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Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en
enfermedad de Alzheimer orientado hacia neuronas piramidales
corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Hernán Guillermo Hernández Hincapié
Universidad Nacional de Colombia
Programa de Doctorado en Ciencias Bio médicas
-
Facultad de Medicina
Bogotá, Colombia
Noviembre, 2015
Estudio de patrones genómicos de Metilación de ADN en
enfermedad de Alzheimer orientado hacia neuronas piramidales
corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Hernán Guillermo Hernández Hincapié
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Doctor en Ciencias Bio médicas
-
Director: Humberto Arboleda
Profesor Universidad Nacional de Colombia
Grupo de Investigación:
Grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Programa de Doctorado en Ciencias Bio médicas
-
Bogotá, Colombia
Noviembre, 2015
Este trabajo está dedicado a la gloria de Dios:
Padre, Hijo y Espíritu Santo, porque Dios lo hizo posible
y Dios es el único que debe recibir
toda la gloria, toda la honra y todo el reconocimiento.
I
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar a Dios, por darme la oportunidad de seguir creciendo como persona, como
investigador y ser mi guía en los momentos más difíciles y por hacer posible la realización
de lo descrito en el presente trabajo.
De forma notable a mi director de tesis, Humberto Arboleda Granados por su orientación,
apoyo en todo momento y por ser un gran ejemplo de disciplina. También, a los profesores
Juan Yunis y Diego Forero de mi comité tutorial por sus importantes asesorías y ayuda. A
Colciencias y al ICETEX por otorgarme el crédito condonable que financió parte de mis
estudios doctorales. A mis suegros Jorge Carreño y Jeaneth Porras, y a mi hermana
Mónica Hernández y su esposo Enrique Sarmiento, que confiaron en mí y fueron mis
fiadores en el crédito condonable, otorgado por Colciencias y el ICETEX. A la Dirección de
Investigación sede Bogotá de la Universidad Nacional de Colombia y al Doctorado en
Ciencias Bio médicas, que apoyaron algunos pasos de la realización de este proyecto.
A las personas del Grupo de investigación de Neurociencias del Instituto de Genética de la
Universidad Nacional de Colombia; asimismo, al Grupo de investigación en Epigenética del
Instituto Universitario de Oncología de la Universidad de Oviedo y al Grupo de investigación
en Parkinson y Enfermedades Neurodegenerativas de la Universidad de Santiago de
Compostela. Por acogerme en sus instalaciones, por su supervisión y por el apoyo que me
dieron en la realización del presente trabajo. También al Departamento de Anatomía
Patológica del Hospital Universitario de la Universidad de Santiago de Compostela y al
Departamento de Anatomía Patológica del Biobanco Navarra Biomed en Navarra, y a su
personal médico especializado con quienes pude realizar las verificaciones histológicas
correspondientes. A todos y cada uno de los que me apoyaron en estos lugares les estoy
enormemente agradecido.
También le doy gracias a mi esposa Carolina, porque este trabajo es fruto de un
emprendimiento conjunto que nos tocó vivir a distancia y cualquier recompensa por este
trabajo pertenece a ella en la misma medida que a mí. A mi hijo Nicolás y a mi hija Elizabeth
que está por nacer, por ser mi fuente más importante de inspiración y a mis padres Nelly y
Hernán, por todo su apoyo para poder realizar mis estudios.
I
1 CONTENIDO
Pág.
CONTENIDO ...................................................................................................................... I
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................ IV
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... VI
LISTA DE ANEXOS ....................................................................................................... VII
DEFINICIÓN DE CONCEPTOS ...................................................................................... IX
ABREVIATURAS Y CONVENCIONES ............................................................................ X
RESUMEN ………………………………………………………………………….. ………...XIII
ABSTRACT ................................................................................................................. XIV
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ................................................................................ XV
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................... 1
OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 3
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 4
MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 6
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER ............................................................................ 6
ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES DE LA ENFERMEDAD DE
ALZHEIMER .......................................................................................................... 6
NEURONAS PIRAMIDALES EN ENFERMEDAD DE ALZHEIMER ....................... 8
VÍAS E HIPÓTESIS EN ENFERMEDAD DE ALZHEIMER ..................................... 8
GENÓMICA, EPIGENÓMICA Y ENFERMEDAD DE ALZHEIMER ........................ 12
CONCEPTOS DE GENÓMICA Y EPIGENÓMICA ............................................... 12
EL ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE EXPERIMENTOS A LO LARGO DEL
GENOMA ............................................................................................................ 13
CONCEPTOS DE LA EPIGÉNETICA Y DE LA METILACIÓN DEL ADN ............. 17
ISLAS CPG, ORILLAS Y REGIONES PROMOTORAS. ....................................... 18
MANTENIMIENTO E INSTAURACIÓN DE LA METILACIÓN DE ADN ................ 19
MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA METILACIÓN DE ADN ...................... 20
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA METILACIÓN DE ADN A NIVEL GENÓMICO EPIGENÓMICA COMPUTACIONAL ..................................................................... 22
METILACIÓN DE ADN, EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, SU PAPEL EN
LA MEMORIA Y EN LA NEURODEGENERACIÓN ............................................... 25
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL (CAPAS
DE NEURONAS PIRAMIDALES) ................................................................................... 31
1.1
MÉTODOS.................................................................................................. 31
1.1.1
MUESTRAS............................................................................................ 31
1.1.2
MICRODISECCIÓN LÁSER Y EXTRACCIÓN DE ADN ......................... 33
1.1.3
CONTROLES DE CALIDAD, PREPARACIÓN Y PROTOCOLO INFINIUM
DNA METHYLATION 450K .................................................................................. 36
1.1.4
ANÁLISIS DE METILACIÓN EN POSICIONES GENÓMICAS................ 37
1.1.5
MÉTODO
DE
ASIGNACIÓN
DE
GENES
A
SONDAS
DIFERENCIALMENTE METILADAS .................................................................... 39
1.1.6
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO FUNCIONAL Y ENRIQUECIMIENTO
FUNCIONAL DE GENES ..................................................................................... 40
1.1.7
ANÁLISIS DE METILACIÓN REGIONES GENÓMICAS (DMR) ............. 42
II
Estudio de patrones de Metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia neuronas
piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica: epigenoma humano
1.1.8
ANÁLISIS DE INTERSECCIONES Y SUPERPOSICIONES .................. 43
1.2
RESULTADOS CAPÍTULO 1 ..................................................................... 45
1.2.1
RESULTADOS GENERALES DMP (TODOS LOS SUJETOS) .............. 45
1.2.2
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS GENERALES .......................... 48
1.2.3
CORRESPONDENCIA
CON
GENES
Y
ENRIQUECIMIENTO
FUNCIONAL DE GENES /AGRUPAMIENTO FUNCIONAL ................................. 49
1.2.4
RESULTADOS DMP EN SUBCONJUNTO HOMBRES.......................... 57
1.2.5
INTERSECCIÓN DE RESULTADOS EN LOS ANÁLISIS DMP .............. 60
1.2.6
RESULTADOS
REGIONES
DIFERENCIALMENTE
METILADAS
(DMR) ............................................................................................................... 65
1.2.7
RESULTADOS SUPERPOSICIÓN DE RANGOS .................................. 68
1.2.8
REVALIDACIONES DE DMP CON DMR Y PRIORIZACIÓN.................. 70
1.3
DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO 1 ................................................................. 72
1.3.1
DISCUSIÓN DE ASPECTOS METODOLÓGICOS................................. 72
1.3.2
DISCUSIÓN DE RESULTADOS GLOBALES DE METILACIÓN DE ADN
EN CEREBROS .................................................................................................. 74
1.3.3
DISCUSIÓN DE HALLAZGOS DE ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL .. 75
1.3.4
DISCUSIÓN ANÁLISIS REGIONALES E INTERSECCIONES ............... 78
1.3.5
DISCUSIÓN DE RESULTADOS MÁS DESTACADOS........................... 80
CAPÍTULO 2: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA CON DATOS DE EXPRESIÓN GÉNICA
NEURONAL ................................................................................................................... 87
2.1
MÉTODOS ................................................................................................. 87
2.1.1
MUESTRAS ........................................................................................... 87
2.1.2
ANÁLISIS Y BASES DE DATOS ............................................................ 88
2.2
RESULTADOS CAPÍTULO 2 ..................................................................... 89
2.3
DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO 2 ................................................................. 92
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE SANGRE
PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN INFINIUM DNA
METHYLATION 450K..................................................................................................... 95
3.1
MÉTODOS ................................................................................................. 95
3.1.1
SELECCIÓN DE MUESTRAS ................................................................ 95
3.1.2
CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS............................................ 95
3.1.3
PROCESAMIENTO Y NORMALIZACIÓN DE DATOS ........................... 96
3.1.4
ANÁLISIS DE DMP EN SANGRE PERIFÉRICA .................................... 97
3.1.5
ANÁLISIS DE DMR EN SANGRE PERIFÉRICA .................................... 97
3.1.6
ANÁLISIS DE CONVALIDACIÓN CRUZADA DMP CON DMR .............. 98
SELECCIÓN FINAL DE DMR/DMP ........................................................ 98
3.1.7
3.1.8
ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL ................................. 98
3.2
RESULTADOS CAPITULO 3 .................................................................... 99
3.2.1
RESULTADOS DMP .............................................................................. 99
3.2.2
RESULTADOS DMR .............................................................................. 99
3.2.3
COINCIDENCIA ENTRE DMR y DMP .................................................. 101
3.2.4
RESULTADOS DE AGRUPAMIENTO FUNCIONAL ............................ 102
3.3
DISCUSIÓN DEL CAPITULO 3 ............................................................... 104
3.3.1
DISCUSIÓN DE RESULTADOS GLOBALES ....................................... 104
3.3.2
LOCI DIFERENCIALMENTE HIPERMETILADOS ................................ 104
3.3.3
LOCI DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS .................................. 108
3.3.4
DISCUSIÓN DE RESULTADOS MÁS DESTACADOS......................... 109
CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA ENTRE RESULTADOS DE CEREBRO
Y SANGRE PERIFÉRICA ............................................................................................. 112
Contenido
III
4.1
MÉTODOS................................................................................................ 112
4.1.1
DATOS USADOS PARA LA BÚSQUEDA DE CONCORDANCIA ......... 112
4.1.2
BÚSQUEDA DE CONCORDANCIAS ................................................... 113
4.2
RESULTADOS Y DISCUSIÓN CAPÍTULO 4 ........................................... 114
4.2.1
HALLAZGO EN MBP ............................................................................ 114
4.2.2
OTROS RESULTADOS ........................................................................ 115
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN GENES
ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA .................................... 117
5.1
INTRODUCCIÓN ...................................................................................... 117
5.2
MÉTODOS DE PCR PARA METILACIÓN DE ADN EN SANGRE ........... 120
5.2.1
REGIONES ESTUDIADAS ................................................................... 120
5.2.2
MUESTRAS.......................................................................................... 121
5.2.3
EXTRACCIÓN DE ADN Y «CONVERSIÓN» POR BISULFITO DE
SODIO 122
5.2.4
DISEÑO DE PRIMERS ......................................................................... 122
5.2.5
CONTROLES DE ADN METILADO Y NO METILADO ......................... 123
5.2.6
DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE DE METILACIÓN POR MSHRM 124
DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE METILACIÓN POR ANÁLISIS
5.2.7
DE SECUENCIAS .............................................................................................. 124
5.2.8
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..................................................................... 125
5.3
RESULTADOS ......................................................................................... 127
1.1 RESULTADOS MS-HRM ............................................................................ 127
1.2 RESULTADOS BSP .................................................................................... 128
5.4
DISCUSIÓN DE CAPITULO 5 .................................................................. 132
5.4.1
HIPOMETILACIÓN DIFERENCIAL EN LA ISLA CpG DE APOE .......... 132
5.4.2
OTROS HALLAZGOS Y APORTES ..................................................... 135
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL ......................................................................... 137
6.1
HALLAZGOS GENERALES..................................................................... 137
6.2
HALLAZGOS DE GENES DIFERENCIALMENTE METILADOS EN EA EN
CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES CORTICALES .................................... 138
6.3
GENES DIFERENCIALMENTE HIPERMETILADOS EN CEREBROS
HUMANOS CON EA ............................................................................................ 139
6.4
HALLAZGO EN REGIÓN DE MBP EN CEREBROS ............................... 141
6.5
GENES DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS EN CEREBROS
HUMANOS CON EA ............................................................................................ 141
CONCORDANCIA CON LOS ESTUDIOS PREVIOS ............................... 142
6.6
6.7
METILACIÓN DIFERENCIAL EN LEUCOCITOS ..................................... 142
6.8
MBP PRESENTÓ IGUALES PATRONES DE METILACIÓN EN EA, EN
SANGRE Y EN CEREBROS ............................................................................... 144
6.9
APLICABILIDAD ...................................................................................... 144
LIMITACIONES............................................................................................................. 148
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 151
RECOMENDACIONES ................................................................................................. 154
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 155
CONSIDERACIONES ÉTICAS ..................................................................................... 179
ANEXOS
................................................................................................................. 180
ANEXOS DIGITALES ................................................................................................... 275
IV
2 LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Características generales de las muestras cerebrales estudiadas, conjunto total de sujetos ............ 31
Tabla 2. Características generales de muestras cerebrales estudiadas, subconjunto de hombres. ............... 32
Tabla 3. Primeras 25 sondas diferencialmente hipermetiladas en EA en capas de neuronas piramidales
identificadas para la totalidad de la muestra de sujetos ordenadas por sinificancia. ....................................... 49
Tabla 4. Ontologías relacionadas con componente subcelular del análisis de genes diferencialmente
hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad de la muestra.......... 52
Tabla 5. Ontologías relacionadas con función molecular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados
en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad de la muestra de sujetos. ............... 54
Tabla 6. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes
diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, resultados para toda la muestra.
......................................................................................................................................................................... 55
Tabla 7. Primeras 25 sondas diferencialmente hipermetiladas en capas de neuronas piramidales en EA en
comparación con controles, análisis para el subconjunto hombres ordenadas por sinificancia. ...................... 57
Tabla 8. Sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA, encontradas en la
intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de hombres. ............................... 61
Tabla 9. Ontologías relacionadas con componente subcelular de sondas diferencialmente hipermetiladas para
EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de hombres,
en capas de neuronas piramidales. ................................................................................................................. 62
Tabla 10. Ontologías relacionadas con procesos biológicos y función molecular de sondas diferencialmente
hipermetiladas para EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el análisis del
subconjunto de hombres, en capas de neuronas piramidales. ........................................................................ 63
Tabla 11. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» de sondas hipermetiladas para
EA encontradas en intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de hombres, en
capas de neuronas piramidales. ...................................................................................................................... 64
Tabla 12. Primeros 25 resultados de análisis de metilación regional diferencial (DMR) en EA en capas de
neuronas piramidales identificados para la totalidad de la muestra de sujetos. ............................................... 65
Tabla 13. Primeros 25 resultados de análisis de metilación regional diferencial (DMR) en EA en capas de
neuronas piramidales, análisis para el subconjunto de hombres. .................................................................... 66
Tabla 14. 52 Regiones diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales, soportadas por
más de una secuencia CpG, en superposición genómica perfecta entre el análisis del conjunto completo de
sujetos y el del subconjunto de hombres. ........................................................................................................ 68
Tabla 15. Resultados ensayo de priorización de 59 posiciones diferencialmente metiladas en EA en capas de
neuronas piramidales corroboradas por rangos y encontradas en la intersección entre el análisis de la muestra
total con el análisis del subconjunto de hombres. ............................................................................................ 71
Contenido
V
Tabla 16. Características y distribución general de muestras de estudio de expresión transcripcional en
neuronas piramidales corticales de giro frontal superior. .................................................................................87
Tabla 17. Genes / sondas expresados diferencialmente a la baja en neuronas piramidales corticales de giro
frontal superior en EA en concordancia con los genes destacados diferencialmente hipermetilados en EA. ..91
Tabla 18. Regiones genómicas diferencialmente hipermetiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) para EA en comparación con controles en leucocitos de sangre periférica..........................................99
Tabla 19. Regiones genómicas diferencialmente hipometiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) para EA en comparación con controles en leucocitos de sangre periférica........................................100
Tabla 20. Resultados regionales destacados con validación cruzada de hallazgos de análisis de regiones
diferencialmente metiladas (DMR) y posiciones diferencialmente metiladas para EA en sangre periférica..101
Tabla 21. Ontologías relacionadas con componente subcelular de los genes identificados diferencialmente
hipermetilados en EA en leucocitos de sangre periférica. ..............................................................................102
Tabla 22. Ontologías relacionadas con procesos biológicos de los genes identificados diferencialmente
hipermetilados en EA en leucocitos de sangre periférica. ..............................................................................103
Tabla 23. Regiones seleccionadas y características de las islas CpG correspondientes a las regiones
seleccionadas, estudio de implementación de técnicas de metilación de ADN basadas en PCR. ................120
Tabla 24. Frecuencias relativas de genotipos TOMM 40 y APOE, muestras de sangre periférica de estudio de
implementación de técnicas basadas en PCR. .............................................................................................. 121
Tabla 25. Lista de «primers» para ensayos de implementación por técnicas basadas en PCR para metilación
de ADN...........................................................................................................................................................123
Tabla 26. Resultados de metilación de DNA por la técnica MS-HRM en muestras de sangre periférica de
estudio de implementación de técnicas basadas en PCR..............................................................................128
Tabla 27. Resultados de metilación de DNA por secuenciación (BSP) a nivel de CpG, encabezando la lista de
significancia estadística, estudio de implementación por técnicas basadas en PCR. ....................................128
Tabla 28. Resultados a nivel de promedio regional por secuenciación BSP, estudio de implementación por
técnicas basadas en PCR. .............................................................................................................................129
Tabla 29. Resultados destacados de secuenciación a nivel de CpG de EA, en comparación de subselección
de controles con puntaje minimental ~29/30. .................................................................................................130
VI
3 LISTA DE FIGURAS
................................................................................................................Pág.
