Document related concepts
Transcript
XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES DE E.COLI MEDIANTE LA INSERCIÓN DEL PLÁSMIDO PGEM-4Z EN LA CEPA DH5 Lizeth Haro Rangel Medico cirujano de la Universidad Autónoma de Nayarit, lizethharo@outlook.es. Asesor Dr. en C. José Arellano Galindo Hospital Infantil de México Federico Gómez, jose.arellano@salud.gob.mx. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Recientes avances en técnicas de recombinación de DNA han hecho posible aislar copias de DNAc de un gen mediante la complementación de un particular defecto en células sin información del producto de dicho gen; permitiendo darles la capacidad de expresar un fenotipo de interés. El desarrollo de estos clones celulares mediante un plásmido recombinante permite estimar la eficiencia de la transformación y la capacidad de competencia celular. METODOLOGÍA Como primer paso se selecciono la cepa de E. Coli (DH5), la cual debía cumplir con propiedades que potenciaran la transformación, así como también se selecciono el plásmido, el cual cuenta con el tamaño y con los sitios de unión a enzimas de restricción (AMPr) necesarios para la recombinación del gen a expresar. Como segundo paso se eligió el protocolo con mayor eficacia de transformación celular. El protocolo seleccionado fue el Método de Inoue (1990), el cual cuenta con una serie de pasos que fueron optimizados para obtener una alta frecuencia de transformación. El material utilizado fue: DMSO, Amortiguador de transformación Inoue (descongelado a 0°C antes de usar), Plásmido recombinante de DNA, medios SOB , SOC Y LB , cepas DH5 competentes, ampicilina. Dentro del protocolo utilizado se realizaron algunas modificaciones para optimizar la eficacia de transformación, como la concentración de ampicilina 25 ug/ml. También se utilizo el protocolo Cribado de colonias usando X-gal e IPTG: complementación ay Preparación del plásmido de DNA por la Lisis Alcalina con SDS: Minipreparación. Para ello se necesitaron soluciones de lisis alcalina I,II y III, así como también una solución STET, X-gal e IPTG. Finalmente el plásmido fue extraído de las colonias transformantes, posteriormente fue sometido a electroforesis, esto para corroborar la competencia celular y que el plásmido PGEM-4Z se encontraba en las células. CONCLUSIONES El método de transformación celular mediante el plásmido recombinante permitió expresar colonias resistentes de E. coli ante la ampicilina. La finalidad de la inducción de clones celulares en la actualidad ha permitido grandes avances en la práctica clínica, permitiendo expresar información de determinados genes en células que carecen de la secuencia de dicho gen, aportando el plásmido DNA recombinante una mayor ventaja en todas aquellas células sometidas a la expresión del vector. Toda esta tecnología ha permitido aplicar los sistemas de vectores en diversas áreas de la medicina, creando futuros más comprometedores y dando una buena calidad y cantidad de vida a la humanidad. Ya que estas intervenciones permiten modificar la fisiología de las células. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014
