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Agrobiotecnología. Curso 2013
Clase 8: Resistencia a bacterias fitopatógenas
mediante ingeniería genética
Bacterias fitopatógenas
Transparencia 3-22
La adecuada identificación de las especies, subespecies y patovariedades de
bacterias es tema de fundamental importancia para los microbiólogos y fitopatólogos.
En la actualidad, existen herramientas genéticas y moleculares que se suman a la
tradicional caracterización fenotípica de las diferentes bacterias. Entre estas nuevas
técnicas se encuentran la secuenciación de ADN, la hibridación ADN-ADN, el análisis
de isoenzimas y los marcadores moleculares. Además, la adecuada identificación de
las bacterias fitopatógenas resulta de particular interés en el marco de estudios
epidemiológicos y de impacto ambiental o ecología.
Las bacterias fitopatógenas capaces de infectar y desarrollar enfermedades en un
gran número de especies vegetales de importancia económica, pertenecen a un
reducido grupo de géneros (transparencis 4 y 5). Los géneros de bacterias Gramnegativas más estudiados desde el punto de vista de su biología, impacto
fitopatológico y aspectos genético-moleculares son Agrobacterium, Erwinia,
Pseudomonas y Xanthomonas. Estos organismos pueden ser cultivados en el
laboratorio, en medios sencillos de cultivo y pueden inocularse fácilmente en plantas
para realizar estudios de fitopatogenicidad. Las bacterias Gram-positivas, como
Clavibacter, Curtobacterium y Rhodococcus, son más difíciles de manejar en
condiciones controladas.
Erwinia chrysanthemi, E. carotovora, E. amylovora y otras 15 especies mas, son
causantes de pudriciones blandas, por su capacidad para producir grandes cantidades
de enzimas pectolíticas, principalmente liasas pectasas, capaces de macerar tejido
parenquimatoso de un amplio rango de especies.
Las Xanthomonas spp. son bacterias aeróbicas, Gram negativas, que presentan un
único flagelo. La mayoría de las especies de este género produce abundantes
cantidades de polisacáridos extracelulares como el xantano. Este género comprende
20 especies que atacan a más de 350 vegetales. En particular Xanthomonas
axonopodis pv citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos,
enfermedad, que por los daños que produce, ha adquirido una importante
trascendencia socioeconómica en los países productores de cítricos. Por otra parte,
Xanthomonas campestris pv campestris, es el patógeno causante de la pudrición
negra en crucíferas, entre ellas Arabidopsis, y constituye un modelo de interacción
planta-patógeno muy estudiado.
Otros géneros de bacterias fitopatógenas son Agrobacterium, Rhodococcus,
Spiroplasma, Xylella y Streptomyces. Xylella fastidiosa, causante de la clorosis
variegada de los cítricos, fue la primera bacteria fitopatógena cuyo genoma fue
secuenciado totalmente.
La transparecia 6 muestra las top 10 enfemedades de importancia a nivel global según
la revista MPP
La transparencia 7 muestra un esquema generalizado de la ultraestructura de una
bacteria fitopatógena típica. Con excepción de Streptomyces, que posee una forma
filamentosa, la mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen forma de bastón. Las
bacterias del género Streptomyces son procariontes filamentosos Gram-positivos que
producen esporas como principal mecanismo de dispersión. Sólo unas pocas especies
entre las 400 descriptas son patógenas de plantas. Las especies de Streptomyces
fitopatógenas causan enfermedades a nivel de órganos y estructuras subterráneas de
diversas especies vegetales. Por ejemplo, Streptomyces scabies causa la sarna de la
papa (escaras a nivel de los tubérculos).
El género Pseudomonas (transparencia 8) comprende bacterias unicelulares Gram
negativas que son móviles por presentar uno o varios flagelos polares (flagelos
lofotricos). Las bacterias de este género son aeróbicas estrictas. Una de las
características de todas las especies del género es que producen pigmentos
fluorescentes. P. syringae es la especie de mayor importancia económica.
Pseudomonas syringae se clasifica en alrededor de 45 patovariedades y puede
infectar un amplio rango de especies de plantas. Entre ellas podemos mencionar: Ps
pv. phaseolicola la cual infecta el fríjol causando la enfermedad conocida como “tizón
de halo”; Ps pv. tomato que produce la “mancha negra” del tomate.
Ralstonia (formalmente Pseudomonas) solanacearum es una bacteria de suelo Gramnegativa que coloniza el floema de una amplia gama de plantas huésped, causando
entre otras la podredumbre parda de la papa.
La figura de la transparencia 9 representa esquemáticamente el ciclo de vida típico de
una bacteria fitopatógena. El ciclo incluye dos fases importantes: la fase epifita o fase
de colonización y dispersión en el ambiente del patógeno. La fase patogénica es
aquella en la que el patógeno invade e infecta a una planta y se multiplica
intratisularmente o intracelularmente. Es durante esta etapa del ciclo de vida que la
planta es capaz de gatillar su sistema defensivo, desarrollando entre otros
mecanismos la Respuesta Hipersensible (HR).
La gran mayoría de las bacterias fitopatógenas ingresa a la planta a través de
discontinuidades naturales de la epidermis tales como estomas o lenticelas. En otros
casos, aprovechan también la existencia de heridas o cicatrices. La transparencia 9
muestra fotografías tomadas al microscopio de barrido que ilustran esta situación.
Una vez que han traspasado las barreras naturales a nivel de cutícula y epidermis, las
bacterias fitopatógenas se traslocan por el apoplasto (espacio extracelular) y/o por los
tejidos de conducción junto con nutrientes del suelo (transparencia 10 y 11). De esta
manera, logran colonizar diferentes órganos. Se ha comprobado que en los órganos
de una planta infectada por bacterias, las células o tejidos menos afectados por las
mismas son los meristemas. Estos tejidos de la planta están pobremente
vascularizados, lo que dificulta el acceso de las bacterias o de cualquier otro tipo de
patógeno.
La tabla de las transparencias 12 y 13 enumera los principales tipos de enfermedades
bacterianas en plantas y sus correspondientes síntomas. Las transparencias 14 a 21
presentan ejemplos de las enfermedades más típicas. La cancrosis de los cítricos
(transparencia 14) es una enfermedad causada por la bacteria Xanthomonas
axonopodis pathovar citri que puede causar un extenso daño a las ramas, las hojas y
las frutas de las distintas variedades de cítricos susceptibles. Esta enfermedad causa
a menudo la caída prematura de la fruta y lesiones en la cáscara, lo que limita su
comercialización. La bacteria que causa la cancrosis de los cítricos puede sobrevivir
por períodos extensos en las ramas y el tallo de los cítricos. La enfermedad se
disemina por el viento, el rocío, la lluvia, las actividades mecánicas (por ejemplo, al
podar, arrancar, y rociar los árboles dentro y entre la arboleda), el movimiento de las
plantas o de partes de las plantas infectadas y las actividades de las aves, los
insectos, y/o los mamíferos. La cancrosis de los cítricos es un peligro para las áreas
que producen cítricos porque se disemina rápidamente y tiene un potencial de daño
muy alto.
