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Enzimas3los catalízadores
de la vida
http://booksmedicos.blogspot.com
T'r
.Ún el Capítulo5 hicimosreferenciaa AG', la variación
de energíalibre,y vimos su importanciacomo indicador
de la espontaneidad
termodinámica.Concretamente,
el
signode AG' nos dicesi una reacciónesposibleen la direcciónindicada,yla magnitudde A,G'indicala cantidad
de energíaquepuedeserliberada(o quedebesersuministrada),mientrasque la reaccióntienelugar en esadirecparalascualessecalculóAG'. Al
ción,bajolascondiciones
mismo tiempo,pusimoscuidadoen señalarque el parámetro termodinámicoAG' no puede proporcionarnos
ningunapista.encuantoa si una reacciónfactibletendrá
y a quévelocidad.En otraspalabras,
lugarrealmente,
AG'
nos dice si una reacciónpuedetener lugar pero no dice
nadaen absolutosobresi realmentetendrálugar.Paraesta
distinción,necesitamos
conocer,no sólo la direccióny la
energlade la reacción,sino tambiénalgoacercadel mecanismoy la velocidad.
Esto nos lleva al tema de la cat¡ílisisenzimática, porqueprácticamente
todaslasreacciones
o procesos
celulares
son mediadospor proteínas(o, en ciertoscasos,
ARN) catalizadorasllamadasenzimas.Las únicas reaccionesque
ocurrena unavelocidadapreciable
en una célulasonaquellasparalascualeslasenzimasapropiadasestánpresentes
y
activas.Así,las enzimascasisiempresignificanla diferencia entre<puedetenerlugar>y <tendrálugao en lasreaccionescelulares.Sólo cuandoexploramosla naturalezade
las enzimasy suspropiedades
catalizadoras,
comenzamos
quesonfactiblesenergéa entenderpor quélasreacciones
ticamente,tienen lugar realmenteen las célulasy cómo se
controlala velocidadde talesreacciones.
En estecapítulo,consideraremosprimero por qué las
reaccionestermodinámicamente
espontáneas
no tienen
lugar normalmentea velocidadesapreciables
sin un catali-
zador,y despuésveremos el papel delas enzimascomo catalizadoresbiológicos específicos.Thmbién veremos cómo
Ia velocidad de una reacción catalizadaenzimáticamente se
ve afectada por la concentración del sustrato disponible
para la reacción. Asimismo, se analizarán algunas de las
formas de regulación de la tasade reaccionesencaminadas
a satisfacerlas necesidadesde la célula.
Energía de activación y el estado
metaestable
Si se detienea pensarlo,ustedya estáfamiliarizadocon
muchasreaccionesque son termodinámicamente
factibles,aunqueno ocurranmuy a menudo.Un ejemploevidente,consideradoen eI Capítulo5, esla oxidaciónde la
glucosa(véaseReaccíón
5.9).Estareacción(realmente,
serie de reacciones)
es altamenteexergónica(AG'= -686
kcal/mol)¡ sin embargo,no ocurrepor sí misma.De hecho,la glucosaen forma cristalinao en solución,sepuede
exponeral oxígenodel aire indefinidamente,y la oxidación serámínima o inclusoinexistente.
La celulosadel papel sobre el cual estánimpresasestaspalabras,es otro
ejemplo,como lo es ustedmismo, que estáformado por
un conjuntocomplejode moléculastermodinámicamente inestables.
No tan cercanas,pero igualmenteimportantespara la
química celular,son muchasreaccionestermodinámicamentefactibles,pero que no tienenlugarpor sí mismasa
una velocidadapreciable.Como ejemplo,consideremosa
la moléculade alta energíaadenosinatrifosfato(AIP),la
cual tiene una AG' altamentefavorable(-7,3 kcal/mol)
para la hidrólisis de su grupo fosfatoterminal, durante la
y el estadometaestable
Energía
deactivación
r39
formación del correspondientedifosfato (ADP) y fosfato
inorgánico(P'):
moléculasdeATPI HzO alcancenel estadode transición.
AG" mide la diferenciaen la energíalibre entrelos reactivosy los productos(-7,3 kcal/molpara estareacción
AIP + HrO:
(6.1)
ADP + Pi
en particular),mientrasEo indica el mínimo de energía
Estareacciónesmuy exergónica
bajo condicionesesrequeridapara que los reactivosalcancenel estadode
tándare inclusolo esmás en las condicionesque prevale- transicióny, por tanto, seancapacesde dar lugar a los
cenen lascélulas.Sin embargo,a pesarde quela variación productos.
de energíalibre esmuy alta,estareaccióntienelugarpor sí
La velocidadreal de una reacciónes siemprepropormismasólolentamente,
de maneraqueel ATP permanece cional a la fracción de moléculasque tienen una energía
establedurante varios días cuando se disuelveen agua igualo mayorqueEo.Cuandoen una solucióna temperapura. Estapropiedadpareceser compartidapor muchas tura ambiente,lasmoléculasde ATP y aguasemuevenlimoléculasy reacciones
biológicas.
bremente,cadauna poseeuna ciertacantidadde energía
en un momentodado.Como semuestraen la Figura6.ib,
la
distribuciónde energíaentrelasmoléculastieneforma
La barrerade aetivaciónenergéticadebeser superada
de
campana;algunasmoléculastendránpocaenergía,alantesde quese puedaverificarunareacciónquimica
gunaspodrán tenermucha,y la mayoríaestarácercadel
Lasmoléculasque deberíanreaccionarentresí,a menudo promedio.El hechoa destacares que sólo las moléculas
no lo hacenporquecarecen
de energíasuficiente.
Paratoda
capacesde reaccionaren un instantedado,son las que tiereacción,hay una energíade activación específica(.Eo), nensuficienteenergíaparasuperarla barrerade energíade
definidacomo la cantidadmínima de energíaque los reacactivación(Figura6.1b,líneadiscontinua).
tivos debentener antesde que la colisiónentre ellostenga
éxito,dandoorigena los productos.Más específicamente,
Elestado
metaestable
eseilesultado
dela barera
los reactivosnecesitana).canzar
un estadocuímico interde
activación
medio llamado estadode transiciór, .tryi energíalibre
es mayor que la de los reactivosiniciales.La Figura6.la
La energíade activación es,para la mayoría de las reacciomuestrala energíade activaciónrequeridapara que las
nes biológicas a temperaturas celularesnormales, lo sufi-
Estado
de transición
(Ú
@
f
O
'q)
t\
c)
_o
(Ú
o)
c)
c
LU
1T:
t
A flo'
I
V
ADP+l
o
E
o
o
o
c)
E
z
.l
Fnornia
(a) Secuenciade reacción
¡inÁtina
/v1
de as moléculas
N2
(b) Activacióntermal
a
t\
5
o
.c)
c
c)
-c)
q)
LL
E
c)
c
o
c)
E
.l
z
(c) Secuenciade reaccióncon catalizador
Fnarníe
ninÁti¡a
,A' /1
de las moléculas\-.J
N;
(d) Activacióncatalítica
-.--\40
Gapítulo
6 Enzimas:
loscatal¡zadores
delavida
Figura6.1 Efectode la catálisisen la
ener$a de activacióny en el númerode
moléculascapacesde reaccionar.
(a) La energíade activación E, esIa
cantidad mínima de energíacinética que
deben poseerlos reactivos(aquí, ATP y
HrO) para permitir ias colisionesque
conducen a la formación del producto.
Cuando los reactivosrebasanla barrera
de energiade activacióny reaccionan,
los productos tienen una energíalibre
reducidaen una cantidadAG". (b) El
número de moléculasN1,que son lo
suficientementeenergéticaspara
sobrepasarla barrerade energíade
activacióny chocarsatisfactoriamente,
sepuede incrementar a N2, elevandola
temperatura de T, a Tr. (c) La energíade
activación también puede disminuirse
por un catalizador,(d) incrementándose
así el número de moléculasde \ a Nr',
sin que cambie la temperatura.
cientemente alta para que la proporción de moléculas que
posean mucha energía en un instante dado, sea extremadamente pequeña. Por consiguiente, la velocidad de las
reacciones no catalizadasen las células es müy baja, y la
mayoría de las moléculas parecen ser estables,pese a ser
reactivos potenciales en reaccionesfavorecidas termodinámicamente. Son, en otras palabras, termodinámicamente
inestables,pero no tienen la energía suficiente para sobrepasar la barrera de la energía de activación.
Talesmoléculas, aparentemente estables,se dice que eslas célgljts¿los- biológitán en un estado metaestable._P*arp
Si los reactivospueden
agruparsesobrealgúntipo de superficieque facilitequelas
porcionespotencialmentereactivasde lasmoléculasadyacentesse yuxtaponganapropiadamente,la interacciónse
veráfavorecidaenormementey la energíade activaciónreducida de maneraeficaz.
Latareadeproveerde tal superficiereactivaesla propia
de un catalizador,agenteque aumentalavelocidadde una
reacción,disminuyendola energíade activación (Figura
6.lc) y asegurandoque una proporción mayorde moléculas
seansuficientementeenergéticaspara experimentarla
Ia
enereí
de
acti-vggióg3lta
el..estado
cos celulares,
gíg
-'-y_
-{PGf'?YfFffireacción
sin suministrode calor (Figura6.1d).Una caracloi'b6fi
cel
ulare
s,
so
n
c
ru
c
iale
s,
cler
' - . - . . . . stabT-e
rn-etae
íftluEt6
.-:+,¡:,...-_"^,-..:,,'
r, i-e
_-_porque Ia ?ida, pdr sb'plopia naturaleza,es un sistema terísticaprimordialde un catalizadoresoueno semodifilejosdel equilibrio. capermanente_nqeIte.nisg__g9nsl¿rng.¡nienjrailalga$tqr-r
mantenidoen un estadoestacionario
rnle j-d-etodaslasreacciones t iene lugatSim plene¡te,plo poLsr! na_u¡ amb_i
Si no fuerapor el estadometaestable,
cuado pa¡a Q_c-i!!1adq
tenderíanrápidamenteal equilibrio y la vida seríaimposi¡949qió_q,
del peróxido
Podemosconsiderarla descomposición
La vida,por lo tanto,depende
ble tal comola conocemos.
de hidrógenoen aguay oxígeno,como un ejemplode cade quelasenergíasde activaciónseanaltas,evitandoque la
mayoríade las reaccionescelularesocurran a velocidades tálisis:
apreciables
en ausenciade un catalizadorapropiado.
(6.2)
2 H2O + 02
2 H 2 O 2- Loscatalizadores
superanla banerade la energ¡la
de activación
La energíade activaciónno es sólo importante para el,
sino que es taml
mantenimientodel estadometaestable,
bién una barreraquesedebesuperar,paraquelasreaccioadecuadas.
Dado
nesdeseables
tenganIugara velocidades
que el contenidoenergéticode una moléculadadadebe
superarEoantesde que la moléculaseacapazde reaccionar, la única manerade que puedaverificarseuna reacción basadaen reactivosmetaestables,
a una velocidad
proporción
de moléculassufiadecuada,
es aumentarla
energéticas.
Estosepuedeconseguir,
bien aucientemente
mentandoel contenidomedio de energíade todaslasmoléculas,o bien reduciendoel requerimientode energíade
activación.
Una manerade incrementarel contenidode energíadel
sistemaes suministrandocalor.Como muestraIa Figura
incrementandola temperaturadel sis6.lb, simplernente
tema desdeT, a T, seaumentarála energiacinéticade las
por tanto, que hayaun mayor númoléculas,asegurando,
merode moléculasreactivas(N, lugarde {). Así,lahi"r
calentandola soludrólisis de AIP podría ser facilitada
ción, esdecir,confiriendo a cadamoléculade ATP y agtJa
másenergía.EI problemade usaruna temperaturaelevada
es que es incornpatiblecon la vida, porque los sistemas
biológicosrequierenuna temperaturarelativamenteconstante. Las célulasson esencialmentesistemasisotérmicos
(temperaturaconstante)y requierenmétodosisotérmicos
para resolverel problemade la activación.
La alternativaa un incrementode la temperaturaesreducir el requerilqlelQ_dcll-ilqlg1a_d9_aclivaqaa.Dc,ese
r-nodo,nos aseguramosde que una proporción mayor de
Éstaesuna reaccióntermodinámicamentefavorecida,pese
a que el peróxido de hidrógeno existaen un estadometaestabledebido a la alta energíade activaciónde la reacción.Sinembargo,si añadimosun númeropequeñodeiones de hierro (Fe") a una solución de peróxido de
hidrógeno,la reacciónde descomposición
tienelugarunas
30.000vecesmás úpida quesin los ionesde hierro.Claramente,el ion Fe'- esel catalizadoren estareacción,reduciendola energíade activación(comosemuestraen la Figura 6.1c)y, por tanto, asegurandoque una proporción
significativamentemayor de moléculasde peróxido de hidrógeno(30.000vecesmás) poseanIa energíaadecuada
paradescomponerse
a la temperaturadada,sin necesidad
adicional.
de aporteenergético
En las células,la soluciónpara la descomposición
del
peróxidode hidrógenono esla adiciónde ionesférricos,
sino la enzimacatalasa,una proteínaque contienehierro.
En presenciade Ia catalasaIa reacciónes 100.000.000
de
vecesmásrápidaque en ausenciade catalizador.La catalaquísacontieneátomosde hierro retenidosen estructuras
micasllamadasporfirinas.Así,la ventajade la catálisisinorgánicaseincorporadentro del contextode una molécula
proteica.Estacombinaciónda lugar a un catalizadormucho más eficazparaladescomposicióndel peróxido de hidrógenoque los ionesde hierro aislados.El incrementode
la velocidadde, aproximadamente,108vecespanla catalasa,no es un valor atípico en absoluto;los aumentosde
velocidad de las reaccionescatalizadasenzimáticamente
en coÍlpaestánen el rangocomprendidoentre107y 1014,
Estosvaloressuración con las reaccionesno catalizadas.
brayanla importanciaextraordinariade lasenzimascomo
catalizadoresy nos llevan hastael tema principal de este
capítulo.
y el estadometaestable 1 4 t
Ener$adeactivación
Enzimas como catalizadores
biológicos
Independientemente de su naturaleza química, todos los
catalizadorescomparten tres propiedades básicas:
1. Un catalizador incrementa la velocidad de una reacción disminuyendo el requerimiento de la energíade
activación y permitiendo que una reacción termodinámicamente factible, tenga lugar a una velocidad
razonable, sin necesidadde activación térmica.
2. Un catalizador funciona formando complejos transitorios con las moléculas de sustrato, ligándolas de
manera que se facilite su interacción.
mamosenzimasfue eldefermentos.Sinembargo,hubo que
esperarhasta\926 para obtenerla primera enzimacristalizada,laureasa(apartir delasalubias,por famesB. Sumner),
demostrándoseque era una proteína. Incluso, entonces,
pasóun tiempo hastaque los bioquímicosy enzimólogos
apreciaranque los <fermentos>que estabanestudiando
eran,de hecho,proteínascatalíticas,
y queparasu completa
comprensiónse requeríaentendersu estructuray función
(Enlosprimerosañosde 1980,losbiólogos
comoproteínas,
descubrieronque,ademásdelasproteínas,ciertasmoléculas
deARN, llamadasr.ubp:wras,tienen
tambiénactividadcatalítica.Lasribozimasserándiscutidasen una secciónpróxima. Aquí, consideraremos
las enzimascomo proteínas,las
cualesson,realmente,la mayoría.)
3. Uncutiliffiad
a l a q u es e
consigueeI equilibrio; no tiene efectosobrela posicióndelequilibrio.Esdecir,un catalizador
puedeincrementarIa velocidadde las reacciones
exergónicas,perono puede,de ningunamanera,servircomo
motor energéticode una reacciónendergónica.
En
otraspalabras,los catalizadores
no son geniostermodinámicos.
El sitio activo. Uno de los conceptosmás importantes
paraentenderlasenzimascomoproteínas,
esel de sitio activo. Cadaenzima,indepe
cataliceo de su estructuraparticular,contienedentro de
algunapartede su estructuraterciariaun grupocaracterísqueformanel sitio activo,dondeocutico de aminoácidos
rre el eventocatalíticodel cual esaenzimaesresponsablg.
Normalmente,
el sitio activoesun surcoo bolsillo real con
Estaspropiedades
son comunesa todoslos catalizadopropiedades
químicas
y estructurales
quepermitenla acores,seanorgánicoso inorgánicos.
Refiriéndonos
a nuestro
modación
adecua9_tyespeclfica.
del
sustrato.
La Figura6.2
ejemplo,estoseaplicaigualmentea los ionesde hierroy a
muestra
los
modelos
obtenidos
por
ordenador
de lasenzilasmoléculasde catalasa.
Sin embargo,los sistemas
biolómas
lisozima
y
carboxipeptidasa
que
A,
ilustran
bien el
gicosraramenteusancatalizadores
inorgánicos.En vezde
preciso
ajuste
de
la
molécula
de
sustrato
en
los
bolsillos
eso,fundamentalmente
todaslas catálisisen las célulasse
producidospor el plieguecaracterístico
de las cadenasde
en la mallevana cabopor moléculasorgánicas(pr.otelnas
polipéptidos.
