Download articulo en formato PDF

EFECTIVIDAD BIOLÓGICA DE EXTRACTOS POLIFENÓLICOS CONTRA
BACTERIAS FITOPATÓGENAS
1
2
2
Eduardo Osorio-Hernández , Janeth M. Ventura-Sobrevilla , M. Flores-Dávila , Faustino
2
2
1
1
Lara , Raúl Rodríguez-Herrera F. D. Hernández-Castillo y Cristóbal N. Aguilar *
1.
2.
Departamento de Parasitología Agrícola. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro,
Buenavista, Saltillo, Coahuila, México.
Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad
Autónoma de Coahuila, México. *cristobal.aguilar@mail.uadec.mx
RESUMEN
La tendencia mundial por encontrar productos de origen natural para el control de bacterias fitopatógenas ha creado
la necesidad de detectar y estudiar plantas con potencial bactericida. El objetivo de esta investigación fue evaluar la
efectividad antibacteriana de extractos de gobernadora (Larrea tridentata Cov.), nuez (Carya illinoensis) y la granada
(Púnica granatum), se probaron 4 concentraciones de cada uno de los extractos (Gobernadora, 0.77, 0.35, 0.17,
0.08 ppm; nuez, 0.20, 0.10, 0.05, 0.02 ppm; granada. 0.21, 0.11, 0.05, 0.02 ppm), el efecto de estas
concentraciones se evaluaron sobre Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith y col., 1992) Dye, Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria (Doinge); Erwinia carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye y Pseudomonas cichorii
(Siwingle) Stapp. La inhibición del crecimiento se evaluó después de 60 h de la inoculación. El mayor efecto
inhibitorio se observó que el extracto de hojas de gobernadora, mientras que las bacterias fitopatógenos más
susceptibles fueron Pseudomonas cichorii y Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria.
Palabras clave: Larrea tridentata, Carya illinoensis, Púnica granatum.
1. INTRODUCCIÓN
Las bacteria causan importantes pérdidas a la agricultura mundial, estos patógenos son importantes porque causan
enfermedades devastadoras, cuando se presentan las condiciones ambientales adecuadas; Entre los géneros de
importancia agrícola se encuentran las bacterias Erwinia, Pseudomona y Xanthomona. (Aranda, 2002). La
aplicación excesiva e indiscriminada de bactericidas para el control de enfermedades agrícolas ha ocasionado un
sin número de problemas de resistencia, afectación del medio ambiente y graves complicaciones a la salud humana.
Además de que elevan los costos de producción por la utilización de esta clase de bactericidas. Ante esta situación,
el nuevo enfoque en el combate de las bacterias trata de integrar nuevas opciones encaminadas a la protección y
aumento de cosechas pero con alternativas no perjudiciales; en este caso la utilización de sustancias de origen
natural, que las mismas plantas han desarrollado a través de la evolución pueden ser una alternativa para limitar
poco a poco el uso de agroquímicos. Esto pudiera eliminar varios efectos adversos causados por el uso de
compuestos sintéticos debido a la rápida biodegradabilidad de los metabolitos orgánicos, ya que estos desparecen
con facilidad del medio ambiente aéreo y del suelo después de que son aplicados en el campo (Tanaka y
Andomuro, 1993).
La tendencia mundial por encontrar productos de origen natural para el control de enfermedades causadas por
bacterias fitopatógenas tales como: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli que ocasiona el tizón común del fríjol,
Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria que ocasiona mancha bacteriana; Erwinia carotovora subsp. carotovora
causante de la enfermedad pudrición blanda y Pseudomonas cichorii que ocasiona la bacteriosis de la lechuga, ha
creado la necesidad de detectar y estudiar plantas que tengan un potencial de uso como bactericidas naturales,
debido a los metabolitos secundarios que biosintetizan y que tienen un efecto bactericida, tratando con ello de que
en un futuro se puedan generar productos orgánicos derivados de la misma para el control de enfermedades
agrícolas.