Ilustración 1. Ilustración del resultado del proceso químico de «conversión por bisulfito» del ADN............... 22
Ilustración 2. Microfotografía ilustrativa de corteza cerebral humana teñida con rojo neutro. ........................ 34
Ilustración 3. Control de calidad en muestras estudiadas por microarreglos Infinium DNA Methylation 450K..
......................................................................................................................................................................... 46
Ilustración 4. Razón entre sondas para orillas CpG y sondas para islas CpG en resultados.. ....................... 48
Ilustración 5. Red funcional de ontologías de «componente subcelular » de análisis principal de
hipermetilación diferencial de DNA en capas de neuronas piramidales. .......................................................... 53
Ilustración 6. Diagrama de Venn que muestra la intersección de DMPs encontradas en análisis con todos los
sujetos y el análisis con subconjunto hombres.. .............................................................................................. 60
Ilustración 7. Ilustración de «Minimal Connected Network» MCN de genes multisoportados como
diferencialmente hipermetilados, encontrados con tendencia a expresión transcripcional disminuida. ........... 93
Ilustración 8. Control de calidad de curvas de melting para MS-HRM.. ....................................................... 127
Ilustración 9. Figura de correlación entre la metilación de la isla CpG de APOE y la expresión de TOMM40.
....................................................................................................................................................................... 134
VII
4 LISTA DE ANEXOS
Pág
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para
la totalidad de la muestra de sujetos. .............................................................................................................180
Anexo 2. Resultados de clasificación funcional de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de
neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID», resultados para toda la
muestra. .........................................................................................................................................................195
Anexo 3. Ontologías relacionadas con procesos biológicos del análisis de genes diferencialmente
hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas para la totalidad de la muestra. ......197
Anexo 4. Sondas diferencialmente metiladas, no asignadas a ningún gen en el estudio de posiciones
diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA, análisis con la totalidad de los sujetos.
.......................................................................................................................................................................199
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres .....................................................................................200
Anexo 6. Ontologías relacionadas con componente subcelular del análisis de genes diferencialmente
hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas para el subconjunto hombres. ........209
Anexo 7. Ontologías relacionadas con función molecular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados
en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas para el subconjunto hombres. ............................... 210
Anexo 8. Ontologías relacionadas con procesos biológicos del análisis de genes diferencialmente
hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas en el subconjunto de hombres. .....211
Anexo 9. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes
diferencialmente hipemetilados en EA en capas de neuronas piramidales, análisis en subconjunto hombres
.......................................................................................................................................................................213
Anexo 10. Resultados de clasificación funcional de genes encontrados diferencialmente hipermetilados en EA
en capas de neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID», análisis del
subconjunto de hombres. ............................................................................................................................... 215
Anexo 11. Resultados de clasificación funcional de genes correspondientes a sondas diferencialmente
hipermetiladas para EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el del subconjunto
de hombres en capas de neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID».
.......................................................................................................................................................................218
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra. ...219
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres. .............227
Anexo 14. Rangos diferencialmente metilados en EA en capas de neuronas piramidales corticales, en
intersección entre el análisis de la totalidad de la muestra y el del subconjunto de hombres. .......................236
VIII
LISTA DE ANEXOS
Anexo 15. 59 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales encontradas en la
intersección entre el análisis de la muestra total con el del subconjunto de hombres y corroboradas por rangos.
....................................................................................................................................................................... 240
Anexo 16. Análisis de priorización de genes correspondientes con los 52 rangos soportados por múltiples
posiciones ...................................................................................................................................................... 244
Anexo 17. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes
diferencialmente hipermetilados en EA en sangre periférica ......................................................................... 245
Anexo 18. Tabla de resumen de resultados de estratificación por el SNP rs2075650 de TOMM40, muestras de
estudio de implementación por técnicas basadas en PCR. ........................................................................... 246
Anexo 19. Artículo de implementación de técnicas de PCR de estudios de metilación de ADN (Hernandez et
al., 2013). ....................................................................................................................................................... 247
Anexo 20. Protocolos para conversión de bisulfito y parámetros utilizados en técnicas basadas en PCR del
laboratorio del Instituto de Genética de la Universidad Nacional. .................................................................. 259
Anexo 21. Controles de calidad de MS-HRM. Ilustraciones de curvas de melting. ....................................... 261
Anexo 22. Resultados de secuenciación (BSP) del análisis principal en sangre periférica en sujetos con EA,
en comparación con controles ....................................................................................................................... 264
Anexo 23. Ilustración de mapa genómico de región de interés de MBP encontrada diferencialmente metilada
en sangre periférica y en cerebros. ................................................................................................................ 266
Anexo 24. Análisis de concordancia con la tabla principal de resultados del estudio recientemente publicado
en NatureNeuroscience (De Jager et al., 2014). ............................................................................................ 267
Anexo 25. Ejemplo de diseño usando región de MBP y desarrollo del protocolo de diseño de primers para MSHRM usando las herramientas «Detailled bisulfite converter for MS-HRM desing» (Capítulo 5 de este trabajo)
y «bi-search» (Aranyi & Tusnady, 2007). ....................................................................................................... 268
Anexo 26. Ejemplo de diseño usando región de MBP y desarrollo del protocolo de diseño de primers para BSP
utilizando la herramienta «bi-search» (Aranyi & Tusnady, 2007) ................................................................... 272
Anexo 27. Ilustración de controles de calidad de software Epigenetic Sequencing MEthylation (ESME) creado
para el proyecto epigenoma humano (Eckhardt et al., 2006; Lewin et al., 2004) y utilizado en el presente
trabajo. ........................................................................................................................................................... 274
Anexo digital 1. Archivo de tablas en formato Excel de resultados DMPs en estudio en sangre periférica. 275
Anexo digital 2. Archivo de tablas en formato Excel de resultados DMRs en estudio en sangre periférica. 275
IX
5 DEFINICIÓN DE CONCEPTOS
Diferencialmente metilado(a): se utiliza ampliamente para describir la diferencia de
metilación de ADN entre la condición de interés en comparación con la condición control,
en genes, CpGs, regiones o sondas que corresponden a locus genómicos.
Diferencialmente hipermetilado(a): se utiliza ampliamente para describir la diferencia de
metilación de ADN, con mayor metilación de la condición de interés respecto a la condición
control, en genes, CpGs, regiones o sondas que corresponden a locus genómicos.
Diferencialmente hipometilado(a): se utiliza ampliamente para describir la diferencia de
metilación de ADN, con menor metilación de la condición de interés respecto a la condición
control, en genes, CpGs, regiones o sondas que corresponden a locus genómicos.
Valores Beta: En microarreglos Infinium DNA Methylation 450K, estos valores se calculan
tomando las intensidades de lectura del fluorosforo asignado a ADN metilado (M) y el
asignado al ADN no metilado (U) de acuerdo a la siguiente formula:
(P. Du et al., 2010).
Valores M: Son el resultado de la transformación de los valores Beta usada para el análisis
de contrastes de metilación entre la condición de interés y la condición control de acuerdo
a la formula
(P. Du et al., 2010).
UCSC genome Browser: Es una herramienta para la investigación que integra en una
base de datos, cientos de análisis científicos en un contexto genómico en un navegador de
genoma on-line instituido por la Universidad de California, Santa Cruz, USA, para el
genoma humano y otros genomas (Karolchik et al., 2014).
Minimental: Cuestionario de tamizaje para la evaluación del deterioro cognitivo y evolución
clínica e investigación de pacientes con alteraciones neurológicas (Arboleda et al., 2001).
Intervalo postmortem: es el tiempo que ha transcurrido entre el deceso del donante y el
procesamiento total del cerebro donado para su total preservación.
X
6 ABREVIATURAS Y CONVENCIONES
Símbolo
Significado
A-Beta
Amiloide Beta.
Ad.p.val
Valor P ajustado por la corrección FDR .
ADN
Ácido DesoxirriboNucleico.
APP
Proteína precursora del Amiloide Beta. Abreviatura del inglés, «Amyloid
Precursor Protein».
BMIQ
Método de normalización para datos de Infinium DNA methylation 450K. Del
inglés, «Beta-MIxture Quantile normalization».
BSP
Abreviatura del inglés, «Bisulfite Sequencing PCR».
CAT
Abreviatura de «Catálogo».
CGIn
Anotación referente a localización de las sondas o regiones en islas CpG, orillas
de islas CpG, plataformas de islas CpG, o que estén fuera de estos elementos.
Chr
Cromosoma.
CT
Abreviatura para grupo de sujetos control.
curvas
ROC
Abreviatura del inglés, «Receiver Operating Characteristic»,
representación gráfica de la sensibilidad frente la especificidad.
DCL
Deterioro Cognitivo Leve.
DE
Desviación Estandar de la media.
DE
Abreviatura de «Desviación Estandar».
Delta
de Betas
Diferencia de valores beta entre la condición de interés y la condición control.
es
una
Dir
Dirección en la que se encuentra diferencialmente metilada una sonda una
región
EA
Enfermedad de Alzheimer, también se refiere a la forma más común de la EA.
EAMF
Enfermedad de Alzheimer mendeliana familiar.
FC
Abreviatura del inglés «Fold Change».
FDR
Corrección para pruebas múltiples. Del inglés, «False Discovery Rate».
FDR
Abreviatura del inglés, «False Discovery Rate».
FOXD3
Abreviatura del inglés, «Forkhead box D3».
FOXO3a
Abreviatura del inglés, «Forkhead box O3».
gene
assoc
Gen asociado por anotación «Infinium DNA Methylation 450K».
Gene ID
Código numérico oficial en base de datos del Centro Nacional para la
Información Biotecnológica (NCBI) en USA.
Gene
Symbol
Símbolo oficial en base de datos del Centro Nacional para la Información
Biotecnológica o National Center for Biotechnology Information (NCBI) en USA.
Contenido
XI
GEO
Respositorio de bases de datos de difrentes tipos de experimentos genómicos.
Abreviatura del inglés, «Gene Expression Omnibus».
group
Localización genica por anotación «Infinium DNA Methylation 450K».
GSTP1
Abreviatura del inglés, «Glutathione S-transferase P».
hg19
Se refiere a las coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la
base de datos del UCSC genome Browser (Karolchik et al., 2014), compuesta
por cromosoma y rango genómico de referencia (transformanble en otras
coordenadas genomicas en http://genome.ucsc.edu /cgi-bin/hgLiftOver).
HOXA3
Abreviatura del inglés , «Homeobox protein Hox-A3».
IDAT
Tipo de los archivos que son generados por el el sistema illumina HiScan System
durante escaneo de la metilación de ADN Infinium DNA methylation 450K.
Abreviatura del inglés, «Intensity Data files».
KO
Abreviatura del inglés, «knockout».
LHX3
Abreviatura del inglés, «LIM Homeobox 3»
LINE-1
Abreviatura del inglés, «long interspersed nuclear element 1».
maxbetafc Abreviatura del inglés «Max fold change».
mean
Media aritmética.
meanpval Media de valores p, de un conjunto devalores p de sondas adyacentes.
minpval
valor p mínimo, de un conjunto de valores p correspondientes a sondas
adyacentes.
MS-HRM
Abreviatura del inglés, «Methylation Specific High Resolution Melting».
NM
Abreviatura de nivel de metilación
#p
Número de sondas.
p.value
Valor P.
pb
Abreviatura de «pares de bases» nuecleotídicas.
PCR
Abreviatura del inglés, Polymerase Chain Reaction.
PM
Abreviatura de Porcentaje de Metilación, consiste en el NM pasado a porcentaje
POU3F2
Abreviatura del inglés, «POU domain, class 3, transcription factor 2».
Probe ID
Código de sonda de illumina correspondiente a Infinium DNA Methylation 450K.
QN
Abreviatura utilizada en la literratura especializada para «normalización cuartil».
Del inglés, «Quartil Normalization».
SLC25A2
Abreviatura del inglés, «Solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; ornithine
transporter) member 2».
SNP
Polimorfismo de nucleótido sencillo. Del inglés, «Single Nucleotide Polimorfim».
SNC
Abreviatura de Sistema Nervioso Central.
SWAN
Método de normalización para datos de Infinium DNA methylation 450K. Del
inglés, «Subset-quantile Within Array Normalization».
WT
Abreviatura del inglés, «Wild type».
12
Abreviaturas Para Tablas de Agrupamiento/Enriquecimiento en
Ontologías Funcionales
Símbolo
Significado
adj pvalue
valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples de
Benjamini & Hochberg.
Funt. Term
Identificador del término de agrupamiento funcional.
G%
porcentaje de identificadores del genoma, anotados al término funcional.
G neg
número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional.
G pos
número de identificadores en el genoma, anotados para el término funcional.
G pos IDs
símbolos de identificadores en el genoma, anotados al término funcional.
List %
porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional.
List neg
número de identificadores de la lista, no anotados para el término funcional.
List pos
número de identificadores de la lista, anotado para el término funcional.
List pos IDs símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional.
odds ratio
log
logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional
para la lista en relación al genoma completo.
p-value
valor p de la prueba exacta de Fisher.
Term size G tamaño global del término en cuestión en el genoma completo.
Term size L
Número de identificadores anotados para ese término.
Abreviaturas de modificaciones de Histonas
H1
Histona tipo 1.
H2A
Histona tipo 2A.
H2B
Histona tipo 2B.
H3
Histona tipo 3.
H4
Histona tipo 4.
XIII
7 RESUMEN
El presente trabajo de doctorado estudia el estado de metilación de ADN del genoma
(metiloma) en capas de neuronas piramidales corticales las cuales tienen susceptibilidad
conocida en la Enfermedad de Alzheimer (EA) y realiza adicionalmente un análisis de
expresión a nivel transcripcional en neuronas piramidales de igual localización al estudio
de metiloma. Además, estudia el metiloma de ADN en leucocitos de sangre periférica para
lo cual, mediante un cuidadoso ensamblaje de datos disponibles en diferentes repositorios,
se logró realizar un análisis original de metilación de ADN en EA, que tal vez sea el más
grande de metiloma de ADN en sangre periférica en EA realizado a la fecha. En cerebros,
resaltan dentro de los múltiples resultados, la hipermetilación diferencial en genes como
BIN1 y HOXA3 que igual que KDM2B y ZNF385A, son concordantes con los hallazgos de
otros autores también en cerebros humanos con EA. Las regiones diferencialmente
metiladas en cerebros incluyen principalmente los genes GSTP1, CXXC1/ MBD1 y MBP.
De forma importante, también se encontró una región del gen MBP en el estudio de sangre,
que coincide exactamente con el estudio en cerebros; en dicha región (coordenadas hg19
chr18:74799495-572) se encuentran 3 CpGs consecutivos que concuerdan en ambos
estudios. Estos hallazgos representan nuevo conocimiento aportado al área.
XIV
8 ABSTRACT
Study of genomic DNA Methylation patterns in Alzheimer’s Disease oriented
toward pyramidal neurons and its concordance with peripheral leucocytes
The present PhD dissertation studies the DNA methylation in the cortical layers of pyramidal
neurons which are susceptible to neurodegeneration in Alzheimer’s Disease (AD). This
work includes studies of transcriptional expression of pyramidal neurons in the same
location to DNA methylome study. Additionally, it includes another DNA methylome study
in peripheral blood by using the available crude data in public repositories. The present
work assembles such databases in order to perform the most powerful analysis of DNA
methylome in peripheral blood of AD performed until now. Between many results, it
highlights the increase of DNA methylation in BIN1, HOXA3, KDM2B and ZNF385A genes
that are corroborated by other recent study. In addition, at regional level differentially
methylated regions in brains include GSTP1, CXXC1/ MBD1 and MBP genes. Interestingly,
we found total coincidence of a region in MBP gene (hg19 coordinates chr18:74799495572) in both peripheral leukocytes and the study in brains. Such MBP region includes 3
consecutive CpGs with concordant direction in both studies. The exposed findings are
contributions to the area of knowledge.