Las bacterias del género Streptomyces producen esporas como principal mecanismo
de dispersión (transparencia 16). Sólo unas pocas especies entre las 400 descriptas
son patógenas de plantas. Las especies de Streptomyces fitopatógenas causan
enfermedades a nivel de órganos y estructuras subterráneas de diversas especies
vegetales. Por ejemplo, Streptomyces scabies causa la sarna de la papa (escaras a
nivel de los tubérculos). El género Erwinia incluye, al igual que otros miembros de la
familia Enterobacteriaceae, bacterias anaerobicas facultativas de formas flageladas y
de tipo Gram negativo. Las especies de Erwinia (transparencias 16, 17 y 18) se
encuentran entre las de mayor impacto económico, ya que son los agentes causales
de varias enfermedades de frutales, de la podredumbre blanda de la papa y de
cucurbitáceas todas las cuales constituyen importantes problemas sanitarios en los
países productores.
Las transparencias 19, 20 y 21 representan otras res enfermedades de importancia
para distintas especies como Ralstonia solanacearum en papa, Agrobacterium
tumefaciens que genera la agalla de corona en numerosas especies leñosas y
Xylelella fastidiosa en cítricos,
Las transparencias 22 y 23 presentan dos de los métodos de manejo agronómico
comúnmente utilizados en el control de enfermedades bacterianas.
Interacciones planta-bacteria
Transparencia 24-35
La transparencia 25 describe algunos de los eventos de señalización que regulan la
interacción bacteria-planta. Los exudados de las células vegetales conteniendo
aminoácidos, azúcares y otros compuestos químicos (o) pueden ser reconocidos como
señales por los microorganismos del suelo e inducen en ellos una respuesta recíproca
(hacha) que puede ser agresiva (como la toxina albicidina, producida por
Xanthomonas albilineans). Los microorganismos producen también moléculas que
actúan como señales y que pueden ser reconocidas por otros microorganismos (Δ) o
por las células vegetales (□). Las acil homoserin lactonas son un ejemplo de moléculas
que son reconocidas por las bacterias. En el caso de bacterias fitopatógenas, estos
compuestos inducen generalmente la producción de factores de virulencia (cuchillo).
Las señales moleculares bacterianas pueden ser reconocidas por la célula vegetal y
funcionar como inductores de la respuesta de defensa de la misma, produciendo
pépticos tóxicos y antibióticos. Hay señales bacterianas que, como en el caso de
Rhizobium, inducen una interacción mutuamente beneficiosa tanto para el
microorganismo como para la planta.
Las plantas se encuentran enfermas cuando una o varias de sus funciones (división y
diferenciación celular, desarrollo, absorción de agua y minerales, translocación de
productos de la fotosíntesis, reproducción y acumulación de reservas) son alteradas
por diferentes patógenos o por determinadas condiciones ambientales. La reacción de
las plantas ante el agente que ocasiona la enfermedad se localiza en la zona afectada
y es de naturaleza química. Poco tiempo después, la respuesta se magnifica y se
producen cambios histológicos que se hacen notables y constituyen los síntomas de la
enfermedad. Las células o tejidos afectados de las plantas enfermas se debilitan o
destruyen a causa de los agentes que causan la enfermedad. La capacidad que tienen
las células y tejidos para llevar a cabo sus funciones normales disminuyen o se anulan
y, como resultado, la planta muere o merma su crecimiento (transparencia 26).
La transparencia 27 muestra un esquema de las diferentes estrategias de ataque de
un patógeno a un organismo vegetal. El gen o los genes de virulencia de un patógeno
son por lo general específicos para una o unas pocas plantas relacionadas. La
especificidad de estos genes es lo que permite explicar porqué las plantas son
susceptibles a algunos patógenos y resistentes a otros. A la resistencia de las plantas
frente a un patógeno que no posee los genes de virulencia adecuados para atacarlas,
se la denomina resistencia de no hospedante. Por otro lado, unos pocos patógenos
son capaces de infectar varias clases y a veces cientos de plantas hospedadoras que,
por lo tanto, resultan ser susceptibles. Estos patógenos poseen una mayor diversidad
de genes de virulencia o los pocos genes de virulencia que poseen son menos
específicos que aquellos de los patógenos muy especializados. Las plantas
susceptibles a estos patógenos muestran claros síntomas de enfermedad. Finalmente,
a pesar de que ciertas especies de plantas son susceptibles al ataque de diversos
patógenos, algunos individuos de esas especies pueden devenir resistentes
adquiriendo genes a través de la evolución o del mejoramiento genético de los
cultivos. La resistencia producida por la presencia de ciertos genes o combinaciones
de genes se denomina resistencia verdadera. Esta resistencia se denomina horizontal
cuando esta controlada por numerosos genes (a veces cientos). En este caso, cada
uno de estos genes juega un rol menor en la totalidad de la resistencia. En cambio, la
resistencia vertical, es siempre controlada por uno o unos pocos genes denominados
genes R, genes de resistencia o genes mayores de resistencia.
La transparencia 28 describe las diferencias entre factores de virulencia, patogenicidad
y avirulencia y en la transparencia 29 se ejemplifican sustancias que funcionan como
efectores de bacterias fitopatógenas.
La transparencia 30 muestra las combinaciones de genes involucradas en distintas
interacciones de resistencia/enfermedad entre un patógeno y su hospedador. Las
bacterias fitopatógenas establecen interacciones compatibles o incompatibles con sus
respectivos hospedadores. En una relación compatible un patógeno logra infectar y
enfermar a una planta, y esto ocurre si las condiciones ambientales son favorables, si
las defensas preformadas de la planta son inadecuadas, si la planta falla en detectar al
patógeno, e incluso si las respuestas de defensa activadas son ineficientes. En una
interacción incompatible las plantas resisten al ataque del patógeno. Esta resistencia
puede ser inespecífica, a través de la denominada resistencia no hospedadora, basal
o innata, en la cual el patógeno no encuentra condiciones favorables para infectar o la
planta presenta barreras estructurales preformadas, o sintetiza compuestos tóxicos
que impiden la proliferación y colonización de la bacteria. La relación incompatible, y
por lo tanto la resistencia de la planta, puede ser debida también a un reconocimiento
específico. En este caso existe una base genética muy definida. La presencia de
genes de resistencia dominantes en el hospedador que le permite reconocer genes de
avirulencia del patógeno. En los años 40 del siglo pasado, Harold H. Flor propuso el
modelo del “gen a gen”. Dicho modelo establece que la resistencia se produce cuando
la planta expresa un gen de resistencia dominante (R) y el patógeno un gen de
avirulencia dominante complementario (Avr). Esta respuesta defensiva de una planta
está frecuentemente asociada a una Respuesta de Hipersensibilidad (HR; del inglés:
Hypersensitive Response), la que se caracteriza por una necrosis rápida y localizada
en respuesta al ataque del patógeno. Es decir, frente a la invasión de tejidos vegetales
por un microorganismo foráneo, la respuesta defensiva inducible más temprana es la
muerte celular controlada. Esta respuesta hipersensible de las células vegetales
ocurre aproximadamente 24 horas después de que la planta percibe un patógeno
potencial.
La transparencia 31 resume algunos efectores descriptos para Xanthomonas que han
sido ms extensamente estudiados
La transparencia 32 esquematiza las estructuras de varias proteínas codificadas por
genes de resistencia que han sido particularmente estudiadas. El descubrimiento de
los genes de resistencia (R) en diferentes cultivares como cebada, maíz y tomate se
ha acelerado notablemente debido al desarrollo de las técnicas de mapeo, aislamiento
y secuenciación. Son interesantes las similitudes halladas en la estructura de las
proteínas R en especies de plantas mono y dicotiledóneas, lo que evidencia que los
sistemas defensivos han sido conservados durante la evolución y diversificación de las
plantas. Los genes R más comunes de función conocida codifican proteínas
intracelulares con dominios de unión de nucleótidos y secuencias repetidas ricas en
leucinas (NB-LRR; nucleotide-binding/leucine-rich repeat) y con un dominio N-terminal
variable. Las proteínas R que presentan en su estructura un dominio intracelular de
serin/treonin quinasa, un dominio extracelular de LRR (eLRR) y un dominio de
transmembrana son menos comunes. Diversos estudios revelaron que los dominios
LRR de varias proteínas R contribuyen al reconocimiento específico del patógeno.