La búsqueda de estrategias, técnicas y métodos que incrementen la productividad agrícola y mantengan el equilibrio
ecológico sin agredir los ecosistemas, sin arriesgar la salud humana, constituye hoy en día un gran reto para la
agricultura y su desarrollo (Gallegos y col., 2004). Existen antecedentes que indican el potencial antimicrobiano de
componentes de especies vegetales distribuidas en la zona semidesértica de México. Entre estas especies
vegetales destacan la gobernadora (Larrea tridentata Cov.) (Lira, 2003), mientras que la nuez (Carya illinoensis) y la
granada (Punica granatum) se encuentran en menor proporción y en regiones localizadas del semidesierto
mexicano. Estos últimos cultivos se caracterizan por tener una gran cantidad y variedad de polifenoles.
Dentro de los compuestos polifenólicos que presentan la gobernadora (Larrea tridentata Cov.), la nuez (Carya
illinoensis) y la granada (Punica granatum) están los galotaninos, elagitaninos, taninos complejos y taninos
condensados, los cuales tienen funciones de protección contra mamíferos y microorganismos. Se sabe que los
taninos en concentraciones altas son antinutricionales, pues contienen muchos grupos funcionales del tipo OH, los
cuales reaccionan fácilmente con proteínas y polisacáridos, volviendo estos productos insolubles, y de esta manera,
impiden su absorción. Además la hidrólisis de estos compuestos genera monofenoles de alto interés médicofarmacéutico, alimentario, agronómico e industrial. La distribución de los compuestos fenólicos en los tejidos y
células vegetales varía considerablemente de acuerdo al tipo de compuesto químico que se trate, situándose en el
interior de las células o en la pared celular. Debido a que a la cáscara de la nuez y de la granada se considera
como basura y no se le da un uso, en el presente trabajo se plantea aprovechar estos materiales, así como también
aprovechar el recurso de la gobernadora como inhibidores del crecimiento de bacterias fitopatógenos.
Hay reportes de la inhibición del crecimiento bacteriano por extractos vegetales (Güven y col., 2005, Güven y col.,
2006). El efecto sobre el crecimiento de bacterias patógenas de humanos también ha sido observado;
Staphylococcus aureus fue inhibido con la aplicación de extracto de Indigofera suffruticosa (Pereira y col., 2006;
Orhan y col., 2007). Escherichia coli y Pseudomonas aerugeniosa fueron inhibidos con extractos de Lupinus
angustifolius (Erdemoglu y col., 2007); Helicobacter pylori fue inhibida con extractos de ajo (Cellini y col., 2006 ).
Extractos vegetales metanólicos y acuosos han resultado efectivos para inhibir el crecimiento de diversos bacterias
(Koduru y col., 2006). Extractos de Cajanus cajon, usando como solventes agua, éter de petróleo, etanol, cloroformo
y metanol inhibieron el crecimiento de E. coli, S. aureus y Salmonella typhimurum (Okigbo y col., 2006). Los
reportes de inhibición del crecimiento de bacterias fitopatógenas por extractos vegetales son menos numerosos,
destacando el trabajo reportado por Pretorius y col. (2003), quienes probaron extractos de 26 especies vegetales
contra 5 bacterias fitopatógenas reportando que todos los extractos tuvieron efecto inhibitorio. El objetivo del
presente trabajo fue evaluar la efectividad biológica de extractos polifenólicos contra bacterias fitopatógenas.
2. MATERAILES Y MÉTODOS
2.1 Obtención del material vegetal
Las muestras de follaje (hojas y pequeños tallos) de gobernadora fueron recolectadas en los suburbios de la ciudad
de Saltillo, las cáscaras de la nuez y granada se obtuvieron de las ciudades de Ramos Arizpe y Sabinas todas
estas ciudades del estado de Coahuila México. El material vegetal fue secado a 60 0C por 48 h posteriormente fue
pulverizado y almacenado a temperatura ambiente en recipientes obscuros para evitar la oxidación de polifenoles
por exposición directa a la luz.
2.2 Extracción de polifenoles
Los extractos de la gobernadora y nuez se llevaron a cabo mediante destilación a reflujo. Para el caso de de
gobernadora se empleo una proporción 1:4 de material seco y acetona al 70 %. Para la nuez se empleó metanol al
70 % relación 1:4 y para el caso de la extracción de polifenoles de la granada, en un recipiente de plástico, se
colocaron 150 g de polvo de cáscara y se utilizó como solvente el agua (relación 1:5).