XV
9 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
En la actualidad se reconoce que los mecanismos epigenéticos, específicamente la
metilación de ADN, tienen importancia en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA)
más de lo sospechado inicialmente e incluso, más de lo atribuible a los polimorfismos
genéticos individuales (Lord & Cruchaga, 2014). Sin embargo, en el área de la epigenética
de enfermedades neurodegenerativas existe un vacío en el conocimiento por la falta de
investigaciones que tengan en cuenta seleccionar de forma preponderante neuronas con
susceptibilidad específica a neurodegeneración en EA para su estudio, a pesar de que se
ha subrayado reiteradamente esta necesidad (Kretzschmar, 2009). Por lo tanto, en este
trabajo se ha considerado realizar un abordaje para llenar dicho vacío en el conocimiento,
orientando el estudio hacia neuronas corticales de tipo piramidal de susceptibilidad
conocida en EA, que se encuentran en las capas corticales del mismo nombre (Bussiere
et al., 2003; Deng, Irizarry, Nitsch, Growdon, & Rebeck, 2001; Lemmens et al., 2011;
Luebke et al., 2010; McMullen & Glaser, 1988).
Adicionalmente, varios estudios han mostrado a la sangre periférica como un tejido
accesible, donde es posible identificar algunos hallazgos de patrones de expresión o de
metilación de ADN encontrados en cerebros, mostrando la utilidad y necesidad de estudiar
la metilación de ADN en sangre periférica en enfermedades neurodegenerativas (Masliah,
Dumaop, Galasko, & Desplats, 2013). Por lo tanto, en el presente trabajo se propuso,
identificar genes/regiones genómicas diferencialmente metilados en EA en sangre
periférica y también, aquellos genes/regiones genómicas diferencialmente metilados en
EA encontrados en común, en muestras de capas de neuronas piramidales, y en sangre
periférica, llenando un vacío en el conocimiento en la epigenética de la EA.
1
10 JUSTIFICACIÓN
La enfermedad de Alzheimer es la enfermedad neurodegenerativa más común y su manejo
es cada vez más costoso, lo cual tiene repercusiones en la salud pública de países en
desarrollo, en los que se presenta un aumento de la expectativa de vida (Prada, Takeuchi,
& Ariza, 2014). Se estima que en el año 2020 en Colombia el gasto monetario mínimo
directo en la EA estará en el orden de 3 billones de pesos anuales, cubriendo con eso sólo
el 16% de los casos por nuestro sistema de salud (Prada et al., 2014) y pese a los gastos
que genera, continúa siendo hasta la fecha una enfermedad sin ningún tratamiento
efectivo.
Existen dos formas de la EA de acuerdo con su causa; una de ellas, la enfermedad de
Alzheimer Mendeliana Familiar (EAMF), corresponde a una proporción muy minoritaria del
total de los casos y tiene causa genética conocida, dada por una mutación en uno de tres
genes específicos, APP, PSEN1 y PSEN2. Por el contrario, la forma esporádica de la
enfermedad corresponde a la gran mayoría de los casos (más del 95%) y difiere desde el
punto de vista causal a la EAMF (Castellani et al., 2006).
A diferencia de la EAMF, la EA esporádica no tiene una causa genética mendeliana, pero
su origen si tiene un componente genético importante y junto con otras enfermedades
devastadoras, pertenece al grupo de «enfermedades complejas». En tal escenario,
factores genéticos y ambientales interactúan de forma que no es posible predecir realmente
si una persona va a presentar o no la EA con base en factores genéticos (Farrer, 2015), ni
tampoco se ha identificado un claro factor de riesgo ambiental asociado a su aparición,
excepto la edad avanzada (Kukull et al., 2002).
En gemelos monocigotos, los cuales son genéticamente idénticos se han encontrado
diferencias epigenéticas y fenotípicas claras (Levesque et al., 2014). Un estudio en
gemelos demostró diferencias epigenéticas que son escasas en las primeras etapas de la
vida, pero se acentúan con la edad (Fraga et al., 2005). En ese contexto, conocer las
diferencias epigenéticas contribuye a la explicación de las discordancias fenotípicas en
cuanto la presencia de enfermedades complejas, no explicables desde la genética, y que
se presentan inclusive en gemelos, en muchos casos con discordancia fenotípica para EA
(Creasey, Jorm, Longley, Broe, & Henderson, 1989; Levesque et al., 2014).
2
Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS), han mostrado la importancia
del componente genético como pieza contribuyente en la aparición de la EA (J. C. Lambert
et al., 2013). Dichos estudios, en general, requieren involucrar un número elevado de
sujetos para poder detectar un aporte parcial a la explicación de la EA, por la genética
dejando claro la existencia de un vacío plausiblemente relacionado con la epigenética,
como factor contribuyente en su explicación (H. Chen et al., 2014; Tosto & Reitz, 2013).
En «la era postgenómica» se han identificado elementos epigenéticos a lo largo del
genoma, que pueden jugar un papel importante en los fenotipos complejos (Bernstein et
al., 2012); sin embargo, en la actualidad no se conocen bien los patrones epigenómicos de
metilación de ADN que puedan influir sobre la susceptibilidad del genoma en las capas de
neuronas piramidales, las cuales representan un grupo de células susceptibles a ser
afectadas en la EA. Actualmente, el campo de la epigenómica provee herramientas con
alto potencial de investigación para el entendimiento de las enfermedades complejas y en
particular de la EA (Lord & Cruchaga, 2014). Más aún, perfiles de metilación de ADN
muestran mucha mayor estabilidad en comparación con los estudios de perfiles de
expresión, por ejemplo, expresión transcripcional de los microRNA o de los RNAm (Birdsill,
Walker, Lue, Sue, & Beach, 2011) lo que implica reconocer perfiles que se relacionen de
forma más clara con EA (Horvath et al., 2012). Al respecto, recientemente se publicó un
trabajo que demostró diferencias de perfiles de metilación de ADN en tejido cerebral,
correlacionados con hallazgos patológicos en EA (De Jager et al., 2014).
El presente trabajo en metiloma de ADN en EA, fue planteado para avanzar en establecer
perfiles más específicos usando microdisección láser para capturar tejido enriquecido en
neuronas piramidales, como tipo celular susceptible en EA. Adicionalmente, se tuvo en
cuenta que un estudio previo de metiloma de ADN en enfermedad de Parkinson mostró
correspondencias entre los resultados encontrados a nivel de cerebros y los encontrados
a partir de leucocitos de sangre periférica, mostrando la necesidad de estudiar la metilación
de ADN en sangre periférica en enfermedades neurodegenerativas (Masliah et al., 2013).
Por lo tanto, el presente trabajo estudió los patrones de metiloma de ADN en sangre
periférica de EA, realizando un análisis de datos disponibles en diferentes repositorios
especializados, que no se habían analizado antes en forma conjunta. Dicho análisis es
original y representa, en nuestro conocimiento, el estudio de metiloma de EA en sangre
periférica con mayor tamaño realizado a la fecha.
3
11 OBJETIVO GENERAL
Estudiar patrones de metilación de ADN en capas corticales de neuronas piramidales en
cerebros humanos con enfermedad de Alzheimer, en comparación con cerebros humanos
controles sin alteración neurológica, y la relación de estos con patrones de metilación de
ADN en leucocitos de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Alzheimer en
comparación con los respectivos controles.
4
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
12 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar y contrastar patrones (perfiles) de metilación de ADN en capas de neuronas
piramidales de la corteza cerebral, giro frontal superior, de cerebros humanos de
donantes con enfermedad de Alzheimer, y cerebros humanos de donantes controles sin
alteración neurológica (Capítulo 1).
Analizar e interpretar los resultados de patrones de metilación identificados en capas de
neuronas piramidales de la corteza cerebral en enfermedad de Alzheimer, mediante un
análisis de agrupamiento funcional génico por métodos bioinformáticos para su
discusión (Capítulo 1).
Confrontar los resultados más importantes de patrones de metilación identificados en
capas de neuronas piramidales de la corteza cerebral, giro frontal superior, con sus
resultados correspondientes de expresión transcripcional en neuronas piramidales de
corteza cerebral, giro frontal superior, de cerebros humanos de donantes con
enfermedad de Alzheimer, y cerebros humanos de donantes controles sin alteración
neurológica (Capítulo 2).
Identificar y contrastar patrones de metilación de ADN en leucocitos de sangre periférica
de pacientes con enfermedad de Alzheimer, y sangre periférica de controles sin
alteración neurológica (Capítulo 3).
Analizar e interpretar los resultados de patrones de metilación de ADN en leucocitos de
sangre periférica de pacientes con enfermedad de Alzheimer, mediante análisis de
agrupamiento funcional génico por métodos bioinformáticos para su discusión
(Capítulo 3).
Evaluar la posible concordancia de metilación de ADN en EA entre los hallazgos
encontrados en las capas de neuronas piramidales y los encontrados en sangre
periférica (Capítulo 4).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
5
Estudiar patrones de metilación de genes con importancia genética conocida en EA
(APOE, APP, CLU, TOMM40 y LINE1), en muestras de sangre periférica del Biobanco
del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia de pacientes con
enfermedad de Alzheimer en comparación con controles, mediante la revisión, diseño e
implementación de técnicas de metilación de ADN basadas en PCR a nivel de locus
único (Capítulo 5).
6
13 MARCO TEÓRICO
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES DE LA ENFERMEDAD
DE ALZHEIMER
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa demencial que
corresponde clínicamente a una pérdida progresiva de funciones cognoscitivas que afecta
el lenguaje, la memoria, la capacidad de pensar y se ve incrementada con la edad
avanzada. La EA puede llevar a quien la padece a una incapacidad de realizar cualquier
tarea sencilla y de reconocer las personas más familiares (Small & Cappai, 2006). Es la
enfermedad neurodegenerativa más común superando a la enfermedad de Parkinson en
prevalencia e incidencia (Reitz, Brayne, & Mayeux, 2011).
Inicialmente, Alois Alzheimer describió en 1907 el primer caso reportado de la enfermedad
que actualmente lleva su nombre. En la actualidad están vigentes en general todas las
características neuropatológicas descritas por Alois Alzheimer, incluyendo los agregados
proteicos, tanto los intracelulares, formados principalmente por proteína Tau fosforilada,
llamados ovillos neurofibrilares, como los extracelulares, principalmente constituidos por
agregación de péptido Amiloide Beta (A-Beta), producto del procesamiento de su proteína
precursora. Asimismo, esta enfermedad se caracteriza también por atrofia cortical y
pérdida sináptica (Castellani et al., 2006; Small & Cappai, 2006). Las perturbaciones
histopatológicas mencionadas, se presentan en estadios iniciales, tanto en la corteza
entorrinal como en el hipocampo (afectando predominantemente neuronas piramidales);
mucho más tardíamente en la neocorteza temporal y finalmente en la corteza frontal, la
cual por tanto es la que menores cambios de distribución celular presenta (Corder et al.,
2000; Nelson, Braak, & Markesbery, 2009).
La EA no tiene una causa única definitoria, por el contrario es causada por una
combinación de factores de riesgos genéticos que interactúan de forma compleja, entre sí
y con «factores no genéticos», estableciendo el desarrollo de la enfermedad (J.-C. Lambert
& Amouyel, 2007). Por tanto, al igual que en otras enfermedades complejas, en la EA un
MARCO TEÓRICO
7
reto general es esclarecer la presencia de «factores» que puedan contribuir en a la
aparición de la enfermedad para avanzar en su entendimiento y de esta forma favorecer
el diseño de tratamientos efectivos (Eichler et al., 2010).
Desde el punto de vista genético, la EA presenta una heredabilidad de 48%, sin embargo,
no tiene ningún patrón de herencia mendeliano (Pedersen, Gatz, Berg, & Johansson,
2004). El contribuyente más importante a la causa de la EA esporádica se trata de la
presencia del alelo ɛ4 de la apolipoproteína E (APOE), que fue encontrado inicialmente
mediante estudios de ligamiento y confirmado reiteradamente en diferentes latitudes por
estudios de asociación genética (Arboleda et al., 2001; Roses, 1996; Saunders et al.,
1993). Además, se encontraron efectos de APOE y APOJ (conocida como CLU) para
remover agregados proteicos en EA, encontrándose claramente relacionados con la
mencionada variante alélica ɛ4 de APOE (Holtzman, 2004).
Sin embargo, de forma reiterada, han sido reportados y estudiados múltiples casos de
gemelos monocigotos, que a pesar de que comparten igual contenido genético fueron
discordantes para la presentación de la EA (Creasey et al., 1989; Jarvenpaa et al., 2004;
Mastroeni, McKee, Grover, Rogers, & Coleman, 2009; Rapoport, Pettigrew, & Schapiro,
1991); indicando que la EA no tiene una causa completamente genética y apreciando de
forma anticipada la presencia de factores de la EA basados en un componente
epigenético/medio ambiental que puede ser un claro determinante para su desarrollo.
En forma opuesta a lo que ocurre en EA esporádica, la causalidad de la EAMF está
establecida en bases totalmente genéticas, tiene un patrón de herencia autonómico
dominante y se ha determinado que se debe a mutaciones de APP o en las presenilinas 1
y 2, que son proteínas involucradas en el procesamiento del A-Beta mediado por la gamasecretasa (Bertram, Lill, & Tanzi, 2010). De esta manera se ha comprendido que la EAMF
se debe consistentemente a defectos genéticos de la vía de síntesis de la proteína A-Beta
(Bertram et al., 2010).
8
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
NEURONAS PIRAMIDALES EN ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Actualmente se reconoce que en neuronas corticales de tipo piramidal, entre otros tipos
celulares, hay una susceptibilidad especial a la neurodegeneración asociada con el
deterioro cognoscitivo en la EA (Luebke et al., 2010). En modelos animales, se reiteró la
susceptibilidad de neuronas piramidales de corteza frontal a neurodegeneración en EA,
por ejemplo, se encontraron alteraciones en la conformación de las prolongaciones
dendríticas en neuronas piramidales corticales, en los modelos murinos, Tg2576, rTg4510
y APP/PS1KI, útiles para estudiar neurodegeneración, en comparación con ratones WT
(Lemmens et al., 2011; Luebke et al., 2010).
Asimismo, en cerebros humanos con EA esporádica, el estudio de la vulnerabilidad de las
neuronas en corteza frontal, giro frontal superior, en las capas III y V de la neocorteza, con
evaluación de su capacidad de arborización axodendrítica mediante la tinción SMI-32,
permitió concluir que poblaciones de neuronas piramidales se encuentran más propensas
a la neurodegeneración en la EA, presenten o no, agregados neurofibrilares intracelulares
(Bussiere et al., 2003). Dicho
estudio confirmó la vulnerabilidad a degeneración en
neuronas piramidales corticales reportada previamente (Hof, Cox, & Morrison, 1990) y
adicionalmente, mostró una correlación de su disfunción sináptica y la pérdida
axodendrítica en las mencionadas capas piramidales III y V, con la clínica demencial en
EA esporádica (Bussiere et al., 2003). Lo mencionado señala la pertinencia de orientar
estudios desde una perspectiva epigenética en EA hacia las capas corticales de neuronas
piramidales, para ampliar la comprensión de la EA respecto a la susceptibilidad que se
encuentra alrededor de las neuronas piramidales corticales.
VÍAS E HIPÓTESIS EN ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Hipótesis de la cascada amiloidea
La «hipótesis de la cascada amiloidea» formuló originalmente que la deposición en placas
del péptido A-Beta en sí misma, o productos del procesamiento de APP que contienen ABeta, llevan a formación de ovillos neurofibrilares y causan la muerte neuronal (Hardy &
Higgins, 1992). Dicha explicación coincide con el hallazgo más evidente de la descripción
histopatológica inicial y es concordante con las mutaciones en la vía de metabolismo de ABeta por las gama secretasa mutadas en EAMF, lo que produce una disrupción en el
MARCO TEÓRICO
9
procesamiento del Amiloide Beta (A-Beta) (Hardy & Higgins, 1992). Posteriormente, se
planteó una «nueva hipótesis amiloidea» centrada en los oligómeros de A-Beta como
responsables de la degeneración y se han encontrado mecanismos mediante los cuales
estos oligómeros A-Beta y otros derivados de APP, producen tanto neurodegeneración
como deterioro sináptico (Tomiyama et al., 2008). Sin embargo, hasta hoy los tratamientos
basados en la disminución del amiloide muestran pobre utilidad en EA esporádica y se
sabe que su presencia no produce la clínica demencial, pues se puede encontrar en gran
abundancia en sujetos cognitivamente sanos (Underwood, 2015).
Neurodegeneración mediada por Tau fosforilada
Paralelamente, se encontró que la proteína Tau fosforilada era el componente
predominante de los ovillos neurofibrilares y se propuso la hiperfosforilación de las
moléculas de Tau, como mecanismo central en la neurodegeneración de la EA (Kosik,
Joachim, & Selkoe, 1986). Al igual que para los oligómeros de A-Beta, el papel de Tau en
afección sináptica también ha sido ampliamente estudiado (Obulesu, Venu, &
Somashekhar, 2011), sin embargo, en cerebros humanos se reportó que la presencia de
Tau forforilada no predice la aparición de efectos irreversibles en la arborización sináptica
de neuronas susceptibles en EA (Merino-Serrais et al., 2013).