Investigaciones posteriores permitieron caracterizar otros tipos de dominios presentes
en genes de resistencia. Por ejemplo, el gen de Arabidopsis RRS1, que confiere
resistencia a Ralstonia solanacearum, es una proteína NB-LRR con un dominio
adicional WRKY en el C-terminal. Las proteínas WRKY son factores de transcripción
con estructura de dedos de zinc que son inducidas durante la HR y que se unen a
promotores activados durante la misma. De esta manera, la proteína RRS1 podría
unirse a ADN y activar genes que confieren un fenotipo de resistencia. Por el contrario,
dos genes de resistencia Ve de tomate, confieren resistencia al hongo Verticillium
alboatrum de manera independiente. Las dos proteínas Ve difieren levemente en su
estructura. Ve1 contiene un posible dominio CC (coiled coil), pero no tiene una
secuencia PEST en el extremo C-terminal, y Ve2 no contiene el dominio CC, pero
contiene el dominio PEST. Los dominios PEST estarían involucrados en la
ubiquitinación y degradación de las proteínas.
BS2: gen de resistencia de pimiento (Capsicum annuum) que confiere resistencia a
Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de resistencia a las razas
2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; L6: gen de resistencia a la roya del lino 6; PBS1:
gen de Arabidopsis thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae (la
proteína codificada por este gen es clivada proteolíticamente por el producto del gen
avrPphB); Pto: gen de resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato; RPG1: gen de
resistancia a Puccin2ia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a Pseudomonas
syringae pv. maculicola (gen avrRPM1 o el gen avrB); RPP5: gen de resistencia a
Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de Arabidopsis thaliana que
confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1:
gen de resistencia a Ralstonia solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae; ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de
localización nuclear; PEST: secuencia Pro-Glu-Ser-Thr-like.
En la interacción compatible (a), en que el patógeno infecta y produce enfermedad en
la planta, el producto de un gen de avirulencia interactuaría con y modificaría a una
determinada proteína vegetal que es denominada “blanco de la virulencia” en el
esquema que se muestra en la transparencia 33. Mediante esta interacción, el
microorganismo puede crecer y producir los síntomas típicos de la enfermedad. En
una relación incompatible (b), la resistencia de la planta frente al patógeno puede
desarrollarse por dos caminos: a) la proteína R1 reconoce e interactúa de manera
directa con el factor de avirulencia. Este situación ocurre en raras ocasiones; un
ejemplo de la misma es la interacción entre Avr-Pita y Pi-ta en la interacción entre
Magnaporthe grisea y arroz; b) la proteína R2 es una proteína “guardiana” que puede
reconocer a la proteína “blanco de virulencia” luego de que ésta es modificada por su
interacción con el factor de avirulencia del patógeno.
La transparencia 34 esquematiza uno de los procesos de secreción mas importante
descripto en bacterias fitopatógenas, el modelo de secreción tipo III mediado por
proteínas tipo Hrp o Hairpin.
Harpin is one of a class of proteins produced in nature by certain bacterial plant
pathogens. It acts by eliciting a complex natural defense mechanism in plants,
analogous to a broad spectrum immune response in animals. While most pesticides act
directly on the target pest, Harpin, by contrast, elicits a protective response in the plant
that makes it resistant to a wide range of fungal, bacterial, and viral diseases. Because
Harpin does not interact directly with disease pests, these organisms are not expected
to develop resistance to it. Harpin protein can be used on a broad range of crops,
including traditional field crops, minor use crops, turf and ornamentals. With no
expected adverse effects to human health or the environment, use of Harpin protein
has the potential to substantially reduce use of more toxic pesticides, especially
fungicides and certain soil fumigants, such as methyl bromide.
La transparencia 35 ejemplifica el sistema de secreción tipo III basado en efectores
TAL descripto para Xanthomonas
La planta y su sistema defensivo
Transparencia 36-42
La transparencia 37 puntualiza las diferencias entre inmunidad innata e inmunidad
inducida. La transparencia 38 esquematiza el modelo de interacción planta-bacteria,
distinguiendo la inmunidad inducida por efectores del tipo PAMP (Pathoen Assocaited
Molecular Patterns) reconocida por receptores (PTI) de la inmunidad inducida por
efectores específicos como los genes AVr que son reconocidos por genes R (ETI)
En una interacción incompatible con el patógeno, la respuesta defensiva de una planta
está frecuentemente asociada a una Respuesta Hipersensible (HR; Hypersensitive
Response), la que se caracteriza por una necrosis rápida y localizada en respuesta al
ataque del patógeno (bacterias, virus u hongos). La HR se basa en el reconocimiento,
a través de una interacción directa o indirecta, del producto del gen de avirulencia del
patógeno por receptores específicos codificados por los genes de resistencia de la
planta (planta resistente). Alrededor de la zona de la respuesta HR se acumulan
compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana (denominados
genéricamente fitoalexinas) muchas de las cuales pertenecen a la familia de los
flavonoides. Al acumularse alrededor de la zona en que se produce la HR (zona de
penetración inicial del patógeno), estos compuestos actúan inhibiendo su dispersión a
otros tejidos. La ausencia del gen de resistencia en la planta o del gen de avirulencia
en la bacteria implica el desarrollo de los síntomas típicos de la infección (planta
susceptible). Luego de una HR, la planta adquiere resistencia en tejidos distales al sitio
primario de infección. Esta resistencia, que protege a toda la planta, es conocida como
Resistencia Sistémica Adquirida (SAR; Systemic Acquired Resistance). La
transparencia muestra, a modo de ejemplo, dos interacciones que inducen la HR en
Arabidopsis thaliana. RPS2 (Resistance to Pseudomonas syringae 2) es un gen de
resistencia que confiere resistencia a las cepas de P. syringae 2 que expresan el factor
de avirulencia avrRpt2. RPM1 (Resistance to P. syringae pv maculicola 1) es un gen
de resistencia de A. thaliana que induce resistencia a cepas que expresan el gen de
avirulencia avrRPM1 (transparecnia 39).
La transparencia 40 muestra un esquema de los mecanismos moleculares implicados
en el desencadenamiento de una respuesta defensiva inducible. Las proteínas
receptoras de la planta reconocen señales derivadas del patógeno o que surgen de la
interacción entre el patógeno y el hospedante. Estas señales incluyen productos
directos o indirectos de los genes de avirulencia (Avr), contacto físico, y componentes
propios de cada especie como pueden ser quitinas, enzimas, y fragmentos de la pared
celular vegetal. Los receptores de las plantas pueden ser o no productos de los genes
de resistencia. Una vez reconocido el patógeno, la membrana plasmática estimula
rápidamente el intercambio de iones con el medio extracelular. De esta forma, se
incrementa la concentración intracelular de H+ y Ca2+, mientras disminuye la de Cl- y
K+. Este intercambio de iones es un prerrequisito para la activación de las proteín
quinasas activadas por mitógenos (MAPK; mitogen-activating protein kinase) y de la
generación de especies de oxígeno reactivas (ROS; reactive oxygen species) a través
de una NAD(P)H oxidasa asociada a membrana. Una vez activadas las MAPK,
algunas son traslocadas al núcleo y otras son rápidamente fosforiladas y
desfosforiladas. Finalmente, se produce la inducción transcripcional de un
considerable número de genes en la célula vegetal, entre ellos los de las proteínas
relacionadas a la patogenicidad (PR; pathogenicity related proteins) y los genes
involucrados en la biosíntesis de fitoalexinas, metabolitos secundarios lipofílicos de
bajo peso molecular y con actividad antimicrobiana.