2.3 Efectividad antibactericida de extractos polifenoles
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli fue aislada de semillas de fríjol (Phaseolus vulgaris), las cuales se
desinfectaron con cloro y enseguida se colocaron en un matraz con agua destilada, posteriormente se agregó
peptona y se mantuvo en agitación durante tres horas, enseguida se realizó la siembra en cajas petri con medio B
King (KB), posteriormente se realizó la identificación de acuerdo a las claves de Schaad y col. (2001). Para el caso
de Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria se aisló de tomate, Pectobacterium carotovora subsp. carotovora se
aisló de papa y Pseudomonas cichorii se aisló de lechuga. Para el aislamiento se tomó material enfermo y se puso
en una bolsa de maceración a la cual se le agrego agua destilada y posteriormente se realizó la siembra para el
caso Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria se utilizó el medio de B King, mientras que para el Pectobacterium
carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye y Pseudomonas cichorii (Siwingle) Stapp se utilizó el medio de KB.
Posteriormente se realizó la identificación siguiendo las clave Schaad y col. (2001).
2.4 Conservación y activación de las bacterias
Las bacterias fueron conservadas en tubos de Eppendorf (1.5 mL), en los que se agregaron 100 µL de bacteria
activa con 500 µL de caldo (KB sin peptona) y se posteriormente se congelaron a una temperatura ≥ -20 ºC. Para
la activación se prepararon diluciones bacterianas agregando 100 µL de la bacteria activa, a un tubo de ensaye con
4 mL de caldo KB, enseguida se mezcló y la solución se leyó en un espectrofotómetro (THERMO SPECTRONC) a
625 nm, ajustándose a 0.08-0.1 de absorbencia, esta turbidez corresponde a una concentración de 1.5x108
UFC/mL.
2.5 Bioensayo de la inhibición de los extractos sobre las bacterias fitopatógenas
El Bioensayo se realizó en microplacas de poliestireno esterilizadas en autoclave por 20 min. a una presión de 5-10
Lb. A cada pozo de la placa se le agregó 200 µL de medio KB, el medio se dejó reposar durante 30 minutos,
enseguida se le agregaron 20 µL de inóculo (previamente ajustado), después se agregaron 20 µL de extracto a
diferentes concentraciones (Cuadro 1) y se empleó el agua como Testigo. Las microplacas fueron incubadas a 28 ºC
durante 60 h. La observación microscópica se realizó con un estereoscopio, esto con el fin de determinar la
inhibición del crecimiento de manera cualitativa.
Cuadro 1. Concentraciones (ppm) de los extractos polifenólicos evaluados a diferentes
concentraciones sobre la inhibición de crecimiento de bacterias fitopatógenas.
Extracto
Gobernadora
Nuez
Granada
Concentración (ppm)
0.70
0.20
0.21
0.35
0.10
0.11
0.17
0.05
0.05
Testigo
0.08
0.02
0.02
0
0
0
2.6 Diseño experimental
El análisis estadístico que se utilizó fue un diseño completamente al azar con arreglo factorial donde los factores
fueron tipo y concentración del extracto y la especie bacteriana. La unidad experimental fue un pozo de la
microplaca, se utilizaron 6 repeticiones, la variable de respuesta fue la inhibición del crecimiento, la cual se evaluó
en forma cualitativa (presencia, ausencia). Para la evaluación de los resultados se empleó un análisis categórico de
datos usando tablas s x r donde las variables de las columnas y de las hileras fueron clasificadas nominalmente.
Para este análisis se empleó el programa SAS Versión 1997.
