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PROTOCOLO EXPERIMENTAL CORRESPONDIENTE AL PROYECTO:
“AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION FUNCIONAL DE
BACTERIAS LACTICAS PRESENTES EN SUERO DE LECHE DE QUESO
RANCHERO ARTESANAL”
Responsable Técnico del Proyecto
América Chávez Martínez, Ph.D.
GRUPO DE TRABAJO
Instituciones participantes.
a
Facultad de Zootecnia y Ecología. Universidad Autónoma de Chihuahua.
b
Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Chihuahua.
Colaboradores.
Ph.D. América Chávez Martínez a, Ph.D. Ana Luisa Rentería M.a, Ph.D. Néstor
Gutiérrez b, Dr. Juan Ángel Ortega Gutiérrez a, Dr. Jose Carlos Rodriguez F a.
Chihuahua, Chih., Febrero de 2012
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I.INTRODUCCION
Existe una gran diversidad entre los quesos Mexicanos; ya que varían entre
otros aspectos en forma, tamaño, peso, tipo de pasta y maduración, esto
descontando las diferencias en proceso, a veces meros detalles, pero que
contribuyen finalmente a tipificar distintos productos. Por forma predominan los
cilindros más bien aplanados (v.g. queso Chihuahua). Sigue luego la forma de
prisma rectangular, como el Adobera y el mismo Chihuahua. No están ausentes
formas un tanto originales como la del Panela. Por tamaño y peso, la gama oscila
desde los pequeños Oaxacas hasta aquellos de varios kilos como el queso
ranchero. Por su tipo de pasta los quesos Mexicanos pueden ser blandos,
semiduros y duros; untables, tajables o rallables.
La mayoría de los quesos artesanales, como el ranchero, se elaboran con
leche cruda sin la adición de cepas iniciadoras y por ello en ocasiones se
presentan problemas para la salud. Para promover los quesos artesanales es
necesario tener prácticas de manufactura estandarizadas y conocer las
características finales del producto que se pueden lograr sólo después de una
comprensiva e integrada caracterización de los perfiles químicos, microbiológicos
y sensoriales (Freitas y Malcata, 2000).
La pasteurización de la leche juega un papel fundamental en el control de
bacterias patógenas, pero provoca una reducción importante de las poblaciones
bacterianas naturales involucradas en la producción de quesos. Sin embargo,
muchos productos tradicionales se elaboran con leche cruda y empleando las
cepas iniciadoras naturales, lo que produce un amplio rango de productos con
diferentes sabores, consistencias y calidades microbiológicas (Cogan y Col.,
1997). Estos productos son considerados como “premium” debido a sus
características organolépticas, sin embargo, el uso de cultivos iniciadores selectos,
necesario para favorecer las fabricaciones usualmente disminuye las
características únicas del producto original (Caplice y Fitgerarld, 1999).
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Bacterias acido lácticas (BAL)
En las dos últimas décadas, las BAL han recibido mucha atención,
particularmente los géneros utilizados como cultivos iniciadores, debido a su gran
importancia comercial. Las investigaciones se enfocan en aislar nuevas cepas con
el fin de estudiar sus potencialidades como fermentos iniciadores. Es un hecho
que las cepas iniciadoras influyen notablemente en los cambios químicos,
bioquímicos y sensoriales que ocurren durante la maduración de los quesos y el
uso de diferentes bacterias iniciadoras produce diferencias significativas en la
calidad de los quesos (Hayaloglu y Col., 2005). Una fuente inagotable de cepas la
constituye los productos artesanales, en especial los quesos (Hayaloglu y Col.,
2005). Algunas investigaciones se han realizado en queso Palmita (Ferrer,
Urdaneta y Rincon, 1991) con El-Khila [5], con Afuega´l pitu (Cuesta, 1996), con
quesos duros argentinos (Reinheimer y Col., 1996), con Tenerife (Belda, Zartate y
Cardell, 1997), en Manchego (Serrano y García, 1997) y en leche cruda (Chacón
y López-Corcuera, 2000), entre otros.
