Download PROYECTO DE TESIS: “Polimorfismo gené

Universidad Peruana
Cayetano Heredia
I CURSO
“BIOSEGURIDAD Y BIOTECNOLOGIA MODERNA”
La Molina-Lima, 06 – 10 de diciembre de 2010
“Biotecnología moderna aplicada a la sanidad animal”
Dr. Jose R. Espinoza
Profesor Principal
Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Farmacología
El costo de las enfermedades infecciosas
•
Las enfermedades infecciosas son una carga pesada para la
economía ganadera mundial
•
Acuerdo de Medidas Sanitarias y fitosanitarias impone
restricciones a la comercialización de productos y subproductos
pecuarios en países afectados por enfermedades infecciosas
•
No solo perdia en la productividad sino perdida por falta de
mercados
Sanidad Animal y Biotecnología Moderna
1.
La sanidad animal se refiere al estatus saludable de las crianzas
en la medida que se tomen medidas preventivas para evitar la
infección, detección rápida de la infección y el tratamiento
adecuado
2.
Las enfermedades infecciosas son una carga pesada para la
economía ganadera mundial
3.
Factor Hospedero: identificar genes asociados a características
mendelianas y cuantitativas que contribuyan a la resistencia a
las infecciones. Mediante la aplicación de selección asistida por
marcadores de ADN contar con hatos saludables.
4.
Factor Patogeno: La Biotecnología moderna puede a reducir
las perdidas por las infecciones en el ganado y las aves
mediante la mejora en los métodos de detección y diagnostico,
nuevos agentes terapéuticos, vacunas y nuevas drogas.
EL HOSPEDERO
Genética molecular de la enfermedad
infecciosa
Actualmente hay evidencia que la variabilidad individual
en la susceptibilidad a infecciones es en parte
determinada por los genes del paciente.

Lo cual es sugerido por estudios en modelos animales,
estudios de asociación, ligamiento y gemelos.

Población humana hay factores de riesgo: inmunocompetencia (HIV), desnutrición, alcoholismo, diabetes y
otros.
Muy pocos estudios en animales domesticos

Genética molecular de la enfermedad
infecciosa

Los estudios iniciales en ratón se identifico un gen
dominante designado locus Bcg/Ity/leish.

El gen candidato fue clonado por genética
reversa y se designo como natural-resistanceassociated-macrophage protein 1 gene (Nramp1).

Actualmente se le denomina SLC11A1 familia de
transportadores de soluto 11A1
Genética molecular de la enfermedad
infecciosa en humanos
El gen candidato: Slc11a1
Este
gen codifica para una proteína integral de
membrana expresada por los fagocitos.
La
proteína se localiza en el compartimiento
endosomal tardio/lisosoma
Reclutado
en la membrana de los fagosomas en
fagocitosis. (Slc11a1, Solute carrier family 11
member a1 )
Funcion de SLC11A1 en el macrofago
Funcion de SLC11A1 en el macrofago
Figure a:
Macrophage
Slc11a1 +/+
Figure b:
Macrophage
Slc11a1 -/-
Polimorfismos y variantes de secuencia de SLC11A1
El homologo humano del gen denotado como SLC11A1 y
está localizado en el cromosoma 2q35, consiste de15
exones.
Se han descrito variantes polimórficas del gen en las
regiones codantes (exones) como no codantes (intrones).
Asociación significativa de SLC11A1 y TB se ha reportado
en africanos, asiáticos y peruanos por análisis de
asociación y en canadienses, brasileños por análisis de
ligamiento.
Expresión in vitro de SLC11A1 en macrófagos
Alelo 3
Protección contra enfermedades infecciosas crónicas y
susceptibilidad a enfermedades autoinmunes
Alelo 2
Susceptibilidad a enfermedades infecciosas crónicas y
protección contra enfermedades inmunes
En Sudán, la susceptibilidad de LV se asocia con el alelo 3.
Leishmaniasis visceral asociada con altos niveles de respuesta proinflamatoria (TNFa) y caquexia.
Balance de fuerzas de los alelos funcionales del promotor SLC11A1
Asociado con infecciones crónicas y baja actividad
del macrófago
Asociado con enfermedades autoinmunes e infecciones
agudas con patología proinflamatoria
Protege contra enfermedades autoinmunes de
infecciones agudas con patología proinflamatoria
Protege contra infecciones crónicas que requieren alta
actividad del macrófago
Modificado de Blackwell
et al., 2003
Asociación de Genes e Infecciones, TB
Asociación de SLC11A1 y TB
D543N
TBC
Pulmonary TB
G/G
336
G/A
157
A/A
14
Pleural TB
G/G
52
G/A
26
A/A
00
Extrapulmonary TB
G/G
05
G/A
02
A/A
02
All cases TB
G/G
405
G/A
191
A/A
17
Cont (513)
OR (95% CI)
2
p
372
124
17
1
1.40 (1.0 – 1.8)
0.91 (0.4 – 1.9)
5.9
0.05
372
124
17
1
1.50 (0.8 – 2.5)
0.00 (0.0 – 2.1)
5.15
0.08
372
124
17
1
1.20 (0.1 – 7.0)
8.75 (1.08 – 57.06)
6
0.05
372
124
17
1
1.41 (1.0 – 1.8)
0.92 (0.4 – 1.9)
6.83
0.03
* Taype et al., (2006) Association between SLC11A1 polymorphisms and susceptibility to different clinical forms
of Tb in the Peruvian popullation. Infection, Genetics and Evolution 6:361-367.
Genética molecular de la enfermedad
infecciosa
Conclusiones
1.
En la población humana la suceptibilidad a TB y leishmaniasis se
sugiere bajo la acción de un gen mayor (?) localizado en la región
genómicas asociada el locus 2q35 (que contiene SLC11A1 e
IL8Ra)
2.
La acción de SLC11A1 en la susceptibilidad a TB puede estar
modulada por la acción de otros genes (IFNγ)
EL PATOGENO
FASCIOLOSIS EN EL PERU
Genómica estructural y funcional
búsqueda de nuevos
blancos de intervención
En la era post-genomica…
Taken from Fairlamb (2002)
Genomica de parasitos helmintos

