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TP N°1:
Síndrome metabólico: Un modulador de la metástasis del cáncer de
mama?
Jefe de trabajos prácticos: Dra. Paola De Luca.
Ayudantes: Lic. Nicolás Dálton, Dr. Franco Izzo, Srta. Paula Farre, Dra. Georgina Scalise.
1.- Antecedentes
El cáncer de mama continúa siendo uno de los problemas más importantes de la salud
pública en el mundo 1.
Si bien existen factores genéticos que influyen en el riesgo del cáncer de mama, son los
factores no heredables los que determinan la mayor parte de las variaciones en el riesgo de
cáncer entre individuos y entre poblaciones 2, 3. Se cree que un tercio de las muertes por cáncer
en la población de Estados Unidos pueden ser atribuidas a hábitos de alimentación y actividad
física, ambos factores están relacionados con el síndrome metabólico 4.
El síndrome metabólico (SM) es un grupo de desórdenes fisiopatológicos que
comprenden al menos tres de las siguientes características: obesidad abdominal (circunferencia ≥
81.5 cm en mujeres), hiperglucemia (≥ 110 mg/dL), dislipidemia (triglicéridos en sangre ≥150
mg/dL o colesterol HDL-C < 50 mg/dL en mujeres), hipertensión (≥ 130/85 mmHg) e hígado
graso5.
Estudios epidemiológicos indican que factores asociados al SM tales como sobrepeso,
obesidad, hipertensión, glucemia y dislipidemia, aumentan el riesgo de padecer cáncer de mama.
Más aún, un reciente estudio sistemático de meta-análisis demostró que el SM es un factor de
riesgo para el cáncer de mama en la población general6 y esta asociación es inclusive mayor en
la subpoblación de mujeres postmenopáusicas7.
Aún no se conoce claramente el mecanismo molecular por el cual el SM activa las vías de
transformación que resultan en el cáncer. Recientemente hemos propuesto una posible
explicación para esta asociación: la proteína CtBP18-10.
C-terminal Binding Protein (CtBP1) es un factor de transcripción que reprime la expresión
de genes supresores tumorales tales como E-caderina, BRCA1, CDKN2A y SIRT1 11. La unión de
CtBP1 al NAD+ o al NADH promueve su dimerización y posterior activación 11. Así, CtBP1 es
conocido como un sensor molecular del estado metabólico de las células debido a que tiene
mayor afinidad (>100 veces) por el NADH que por el NAD+ 12.
Recientemente generamos un modelo in vivo para estudiar el efecto de CtBP1 y el SM
sobre el desarrollo tumoral mamario 8, 9. Para ello alimentamos de manera crónica a ratones
hembra nu/nu con una dieta enriquecida en grasas y encontramos que esta dieta indujo
alteraciones consistentes con la aparición de un SM. Utilizando este modelo encontramos que el
SM aumentó el desarrollo postnatal de la glándula mamaria aumentando el número de bulbos
terminales e induciendo la formación de un epitelio de tipo prominente. Interesantemente,
encontramos que la presencia de conductos mamarios revestidos con un epitelio prominente
correlacionó con un aumento en la expresión de CtBP1 y Ciclina D1. Dado que las células
tumorales mamarias derivan y son mantenidas por células madre cancerosas13, analizamos si el
SM altera la capacidad de autorrenovación celular en cáncer de mama. Encontramos que el SM
expandió la población de células progenitoras en células tumorales mamarias LM38-LP. Además,
la proteína CtBP1 aumentó la proliferación de células tumorales mamarias, inhibiendo el arresto
del ciclo celular e induciendo la expresión de Ciclina D1. Por último CtBP1 y el SM aumentaron el
crecimiento tumoral de xenotransplantes mamarios regulando la expresión de múltiples genes y
miRNAs involucrados en proliferación celular, autorrenovación celular, diferenciación mamaria,
transición epitelio-mesenquimal y comunicación celular 8.
La principal causa de mortalidad por cáncer de mama resulta de la diseminación de las
células tumorales a tejidos distintos del que da origen al tumor primario. Este proceso es
denominado metástasis, y su prevención y/o cura representa en la actualidad el principal desafío
clínico en el campo de la oncología.
Recientemente, demostramos que, en un contexto de SM, CtBP1 regula la expresión de
genes y miRNAs que se encuentran involucrados en el proceso de metástasis 8. En base a esto,
el objetivo general de este proyecto es investigar el rol de CtBP1 y el SM en la metástasis
del cáncer de mama y los mecanismos moleculares que son orquestados por CtBP1
durante este proceso. Nuestra hipótesis es que el aumento de la actividad de CtBP1 en
tumores mamarios resultante del SM, produce una disminución en la expresión de genes
involucrados en adhesión y/o migración celular, acelerando el proceso de metástasis de
cáncer de mama.
2.- Objetivo general
Para responder a la hipótesis planteada el objetivo general de este proyecto es investigar el
rol de CtBP1 y el SM en la metástasis del cáncer de mama y los mecanismos moleculares
orquestados por CtBP1 durante este proceso.
3.- Objetivos específicos
En base a la hipótesis nos proponemos los siguientes objetivos específicos:

Objetivo 1. Investigar el rol del SM en la metástasis del cáncer de mama.