La transparencia 41 muestra un esquema general de la red de señalización que
controla la activación de la respuesta de la defensa local en las plantas. Existen cinco
cascadas de señalización [denominadas (a), (b), (c), (d) y (e) en el esquema] y
numerosas evidencias sobre la presencia de reguladores positivos y negativos y sobre
la interacción de las diferentes cascadas. Cada cascada de señalización está definida
por 4 clases características de proteínas codificadas por genes R. De acuerdo con la
cascada en cuestión, estas proteínas son: (a) Pto, una proteín quinasa serina/treonina;
(b) CC-NB-LRR; (c) TIR-NB-LRR; (d) RPW8. La resistencia mediada a través de la
quinasa Pto (a) , involucra interacciones con RAR1 y con los factores de transcripción
Pti4/5/6, lo que le permite activar directamente la expresión de los genes relacionados
a la patogenicidad (proteínas PR). La proteína Prf es requerida río abajo en la cascada
de resistencia mediada por Pto pero su posición no es precisa y no se muestra en el
esquema. La mayoría de las proteínas CC-NB-LRR (b, c) requieren de NRD1 para
ejercer su función. Por otro lado, las proteínas R/TIR-NB-LRR son dependientes de
EDS1. RPW8 opera a través de EDS1 y SGT1 (d). Un posible punto de convergencia
para las cuatro cascadas mencionadas es RAR1/SGT1. Ambos componentes actúan
rio arriba de la Respuesta Hipersensible (HR) y la formación de especies activas de
O2 (OB). El óxido nítrico es otra de las señales tempranas de defensa y puede
potenciar la HR y la formación de OB. En la cascada que involucra las proteínas TIRNB-LRR, existe una potenciación de la respuesta debida a la acción combinada de
EDS1 y PAD4, EDS5, SA, y NPR1. A su vez, EDR1, MAPK4 y SSI2 pueden reprimir la
señal inducida por el ácido salicílico (AS). Varias proteínas que se unen a SA
(proteínas SABPs) y que se localizan en distintos compartimentos celulares podrían
estar modulando la disponibilidad de SA. Las especies activas de oxígeno pueden
potenciar la acción del SA ya sea directamente o a través de una cascada de proteín
quinasas, como por ejemplo SIPK. NPR1 es requerido río debajo de la acción del SA.
El SA induce la translocación de NPR1 al núcleo, en donde, interactuando con varios
factores de transcripción TGAs (factores que se unen a la secuencia TGACG de ADN)
induce la expresión de genes PR. Las cascadas de señalización (a), (b), (c) y (d) son
importantes en la resistencia a patógenos biotróficos. Otro camino de señalización (e),
que induce la defensa contra patógenos necrotróficos, es el que involucra al ácido
jasmónico/ácido 12-oxofitodienoico y al etileno en dos cascadas paralelas. La primera
(cascada del ácido jasmónico), requiere secuencialmente de COL1 y JAR1. La
segunda` (cascada del etileno), requiere de EIN2 para la expresión de PDF1.2, un
marcador de defensa. Las proteínas EDR1, MAPK4 y SSI2, participan de la
comunicación de las cascadas de ácido jasmónico y el etileno.
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1;
EDR1: enhanced disease resistance 1; EIN2: ethylene-insensitive 2; NDR1: non-race
specific disease resistance 1; OPDA: 12-oxophytodienoic acid; PAD4: phytoalexindeficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA
induction deficient 2; SSI2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5.
La transparencia 42 esquematiza los componentes de la red de señalización que
participan de las respuestas de defensa sistémica. La Resistencia Sistémica Adquirida
(SAR; Systemic Acquired Resistance) ocurre como consecuencia de la Respuesta
Hipersensible (HR). Esta respuesta temprana induce la SAR en zonas distales no
infectadas del tejido vegetal y prepara a la planta para resistir ataques posteriores. La
señal sistémica para esta respuesta podría ser un compuesto lipídico móvil que
interactuaría con DIR1 (defective in induced resistance 1), una proteína apoplástica
transportadora de lípidos, y desencadenaría la acumulación de ácido salicílico (SA) y
SAG (SA 2-O-beta-D-glucósido) en distintos tejidos de la planta. La proteína NPR1 es
requerida río abajo de la señal de SA. NPR1 se moviliza al núcleo, uniéndose a varios
factores de transcripción de clase TGA que inducen la expresión de distintos genes PR
(Pathogenicity Related). Los factores de transcripción WRKY son también activados
durante el desarrollo de la SAR. SNI1 es un regulador negativo de la SAR que actúa
río abajo de NPR1. Las proteínas EDS5, EDS12 y Dth9 juegan también un papel en
SAR, pero su localización es incierta. La Resistencia Sistémica Inducida (ISR; Induced
Systemic Resistance) por bacterias del suelo no patógenas, como las rizobacterias,
requiere tanto de ácido jasmónico (AJ) como de etileno (ET) y de la proteína NPR1.
Las proteínas EDS8, JAR1 y COI1 son requeridas para la ISR y su actividad se
localiza entre AJ y NPR1, mientras que las de ISR1 y EDS4 operan entre el nivel de
acción del ET y de NPR1. La inducción de ISR requiere también de EDS10, la que
actúa tanto rio abajo como arriba de NPR1. La ISR no involucra la acumulación de
proteínas PR y no requiere de AS. Ambas respuestas, SAR e ISR, pueden ser
simultáneamente activadas. MAPK4, aumenta la señal mediada por AJ y suprime la
señal de AS. Un tercer tipo de respuesta sistémica es llamada Respuesta
Independiente de SAR (SIR; SAR Independent Resistance). Este fenómeno, que no
involucra expresión de proteínas PR ni acumulación de AS, se activa a través de un
mecanismo de regulación negativa, siendo la proteína SON un supresor de NPR1.
Dth9: detachment 9; ISR1: induced systemic resistance 1; JAR1: JA resistance 1; NPR1-1
inducible; SNI1: suppressor of SON1: suppressor of nim1-1; SAG: salicylic acid glucoside.
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias mediante ingeniería genética
Transparencia 43-70
En la transparencia 44 y 45 se enumeran diferentes estrategias que han sido utilizadas
para obtener plantas resistentes a patógenos por técnicas de ingeniería genética.
Entre estas estrategias, se incluye la producción de compuestos antimicrobianos de
diverso origen no vegetal, la expresión de proteínas inhibidoras de la patogenicidad o
virulencia, la activación del sistema defensivo de la planta y la muerte celular inducida
en el sitio de infección. Existe gran diversidad de proteínas de orígenes variados que
presentan actividad antibacteriana y/o antifúngica. Estas proteínas constituyen un
componente clave en el mecanismo defensivo de todo organismo vivo, actuando en
muchos casos en forma sinérgica junto con otros compuestos biológicamente activos.
Pueden también actuar en forma aislada mediante efectos altamente específicos. Las
transparencias presentan un listado de proteínas de que han sido expresadas en
diferentes especies vegetales. El efecto de estas proteínas foráneas ha sido evaluado
a través de ensayos de resistencia y/o tolerancia frente a patógenos fúngicos y
bacterianos (se detallan las especies de bacterias usadas en los desafíos). En la
columna de la derecha se resume el efecto o nivel de resistencia observado en las
plantas transgénicas que expresan las proteínas de interés.