Importancia
Helmintos causan infecciones cronicas,
Altamente prevalentes a nivel global
Modelos biologicos de desarrollo

Dificultades
 Poseen genomas grandes (108 bp/102 Mb)
 Las especies relevantes son diversas
Proyectos de EST projects – Secuenciamiento Sistematico de cDNAs
cogidos al azar de librerias de diferentes estadios del ciclo de vida

Estrategia
• Nematodes
• Trematodes
• Cestodes
Relevancia en el Desarrollo
dos hospederos, varios estadios
Ciclo de vida en el lab
Modelos de Invasion
Experimental
Mamífero
Huésped definitivo
Metacercarias
Huevos
Cercarias
Miracicios
Limnea
Huésped intermediario
Sanidad y Relevancia en la productividad
Helmintos causan infecciones cronicas
Prevalencia muy alta a nivel mundial
Importancia Economica y Sanitaria
Asociada a Morbilidad y mortalidad
Deteccion y diagnostico
•
Pruebas poco sensibles y poco especificas
•
Caras
Quimioterapia
• Drogas Efectivas pero caras
• Altas tasas de reinfeccion
• Emergencia de resistencia a las drogas
• Tratamiento no evita los daños
Vacunas
• Selección de blancos relevantes
Bibliotecas: i) Genomicas ii) cDNA
Genomic libraries
Gene structure
Regulation
cDNA libraries
cDNA intron-less
from: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)
Frequency related to
Transcription level
Análisis del Transcriptoma de Fasciola hepatica
Desenquistamiento in vitro de la metacercaria
1) 5 min NaClO 1%
Metacercariae
2) NaHCO3 1% NaCl 0,8% pH
7.3, cysteine 33mM,
sodium taurocholate
NEJ n=1000
RNAtotal
(kit Invitrogen Micro-Midi RNA)
Construccion de biblioteca de cDNA
AAAAA
TTTTT
cDNA
>2000 bp
800-2000 bp
CAP
PCR
400-800 bp
Size fractionation
96-well plates
Bacterial
Stocks
Plate
TA cloning vector
Control del tamaño del inserto por PCR de colonias
1000500300-
NEJ Library
Fragments 400-800 bp
100-
PCR Mix
clones
300020001650-
NEJ Library
Fragments 800-2000 pb
1000850-
>70% clones with expected size fragments
Plasmid DNA
sequenciation
Analisis de las Secuencias de cDNA
Staden Package
Reads
Quality
Vector
Phred
Pregap
Good Reads
Consed
CAP3
Assembly
Phred
Cross match
Consensus
tBlastX
GenBank
Non Redundant
Anotation
KOG
Functional
categories
SignalP
Signal
peptide
TMHMM
Transmembrane
domain
Consensus
(Contigs)
CAP3
ESTs comparados de Adultos y Juveniles