La
lisozima
es
una enzimaque rompe las
yorla de los ce.s_o!)-llamadgs-e¡zimas.
Debido a que las enqniones
glicosídicas
peptidoglicanos
en los
de las paredes
zimassonmoléculasorgánicas,
sonmuchomásespecíficas
(ruptura)
bacterianas.
conduciendoa la lisis
y muertede
quelos catalizadores
inorgánicos,
y susactividades
sepuelas bacterias.La carboxipeptidasa
A es una enzima que
den regularcon muchomáscuidado.
modificalos polipéptidoseliminandoun aminoácidocada
vezdesdeel extremoC-terminal del polipéptido.
La mayoríade las enzimasson proteínas
El sitio activode una enzimatípica comprendeun núLa capacidadde los extractoscelularespara catalizarreac- mero determinadode aminoácidos,
que normalmenteno
cionesquímicasseha conocidodesdelos estudiosde la fersoncontiguos,a io largodela secuencia
primariadela promentaciónde Eduardy HansBuchneren 1897.De hecho, teína.En todo caso,se mantienenjuntos,en una conforuno de los primerosnombresaplicadosa lo que ahorallamacióncorrecta,graciasal plegamiento
tridimensionalcaSustrato
u n i d oa l
centroactivo
Figura6,2 Estructurasmoleculares
de la lisozimay la caÉoxipeptidasa
A.
Modelo tridimensional compacto
generadopor ordenador de las enzimas
(a) Iisozima y (b) carboxipeptidasaA,
con las respectivasmoléculasde sustrato
unidas a sus sitios activos,un segmento
corto de un peptidoglicano bacteriano,
en el casode la lisozima y un péptido
artificial, en el casode la
carboxipeptidasaA.
Sustrato
u n i d oa l
centroactivo
¡
tr
(a) Lisozima
142
Capitulo6
Enzimas:
loscatalizadores
de la vida
(b) Carboxipeptidasa
A
Porejemplo,lamodela cadenapolipeptídica.
racterístico
A, que se muestraen la Figura
lécula carboxipeptidasa
6.2b, consisteen un único polipéptido de 307 residuos
en el sidelos quesóloseisestánpresentes
amoinoacílicos,
posiciones
69 y
las
en
histidina
de
los
residuos
tio activo:
270,
el
de
argiposicionesT2y
las
en
glutamato
196,losde
nina en la posición145,y el de tirosinaen la posición248.
Estarelaciónde aminoácidossituadosa lo largo de Ia cadena,subrayala importanciade la estructuraterciariatotal
de la molécula enzímática.Sólocuandola moléculaalcanza su conformacióntridimensionalestablese reúnenlos
para constituir el sitio activo.
aminoácidosespecíficos
En realidadsólounospocosde los 20 aminoácidosdiferentesque forman las proteínas,estánpresentesen el sitio
activode la mayoríade las proteínasque han sido estudiadas.Casisiempreaparecenlos aminoácidoscisteína,histidina, serina,aspartato,glutamatoy lisina.Ib4gs etlospugden
parficiparen la únión del sustratoal sitio activoduranteel
procesocatalítico,v Ia histidina,el aspartato.y el glutamato'
de protones.
sirventambiéncomodonanteso aceptores
Algunasenzimas,ademásde estarformadaspor una o
polipeptídicas,
máscadenas
Puedenportar tambiéncomponentesno proteicos.! stoscomponente
pg!_plgstéticg! normalmente son moléculasorgánicas
olonesmetálicos'talescomoel hierro dela enzif'equeñas
funcjqn4njolqo-gcqplqres
ma catalasa.Frecue_nteme!8,
s
porquenlngu¡o delosaminoácido
deélectrones,
grupos
Los
buen3qgplal-d-9-el9Ell9nes'
de Ia.cadenaesun
selocalizan
prostéticos,
en los casosen queestánpresentes,
capara
la
actividad
en el sitio activoy son indispensables
un
ejemplo
A
es
talítica de la enzima.La carboxipeptidasa
de una enzirhacon un grupoprostético;tieneun átomode
unido a dos residuosde histidina y a
zinc estrechamente
uno de los glutamatos'en su sitio activo.
Esta reacción se puede llevar a cabo en el laboratorio
usando un catalizador de platino (Pt) o de níquel (Ni),
como se indica. Estos catalizadoresinorgánicos son muy
poco específicos,pudiendo catalizarIa hidrogenación de
una amplia variedad de componentes insaturados.De hecho, el níquel o el platino se usan comercialmente para hidrogenar aceitesvegetalespoliinsaturados, en la fabricación de manteca para guisar o de manteca vegetal. Se
pueden hidrogenar eficazmenteen presenciade níquel o
platino, con independencia de cuál sea la estructura del
componente insaturado.
Comparémoslo con el ejemplo biológico de la hidrogenación que tiene lugar en la conversión de fumarato en
succinato,reacciónque consideraremosde nuevo en el Capítulo 10:
o
HO
-O-C
lll
H
H-C-C-O
^l
\,/
C
+2H*+2e-:
it l
,/\
H
C-O_
UI
il |
-o-c-c-H
I
(6.4)
H
lt ll
o
Succinato
Fumarato
en lascélulaspor Ia enzima
Estareacciónescatalizada
(llamadaasíporquenormalmendeshidrogenasa
succinato
te funcionaen el metabolismoenergéticoen la dirección
como muchasenzimas'es
opuesta).Estadeshidrogenasa,
No puedeañadiro quitarhidrógenos
altamenteespecífica.
desdeningún compuesto,exceptolos que semuestranen
que
6.4.Dehecho,estaenzimaestan específica
la Reacción
inclusono puedereconoceral maleato,una isoformadel
fumarato(Figura6.3).
algunasrecoNo todaslasenzimassontan específicas;
dela estructuenzimática.Una consecuencia
Especificidad
y otrasresubstratos,
de
muy
concreto
número
nocenun
ra del sitio activo es que las enzimasmanifiestanun alto
que
siempre
sustancias'
de
amplia
categoría
conocenuna
grado de especificidadpor el sustrato, puesto de maniEsta
especicomunes.
estructurales
fiesto por su habilidad para discriminar entre moléculas poseancaracterísticas
esuna de las propiedades ficidad por grupos esmás frecuenteen enzimasimplicamuy similares.La especificidad
dasen la síntesisy degradaciónde polímeros.El objetivo
lasendelosseresvivos,y precisamente
máscaracterísticas
polipeptíA esdegradarlos enlaces
de la carboxipeptidasa
de eszirnasson unos de los ejemplosmásespectaculares
la
función
de
así,
terminal;
dicosdesdeel grupo carboxilo
pecificidadbiológica.
Podemosmostrar estaespecificidadcomparandolas
enzimascon los catalizadoresinorgánicos.La mayotiade
o
o
y
inorgánicosson muy pocosespecíficos
los catalizadores
o
c
-o-c
H
H
por ello puedenactuarsobreuna variedadde componen\^./
\^/
U
químicageneral.
tes que compartenalgunacaracterística
tl
(incorpotaConsidere,por ejemplo,la hidrogenación
a
n
"\
,,,"\
,/
ción de hidrógenoa un enlaceinsaturadoC:C):
! r
N
tl
R-C:C-R'
tl
+ Hz ---------) R-Q-q-R
PtoNi
I
I
HH
U-U
o
HH
HH
^
(6.3)
(a) Fumarato
n
\J-\,
ó
(b) Maleato
(a) fumaratoy (b) maleato'
Figura6.3 Losestereoisómeros
biológicos t43
comocatalizadores
Enzimas
estaenzimaesaceptaruna gran variedadde polipéptidos
como sustratos,ya que la utilización de enzimasdistintas
paratodoslos enlacespéptidicosdiferentesque tienen que
serhidrolizadosen la degradaciónpolipeptídica,representarla un gastoinnecesariopara la célula.
Sin embargo,las enzimasson generalmentede alta especificidadcon relación al sustrato,tanto que una célula
puedeposeercasitantasenzimasdiferentes,como reaccionestiene qtoecatalizar.Parauna célulatípica, son necesarias miles de enzimasdiferentespara cumplir con todo su
programametabólico.En principio, pareceun gastosuperfluo tener que sintetizartantasproteínas,almacenartanta
información genéticay tener siemprea mano tantasenzimas en la célula.Peroestoimplica enormesposibilidades
de regulación,como veremosmás adelante.
ratura no esproblemáticaparalasenzimasde lascélulasde
mamíferoso aves,porque estosorganismosson homeoterde regularla temperaturacorporal indepenmos,capaces
dientementedel medioambiente.Sinembargo,losanimales
inferiores,lasplantas,los protistasy lasbacterias,funcionan
a la temperaturade su medio ambiente,la cualpuedevariar
mucho.Paraestosorganismos,la dependenciade la actividadenzimáticade la temperaturaesmuy significativa.
La velocidad de una reacción cata[zada enzimáticamente aumentacon la temperatura,dentro de unos límites,porque el incrementoen la energíacinéticade las moléculasde la enzimay del sustrato,conducea una mayor
frecuenciaen lascolisiones,facilitandola unión correctaal
sustrato.Sin embargo.seIlegaa un punto en el que el aumento de la temperaturaes contraproducente,porque la
molécula enzimática comienza a desnaturalizarse.Los
hidrópuentesde hidrógenoserompen,las interacciones
fobascambian.v la integridadestructuraldel sitio activose
interrumpe,causandola pérdidade la actividad.
El rangode la temperaturapor encimadel cual una enzima sedesnaturalizavariamucho de una enzimaa otra y
deun organismoa otro.En la Figura6.4asecomparala dependenciade la temperatura de una enzima típica del
cuerpo humano, con una enzimatípica de una bacteria
termófiIa.La velocidadde reacciónde una enzimahumana esm¡íximaalrededorde los 37 oC,que esla temperatubruscoen
ra corporalnormal.A partir de ahí el descenso
su actividad reflejala progresivadesnaturalizaciónde las
moléculasenzimáticas.La mavorla de las enzimasde los
sereshomeotermosse inactivan por la temperatura,por
nzimas,la inactivación
de laboratorio.Sin embar@ómeno
go, algunasenzimasson extraordinariamentesensiblesal
calor y se desnaturalizane inactivan a temperaturasmás
corporales
bajas,en algunoscasos,inclusoa temperaturas
en personascon fiebrealta.
En el otro extremodel espectro,algunasenzimasconaltas.
servanla actividada temperaturasexcepcionalmente
La curvaverdeen la Figura6.4arepresentala dependencia
de la temperaturade una enzimapropia de lasarqueastermófilas,ya mencionadasen el Capítulo 4. ¡Estosorganis,
mos crecenen manantialescalientesácidosa temperaturas
cadauna de lasmiles
tan altascomo 80 oC!Evidentemente,
de enzimasque estosorganismosnecesitanpara la actividad celularnormal, debensercapacesde funcionar a temperaturasa las que sedesnaturalizanlamayorlade las enzimasen las célulasde otros organismos,incluido usted.
y nomenclatura,No essorprendente
Divetsidad
enzimát¡ca
que hayansido identificadasmiles de enzimas,dadasu especificidady el amplio número de reaccionesque ocurren
dentro de una célula.Estaenormediversidadde enzimasy
funcionesenzimáticasha dado lugar a una gran variedad
de combinacionespara nombrarlas,a medida que eran
y descritas.Algunassedenominaronsegúnel
descubiertas
proteasayamilasustrato,comopor ejemploribonucleasa,
sa.Otras,cbmo la succinatodeshidrogenasayla
fosfoglucoinombraronsegúnsusfunciones.Sinembargo,
someresa,se
otrasenzimastienennombresqueno estánen absolutorelacionadoscon sussustratoso sus funciones.La tripsina,
catalasa,y lisozimason enzimasde estaúltima categoria.
La proliferaciónde nombrescomunesparalas enzimas
y la confusiónresultante,hizo que la Unión Internacional
de Bioquímicadesignarauna ComisiónEnzimática(EC),
encargadade idear un sistemaracional para nombiar las
en la Tabla6.1.
enzimas.El sistemaEC estárepresentado
Lasenzimassedividen dentro de seisclasesprincipalesbacon subgruposparadefisadasen susfuncionesgenerales,
Lasseisclasesprincipales
nir susfuncionesmás precisas.
hidrolasas,liasas,isomeson oxidoreduct*sts,transferasas,
rasasy ligasas.La Tabla 6.1 proporciona un ejemplo de
cadaclase,usandoenzimasque catalizanreaccionessetratarán mástarde en el texto.
El sistemaCE designatodaslasenzimasconocidascon
un número separadoen cuatro partes.Por ejemplo,EC
A. Losprime3.4.17.I,esel códigode la carboxipeptidasa
y sub-subclase,
ros tresnúmerosdefinenla clase,subclase
y el número final esel número de serieasignadoala enziA,
ma cuandofue añadidaa la lista.Así,la carboxipeptidasa
de la cuarta
esla primera entradaenla 17.usub-subclase
al
al pH. Las enzimastambiénson sensibles
Sensibilidad
La listade enzimasque
subclase
de la clase3 (hidrolasas).
han sido clasificadasde estaforma, crececontinuamente pH. Muchassólo son activasdentro de un rango de pH de
del pH se debe,normal3-4 unidades.Estadependencia
y caracterizadas.
con las quevan siendodescubiertas
mente,a la presenciade uno o más aminoácidoscargados
Sensibilidad
a la temperatura.Ademásde por su especifici- en el sitio activo o en el propio sustrato.La actividaddependede cómo esténestosgrupos,cargadoso sin carga.
tambiénpor su
lasenzimassecaracterízan
dady diverSidad,
Por ejemplo, en el sitio activo de la carboxipeptidasaA,
dela tempesensibilidada la temperatura.Estadependencia
r44
loscatalizadores
delavida
Capítulo
6 Enzimas:
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bioló$cos
Enzimas
Temperatura
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unaenzimahumana
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Temperatura
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(b)
pH
Figura6.4 Efectode la temperatulay el pH en la velocidadde las
reaccionescqtalizadasenzimáticamente. (a) Efecto de la
temperatura eh la velocidad de una reacción catalizadapor
una
-bacteria
enzimahumana típica (en negro) y una enzima de una
termófila (en verde). La tasade reacción esmiíxima a la
temperatura óptima, unos 37 oC en el casohumano (la
temperatura de cuerpo) y unos 75 "C en la bacteria (la temperatura
de un manantial termal). El incremento inicial de la actividad con
la temperatura, es debido al aumento de la energíacinética en las
moléculas de enzima y sustrato.Sin embargo,un aumento excesivo
de la temperatura inactiva la reacción,pues la proteína de la enzima
se desnaturaliza.(b) Efecto del pH en la velocidad de una reacción
catalizadapor Ia enzima gástricapepsina (en negro) y Ia enzima
intestinal tripsina (en rojo). La tasade reacción es miíxima al pH
óptimo, aproximadamerLte2,0 para la pepsinay 8,0 para la tripsina.
EI pH óptimo para una enzima se correspondecon la
concentración de protones a la cual los grupos ionizables,tanto de
la enzima,como del sustrato,estánen la configuraciónmás
favorablepara reaccionar.Los valoresde pH lejos del óptimo
producen, en general,modificaciones en Ios grupos cargadosde la
enzima, el sustrato o ambos. El grado óptimo pH de una enzima
sueleser el mismo que el del compartimiento celular,o el medio
externo, en el que la enzima esactiva.
aparecenlos gruposcarboxilosde dos residuosglutamato.
Estosgrupos carboxilosdebenestarpresentesen la forma
cargada(ionizados),de forma que la enzimaseinactivasi
el pH disminuyehastael valor en el cual los gruposcarboxilo del glutamatoen la mayoríade las moléculasenzimáticas,estánprotonados¡ por tanto,sin carga.
Como sepodríaesperar,
la dependencia
de pH de una
enzimanormalmentereflejael medio ambienteen el cual
la enzimaestáactiva.La Figura6.4bmuestrala dependencia de pH de dosenzimasque degradanproteínas,encontradasen el tracto digestivohumano.La pepsina(líneanet46
Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
gra) estápresenteen el estómago,donde el pH normalmentetiene valoresen torno a 2, mientrasque la tripsina
(línearoja) essecretada
en el intestinodelgado,el cualtiene un pH en torno a 8. Ambas enzimasson activasen un
rangode casi4 unidadesde pH, pero difierenmucho en su
pH óptimo, consecuentecon las condicionespropias de
susrespectivas
localizacionesdentro del cuerpo.
Sensibilidad
a otrosfactores. Otra de lascaracterísticas
de
las enzimasessu sensibilidada otros factores,ademásde a
la temperaturay pH, como lassustancias
inhibidoraso activadorasde la enzima,un aspectoal cual volveremosmás
tarde en el capítulo.En el casode enzimascon especificidadpor determinados
grupos,laactividadtambiénsepuede ver afectadapor la presenciade sustratosalternativos.
La mayoríade las enzimasson sensiblesal medio ambiente iónico, el cual esprobablementeel que afectaa la conformación total de la enzima,debido a que los puentesde
hidrógenodependende é1.El medio ambienteiónico puede afectartambién a las uniones del sustratoporque las
interaccionesiónicasestána menudo involucradasen las
unionesentreel sustratoy el sitio activo.