La transparencia 46 muestra la estructura de diferentes péptidos antimicrobianos. La
amplia distribución de este tipo de moléculas en los reinos animal y vegetal sugiere
que han cumplido un rol fundamental en su evolución como organismos multicelulares
complejos. Constituyen armas defensivas de amplio espectro contra bacterias y
hongos. La mayoría de los péptidos antimicrobianos presenta una estructura anfipática
en la que diferentes aminoácidos catiónicos y aminoácidos hidrofóbicos se organizan
espacialmente en sectores discretos de la molécula. Los péptidos lineales como la
cecropina y la magainina sólo adoptan esta conformación una vez que se insertan en
la membrana en la que asumen una estructura anfipática secundaria en forma de hélice.
Los péptidos antimicrobianos actúan frente a los microorganismos en forma específica
(transparencia 47). La base de esta especificidad está determinada por la diferente
naturaleza de la membrana de las células bacterianas y las células animales o
vegetales. En las bacterias, la membrana está organizada de forma tal que la gran
mayoría de fosfolípidos con carga negativa está expuesta al medio externo. En el caso
de las células de mamíferos y de plantas, la membrana presenta sólo lípidos sin carga
neta hacia el exterior. Los lípidos con carga negativa se disponen hacia el interior de la
célula, es decir, hacia el citoplasma. Por esta razón, los péptidos con carga positiva se
unen electrostáticamente con los lípidos de carga negativa presentes en la cara
externa de la membrana bacteriana, pero no interactúan con los lípidos que
constituyen las membranas de las células superiores.
La transparencia 48 ilustra un modelo para explicar el mecanismo de acción de los
péptidos antimicrobianos propuesto por Shai-Matsuzaki-Huang. Se representa un
péptido con su estructura en -hélice. A: reconocimiento de la membrana bacteriana
por parte de los péptidos. B: inserción del péptido a la membrana mediada por la
atracción electrostática de cargas; adelgazamiento de la capa externa de la
membrana; se generan tensiones en la bicapa (flechas). C: formación de poros en la
membrana. D: transporte de péptidos y lípidos a la capa interna de la membrana. E:
acción de los péptidos sobre “blancos” intracelulares (en algunos casos). F: colapso de
la membrana bacteriana y ruptura de la célula. Los lípidos representados en amarillo
poseen carga negativa. Los lípidos representados en negro no poseen carga neta.
La transparencia 49 presenta los resultados obtenidos a partir de ensayos de infección
de plantas que expresan un péptido antimicrobiano (un análogo de magainina) contra
P. syringae. Se muestran las fotos de un ensayo de infección en plantas de Nicotiana
tabacum transformadas con el gen MSI-99. Se rasparon áreas de 5-7 mm en hojas de
plantas transformadas R0 y de plantas control con un papel de lija fino y se inocularon
en las mismas 10 l de 8.106, 8.105, 8.104, 8.103 y 8.102 células de P. syringae pv
tabaci. Las fotos se tomaron 5 d post-inoculación. La hoja transgénica muestra una
ligera decoloración, mientras que la hoja control muestra necrosis.
La sarcotoxina (transparencia 50) es un péptido antibacteriano aislado a partir de
larvas de Sarcophaga peregrina por el laboratorio de Dr. Y. Ohashi de la Universidad
de Tokio. Este péptido posee 39 aminoácidos y pertenece al grupo de las cecropinas.
Las cecropinas son pequeños péptidos, aislados de la hemolinfa de insectos, que
presentan actividad lítica y antibacteriana contra muchas bacterias Gram positivas y
Gram negativas. Poseen una región N-terminal bastante básica y una larga secuencia
hidrofóbica en el extremo C-terminal. Estas características determinan su acción
antibacteriana a través de la formación de canales en las membranas que provocan el
vaciamiento y muerte de las células bacterianas. En estudios in vitro, la sarcotoxina
ha resultado altamente eficiente en la inhibición del crecimiento de algunas bacterias
fitopatógenas tales como Xhantomonas axonopodis pv. Citri. Se ha comprobado que la
expresión de sarcotoxina en plantas de tabaco bajo el control de un promotor
constitutivo aumenta la resistencia de estas plantas a P. syringae pv. tabaci y E.
carotovora pv. carotovora. (transparencia 50). También en plantas de tabaco, pero en
este caso transformadas con el gen de la sarcotoxina bajo el control de un promotor
inducible por ácido salicílico (PR1a), se ha observado un aumento de la resistencia
tanto a bacterias fitopatogénicas como a los hongos Rhizoctonia solani e Pythium
aphanidermatum.
Estas enzimas del tipo lisozima catalizan la hidrólisis de la mureína, constituyente de la
pared celular bacteriana. Las lisozimas se localizan en las vacuolas de numerosas
especies vegetales por lo que entran en contacto con las bacterias fitopatógenas una
vez que éstas han producido la lisis o ruptura de la célula vegetal. Pocas lisozimas
vegetales han sido caracterizadas y clonadas, por lo que se han buscado lisozimas de
otros orígenes para ser expresadas en plantas transgénicas, como las del bacteriófago
T4 (los bacteriófagos son virus que infectan a las bacterias) y la del huevo de gallina.
La transparencia 51 muestra la estructura del vector pSR-2, el que contiene un gen
quimérico de la lisozima del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido
señal de la -amilasa de cebada y es dirigido por el promotor de 35S del Cauliflower
mosaic virus (CaMV). El gen de la lisozima del fago T4, uno de los miembros más
activos de esta familia de enzimas bacteriolíticas, se expresó en plantas de Solanum
tuberosum. Las plantas transgénicas obtenidas fueron infectadas con la bacteria
fitopatógena E. carotovora pv. atroseptica bajo condiciones de laboratorio e
invernáculo. Usando una alta presión de infección, se observó una reducción
significativa en la maceración de los tejidos infectados. También se comprobó que la
capacidad de brotación de los tubérculos transgénicos desafiados con el patógeno
estaba sumamente disminuida.
Las transparencias 52-54 muestran los resultados obtenidos en ensayos de infección
realizados con diferentes líneas transgénicas de Solanum tuberosum que expresan un
gen quimérico de la lisozima del fago T4. La fotografía superior de la transparencia 46
muestra un ensayo de brotación realizado con tubérculos dormidos que fueron
inoculados con E. carotovora pv. atroséptica (las 6 macetas de izquierda portan
tubérculos de líneas transgénicas, mientras que las macetas 6 macetas de la derecha
corresponden a tubérculos no transgénicos). Sólo los tubérculos correspondientes a la
línea T424 fueron capaces de brotar luego de la infección en condiciones de
invernáculo. La foto superior presenta los resultados de un ensayo de brotación de
tubérculos. El histograma de la parte inferior grafica los porcentajes de brotación de
tubérculos transgénicos (T#) y de tubérculos no transgénicos (Z2) luego de ser
infectados con E. carotovora.