3. RESULTADOS Y DISCUSION
Evaluación de la actividad biológica de los extractos, sobre cepas de bacterias fitopatógenas
El estadístico al azar de Qs está marcado como Chi-cuadrada de Mantel-Haenszel, el valor Chi-cuadrada de
Pearson Qp esta etiquetado “Chi-cuadrada”. Qs tiene un valor de 21.073 (Cuadro 2) y P=0.001; Qp tiene un valor de
173.413 y P=0.001, ambos son altamente significativos, por lo que se concluye que hay una estrecha asociación
entre el extracto y la inhibición del crecimiento de las bacterias. Para el variable extracto se encontró un valor de
21.073 el cual es altamente significativo, por lo tanto los extractos inhiben en forma diferente el crecimiento de las
bacterias (cuadro 3). La gobernadora inhibe más el crecimiento de las bacterias seguido del extracto de la nuez y
finalmente el extracto de granada presentó menor efecto inhibitorio (cuadro 4). El valor QMH para la correlación no
cero fue =21.073, con 1 grado de libertad este es claramente significativo, lo cual refuerza la idea de la relación
estrecha entre el extracto y la inhibición de crecimiento de la bacterias (Cuadro 3). Una posible explicación es que la
gobernadora presenta una mayor concentración de polifenoles, en comparación con la nuez y la granada. Cabe
señalar que Aguilera-Carbo y col. (2005) reportan que la gobernadora y la granada tienen efectos inhibitorios sobre
bacterias de alimentos a concentraciones mayores de 50 µgmL-1. En este estudio se evaluó el efecto de los
extractos de gobernadora sobre el crecimiento de bacterias fitopatógenas, con resultados que coinciden con los
reportados para bacterias de alimentos. Es de enfatizar que aunque no se tienen estudios del efecto de los tres
extractos (gobernadora, nuez y granada) sobre bacterias fitopatógenas, Peralta-Bello (2006) reportó que se
presentó inhibición del crecimiento de las bacterias Pseudomanas cichorii, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli y
Erwinia carotovora pv atroseptica, con extractos de Flourensia cernua D.C. El control de Xanthomonas axonopodis
pv vesicatoria y de Erwinia carotovora carotovora es importante dado que la primera es el agente causal de la
enfermedad conocida como mancha bacteriana de tomate y chile, mientras que la segunda causa daños estimados
entre 10 y 60 % en frutos de chile. Las plantas se enferman aproximadamente a los 40 días de su plantación (García
y col., 2000) las recomendaciones tradicionales para controlar de estas enfermedades son las aplicaciones de
bactericidas a base de cobre combinadas con mancozeb o estreptomicina; sin embargo, su control no ha sido del
todo satisfactorio (Carrillo y col., 2001). Para estas bacterias los extractos vegetales probados en esta investigación
tiene potencial como un método alternativo de control.
Cuadro 2. Estadístico de extracto menos inhibición de las bacterias
bacte
fitopatógena
genas
Estadístico
Chi-Cuadrado
Cuadrado
Taza de versimilitud Chi-Cuadrada
Cuadrada
Chi-Cuadrada Mantel-Haenszel
Haenszel
Coeficiente Phi
Coeficiente de Contingencia
Cramer's V
Muestras totales = 475
Grados de libertad
6
6
1
Valor
173.413
209.316
21.073
P
0.001
0.001
0.001
0.604
0.517
0.427
Inhibicion del crecimiento
De acuerdo a las concentraciones del extracto de gobernadora que see utilizaron (figura 1) se observo claramente que
a mayor concentración es mayor la inhibición, ya que las concentraciones
c
1 y 2 inhibieron
on totalmente el crecimiento
de las 4 bacterias (P. c. subsp. c= Pectobacterium carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye, X. a. pv. p=
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli,
phaseoli X. a. pv. v= Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria y P. c= Pseudomonas
cichorii, mientras con el testigo no hubo
hu inhibición del crecimiento. Estos resultados coinciden con lo obtenido por
Peralta-Bello (2006), obtuvo extractos de Flourensia cernua D.C. con diferentes
tes solventes (hexano, éter, etanol,
e
metanol-cloroformo) y observó que el mayor efecto inhibitorio se presentó a la concentración más alta (4000 ppm).