La unióndelsustrato,la activacióny la reacciónse
producen
en elsitio act¡vo
Las enzimasson catalizadoresmuy eficaces,graciasa que
los sustratosencajande forma precisacon el sitio activode
las enzimas.Estaeficaciase puedeobservaren toda su
extensión,si comparamosla catálisisenzimáticacon la
catálisisinorgánica.Como apuntamosanteriormente,
las
reaccionescatalizadasenzimáticamenteprogresana una
velocidadde 107a 10ravecesmásrápidoquelasreacciones
no catalizadas,
mientrasque las que utilizan catalizadores
inorgánicos,
sonde 103a l0aveces
másrápido.Comousted
puedeadivinar,la mayor parte del interéspor las enzimas,
secentraen el sitio activo,dondeocurrenla unión, activación y transformaciónqulmicadel sustrato.
Launióndelsustrato. El contactoinicial entreel sitio activo deuna enzimayunamoléculade sustratopotencial,dependede colisionesaleatorias.Srnembargo.una vez eú
hendidura o bolsillo del sitio activo,las moléculasde sustrato seunen temporalmentea la superficiede la enzima.
con la orientaciónapropiadapara interaccionarentre sí y
de la enzima,lo cual facicon.gruposcatalíticosqspecíficos
lita la reacción.La unión delffi
vésde aminoácidoscargados,por medio de puentesde hidrógenoo enlaces
iónicos(o ambos).Estáiüñion'esson,en
general,débiles,pero la sumade variasde ellasessuficiente para mantenera la molécula en su lugar. La fuerzade
unión entre una enzimay una moléculade sustrato,suele
encontrarse
en el rangode 3-I2 kcal/mol,menosde un décimo dela fuerzade un enlacecovalente(téaseFigra2.2).
Por tanto,la unión al sustratoesfácilmentereversible.
Durante muchos años,los enzimólogosconsideraronel
sitio activo como una estructura rigida. Comparaban el
ajuste de un sustrato dentro del sitio activo a una llave dentro de una cerradura,analogíasugeridaen 1894por el bioquímico alemán Emil Fischer.Esle modelo de cerraduray
llaye, mostrado en la Figura 6.5a, explicó la especificidad
enzimáticapero hizo poco para acrecentarnuestro conocimiento del evento catalítico. Un punto de vista más útil
acercade la interacción enzima-sustrato es el provisto por
el modelo de ajuste inducido, propuesto en 1985 por Daniel Koshland.Como ilustra la Figura 6.5b,estemodelo supone que la unión inicial de la(s) molécula(s) de sustratoal
sitio activo deforma la enzima y el sustrato,estabilizandoa
las moléculas de sustrato en su estadode transición y permitiendo que los enlacescríticos sean más susceptiblesa
ataquescatalíticos.
La distorsión de ia enzima implica un cambio conformacional en la misma ¡ por tanto, en la configuración del
sitio activo. Este cambio posiciona de forma óptima a los
grupos reactivosapropiados de la enzima, para la reacción
catalíticaen la cual intervienen, aumentando asíla probabilidad de que la reacción se produzca. EI cambio conformacional aceÍcaal sitio activo a las cadenaslateralesde los
aminoácidos que son críticos para el proceso catalítico,
pero {.ue no estánen las proximidades del sitio activo en la
conformación no inducida. En muchos casos'estascade-
nas lateralesson grupos ácidos o básicos,que promueven
la catálisis.En el casode la carboxipeptidasaA, la unión del
sustrato atrae a tres residuos aminoacílicos críticos al sitio
activo (una arginina, un glutamato y una tirosina).
Los estudiosde difracción de rayosx de proteínas cristalizadashan confirmado que realmentese producen estos
cambios, durante Ia unión del sustrato. La cristalografía
con rayos X se usa para determinar la forma de una molécula enzimática con o sin sustrato unido al sitio activo. La
Figura 6.6 ilustra los cambios conformacionalesque tienen
lugar tras la unión del sustrato ala lisozima,la enzima ya
mostrada en la Figura 6.2a,y parala hexoquinasa,una enzima que podremos encontrar de nuevo más adelante en
estecapítulo. En ambos casosse produce un cambio notorio en la conformación de la molécula proteica, como respuesta a la unión del sustrato.En el casode la hexoquina,u, po. ejemplo, la unión del sustrato (una molécula de
D-glucosa) provoca que dos de los dominios de la enzima
se doblen el uno hacia el otro, cerrando el pliegue del sitio
de unión alrededor del sustrato (Figura 6.6b).
El cambio conformacional al producirse la unión del
sustrato, puede resultar en un desplazamientoextensode
grupos de aminoácidos dentro de la molécula proteica.
¡En el casode la carboxipeptidasaA, por ejemplo, la unión
del sustrato hace que el residuo de tirosina de la posición
248 se mueva a I,2 nm, ¡una distancia aproximadamente
igual a una cuarta parte del diámetro de la molécula enzimática!
q'Yc*e*(.8
Activacióndel sustrato. El papel del sitio activo no es sólo
reconocer y unir el sustrato apropiado sino también acflvarlo, sumergiéndoloen el medio químico necesariopara
la catálisis.Una determinada reacción cafalizadaenzimáticamente,puede involucrar a uno o más recursosde activación del sustrato. Los tres mecanismosmás comunes son
Ios siguientes:
(a) Modelode cerraduray llave
Enlace(s)
desestabilizado(s)
Sitio
/
- F)-[,(:)/
.Y*\U/-
aCtlVO
/
/a\
/
@
v,,é\
(b) Modelode ajustelnducldo
Figura6.5 Dosmodelosde interacciónenzima-susttato'
(a) El modelo de cerraduray llave.En estemodelo clásico,la
molécula enzimárica(E) era consideradauna estructura rígida, con
un sitio activo, donde encajabael sustrato (S), análogamentea
como 1ohace una llave en una cerradura. La reacción en el sitio
activo, convierte a las moléculasde sustrato en moléculasde
producto (Pr y Pz).(b) El modelo de ajusteinducido. Segúneste
modelo, la unión de una molécula de sustrato al sitio activo de una
enzima,induce un cambio conformacional en ésta,que sitúa en el
sitio activo a los grupos reactivosadecuados,de manera óptima
para la reacción catalizada.Además,el aiuste estrechoentre la
ánzimay el sustrato desestabilizauno o más de los enlacesdel
sustrato,haciendo que seanmás susceptiblesa un ataquecatalítico.
1. El cambio en la conformación enzimática inducida
por Ia unión del inicial sustrato al sitio activo, no
sólo causauna mejor complementariedady un ajuste más estrechoenzima-sustrato,sino que también
deforma uno o más de sus enlaces,debilitando así
dichos enlaces,haciéndolos más susceptibleal ataque catalítico.
2. La enzimatambién puede aceptaro donar protones
incrementando, por tanto, la reactividad química
del sustrato.Esto da cuenta de la importancia de los
aminoácidos cargadosen la química del sitio activo,
lo cual, a su vez, explica por qué la actividad de la
enzimasueleser tan dependientedel pH.
3. Como forma adicional para la activación del sustrato, las enzimas también pueden aceptar o donar
electrones,formando de esemodo enlacescovalentes temporales entre la enzima y su sustrato.El mecanismo necesitaque el sustrato tenga una región
biológicos t47
Enzimas
comocatalizadores
Sustrato
(peptidoglicano)
V
Figura6.6 Cambioconformacionalen la estluctura
de la enzima,inducidopu la unióndel sustrato,
Aquí semuestran los modelos compactosde las
enzimas:(a) lisozimay (b) hexoquinasay sus
sustratos(un peptidoglicano artificial y una
molécula de o-glucosa,respectivamente).En
ambos casos,la unión del sustrato induce un
cambio conformacional en la enzima, detectable
por análisisde difracción con rayos-X.
\r.
(a) Lisozima
(b) Hexoquinasa
que seaelectropositiva
(deficienteen electrones;o
(ricaen electrones)
electronegativa
y queel sitio activo de la enzimatengauno o másgruposde polaridad opuesta.
El acontecimiento
catalitico. La secuenciade acontecimientos que tienen lugar en el sitio activo,seilustra en la
Figura6.7,tomandocomo ejemploala enzimasacarasa.
La sacarasa
hidrolizael disacáridosacarosa
en glucosay
fructosa.Hastael momento,hemosvisto que la colisión
inicialaleatoriade una moléculade sustrato-sacarosa,en
ssfs 6¿s6- con el sitio activo, tiene como resultado su
unión a residuosaminoacílicos
que estánposicionados
estratégicamente
allí (Paso1). La unión del sustratoinduce
un cambioen la conformaciónenzimáticaque intensifica
el ajusteentre la moléculasustratoy el sitio activo,facilitando de esemodo la conversióndel sustratoen los productos,en estecasoglucosay fructosa(paso2). Después,
estosproductosse liberan desdeel sitio activo (paso3),
permitiendo que la moléculaenzimáticaregresea su conformación original, quedandoel sitio activo ahora disponible para admitir otra moléculade sustrato(paso4). ¡La
148
Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
secuencia
completade acontecimientos
tienelugar en un
tiempolo suficientemente
cortoparapermitir queen el sitio activo de una solamolécula enzimáticaocurran cientos,o inclusomiles,de talesreacciones
por segundo!
Cinética enzimática
Hasta el momento, nuestra exposición acercade las enzimas ha sido básicamentedescriptiva. Hemos hablado del
requerimiento de energía de activación que evita que las
reaccionestermodinámicamente factibles ocurran, y de los
catalizadores como medio de reducir la energía de activación y de esemodo facilitar dichasreacciones.Thmbién hemos consideradoa las enzimascomo catalizadoresbiológicos y hemos examinado su estructura y función .ot -á,
detalle.Además,nos hemos dado cuenta de que las únicas
reacciones que probablemente ocurren en las células a velocidades razonables, son aquellas para las cuales las enzimas específicasestán al alcance de la mano, de manera que
la capacidad metabólica de una célula, está especificáda
por las enzimas que estánpresentes.
Q E I s u s t r a t oc o l i s i o ncao n e l
s r t i oa c t i v o d, o n d ee s m a n t e n i d o
p o ' e n l a c e ds e b r i e cs o r ^i o sg , u p o sR
d e o s a r i r o ¿ cr c o so e s i t i oa c t i v o .
L a u n i o nd e l s u s t r a t op r o v o c au n c a m b i o
contorr¡ao
c n a e n l a e n z i m a r, e s p o n s a b l e
d e q u e e l s u s t r a t os e au n i d om á s
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Complejo
enzimasustrato
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de sustrato.
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e¡ pfocjuctos
O L o sp r c c l L r c t o s
5 0 ni o e f a t o s
t
Fructosa
Figuta6.7 Cfclocatalíticode unaenzima, En esteejemplo,la enzimasacarasa
catalizalahidrólisis
de sacarosa
en glucosay fructosa.
Inclusocuandofaltanlas enzimasDodemosservirnos
de su ausenciaparacalcular,por com¡aración,la velocidad real a la cual tiene lugar una reaccióncatalizadaenzimáticamentey cuálesel efectoejercidopor determinados
factoresen la velocidadde reacción.La simplepresencia
de la enzimaapropiadaen Ia célulano aseguraque una
determinadareacciónpuedaocurrir a una velocidadadecuada,a menosque también podamosestarsegurosde
quelascondicionescelularessonfavorables
parala actividad enzimática.Yahemosvisto que hay factoresque pueden influir en la actividadenzimática.talescomo la temperaturao el pH. Ahora estamospreparadosparavalorar
cómo la actividad enzimáticatambiéndependede la concentraciónde los sustratos,
de los produciosy de los inhibidorespresentes
en la célula.Además,veremoscómo,al
menos algunos de estos efectos,pueden ser definidos
cuantitativamente.
Cuando dirigimos nuestra atención a estosaspectos
cuantitativosde la catálisisenzimática,nos encontraremos
en el campbde la cinética enzimática.I,a palabracinética
es de origen griego (Klnetlkos,siqnifica<movimiento>).
Aplicadaa lasreacciones
químicas.la cinéticaconciernea
lasvelocidades
de reaccióny la maneraen que esasvelocidadesestáninfluidaspor varios factores,pero especialmentepor la concentración
delsustrato.delosproductosy
de los inhibidores,Aquí nos centraremos,mayoritariamente,en los efectosde la concentración
del sustratoen la
cinética de las reaccionescatalizadasenzimáticamente.
Nuestroestudioestarálimitado alasvelocidades
inicialesde
reacción,
medidasalrededorde un periodode tiempoen el
cual la concentraciónde sustratotodavíano ha disminuido lo suficientepara afectara la velocidad,y la acumulación de producto es todavíapequeñapara provocaruna
reacciónapreciable,en sentido contrario.Aunque esto es
una simplificaciónde lo queocurrerealmente,
nospermitirá entenderalgunosprincipiosimportantesdela cinética
enzimática.
La cinéticaenzimáticapuedeparecerbastantecompleja al principio. Paraa¡rdarle a entenderlos conceptosbásicos,en el Anexo6A seplanteaun símil, en el cual,lasepzimas que actúan sobre las moléculas de sustrato, se
comparancon una habitaciónllena de monos pelando
cacahuetes.
Puederesultarleútil recurrira la analogíaahora y regresardespués
a estasección.
Cinética
enzimática 149
Anexo
MoNos Y CACAHUETES
Si le parecióde utilidad el ejemplode los frijoles saltarines
mejicanos,para entenderel conceptode energíalibre del
Capltulo 5, qraá apreciela aproximacióna la cinética
enzimáticabasadaen la analogíacon una habitaciónrepletade
y una cantidadvariablede cacahuetes
monos (<enzimas>)
pelados(<sustratos>).
Tiate de entendercadapaso,primero en
y luegocomo una
términos de monos pelandocacahuetes,
'
auténticareacción,catalizadaenzimáticamente.
LaGaleríadelCacahuete
\
Paranuestromodelo,necesitamosuna tropa de diez monos,
todos igualmenteexpertosen encontrary pelar cacahuetes,
Suponemostambién que los monos son incapacesde comeü
que pelan,pero pesea
siquiera,uno solo de los cacahuetes
todo, sufrenuna necesidadcompulsivade seguirpelando.
(Parahacerel modelo algo más riguroso,podemosinsistir
que los cacahuetes
son una nuevavariedadhíbrida, que se
puederecomponerfácilmente,y que los monos,lo mismo
que
estáncolocandolos cacahuetes
dentro de suscáscaras,
pelándolos.Peroestasconsideraciones
no nos preocupan
aqul; sólo estamosinteresadosen las condicionesiniciales
en las cualestodos los cacahuetes
estándentro de sus
cáscaras.)
Necesitaremos
tambiénla Galeríade Cacahuetes,
una
se
habitaciónde superficieconociday en la cual los cacahuetes
distribuyenhomogéneamente
en el suelo.EI número de
pero en todo
cacahuetes
variaráa medidaque avancemos,
que
momento,en Ia habitaciónhabrámuchosmáscacahuetes
monos.Además,dado que conocemosel número de cacahuetes
y la superficiedel suelo,podremoscalcular<laconcentración>
(parasermásexactos,Ia densidad)de cacahuetes
en la
habitación.En cadacaso,los monos comienzanen una salade
esperacontigua.Paraempezarel ensayo,simplementeabrimos
La mayofa de las enzimass¡guenla cinética
de Michaelis-Menten
Desdehacemucho tiempo sesabeque la velocidadde una
reaccióncatahtafiá;éMffiá'fíiáfoénti.aumentacon la concentraciónde sustrato,pero de tal forma, que cadaincremento adicional de sustrato,da como resultadoun aumento menor de la velocidadde reacción.De maneramás
precisa,sepuedeobservarexperimentalmenteque la relación entre la velocidad inicial de reacción yy la concentración de sustrato[S] es una hipérbole,.oÁo ,. ilustra
en la Figura6.8.Una propiedadimportantede estarelaciónhiperbólicaesquea medidaque [S]tiendehaciael infinito, y tiende hacia un valor miíximo, que dependedel
número de moléculasenzimáticas¡ por tanto, sólo puede
incrementarseañadiendomásenzima.
La incapacidadpara aumentarla velocidadde reacción más allá de un valor finito máximo a concentracio150
Gapitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
la puertay permitimos que los ansiososmonos pasena la
Galeríade Cacahuetes.
