufa de calor y mezclar suavemente hasta que el medio se vea transparente.
Preparar los tubos de ensayo con tapa con 10 ml aproximadamente de caldo y llevar
al autoclave por 15´.
3. Selección de muestras a cultivar: mano, garganta, ambiente, mesón
Marcar la caja de petri con agar-agar, la caja de petri con agar maconckey y el tubo
con caldo de tioglicolato, colocar el nombre del alumno y la indicación del tipo de
muestra que se cultivará.
4. Preparar el campo estéril de trabajo y prender mecheros.
Siembra N°1: Tomar un escobillón estéril y humedecerlo con agua destilada, frotar el
mesón con el aplicador y sembrar en estrías por agotamiento, en el agar-agar y agar
maconckey. Desechar el escobillón después de flamearlo. Incubar los medios
Siembra N°2: Tomar otro escobillón estéril y humedecerlo con agua destilada, frotar la
palma de la mano con el escobillón y sembrar en estrías por agotamiento, en el agaragar y agar maconckey, Desechar el escobillón después de flamear. Incubar los
medios
Siembra N° 3: Tomar un escobillón estéril y hacer un frotis directo de garganta,
enfocándose hacia la zona de las amígdalas, hacer siembra en estrías por
agotamiento en agar-agar y agar maconckey, colocar el escobillón en el tubo con
tioglicolato y mezclar, tapar el tubo después de flamear y desechar el escobillón
después de flamear. Incubar los medios.
Siembra N°4: Abrir la caja de petri y pasearla al ambiente con el aire hacia el medio
de cultivo, cerrar la caja. Incubar los medios.
5. Limpiar y esterilizar el campo de trabajo.
.
Realizar observaciones cada 24 horas durante los 5 días siguientes y llevar un cuaderno
de laboratorio con las características del crecimiento
Preguntas
1.
2.
3.
4.
5.
Que es un medio enriquecido para cultivo?
Que es un medio selectivo para cultivo?
Que elementos nutritivos tienen estos medios?
Porque pueden crecer en ellos todo tipo de gérmenes?
Que es el agar y de donde se obtiene?