10413 Adult ESTs sequenced at the Sanger Center were retrieved and clusterized
locally in 3646 different clusters.
Some sequences
show similarities
only with adult
Fasciola sequences,
not being present
in any other
available database.
unique hits
(Fasciola
specific?); 54
no hits; 282
hits shared
w/other
databases;
181
Functional categories
cDNA Library GRN 400-800 bp
A: RNA processing and modification
B: chromatin structure and dynamics
C: energy production and conversion
D: cell cycle control and mitosis
G: carbohydrate metabolism and transport
L: replication and repair
T: signal transduction
U: intracellular trafficking and secretion
Z: cytoskeleton
R: general functional
S and no relat: function unknow
cDNA Library GRN 800-2000 bp
GO function asignation
The 10 most abundant contigs from
NEJ library 400-800 bp
SignalP v3.0
TMHMM v2.0s
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
The 10 most abundant contigs from
NEJ library 800-2000 pb
SignalP v3.0
TMHMM v2.0s
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
Conclusiones y perspectivas
Analisis de las secuencias revelan una buena representacion en ambas bibliotecas
Un numero alto de proteinas hiopoteticas con sin funcion conocida se han hallado en
ambas bibliotecas (Parasito-especificas?)
Herrameintas de genomica funcional como interefrencia por ARN son utiles para
determibnar la funcion y relevancia en el parasito
Developments in Techology
Massively parallel Technologies
454
SOLID
SOLEXA
454 sequencing
Clonal amplification on beads
Pico titre plate (1.6 M wells)
Sequencing-by-synthesis
Chemiluminescent detection
No cloning required
Increased performance
20,000,000 bp per run (4.5 hours)
2 Mb genome, 10x coverage
Current performance (ABI 3730)
250,000 bp per run
GENOMICA FUNCIONAL DEL PATOGENO
Silenciamiento Genético Mediado por ARN
El ARNds y los nemátodos
(Fire et al., Nature 391: 806-811, 1998)
El ARNds produce la eliminación del ARNm
blanco
RNAi como herramienta de
genómica funcional

Generación del ARNds

Disponibilidad del ARNds

Determinar la eficiencia

Detección del efecto

Correlacionar la eficiencia de
silenciamiento con efecto
Métodos de introducción del RNAi

Microinyección

Soaking

Feeding

Transfección
(electroporación)
Distintos tipos de
interferencia
QPCR
QPCR on worms treated with different RNAi
Problema
Síntesis
Blancos
Estadio
Delivery
Duracion
Detección
Eficiencia
Cascada digestiva
Tr. in vitro fragmentos clonados
SMCB1, SMCL1, SMCD, SmAE
Schistosomulas de 3 semanas
Soaking (1ug/ul)
6 semanas
Bioquimica (sust. Sinteticos y naturales),
qPCR
ND
CatL & CatB
CatB
CatD
Legumain
FR-AMC
RR-AMC
AMC-GKPILFFRLK-Dnp-R
AAN-AMC
Objetivo de Genomica Funcional
de Fasciola hepatica

Comprender los mecanismos de interacción huésped parásito detectando mediadores
moleculares claves, que puedan ser blancos potenciales para la generación de drogas
antiparasitarias y/o el desarrollo de vacunas.

Modelo de estudio: Platelminto trematode, Fasciola hepatica
Blancos??
Cisteína proteasas en F. hepatica
Adulto
 Altamente expresadas (10% EST)
• Constituyen familias multigénicas
 80% de las proteínas secretadas
 Catepsinas L1, L2 predominantes
 Se localizan en la gastrodermis
Juveniles (JDR)
• Predominantes en los extractos somáticos
Posibles roles en la interfase:
•Nutrición.
• Catepsina L3 es inmunodominante
•Invasión.
• Catepsina B presente en E/S
•Evasión de la respuesta inmune.
•Catepsins B y L entre los EST mas abundantes
•Autorregulación; propéptido.
Objetivos
(RNAi como herramienta de Genómica Funcional)

Ajustar las condiciones para emplear iRNA como herramienta de genética
reversa en Fasciola hepatica , aguardando en primer lugar, demostrar la
interferencia a nivel molecular (RT PCR, Western blot, actividad enzimática).