Comienza
el peladode cacahuetes
Yaestamoslistospara nuestroprimer análisis.Comenzamos
con una concentracióninicial de un cacahuetepor metro
cuadrado,y asumimosque,con estaconcentración,un mono
yI
tarda como media9 segundosen encontrarun cacahuete
segundoen pelarlo.Estosignificaque cadamono necesita10
y por tanto puedepelarlosa una
segundospor cacahuete
por segundo.Como hay l0 monos
velocidadde 0,1 cacahuetes
para el total
en la galería,la velocidadv de peladode cacahuetes
de los monos esde 1 cacahuetepor segundo,con esta
(la cual llamanos[S] para recordar
concentraciónde cacahuetes
que los cacahuetes
son el sustratode la acciónde pelar).Todo
estosepuedetabular como sigue:
[S] : concentraciónde cacahuetes
(cacahuetes/m2)
I
Tiempo requeridopor cacahuete:
Paraencontrarlo(segundo/cacahuete)
9
Parapelarlo (segundo/cacahuete)
1
Total (segundo/cacahuete)
10
Velocidadde pelado:
Por mono (cacahuete/segundo)
Total (r)
0,10
1,0
Aumenta
el númerode cacahuetes
Paranuestrosegundoensayo,llevamosa todoslos monos de
y
vueltaa la salade espera,barremoslos desperdicios,
por
empezamosahoracon una concentraciónde 3 cacahuetes
nes de sustrato cadavez más altas,se llama saturación.
fundamentalde las reacciones
Estaes una característica
catalizadasenzimáticamente.
Las reaccionescatalizadas
altas de
siemprellegan a saturacióna concentraciones
no
sustrato,mientrasqueestono ocurreen lasreacciones
catalizadas.
Gran parte de nuestracomprensiónde la relaciónhiperbólicaentre [S] y l sedebea los trabajospionerosde
dos enzimólogosalemanes,Leonor Michaelisy Maud
Menten.En 1913,postularonuna teorlageneralde la acción enzimática,que ha resultadoserla basepara el análisiscuantitativode casitodoslos aspectosde la cinéticaenzimática.Paraentendersu enfoque,considereuna de las
posiblesreaccionescatalizadas
enzimáticamentemás simples,en la cual un único sustratoS seconvierteen un único producto P.
S ---------+ P
Enzlma
\El
(6.s)
metro cuadrado.Como la cantidadde cacahuetes
seha
triplicado,cadamono podrá encontrarun cacahuetetresveces
másrápidamenteque antes,esdecir,que el tiempo que emplean
en encontrarel cacahuete,
ahoraesde sólo 3 segundos.Dado
que sesigueempleandoI segundoen pelar cadacacahuete,
el
tiempo total por cacahueteesahorade 4 segundosy la
velocidadde peladoes0,25cacahuetes
por segundoy mono, es
decír,2,5cacahuetes
por segundopara el total de los de monos.
Estogeneraotra columnade entradaspara nuestratabla de
datos:
lSl = concentraciónde cacahuetes
(cacahuetes/m2)
1
Tiempo requeridopor cacahuete:
Paraencontrarlo(segundo/cacahuete)
Parapelarlo (segundo/cacahuete)
Total (segundo/cacahuete)
9
3
1
I
l0
4
Velocidadde pelado:
Por mono (cacahuete/segundo)
Total (/)
0,10
1,0
óQuéocuresi v y [S]cont¡núan
aumentando?
Paradescubrirqué ocurre finalmentecon la velocidadde
peladosi Ia concentración
de cacahuetes
en la galeríaescada
vez mayor,lo único que hay que haceresampliar la tabla de
datos,suponiendoun incrementode los valoresde [S] V
calculandola correspondientey. Por ejemplo,una
(de 3 a 9
concentración
triplicadade cacahuetes
cacahuetes/m2)
conducea una reduccióndel tiempo-necesario
por cacahuete,
que ahoraseráde 2 segundos( 1 segundopara
encontrarloy otro segundoparapelarlo),con una velocidadde
Segúnla hipótesisde Michaelis-Menten,la enzima E
qloecatalizaestareacciónreaccionaprimero con el sustrato
S, formando un complejoenzima-sustrato
transitorio,ES,
que sufreluegola reaccióncatalíticareal,paraformar la enzima libre y el productoR como semuestraen la secuencia
Er+s *
tt {ie,+r
(6.6)
donde E¡ es la forma libre de lu .rrri-u, S es el sustrato,ES
es el complejo enzima-sustrato,P es el produ cto,y k1,k2,k3
y knson las constantesde velocidad para las reaccionesindicadas.
Comenzando con este modelo y suponiendo varias
simplificaciones, Michaelis y Menten llegaron a la siguiente relación entre la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamentey la concentración de sustrato:
y^""Is]
v:
-=------.^:
K- + LSl
(6.7)
peladode 0,5 cacahuetes
por segundoy mono, o 5 cacahuetes
por segundoen total.
Ya seempiezaa ver una tendencia.El primer triplicado
de la concentraciónde cacahuetes
aumentóla velocidad
2,5veces,pero el siguientetriplicadosólola dobla.Esdecir,
que Ia progresiónno eslineal.Puedever estoclaramentesi
eligeuna concentraciónalgo mayor de cacahuetes
y representa
v en el eje/ (escalasugerida:0- 10 cacahuetes/segundo)
y [S]
en el ejer (escalasugerida:0-100cacahuetes/m2.¡.
Como verá,
los datosgeneranuna curvahiperbólicamuy parecidaa la de
Ia Figura6.8,y si observacuidadosamente
susdatos,verápor
quéla curvacontinúandoblándose,a medidaque [S]
incrementa(esdecir,porquela velocidadincrementa
progresivamentemenosconforme aumentael número de
cacahuetes):
el tiempo de peladoesfijo y por tanto llegaa ser
un componentecadavezmás importante del total del tiempo
empleadopor cacahuete
mientrasque el tiempo para
encontrarlo,escadavezmenor.Esprecisamente
estetiempo
fijo de peladoel que establece
el límite superioren la velocidad
de procesamiento
del cacahuete,
porqueinclusosi [S] fuera
infinita (o sea,en un mundo repletode cacahuetes),
todavíase
precisaríaun tiempo finito de I segundoparaprocesarcada
cacahuete.
Por último, ustedpuededarsecuentade que hay algo
especialen la concentraciónde cacahuetes
a la cual,el tiempo
para encontrarlos,esexactamenteigual al tiempo de pelado
(éstaresultaserde 9 cacahuetes/m').
Esteesel punto de Ia curva
en el cual la velocidadde procesamientodel cacahuetees
exactamentela mitad de Ia velocidadmáxima.De hecho,esuna
referenciatan importante en la escalade concentración,que
ustedpodría estartentadode darleun nombre especial,sobre
todo si sellamaraMichaelisy ¡estuvierahaciendoel mono con
enzimasen vezde con cacahuetes!
Aquí, IS] esla concentracióninicial de sustrato,y esla velocidad inicial de reaccióna esaconcentraciónde sustrato,y
V-o y K- sonparámetroscinéticosimportantesque consideraremos
enla próximasección.
Éstaesla ecuaciónMichaelis-Menten, la principal de la cinéticaenzimática.(El Problema6.11al finaldelcapítulole daráunaoportunidadpara
deducirpor sí mismo la ecuaciónde Michaelis-Menten.)
de V^,y K^?
¿Cuáles ef significado
Paravalorarlasconsecuencias
de la relaciónentrevy [S] y
examinarel significadodelos parámetrosV-u*y K-, podemos considerartres casosespeciales
de concentraciónde
sustrato:concentraciónde sustratomuy baja, concentración de sustratomuy altay el casoespecial
de [S] : K-.
Caso1: concentración
de sustratomuyba¡a([S]< K,). A
concentraciónde sustratomuy baja, [S] es despreciable
Cinética
enzimática 1 5 1
s
E
.O
-c
ñ
o
p
7\/
2'max
O
a)
Concentración
de sustratoLSI
K
m
Figura6.8 Relaciónentre la velocidadde leaccióny la
concentlaciónde susttato, Parauna ¡eacción catalizada
que siguela cinéticade Michaelis-Menten,la
enzimáticamente,
velocidad inicial tiende hacia un límite superior de velocidad V*u*
a medida que la concentraciónde sustrato[S] tiende hacia
el infinito. La constantede Michaelis-MentenK- corresponde
a la concentraciónde sustratopara la cual la reaccióntiene lugar a
la mitad de la velocidadmáxima.
comparada con Ia constante K. del denominador de Ia
ecuación de Michaelis-Menten, por lo que podemos escribir
v."*[S].- v."*[s]
,,_
'
K-+lsl
K-
(6.8)
Por tanto, a concentración de sustratomuy baja, la velocidad inicial de reacción es más o menos proporcional a
la concentración de sustrato.Éstaes,por tanto, la regiónde
primer orden de la gráfrcade Michaelis-Menten. Mientras
la concentración del sustrato sea mucho más baja que el
valor de K-, la velocidad de una reacción catalízada enzimáticamente, aumenta casi linealmente con la concentración de sustrato.
Esto nos proporciona una definición de V-*, uno de
los dos parámetros cinéticos de la ecuación de MichaelisMenten. V-u" es la velocidad máxima, o el valor límite superior, al cual tiende la velocidad de reacción inicial v
cuando la concentracióndel sustrato [S] seacercaal infinito. En otras palabras,V-",es la velocidad a concentración
saturante de sustrato.En estascondiciones,toda molécula
enzímática está ocupada, casi todo el tiempo, en el proceso
real de la catálisis,puesto que Ia concentración de sustrato
es tan alta que, casi alavez que se libera una molécula de
producto, llega otra molécula de sustrato al sitio activo.
Por tanto, el límite superior de V-u, se determina por
1) el tiempo necesariopara la reaccióncatalíticareal más la
liberación subsiguientedel producto desdela superficiede
cadamolécula de enzima,y2) eInúmero de moléculaspresentes.Debido a que la velocidad real de la reacción es limitada, la única manera de que la V-", pueda aumentar es
incrementando la concentración de la enzima. De hecho,
V-u* es linealmente proporcional a la cantidad de enzima
presente,como se muestra en la Figura 6.9.
Caso3: ([S] = l(r). Hasta el momento, hemos visto Ia razón para Ia cinética de las reaccionesde primer orden a
concentracionesde sustratobajasy para cinéticasde orden
cero a concentracionesaltas.También hemos formulado la
definición para V-u*, pero todavía tenemos que descubrir
el significado del segundo parámetro cinético, K-. Fíjese
que con independenciade su significado, K- parecetener
algo que ver con la determinación de cuánto de baja debe
ser la concentración de sustrato,para asegurarla cinética
de primer orden, o bien, cuánto de alta debe ser,para asegurar la cinética de orden cero.De estamanera, K- parece
ser un punto de referencia en la escalade concentración
que determina cuánto de alto es alto y cuánto de bajo es
bajo. Para explorar su significado de manera más precisa,
considere el caso especial en el que [S] es exactamente
Gaso 2: Concentración
de sustrato muy alta ([S] > ,(,). A
concentracionesde sustrato muy altas,K- se vuelve insignificante comparada con [S] en el denominador de Ia
ecuación de Michaelis-Menten,y podremos escribir:
,' , -
V.o*[Sl K- + LSI
V.r*[Sl -r,
LSI
'max'
(6.e)
Estarelación significa que, a concentracionesde sustrato muy altas, la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente, es esencialmenteindependiente de Lavariación de la IS], volviéndosecasiconstante.Éstaconstituyela
región de orden cero de la representación de MichaelisMenten. Mientras la concentración de sustrato seamucho
mayor que el valor de K*, la velocidad no seve afectadapor
los cambios en la concentraciónde sustrato,permaneciendo casi constante,con valorespróximos a V^u,.
r52
Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
Concentración
de la enzima[E]
enzimática.
Figura6.9 Relaciónlinealentre V,"" y la concentración
EI incremento iineal en la velocidad de reacción en función de la
concentración dela enztma,proporciona la basepara determinar,
experimentalmente,las concentracionesde enzima.
iguala K^. Bajoestascondiciones,
la ecuaciónde Michaelis-Mentensepuedeescribircomo
Y:
y-*[s]
: v_u"[s]: v-*
K*+tsl
,rsl
2
(6.r0)
Estaecuaciónnos proporciona la definición que hemos
estadobuscando: K- es la concentración de sustrato para
la cual la reacción tiene lugar a la mitad de su velocidad
máxima. Esta concentración es un valor fijo para cada enzima que cataliza una reacción determinada bajo unas
condiciones específicasy se denomina constante de Michaelis (de ahí su abreviaturaK-) en honor al enzimólogo
que dilucidó su significado.La Figura 6.8 ilustra el significado de V-u,y de K-.
¿Porquéson importantesVr.* y Kmpa¡alos Biólogos
celulares?
Ahora que entendemos
lo que significaDV-* y K-, debemos preguntarnos
por qué estosparámetroscinéticosson
importantesparalos biólogoscelulares.
El valor de K. es
útil, porquenos permitecalcularen quéparteen la representaciónde Michaelis-Menten
de Ia Figura6.9, estáfuncionandouna enzima(suponiendo,por supuesto,que la
concentración
de sustratoen la célulaesconocida).Podemos entonces
calculara quefracciónde Ia velocidadmáxima esprobableque Ia reaccióncatalizadaenzimáticamente tengalugaren la célula.Además,K- sepuedeconsiderar
como un cálculoaproximadode la <calidad>
esuna enzima, en el sentidode que,cuantomásbajo esel valor K-,
más bajo es el rango de concentraciónde sustratoen el
cual la enzimaeseficaz*.Losvaloresde K- paravariasenzimasaparecen
en la Tabla6.2.
La V-"* de una reacciónparticularnos proporciona
una medidadela tasade reacción.Realmente
sonpocaslas
enzimasque se encuentran,in vivo, con concentraciones
saturantesde sustrato,de maneraque las enzimasraramentevan a funcionarlejosde susvelocidades
miíximas,
en condicionescelulares.
Sin embargo,conociendolos valores de V-",, K-, y la concentraciónde sustratoen vivo,
podremosal menosestimarla velocidadprobablede la
reacción,en dichascondiciones
celulares.
V-* también puede usarse para determinar otro parámetro útil llamado número de recambio (K."J, que expresa la velocidad a la cual las moléculas de sustrato se convierten en producto por una única molécula de enzima,
cuando ésta está funcionando a su máxima velocidad. La
constante (u, se expresa en unidades de tiempo inverso
(s-', por ejemplo) y se calcula como el cocienteentre V-*
y [E,], la concentración de la enzima en moles/litro:
r
'-cat
t' /m u
(6.u)
fl !Ff l I
El número de recambio varía mucho entre enzimas,
como se apreciaen los ejemplos dados enlaTabla 6.2.
La gálicadoblerecíproca
es unaformaútil
de representar
losdatoscinéticos
La gráfi,ca
clásicade Michaelis-Menten
de y frentea [S],tal
y como semuestraen Ia Figura6.8,esuna representación
fiel de cómo Ia velocidaddependede la concentración
de
sustrato,pero no es una herramientaespecialmente
útil
paraladeterminacióncuantitativade los parámetroscinéticosclavesK^y V^u*.Suforma hiperbólicahacedifícil extrapolarconprecisiónel parámetrocrítico V^^*,a concentración infinita de sustrato,y si V.u* no es conocidacon
precisión,K- no se puededeterminar.Esteproblemase
apreciaen la Figura6.9,en la que seríadifícil calcularV-u*
si no estuvieraya dibujada,y sin V-u*,K- tampocopuede
sercalculadafácilmente.
Parasolucionaresteproblemay proporcionarun enfoque gráfico más útil, Hans Lineweavery Dean Burk convirtieronla relaciónhiperbólicade la ecuaciónde Michaelis-Mentenen una función linealinvirtiendoamboslados
de la Ecuación6.7y simplificandola expresiónresultante
con la forma de una ecuaciónparauna línearecta:
1_
v
K.+[S]
V-o[S]
_
K*
_,
Y-*[S]
[S]
Y.".[S]
'l
- K^ lf
* I
v^* \lsl / v_*
(6.r2)
Tabla6.2 Valores
del(, y k r, paraalgunas
enzimas
Sustrato
Nombre
de la enzima
,(' (M)
k n(s-")
1 , 4 9x 1 0 4
Acetilcolinesterasa
Acetilcolina
g x 10-s
Anidrasacarbónica
Cot
1 X 10-2
Fumarasa
Fumarato
5 X 10-Ó
1
g
Triosafosfatoisomerasa
Gliceraldehído3-fosfato
5 X 10-4
4,3 x 103
B-lactamasa
Bencilpenicilina
2 X 10-s
2
X106
xl02
Xl03
* K- se considera a menudo como una medida de la afinidad de una enzima por sus sustratos,es decir, como la constantede disociación para ES.
Sin embargo,
es una relación de las constantesde velocidades:K^ : (k, + k) I h, Para conocer las consecuenciasde estarelación, véaseelPrcblema 6.I I a1final del capítulo.
Cinética
enzimática 1 5 3
La Ecuación6.12 esla ecuaciónde Lineweaver-Burk.
Cuandoéstaserepresentacomo Ilv frentea l/[S], como
en la Figura 6.10,la gráfrcadoble recíprocaresultante es
lineal,con una intersecciónde IIV^^ con el ejey, otra de
-llK^,con el ejex,yunapendienteK^lV^o. (Puedeconvencersea sí mismo de estosvaloresde intersecciónestableciendoprimero 1/[S],igualandollv a ceroen la Ecuación 6.12y resolviendoluegoel otro valor.) Por tanto, una
vez que seha dibujado la representacióndoble recíproca,
V-* se puede determinar directamentea partir del recíproco de la interseccióncon el ejey,y K- a partir del recíproconegativode la interseccióncon el ejex. Además,la
pendientesepuedeusar para comprobarambosvalores.