Las BAL poseen un complejo metabolismo que condiciona su actividad
proteolítica, la generación de ácido láctico y la producción de bacteriocinas. Es por
ello que las características organolépticas, tecnológicas y nutricionales del
alimento dependen de la presencia de estas cepas. La contribución en dos o más
características
antes
mencionadas
permite
clasificar
a
las
BAL
como
multifuncionales (Leroy y De Vuyst, 2004). Lactococcus (L.) lactis es un ejemplo
de multifuncionalidad por generar péptidos precursores de compuestos volátiles y
por determinar la textura de productos lácteos fermentados (Pihlanto-Leppälä et
al., 1998; Leroy y De Vuyst, 2004). L. lactis es utilizado ampliamente como cultivo
iniciador comercial, por lo que económicamente es importante (Savijoki et al.,
2006). Además se encuentra extensamente distribuido en la naturaleza
(Topisirovic et al., 2006). De acuerdo con Ayad et al. (1999), la generación de
compuestos volátiles está influenciada por el origen del aislamiento de las cepas
de L. lactis. Sin embargo, su capacidad para producir péptidos potencialmente
antihipertensivos y la repercusión que podría tener el origen del aislamiento de L.
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lactis ha sido poco investigada. Estudios recientes señalaron que cepas de L.
lactis aisladas de su nicho ecológico, particularmente leche cruda fermentada,
pueden generar péptidos con actividad antihipertensiva en leche fermentada
(Muguerza et al., 2006). Asimismo, se ha encontrado que estos microorganismos
pueden generar péptidos potencialmente antihipertensivos en queso fresco
(Torres-Llanez, 2007). Esto permite considerar la presencia de péptidos
inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina en leche fermentada con
cepas de L. lactis aislados de diversos orígenes
Por otra parte, las bacteriocinas producidas por las BAL, presentan
actividad antimicrobiana principalmente contra bacterias Gram positivias (De
Martinis et al., 2002; Thomas y Delves 2005).
La búsqueda y obtención de cepas que posean características tecnológicas
interesantes, tales como buena actividad acidificante o proteolítica, y que puedan
sobrevivir en productos lácteos, quesos, suero, podría permitir el desarrollo de los
procesos de fabricación manteniendo las características organolépticas de los
quesos y otros productos lácteos fermentados Baruzzi y Col., 2002).
En este trabajo se pretende aislar e identificar bacterias lácticas del queso
ahumado andino, caracterizar y seleccionar aquellas que posean aptitudes de
cultivo iniciador, y con ellas crear mezclas de cepas para fabricar un queso
ahumado andino pero empleando leche pasteurizada.
II.JUSTIFICACION
El estado de Chihuahua en el 2007 se ubicó en el cuarto lugar a nivel
nacional de producción de leche (817 millones de litros), aproximadamente el 40%
de esta producción es utilizada para la elaboración de queso (SAGARPA, 2007); la
mayor parte de esta producción se destina a la elaboración de queso Chihuahua,
sin embargo, la elaboración de otros productos como lo es el queso ranchero
artesanal representan una importante fracción de la producción total de queso en
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el estado. A la fecha no se ofrecen cultivos lácticos iniciadores específicos para
este producto.
III. HIPOTESIS
El suero de leche de queso ranchero artesanal contiene bacterias acido
lácticas responsables de las características organolépticas del queso ranchero
artesanal.
V. OBJETIVO GENERAL
Llevar a cabo el aislamiento, identificación y caracterización funcional de
bacterias lácticas presentes en suero de leche de queso ranchero artesanal.
VI. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Aislar bacterias acido lácticas (BAL) presentes en el suero de leche de
queso ranchero artesanal.
2. Llevar a cabo la identificacion bioquimica de las BAL aisladas
3. Llevar a cabo la caracterizacion tecnologica de las BAL aisladas:
actividad proteolitica, acidificante, antioxidante y lipolitica.
4. Evaluacion de las BAL a la resistencia a antibioticos y la capacidad
acidificante en presencia de antibioticos
5. Evaluar la compatibilidad entre cepas
6. Elaborar el cultivo lactico para elaboracion de queso ranchero artesanal.
7. Llevar a cabo el analisis sensorial del queso ranchero artesanal.
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VII. MATERIALES Y MÉTODOS
Análisis microbiológicos
El suero se obtendrá de las diversas regiones productoras de queso ranchero
artesanal existentes en el estado de Chihuahua. Se pesaran 10 g, y se
homogenizaran en 90 mL de agua fisiológica estéril. Se prepararan las diluciones
seriadas hasta 10–8 del homogenado, se sembraran por duplicado en placas de
Petri conteniendo medios selectivos para bacterias ácido lácticas: agar MRS de
Man, Rogosa y Sharpe (Merck) para Lactobacilos, agar Elliker (HiMedia) para
Lactococos y agar MSE de Mayeux, Sandine y Elliker (Biokar) para Leuconostoc.