ppm)
Extractos de plantas con alto contenido de taninos como la corteza de mimosa han reportado tener una gran actividad
antibacteriana. La resina de gobernadora a dosis bajas tiene efectos bactericidas contra las bacterias fitopatógenas
Erwinia amylovora, E. atroseptica y Pseudomonas solanacearum (Lira-Saldivar, 2003). Para el extracto
e
de cáscara de
nuez (Figura 2), se observó que sólo la concentración más alta inhibió el crecimiento
ento de las 4 bacterias fitopatógenas,
fitopatógena
cabe señalar que no existen trabajos que
q evidencien el potencial inhibitorio de estos extractos sobre bacterias
fitopatógenas. La figura 3 muestra el efecto de las concentraciones del extracto de granada, sobre el crecimiento
bacteriano, en este caso solo la concentración
concent
más alta inhibió el crecimiento de las cuatro bacterias fitopatógenas.
100
80
60
40
20
0
P.c. sub.c
X.a. pv. v
P.c
X.a.pv. p
Inhibicion del crecimeinto (%)
Concentraciones
Figura 1. Inhibición del crecimiento
cre
de 4 bacterias fitopatógenas sometidass
a 4 concentraciones de extracto de gobernadora.
100
50
0
C1
C2
C3
C4
P.c
X.a.pv.
X.va. pv. p
TestigoP. c. sub.c
Concentraciones
Figura 2. Inhibición de crecimiento de 4 bacterias
bacteri fitopatógenas sometidass
a 4 concentraciones
co
del extracto del cáscara de nuez.
Inhibicion del crecimiento (%)
100
80
60
40
20
X.a. pv. v.
0
P.c.sub. C
Concentraciones
Figura 3. Inhibición de crecimiento
cre
de 4 bacterias fitopatógenos sometidass
a 4 concentraciones
co
del extracto de cáscara de granada.
Cuadro 3. Comparación estadística para el efecto del extracto sobre el crecimiento bacteriano con el estadístico
Cochran--Mantel-Haenszel (Basado en calificaciones de rango).
___________________________________________________
Estadístico Hipótesis alternativa
gl
Valor
Prob
___________________________________________________
1 Correlación no cero
1 21.073
0.001
2 Difer. Calific.promedio hileras 2 37.089
0.001
3 Asociación general
6 173.048
0.001
___________________________________________________
Número total de muestras=475
Cuadro 4. Porciento de crecimiento de diferentes bacterias fitopatógenas expuestas
a tres extractos vegetales y cuatro concentraciones
P.c. sbsp. c Ps. c X. a. pv ph X. a. pv v
Total
50
0
25
0
75
10.53
0.00
5.26
0.00
15.79
66.67
0.00
33.33
0.00
33.33
0.00
14.29
0.00
_____________________________________________________________
Granada
75
75
75
75
300
15.79
15.79
15.79
15.79
63.16
25.00
25.00
25.00
25.00
50.00
100.00 42.86
100.00
_________________________________________________________________
Nuez
25
0
75
0
100
5.26
0.00
15.79
0.00
21.05
25.00
0.00
75.00
0.00
16.67
0.00
42.86
0.00
_________________________________________________________________
__________________________________________________
Total
150
75
175
75
475
31.58
15.79
36.84
15.79
100.00
_______________________________________________________________
Gobernadora
4. CONCLUSIONES
Las mayores actividades inhibitorias sobre el crecimiento de las bacterias fitopatógenas se presentaron a las dosis
más alta en todos los extractos. Por su parte los extractos de follaje de gobernadora y de cáscara de nuez
mostraron mayor efecto bactericida en comparación con el extracto de cáscara de granada. Finalmente las bacterias
más sensibles fueron Pseudomonas cichorii y Xanthomonas axanopodis pv. vesicatoria.
5. Agradecimientos
El presente trabajo forma parte del proyecto CONAFOR-CONACYT-2004-13
6. Referencias
Aguilera-Carbo, A. 2005. Efecto Inhibitorio del acido elágico Obtenido de Cáscaras de granada (Púnica granatum) y
gobernadora (Larrea tridentata) sobre diferentes microorganismos patógenos. Memorias, Congreso internacional de
Inocuidad Alimentaría. Monterrey Nuevo León, México.
Aranda O S. 2002. Enfermedades Bacterianas en Ornamentales. In: Manejo Fitosanitario en Ornamentales. N.