De estamanera,la representaciónde Lineweaver-Burk
esútil porqueconfirma mediantesu linealidadquela reacción en cuestiónestásiguiendola cinéticaMichaelis-Menten, y permite determinarlos parámetrosV-o y K- sin la
complicación de una curva hiperbólica. Thmbién sirve
comoun diagnósticoútil en el análisisde la inhibiciónenseve afectazimática,porquela forma de la representación
por varias tipos diferentesde
da de forma característica,
inhibidoresreversibles.
Sin embargo,la ecuaciónde Lineweaver-Burktiene algunaslimitaciones.El principalproblemaesque,a menudo, seprecisauna extrapolaciónelevadapara determinar
K-, por lo queel resultadopuedeserpocofiable.Además,
los datosmáscrucialesen Ia determinaciónde la pendiente de la curvasuelenserlos másalejadosdel eje¡ éstosse
corresponden
conlasconcentraciones
másbajasde sustrato y los nivelesbajosde la actividad enzimática,y por tanto, con los valoresmásinciertos.
Parasortearestasdesventajas,
sehan propuestovarias
a
la
ecuación
de
Lineweaver-Burk.
alternativas
Una de ellas
Eadie-Hofstee,
que
es la ecuaciónde
se representacomo
una gráficade v/[S] frentea v. Como seilustraen la Figura 6.1I, V-o sedeterminapor la intersección
con el ejexy
K- a partir de la pendiente.(Paraexplorarla representa-
,*,(tJ.t'*
Intersección
.j
C O ne l e J ex = - v
Km
Intersección
1
con el eJeY =;v^^*
1/[S]
Figura 6.10 Representacióndoble reciprocade Lineweaver-Burk.
El recíproco de la velocidad inicial Uv, serepresentacomo una
función del recíproco de la concentración de sustrato, 1/[S]. Kpuede calcularsepor la interseccióncon el eje xy V-o, coneleje y.
154
Gapítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
Intersección
con el eje y = V^
*l K^
vV^uv
=
ra1
,K
.m
-
Lvl
K
'.m
v/[S]
La relaciónv/lSl se
Figura
6.11 Representación
de EadieHofstee.
comounafunciónde r;.K- puededeterminarse
representa
desdela
pendientey V-o por la intersección
con el ejex.
ción de Eadie-Hofsteey otra alternativamás a la representación Lineweaver-Burk,vea el Problema 6.12. al final de
estecapítulo.)
de K^y V^u*
Unejemplode determinación
Considereun ejemplo específicopara determinar V** y
K-, a partir de la representación
doblerecíproca,que implique a la enzimahexoquinasa,como seilustra en las Figuras6.12y 6.13.La hexoquinasa
esuna enzimaesencial
en el metabolismoenergéticocelular,porque cataliza\a
primerareaccióndela glucolisis,
la cualsediscutiráen detalle en el Capítulo 9. La hexoquinasacatalizala fosforilación de la glucosaen el átomo de carbono6, usandoATP
comofuente,tantode fosfato,comodela energíanecesaria
parala reacción:
Glucosa+ AIP -----------)
Glucosa-6-fosfatof ADP (6.13)
Hexoquinasa
Para analizar cinéticamente esta reacción, debemos
determinar la velocidad inicial en cada una de las diversas
concentraciones de sustrato. Cuando una enzima tiene
dos sustratos,el enfoque habitual es variar la concentración de un sustrato en un momento dado. mientras se
mantiene la del otro constante, a un nivel suficientemente
alto (cercade la saturación), para asegurarque no llegue a
ser un factor limitante de la velocidad. Debemos también
tener cuidado de asegurarnosde que la determinación de
la velocidad se haga antes de que el producto se acumule
hasta los valores que hagan que la reacción contraria pueda tener lugar.
En el enfoque experimental que se muestra en la Figura 6.I2,la glucosa es el sustrato variable, con el AIP presente a una concentración saturante en cada tubo. De las
nueve reaccionesde mezcla programadaspara esteexperimento, una se toma como blanco (B), porque no contiene
glucosa.Los otros ocho tubos tienen concentracionesgraduales de glucosaque van desde0,05 a0,40 mM.Unavez
que la alejende la cinéticade
naspropiedades
especiales
Michaelis-Menten.
La curvahiperbólicade Ia Figura6.12ilustrala necesidad de recurrir a un análisislineal, porque no se pueden
obtener,ni V-*, ni K-, a partir de los valoresde la representaciónhiperbólica,aunquese dispongade los datos
para construir la curva.Sin embargo,la representaciónlinealdoblerecíprocade la Figura6.13,sí lo permite.Para
obtenerlos datosmostradosaquí,se calcularonlos recíprocosde cadavalorde [S]y v dela Figura6.12.Asi,losvamM, generanrecíprocos
de20-2,5
loresde [S] de0,05-0,40
mlullt, y los valoresde v de 2,5-7,3¡.rmol/min,arrojanrecíprocosde 0,4-0,14min/¡rmol.Dadoquesonvaloresrecíprocos>el dato del tubo I es el más alejadodel origen,
mientras que cadatubo sucesivo,alcanzaráun valor más
próximo al origen.
Cuandoestosdatossevan uniendo por medio de una
línearecta,la interseccióncon el eje7 coincidgcon el valor
'.
0,1min/mmol, y la del ejex" con -6,7 mluf Desdeestas
intersecciones
con los ejes,podemoscalcularque V-o :
:
1/0,1 10 prmol/miny K- : -(ll-6,7) : 0,15mM. Si
ahora volvemosa la representaciónde Michaelis-Menten
de la Figura6.12,podremosver queambosvaloressonrazonablesporquepodemosimaginarfácilmenteque la representaciónestá creciendohiperbólicamentehasta un
miíximo de l0 nmollmin. Más aún, Ia gráfrcaalcanzala
de sustratode 0,15
mitad de su valor a una concentración
püüwwwffiwry
I-'t
Númerode tubo:
|--t
|-1
t-1
t-1
t-T
t-T
lBll 1ll2ll3ll4ll5ll6ll
|-1
t-1
rllsl
(mM):
[S]= lglucosal
v (pmol/min):
Bliiii
f
a
OE
-tr
'6*
,, - /t"" [S]
K* + [S]
¡O
-oOcA)
o
- 0:
0,10
0,20
0,30
0,40
(mM)
de glucosa
[S]= Concentración
Figwa 6.L2 Estudioexpeilmentalde la cinética de la reacciónde la
hexoquinasa. Seincubó una seriede tubos de ensayocon
concentracionescrecientesde glucosay una concentración saturada
de ATR añadiendo una cantidad estándarde hexoquinasa.La
velocidad inicial de la aparición del producto, v, se representócomo
una función de la concentración del sustrato [S]. La curva es
hiperbólica, acercándosea V-*, a medida que la concentración de
sustrato escadavez mayor. Parala representacióndoble recíproca
derivadade estosdatos,véaselaFigura 6.13.
preparados
los tubosy mantenidosa una temperaturafa(generalmente,
25 oC),se inicia la reacción,mevorable
diantela adiciónde una cantidadfija de hexoquinasa.
La velocidadde formacióndel productosepuededeterminar,bien mediantemonitorizaciónespectofotométrica continuade Ia reacciónde mezcla(suponiendoque
uno de los reactivoso productosabsorbenluz de una determinadalongitud de onda),bien permitiendoque cada
reacciónde mezclaprogreseduranteun periodode tiempo
corto y fijo, seguidode un ensayoquímico de la desaparición del sustratoo de la acumulacióndel producto.En el
casode la reaccióncon hexoquinasa,seusael último procedimiento,porque no hay manerade medir fotométricamenteni los productosni los reactivos.
Como se indica en la Figura6.12,la velocidadinicial
paralos tubos 1-8 oscilódesde2,5 a 7,3 ¡.rmolde glucosa
consumidapor minuto, sin reacciónen el blanco.(Si la
glucosaconsumidahubierasidodetectada
en el blanco,los
valoresdel resto de los tubos tendrían que normarlizarse
con relacióna estareacciónno enzimática.)Cuandolasvelocidadesde reacciónserepresentancomo una función de
la concentraciónde glucosa,los ocho puntos generanla
curvahiperbólicaque semuestraen Ia Figura6.12.Aunque los datosde la Figura6.12sehan corregidoparailustrar mejor el ejemplo,lo cierto esque la mayoríade los datos cinéticosobtenidospor estemétodo encajanbien en
una curva hiperbólica,a menosque la enzimatengaalgu-
detubo:
Número
Itll ;l I;l Itl |;l
I,I
rlr.r$ffi|
|B
uu|8|ffiu
1/v(min/pmol)
4 0 , 1 50 , 1 80 , 2 00 , 2 5
-o
E
.c
E
0 ,2
0,
1 l(ml1l
1
=
n v* [ts]l-v*
1/[S]= 1/[glucosa](ml1z|1)
Figura6.13 Representacióndoble recíprocade los datos de la
hexoquinasa
de la Figura6.12. Los valoresde l/vy 1/[S] de cada
tubo de ensayose calcularon a partir de los datos de la Figura 6.12.
Despuésserepresentól/v como función de 1/ [S]. La intersección
con el eje7 en el punto 0,1,correspondea llV^*, por lo que V-o es
10 zmollmin. La intersección con el eje x en elvalor '6,7 ,
correspondea -llK^,y así,{, es0,15 mM. (Note que,por falta de
espacio,no semuestran aquí algunos de los tubos representadosen
la Figura 6.12.)
Cinética
enzimática 1 5 5
mM que esel datodel tubo 3. Éstaes,por supuesto,
la Kde la hexoquinasapara la glucosa,generalmenteescrita
como K-,r1u.oru.
Además, la enzima tiene una K- para el otro sustrato,
Km,Arp,quesepodría calcularvariando la concentraciónde
ATP mientras se mantiene la concentración de glucosa a
un valor alto y fijo. Curiosamente, la hexoquinasa fosforila, no sólo a la glucosa,sino también a otras hexosas,teniendo un valor distinto para cadauna. La K^para fructosa,por ejemplo, es 1,5mM 1ocual significa que necesita10
vecesmás de fructosa que de glucosa, para mantener la
reacción a la mitad de su velocidad miíxima.
Aunque ligeramente simplificada e idealizada,esta es la
manera en que los enzimólogos abordan el estudio de las
reacciones catalizadasenzimáticamente. Sus análisis son a
menudo más complicadosy casisiempreprecisande un ordenador para calculary trazar los datos doblesrecíprocosy
determinar los valores de K- y de,V-o, pero el enfoque básico es el mismo que el ilustrado en las Figuras6.12y 6.13.
Losinhibidores
enz¡máticos
actúanirreversible
o
fevefsiblemente
Hastaaquí,hemosasumidoquelasúnicassustancias
enlas
célulasque afectana las actividadesde lasenzimasson sus
sustratos.Sin embarso,las enzimastambiénestáninflui'
sustratosanálodaspor productos,sustratosalternativos,
gos,drogas,toxinasy una claseimportantede reguladores
I^ ^aot 4rrtofgt-olgltérir^. Muchas de estassustancias
-tienen un efectoinhibidor en la actividad enzimátíca,reduciendo(o incluso anulando)la velocidadde reacción
con el sustratodeseado.
Ebtainliiliiiió:n dé la actividadde la enzimaesimportantepor variasrazones.La primeray principal,esque Ia
inhibiciónenzimáticadesempeña
un papelvital comomécanismode controlen lascélulas.Comodiscutiremos
en el
próximo apartado,muchasenzimasse sometena regulación por moléculaspequeñasespecíficas
distintasde sus
sustratos.La inhibición enzimáticatambiénesimportante
en la acciónde drogasy toxinas,IascualesejercenfrecuenLosintementesusefectosinhibiendoenzimasespecíficas.
hibidorestambiénson útilespara los enzimólogoscomo
herramientaspara el estudiode los mecanismosde reacción. Son especialmente
importantesen esteúltimo caso,
los análogosde sustratos,compuestosque se asemejanal
sustratorealpero que son químicamenteincapaces
de IIevar a cabola reacción.
Losinhibidorespuedense¡reversibles
o irreyersíbles.Un
inhibidor irreversibleseune a la enzimaconvalentemente,
causandouna pérdidairrevocablede la actividadcatalítica.
No sorprendeque los inhibidoresirreversibles
seannormalmentetóxicosparalascélulas.Losionesde metalgspesadosson,a menudo,inhibidoresirreversibles,
al igual que
suelenserlolos agentesalquilantesy los gasestóxicosnerviosos.Éstaes,de hecho,larazónde quemuchosinsectici156
Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
dasy gasesnerviososseantan tóxicos.Estassustanciasse
a la acetiLcolinesterasa,
unen irreversiblemente
una enzima
queesfundamentalparala transmisióndel impuso nervioso (véaseCapítulo 13).La inhibición de la actividadacetilllevaa una parálisisrápidadelasfuncionesvicolinesterasa
tales¡ por tanto, a la muerte.Uno de talesgasesnerviosos
esel di-isopropilo
el cualseune covalentemenfluorofosfafo,
te al grupo hidroxilo de una serinacríticadel sitio activode
la enzima,a la cualinactivapermanentemente.
Muchastoxinasnaturalessontambiéninhibidoresenzimáticosirreversibles.
Por ejemplo,el alcaloidefsostigmidel habade Calabar(Nigeria),estóxina,un componente
co paralos animalesporqueinhibe irreversiblemente
a la
acetilcolinesterasa.
El antibióticoDenicilinqesun inhibidor
irreversibled. tut
de la paredcelularbacteriana.
La penicilina,por tanto,es
porque
eficazen el tratamientode infecciones
bacterianas,
impide la formaciónde las paredescelularesde bacterias.
Por contra,un inhibidor reversibleseune a una enzima de forma disociable,
no covalente,
de maneraqni lut
formas libres y unidas del inhibidor existenen equilibrio
las unascon las otras.Podemosreplesentartalesuniones
E + Ii-EI
(6.14)
siendoE la enzimalibrey activa,Iel inhibidor,y EI el complejo inactivo enzima-inhibidor.Evidentemente,
la fracción de la enzimaqueestádisponibleen la célulaen forma
activa,dependede la concentracióndel inhibidor y de la
estabilidad
del complejoenzima-inhibidor.
Lasdosformasmáscomunesde inhibidoresreversibles
seclasificancomo inhibidorescompetitivos
e inhibidoresno
competitivos.
vo de la ertzimay por lo tanto compite directamentecon
las moléculasde sustratopor el mismo sitio de la enzima
(Figura6.14a),reduciendosu actividad,-hasta
el punto de
quelossitiosactivosdelasmoléculasde enzimapuedentener unidas,en cuálquiermomento,moléculasdel inhibidor,en lugarde moléculasdel sustrato.
Un inhibidor no competitivo po-r-g1lglgdq,se
une a la
aell sl4ry stlffi{iiió
sgegsr"
por
áai ro.
délsitio
"Tiñ;Aie
talió,nó6lo?frea
fa;ñiónelsustñió
6iéiin
embargoinhibe la actividadde la enzimaporque la unión
del inhibidor con su sitio específico,reduceenormemente
o incluso suprime la actividad cataliticaen el sitio activo
(Figura6.14b)
Regulación enzimática
Para entender el papel de las enzimas en la función celular,
debemos saber que es muy infrecuente, que la mejor opción para una célula,seapermitir funcionar a éstasa velocidades indiscriminadamente altas. En su lugar, las velocidades de las reacciones catalizadas enzimáticamente y las
Sustrato
..
.i.l':3l),H"
tí
&\,
Productos
Productos
trb
/^\
,s,
{-t
[/
1lrra,nn,o,oo,,
I
-lb
r
\
Fr
E J
\=/
Ausenc¡a
oe rormaoon
deproductos
(a) lnnibicióncompetitiva.Tantoei inhibidor,como el sustrato,
se unenal sitioactivode la enzima,La uniónde un inhibidor
por tanto,la
impldeque el sustratose una,inhibiendo,
actlvidadenzimática.
(b) Inhibiciónno competitiva.El inhibidory el sustratose unen
La uniónde un inhibidordeformala
a sitiosdiferentes.
la probabilidadde la unióndel
enzima,disminuyendo
SUSTTAIO.
(a),comolosno
competitivos
y nocompetitivos.Tantolosinhibidores
competitivos
F¡gura
6.14 Modosdeaccióndelosinhibidores
difieren
Losdostiposdeinhibidores
por tanto,su actividad.
(b) (enrojo)seunenreversiblemente
a la enzima(E)inhibiendo,
competitivos
oor el sitiodeia enzimaal queseunen.
rutas bioquímicas de las que forman parte, deben ajustarse
continuamente, para mantenerlas sintonizadas,de forma
precisa,con las necesidadesde la célula.Un aspectoimportante de ese ajuste reside en la capacidad de la célula de
controlar las actividadesde la enzima con especificidady
precisión.
