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PROGRAMA DE BIOQUIMICA EXPERIMENTAL I: Parte práctica (14 créditos) COORDINADORAS: Elena Bogonez Departamento de Biología Molecular CX-450. Extensión 3505 e-mail: ebogonoz@cbm.uam.es Ana Ruiz Gómez Departamento de Biología Molecular CV-201 Extensión: 2681 e-mail: aruiz@cbm.uam.es ______________________________________________________________________ La Parte Práctica de la asignatura es de 14 créditos (que se completan con 3 créditos de teoría) que se imparten en el primer cuatrimestre en los Laboratorios del Prácticas del Departamento de Biología Molecular en el Edificio de Biológicas. Los 14 créditos prácticos se realizan en horario de tarde. Es necesaria la asistencia a las clases prácticas para aprobar la asignatura, así como la entrega del cuaderno de laboratorio y la realización del examen. PROGRAMA: I. II. Proteínas: Constituye el 55% de la parte práctica de la asignatura: 1. Cromatografía de Filtración Molecular: Preparación de la columna de Sephadex G-100. Calibrado de la columna. Separación de proteínas de una mezcla problema. Regeneración de la columna. 2. Determinación de proteínas y actividades enzimáticas. Método de Bradford. Determinación de la actividad catalasa. Determinación de la presencia de lisozima. 3. Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Preparación del gel de poliacrilamida. Preparación y carga de las muestras. Tinción del gel de proteínas. 4. Transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF. Tinción reversible de proteínas fijadas a filtros de nitrocelulosa y/o PVDF. Detección inmunológica de proteínas. 5. Purificación de la lisozima a partir de clara de huevo. Preparación de la resina de intercambio iónica CM-celulosa y purificación de la lisozima. Ensayo enzimático y determinación de proteínas por la técnica de Lowry. Electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida de las fracciones del proceso de purificación. 6. Fraccionamiento subcelular de hígado de rata. Obtención de las fracciones mitocondrial y citosólica. Determinación de proteínas. 7. Medida de la actividad piruvato quinasa en la fracción citosólica. Efecto de la concentración de sustrato en la velocidad inicial. Regulación de la actividad enzimática por los efectores fructosa 1,6-bisfosfato y L-alanina. 8. Medida de la actividad succinato deshidrogenasa en la fracción mitocondrial. Establecimiento de las condiciones de ensayo en velocidad inicial: tiempo de reacción, concentración de enzima. Efecto de la concentración de sustrato. Inhibición por malonato. DNA: Constituye el 45% de la parte práctica de la asignatura. 1. Aislamiento de DNA genómico de hígado de rata.. Análisis de la muestra obtenida, determinación de la concentración de DNA, electroforesis en geles de agarosa 2. Amplificación del exón 3 de la globina por PCR. Visualización del producto de PCR por geles de agarosa 3. Aislamiento del plásmido pBluescript por el método de lisis alcalina. Crecimiento de bacterias en presencia de amplicilina y purificación del plásmido por minipreps. Determinación de la concentración de DNA por Absorbancia a 260 nm y en geles de agarosa. 4. Clonaje del producto de la PCR en pBluescript. Digestiones del producto de la PCR y del plásmido purificado con la enzima Bam H1. Desfosforilación del plásmido pBluescript. Purificación y cuantificación de los DNAs digeridos. Ligación. Preparación de bacterias competentes. Transformación de bacterias, siembra en placa e identificación de colonias recombinantes. 5. Análisis de los clones recombinantes. Análisis por PCR de colonias. Análisis por minipreps y digestiones de los DNAs recombinantes. Southern-blot.