Bautista M., J. Alvarez L, J. C. Chavarria P, H. Sánchez A ed. Colegio de Postgraduados,
Montecillo,
Texcoco, Estado de México, 156 pp.
Carrilo F J A, García E R S, Allende M R, Millan O S y Gaxiola, E G. 2001. Sensibilidad a cobre de cepas de
Xanthomonas campestris pv. vesicatorio (Doidge) Dye, en Sinaloa, México.19(1): 72-77.
Cellini L, Di Campli E, Masulli M, Di Bartolomeo S y Allocati, N. 2006. Inhibition of Helicobacter pylori by garlic extract
(Allium sativum). FEMS Inmunology & Medical Microbiology. 13(4): 273-277.
Erdemoglu N, Ozkan S y Tosum, F. 2007. Alkaloid profile and antimicrobial activity of Lupinus angustifolius. L.
Alkaloid extract. 6(1,5): 197-201.
Gallegos M G, Cepeda S M y Olayo, P R P. 2003. Entomopatógenos. Ed. Trillas, México, 9-10 pp.
García R S E, Juárez R C, Carillo F J A, Allende M A, Márquez Z I y Muy, R M D. 2000. Marchitez bacteriana en
chile bell causada Erwinia carotovora subsp. carotovora. Revista Mexicana de Fitopatología. 18(2): 120-124.
Güven K Y, Yücel E y Cetinas, F.2006. Antimicrobial activities of fruits of crataegus and pyrus species.
Pharmaceuticas Biology. 44(82): 79-83.
Güven K, Celik S y Uysal, I. 2005. Antimicrobial Activity of Centaurea Species. Pharmaceutical Biology. 43 (1): 6771.
Koduru S, Grierson D S y Alfolayan, A J. 2006. Antimicrobial Activity of Solanum aculeastrum. Pharmaceutical
Biology. 44(4): 283-286.
Lira-Saldivar, R H. 2003. Estado actual del conocimiento sobre loas propiedades
biocidas de la gobernadora
[Larrea tridentata (D. C.), Coville]. Revista Mexicana de Fitopatología. 21(2): 214-221.
Okigbo R N y Omodamiro, O D. 2006. Antimicrobial effect of leaf extracts of pigeon pea (Cajanus cajan (L.) Millsp.)
on some human pathogens. Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 12(1-2): 117-127.
Orhan I, Özçelik B, Aslan S, Kartal M, Karaoglu T, Şener B, Terzioglu S y Choudhary, M. 2007. Antioxidant and
antimicrobial actions of the clubmoss Lycopodium clavatum L. Phytochemistry Reviews. 6(1): 189-196.
Peralta-Bello, J E. 2006. Evaluación de la actividad de extractos de hojas en Flourensia cernua D.C. in vitro en el
control de las bacterias fitopatógenas; Xanthomonas campestres pv. phaseoli (Smith) Dye., Erwinia carotovora pv.
atroseptica (Van may) Dye y Pseudomonas cichorii (Swingle) Stapp. Tesis de licenciatura. Universidad Autónoma
Agraria Antonio Narro. 55-62 pp.
Pereira L S, Cardoso V J R, Lys de M P, Pereira L R M, Menezes L V L, Satiro X H y Oliveira, L E. 2006.
Antimicrobial Activity of Indigofera suffruticosa. Evidence-based complementary and Alternative Medicine. 3(2): 261265.
Pretorius J C, Magama S y Zietsman, P C. 2003. Growth inhibition of plant pathogenic bacteria and fungi by extracts
from selected South African plant species. South Africa Journal of botany. 69(2):186-192.
Schaad N W, Jones J B, y Chun, W. 2001. Laboratory Guide for identification of plant pathogenia bacteria. 3 ed The
American Phytopathological Society, St Paul Minessota, 40-199 pp.
Smith I M, Dunez J, Phillips D H, Lelliott R A y Archer, S A. 1992. Manual de Enfermedades de las Plantas. MundiPrensa, España, 201-329 pp.
Tanaka Y T y Andomuro, S. 1993. Agroactive compound of Microbial Origin. Annu. Rev. Microbiol. 47: 57-87.