Hipótesis acetilcolinérgica
Se planteó una hipótesis acetilcolinérgica, basada en una actividad aumentada de acetil
colinesterasa en cerebros de pacientes con EA (Bartus, 2000). Se han usado
medicamentos colinérgicos en EA mostrando utilidad transitoria en algunos pacientes
(Contestabile, 2011). Sin embargo, se encontró que el efecto de esos medicamentos
colinérgicos involucra una regulación en otros sistemas de neurotransmisión sináptica que
pueden estar alterados como conjunto (L. Zhang, Zhou, & Dani, 2004), lo cual podría
explicar su utilidad clínica –la cual igualmente no lleva a mejoría del curso de la
enfermedad- (Bartus, 2000; Contestabile, 2011).
Hipótesis reconocidas
Dentro de las vías claramente contribuyentes a la EA, se encuentra la «hipótesis del estrés
oxidativo» como fue originalmente planteada (Markesbery, 1997; Persson, Popescu, &
Cedazo-Minguez, 2014). La hipótesis se basa en que el estrés oxidativo, que es un
desbalance de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la capacidad
10
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
celular de neutralizarlas, entre otras cosas, es capaz de dañar directamente membranas
celulares y el núcleo de una célula, lo que lleva a muerte celular neuronal y pérdida
sináptica.
Fuertes evidencias soportan el papel del estrés oxidativo en EA, por ejemplo, los productos
de la peroxidación lipídica se encontraron incrementados en el cerebro y en el líquido
cefalorraquídeo de pacientes con EA (Bradley, Xiong-Fister, Markesbery, & Lovell, 2012;
Persson et al., 2014; Williams, Lynn, Markesbery, & Lovell, 2006). Igualmente, se sabe que
hay una importante disminución de la actividad glutatión reductasa y de enzimas
antioxidantes que se localiza preferencialmente en la sinapsis y se relaciona con el estado
de severidad de EA (Ansari & Scheff, 2010), por tanto, se reconoce al estrés oxidativo, al
deterioro de la fosforilación oxidativa y al aumento de la producción de radicales libres
como parte de la fisiopatología de la EA (Arikanoglu et al., 2013; Persson et al., 2014).
A pesar del hecho que se ha demostrado que las ROS juegan un papel importante en las
enfermedades neurodegenerativas y en específico en EA, múltiples estudios con
antioxidantes no han mostrado utilidad clínica en la EA, indicando que es necesaria una
visión terapéutica menos simplificada -que el consumo de antioxidantes- para lograr
avances significativos en el manejo preventivo que permita un cambio del curso natural de
la EA (Gandhi & Abramov, 2012; Persson et al., 2014). Finalmente, cabe mencionar que
la acción de las proteínas disulfuro reductasas pueden revertir oxidación de aminoácidos
de cisteína y metionina como respuesta al estrés oxidativo (Persson et al., 2014).
De forma interesante, se propuso la hipótesis de la «cascada mitocondrial» en EA, que se
fundamenta en tres pilares, el primero asume un presupuesto genético relacionado con
una función mitocondrial disminuida. En segundo lugar, en que los «factores ambientales»
pueden ser determinantes de la velocidad en que ocurre la disfunción mitocondrial en la
vejez y en tercer lugar, que tanto el presupuesto genético, como la velocidad de alteración
en función mitocondrial, afecta directamente en la cronología de la EA (Swerdlow & Khan,
2004). Por consiguiente, el estrés oxidativo aumentaría la disfunción celular mediante el
daño de fosfolípidos de las membranas celular y mitocondrial (Smith et al., 2010; Sultana
& Butterfield, 2009). La hipótesis actual de la cascada mitocondrial se apoya en que una
menor actividad de COX está relacionada con el estrés oxidativo y disfunción mitocondrial
en EA (D. F. Silva et al., 2013; Swerdlow, Burns, & Khan, 2014).
MARCO TEÓRICO
11
Asimismo, un componente de disrupción metabólica y, en específico, ha sido propuesto un
fenómeno de resistencia a la insulina como un mecanismo dentro de la EA (Biessels,
Kappelle, & Utrecht Diabetic Encephalopathy Study, 2005; Watson & Craft, 2003).
Concordantemente, se encontró que la insulina pudo evitar el daño sináptico asociado a
los oligómeros de A-Beta en cultivos primarios posiblemente a través de mecanismos
regulatorios génicos, relacionados con degradación de oligómeros A-Beta (Neumann et
al., 2008) y sinapsis (De Felice et al., 2009).
Recientemente, se ha encontrado un fuerte contribuyente inflamatorio en EA relacionado
con la producción de leucotrienos, los cuales son importantes en respuesta inflamatoria y
en enfermedades alérgicas (Joshi & Pratico, 2014). Asimismo, en un estudio en cerebros
de un modelo murino, el bloqueo de la vía de leucotrienos se vinculó a la reducción del
déficit cognoscitivo producido por trauma cráneo encefálico (Corser-Jensen et al., 2014).
Además, en cultivos neuronales primarios de ratas, la inhibición de la vía de la lipoxigenasa
/leucotrienos mostró ser protectora en excitotoxicidad glutamatérgica (Joshi & Pratico,
2014). Concordantemente, una mutación en el gen TREM2, que se encontró altamente
expresado en microglía incrementa claramente el riesgo de la EA (Hickman & El Khoury,
2014; Jonsson et al., 2013) apoyando la importancia central de procesos inflamatorios en
la instauración de la EA. En conjunto, lo mencionado indica que la EA no se restringe al
compartimento neuronal y se hace más que comprensible la participación de la microglía
y de la inflamación que rodea a la neurodegeneración en la EA (Avila-Munoz & Arias,
2014).
Algunas de las hipótesis mencionadas tienen un soporte más que robusto gracias a los
esfuerzos investigativos en el área, permitiendo trazar un modelo general más adecuado
que lo concebido inicialmente. Sin embargo, el asunto central sobre qué puede hacer que
un individuo desarrolle la EA, a diferencia de otro, sigue siendo pobremente entendido,
indicando la necesidad de estudios, en específico desde la epigenética que aporten nuevas
piezas en la construcción de un entendimiento más completo del cuadro fisiopatogénico y
por tanto en el diseño de posibles medicamentos útiles en la EA esporádica (Farrer, 2015;
Lord & Cruchaga, 2014).
12
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
GENÓMICA, EPIGENÓMICA Y ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
CONCEPTOS DE GENÓMICA Y EPIGENÓMICA
En el 2001 se publicó el primer borrador del proyecto «Genoma Humano» que dio a
conocer la inmensa mayoría de secuencias nucleotídicas de los genes humanos (Lander
et al., 2001). La palabra genoma se deriva de la unión de «gen» y «oma», se refiere a la
amplitud de la totalidad de los genes y de los elementos relacionados con el material
genético de los organismos. La «genómica humana» es una disciplina de la biología que
se encarga de estudiar la totalidad del genoma humano (Kumar & Eng, 2014) e incluye
tanto el estudio de los genes y elementos relacionados a lo largo del genoma, como la
evaluación de conexiones funcionales entre grupos de genes relacionados y de sus
relaciones estructurales en los cromosomas (Vineis, Khan, Vlaanderen, & Vermeulen,
2009). En la era post genómica -luego de la secuenciación del genoma humano- ocurrió
una rápida extensión del sufijo «oma» y su derivado «omica» a las áreas del conocimiento
conocidas en inglés como high-throughput «omics diciplines» y en castellano como
ciencias «omicas» de alta producción de resultados, entre las cuales se encuentra la
epigenómica, disciplina encargada de estudiar los patrones epigenéticos que se
encuentran a lo largo de todo el genoma (Bernstein et al., 2012).
Las tecnologías para evaluar variantes genéticas a lo largo del genoma humano
permitieron realizar estudios de asociación de genoma amplio (GWAS), en diversas
enfermedades incluyendo trastornos del sistema nervioso central (Geschwind & Konopka,
2009; J. C. Lambert et al., 2009). De forma análoga ha sido posible realizar estudios
importantes de expresión transcripcional a lo largo del genoma (Kodama et al., 2012) y más
recientemente, estudios de asociación de epigenoma amplio, conocidos como EWAS, del
inglés «Epigenome Wide Association Studies» (Flanagan, 2015; Rakyan, Down, Balding,
& Beck, 2011). Como su nombre lo indica los EWAS son estudios a nivel del genoma
humano desde la perspectiva epigenética los cuales han mostrado asociarse igualmente a
enfermedades de diferentes tipos (Flanagan, 2015).
En enfermedades neurodegenerativas, varios GWAS reportaron y ratificaron la asociación
de la EA a polimorfismos genéticos en los genes APOE, CLU, PICALM, BIN1 y CR1 (Harold
et al., 2009; Wijsman et al., 2011). Posteriormente, se encontraron asociadas a EA
MARCO TEÓRICO
13
variantes genéticas de genes como TREM2, CD33, ABCA7, HLA-DRB5 y HLA-DRB1
-relacionados con inflamación al igual que CR1-. Asimismo, SORL1, se encontró asociado
a EA, que se relaciona con endocitosis y transporte de lípidos, como APOE, BIN1 y PICALM
(Guerreiro, Bras, & Hardy, 2013; Guerreiro & Hardy, 2014; J. C. Lambert et al., 2013).
Igualmente, el grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia ha
realizado estudios relevantes de asociación genética de EA para la población Colombiana
(Forero, Arboleda, Yunis, Pardo, & Arboleda, 2006; Ortega-Rojas et al., 2015). Todos estos
importantes hallazgos desde la genética, siguen confiriendo aún riesgos muy parciales para
la EA esporádica, lo cual deja clara la importancia de elementos aún poco estudiados de
la EA, que van más allá de la genética (Chakravarti, 2011; Farrer, 2015).
EL ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE EXPERIMENTOS A
LO LARGO DEL GENOMA
Para la interpretación funcional de los resultados de la genómica y epigenómica, se han
desarrollado abordajes cada vez más refinados, que requirién la integración de información
de diferentes campos de la biología,con recursos computacionales, diseños estadísticos
matemáticos complejos y, como en cualquier área del conocimiento, de una interesante
pregunta de investigación. Esto es válido en general para los experimentos que evalúan la
totalidad del genoma humano (Pleasants et al., 2015).
Múltiples trabajos y legitimaciones exitosas de «ensayo de principio» o «proof-of-principle»
(Chesler et al., 2005; Geschwind & Konopka, 2009; Solomon et al., 2014) han demostrado
la utilidad de la genómica para el avance de la biomedicina de las enfermedades
neurodegenerativas y otras enfermedades. Sin aminorar la importancia de las
investigaciones establecidas en hipótesis únicas, hoy es clara la validez de investigaciones
que basándose en métodos «omics-based» o «discovery-based» (numeral 0, Página 22)
resuelven interrogantes a escala genómica y realizan descubrimientos de perfiles en todos
los genes del genoma que en muchos casos generan nuevos aportes que pasan a ser
evaluables en investigación biomédica traslacional (Y. Nishimura et al., 2007; Solomon et
al., 2014).
14
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Lo mencionado arriba ha ampliado la comprensión de lo que se conoce como posible de
realizar en investigación biomédica, pues la genómica, al igual que otras disciplinas
científicas, conocidas como «discovery-based-disciplines», tiene abordajes que se
diferencian de los utilizados por la mayoría de disciplinas de la biología habituadas a
abordajes típicamente reduccionistas que son requeridos y valiosos, en los estudios que
se ciñen a una única hipótesis (Geschwind & Konopka, 2009).
Estas disciplinas han demostrado la capacidad de aportar a las neurociencias humanas
con trabajos que han permitido parte de la identificación de las bases moleculares de la
diversidad neuronal y la sinaptogénesis (D. O. Wang, Martin, & Zukin, 2010), de
biomarcadores en enfermedades neurológicas (Geschwind & Konopka, 2009), así como
de sus vías patogénicas (Parikshak et al., 2013). Conjuntamente, se ha logrado el
desarrollo de repositorios de bases de datos públicas, con el beneficio de una política de
liberación de datos genómicos (Barrett et al., 2009; Shen, Overly, & Jones, 2012).
La política mencionada exige a los investigadores con diferentes tipos de trabajos a nivel
de genoma humano, el registro de sus datos crudos en bases de datos libremente
disponibles (Barrett et al., 2009). Gracias a dicha política se ha podido observar como el
aporte realizado en un trabajo puede ser trascendido por nuevas investigaciones capaces
de realizar análisis más interesantes usando una o varias bases de datos disponibles (L.
C. Chang, Lin, Sibille, & Tseng, 2013; Geschwind & Konopka, 2009); por tanto, en la
actualidad un reto fundamental en el área es el aprovechamiento de los datos disponibles
para realizar análisis originales para generar nuevos e importantes aportes.
El Proyecto Bioconductor (Gentleman et al., 2004), lidera la tendencia actual de creación
colaborativa de «software» de tipo extensible, para análisis de biología computacional y
bioinformática. El mencionado proyecto se generó en el entorno de programación y
estadística de código abierto R-Project (Team, 2014) y ha permitido el rápido desarrollo de
herramientas bioinformáticas de código abierto para análisis de alto rendimiento o «highthroughput análisis» (Gentleman et al., 2004; Huber et al., 2015).
La Interfaz de R-Bioconductor requiere un manejo total por línea de comandos y está lejos
de ser un entorno sencillo e intuitivo; sin embargo, tiene un sistema muy estructurado con
herramientas estandarizadas de instrucción («workflows», «package vignettes», «function
manual», etc.) de forma que permite realizar un aprendizaje asistido efectivo en este
MARCO TEÓRICO
15
entorno de programación, haciendo probable el establecimiento de mejoras por sus
usuarios; citando textualmente palabras de las autoridades del tema «In many cases, users
ultimately become developers, making their own algorithms and approaches available to
others» (Huber et al., 2015).
En la interpretación de hallazgos de estudios a nivel de genoma amplio, se utilizan en
general tres grupos grandes de metodologías. Estas metodologías se usan casi siempre
realizando diferentes combinaciones entre sí; pero en aras de la claridad, se mencionan a
continuación de forma separada. Este tipo de abordajes permite responder grandes
preguntas, integrar datos de diversos estudios incluso de distintos tipos de ciencias
«omicas» y pueden revelar interacciones no conocidas (Parikshak et al., 2013).
Adicionalmente tienen la posibilidad de aportar modelos teóricos que se conviertan en
importantes hipótesis de la patogenia de una enfermedad (Wingo & Gibson, 2015).
En primer lugar, dentro de la interpretación de este tipo de trabajos se realiza un «análisis
por enriquecimiento en grupos funcionales». Dicho análisis consiste en la comparación del
enriquecimiento de los genes encontrados diferencialmente metilados o expresados en la
condición de interés, dentro de un conjunto de genes pertenecientes a un «módulo
funcional» definido por diferentes tipos de anotaciones bioinformáticas a nivel de genoma
completo (Alonso et al., 2015).
En dichas búsquedas de enriquecimiento funcional, se utilizan anotaciones de módulos
funcionales de diferentes bases de datos curadas para identificar funciones que se
encuentren alteradas en la condición estudiada. En este proceso se utiliza por ejemplo
información sobre regulación génica (Matys et al., 2006), interacciones proteicas (Hunter
et al., 2012), la referente a vías moleculares de KEGG pathway Database (J. Du et al.,
2014), de vías moleculares de Biocarta (Alonso et al., 2015; D. Nishimura, 2001) y de los
módulos del consorcio «Gene Ontology», que corresponde a una iniciativa de
estandarización de nomenclatura para «procesos biológicos», «funciones moleculares» y
«localización subcelular» (Consortium, 2015).
Asimismo, es posible realizar construcción de redes de interacción en integración con
información de vías anotadas, interacciones proteicas e incluyendo datos de otros perfiles
moleculares. De esta forma se evalúa mediante un análisis «Minimum Connected Network»
16
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
(MCN), el comportamiento cooperativo de la lista de genes como un «módulo funcional»
similar a los de análisis de enriquecimiento. En dicho abordaje se valora la topología de la
red de una lista de resultados encontrados mediante una comparación de la distribución de
los nodos encontrados en la red de interés, contra listas aleatorias de igual tamaño. Es en
realidad una variación del método de análisis de enriquecimiento que permite examinar la
conectividad indirecta de los resultados más destacados de un estudio, mediada por otras
moléculas no presentes en los resultados (Minguez, Gotz, Montaner, Al-Shahrour, &
Dopazo, 2009).
En segundo lugar, se encuentran los análisis de coexpresión génica que requieren evaluar
la expresión conjunta de genes a lo largo de un número de muestras, por ejemplo a lo largo
de diferentes localizaciones cerebrales; esto permite identificar una posible pérdida de
coexpresión en una muestra o condición de interés (Coppola, 2014). Dentro de los análisis
de coexpresión se encuentran diferentes métodos encaminados hacia la reducción
dimensional mediante la búsqueda de datos correspondientes a genes de características
y comportamientos similares (de la Fuente, 2010). Este abordaje se basa en el supuesto
de que genes coexpresados estarían corregulados (Coppola, 2014), lo cual depende de
que realmente exista o no relación regulatoria entre ellos (Dehmer & Emmert-Streib, 2008).