Ya hemos visto una variedad de mecanismosreguladores,incluyendo cambios en las concentracionesde sustrato
(y de producto), alteracionesen el pH, y la presenciade inhibidores. ta ¡cgulación que depende directamente de las
interaccionesentre lg! t@
zima, se llama reg¡la_c_iQn
pqr el sustrato..Tal y como se
desprendede la ecuación de Michaelis-Menten, los incrementos en la concentración de sustrato tienen como
resultado un aumento en la velocidad de reacción (véase
Figura 6.8). Por el contrario, los incrementos en la concentración de producto reducen la velocidad a la cual el susla
lrato se convie
concentración de producto es porque vtiene que ser identificado como la velocidad de reacción inicial en Ia ecuación de Michaelis-Menten, tal y como viene dado por la
Ecuación 6.7. Si una cantidad significativa de producto
esfáya presente,o se acumula durante el curso de Ia reacción, la ecuaciónsemelve más compleja que ia forma simple en que la hemos considerado.)
La regulación por el sustrato es un importante mecanismo de control en las células,pero no es suficiente para
la regulación de]a mayoría de las reacciones o secuencias
de reacciones.En la mayoria de las rutas, Ias enzimas se regulan también mediante otros mecanismos. Dos de los
más importantes sonla regulación alostéricav la modirtca'
Estosmecanismospermiten a las célulascoción,covalente.
nectar o desconectara las enzimas o aiustar susvelocidades
de reacción, modulando apropiadamente las actividades
de las enzimas.
Casi invariablemente,una enzima que se regula por tal
mecanismo, catalizael primer paso de una ruta de múltiples etapas. La secuencia completa se controla, incrementando o reduciendo Ia velocidad a la cual funciona la
primera etapa. Entre las rutas que se regulan así, se encuentran las de ruptura de moléculas grandes (como azúcares,grasaso aminoácidos) y las que conducen a la síntesis de sustancias necesarias para la célula (como
aminoácidosy nucleótidos).Ahora discutiremosla regulación alostéricayla modificación covalentede una manera
introductoria. con Ia intención de volver a estosmecanismos a medida que encontremos ejemplos específicosen
capítulosposteriores.
pormoléculas
se regulan
alostéricas
Lasenzimas
y losproductos
delosreactivos
diferentes
La regulaciónolostéricaes el único mecanismo importante
de control, por el cual Ia tasa de las reaccionescatalizadas
enzimáticamente,se aiustaa las necesidadescelulares.Para
entender este-modo áé ieguiaciOn,considerela vía por la
cual una célula convierte un precursor A en un producto
final R mediante una serie de intermediarios B, C y D, en
una secuenciade reaccionescatalizadasrespectivamente,
por las enzimasE1,E2,E3y Ea:
A --;-t l
B --;-F t
C --;-L ,
D --;-+
P
rc
(6.1s)
El productoP podríaser,por ejemplo,un aminoácido
quela célulanecesitaparala síntesisde proteínas,y A poRegulación
enzimática t57
l-
dría ser algún componente celular común que sirve como
punto de partida parala secuenciade reacción específica
que conduce a P.
Rettoinhibición, Si se permite progresar constantementea
la ruta 6-15, con una tasano limitada, se convertirán grandes cantidadesde A en R con los posiblesefectosadversos
de la reducción de A o una excesivaacumulación de P (o
ambos). Estáclaro que los interesescelularesquedan mejor
satisfechoscuando la ruta no estáfuncionando a su miíxima velocidad o incluso a una velocidad constante,sino a
una velocidad,cuidadosamentedeterminadapor la necesidad de P. De alguna manera, las enzimas de estavía deben
ser sensiblesal nivel celular del producto P,al igual que una
calderanecesitaser sensiblea la temperatura de Iashabitacionesque pretendecalentar.En el último caso,un termostato proporciona el vínculo regulador necesario entre la
calderay su <producto>,el calor. En nuestro ejemplo de la
enzima,la regulación deseadaesposible porque el producto P es un inhibidor específicode E,,la enzima que catalizalaprimera reacción de la secuencia.
Este fenómeno es llamado retroinhibición (o inhibición por el producto final) y se representapor la flecha de
líneasdiscontinuas que conectael producto P con la enzima E1,en la siguientevía:
A -;-
S
l-
C -E- D
I'P
(6.16)
Retroinhibiciónde El medianteP
De manera más general, una retroinhibición sucede
cadavez que un producto metabólico inhibe a una de las
enzimasimplicada en la vía por la cual eseproducto sesintetiza. La retroinhibición es uno de los mecanismos más
comúnmente usadospor las célulaspara asegurarque las
actividades de las secuenciasde reacción se aiustan a las
necesidadescelulares.
La Figura 6. l5 proporciona un ejemplo específicode tal
secuencia-la ruta de cinco pasosen la que el aminoácido
isoleucinase sintetiza a partir del aminoácido treonina-.
En estecaso,la primera enzima en la vía, la treonina desaminasa,seregulamediante la concentraciónde isoleucina
en la célula. Si se estáconsumiendo isoleucina (por ejemplo, en la síntesisde proteínas),su concentraciónserábaja.
En estascondiciones,la treonina desaminasaestá activa y
la vía funcionapara producir más isoleucina, de manera
que se satisfacela necesidadreal de esteaminoácido. Si los
requerimientos de isoleucina decrecen, ésta empezará a
acumularse en la célula y el incremento de su concentración conducirá a una reducción de la actividad de la treonina desaminasay, por ende,de Ia velocidad de síntesisdel
aminoácido.
Regülación
alostédca. ¿Cómo puede la primera enzima en
una vía (por ejemplo, la enzima E, en Ia secuenciade Reac-
158
Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
o
^v - ^v -
I
H.+N-C-H
"l
H-C-OH
.-v;;;;:.
-'1
I
cH.
i-
lntermeo¡a¡á
Á-l
I
Enzima2
I
V
-o
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.o.E
cú
E
6
c)
1)
-
;vñE Y
v
..
fxx
oo
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I
t
' có@
o uc ú
lri
Intermediario
B
E n z i m a3
Intermediarlo
C
II
Enzima 4
V
lntermediarlo
D
II
v
E n z i m a5
o
c-oI
H -?l+ N - C - H
Producto
final
(isoleucina)
H-C-CH"
t"
CH,
t-
CH^
Figura
6.15 Regulación
alostérica
dela actividad
enzimática.La
rutadesíntesis
delaminoácido
isoleucina
a partirdetreonlna,es
un buenejemplode retroinhibición.
Laprimeraenzimadela
secuencia,
la treorrina
deaminasa,
esinhibidaalostéricamente
por la
isoleucina,
Ia cualseunea la enzimaen un sitio diferente
d,elsitío
actlvo.
ción 6.16) ser sensiblea la concentración de una sustancia
P que no es ni su sustrato ni su producto inmediato? O,
volviendo a la Figura 6.15, ¿cómo puede la actividad de la
treonina desaminasaser sensiblea la concentraciónde isoleucina, cuando su estructura difiere tanto de la de la treonina, que es improbable que seareconocida por el centro
activo de la treonina deaminasa?
Esta pregunta fue respondida por primera vez en 1963
por |acquesMonod, Jean-PierreChangeux y Frangois Ja-
cob. Aunque basadainicialmente en datos incompletos, su
modelo fue rápidamente tenido en consideracióny se desarrolló hastallegar a ser la basede nuestro entendimiento
de Ia regulación alostérica. El término alostéricoderiva del
griego <otra forma (o estado)>,indicando, por lo tanto,
que todas las enzimascon capacidadde regulación alostérica, pueden existir en dos estadosdiferentes. En una de las
dos formas, la enzima tiene una afinidad alta por su(s) sustrato(s), mientras que en la otra, tiene poca o ninguna afinidad. Las enzimas con estapropiedad se llaman enzimas
alostéricas. Las dos fognas dife:e-ntes-deuna en-ima alq,stérica qqq fácilmp-q1elntelga¡lyqrtlbl€Ey€sté!-de¡scha.qn
equilibrio una con otra. Obviamente, la velocidad de reacción es alta cuando la enzima está en la forma de alta afinidadybaja,o incluso nula, cuando Ia enzima estáen su forma de baja afinidad.
El que se favorezcala forma activa o inactiva de una enzima alostérica depende de la concentración celular de la
sustanciareguladora apropiada, llamada efector alostérico.
En el casode la síntesisde isoleucina,la enzima alostéricaes
la treonina desaminasay el efector alostéricoes la isoleucina. De manera más general,un efectoralostéricoes una pequeña moléculaorgánica que regula Ia actividad de una enzim6 para Ia cual no esni el sustrato,ni eIproductoinmediato.
Un efector alostérico influye én la actividad de la enzima
uniéndose a una de las dos formas interconvertibles de ésta,
estabilizándolaen eseestado.En otras palabras,una enzima
Sitio
",":i:?."
activo
ffsustrato
-¿
L¡ \
,.--.t'oxto'
\
r't1x
al*'h
-_(jr.-?
\--,\-:/
Y
Formade altaafinidad
de la enzima
il.--lnnroroor
arostérico
fflI
lt
alostérica puede existir en una forma compleja o simple,
dependiendo de si tiene una molécula efectora unida a ella
o no. El efector se une a la enzima debido a la presencia en
la superficie de ésta de un sitio alostérico (o regulador),
que es distinto del sitio activo en el cual tiene lugar el evento catalítico. Así, una característica distintiva de todas las
enzimas alostéricas(y otras proteínas alostéricas) es la presenciaen la enzima dew sitio activo al que se une el sustrato y un sitio alostéricoal que se une el efector. De hecho,
algunas enzimas alostéricastienen multiples sitios alostéricos, cada uno capaz de reconocer un efector diferente.
Un efector puede ser, o bien un inhibidor alostérico o
bien un activador alostérico, dependiendo del efecto que
ejerza cuando se una al sitio alostérico de la enzima, es
decir, dependiendo de si la forma compleja es el estadode
baja afinidad o alta afinidad de la enzima (Figura 6,16).La
unión de un inhibidor alostéricocambia el equilibrio entre
las dos formas de la enzima para favorecerel estadode baja
afinidad (Figura 6.16a).La unión de una activador alostérico, por otra parte, cambia el equilibrio a favor del estado
de alta afinidad (Figura 6.16b). En cada caso,la unión del
efector al sitio alostéricoestabilizala enzima en una de sus
dos formas, incrementando o disminuyendo de esemodo
la probabilidad de unión al sustrato.
La mayoría de las enzimas alostéricas son proteínas
grandes,multiméricas y con un sitio activo o un sitio alostérico en cada subunidad. De hecho, los sitios activosy los
Sitlo
Sitio
activo
alostérico
Escasao nula
formación
de producto
Formade bajaafinidad
de laenzima
n lk c-mg:l;;
"\l
Escasa
o nula
formación
de producto
Formade bajaafinidad
de la enzima
(a) tnnibiciónalostérica.Una enzimasusceptiblede
inhibiclónalostéricaes act¡vaen la formalibre,la cual
tieneuna altaafinidadpor sus sustratos(S).La uniónde
un inhibidoralostérico(en rojo)estabilizala enzimaen su
formade baja afinidad,resultando
en poca o nula
actividad.
productos
^
pl^fl"b.€-.4
\-/\-:/
-
[\1/
V
Formade altaafinidad
de la enzima
(b) Activac¡ón alostérica. Una enzimasusceptiblede
activaciónalostéricaes inactlvaen su formalibre,la cual
tieneuna afinidadbaja por su sustrato.La uniónde un
activadoralostérico(en verde)estabilizala enzimaen su
formade baja afinidad,activandoa la enzima.
de inhibicióno activaciónalostéticas, Una enzimaalostéricaestáconstituidapor una o más subunidades
Figura6.16 Mecanismos
catalíticas(C) y una o más subunidadesreguladoras(R), cada una de las cualescon un sitio activo y un sitio alostérico,respectivamente.La
enzimaexisteen dos formas, una con alta afinidad por el sustrato (¡ por tanto, con una probabilidad alta de formación de producto) y otra
con una baja afinidad (y la correspondienteprobabilidad baja de formación de producto). La forma que adquiere una enzima es
dependientede la concentracióndel efector(es)alostérico(s)para esaenzima.
Resulación
enzimática
L59
sitiosalostéricosestánnormalmenteen diferentessubunidadesde la proteína,a lasque denominamossubunidades
catalíticas y subunidades reguladoras, respectivamente
(fijeseen lassubunidadesC y R de lasmoléculasde la enzima que semuestranen la Figura6.16).Estosignifica,consecuentemente,
quela unión delasmoléculasefectorasa los
sitiosalostéricos,
no sólo afectaa la forma de lassubunidadesreguladoras,
sino tambiéna lassubunidadescatalíticas.
Lasenzimasalostéricasman¡f¡estan
interacciones
cooperativas
entresubun¡dades
Muchasenzimasalostéricasposeenuna propiedadconocida'comocooperatividad.Estosignificaque,a medidaque
los múltiples sitios catalíticosunen moléculasde sustrato,
la enzimasufrecambiosconformacionales,
queafectana la
afinidad de los restantessitiosde unión del sustrato.Algunasenzimasmuestrancooperatfuidad
positiva,en la cual la
unión de una moléculasustratoa una subunidadcatalítica
incrementala afinidadde otrassubunidadescatalíticaspor
el sustrato.Otrasenzimasmuestrancooperativad
negativa,
en la cual el sustratounido a una subunidadcatalíticareduce la afinidad de otros sitios catalíticospor el sustrato.
El efectocooperativopermite a las célulasproducir enzimasque son más o menossensiblesa los cambiosen la
concentraciónde sustrato,lo que por otra parte,seríapredeciblepor la cinéticade Michaelis-Menten.La cooperatividad positivahaceque la actividad cataliticade la enzima
se incrementemás rápido de lo normal a medida que la
concentracióndel sustratoaumenta,mientrasque la cooperatividadnegativasignificaque la actividad enzimática
aumentamáslentamentede lo esperado.
Lasenzimastambiénse puedenregularpor la adiclón
o eliminaciónde gruposquím¡cos
Muchasenzimas,adernásde la regulaciónalostérica,están
sometidasa control mediantemodificacionescovalentes.
En estamanerade regulación,la actividadde una enzima
seve afectadapor la adición o eliminaciónde gruposquímicosespecíficos.
Lasmodificacionescomunesincluyenla
adición de gruposfosfato,gruposmetilo, gruposacetilo,o
derivadosde nucleótidos.Algunasde estasmodificaciones
pueden ser reversibles,mientras que otras no. En cada
caso,el efectode la modificaciónesla activacióno la inactivación de la enzima,o por lo menosla modulación,hacia
arriba o haciaabajo,de su actividad.
Fosfodlación/defosforilación.
La adición reversiblede grupos fosfatoesuna de las modificacionesmás frecuentesy
mejor entendidas.La adición de gruposfosfato,esdecir,la
fosforilación suele producirse por transferenciade un
grupo fosfatodesdeel ATP al grupo hidroxilo de un residuo de serina,treonina o tirosina de la proteína enzimática.Lasenzimasque catalizanla fosforilaciónde otrasenzimas (o de otrasproteínas)sellaman proteín-quinasas.El
160
Capítulo
6
Enzimas:
loscatalizadores
de lavida
procesoinverso,la defosforilación,estácatalizadopor enzimas llamadasproteín-fosfatasase implica la eliminación de un grupo fosfatodesdela proteínafosforilada.
Estaforma de regulaciónesla de la glucógeno
fosforilasa,rrna enzimaque seencuentraen las célulasmusculares
(Figura6.I7).La enzimahidrolizael glucógeesqueléticas
no por eliminacionessucesivas
de unidadesde glucosa,en
(Figura6.I7a). La regulación
forma de glucosa-1-fosfato
de esta enzimadimérica se consigueen parte por la presenciaen lascélulasmuscularesde dosformasinterconvertiblesde la enzima,una forma activallamadafosforilasaay
otra inactiva,llamadafosforilasab (Figura6.17b).Cuando
senecesitahidrolizar glucógenoen las célulasmusculares,
la forma inactiva b de la enzimapasaa la forma activaa,
por adición de un grupo fosfatoen una serinaespecífica,
en cadauna de las dos subunidadesde la fosforilasa.Esta
reacciónsecatalizapor la fosforilasaquinasayel resultado
esun cambioconformacionalen la fosforilasa.Cuandono
senecesitahidrolizar más glucógeno,los gruposfosfatola
fosforilasaa son éliminadospor la enzimafosforilasafosfatasa.(La glucógenosintasa,la enzima que añadenueyas
unidadesde glucosaa la cadenade glucógeno,respondede
forma opuesta;esinactivaen la forma fosforiladay seactiva por defosforilación.
)
Ademásde la regulaciónpor los mecanismosde fosforilación/defosforilación
dela Figura6.l7,la glucógenofosforilasa es también una enzima alostérica,que se inhibe
por glucosay ATR y seactivapor AMP. Si una señalhormonal provocala fosforilación¡ por tanto,activaciónde la
fosforilasaen una célulamuscular,que aún poseesuficiente de glucosa,ésta inhibirá alostéricamentea la enzima,
hastaque searealmentenecesaria.
Por otra parte,las célulasmuscularesquetengannivelesbajosde glucosa,podrán
beneficiarseinmediatamentedela conversióndela fosforilasaa la forma activa.
