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Examen A cinética enzimática
1.- Cuando una solución de enzimas se calienta, hay una pérdida progresiva de la actividad catalítica con
respecto al tiempo, debido a la desnaturalización de la enzima. Una alícuota de una solución que de la
enzima Hexocinasa se incubó a 45°C y perdió el 50% de su actividad en 12 minutos; pero cuando otra
alícuota de la misma solución se incubó a 45°C en presencia de una concentración elevada de glucosa o
fructosa, sólo se perdió el 3% de la actividad en 12 minutos. Sugiera porqué se retardó la desnaturalización
térmica de la Hexocinasa, en presencia de uno de sus sustratos.
2.- Con base en la ecuación de Michaelis-Menten conteste las siguientes preguntas:
a) ¿A qué concentración de sustrato podrá una enzima operar a un cuarto de su velocidad máxima (1/4 Vmax),
si cuenta con una kcat de 30.0 s-1 y una Km de 0.0050 M?
b) Determine la fracción de Vmax que se obtendría con las siguientes concentraciones de sustrato [S]: ½ Km, 2
Km y 10 Km.
3.- Una enzima que cataliza la reacción X↔Y se aisló de dos especies bacterianas diferentes. Ambas
enzimas tienen la misma Vmax pero diferentes valores de Km para el sustrato. La enzima A tiene una Km de 2.0
μM, mientras que la enzima B tiene una Km de 0.5 μM. El gráfico representa las cinéticas de reacción llevadas
a cabo con la misma concentración de cada enzima y con [X]= 1 μM. ¿Qué curva representa a la enzima A y
cuál a la enzima B?
4.- Un grupo de investigadores ha descubierto una enzima a la que llamaron Happyasa, que cataliza la
siguiente reacción química:
HAPPY ↔ SAD
Los investigadores comenzaron a caracterizar la enzima.
a) En el primer experimento, con [ET] de 4 nM, encontrado que la Vmax era de 1.6 µM s-1. Con base en este
experimento, ¿cuál es la kcat de la Happyasa?
b) En otro experimento, con [ET] de 1 nm y [HAPPY] de 30 µM, los investigadores encontraron que V0= 300
nM s-1. ¿Cuál es el valor de Km de la Happyasa para el sustrato HAPPY?
c) Una investigación más profunda mostró que la Happyasa purificada y que se había usado para los dos
primeros experimentos, en realidad estaba contaminada con un inhibidor reversible llamado Anger. Cuando
Anger fue removido de la preparación de la Happyasa y se repitieron los dos primeros experimentos, la Vmax
determinada en (a) se incrementó a 4.8 µM s-1, y la Km determinada en (b) es ahora de 15 µM. Calcule la Ki
de Anger y los parámetros cinéticos aparentes.
d) ¿Qué tipo de inhibidor es Anger?
5.- En la conversión de A en D, en la siguiente ruta bioquímica, las enzimas E A, EB y EC tienen los valores de
Km indicados debajo de cada enzima. Si todos los sustratos y productos están a una concentración de 10 -4 M,
¿qué paso será el determinante de la velocidad y por qué?
A
Km
EA
↔
10-2 M
B
EB
↔
10-4 M
C
EC
↔
10-4 M
D
6.- Se midió la cinética de una enzima como función de la concentración de sustrato en presencia y ausencia
del inhibidor (I), a una concentración de 2 mM.
[S] (µM) V0 sin inhibidor (µmol/min) V0 con inhibidor (µmol/min)
3
10.4
4.1
5
14.5
6.4
10
22.5
11.3
30
33.8
22.6
90
40.5
33.8
a) ¿Cuáles son los valores de Vmax y Km en ausencia del inhibidor? ¿Y en su presencia?
b) ¿De qué tipo de inhibición se trata?
c) ¿Cuál es la constante de unión del inhibidor?
d) Cuando [S]= 30 µM y [I]= 2 mM, ¿qué fracción de las moléculas están unidas al sustrato? ¿Y al inhibidor?
7.- Completa la tabla de purificación
8.- De acuerdo a la siguiente tabla predice cuál es la enzima con la mayor afinidad
Enzyme
Acetylcholinesterase
Catalase
Fumarase
Superoxide dismutase
kcat/KM (s-1M-1)
1.6 × 108
4 × 107
1.6 × 108
7 × 109
9.- Se midió la actividad de la LDH utilizando 10 uL de una dilución 2:350 de un extracto que tiene una
concentración de 4.5 mg/mL. El medio de ensayo incluyo piruvato, amortiguador a pH 7.0 y NADH, para un
volumen final con todo y enzima de 800 µL. El coeficiente de absorbitividad molar del NADH es 6220 M-1cm-1.
Usando los siguientes datos calcula la actividad de la enzima en Unidades internacionales (U/mg) y en
Kat/mg.
Tiempo
Absorbancia
(min)
340 nm
0.5
1.114
1
1.006
1.5
0.855
2
0.770
2.5
0.647
3
0.538
3.5
0.422
4
0.336
4.5
0.330
5
0.143