Objetivo 2. Investigar el rol de CtBP1 en la adhesión y migración de células
tumorales mamarias 4T1.

Objetivo 3. Identificar el efecto de CtBP1 y el SM en la inducción de la transición
epitelio mesenquimal.
4.- Metodología
En las siguientes secciones describiremos la metodología para llevar a cabo cada
uno de los objetivos.
4.1.- Objetivo 1. Investigar el rol del SM en la metástasis del cáncer de mama.
Investigaremos el efecto de CtBP1 en la metástasis del cáncer de mama utilizando un modelo
murino de síndrome metabólico y xenotransplantes mamarios derivados de células tumorales
mamarias 4T1. La presencia de metástasis en pulmón, hígado y hueso se evaluará por histología
y mediante un ensayo clonogénico de metástasis en presencia de 6-tioguanina.
Para ello, 12 ratones Balb/c hembra de 4 semanas de edad que serán mantenidos de
acuerdo a las normas del bioterio del Intituto de Biología y Medicina Experimental (IByME –
CONICET). Los animales serán divididos azarosamente en dos grupos: dieta control o dieta
grasa. Así, los animales serán alimentados durante 10 semanas con alimento control (DC, 5%
grasa, 4640 kcal/kg) o alimento rico en grasas (DG, 37% grasa, 6040 kcal/kg). Al cabo de 12
semanas los animales serán inoculados en la almohadilla de grasa mamaria inguinal izquierda
con 106 células 4T1 en 0.2 l de medio RPMI. Luego de 17 días post-inoculación los animales
serán sacrificados y se evaluará la presencia de metástasis en pulmón, hueso e hígado. Para ello,
se tomarán muestras de tejido para analizar por histología. Por otra parte se tomarán muestras
de pulmón e hígado para ser procesados para realizar un ensayo clonogénico. Brevemente,
muestras de tejido de pulmón e hígado serán disgregadas y luego tratadas con 2mg/ml de
colagenasa tipo 4 a 37°C durante 1 hora. Luego las células disgregadas serán filtradas con filtro
de 70 m, centrifugadas a 2000 rpm durante 5min, lavadas 2 veces con PBS y resuspendidas con
10ml de RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino y 60M de 6-tioguanina. Para
realizar el ensayo clonogénico diluciones seriadas de cada suspensión celular (factor de dilución
10) serán sembradas en placas de 6 pocillos durante 10 días sin cambios de medio. Al cabo de
ese tiempo se fijarán los pocillos con metanol durante una hora, los focos de crecimiento serán
teñidos con cristal violeta 1% y se cuantificará el número de colonias por pocillo.
4.2.- Objetivo 2. Investigar el rol de CtBP1 en la adhesión y migración de células tumorales
mamarias 4T1. Realizaremos ensayos in vitro de adhesión celular en células 4T1 con
sobreexpresión de CtBP1 (pcDNA3 CtBP1) o células control (pcDNA3).
Para ello células 4T1 serán transfectadas transientemente con el plásmido pcDNA3 o pcDNA3
CtBP1, como fue descripto previamente8 y se analizará la expresión de CtBP1 en estas células
por Western blot. Para realizar el ensayo de adhesión se sembrarán 1,2 X 104 células en 200 l
de medio de cultivo en placas de 96 wells y se incubarán en estufa a 37 °C y 5% CO 2 durante 45
min. Al cabo de ese tiempo se descartará el medio de cultivo, se realizarán dos lavados con PBS
y las células adheridas a la placa serán fijadas en metanol durante 10 minutos. Luego se realizará
un lavado con PBS y se procederá a la tinción de las células con una solución de cristal violeta
0.5% durante 10 minutos. A continuación se realizarán dos lavados con PBS y luego se
resuspenderá el cristal violeta de las células teñidas en 60 l de una solución 10% metanol 5%
acético en agua y se medirá absorbancia a 620 nm. Finalmente se determinará la adhesión
celular como absorbancia a 620nm normalizada a los niveles de proteína total plaqueada y a las
células control. Para estudiar la migración celular, se realizarán ensayos de la herida (wound
healing assay). Brevemente, células 4T1 serán transfectadas con el plásmido pcDNA3 o pcDNA3CtBP1. Al llegar a confluencia, se realizará una herida en la monocapa de células, y se
monitoreará la migración hacia la herida mediante la adquisición de imágenes digitales.
Finalmente se procederá a la cuantificación del porcentaje de cobertura de la herida y la
comparación entre tratamientos.
4.3.- Objetivo 3. Identificar el efecto de CtBP1 y el SM en la inducción de la transición
epitelio mesenquimal. Realizando RT-qPCR analizaremos si la expresión de CtBP1 se
encuentra modulada por SM en los tumores primarios. Para evaluar el rol de CtBP1 y/o el SM en
la inducción epitelio mesenquimal determinaremos la expresión génica de un panel de genes
involucrados en EMT en los xenotransplantes crecidos en ratones con SM o control.
5.- Referencias
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