La existenciade dosnivelesde regulaciónparala glucógenofosforilasa,ilustraun aspectoimportantede la regulación enzimática.Muchasenzimasse controlan por dos o
másmecanismosreguladores,
y de esemodo,permitena la
célularesponderadecuadamente
frentea variassituaciones.
Ruptutaprcteolítica. Un tipo diferentede activacióncovalente de enzimasconsisteen la eliminaciónirreversiblede
un fragmento de la cadenapolipeptídica,mediante una
enzima proteolítica (que degrada proteínas) adecuada.
Estetipo de modificación,llamado ruptura proteolltica,
esel que tiene lugar en las enzimasproteolíticasdel páncreas,tripsina, quimiotripsina y carboxipeptidasa.Estas
enzimas,sintetizadasen el páncreas,son secretadas
al duodeno,en respuestaa una señalhormonal. Estasproteasas,
junto con la pepsinadel estómagoy otras enzimasproteolíticassecretadaspor las célulasdel intestino, pueden
digerir casi todas las proteínasingeridas,rindiendo aminoácidoslibres,que sepuedenabsorberpor lascélulasepitelialesdel intestino.
cH2oH
cH2oH
CH2OH
,.#t"#'"-,{}'"OH
OH
Cadenade glucógeno
OH
Restode glucosa
del extremode la
cadenade glucógeno
t99
loo
,sii"T::::
@
|
i
cH,oH
cH,oH
-"ó"rót
o-eo.+ *
OH
Glucosa-1-fosfato
Figura6.17 Regulación
de la glucógeno
fosfodlasapu fosforilación, (a) La
glucógeno fosforilasa esuna enzima
dimérica en las célulasmusculares,que
libera unidades de glucosaa partir del
glucógeno,en forma de glucosa-l fosfato,
utilizable por Ia célula muscular, como
fuente de energía.(b) La glucógeno
fosforilasaestáregulada,en parte, por un
mecanismo de fosforilación/defosforilación.
La forma inactiva de la enzima, la fosforilasa
á, puede ser convertida a la forma activa,
fosforilasa a,porla transferenciade grupos
fosfato desdeel AIP a una serina
determinada,en cada una de las dos
subunidadesde la enzima, La reacción de
fosforilación escatalizadapor la enzima
fosforilasa quinasa.La eliminación de los
grupos fosfato por la fosforilasa fosfatasa,
devuelvea la fosforilasa a la forma b inactiva.
o -..
OH
Cadenade glucógeno
con
restode glucosa
menos
OH
(a) Reaccióncatalizadapor la glucógenofosforilasa
--slN4.''xl
'¿ry:RÉ
'@
OH
OH
w
Glucógeno
fosforilasab
(inactiva)
-'
qutnasa
FOSrOllasa
Fosforilasafosfatasa
H2 @
,@
Glucógeno
fosforilasaa
(activa)
(b) Regulación
de la glucógenofosforilasa
Lasproteasas
pancreáticas
no sonsintetizadas
en su forma activa;probablementeesopodría causarproblemasen
las célulasdel páncreas,la cualesdebenprotegersede sus
propiasenzimasproteolíticas.En cambio,cadauna de estas
enzimasse sintetizacomo una moléculaligeramentemás
grandey catalíticamente
inactivallamadazimógeno.
Loszimógenosdebenautodigerirseproteolíticamentepara producir lasenzimasactivas.Variosde estosacontecimientos
se
muestranen la Figura6.18.Por ejemplo,la tripsinasesintetizainicialmentecomo un zimógenollamadotripsinógeno. Cuando el tripsinógenoalcanzael duodeno,se activa
por la eliminaciónde un hexapéptido(una cadenade seis
aminoácidos)desdesu extremoN-terminal, por la acción
dela enteroquinasa,
una proteasade membrana,producida
por las célulasdel duodeno.La tripsina activaluego a los
otros zimógenos,medianteproteolisisespecíficas.
Ribozimas: moléculas de RNA
con actividad enzimática
Antesde los primerosañosde Ladécadade 1980,sepensaba quetodaslasenzimaseranproteínas.De hecho,esaafirmación seconsiderócomo una de lasverdadesfundamentales de la biología celular y se encontrabaen todos los
libros de texto.Los biólogoscelularesllegarona estarconvencidosde que todaslas enzimaseran proteínas,porque
todaslasenzimasaisladasen los 55 añosque siguierona la
purificación de la ureasapor Sumneren 1926,resultaron
ser proteínas.Pero Ia biología está llena de sorpresas,y
ahora sabemosque la afirmación necesitaser revisada,
para incluir a los catalizadores
constituidospor ARN y denominadosribozimas.
Ribozimas:
moléculas
de RNAconactividad
enzimática 1 6 1
Procarboxioeotidasa
/ i ^¡^o^u+ui ,v, a^ ,\ ,
\il
-->
Carboxioeotidasa
(activa)
para que
del nucleótidoguanosina- erannecesarias
tuvieralugar la reacción.Paranuestrasorpresa,
no era
necesario
el extractonuclearqueconteníalasenzimas.
Nosvimosobligadosa concluirque,o Ia actividad
enzimáticaproyeníade unaproteínaunida tan
estrechamente
al RNAqueéramosincapaces
de
separarlade é1,o queel RNAestabacatalizandosu
propioayuste.Dado lo arraigadaqueestabala ideade
quetodosloscatalizadores
biológicos
eranproteínas,Ia
hipótesisde Ia católisispor RNAno erafácil de aceptar.
Pesea todo, Ios experimentosadicionalesapuntaron
haciala conclusióninicial:la eliminaciónde un intrón de
4 13-nucleótidosdel pre-rRNA de Tetrahymenaestácatalizadaporla propiamoléculade pre-rRNA,siendo,por tanto, un ejemplode autocatalisis.
La Figura6.19muestrael procesode escisión,el cual
Células
implica
O el plegamientode la moléculade pre-RNArno
epiteliales
a¡rstadaparaformar un bucle,@ el ataquepor un grupo
hidroxilo de una de guanosinaque actúa como cofactor,
Figura6.18 Activaciónde los zimógenospancreáticospor
ptoteolisis. Lasproteasaspancreáticas
@ cortey ayustede la moléculade rRNA con la liberación
son sintetizadas
y
secretadasen el intestino deigado,como precursoresinactivos
del intrón, y @ rotura adicionalautocatalítica
del intrón
llamadoszimógenos.La procarboxipeptidasa,
el tripsinógenoy el
paralaeliminaciónde 19nucleótidosmás.El intrón comquimiotripsinógenoson zimógenos.La activacióndel tripsinógeno
pletamenteprocesado
esuna ribozima,capazde acortaro
a tripsina requiere la eliminación de un segmentohexapeptídico
gar
gonucleótidos
pequeños.
alar
oli
por la enteroquinasa,
una enzimaduodenalde membrana.La
Sepodría argumentarque la moléculade rRNA de la
tripsina activaluego a otros zimógenos,por ruptura proteolítica.La
procarboxipeptidasa
esactivadaen una proteolisisúnica, mientras
Figura6.19 no satisface
la definiciónde catalizador,
que
que la activaciónde quimiotripsinógenoesun procesoalgo más
suponeque el propio cafalizadorno sedebealterardurancomplicado,en dos etapas,cuyosdetallesno semuestranaquí.
te el procesode reacción.Sin embargo,dosañosmástarde
sedescubrióotro catalizador
constituidopor RNA en el lade
Sydney
Altman
en
Ia UniversidaddeYale,que
boratorio
La primera evidenciallegó en 1981,cuandoThomas
La
supera
esta
restricción.
enzima,
llamadaribonucleasa
P,
Cechy suscolegasde la Universidadde Coloradodescu(pre-tRNAs)
rompe
precursores
de
RNA
de
transferencia
brieron una excepciónaparentea la regla(todaslasenzipara producir moléculasde RNA funcionales.(En este
mas son proteínas)).
Estabanestudiandoel a¡rster de un
segmentointerno de un precursorde un RNA específico caso,se eliminaun segmentoterminal de la moléculade
(pre-rRNA) in Tetrahymena
thermophila,un organismo RNA, en lugar de un intrón, como ocurríaen el procesamientodel pre-rRNA.)
eucariotaunicelular.(Como veremosen el Capítulo21,
Sesabíadesdehacíatiempo que la ribonucleasaP tenía
muchosde los RNAsde eucariotas
requierenque seelimiproteicoy otro de RNA,y sesuponíaqueel
un
componente
nen uno o mássegmentos
internosllamadosintrones,ansitio
activo
estaba
en el componenteproteico.Sin embargo,
tesde quelleguena serfuncionalesen Ia célula.El proceso
y
Altman
sus
colaboradores
demostraroninequívocamente,
de corteimplicala escisióndel intrón y la unión de lasdos
mediante
el
aislamiento
de
los componentesy su estudio
partesde la moléculaoriginalen el sitio de escisión.)
En el
que eI componenteproteicoaisladoeracompor separado,
cursode su trabajo,los investigadores
hicieronla observapletamenteinactivo,mientrasque el componenteribonución notable de que el procesoiaparentementeavanzaba
cleotídicosi eracapazde catalizarlarupturaespecífica
delos
sin la presenciade proteínas!Describiendosu intento de
precursoresdel IRNR y, además,no se alterabadurante el
estudiarla escisiónde intronesin vitro. Ceahescribió:
proceso.Además,la reaccióncatalizadamedianteRNA seguíala cinéticade Michaelis-Menten,
una evidenciamásde
pequeñas
Resultóquealgunasdelasmoléculas
que erael RNA quien estabaactuandocomo una auténtica
-principalmente ionesde magnesio
y variasformas
enzima.(El componenteproteicoaumentaIa actividadpero
no esnecesarioparala unión del sustratoo su ruptura.)
t
N. del Z: siguiendo la recomendación de Biólogos Moleculares hispanohaLa trascendencia
de estoshallazgos
sereconociócon el
blantes,traduciremos como ayusteeI término inglés splicing que hace refePremioNobel que Cechy Altman compartieronen 1989
rencia al procesamientode1RNA, consistenteen el corte y empalme de cierpor susdescubrimientos
de lasribozimas.A partir de estos
tos sectoresdel mismo. Segrin el DRAI, a)'uste es un término náutico que
refiere a la (costura o unión de dos caboso.
iniciales,sehan descritomásejemplosde
descubrimientos
t
QuimiotripsinÓoeno-P
(inactiva
t
r62
Quimiotripsina
(acriva)
Capítulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
5' r
UpCpUpApApApPre-rRNA
s,-
r
GPUPAPAP
o
upcpupoooooo\
GpupApAp- 3,
,.)fo
S'oGon0A0n01
g'rUpCpUor
3'
3'
Figura6.19 La autocatálisisy el ayuste del intÉn del Pre-rRNAde
Tetrahymena. La molécula precursora del RNA ribosomal (pre-rRNA)
de Tetrahymenacontiene un intrón que es capazde catalizarsu propia
escisión.La escisióny el a)'usteocurren en cuatro etapas.O Formación
de un bucle en la región intrónica de la molécula de pre-rRNA. @ El
bucle del intrón es atacadopor un grupo hidroxilo de un nucleótido de
guanina libre, pG, que funciona como cofactor.@ La molécula de prerRNA esrota en el extremo 5'terminal del segmentodel intrón, con Ia
adición de G al intrón. La uridina en el extremo 3' de otro fragmento de
rRNA atacaluego al extremo 3'del intrón, liberándolo y empalmando
las dos piezasde rRNA para formar el rRNA procesado.@ El intrón
sufre una subsiguienteruPtura autocatalítica,eliminando otros 19
nucleótidos en dos etapas,primero libera un segmentode 15
nucleótidos y luego otro de 4.
\6PUPAPAP-3'
5'PGPAPAPAP-Go"
eliminado
lntrÓn
3'
lo
t
l\
nucleótidos
N,u
t\
\
o nucleótidos
I
procesado
Intrón
esel ejemplode un paso
ribozimas.De especialrelevancia
en los ribosomas.Éstos
proteínas
de
la
sínlesis
en
esencial
como enzimasmuy grandes,que
puedenserconsiderados
peptldicos,añadiendo
iatalizanla formacióndelos enlaces
ctecíente(véase
polipeptídica
cadena
a
una
aminoácidos
ribosomal
subunidad
específicamente,la
4.8).
Más
Figura
que
peptidil
transferasa,
Ia
actividad
de
el
lugar
grandees
peptídico.
del
enlace
formación
catalizala
Durantemucho tiempo seha supuestoque el sitio activo de la peptidil transferasaestabalocalizadoen una de las
moléculasproteicasde la subunidadgrande.Sin embargo,
de la Universidadde SanHarry Noller y suscolaboradores
su
atenciónen una de las
centraron
ta Cruz en California,
a la demostración,
llevó
les
trabajo
moléculasderRNA. Este
de por
la
eliminación
pesar
de
que
a
publicadaen 1992,de
ribosomal
la
subunidad
proteína
de
io -.not el 95o/ode la
de
grandede una bacteria,el rRNA manteníaintactael 800/o
Además,la
la
subunidad.
de
la actividadpeptidil transferasa
por el tratamientocon ribonucleasa'
actividaddesaparecía
una enzimaque degradaRNA,pero no seafectabapor proteinasaK, una enzima que degradaproteínas(de hecho,
éstafue uno de los agentesusadospara eliminar lasproteínas de la subunidad).Así pues,quedó demostradoque la
de un pasocruresponsable
actividadpeptidil transferasa,
ribozima.
cial en la síntesisde proteínas,esuna
Aunque muchos biólogos se quedaron inicialmente
asombradospor el descubrimientode las ribozomas'no
hay razón para pensarque las moléculasde RNA no puedan ser capacesde funcionar como enzimas.Al igual que
las proteínas,las moléculasde RNA puedenadoptar una
estructuraterciariacompleja,que es la condiciónprevia
paralafunción catalizadoraen amboscasos.
El descubrimientode las ribozomasha cambiadoconla manerade pensarsobreel orilen de la
siderablemente
vida en la tierra. Durante muchosaños,los científicoshabían pensadoque las primeras macromoléculascatalizadorasdebíanhabersido polímerosde aminoácidos,semejantesa las proteínas.Sin embargo,estasuposiciónchoca
con la dificultad de que no hay una forma sencillade explicar cómo una protelnaprimitiva puedeportar información o replicarsepor sí misma,que son dos atributosvitales básicos.Sin embargo,si el primer catalizadorfuera
RNA en vez de moléculasproteicas,es conceptualmente
más fácil de asumir un sistemade moléculasde RNA que
actúesirviendo,tanto a la catálisis,como a la replicación,
pudiendo transferir la información a otras generaciones.
enzimática 163
de RNAconactividad
moléculas
Ribozimas:
Cerrando el círculo, volvemos al tema
planteadoen la introducción de estecapítulo -a saber,que la termodinámica
nos permite valorarla factibilidadde una
reacción,pero no dice nada sobrela probabilidadde que esareacciónocurra realmente en Ia célula,a una velocidadapreciable-. Serequiereun catalizador,
que
siempre es una enzima en los sistemas
biológicos,para asegurarque secumplen
los requerimientosde energía de activacíóny que sealcanzael estadode transición. Todaslas enzimasproteicasson
polímerosde aminoácidoscon una secuencia programada genéticamente,y
son sensiblesa la temperaturay el pH.
Thmbiénson exquisitamenteespecíficas,
paraun únicosustratoo paraun conjunto de compuestosestrechamente
relacionados.El procesocatalíticotiene lugar en
el sitio activo, un grupo crítico de aminoácidosresponsables
de la unión y la activación del sustratoy de la auténticareacciónquímica.La unión de un sustrato
apropiadoen el sitio de activo,induce un
acoplamientomás.eficazentre la enzima
y el sustrato,facilitando de esemodo Ia
activacióndel sustrato.
Las reaccionescatalizadasenzimátícamentetienenlugar a travésde un intermediario enzima-sustrato.Muchas
enzimassiguenIa cinéticade MichaelisMenten, caracterizadapor una relación
hiperbólicaentre la velocidadde reacción inicial v y la concentracióndel
sustratoIS].El límite superiorde la velocidad se denominaV^*, y Ia concentración de sustratonecesariapara alcanzar
la mitad de la velocidadmáxima,se expresa como la constantede Michaelis,
(. La relaciónhiperbólicaenrrey y [S]
se puede convertir en lineal, mediante
una ecuacióndoble recíproca,en la que
V-* I K- sepuedendeterminar gráficamente o analizaren un ordenador.
La actividad enzimátícaestáinfluida,
no sólopor la disponibilidaddel sustrato,
sinotambiénpor los productos,suStratos
alternativos,sustratosanálogos,drogasy
toxinas,muchasde las cualestienen un
efectoinhibidor. La inhibición puedeser
reversible
o irreversible,
implicandoestas
últimas la formación de unionescovalentesdel inhibidor a la superficiede la enzima. Por otra parte, un inhibidor reversible seune a la enzimade forma reversible.
ya seaen el sitio activo (inhibición competitiva) o en otro lugar de la superficie
de la enzima(inhibiciónno competitiva).