Las transparencias 55-56 muestran otro ejemplo de resultados obtenidos en ensayos
de infección con Erwinia caratovora realizados con diferentes líneas transgénicas de
Solanum tuberosum que expresan tres genes: Dermaseptina de Phylomedusa
sauvagii, AP24 de Tabaco y Lisozima de Pollo
En otro trabajo, se transformaron plantas de tabaco con dos construcciones diferentes
comprendiendo secuencias que codifican, respectivamente, α-tioninas de cebada y
trigo. La transparencia 57 muestra un esquema de las construcciones genéticas
utilizadas. En el caso de la tionina de cebada, se utilizó la secuencia genómica del
gen; en el caso de la tionina de trigo una copia de ADNc. Ambas construcciones están
dirigidas por el promotor constitutivo 35S de CaMV. El terminador de la transcripción
corresponde al gen de la octopina sintetasa. Se seleccionaron líneas transformadas
por selección en kanamicina y las plantas transgénicas se desafiaron con bacterias
fitopatógenas (P. syringae pv. tabaci 153 y P. syringae pv. syringae). La α-tionina
purificada de las plantas transgénicas presentó los patrones de movilidad e
inmunogenicidad correspondientes a la proteína nativa y exhibió, in vitro, las
propiedades antibióticas esperadas. Las transparencias 58-60 muestran resultados
obtenidos en el mismo trabajo. Como se observa en las fotografías de la transparencia
60, las plantas transgénicas que expresan el gen de la α-tionina (UPI), mostraron
menor proporción de lesiones necróticas en comparación con la planta no
transgénicas (A). Se midió el número de lesiones en función de la expresión de tionina,
observándose un incremento en el mismo en la medida que ésta disminuye. Se
tomaron por lo menos 10 plantas y 30 puntos en 3 experimentos independientes. Se
ensayaron plantas de Nicotiana tabacum Samsun NN (SNN) no transformada, plantas
de N. tabacum Samsun NN transformadas con un vector vacío (SNN+CS), plantas
homocigotas de transformantes UP1 y UP2 que expresan la tionina de cebada (UP1
hz y UP2 hz), progenies de transformantes heterocigotos que expresan la misma
construcción (UP6 pg y UP7 pg) y plantas homocigotas de los transformantes UP3 y
UP4 que expresan la tionina de trigo (UP3 hz y UP4 hz).
Otro ejemplo de resistencia conferida a bacterias y hongos es la snakina, péptido
antimicrobiano, cuyos genes fueron aislados de papa y cuya sobreexpresión confiere
resistencia al hongo Rhizoctonia solani y a la bacteria Erwinia carotovora (transparecia
61)
Las toxinas inespecíficas son un importante componente de la virulencia de hongos y
bacterias fitopatógenas. La faseolotoxina, una toxina producida por P. syringae pv.
phaseolicola, inhibe específicamente una enzima involucrada en la biosíntesis del
glutamato, la ornitilcarbamoil transferasa (OCTasa), lo que provoca necrosis en los
tejidos afectados por la bacteria. Para protegerse de los efectos de la toxina, la
bacteria posee una versión de la OCTasa resistente a la misma. La transparencia 62
indica el mecanismo de acción de la faseolotoxina y presenta la estructura química de
esta molécula. En el trabajo que se presenta en las transparencias 63-65, se
obtuvieron plantas transgénicas de Nicotiana tabacum que expresan el gen de la
OCTasa bacteriana resistente a faseolotoxina, como estrategia para obtener plantas
insensibles a la toxina y más resistentes al ataque de P. syringae pv. phaseolicola.
Debido a que la ruta de síntesis del glutamato está localizada en los cloroplastos, se
agregó a la secuencia del gen una secuencia que codifica un péptido de transporte a
dicha organela (construcción SSU-OCTasa). La transparencia 56 muestra los
resultados obtenidos al evaluar la susceptibilidad a la faseolotoxina de la OCTasa
presente en las plantas control y en las transgénicas. La actividad OCTasa presente
en los controles fue inhibida en un 96% a una concentración de 35 ng/mL de
faseolotoxina, y en un 99% a una concentración de 375 ng/mL. En el caso de las
plantas transgénicas que expresaban la construcción SSU-OCTasa, la inhibición de la
enzima fue de entre 14 y 62% para las mismas concentraciones de faseolotoxina. El
grado de inhibición de la OCTasa fue diferente para cada línea transgénica. Este valor
fue mínimo en el caso de las líneas que presentaban mayores niveles de expresión de
actividad OCTasa. Para evaluar si la presencia del transgen tenía un efecto protector a
la faseolotoxina se aplicó esta toxina en las hojas de plantas control y transgenicas
(transparencia 65). Las plantas control desarrollaron halos cloróticos similares a los
que se observan en las infecciones de Phaseolus. Por el contrario, en las hojas de las
líneas transgénicas tratadas con faseolotoxina no aparecieron halos cloróticos. No se
apreció variación alguna en el contenido de clorofila en las hojas de las plantas SSUOCTas tratadas con la faseolotoxina, mientras que las plantas control presentaron una
disminución de clorofila del 30% a las 24 h de la aplicación de la toxina. En la
transparencia 58 muestran los obtenidos al estudiar el comportamiento de las plantas
transgénicas SSU-OCTasa en ensayos de infección con P. syringae pv. phaseolicola
utilizando diferentes condiciones de inoculación. Se logró una interacción compatible
entre la bacteria y N. tabacum al mantener las plantas en la oscuridad luego de la
infección. La transparencia muestra fotografías de las plantas ensayadas: A) y C):
aspecto general y detalle de una planta no transformada; B) y D): vista general y
detalle de una hoja de una planta transgénica SSU-OCTasa. Las plantas de tabaco no
transformadas (A) desarrollaron lesiones necróticas (C) que derivaron en una infección
sistémica en algunas plantas. Estas plantas no se elongaron en respuesta a la
oscuridad y murieron. Por el contrario, las plantas transgénicas de tabaco, inoculadas
bajo las mismas condiciones, no presentaron lesiones necróticas ni desarrollaron
infección sistémica y se elongaron en respuesta a la oscuridad (B y D).
Xa21 es el primer gen de resistencia de arroz que ha sido bien caracterizado (66-67).
La proteína codificada por este gen posee un dominio de quinasa serina/treonina
similar al que posee Pto en tomate y es capaz de autofosforilarse en varios sitios en el
curso de una interacción incompatible. Xa21 confiere resistencia a la mayoría de las
razas de X. oryzae pv. oryzae (Xoo) y fue introducido por transformación genética en
los cultivares Minghui 63-12 e IR72-82 susceptibles a Xanthomonas, con el objetivo de
obtener resistencia. En la transparencia 67 se muestran los datos correspondientes a
ensayos realizados en diferentes generaciones de plantas de la variedad Minghui.
Panel A: línea 63-12; Panel B: línea IR72-82 y los respectivos controles no
transgénicos. La resistencia se mide como disminución del tamaño de las lesiones
foliares. Los datos fueron obtenidos a los 14 d luego de la inoculación con
Xanthomonas. El panel C ilustra la reducción de los síntomas observada en las plantas
transgénicas (izquierda) en comparación con las plantas control no transgénicas
(derecha). Otro de los genes de resistencia, además del Xa21, aislados de arroz y que
confiere resistencia a X. oryzae pv. oryzae, es el gen Xa26. Si bien ambos genes
codifican para proteínas muy similares, el Xa26 confiere resistencia a plantas jóvenes
como adultas. Mientras que el gen Xa21 sólo tiene efecto en plantas adultas, lo que
sugiere que estaría regulado por genes involucrados durante el desarrollo de la planta.
