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Trabajo Practico Nº3:
MANEJO DE MICROSCOPIO – COLORACIONES
Objetivos.
 Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de
microbiología.
 Realizar coloraciones más utilizadas en el laboratorio de microbiología a partir de materiales
biológicos y explicar sus fundamentos.
 Reconocer a través de la observación microscópica la existencia de microorganismos en
diversos materiales biológicos.
 Aprender el manejo del ansa y las distintas técnicas de cultivo en medios sólidos en placa y
medios de identificación en tubo.
Contenidos previos que el alumno deberá conocer:
 Microscopía: tipos de microscopio.
 Morfología y estructura bacteriana.
 Fundamento de las coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.
 Conocer la clasificación y utilidad de los diferentes medios de cultivo.
FUNDAMENTOS TEORICOS
Tamaño y formas bacterianas.
Existen tres formas básicas de bacterias:
 Esféricas (cocos)
 Bastoncitos o cilíndricas (bacilos)
 Helicoidales (espirilos)
Según el plano de división de la célula, los cocos pueden aparecer: de a pares (diplococos), en
cadena (estreptococos), en tétradas y racimos (estafilococos).
Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o tener una longitud de 2 a 10 veces su
diámetro. Sus extremos pueden ser redondeados, cuadrados o agudizados.
Los bastones bacterianos curvos pueden ser pequeños microorganismos en forma de coma
(vibrios) o levemente helicoidales en una sola curvatura, o espiroquetas largas y sinuosas.
La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 µm. La longitud de una
bacteria puede variar considerablemente según el estadio de crecimiento y el medio de cultivo
utilizado.
Técnicas de tinción.
La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras:
 En estado vivo
 Muertas y coloreadas.
Las bacterias en estado vivo son, en general, incoloras y carentes de suficiente contraste con
el agua en la que se encuentran en suspensión como para ser claramente vistas.
Por lo tanto se hace necesario el uso de sustancias químicas coloreadas, llamadas
colorantes, que poseen afinidad por algún componente celular, dando su color a las células. Al teñir
el microorganismo con los colorantes se aumenta el contraste y se hacen más visibles, En
bacteriología, la mayoría de los colorantes son sales en las que uno de los iones es coloreado.
Los colorantes se clasifican en:
 Básicos o catiónicos: el ión coloreado es el positivo (catión). Estos colorantes se
combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente (ácidos
nucleicos, polisacáridos). Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.
 Ácidos o aniónicos: el ión coloreado es el negativo (anión). Estos colorantes se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas).
Ejemplos: eosina, fucsina ácida, rojo Congo.
 Sustancias liposolubles: estos colorantes se combinan con los materiales lipídicos
de la célula, se usan para revelar la localización de gotas o depósitos de grasa.
Ejemplo: negro Sudán.
Algunos colorantes tiñen mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí misma. Esta sustancia se denomina
mordiente. Ejemplo: ácido tánico.
Clasificación de las tinciones.
Existen dos tipos de tinciones:
1. Positivas: Cuando lo que se colorea es el microorganismo a observar. A su vez pueden
ser:
 Simples: cuando se utiliza un único colorante para incrementar el contraste de las células
para la microscopía. Ejemplo: azul de metileno, especialmente útil para detectar bacterias en
muestras naturales, ya que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
 Diferenciales: cundo se utilizan dos o más colorantes y sirve para diferenciar a las
bacterias entre sí por alguna propiedad particular, es decir no todas las células se tiñen igual.
Ejemplo: tinción de Gram. tinción de Acido-alcohol resistencia.
 Estructurales: cuando se utilizan dos o más colorantes para poner de manifiesto una
determinada estructura de la bacteria. Ejemplo: cápsulas, esporas, flagelos.
2. Negativas: Cuando lo que se colorea es el fondo y queda el microorganismo sin teñir.
Se observa el perfil de la célula. La sustancia utilizada es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, ejemplo la
tinta china (suspensión de carbono coloidal).En el microscopio aparecen las células
(bacterias, hongos) transparentes y perfiladas sobre fondo oscuro. La ventaja de este tipo de
tinción, es que la célula no recibe tratamiento físico o químico. Es muy apropiada para
organismos capsulados.
La fijación del extendido antes del teñido y la subsiguiente exposición a una serie de
reactivos, como en las tinciones positivas, ocasiona alguna deformación en la célula, lo que
es menos probable que ocurra en una tinción negativa.
Fijación.