Las enzimasse pueden regular para
ajustarsusnivelesde actividada lasnecesidadesde la célula.La regulaciónpor el
sustratosebasaen los efectosque tienen
Ias concentraciones
del sustratoy de los
productos,en la velocidadde reacción.
Los mecanismosde control adicionales
incluyenla regulaciónalostéricay lasmodificacionescovalentes.
La mayoríade las
enzimasreguladasalostéricamente
catalizan el primer pasoen una secuencia
de
reaccionesy son proteínasmultiméricas
con variassubunidadescatalíticasy varias
subunidadesreguladoras.Cadauna de Ia
subunidadescatalíticastieneun sitio activo que reconocea los sustratosy a los
productos,mientras que cadasubunidad
reguladoratiene uno o más sitios alostéricos,que reconocena lasmoléculasefectoras específicas.
Un determinadoefector
puedeinhibir o activarla enzima,dependiendode cuálde lasformasde la enzima
estéfavorecidapor la unión del efector.
Las modificacionescovalentesmás comunessonla fosforilacióny la desfosforilación,como ocurre,por ejemploen la
glucógenofosforilasa,y la ruptura proteolítica,como ocurre en la activaciónde
los zimógenosde las enzimasproteolíticassecretadas
por el páncreas.
Aunque durante mucho tiempo se
pensóque todaslasenzimaseranproteínas,ahorareconocemos
las propiedades
catalizadorasde ciertas moléculas de
RNA llamadasribozimas.Éstasincluyen
algunasmoléculasde rRNA, que son capacesde catalizarIa eliminación de sus
propiosintrones,de eliminarlos componentesRNA de enzimasribonucleoproteicasy quizásinclusopartedel nNÁ de
ribosomasya ensamblados.
El descubrimiento de las ribozomasha cambiadoel
pensamientosobreel origen de la vida en
la tierra porque las moléculasde RNA, a
diferenciade lasproteínas,son capaces
de
replicarse
a sí mismas.
Problemas
Losproblemas
demayor
dificultad
están
marcados
conun ..
6,1 La necesidadde las enzimas.Nos encontramosahoraen
disposiciónde apreciarla diferenciaentrela factibilidad
termodinámicade una reaccióny la probabilidadde que
realmentevayaa tenerlugar.
(a) Muchasreaccionesque son posiblestermodinámicamente
no ocurrena una velocidadapreciable,debido a las
necesidades
energéticas
de los reactivospara superarel
estadode transición.¿Quésignificaestoen términos
moleculares?
(b) Una forma de cumplir esterequerimientoesmediante
aportaciónde calor,que en algunoscasos,sólo esprecisoal
inicio. Dé un ejemplo,y expliquelo que significaen
términos moleculares.
r64
Capítulo
6 Enzrmas:
loscatalizadores
delavjda
(c)
Una solución alternativa es reducir Ia energía de activación.
¿Qué significa en términos moleculares decir que un
cataLzador disminuye la energía de activación de una
reacción?
(d) Los químicos orgánicos usan a menudo en sus reacciones,
catalizadores inorgánicos tales como el níquel, el platino, o
ciertos cationes,mientras que las célulasusan proteínas
denominadas enzimas.¿Cuálesson las ventalasdel uso de
las enzimas?¿Ylas desventajas?
6,2 Energía de activación. Como se muestra en la Reacción
6.2, el peróxido de hidrógeno,H2O2, se descomponeen HrO y
Or. La energía de activación, E¡, para la reacción no cataljzadaa
20'C es de 18 kcal/mol. La reacción se puede catalizarpor iones
de hierro (E¡ : i3 kcal/mol) o por Ia enzima catalasa
(4:
7 kcal/mol).
(a) Dibuje un diagramade energíade activaciónpara esta
reacciónbajo condicionesde catalizacióny no catalización,
y expliquelo que significaque la energíade activaciónbaje
de 18a 13kcal/mol,cuandoseusanionesde hierroy de 18
a7 kcallmol en presenciade Ia catalasa.
(b) Sugieradospropiedadesde la catalasaque hagande ella un
catalizadorintracelularmás apropiadoque los ionesde
hierro.
(c) Sugierauna forma másde acelerarla tasade la
descomposicióndel peróxido de hidrógeno.¿Esésteun
medio apropiadode incrementarlasvelocidadesde
reaccióndentro de lascélulas?¿Porqué o por qué no?
(d) Recuerdedel Capítulo4 que Ia catalasapresenteen las
célulaseucariotasselocalizadentro de los peroxisomas,
junto con cualquierade lasdiversasenzimasgeneradoras
de HrOr. Debido a la toxicidaddel peróxido de hidrógeno,
expliqueen términosde cinéticaenzimáticapor qué es
de HrO, y Ia
ventajosotenera lasenzimasgeneradoras
catalasajuntas dentro de un mismo orgánulo.
La
6.3 Incremento de la velocidadmediantela cat¿íüsis.
descomposición
de HrO, en HrO y O, mostradaen la Reacción
por un catalizador
inorgánico(iones
6.2sepuedecatalizar,bien
por
Esta
reacción
tienelugar
bien
la
enzima
catalasa.
de hierro),
de ionesde hierro,
unas30.000vecesmásrápidaen presencia
veces
perohasta100.000.000
quecuandono haycatalizador,
de la catalasa,
una enzimaquecontiene
másrápidaen presencia
hierro. Contestea lassiguientespreguntas,asumiendoque I ¡.rg
descompone
una cantidaddadade HrO, en 1
de catalasa
sellevana caboen
minuto a 25 'C y quetodaslasreacciones
condiciones
estériles.
(a) ¿Cuántotiemposenecesitaría
paradescomponer
la misma
de una cantidadde ionesde
cantidadde HrO, en presencia
hierro equivalenteal contenidoen hierro de I ¡rg de
catalasa?
(b) ¿Cuántotardariaen descomponerse
la misma cantidadde
de un catalizador?
HrO, en ausencia
(c) Expliquecómo éstosilustrancálculosla necesidad
de los
y la superioridadde lasenzimassobrelos
catalizadores
inorgánicos.
catalizadores
6.4 Efectosde la temperaturay el pH. La Figura6.4 muestra
las actividadesde las enzimasen función de la temperaturay el
pH. En general,la actividadde una enzimaespecíficaesmásalta
del ambienteen
a la temperaturay el pH que son característicos
el cual funciona normalmente.
(a) Expliquelasformasde lascurvasde la Figura6.4 en basea
los factoresquímicoso ffsicosmásdeterminantesen la
actividadde la enzima.
(b) Paracadaenzimade la Figura6.4,sugieraIa ventaja
adaptativade tenerel perfil de actividadenzimática
mostradoen la figura.
(c) Algunasenzimastienenun perfil de pH plano,esdecir,
Ia misma actividadsobreun rango
tienen esencialmente
ampliode pH. ¿Cómopodríaexplicarestaobservación?
6,5 Cinética de Michaelis-Menten.La Figura6.20representa
Ia gráñcade Michaelis-Mentende una enzimatípica,con una
velocidadinicial de reacciónexpresadacomo una función de la
concentraciónde sustrato.En la curva seidentificantres
E
.o
.g
c
(s
'ó
!
a)
Concentración
de sustratofSl
6.20 Análisis
de la representación
de Michaelis-Menten.
Figura
6.5.
Veáse
el Problema
regiones,mediantelasletrasA, B y C. Paracadauna de las
afirmacionesque siguen,indique con una única letra cuál de las
3 regionesde la curvaseajustamejor a la afirmación.
(a) El sitio activode una moléculade enzimaestáocupadopor
el sustratoIa mayorparte del tiempo.
(b) El sitio activode una moléculade enzimaestálibre la
mayorpartedel tiempo.
(c) El rangode concentracióndel sustratoen el cual la mayoría
de lasenzimasfuncionan en lascélulasnormales.
(d) Incluya el punto (K^, V^u*12).
(e) La velocidadde la reacciónestálimitada,principalmente,
por el númerode moléculasde enzimapresentes.
(0 La velocidadde la reacciónestálimitada,principalmente,
por el númerode moléculasde sustratopresentes.
cafalizala
6.6 Cinética enzimática.La enzimaB-galactosidasa
hidrólisisdel disacáridolactosaen suscomDonentes
monosacáridos:
#
Lactosa+ H2O
-
Glucosaf Galactosa
(6.L7)
d-salactosidasa
parala lactosa,
ParadeterminarV^*y K- de Ia B-galactosidasa
seincubóla mismacantidadde enzima(1 ¡lg por tubo) con una
de lactosa,en condiciones
en lasque
seriede concentraciones
de productoerandespreciables.
La
lasconcentraciones
velocidadde la reaccióninicial sedeterminó para cada
concentraciónde lactosa,valorandola cantidadde este
disacáridoque permaneceal final del ensayo.Seobtuvieronlos
datos:
siguientes
Concentración
de lactosa
(mM)
Velocidad
del consumo
de lactosa
(¡rmollmin)
I
10,0
2
16,7
4
25,0
I
33,3
i6
40,0
)z
44,4
(a) ¿Por qué es necesario especificar que las concentraciones de
producto eran insignificantes durante el curso de la
reacción?
(b) Represente v (velocidad del consumo de lactosa) frente a
[S] (concentración de lactosa).¿Porqué cuando se doblala
Problemas 165
concentraciónde lactosa,el incrementode la velocidades
siempremenor que el doble?
(c) CalculeIlvy ll[S] para cadaentradaen la tabla de datosy
tracellv frentel/[S].
(d) DetermineK- y V-* a partir de Ia representación
doble recíproca.
(e) En la misma gráficade la parte b, representelos resultados
que esperaríasi cadatubo contuvierasólo 0,5 ¡.rgde
enzima.Expliqueel gráfico.
6.7 Más cinéticaenzimática.La galactosaformada en la
Reacción6.17sepuedefosforilar mediantela transferenciade
un grupo fosfatodesdeel AIfl reacciónque escatalizadapor la
enzimagalactoquinasa:
Galactosa* AIP ----------------+
Galactosa-l-fosfato* ADP (6.1S)
galacquinasa
Supongaque ha aisladola enzimagalactoquinasa
y ha
determinadosusparámetroscinéticos,variandola
concentraciónde galactosaen presenciade una concentración
de AIP constantey alta (esdecir,en saturación).La
representación
doble recíproca(Lineweaver-Burk)de los datos
semuestraen la Figura6.21.
Estareacciónes,como descubriremosen el Capítulo 8, básica
en el transportedel dióxido de carbonoen los glóbulosrojos,
desdelos tejidosdel cuerpoa los pulmones.La anhidrasa
carbónicatiene un pesomolecularde 30.000y un número de
recambio(valorft.",)de I X 106sec-r.SupongaqueseIe da
1 mL de una soluciónque contiene2,0 pgde anhidrasa
carbónicapura.
(a) ¿Aqué velocidad(milimoles de CO, consumidospor
segundo)tendrálugar estareacciónen condiciones
óptimas?
(b) Suponiendonormalesla temperaturay la presión,¿cuáles
el consumode CO, en mL por segundo?
6.9 Inhibidores devarias clases.Conteste,razonandoen cada
caso,cuálesde lassiguientesafirmacionesson verdaderas(V) o
falsas(F).
(a) El di-isopropil fluorofosfatoseune covalentemente
al
grupo hidroxilo del residuode un aminoácidoespecífico
de Ia enzimaproblema,siendo,por tanto, casicon toda
certeza,un efectoralostérico.
(b) La enzimahexoquinasaseinhibe por su propio producto,
la glucosa-6-fostato
y, por tanto,esun ejemplode
retroinhibición.
(a) ¿Cuálesla K. de la galactosidasa,
para la galactosa,
en estas
condicionesde experimentación?
¿Quénos dice la Kacercade la enzima?
(c) La glucógenosintasa,como la glucógenofosforilasa,es
activaen la forma fosforiladae inactivaen la forma
defosforilada.
(b) ¿Cuálesla V-o de la enzimaen estascondicionesde
experimentación?
¿Quénos dicela V-o acercade la
enzima?
(d) Esmuy probableque una enzimaque estásujetaa la
activaciónalostérica,catalicela primera reacciónde una
vía biosintética.
(c) Supongaque repite el experimento,pero variandoIa
concentraciónde ATP y manteniendoa la galactosaen
nivelesaltosy constantes.
Asumiendoque lasdemás
condiciones
semantienencomoantes,¿esperaría
obtenerla
misma V-o que en el apartadob? ¿Porqué o por qué no?
(e) Si los investigadores
sostienenque una enzimaesactivada
alostéricamente
por el compuestoA e inhibida
alostéricamente
por el compuestoB, una de estas
afirmacionesdebeestarequivocada.
(d) En el experimentodescritoen el apartadoc, el valor de K*
esmuy diferenteal del apartadob. ¿Puedeexplicarpor qué?
6.8 El número de recambio.La anhidrasacarbónicacatalíza
Ia hidrataciónreversibledel dióxido de carbonopara formar
ion bicarbonato:
CO2+ H2O;-
HCO; + H-
-'"
E
r1>
o2
10 20 30 40
(mM-1)
1/lgalactosa]
Figura6.21 Representación
doblereciproca
de la enzima
galactoquinasa.Veáse
el Problema6.7.
t66
La tioredoxinaesuna proteina reguladoracon dos grupos
sulfhidrilo (-SH) que sepuedenoxidar de manera
reversible,formando un enlacedisulfuro (-S-S-).
Probablementeafectea la actividadde una enzima
a la que seuna,reduciendolos puentesdisulfurode la
enzimaa grupossulfhidrilo,haciendoque la enzima
experimenteun cambio conformacionalque conduzcaa
su activación.
.6.10 Relevanciabiológica. Expliquela relevanciabiológica
de cadauna de lassiguientesobservaciones
relativaa la
regulaciónde enzimas.
(a) Cuandoustednecesitaun aportede energía,lashormonas
adrenalinay glucagónsesecretanhaciasu torrente
sanguíneoy sedirigen a suscélulasmusculares,donde
inician una cascadade reaccionesque conducena la
fosforilaciónde la forma inactiva (b) delaglucosa
fosforilasa,que pasaa Ia forma activa(a).
ñA
o
C
(6.1e)
(0
Capitulo
6 Enzimas:
loscatalizadores
delavida
(b) Incluso en la forma a, la glucosafosforilasade lascélulas
musculares,seinhibe alostéricamente
por glucosao AIP,
en concentraciones
elevadas.
(c) Su páncreassintetizay secretaIa enzimaproteolítica
carboxipeptidasa
en forma de precursorinactivo,llamado
procarboxipeptidasa,
que seactivacomo resultadode la
proteolisis,mediantetripsina,en el duodeno.
.6.11 Consecuencias
de la ecuaciónde Michaelis-Menten.
ParaIa reaccióncatalizadaporla enzimaen la cual el sustratoS
6.5),la velocidad
seconvierteen un producto P (véaseReacción
o la aparición
del
sustrato
la
puede
como
desaparición
definir
se
del producto por unidad de tiempo:
dtst
dlPl
y:----:---:-:+--elt
rlt
(6.20)
Partiendode estadefinicióny restringiéndonosa Ia etapainicial
de reacción,cuando [P] esprácticamentecero,derivela
(véaselaEcuación6.7).Los
ecuaciónde Michaelis-Menten
pueden
en su derivación:
ayudarle
siguientesapartados
(a) ComienceexpresandoIa ecuaciónde la velocidadpara
dlS)ldt, dlp)ldt,y dlBS)ldter términos de concentraciones
y velocidadesconstantes.
(b) Supongaun estadoestacionarioen el cual el complejo
a la misma
de la Reacción6.6desaparece
enzima-sustrato
velocidada la que seforma, de forma que Ia tasanetadel
cambio,d[ES]ldt, escero.
(c) Desecuentade que la cantidadtotal de la enzimapresente,
E, esla sumade la enzimalibre E¡másla queestáen el
complejoenzimaES:E : Er + ES.
(d) En su debido momento, se dará cuenta de que la V-* y la
K- se pueden definir como sigue:
v-*:
kr[E]
*^:
h* ot
k1
(6.2t)
.6.1Íl La ecuaciónde Michaelis-Mentenen forma lineal.
de Lineweaver-Burk(Figura6.10)'
Ademásde la representación
a vecesseempleanotrasdos formaslinealesde la ecuaciónde
Michaelis-Menten.La representaciónde Eadie-Hofsteeesuna
gráficade v/ [ S] frentea v (véaseFigura6.I I ), y la representación
de Hanes-Woolfenfrentaa [S]/vya [S].
(a) Demuestre,en amboscasos,que la ecuaciónque se
representagráficamentesepuedeobtenera partir Ia
ecuaciónde Michaelis-Menten,con una simple
manipulaciónaritmética.
(b) En amboscasos,indique cómo sepuedendeterminarK- y
V-o desdeel gráficoresultante.
de Hanes-Woolf,señalandolos
(c) Hagauna representación
puntos de interseccióny la pendientecomo en las
de Lineweaver-Burky de Eadie-Hofstee
representaciones
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6.10y 6.11).¿Puede
Hanes-Woolfesla mássatisfactoria,desde
representación
de lastres?
el punto de vista estadístico,
Bibliografía recomendada
con'
histórica
estánmarcadas
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