De forma análoga, se ha reportado co-metilación de ADN estudiando la correlación de
genes metilados en un número de muestras (Akulenko & Helms, 2013); en el presente
trabajo, la noción de «co-metilación» de ADN se aborda en el hecho conocido de la
correlación que existe entre la metilación de varias CpG, en relación a su proximidad
genómica, lo cual se direccionó en los análisis de metilación de ADN regional realizados y
evaluados mediante el paquete informático «DMRcate» (Martin, Yet, Tsai, & Bell, 2015;
Peters et al., 2015).
En tercer lugar, se encuentran los análisis por priorización génica bioinformática
(Rappaport et al., 2014; Schuierer, Tranchevent, Dengler, & Moreau, 2010). La priorización
génica bioinformática, consiste en la selección de los genes candidatos relacionables
con una enfermedad, a partir de una lista de genes con «hallazgos positivos», que
pueden contrastarse con una lista de genes de causalidad conocida con una
enfermedad -o bien «palabras clave» relacionadas con dicha enfermedad- (Rappaport
MARCO TEÓRICO
17
et al., 2014); estos análisis se basan en evidencia de bases de estudios de expresión
génica, interacciones proteicas, regulación en cis, factores de transcripción,
anotaciones funcionales KEEG y literatura científica (Aerts et al., 2006; Cantor, Lange,
& Sinsheimer, 2010; Rappaport et al., 2014; Tranchevent et al., 2008).
Una gran cantidad de metodologías derivadas han sido diseñadas para análisis diferencial.
Por ejemplo, se adoptó simultáneamente, análisis de coexpresión, de interacciones
proteicas y una carga de genes mutados en desordenes del neurodesarrollo (autismo),
combinándolos en una red integrada (Hormozdiari, Penn, Borenstein, & Eichler, 2015).
Asimismo, es posible realizar un análisis de regresión logística ponderando las diferencias
de acuerdo a su medición numérica (Sartor, Leikauf, & Medvedovic, 2009) y también una
construcción de redes ponderadas de co-expresión génica (Langfelder & Horvath, 2008).
Dentro de los aspectos más importantes en estos estudios, está la selección de un punto
de significancia adecuado para las diferencias detectadas, esto teniendo en cuenta la gran
cantidad de evaluaciones experimentales simultaneas realizadas; para esta selección
existen diferentes abordajes estadísticos (Assennato & Bruzzi, 2002; Benjamini & Yekutieli,
2001). Sin embargo, la forma más utilizada para estudios a nivel genómico es la corrección
de Benjamini & Hochberg que permite obtener un mejor poder estadístico (Benjamini &
Hochberg, 1995). De igual forma, para enriquecer estos análisis se requiere considerar que
la variabilidad técnica, es menor a la variabilidad biológica, por lo que es crítico tener un
número adecuado de réplicas biológicas, más que emplear los recursos disponibles en
replicas técnicas (Y. Liu, Zhou, & White, 2014; Rapaport et al., 2013; Robles et al., 2012).
CONCEPTOS DE LA EPIGÉNETICA Y DE LA METILACIÓN DEL
ADN
Inicialmente, en 1942 se planteó una definición de epigenética centrada en la importancia
del estado de cromatina sobre el fenotipo (Waddington, 2012) «The causal interactions
between genes and their products, which bring the phenotype into being». La definición que
fue más conocida consiste en que los «cambios epigenéticos», son cambios en los
cromosomas, sin transformaciones en la secuencia del ADN que por definición pueden
heredarse, permitiendo la transmisión de un fenotipo a través de la división celular
(Morange, 2002).
18
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Actualmente se considera que la definición debe corregirse ligeramente así «The structural
adaptation of chromosomal regions so as to register, signal or perpetuate altered activity
states», teniendo en cuenta que las modificaciones que transforman la función de la
cromatina, no necesariamente son transmisibles a células hijas pues se incluye a las
células post-mitóticas en donde tales modificaciones, son de total importancia (Bird, 2007).
En la actualidad, se reconocen cuatro «principales mecanismos epigenéticos» que rigen
los patrones de expresión a saber, la metilación del ADN, las modificaciones covalentes de
las proteínas histonas, los complejos de remodelación nuclear y los microRNAs (Bernstein
et al., 2012). Dada el área específica del presente documento, este revisa sólo los
componentes relacionados directamente con la metilación del ADN aunque en muchos
casos se deben considerar y se incluyen en este texto, aspectos lindantes con los otros
principales mecanismos epigenéticos.
La metilación del ADN, uno de los principales mecanismos epigenéticos reguladores de la
expresión génica, consiste en la adición covalente de un grupo químico metilo (CH3), al
carbono 5 del anillo pirimidímico de los nucleótidos de Citosina (C) del ADN, sin alterar la
secuencia de nucleótidos. En los mamíferos adultos, la metilación de ADN se encuentra
predominantemente en las citosinas de secuencias dinucleotídicas 5' citosina –enlace
fosfodiéster–Guanina 3', conocidas como CpG. Esta modificación covalente en general
lleva a disminución de la expresión génica, aunque en ciertos casos puede aumentarla con
mayor frecuencia cuando se encuentra en el cuerpo de los genes (Lashley et al., 2015).
ISLAS CPG, ORILLAS Y REGIONES PROMOTORAS
Las secuencias nucleotídicas CpG son evolutivamente escasas en el genoma, de hecho,
hay 5 veces menos CpG que lo que se podría predecir por azar (Antequera, 2003), sin
embargo, las secuencias CpG se concentran en zonas que son conocidas como «Islas
CpG», las cuales se encuentran localizadas más frecuentemente hacia las regiones 5’ de
los sitios de inicio de la transcripción de los genes (Bernstein et al., 2012). Las islas CpGs
se definen como regiones en las que hay una cantidad importante de citosina y guanina
enlazados por fosfatos (CpG) donde se observa un contenido CpG mayor a 50% y una tasa
de CpG observadas sobre esperadas mayor a 0.6 (Gardiner-Garden & Frommer, 1987).
MARCO TEÓRICO
19
Las «Orillas de islas CpG», son las regiones genómicas que rodean las islas CpG tanto 2
kb «corriente arriba» como 2 kb «corriente abajo»; las cuales se encontraron como
regiones regulatorias más trascendentes que lo sospechado, relacionándose de una forma
incluso más importante que las mismas islas CpG, tanto con estados patológicos, como
con diferencias tisulares y con expresión génica (Irizarry et al., 2009; Kim et al., 2014).
Recientemente se encontró la correlación de la metilación de ADN en vecindad de ~2kb de
los Sitios de Inicio de Transcripción (SIT), con represión transcripcional -e incluso de forma
más clara corriente abajo de los SIT– lo que generalmente involucra el primer exón. Esta
correlación mostró ser mucho más importante que en las regiones tradicionalmente
consideradas como «promotoras», contrariando el pensamiento clásicamente aceptado
(Brenet et al., 2011; Rhee et al., 2013).
MANTENIMIENTO E INSTAURACIÓN DE LA METILACIÓN DE ADN
Los patrones de metilación son mantenidos fisiológicamente por enzimas DNAmetiltransferasas (DNMTs), cuya acción es adicionar un grupo metilo en la posición 5 del
anillo pirimidímico de la citosina (Day, Kennedy, & Sweatt, 2015). El mantenimiento del
estado de metilación del ADN es una función presente en células en división y en células
postmitóticas, que provee un grado de estabilidad a los patrones de metilación del ADN.
En la división celular, este mantenimiento está a cargo de la enzima DNA-metiltransferasa
1 (DNMT1) y una supresión de dicha enzima lleva a una pérdida de la metilación por un
mecanismo conocido como desmetilación pasiva (H. Wu & Zhang, 2014).
La DNMT1 reconoce moléculas de doble cadena de ADN, hemimetiladas, es decir, donde
sólo una de las dos cadenas complementarias presenta metilación en el carbono 5 de la
citosina del CpG, lo cual sucede normalmente en el proceso de la replicación del ADN.
Esto hace que los patrones de metilación tengan estabilidad a través de la división celular
y que las secuencias CpG -las cuales son palindrómicas- en las dos hebras de la doble
hélice, estén metiladas equivalentemente en condiciones normales (S. C. Wu & Zhang,
2010). La DNMT3A y la DNMT3B se encargan de la metilación «de novo» y del
mantenimiento de los patrones de metilación (Klose & Bird, 2006). Asimismo, la clase
DNMT3 tiene como una de sus funciones, una actividad metilasa de mantenimiento capaz
20
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
de compensar la función de la DNMT1 en células postmitóticas (H. Wu & Zhang, 2014).
Además, un estudio reveló que la DNMT3B puede unir al ADN de forma independiente a
S-Adenosil-metionina (SAM) (Moarefi & Chedin, 2011). La forma exacta con la que la
DNMT3A y la DNMT3B se unen al ADN no ha sido totalmente elucidada. Sin embargo, en
diferentes contextos se reconoce una selectividad en la producción de metilación de ADN
en locus específicos (Steine et al., 2011; H. Wu & Zhang, 2014).
Un mecanismo epigenético principal, altamente relacionado con la metilación del ADN es
el que se produce con las modificaciones covalentes de las proteínas histonas. El
nucleosoma, se compone de 8 proteínas histonas, el cual tiene un par de copias de cada
una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 que constituyen una unidad junto con el fragmento
de 147 pares de bases (pb) de ADN que las envuelve (Rose & Klose, 2014). De forma
redundante, se observa la presencia de un sistema para adecuar el «código de histonas»
a los «patrones de metilación» y, a su vez, un sistema donde las histonas ayudan a
establecer los patrones de metilación, mostrando una estrecha relación bidireccional (Rose
& Klose, 2014). Por ejemplo, se ha observado a nivel genómico que la metilación de ADN
tiene una relación inversa con modificación de histonas H3K4me3 y una relación directa
con H3K4me0 (Otani et al., 2009) y se conoce que las islas CpG no metiladas pueden
actuar como patrón epigenético, llevando a la trimetilación de H3K4 y de H3K27, así como
excluir a H3K36 (Simon & Kingston, 2013), posiblemente creando ambientes cromáticos
únicos
para
elementos
regulatorios
que
sean
capaces
de
modular
estados
transcripcionales (Rose & Klose, 2014).
MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA METILACIÓN DE ADN
La metilación del ADN regula la expresión génica mediante diferentes mecanismos
moleculares uno de ellos es su capacidad de impedir la unión de factores de transcripción
e influenciar directamente el plegamiento de la cromatina (Day et al., 2015). Otro de los
mecanismos es el reclutamiento de las proteínas con dominio de unión a metil-CpG
(MBDs), las cuales unen ADN reconociendo secuencias CpG de acuerdo con su estado de
metilación. El ADN metilado unido a las MBDs pueden reclutar histona desacetilasas
(HDACs), lo cual genera cambios en la estructura cromática local (Day et al., 2015). Por
tanto, varios miembros de la familia MBD -incluyendo MBD1(a veces llamado CXXC3) -
MARCO TEÓRICO
21
ostentan un papel en el mencionado mecanismo que parte de la metilación en CpGs, para
orquestar los perfiles de la expresión génica (Q. Du, Luu, Stirzaker, & Clark, 2015).
Asimismo, las islas CpG no metiladas generan cambios en la estructura de la cromatina
que favorecen la expresión génica, reclutan la proteína 1 con dedos de zinc CXXC (CXXC1)
la cual es activadora transcripcional, se une específicamente a CpGs no metilados y se
asocia a una enzima histona-metiltransferasa, favoreciendo la generación de trimetilación
H3K4 (Xu, Bian, Lam, Dong, & Min, 2011). Conjuntamente, se ha encontrado que el cerebro
es especialmente susceptible a verse afectado por fallas en la maquinaria epigenética
(Portela & Esteller, 2010; H. Wu & Zhang, 2014).
Además, recientemente se conoce que el mantenimiento de la metilación de ADN a través
de la replicación involucra dos proteínas que acompañan a la DNMT1 que son PCNA Y
Uhrf1, importantes para flanquear y coordinar esa actividad a través de la modificación de
histonas. Además, se ha demostrado que las histonas demetilasas KDM2A (también
conocida como CXXC8) y KDM2B (también conocida como CXXC2) son reclutadas mediante sus dominios de dedos de zinc- hacia la cromatina de las islas CpG, donde llevan
la remoción de H3K36me2 (Rose & Klose, 2014). Cabe aclarar que las interacciones entre
las modificaciones de histonas y la metilación de ADN encontradas en un contexto, no son
fácilmente extrapolables a otro, por lo que pese a su relación recíproca, lo encontrado en
los modelos, se limita a un contexto muy específico (Rose & Klose, 2014).
Aunque la metilación del ADN puede permanecer estable en condiciones fisiológicas,
incluso a través de la división celular, permitiendo heredar la regulación génica a una célula
hija, esta estabilidad es plástica y puede representar marcas debidas a fenómenos
externos. Esto produce muy posiblemente estados alterados de regulación genética, con
repercusiones en la fisiopatogenia de una enfermedad neurodegenerativa (Day et al., 2015;
Fitzsimons et al., 2014; J. Wang, Yu, Tan, Jiang, & Tan, 2013).
22
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA METILACIÓN DE ADN A NIVEL
GENÓMICO - EPIGENÓMICA COMPUTACIONAL
De la misma forma que ocurre con las técnicas más utilizadas para estudiar la metilación
de ADN en un locus de forma separada (Hernandez, Tse, Pang, Arboleda, & Forero, 2013),
las técnicas de alta producción de datos de metilación de ADN tienen un paso común que
se conoce como «conversión de bisulfito». Este proceso que hace posible diferenciar entre
el ADN metilado y el ADN no metilado, produce una modificación química de la secuencia
de ADN que de forma selectiva transforma cada citosina del ADN no metilado, en uracilo,
pero dicha «conversión» no ocurre si la citosina está metilada (Ilustración 1).
Ilustración 1. Ilustración del resultado del proceso químico de «conversión por bisulfito» del ADN. Arriba,
«conversión» de una secuencia de ADN metilada. Abajo «conversión» de igual secuencia no metilada. En lo
sitios CpG las citosinas metiladas no presentan ningún cambio en la secuencia nucleotídica (arriba, de izquierda
a derecha); mientras que las citosinas no metiladas si presentan una transformación de citosina a uracilo (abajo
a la derecha -U en color rojo-). Las citosinas que están por fuera de las secuencias CpG, no presentan
metilación, por lo tanto, luego de tratamiento con bisulfito estas «citosinas no CpG» deben en cualquier caso
convertirse en uracilos (a la derecha tanto en la parte superior como en la inferior -U en color celeste-). Gráfica
elaborada por autor de la presente tesis (Capítulo 5) para uno de los artículos que hace parte del presente
trabajo (Hernandez et al., 2013).
La revisión y discusión de las técnicas de metilación de ADN para estudiar un locus sencillo
se presenta en el artículo científico que se anexa al capítulo 5 del presente documento. Por
otro lado, dentro de los estudios de metilación de ADN, las diversas técnicas que ofrecen
una alta producción de resultados a nivel genómico están conformadas por las de
secuenciación de nueva generación -posterior a «conversión de bisulfito»- y aquellas que
utilizan microarreglos para estudiar la metilación del ADN a nivel de todos los genes del
genoma.
MARCO TEÓRICO
23
En la actualidad, la plataforma más utilizada para estudios de metilación de ADN a nivel de
genoma humano es el «Infinium DNA methylation 450K», debido a su relativo bajo costo
en relación a la alta resolución de la información que provee, y a que no se limita a islas
CpG, sino que evalúa las «Orillas de islas CpG» correspondientes a lo largo de todos los
genes del genoma humano; su química se conforma de dos tipos de diseño. El diseño de
sondas de hibridación iniciales «illumina tipo 1», estaba implementado desde la plataforma
antigua Infinium DNA Methylation 27K y consiste en que para cada CpG se asignan dos
microesferas, una con una sonda fluoromarcada con Cy3, específica de ADN metilado, y
otra con una sonda marcada con Cy5, específica de ADN no metilado. De esta forma, el
color verde corresponde a la señal de hibridación para ADN metilado y el rojo a la señal de
hibridación de ADN no metilado (Dedeurwaerder et al., 2011; Sandoval et al., 2011).
Por el contrario, el diseño de las sondas tipo 2, que enriquecen la nueva plataforma, consta
de una «microesfera» única por locus, con un único tipo de sonda en la que luego de la
hibridación –de la misma clase de sonda-, tanto al ADN metilado, como al no metilado se
produce una reacción de extensión de nucleótido sencillo con nucleótidos fluoromarcados.
Los nucleótidos correspondientes a ADN metilado (C y G) son marcados con Cy3 y los
correspondientes a ADN no metilado (A y T), son marcados con Cy5. De esta forma,
agregando el segundo tipo de química en el «Infinium DNA methylation 450K», se logró
incrementar la cobertura masivamente en comparación con su predecesor (incremento de
cubrimiento ~2000%), pero con el reto técnico de usar dos tipos de química diferentes de
forma simultanea (Dedeurwaerder et al., 2011; Sandoval et al., 2011).