Las células generalmente son tratadas para coagular el citoplasma antes de teñirlas
(fijación). Para bacterias la fijación por calor es lo más corriente, aunque también pueden fijarse
con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes.
ACTIVIDADES A REALIZAR POR EL ALUMNO
1. Observación microscópica:



Reconocimiento de las partes del Microscopio óptico (MO).
Manejo del MO utilizando una muestra sin colorear.
Manejo del MO utilizando una muestra previa coloración.
2. Técnica de examen microscópico directo de muestra sin colorear (en fresco).
Utilidad: Se realiza para la observación de bacterias, hongos y parásitos (morfología y movilidad)
y células (epiteliales, leucocitos y hematíes), de manera de evaluar la calidad de la muestra.
Técnica: Sobre un portaobjetos suspender, en una gota de solución salina, una pequeña cantidad de
la muestra. Colocar un cubreobjetos y examinar al MO con objetivos de 10x y 40x.
3. Coloración de Gram:
Utilidad: Es una tinción diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales de las bacterias,
lo cual depende de la naturaleza química de la pared celular. Tiene importancia taxonómica. El
análisis de los extendidos coloreados revela al mismo tiempo morfología y la reacción al Gram de
las bacterias.
Colorantes: Cristal violeta
Yodo de Gram: cristales de yodo-yoduro de potasio
Decolorante: Acetona-Alcohol etílico
Safranina.
Técnica: *Se hace un frotis delgado del material a estudiar y se deja secar al aire.
*Se fija el material en el portaobjeto pasándolo 3 o 4 veces a través de la llama de un
mechero, de modo que el material no sea lavado durante el procedimiento de tinción.
*Se coloca el frotis sobre un soporte para tinción y se cubre la superficie con solución de
cristal violeta.
*Después de un minuto de exposición al cristal violeta, se lava totalmente con agua
destilada.
*Se cubre el frotis con solución de yodo de gram durante un minuto. Se lava nuevamente
con agua.
*Se sostiene el frotis entre los dedos pulgar e índice y se cubre la superficie con unas
gotas de decolorante de alcohol y acetona hasta que no se desprenda más color violeta.
Habitualmente esto tarda 10 segundos más o menos.
*Se lava con agua corriente y se coloca otra vez el preparado sobre el soporte para
tinción. Se cubre la superficie con la safranina durante un minuto. Se lava con agua corriente.
*Se deja secar al aire en posición vertical.
* Se examina el frotis teñido con aceite de inmersión con objetivo de 100x del MO. Las
bacterias grampositivas se tiñen de color azul oscuro y las gramnegativas se ven de color rojorosado.
4. Coloración de Ziehl-Neelsen.
Utilidad: esta coloración se usa para colorear a las bacterias llamadas ácido-alcohol resistentes, ya
que por la naturaleza química de su pared necesitan de calor o detergentes para que el primer
colorante penetre, como así también resisten la decoloración con solventes orgánicos fuertes.
Colorantes: Carbolfucsina: cristales de fenol, alcohol, fucsina básica.
Decolorante: alcohol-ácido (HCl cc+ alcohol)
Azul de metileno.
Técnica: * Cubrir un frotis seco, fijado por calor, con un pequeño rectángulo de papel de filtro.
*Aplicar 5-7 gotas de carbolfucsina para mojar completamente el papel de filtro.
*Calentar el portaobjeto cubierto con la coloración hasta que se evapore, pero sin dejar
secar. Puede calentarse con un mechero o un hisopo de algodón embebido en alcohol.
*Quitar el papel con una pinza, enjuagar y dejar secar.
*Decolorar con ácido-alcohol hasta que no aparezca colorante en el lavado
(Aproximadamente 2 minutos).
*Agregar el azul de metileno (1 a 2 minutos).
*Enjuagar, escurrir y secar al aire.
* Examinar con objetivo de inmersióm en aceite de 100x en MO. Los bacilos ácido
alcohol resistentes (BAAR) se tiñen de rojo y el fondo de celeste.
Existen también otras coloraciones para los BAAR que las mencionaremos, ellas son: la técnica en
frío de Kinyoun y la del fluorocromo.
Otras tinciones usadas en bacteriología son:
 Azul de metileno: positiva simple
 Giemsa
 tinción de endosporas: positiva estructural
 tinción de cápsulas: negativa
Bibliografía:
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Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de
laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000.
Cap. 5, 25-32.
Koneman y col. Diagnóstico microbiologíco. Ed. Panamericana