Se espera poder generar fenotipos visibles y cuantificables debidos a la
interferencia de las catepsinas.

Ensayos biológicos (ej. de invasión, infección experimental, etc)
Estrategia de Trabajo
Generación de moldes transcripcionales
1
Generacion de ARN
doble cadena (ARNds)
Moldes por PCR
Clonado de fragmentos
Transcripcion in vitro
Transcripcion in vivo
Evaluación y cuantificación del ARNds
2
ADULTOS
Ensayos de
incorporación
(delivery) del ARNds
3
Detección de la
interferencia
Microinyección
Feeding
TRANSCRIPCIONAL
RT-PCR
JUVENILES
Soaking
PROTEICO
Hibidacion in toto
WesternBlot
Electroporación
ENZIMATICO
Actividad
Inmunolocalización
Zimogramas
Generación del dsRNA.
Generación de dsRNA de catepsinaL:
-por Tiv a partir de molde generado por PCR(primers catL esp.+promotorT7)
-por Tiv a partir de clones en plásmidos linearizados
Tiv a partir de molde generado por PCR. (primers catL esp.+promotorT7)
MP
1: ARN doble cadena
2: ARN simple hebra sentido
3, 4 y 5: Productos de la hibridación de ARN sentido y antisentido a 75°, 80° y 85°,
respectivamente
1
2
3
4
5
Desenquiste y cultivo



Desenquiste in vitro de formas juveniles
Soaking
Cultivo a largo plazo
Figura 1
Figura 2
A
B
C
D
A
B
C
D
Detección de la interferencia
3 condiciones s/RNAds, RNAds CL2, RNAds MalE (1 ug/ul)
1.
FENOTIPO
Movilidad reducida en tratados
2. TRANSCRIPTOS
RT-PCR sobre parásitos cultivados
327pb
1
1
2
2
202pb
CL2 GAPDH
405pb
3
3
4
4
Detección de la interferencia : Western blot
dsCl2
Ctol
24hs 48hs 24hs 48hs
dsCL2
Ctol
24hs 48hs 24hs 48hs
Inhibición de penetración



30 NEJs tratados colocados en asas intestinales ligadas
Incubados 2 hs. 37°
Conteo de gusanos que penetran
Incorporación del ARNm LUC en F.hepatica
A Actividad LUC a distintos tiempos post.electroporación
B NEJ tratado a distinto tiempo post-desenquiste
Los acidos nucleicos electroporados se localizan
predominantemente en los ciegos intestinales
La localizacion de siRNA es similar a
la del mRNA transfectado
Vía de RNAi activa en F.hepatica

Interferencia de un gen exógeno (LUC)
Diseño experimental
Excystement
mLuc
2 days
3hs
dsMalE
1 day
mLuc
1 days
dsLuc
1 day
Harvest
3hs
mLuc
1 days
3hs
RT-PCR semicuantitativo (500 ng ARN
total, 1/1, 1/10, 1/100)
Interferencia de un gen endógeno
Diseño experimental
Electroporación ARNdc FhLAP o ARNdc LUC
[300ng/µl] 100µl de RPMI. en juveniles
Cultivo por 48hs
Detección:
Fenotipos ( negativo)
RT-PCR semicuantitativo (500 ng ARN total, 1/1,
1/10, 1/100)
A
B
Inhibicion de la
eclosion mediada
por RNAi
C
A)
B)
dsRNA LAP
D
Inhibicion de eclosion de miracidios
F
E
Similar a bestatina
120
Eliminacion de mRNA especifica
100
dsRNA treatment:
80
Sm_LAP1
60
Sm_LAP2
40
20
Sm_ACTIN
0
Parasite mRNA:
1
2
3
4
5
6
dsLAP1
dsLAP2
dsLAP1_2
dsLUC
Control
CONCLUSIONES
La Biotecnología moderna haciendo uso de las
tecnologías de alta procesividad generara agentes
terapéuticos y drogas sobre la base de la aproximación
de genómica funcional de organismos patogenos
Generara marcadores geneticos que contribuyen a un
mayor resistencia a las infecciones que pueden ser
utilizados en programas de selección asistida por
marcadores genómicos