Alternativamente, existen en la actualidad abordajes de metilación de ADN por
secuenciación de «nueva generación» que incluyen principalmente la secuenciación
postbisulfito de representación reducida, la secuenciación postbisulfito de «methyl capture
sequencing «SS-Meth Seq», «MethSeq NimbleGen» y «Methylated DNA ImmunoPrecipitation (MeDIP)» (Walker et al., 2015). Dichas opciones mapean también ciertos
locus a lo largo del genoma y pueden cubrir también todos los genes del genoma (GarrettBakelman et al., 2015). Sin embargo, presentan un costo considerablemente más alto que
los microarreglos de alta definición Infinium DNA Methylation 450K (Walker et al., 2015) y
por tanto, el uso de métodos de secuenciación permitiría evaluar un número mucho menor
de muestras que las estudiadas con dicho microarreglos (Roessler et al., 2012).
24
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
En resumen, mediante los abordajes de microarreglos de alta definición o de secuenciación
reducida en plataformas de nueva generación, es posible evaluar los patrones de
metilación diferencial de ADN, cubriendo una parte representativa de la totalidad de las
secuencias CpG humanas a lo largo del genoma (L. Q. Wang & Chim, 2015). Asimismo,
los microarreglos de metilación de ADN Infinium DNA Methylation 450K, han sido validados
y convalidados en múltiples trabajos, con resultados por técnicas basadas en
secuenciación que se encuentran correlacionando con un r2 de alrededor de 96% a 99%,
lo que determina su confiabilidad cruzada (Dedeurwaerder et al., 2011; Laurent et al., 2010;
Roessler et al., 2012; Sandoval et al., 2011; L. Q. Wang & Chim, 2015).
Existen a «groso modo» dos sistemas para realizar el análisis de los millones de resultados
de los microarreglos Infinium DNA Methylation 450K; uno de ellos es el uso simple del
«software propietario» GenomeStudio (Illumina, ink) el cual ofrece un procesamiento y
análisis muy básico, sin embargo, carece de un abordaje para tratar el mencionado reto
técnico de tener dos tipos de química en un solo microarreglo (Maksimovic, Gordon, &
Oshlack, 2012). El mencionado «software» tiene una Interfaz gráfica amigable pero
igualmente carece de la versatilidad requerida para realizar los análisis estadísticos
adecuados, que son posibles por línea de comandos en la plataforma R (Aryee et al., 2014).
El segundo modo de realizar el análisis de los datos generados es mediante el uso de
codificación en entorno de programación de R-Bioconductor (Gentleman et al., 2004). En
tal plataforma computacional existe la disponibilidad de abordajes más adecuados
mediante el uso de funciones de paquetes por línea de comandos, tales como la
normalización de SWAN (Maksimovic et al., 2012) y la normalización de BMIQ
(Teschendorff et al., 2013), capaces de resolver el reto técnico mencionado separando las
señales correspondientes a tipos de química diferentes, para procesamientos separados.
Así mismo, para el análisis subsiguiente de metilación diferencial, existen diferentes
opciones entre ellas la función «dmpFinder» de minfi la cual permitiría realizar una
comparación de dos grupos mediante «la prueba t de Student». Otra posibilidad, es el uso
del paquete limma para modelamiento lineal disponible en la plataforma Bioconductor
(Smyth, 2005), el cual debido a su funcionalidad es veinticinco veces más usado para
análisis de metilación diferencial, que «dmpFinder» -conteo de citaciones en «Google
Scholar»- (Breuer & Bowen, 2014). El paquete limma, permite corregir de forma confiable
MARCO TEÓRICO
25
la metilación diferencial atribuible a covariables como la edad, que si no se incluyesen en
el modelo, serían problemáticas para este tipo de estudios de metiloma (Smyth, 2005).
Adicionalmente, la iniciativa R-Bioconductor ha permitido el surgimiento de codificación de
paquetes especializados en análisis de regiones DMR. Análogamente a los DMP, se
encuentra la función «Bumphunter» del paquete minfi y una alternativa basada en limma
dada por el paquete DMRcate (Aryee et al., 2014; Peters et al., 2015). Recientemente, se
encuentra disponible el paquete «coMET» (Martin et al., 2015), el cual sirve para valorar y
visualizar «co-metilación» dentro de las regiones DMR que sean identificadas. Estos
abordajes evalúan los CpG que al encontrarse de forma adyacente, dan un mayor soporte
a una región diferencialmente metilada (DMR), que un CpG encontrado de forma aislada.
Especificaciones más detalladas de los paquetes y funciones utilizados en el presente
trabajo, se encontrarán en la sección de métodos pertinente del presente documento.
METILACIÓN DE ADN, EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, SU
PAPEL EN LA MEMORIA Y EN LA NEURODEGENERACIÓN
El síntoma más perceptible de la EA está dado por la pérdida de la memoria y se ha
demostrado que existe un papel de la metilación del ADN en la memoria a largo plazo y
una posible alteración en el hipocampo en EA explicaría conjeturalmente el síntoma clínico
inicial de esta enfermedad (Miller, Campbell, & Sweatt, 2008); al respecto se encontró que
el bloqueo de DNMT, enzima responsable de la metilación del DNA, bloquea la formación
de memoria comportamental, en ratas adultas (Miller et al., 2008).
Igualmente, en un estudio de KO de MBD1 en modelo murino, se evidenció un papel
funcional de la metilación de DNA en neurogénesis y neurodegeneración, se encontró que
la ausencia total de MBD1, deteriora la diferenciación neuronal presente trastornando la
neurogénesis, en ratones adultos (X. Zhao et al., 2003). Asimismo, otro indicio de la posible
existencia de patrones de metilación claves en EA fue que una metilación y desmetilación
activa del ADN puede ocurrir en un gen, e incluso en un sitio CpG específico, en tipos
celulares específicos; por ejemplo, en el contexto de neuronas hipocampales, claramente
postmitóticas, el factor de crecimiento inducible por la proteína A, produce desmetilación
26
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
activa específica del gen del receptor de glucocorticoide (H. Wu & Zhang, 2014; S. C. Wu
& Zhang, 2010).
De forma interesante, las especies reactivas de oxigeno (ROS) pueden interactuar con la
vía de metilación de ADN a través de oxidación de la guanina de los dinucleótidos CpG
llevando a reducción de su afinidad a MBD (Day et al., 2015; Zawia, Lahiri, & CardozoPelaez, 2009). Por todo lo mencionado arriba, considerando el papel de la epigenética en
específico de la metilación de DNA para una correcta neurogénesis, se especuló de forma
anticipada que la metilación de ADN fuera importante en EA (Allan et al., 2008).
Por otro lado, una de las proteínas de unión a CpG (MeCP2) es altamente expresada en
neuronas y actúa como represor transcripcional uniéndose a genes metilados. La MeCP2
es capaz de inhibir la diferenciación de los astrocitos y de promover la diferenciación
neuronal (Tsujimura, Abematsu, Kohyama, Namihira, & Nakashima, 2009). Formas
mutantes de MeCP2 comprometen su función de inducir maduración neuronal y
diferenciación neuronal y pacientes con dichas mutaciones padecen del Síndrome de Rett.
También cabe mencionar, que desde el punto de vista nutricional, la vitamina B12
normalmente interviene en el «metabolismo de carbono sencillo», sirviendo como sustrato
indirecto para la metilación del ADN. En este sentido, una depleción sustancial de vitamina
B12, cambiaría la dirección de la reacción catalizada por las DNMT y tendería a producir
una reacción de desmetilación (Chmurzynska, 2010). Se sabe que el metabolismo de un
carbono ejerce influencia sobre algunas vías de biosíntesis, incluyendo la metilación del
DNA (Fuso & Scarpa, 2011). Adicionalmente, los pacientes con EA muestran desregulación
en el ciclo S-adenosil-metionina requerido para la regulación epigenética vía metilación de
DNA, como indican las alteraciones encontradas en algunos de los pacientes con EA donde
se encuentra hiperhomocisteinemia y depleción de niveles de folato en sangre(Fuso, 2013).
De forma interesante se encontró importancia epigenética de la metilación de DNA en la
isla CpG de APOE –en su exón 3- la cual presenta actividad reguladora dual
silenciadora/potenciadora (C.-E. Yu et al., 2013). Dicha región corresponde a los
polimorfismos ɛ2/ɛ3/ɛ4 y su metilación influencia principalmente la expresión de APOE
como «enhancer» y la expresión de TOMM40 como regulador dual, independientemente
MARCO TEÓRICO
27
de los polimorfismos genéticos y da importancia a evaluar la metilación de ADN en EA (C.E. Yu et al., 2013).
Sin embargo, debido al vacío del conocimiento sobre los patrones de metilación de ADN a
nivel genómico en EA, se hizo importante abordar ese reto en el presente trabajo. Varios
trabajos centrados en metilación de ADN de promotores canónicos individuales en tejido
cerebral de EA que estudiaron islas CpG, no encontraron ningún hallazgo positivo
(Barrachina & Ferrer, 2009; Brohede, Rinde, Winblad, & Graff, 2010; Furuya et al., 2012;
P. N. Silva et al., 2013). Por ejemplo, en cerebros con EA se evaluó el estado de metilación
del ADN en promotores de 4 genes, dos relacionados con la vía del metabolismo de APP
y dos relacionados con la vía de fosforilación de la proteína Tau (Barrachina & Ferrer,
2009). Sin embargo, los autores de dicho trabajo discutieron que el uso futuro de un
abordaje como la microdisección láser pudiera traer resultados no observables por la
evaluación de homogenados totales de regiones cerebrales (Barrachina & Ferrer, 2009).
En dos estudios encontraron resultados singularmente interesantes. El primero estudió la
metilación del ADN de 12 genes o bien genéticamente asociados a EA, o que
correspondían a proteínas de la maquinaria de la metilación del ADN. De forma destacada
se encontró un CpG de DNMT1, codificado como «DNMT1 CpG 10» que claramente se
trataba del CpG mayor soportado estadísticamente (valor p ~ 0.01) y presentaba además
el mayor cambio hacia la hipermetilación en ese estudio (delta de metilación ~ 0.06), cabe
mencionar que en dicho trabajo no se realizó corrección estadística pruebas múltiples a
pesar de que fueron evaluados en total 123 CpG y que los otros CpG encontrados
diferencialmente metilados podrían no superar dicha corrección estadística (S. C. Wang,
Oelze, & Schumacher, 2008).
El otro estudio con resultados interesantes, evalúo genes relacionados con plasticidad
neuronal en corteza frontal -que no tenían evidencia de variaciones genéticas asociadas a
la EA- en el cual se encontró de forma destacada un aumento de metilación de ADN en los
genes CREB1 y sinaptofisina (Rao, Keleshian, Klein, & Rapoport, 2012). Al respecto, se
conoce que las mutaciones en el gen de la proteína de unión a CREB, originan una
alteración del neurodesarrollo produciendo el síndrome de Rubinstein-Taybi (Rudenko &
Tsai, 2014) y recientemente se encontró que una depleción de CREB1 en un modelo de
28
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
memoria en Aplisia (del orden Opisthobranchia), genera disrupción de la consolidación de
la memoria restaurable por entrenamiento (Zhou et al., 2015)
1.
A finales de 2012, fue publicado el primer estudio sobre metilación de ADN en EA en
genoma amplio con una muestra de doce (12) pacientes con EA y doce (12) controles,
usando un microarreglo inicial de ilumina «Infinium DNA Methylation 27K», limitado a 27
mil sondas, en el cual se escogió estudiar homogenados de corteza frontal, encontrando
cambios modestos en algunos promotores (Bakulski et al., 2012). Cabe recordar que dicho
microarreglo Infinium DNA Methylation 27K mide alrededor del 5% de las posiciones
genómicas evaluadas por la plataforma de alta definición Infinium DNA methylation 450K.
De forma casi simultánea con lo mencionado arriba, se reportó metilación diferencial, hacia
hipermetilación en algunos promotores génicos de dos modelos diferentes de EAMF, el
doble mutante APP/PSEN1 y el triple mutante 3xTg (Sanchez-Mut et al., 2013). Asimismo,
varias investigaciones recientes indicaron que las diferencias de metilación en EA se deben
a cambios en regiones genómicas específicas, en lugar de cambios indiscriminados, dando
importancia a la evaluación específica con alto cubrimiento epigenómico (Hernandez,
Mahecha, Mejia, Arboleda, & Forero, 2014; Lashley et al., 2015; Sanchez-Mut et al., 2013).
Por lo mencionado anteriormente, se planteó la necesidad de realizar estudios
epigenómicos que pudieran capturar los patrones de metilación de ADN en EA de una
forma estadísticamente más poderosa y con mucha más alta definición en cuanto al
cubrimiento de los CpG estudiados.
El estudio a nivel genómico de la metilación de ADN en EA es un campo naciente y de
investigación de frontera. De hecho, los últimos meses se han publicado 3 estudios con la
nueva plataforma de Ilumina, Infinium DNA methylation 450K que evalúa más de 480.000
(cuatrocientos ochenta mil) posiciones/sondas, mapeando con mucha mejor resolución la
metilación del epigenoma humano del cerebro con EA (De Jager et al., 2014; Humphries
et al., 2015; Lunnon et al., 2014). Los 3 trabajos citados fueron realizados con millonarios
esfuerzos económicos de múltiples instituciones y obtuvieron interesantes resultados.
De Jager y colaboradores (De Jager et al., 2014), estudiaron la metilación de ADN de EA
en corteza frontal encontrando los hallazgos más prominentes publicados hasta hoy en
relación con la metilación de ADN en EA; en dicho trabajo se reportaron 71 locus
MARCO TEÓRICO
29
destacados diferencialmente metilados en su gran mayoría hacia hipermetilación,
correspondientes al mismo número de CpG. Entre los genes reportados por dicho estudio
se encuentra ANK1. De forma simultánea, en la misma edición de la revista Nature
Neuroscience, se publicó un segundo estudio -de forma colaborativa con PL De Jager(Lunnon et al., 2014), el cual reportó una alteración también en ANK1 hacia la
hipermetilación en la corteza temporal y entorrinal en concordancia con el primer estudio.
Muy recientemente, un tercer trabajo (Humphries et al., 2015) realizó un análisis de redes
de interacción de transcriptoma usando datos de RNAseq, y de metiloma usando Infinium
DNA methylation 450K estudiando corteza temporal. En dicho trabajo se encontró en el
análisis de redes transcripcionales con metilación diferencial específica de EA, a un módulo
funcional relacionado con la ontología de mielinización axonal (axon ensheathment,
GO:0042553) dentro del cual se encuentra destacadamente el gen FRMD4B. Dicho estudio
contó con 10 muestras por grupo.
Recientemente se publicó otro interesante trabajo usando la misma plataforma Infinium
DNA methylation 450k (L. Yu et al., 2015), sin embargo, no se puede considerar un «estudio
a nivel de genoma amplio» pues consideró sólo un conjunto de genes correspondientes a
28 loci conocidos asociados genéticamente con EA. Dicho trabajo se realizó también con
coautoría de PL De Jager estudiando cohortes usadas en trabajos anteriores, encontró
resultados particularmente de aumento de metilación, en relación con la patología de EA
en los genes BIN1, SORL1, ABCA7, HLA-DRB5 y SLC24A4. Pese a que en el citado
estudio se reporta una modesta concordancia con expresión transcripcional (L. Yu et al.,
2015), esto podría deberse a un intervalo postmorten por encima de lo óptimo para los
estudios transcripcionales, el cual es mucho más estricto que el requerido para trabajos de
metilación de AD (Birdsill et al., 2011). No obstante, el citado estudio no reportó el intervalo
postmortem de las muestras usadas en los experimentos de expresión (L. Yu et al., 2015).
A la fecha, ningún estudio en metilación de ADN en la EA, ni a nivel genómico ni de locus
individual, ha realizado microdisección para seleccionar capas de neuronas afectadas. Lo
mencionado justifica el esfuerzo realizado en efectuar microdisección láser seleccionando
de forma más dirigida las neuronas susceptibles, en una subregión donde se encuentra
más plausiblemente disrupción de los patrones de metilación de ADN en EA. Ninguno de
30
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
estos estudios evaluó metiloma mediante la plataforma Infinum DNA Methylation 450K en
hipocampo, ni realizó microdisección alguna de los tejidos estudiados.