El gen Xa26 (transparencia 60) fue aislado del cultivar Minghui 63 (MH63, Oryzae
sativa ssp. indica), moderadamente resistente a Xhantomonas, y transferido al cultivar
susceptible Mudanjiang 8 (MDJ8, O. sativa ssp. japonica). En la gráfica superior de la
transparencia 68, se presenta el crecimiento bacteriano en escala logarítmica para el
cultivar susceptible, el moderadamente resistente y la planta susceptible transformada
con el gen Xa26, observándose un considerable incremento de la resistencia (o menor
crecimiento bacteriano) en ésta última respecto de las dos primeras. En el panel
inferior se pueden apreciar los síntomas producidos por X. oryzae pv. oryzae sobre
plantas de arroz y se comparan plantas resistentes y susceptibles. Se presentan líneas
transgénicas para el gen Xa26 (Rb17 y Rb18), resistentes (IRBB3), moderadamente
resistente (MH63) y susceptibles (IR24 y MDJ8) y la F1 (filial 1) de un cruzamiento
entre MDJ8 y MH63. Se pueden observar diferencias significativas en la longitud de
las lesiones. Las plantas transformadas con el gen Xa26 mostraron mayor resistencia,
incluso cuando se las compara con la línea donante del gen Xa26 (MH63). Este
resultado sugiere que la resistencia conferida por Xa26 está condicionada por el fondo
genético del cultivar receptor.
El gen Pto de tomate codifica una proteín quinasa de serina/treonina que le confiere a
la planta resistencia a las cepas de P. syringae pv tomato que contienen el gen avrPto.
La transparencia 69 muestra los resultados de un trabajo en que se introdujo el gen de
resistencia de tomate Pto en plantas de tabaco. Como se muestra en la gráfica, se
observó un aumento de la resistencia de estas plantas a P. syringae pv tabaci que
expresan el gen avrPto. En comparación con las plantas no transformadas de tabaco,
las plantas transgénicas mostraron un desarrollo más rápido de la Respuesta
Hipersensible (HR), un descenso en la formación de síntomas y disminución del
número de bacterias en las hojas inoculadas. La figura muestra el crecimiento de P.
syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas con el gen Pto (líneas sólidas)
y en plantas control no transformadas (líneas discontinuas). Se inocularon hojas
completamente expandidas de plantas de 9 semanas con 106 cfu/mL de bacterias que
expresan el gen avr/Pto (cuadrados) o que no lo poseen (triángulos). Los tipos de
interacciones que se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr);
[2]: compatibilidad (ausencia del gen R y presencia del gen avr); [3]: compatibilidad
(presencia del gen R y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y
del gen avr).
Una estrategia mas reciente se basa en la resistencia conferida por la expresión de
receptores de PAMPs de patógenos con la ventaja de conferir un tipo de resistencia
horizontal eficaz sobre distintas especies de patógenos ( transparencia 70)
Regulación de factores de virulencia
Transparencia 71-81
Las bacterias fitopatógenas han desarrollado una serie de compuestos que
contribuyen para que éstas puedan invadir y colonizar los respectivos hospedadores.
Estos compuestos o factores de virulencia, determinan la patogenicidad y el grado de
virulencia del patógeno. Dependiendo de la interacción planta-bacteria, las bacterias
producen factores, algunos de los cuales son comunes y otros específicos para cada
interacción patógeno-hospedador.
Muchos de estos factores son proteínas que son inyectadas directamente en la célula
hospedadora (proteínas efectoras) a través del sistema de secreción tipo III (SST-III),
un sistema común entre las bacterias patógenas tanto de plantas como animales, y
que se induce cuando la bacteria toma contacto con el hospedador. Lamentablemente
para el agente patógeno, estas proteínas son moléculas ideales para ser reconocidas
por el sistema de defensa de la planta (sistema gen a gen). En donde la planta, a
través de una proteínas de resistencia (proteína R) puede "reconocer" la presencia de
determinada proteína efectora (proteína AVR), desencadenando la ya mencionada
respuesta hipersensible (HR).
Algunos de los factores de virulencia han sido caracterizados recientemente como
supresores de la respuesta de defensa vegetal y le permiten a la bacteria promover su
crecimiento y difusión dentro del tejido vegetal. Varios de estos incluyen proteínas
efectoras secretadas por el SST-III, pero también exopolisacáridos y fitotoxinas, han
sido reseñadas en la literatura.
Las bacterias no viven aisladas sino que forman una comunidad estructurada,
coordinada y funcional que se denomina comúnmente biopelícula o biofilm.
Se ha podido observar una relación directa en la capacidad de producir biofilms y la
virulencia de estas bacterias. Los biofilm son estructuras importantes en el desarrollo
bacteriano y podrían ser un blanco muy apropiado para contrarrestar las
enfermedades producidas por éstas en los respectivos hospedadores.
Entre las ventajas que le proporciona a la bacteria poseer la capacidad de desarrollar
un biofilm, podemos mencionar:
 Protección del medio ambiente
 Mayor disponibilidad de nutrientes
 Cooperación entre especies (microconsorcio; sintrofismo)
 Adquisición de nuevas características genéticas
La formación de biofilms requiere de la capacidad de las bacterias de unirse a distintas
superficies, en particular el tejido vegetal. Para lograr esta asociación as bacterias
utilizan diversas moléculas entre las cuáles están los exopolisacáridos (EPS) y las
proteínas de superficie. La expresión de los genes involucrados en la síntesis de estas
moléculas de adhesión, así como otros factores de virulencia, están regulados por
mecanismos dependientes de la densidad celular. Cada especie bacteriana responde
a sus propias señales ambientales a través de un conjunto de mecanismos
moleculares. A pesar de esta gran diversidad, hay un sistema conservado de
regulación que responde a varios estímulos que son importantes para la asociación
entre bacterias y plantas. El sistema de regulación de la formación de biofilm, al igual
que algunos factores de virulencia, en particular las enzimas extracelulares y los EPS,
son dependientes del número de bacterias presentes, o del mecanismo comúnmente
denominado quorum sensing.
El fenómeno de quorum sensing fue reconocido en la década de los 60 en estudios
realizados con la bacteria Vibrio fischeri. Esta bacteria marina bioluminiscente produce
luz sólo cuando hay una gran cantidad de bacterias presentes. Se observó que la
luminiscencia se producía por acumulación de un activador o molécula “autoinductora”.
Esta molécula es producida por la bacteria y activa la luminiscencia cuando alcanza
una determinada concentración crítica. Las bacterias son capaces de sensar su
densidad de población a través de la detección de esta molécula autoinductora. Al
mecanismo del sensado de la densidad celular se lo llamó quorum sensing y la
molecula activadora producida por V. fischeri fue aislada en el año 1981, siendo
identificada como una N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lactona, con una estructura
similar a la que se muestra en la figura de la transparencia 68.
El quorum sensing es un proceso relativamente simple. Las acil-homoserin lactonas
(HSL) son sintetizadas a bajo nivel basal por las acil-HSL sintasas (generalemente
homólogas a las proteínas tipo LuxI de V.fisheri). Las moléculas de acil-HSLs
sintetizadas son rápidamente liberadas por las células bacterianas por difusión. El
incremento en el tamaño de la población bacteriana eleva la concentración de las acilHSLs. A pesar de que cada célula individual produce un bajo nivel de acil-HSL, al
agregarse la población bacteriana produce mayores concentraciones de estas
moléculas señal. A niveles elevados, las acil-HSLs interactúan con un factor de
transcripción (homólogo a la proteína LuxR de V. fisheri) que modula la expresión de
de los genes regulados por quorum sensing.