Estas placas seran incubadas en condiciones de microaerofília durante 48 h a
37°C, las colonias seleccionadas seran crecidas en caldo Elliker o MRS y
conservadas a –20°C en el mismo caldo con 30% de glicerol haciendo el papel de
crioprotector. Los preinóculos de las cepas de interés seleccionadas para ensayos
posteriores, se incubaran en caldo MRS o Elliker a 37°C durante toda una noche.
Identificación de los géneros
Las cepas purificadas seran identificadas de acuerdo a los criterios del Manual
Bergey , y de Dellaglio y col. [Dellaglio y Col., 1994). Las pruebas de identificación
se realizaran principalmente para bacterias ácido lácticas (géneros Lactobacillus,
Lactococcus y Leuconostoc) ya que estos microorganismos son los que se utilizan
como fuente de cepas iniciadoras. Y la identificación bioquímica se llevara a cabo
utilizando kits comerciales (API).
Caracterización de las cepas aisladas.
Capacidad acidificadora de la leche
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200 mL de leche descremada y estéril UHT seran inoculados con 2 mL de cultivo
de las cepas a evaluar, se incubaron a 37°C y monitoreara el descenso del pH
hasta las ocho horas.
Resistencia a antibióticos
Los antibióticos utilizados seran: Penicilina G 1.000.000 U I (Valmorca),
Kanamicina 25 mg/mL (Bristol) y Cloxacilina 25 mg/mL (Beechman Research
Laboratories), el ensayo se realizara mediante el método del disco (Bauer y Co.,
1966) con algunas modificaciones. Las cepas a ensayar se incubaran en caldos
adecuados para cada una de ellas y luego dependiendo del género a usar, la
suspensión bacteriana se sembrara en cajas de Petri contentivas de agar Elliker o
MRS, en la superficie se colocaran los discos de papel de filtro (con diámetro de 5
mm) impregnados con soluciones de diferentes concentraciones de los antibióticos
(5; 25; 50; 75; 100 µg/mL), para la penicilina se considerara que 800.000 U I son
equivalentes a 500 mg. Después de una incubación por 12 horas a 37°C se
observara la aparición de halos de inhibición alrededor del disco, halos con
diámetro menor o igual a 5 mm indican resistencia de la cepa.
Capacidad acidificadora de la leche en presencia de antibióticos o productos
de limpieza
Para la prueba de acidificación de la leche con antibióticos, 200 mL de leche
descremada y estéril conteniendo antibióticos (Penicilina G, 25 µg/mL;
Kanamicina, 100 µg/mL o Cloxacilina, 100 µg/mL) seran inoculados con 2% v/v de
un cultivo de las cepas seleccionadas, y se incubaran a 37°C y se medira el
descenso del pH hasta las ocho horas.
Compatibilidad entre cepas
Para evidenciar la compatibilidad entre las cepas seleccionadas se utilizara el
método de difusión en agar (Collins y Col., 1991). Cajas de agar MRSseran
sembradas con cultivos de las cepas crecidas durante 24 horas, luego de una
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preincubación de 1 hora a 30°C se haran pocillos en el agar de las placas y se
llenaran con 50 µL del sobrenadante libre de células del cultivo de las cepas a
ensayar. Las placas serán incubadas por 24 horas a 37°C, se observara la
presencia o ausencia de halos de inhibición alrededor de los pocillos.
Preparación de los cultivos iniciadores
Para elaborar los cultivos iniciadores a ser empleados en la fabricación de los
quesos, cada cepa se cultivara independientemente en un volumen de leche
durante 12 horas a 37°C, al día siguiente se prepararan las mezclas de cepas
compatibles tomando volúmenes iguales de cada uno de los cultivos. Las cepas
seleccionadas se combinaran en pares y también se creara una mezcla de todas
ellas.
Elaboración de los quesos
Con las diferentes mezclas preparadas en el punto anterior se elaboraran los
quesos rancheros.
Análisis sensorial de los quesos
El análisis de los diferentes quesos se realizara por un grupo de 5 personas
expertas, entrenadas en ese tipo de actividad y familiarizadas con el queso. Los
quesos se evaluaran en 2 repeticiones y se consideraran atributos como:
características externas (forma del queso, consistencia, textura y color de la
corteza), características de la pasta (textura y color), aroma, sabor y aceptabilidad
general. Los resultados se calificaran mediante una prueba de puntos o
calificación ya que esta es la prueba que frecuentemente se emplea en los
paneles sensoriales. Posteriormente se aplicara un análisis de varianza para
detectar las diferencias entre los diferentes tipos de queso.
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