En la actualidad, diferentes hechos dan importancia a realizar un estudio de la metilación
de ADN en EA a nivel genómico que evalúen leucocitos de sangre periférica. En primer
lugar, se ha encontrado en otros desórdenes neurodegenerativos e incluso en alteraciones
neurológicas sutiles, la existencia de alteraciones de metilación de ADN observables en
muestras de tejidos periféricos que constituyen marcadores de potencial aplicabilidad en
biomedicina (Bacalini et al., 2015; Masliah et al., 2013; Wilmot et al., 2015). En segundo
lugar, porque se sabe que la EA tiene un componente «sistémico» que explica la presencia
de cambios en todo el organismo durante su proceso fisiopatológico y no se limita
únicamente al sistema nervioso central (J. K. Morris, Honea, Vidoni, Swerdlow, & Burns,
2014; R. Zhang et al., 2013). Por último, pero igualmente importante, la sangre periférica
es mucho más accesible que el tejido cerebral lo que implícitamente da la posibilidad de
realizar seguimientos longitudinales por años, durante la evolución de diferentes tipos de
enfermedades (Andreotti et al., 2014).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
31
1 CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN
CORTEZA CEREBRAL (CAPAS DE NEURONAS
PIRAMIDALES)
1.1 MÉTODOS
1.1.1 MUESTRAS
Los especímenes de cerebros humanos fueron obtenidos del Biobanco de Cerebros
NavarraBiomed y corresponden a giro frontal superior (área de Brodmann 8). La muestra
utilizada para el grupo de EA -de acuerdo a lo solicitado- corresponde con «cerebros con
estratificación histopatológica de intermedia a alta probabilidad usando las clasificaciones
patológicas para enfermedad de Alzheimer de CERARD y Braak- Braak en conjunto,
descrito como la clasificación de NIA–Reagan (Hyman & Trojanowski, 1997). Muestras de
cerebros sin evidencia (o historia) de accidente neurovascular, de otra enfermedad del
sistema nervioso central (SNC), de encefalopatía hipertensiva, ni de cáncer». Todas las
muestras fueron criopreservadas por congelación rápida «fast frozen», mantenidas a 80ºC, por tanto aptas para el estudio de microarreglos de Metilación de ADN (Karolchik et
al., 2014.
De igual forma, se obtuvieron controles con características de edad similares al grupo de
pacientes (Tabla 1); sin enfermedad neurológica conocida, cáncer o encefalopatía
neurovascular. Todos los sujetos donantes fueron de origen caucásico.
Tabla 1. Características generales de las muestras cerebrales estudiadas, conjunto total de sujetos
Género
Grupo experimental
EA
CT
TOTAL
GRUPO CT
Variable
Edad en años
Intervalo postmortem
Peso encéfalo
n.obs
18
14
32
media
70.29
6.94
1212
GRUPO EA
Variable
Edad en años
Intervalo postmortem
Peso encéfalo
media
77.22
4.66
1080
mediana
71.5
7.5
1175
mediana
78.5
3.3
1062
F
8
2
10
M
10
12
22
DE
13.1
4.3
191
DE
8.29
3.09
145
Abreviaturas. Grupo CT: Grupo de sujetos controles. Grupo EA: grupo de sujetos EA. n. obs: número
observaciones. DE: desviación estándar. Intervalo postmortem: Intervalo postmortem en horas. Todas las
muestras de EA se clasificaron como «alta probabilidad de EA».
32
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Dentro de las muestras obtenidas el subconjunto de hombres constituye un universo
importante en el que se amerita hacer todos los análisis de forma estratificada debido a
que, como se puede observar claramente en la tabla 1, las muestras a las que se logró
disponibilidad fueron en su mayoría hombres, esto principalmente en el grupo de controles.
A diferencia del género, del cual las diferencias entre los dos grupos fueron significativas
(prueba Xi2 p<0.05), las edades de ambos grupos no presentaron diferencias significativas
(prueba t, p>0.05). Teniendo en cuenta que la edad y el género pueden influir en los
patrones de metilación del ADN (Horvath et al., 2012), un análisis enfocado en el
subconjunto de hombres significó un valor agregado a este estudio pues permite controlar
completamente cualquier ruido relacionado con la influencia de género en este tipo de
análisis. Las características del subconjunto de hombres se muestran a continuación (Tabla
2).
Tabla 2. Características generales de muestras cerebrales estudiadas, subconjunto de hombres.
Variable
Edad en años
Intervalo postmortem
Peso encéfalo
GRUPO EA (n=12)
media
70.33
6.98
1237
mediana
71.5
7.5
DE
13.8
4.13
1240
193
mediana
70
2.9
1116
DE
8.8
GRUPO CT (n=10)
Variable
Edad en años
Intervalo postmortem
Peso encéfalo
media
73.5
4.27
1126
2.8
127
Abreviaturas. Intervalo postmortem: Intervalo postmortem en horas, DE: desviación estándar, Grupo CT: Grupo
de sujetos controles, Grupo EA: grupo de sujetos. Los grupos experimentales son similares, sin diferencias
significativas en su edad (p>0.05).
El intervalo postmortem de las muestras utilizadas (Tabla 1 y Tabla 2) fue menor a 12 horas
en todos los casos, y por tanto adecuado para obtener confiabilidad en los estudios de
metilación de ADN. De hecho, una de las ventajas de los perfiles de metilación de ADN es
dada por la estabilidad química de sus patrones que permite un tiempo de intervalo
postmortem mucho menos restrictivo en comparación con el adecuado para estudios
transcripcionales (Birdsill et al., 2011; Rhein et al., 2015), e incluso puede permanecer
estable a condiciones mucho menos exigentes de almacenamiento (Kristensen et al.,
2009). El peso encefálico se enlista como característica puramente descriptiva.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
33
1.1.2 MICRODISECCIÓN LÁSER Y EXTRACCIÓN DE ADN
Se realizó microdisección asistida por láser de las capas piramidales de la corteza frontal
usando microdisector Zeiss PALM MicroBeam IV, en los «cryostats» teñidos con rojo
neutral. La identificación de las capas piramidales contó con validación por expertos gracias
a la asesoría personal de dos patólogas expertas, la Doctora Silvia García del laboratorio
de Anatomía Patológica del Hospital Clínico de Santiago de Compostela (España) y de la
Doctora María Victoria Zelaya del Neurobanco de Cerebros Navarra Biomed, en Pamplona
(España).
Las capas de neuronas piramidales III y V que contienen las neuronas piramidales de
susceptibilidad en corteza frontal fueron microdisecadas por láser de la siguiente manera:
Secciones de tejido congelado (60 μm de espesor) fueron cortadas usando el criótomo
(Shandon Cryotome®, Thermo Scientific) y montadas en portaobjetos tratados con luz
ultravioleta. Las criosecciones fueron congeladas de forma inmediata y preservadas a 80ºC en cajas plásticas usando gel de silica (Sigma) para absorber el exceso de agua hasta
el momento del procesamiento. Tales procedimientos fueron realizados en el Laboratorio
de Neuroanatomía del Departamento de Ciencias Morfológicas de la Universidad de
Santiago de Compostela.
Se utilizó la tinción de rojo neutro como guía para la microdisección láser realizando el
protocolo descrito previamente (Kerman, Buck, Evans, Akil, & Watson, 2006) con ligeras
modificaciones como se describe a continuación:
Descongelación y secado al aire del criostato 3 minutos.
Hidratación inicial: inmersión en etanol 75%, 15 segundos, H2O miliQ 15 segundos.
Rojo neutro filtrado al 1% en agua miliQ, 120 segundos.
Deshidratación en gradientes de alcoholes al 70%, 95% y 100%, dos segundos (dos
inmersiones) en cada alcohol y secado al aire 2 minutos.
Todos los reactivos se prepararon en fresco para cada día de experimentación.
34
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Ilustración 2. Microfotografía ilustrativa de corteza cerebral humana teñida con rojo neutro. Bajo el lente
con aumento de 40X (véase recuadro superior derecho), la morfología de las neuronas piramidales de
diferentes tamaños es fácilmente reconocible con la tinción utilizada, aunque el grado de tinción de las
células piramidales sea variable. Bajo el lente con aumento de 10X se muestran las capas identificadas de
izquierda a derecha con las capas corticales piramidales III y V adyacentes, en citoarquitectura agranular.
SB: Sustancia Blanca. La zona en aumento 40X corresponde al rectángulo con el icono de lupa.
Se visualizaron claramente con objetivo 40X (Ilustración 2) las capas de neuronas
piramidales (III y V). La microdisección láser se realizó utilizando la herramienta de
posicionamiento y ablación del sistema PALM-Zeiss-Microbeam de microdisección láser el
cual está equipado con un microscopio axio y el sistema RoboSoftware-PALM para su
manejo. Mediante lo cual un área total de 9 mm2 tomadas de la capa III y V de las capas
de células piramidales, fueron transferidas a un tubo de 1,5 µl y almacenadas a -80ºC hasta
su procesamiento de extracción. Luego de la microdisección, las muestras fueron
procesadas para su extracción de ADN usando el kit de extracción QIAamp ADN Micro Kit
(Quiagen) con un protocolo modificado basado en el protocolo del fabricante de la siguiente
manera:
Añadir 180 μl de Buffer ATL a la muestra microdisecada por láser (previamente trasladada
a un tubo de 1.5 ml).
Añadir 20 μl de proteinasa K y mezclar por pulso de «vortex» durante 15 segundos incubar
«overnight» a 56ºC.
Añadir 200 de Buffer AL (al que se ha adicionado previamente 1 µl de cargador de ácido
nucleico «Carrier-Solution» del mencionado Kit por cada 100 µl de Buffer). Mezclar
fuertemente mediante «vortex» 60 segundos y obtener una muestra homogénea.
Añadir 200 µl de etanol absoluto. Mezclar fuertemente por «vortex» 15 segundos y obtener
una muestra homogénea. Centrifugar muy brevemente.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
35
Transferir el lisado de forma cuidadosa a una columna QIAamp MinElute dentro de un tubo
de colección de 2 ml sin humedecer la parte exterior de la columna. Centrifugar a 6200
gravedades (G) por 1 minuto. Colocar la columna QIAamp MinElute en un nuevo tubo de
colección de 2 ml (dejando para descartar el primer tubo lleno).
Añadir 500 μl de Buffer AW1 a la columna QIAamp MinElute sin humedecer su parte
exterior. Centrifugar a 6200 G por 1 minuto. Colocar la columna QIAamp MinEluteen un
nuevo tubo de colección de 2 ml.
Añadir 500 μl de Buffer AW2 a la columna QIAamp MinElute sin humedecer su parte
exterior. Centrifugar a 6200 G por 1 minuto. Colocar la columna QIAamp MinEluteen un
nuevo tubo de colección de 2 ml.
Centrifugar a 20000 G por 3 minutos para secar la membrana completamente. Colocar la
columna QIAamp MinElute en tubo de 1.5 ml.
Agregar 22 µl de buffer de elución AE directamente al centro de la membrana. Dejar incubar
5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 20000 G por 1 minuto.
Se separa una alícuota de 2 µl de volumen, para pruebas de integridad y cuantificación.
36
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.1.3 CONTROLES DE CALIDAD, PREPARACIÓN Y PROTOCOLO
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
Dentro de los pasos de control de calidad se usó 1 µl de la alícuota anteriormente
mencionada para cuantificar el ADN extraído mediante el sistema de fluorometría de alta
sensibilidad Qubit HS (ThermoFisher) de acuerdo con el protocolo del fabricante para
verificar cantidad suficiente de ADN (>500 ng por sujeto) y 1 µl para electroforesis en gel
de agarosa al 1%, para verificar integridad de ADN genómico de acuerdo a lo recomendado
(Karolchik et al., 2014). Una vez verificadas las extracciones, estas fueron preparadas y
enviadas a Canadá al servicio GenomeQuebec, el cual cuenta con una trayectoria de
experiencia idónea para procesar este tipo de microarreglos en su unidad de epigenética.
Dado el valor único del ADN conseguido por microdisección láser se dieron indicaciones
especiales sobre el procesamiento de las muestras a los miembros del servicio
especializado de la unidad de epigenética de GenomeQuebect. Las indicaciones
específicas contaron con la asesoría directa del Laboratorio de Epigenética de la
Universidad de Oviedo, durante estancia académica del doctorando en dicho laboratorio.
En el servicio Genome Quebec, Canadá, se llevó a cabo de forma automatizada el
protocolo de illumina de acuerdo con lo descrito extensamente en la base UCSC para los
procedimientos de Infinium DNA Methylation 450K (Karolchik et al., 2014) -disponible en
http://hgdownloadtest.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaib Methyl
450 /supplemental/wgEncodeHaibMethyl450IlluminaProtocol.pdf-. El protocolo consta de
una etapa de conversión de bisulfito, una etapa de hibridación de las microesferas una
etapa de extensión de única base, lavados múltiples y lectura mediante el sistema illumina
HiScan System, el cual usa un láser de excitación para los fluorósforos y un escaneo de
alta resolución de la señal de fluorescencia. Adicionalmente, solicitamos a Genome
Quebec los archivos IDAT que son generados directamente por el illumina HiScan System
y son necesarios para poder realizar la normalización SWAN.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
37
1.1.4 ANÁLISIS DE METILACIÓN EN POSICIONES GENÓMICAS
En este trabajo se utilizaron varios paquetes dentro del entorno de programación por línea
de comandos de R-Bioconductor, por ejemplo, minfi, limma, SVA, CHAMp, BMIQ,
wateRmelon, data.table y DMRcate (Peters et al., 2015; Smyth, 2005; Teschendorff et al.,
2013; T. Wang et al., 2015), los cuales están relacionados con el análisis bioinformático del
metiloma utilizando el Infiniun Illumina DNA Methylation 450K y con el manejo de los
millones de resultados generados. El entrenamiento en su manejo se realizó con el apoyo
del Laboratorio de Epigenética de la Universidad de Oviedo, bajo la instrucción del Doctor
Gustavo Bayón y comunicación personal con autores citados.
1.1.4.1 FILTRADO Y NORMALIZACIÓN DE SWAN
Mediante el uso de la función dropMethylationLoci del paquete minfi, se usaron filtros de
sitios CH, sitios SNPs y del cromosoma sexual, eliminando estas sondas del análisis,
llevando a un aumento en la equivalencia de las muestras y evitando sesgos del
cromosoma sexual inherentes a diferencias de género (Horvath et al., 2012).
Posteriormente, se usó la normalización SWAN de Infinium DNA Methylation 450K. SWAN
consiste en una normalización al interior de cada microarreglo en la cual inicialmente se
separa la señal de las sondas Illumina tipo I de las sondas Illumina tipo II e igualmente se
separa la señal de las sondas que corresponden a forma metilada de las de señal no
metilada (Maksimovic et al., 2012). Por tanto, SWAN evita la interferencia producida por
mezclar en la normalización todos los tipos de sondas de la plataforma (Maksimovic et al.,
2012). Este proceso requiere de los archivos IDAT y ha mostrado controlar posibles
variaciones técnicas, sin conllevar a una pérdida de sensibilidad de dicha plataforma de
metilación de ADN para el epigenoma humano (Maksimovic et al., 2012).
1.1.4.2 ANÁLISIS DMP USANDO EL PAQUETE LIMMA
El análisis fue realizado con el paquete Limma Bioconductor (Smyth, 2005) de
modelamiento lineal, teniendo en cuenta la edad y el género dentro del modelo para evaluar
contrastes de metilación del grupo con Alzheimer (EA) en comparación con el grupo control
(CT) mediante el uso de la función lmfit con métodos robustos de dicho paquete. Se
consideraron para el análisis únicamente las sondas con un valor p de detección <0.01 en
38
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
más del 90% de los sujetos evaluados. Se tomó un punto de corte para posiciones
diferencialmente metiladas, el valor de p corregido por FDR <0.001 (equivalente a un valor
p <4.66 x 10
-6
antes de corrección), punto de corte usado en estudios previos (Dai et al.,
2015). Finalmente, se agregó un filtro de Delta de Beta de >0.06 entre grupos, lo cual
acompañado de la alta rigurosidad estadística en el punto de corte de p, mostró evaluar en
forma reproducible las diferencias finas de metilación de corteza cerebral en EA (Lunnon
et al., 2014).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
39
1.1.5 MÉTODO DE ASIGNACIÓN DE GENES A SONDAS
DIFERENCIALMENTE METILADAS
La anotación de Ilumina para asignar genes a las sondas del Infinium DNA Methylation
450K, no tiene en cuenta criterios funcionales de asignación, por el contrario, asigna el gen
más cercano a cada sonda.
En el presente estudio, la asignación de genes a sondas diferencialmente metiladas se
basó en una búsqueda a 2 Kb de distancia -corriente arriba o corriente abajo- de los sitios
de inicio de transcripción (SIT). Este tipo de asignación provee una mejor interpretabilidad
biológica, debido a que recientemente se probó que el aumento de metilación de ADN en
vecindad aproximada de 2 kb de los SIT, se correlaciona con represión transcripcional de
forma mucho más importante que en las regiones tradicionalmente consideradas como
«promotoras» -incluso de forma más clara corriente abajo de los SIT- (Brenet et al., 2011;
Rhee et al., 2013). La búsqueda se realizó mediante programación en entorno de R, con
ayuda de una función que fue facilitada por el Laboratorio de Epigenética de la Universidad
de Oviedo (Ivorra et al., 2015).