La transparencia 74 muestra un modelo simplificado de la traducción de señales en el
proceso de quorum sensing. En la regulación de factores de virulencia a través de
quorom sensing, las proteínas I y R juegan un rol central. La célula bacteriana (en
gris) contiene una proteína I que es responsable de la síntesis de moléculas difusibles
(en verde) de acil homoserin lactonas (A-HSLs), las que actúan como señalizadoras. A
una alta concentración celular, las moléculas señalizadoras interactúan con la proteína
R. La interacción con la misma induce un cambio conformacional que aumenta su
afinidad por determinadas secuencias de ADN (secuencias lux) presentes en las
regiones promotoras de los genes regulados por acil homoserin lactonas.
La transparencia 75 muestra un modelo del mecanismo de acción de los genes rpf. La
bacteria Xanthomonas produce enzimas (endoglucanasas, pectinasas, proteasas y
lipasas) y polisacáridos (EPS) extracelulares. Uno de estos polisacáridos es
denominado xantano. Se ha postulado que estos factores estarían involucrados en la
patogénesis; no obstante, sus mecanismos de acción son desconocidos. En X.
camprestris pv campestris (Xcc), un patógeno que afecta crucíferas, la producción de
las enzimas extracelulares y de EPS está regulada por el grupo de genes rpf
(regulation of pathogenicity factors), compuesto por 9 genes (rpfA-I). Los genes rpfB y
rpfF están implicados en la regulación mediada por pequeñas moléculas difusibles
denominadas DSF (diffusible signal factor), las cuales actuarían como comunicadoras
intercelulares. En el modelo que se presenta, los cambios en el ambiente o en los
mismos DSF (representados en la figura con triángulos violetas), interactúan con el
dominio sensor de la proteína RpfC; esto estimula la autofosforilación de este dominio,
desencadenando una serie de fosforilaciones (representadas por línea punteada)
sobre la proteína reguladora RpfG. RpfH podría actuar como una proteína accesoria
para la unión de ligandos. En el esquema, los residuos de histidina y aspartato
involucrados en la fosforilación están representados como H y D. P indica el grupo
fosfato. La proteína RpfG fosforilada regula positivamente la expresión de genes
requeridos para la patogenicidad, incluyendo aquellos que codifican una
endoglucanasa (engXCA), una proteasa (prtA) y al grupo de genes gum, que codifican
proteínas involucradas en la producción del xantano.
La transparencia 76 muestra un esquema de las diferentes estrategias que pueden
utilizarse para interferir la comunicación entre células bacterianas. Los
microorganismos censan sus poblaciones a través de un sofisticado mecanismo de
comunicación celular. Cuando la densidad celular alcanza un determinado umbral se
dispara la expresión de determinados genes. Este tipo de regulación que controla
diversas funciones biológicas, entre ellas las de virulencia, es conocido como
autoinducción o quorum sensing. Las moléculas señalizadoras esenciales de este
sistema son la acil-homoserin lactonas (acil-HSL). Existen diferentes mecanismos que
afectan la regulación por acil-HSL. Existen mecanismos bioquímicos que interfieren en
la comunicación entre bacterias a nivel de la generación de la señal: por ejemplo la
inhibición de la síntesis o de la transferencia de estas moléculas señal o de sus
precursores. Existen además posibles interferencias en el transporte y en la recepción
de la señal. Otras estrategias de interferencia a la comunicación entre células
bacterianas se relacionan con la degradación de las acil-HSL.
Algunos
microorganismos son capaces de sintetizar compuestos que imitan a las acil-HSL con
el objeto de interferir la comunicación entre otras especies y competir con ellas por
nichos ecológicos.
La transparencia 77 presenta los diferentes mecanismos que afectan la regulación por
acil homoserin lactonas (acil-HSL). Las moléculas que degradan acil-HSLs (la
aminoacilasa de Variovax sp. y la lactonasa de Bacillus sp.) atenúan la virulencia de
los patógenos que las utilizan como moléculas señalizadoras. Entre las moléculas que
interfieren con el sistema de señalización entre bacterias mediado por acil-HSLs están
las furanonas. Por ejemplo, las furanonas halogenadas producidas por el microalga
marina Delisea pulchra inhiben el quorum sensing entre bacterias, impidiendo la
formación de biofilmes en Pseudomonas spp. y anulando factores de virulencia en E.
carotovora. La estrategia de los organismos oportunistas consiste en que cuentan con
homólogos de la proteína Lux-R por lo que reconocen las acil-HSLs de otros
organismos e interfieren en su mecanismo de comunicación. No son productores de
acil-HSLs propias.
Se ha demostrado recientemente que el gen aiiA de la bacteria Gram positiva Bacillus
sp. 240B1, codifica una aminoacilasa (acil-homoserin lactonasa; acil-HSLasa) capaz
de degradar las moléculas de acil-homoserin lactonas (acil-HSL) y liberar homoserin
lactonas. Se introdujo el gen aiiA en plantas Nicotiana tabacum y Solanum tuberosum,
para evaluar el efecto de la acil-HSLasa en ensayos de infección con E. carotovora. La
transparencia 78 muestra resultados de dicho trabajo. Se muestran hojas de tabaco
inoculadas (de arriba a abajo) con 60.000, 6.000 y 600 unidades formadoras de
colonias (ufc) a las 20 h de la inoculación. En el panel de la derecha, se muestran
rodajas de tubérculos inoculados con E. carotovora con un inóculo de 25.000 ufc las
48 h de la inoculación. Como puede observarse, la expresión de acil-HSLasa interfirió
con la patogenicidad incrementando la resistencia a la infección bacteriana.
La producción de N-oxoacil-homoserin lactona (OHL) juega un papel esencial en el
control de los factores de virulencia durante la infección por Erwinia carotovora en
tabaco. Los genes bacterianos que codifican enzimas que degradan la pared celular
vegetal, son inducidos en presencia de una alta densidad de bacterias. Esta densidad
es detectada por el censado de OHLs presentes en el medio extracelular. Los
productos de degradación de la pared vegetal pueden también inducir una respuesta
defensiva de la planta, pero la alta densidad bacteriana impide que ésta sea exitosa. El
mecanismo de quorum sensing, que regula estos factores de virulencia, podría ser
importante para el establecimiento de una infección exitosa, evitando que la bacteria
pueda ser detectada prematuramente. Con la idea de alterar la expresión de los
factores de virulencia, se introdujo el gen expI de E. carotovora, (que codifica la
enzima responsable de la síntesis de OHLs) en plantas de Nicotiana tabacum. La
presencia de las OHLs en la planta al inicio del curso de la infección induce la
expresión de los genes de virulencia, proceso que normalmente no ocurre hasta que la
población bacteriana alcanza una densidad mayor. La inducción de la defensa vegetal
en forma temprana puede contrarrestar la infección bacteriana debido a la baja
densidad celular. En la transparencia 79 se muestran resultados de ensayos de
infección con E. carotovora de plantas de tabaco transgénicas. Se muestran dos hojas
provenientes de plantas transgénicas (A) que expresan el gen expl y de una planta
control no transformada (B). Se observó que la bacteria posee reducida capacidad de
producir síntomas en la planta transgénica (comparar A con respecto a B). En el
histograma se observan los resultados obtenidos (% de plantas infectadas) para dos
líneas transgénicas (barra verde y anaranjada) y una planta no transgénica (barra
violeta). El % de plantas infectadas, con desarrollo de síntomas, es sensiblemente
menor en las dos líneas transgénicas respecto de lo observado para la planta no
transformada. Estos valores se obtuvieron 24 y 48 h post-infección.
Las transparencia 80 esquematiza el sistema de secreción Tipo III descripto para
Xanthomonas y la 81 resume las aplicaciones biotecnológicas de este tipo de sistema
de secreción en estrategias de incorporación génica dirigida como “gene targeting”.