40
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.1.6 ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO FUNCIONAL Y
ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL DE GENES
FatiGO-Babelomics, se identificaron relaciones biológicas relevantes entre los genes
encontrados diferencialmente metilados; dicha herramienta permite el análisis de
experimentos genómicos con alto rendimiento de resultados (Al-Shahrour et al., 2006; AlShahrour, Minguez, Vaquerizas, Conde, & Dopazo, 2005; Alonso et al., 2015). Dentro de
las búsquedas de enriquecimientos funcionales mediante FatiGO-Babelomics se utilizaron
las anotaciones de Gene Ontology consorsium (GO), de KEGG pathway Database y de
Biocarta; además, se incluyeron bases de datos de información sobre regulación génica
como Transfac, Jaspar y de interacciones proteícas, como interPro (Alonso et al., 2015).
Para FatiGO-Babelomics, se usaron las opciones predeterminadas en los genes
analizados (Al-Shahrour et al., 2007) que incluye la corrección de Benjamini & Hochberg,
p < 0.05 (Benjamini & Hochberg, 1995) excepto que para los análisis en el conjunto total
de sujetos se fijó una p < 0.02, dado el poder estadístico alcanzado.
Paralelamente, se utilizó la herramienta bioinformática DAVID, con la cual se realizó -para
los genes encontrados diferencialmente metilados-, un análisis de agrupamiento funcional
correspondiente a la opción «functional annotation clustering» para anotaciones
UCSC_TFBS del módulo «Protein_Interaction», que corresponden a sitios de unión a
factores de trascripción, de la base de datos de UCSC genome browser (Huang da,
Sherman, & Lempicki, 2009). Este análisis se realizó accediendo a DAVID en el entorno de
programación de R mediante el paquete RdavidWS (Fresno & Fernandez, 2013).
El análisis mediante DAVID es complementario, dado que las anotaciones UCSC_TFBS,
no están disponibles dentro del análisis de FatiGO-Babelomics. Además, dichas
anotaciones tienen la ventaja comparativa de tener anotaciones 3 veces más completas
que todas las demás anotaciones del módulo Protein_Interaction en DAVID y más de 2
veces que las de KEGG, cubriendo un alto porcentaje de genes anotados (Jiao et al., 2012).
Dichas anotaciones más completas implican un mayor número de genes incluidos en los
análisis de enriquecimiento, y por tanto un poder estadístico mucho mayor, por dicha razón
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
41
se utilizó la corrección de Bonferroni, se fijó una p <0.01 excepto que para los análisis de
subconjuntos de sujetos se utilizó una p<0.02, luego de la corrección de pruebas múltiples.
Al igual que FatiGOBabelomics, DAVID usa algoritmos que permiten agrupamiento
funcional para un grupo de genes de estudios genómicos con alta producción de resultados
que en comparación con elgenoma, se encuentren enriquecidos o sobre-representados.
Tales herramientas son utilizadas en análisis de trabajos con alto rendimiento de resultados
de metilación de ADN (Fernández-Tajes et al., 2012; Van Neste et al., 2010; Y. Zhang et
al., 2013).
En forma adicional, para facilitar el proceso de la lectura biológica inicial de los resultados
en cerebros, se utilizó la opción «gene functional classification» de la herramienta DAVID.
Dicha opción permite un agrupamiento general de los genes basándose únicamente en
similitudes biológicas, lo que facilita la ubicación funcional de varios genes que pudieran
tener potencial interés tanto para el autor como para el lector de este trabajo y que no
fueran agrupados con los requerimientos más estrictos de la opción «functional annotation
clustering» (D. W. Huang et al., 2007).”
42
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.1.7 ANÁLISIS DE METILACIÓN REGIONES GENÓMICAS (DMR)
Con el fin de establecer las regiones diferencialmente metiladas (DMR) entre las muestras
obtenidas de pacientes con enfermedad de Alzheimer y controles, se realizó un análisis de
modelamiento lineal usando el paquete DMRcate Bioconductor R pakeage. DMRcate está
basado en limma pakeage y diseñado para realizar análisis regional, es decir, en lugar de
identificar sondas diferencialmente metiladas, identifica regiones genómicas donde existan
CpGs diferencialmente metiladas con vecindad genómica. La importancia de este abordaje
que selecciona regiones genómicas DMR, es que estas tienen plausiblemente más
importancia biológica que posiciones genómicas aisladas (Jones, 2012) y desde ese punto
de vista, puede evitar falsos descubrimientos, sin detrimento de la potencia del estudio
(Peters et al., 2015; Robinson et al., 2014).
En los análisis DMR realizados, que se basan en el modelamiento con métodos de
regresión lineal (función lmfit:ls, tomada del paquete limma), se consideraron los factores
edad y género para eliminar su influencia sobre el contraste en la metilación de ADN del
grupo EA, contra la del grupo control (Peters et al., 2015). Se fijó un punto de corte de
diferencia estadística en valor p <0.05 después de corrección de Bonferroni. Se fijó el
parámetro de «distancia máxima entre CpGs de una misma región», en 200 pb.
Se agregó como filtro adicional un «delta de beta neto», -análogo a lo usado en DMP-. En
relación con este filtro el autor de esta tesis realizó un aporte al código bioinformático del
paquete DMRcate, agregándole dicho filtro «DeltaBetacutoffNetMean». Este nuevo código
permite seleccionar aquellas DMR que adicional a estar diferencialmente metiladas,
presenten dirección concordante de cambio de la metilación del ADN (hacia hipermetilación
o hacia hipometilación).
Sin incluir este parámetro, la búsqueda realizada por DMRcate (Peters et al., 2015) verifica
la significancia estadística de sondas consecutivas para agruparlas en un DMR
independientemente que la dirección del cambio sea concordante o no (Peters et al., 2015).
Usando «DeltaBetacutoffNetMean» como filtro adicional, si el promedio regional de delta
de betas no es mayor a 0.06 o menor a -0.06, la región DMR es descartada de los
resultados. La validez de este abordaje fue discutida y aprobada en comunicaciones
personales con T Peters autor del código inicial (Peters et al., 2015).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
43
1.1.8 ANÁLISIS DE INTERSECCIONES Y SUPERPOSICIONES
1.1.8.1 ANÁLISIS DMP Y DMR EN EL CONJUNTO DE HOMBRES
Es necesario reconocer la diferencia sustancial entre el grupo de EA y el grupo de controles
en cuanto a la composición de género por grupo. Se realizó un abordaje que permite
identificar los resultados concordantes entre los análisis realizados usando todos los
sujetos y los análisis equivalentes usando solo los hombres. De esta forma se descarta
totalmente una interpretación en la cual las diferencias en metilación entre EA y controles
encontradas en estos análisis fueran debidas a la discrepancia en el número de mujeres
presentes en cada grupo. Es decir, identifica los resultados más rigurosos en cuanto a que
persisten después de eliminarse cualquier posibilidad de sesgo por discrepancia en la
composición de género entre los EA y controles. Por tanto, un análisis de DMP y un análisis
de DMR fueron corridos en primera instancia con los datos del conjunto con la totalidad de
sujetos y en segundo lugar, se corrieron los mismos análisis para el subconjunto de sujetos
de género masculino.
1.1.8.2 ANÁLISIS DE CONVALIDACIÓN CRUZADA DMP CON DMR
Para determinar la superposición de las regiones DMR se utilizó el paquete
GenomicRanges (Carey, 2013) usando las funciones «findOverlaps», «subsetByOverlaps»
y «pintersect». Además, mediante codificación en R, se generaron objetos de rangos a
partir de las DMP, de tal forma que también pudieran usarse las funciones mencionadas
para encontrar superposición entre las DMP y las DMR.
Como se mencionó antes, los resultados de regiones encontradas en análisis de DMR,
resaltan la importancia biológica de aquellos CpG diferencialmente metilados que son
contenidos en ellas. Este abordaje robustece tanto la fuerza estadística como la biológica
de los resultados coincidentes, a la par que aumenta su rigurosidad (Peters et al., 2015).
44
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.1.8.3 SUPERPOSICIÓN DE RANGOS MÁS ROBUSTOS Y PRIORIZACIÓN
Se realizó una búsqueda de los resultados DMR –soportados por más de una CpG- que
estuvieran superpuestos, entre el análisis del conjunto completo de sujetos y el realizado
al interior del subconjunto de hombres; obteniendo así, una lista final destacada de
regiones diferencialmente metiladas en este estudio y sus correspondientes genes. En
dicho proceso, se utilizaron las funciones geneOverlaps, subsetByOverlaps y pintersect del
paquete GenomicRanges (Carey, 2013).
De forma agregada, empleando los genes más destacados, se usó la herramienta NGS
phenotyper (LifeMap Sciences and Weizmann Institute of Science v2.0 Build 49 2015)
disponible en https://ve.genecards.org (Rappaport et al., 2014; Stelzer et al., 2015), la
cual, realiza un análisis de priorización génica en forma directa y escueta teniendo en
cuenta la anotación de literatura científica e interacciones moleculares para
enfermedades de la base MalaCards (Rappaport et al., 2014), dando información
adicional de los resultados más destacados. Los parámetros utilizados fueron la palabra
clave «Alzheimer's Disease» en «Phenotype Keyword input» y los genes a evaluar en
«Gene Symbols input». Esta herramienta permite seleccionar en forma escueta, genes
con mayor relación con una enfermedad de una lista de genes candidatos encontrados
diferencialmente metilados en experimentos de alta producción de resultados -como los
de este trabajo-.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
45
1.2 RESULTADOS CAPÍTULO 1
1.2.1 RESULTADOS GENERALES DMP (TODOS LOS SUJETOS)
1.2.1.1 CONTROLES DE CALIDAD
El filtrado de los datos se realizó según lo descrito en el numeral 1.1.4 de este capítulo.
Inicialmente, se descartaron sondas que corresponden a SNP, sitios CH y a cromosoma
sexual y posteriormente, se descartaron las sondas que fallaron en más del 10% de las
muestras por valor p de detección; en total, se descartaron 15113 sondas de las 485512
sondas iniciales, por lo que fueron analizadas finalmente 470399 sondas.
Dentro del análisis de control de calidad habitual en este tipo de estudios usando Infinium
DNA Methylation 450K, se observa un patrón adecuado de densidades beta de las sondas
incluidas en el análisis lo que es concordante con el índice de calidad observado en las
gráficas de evaluación de control de calidad correspondientes a la función getQC del
paquete minfi (Ilustración 3)
46
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
A
Quality control
B
Ilustración 3. Control de calidad en muestras estudiadas por microarreglos Infinium DNA Methylation
450K. A) Gráfica de densidades de valores beta en las muestras evaluadas en la plataforma Infinium DNA
Methylation 450K. La gráfica muestra una distribución bimodal indicando patrones de metilación globales
esperados en estos microarreglos de metilación. Gráfica realizada con función DensityPlot del paquete minfi
en el entorno de R. El eje de las abscisas muestra los valores Beta, equivalentes al nivel de metilación y el eje
de las ordenadas muestra la densidad de sondas del microarreglo Infinium DNA Methylation 450K en cada
nivel de metilación. B) Gráfica que muestra el índice de calidad evaluado por el paquete minfi utilizando las
funciones getQC y plotQC. Todas las muestras estudiadas muestran calidad adecuada para los análisis dadas
por medianas de intensidades metiladas y no metiladas en el rango esperado.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
47
1.2.1.2 SELECCIÓN DE DMP
Como un abordaje preliminar del análisis realizado con el paquete bioinformático limma
usando preliminarmente una FDR < 0.05 encontrábamos 3517 sondas diferencialmente
metiladas. Sin embargo, para los resultados con más de 3000 identificadores en ensayos
de alto rendimiento de datos se requiere realizar filtrados adicionales para permitir el
análisis funcional de acuerdo con las guías de Gene Ontology Consortium (Consortium,
2015) -consultado en octubre 5 de 2014 en http://geneontology.org-. De igual forma, el
análisis funcional con la herramienta DAVID (Huang da et al., 2009), requiere un número
menor a 3000 identificadores en los datos de entrada para generar resultados de
agrupamiento funcional (Huang da et al., 2009).
Adicionalmente, consideramos que, de acuerdo con lo mencionado en métodos, se
encontró conveniente una rigurosidad estadística incrementada para la detección confiable
de las diferencias finas de metilación (delta de beta incluso alrededor de 0.05), reportadas
en recientes estudios de EA en corteza que usaron la plataforma de microarreglos Infinium
Illumina DNA Methylation 450K (Lunnon et al., 2014), idéntica a la usada en este trabajo.
Conforme a lo recomendado se agregó un filtro con un criterio más conservador con FDR
<0.001. Usando los filtrados mencionados, permanecieron 504 sondas diferencialmente
metiladas, las cuales fueron utilizadas para los análisis subsiguientes del conjunto completo
de sujetos (Anexo 1).
48
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.2.2 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS GENERALES
1.2.2.1 IMPORTANCIA DE ORILLAS DE LAS ISLAS CPG
Se encontraron más sondas diferencialmente metiladas en orillas de islas CpG que en las
Islas CpG como tal. De hecho, la relación entre sondas en orillas CpG y sondas en Islas
CpG (orillas /islas) pasó de 0.75 en el total de las sondas evaluadas luego de aplicación de
filtros, a un valor de 1.6 en las sondas que fueron encontradas diferencialmente metiladas,
mostrando que las orillas de islas CpG tuvieron una mayor posibilidad de estar
diferencialmente metiladas en EA que las islas CpG como tal (Ilustración 4)
CpG shores / CpG islands probes ratio
A
B
Shore: En celeste se
representan las sondas
en orillas de islas CpG
Island: En blanco se
representan las sondas
en islas CpG.
Ilustración 4. Razón entre sondas para orillas CpG y sondas para islas CpG en resultados. A) Representa
la relación orillas / islas en todas las sondas evaluadas en el genoma (después de aplicar los filtros). B)
Representa la relación orillas / islas para las 504 sondas encontradas como diferencialmente metiladas.
1.2.2.2 CAMBIOS ESPECÍFICOS CON MAYOR HIPERMETILACIÓN
De las 504 sondas diferencialmente metiladas, 487 presentaron mayor metilación de ADN
en EA en comparación con el grupo controles y las 17 sondas restantes fueron encontradas
con cambio hacia la hipometilación en EA. Sin embargo, los niveles de metilación promedio
a lo largo del genoma de los sujetos con EA, fue similar al de los sujetos control (EA 0.5371±
0.008 NM vs. controles 0.5313 ± 0.01 NM, valor p > 0.05). Lo cual indica que la presencia
de hipermetilación diferencial es especifica de los loci encontrados diferencialmente
hipermetilados.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
49
1.2.3 CORRESPONDENCIA CON GENES Y ENRIQUECIMIENTO
FUNCIONAL DE GENES /AGRUPAMIENTO FUNCIONAL
1.2.3.1 CORRESPONDENCIA CON GENES (TODOS LOS SUJETOS)
En el análisis de estas 504 sondas, 349 sondas corresponden con genes de acuerdo con
el criterio explicado en el numeral 1.1.5 de los métodos de este capítulo. Teniendo en
cuenta los casos en los que se encontró más de un gen por sonda de acuerdo con el criterio
explicado, las 349 sondas corresponden a 361 genes. Como se mencionó antes, la mayoría
de las sondas se encontraron diferencialmente hipermetiladas en EA -en comparación con
controles-, de estas, 337 correspondieron con genes, y 150 no mostraron correspondencia.
En el primer anexo de resultados se muestra el listado completo de sondas y genes
diferencialmente hipermetilados y diferencialmente hipometilados en EA -en comparación
a controles- para el conjunto completo de sujetos (Anexo 1). Por razones de espacio a
continuación se muestran únicamente los resultados de 25 sondas diferencialmente
hipermetiladas en EA que encabezan la lista y sus genes correspondientes (Tabla 3).
Tabla 3. Primeras 25 sondas diferencialmente hipermetiladas en EA en capas de neuronas piramidales
identificadas para la totalidad de la muestra de sujetos ordenadas por significancia.
Probe ID
cg23098789
cg09852619
cg21134610
cg19718360
cg19498600
cg02630914
cg00452039
cg01498641
cg06709442
cg15255329
cg16206364
cg19983221
cg08925882
cg20622410
cg07579107
cg12785183
cg00756845
cg10662603
cg06986330
cg05431942
cg19647370
cg16748008
cg19969733
cg07432352
cg01441308
Gene Symbol
GPR123
DOCK5
CXXC1
CD84
CCDC7
ZBTB46
PRKAG2
PRMT8
LAIR2
CPT1C
AMBRA1
GSTP1
JUP
WDR72
IPCEF1
MAD1L1
OR10A5
RASSF8
HOXA3
IL18R1, IL1RL1
EFCAB13, ITGB3
BIN1
Gene ID(s)
84435
80005
30827
8832
79741
140685
51422
Chr
10
8
18
1
10
20
7
16
56341
12
3904
19
126129
19
55626
11
2950
11
3728
17
256764
15
6
26034
6
3
8379
7
144124
11
11228
12
3200
7
8809, 9173
2
124989, 3690 17
274
2
CGIn
Shore
Sea
Shore
Sea
Sea
Shelf
Shore
Shelf
Sea
Sea
Shore
Sea
Shore
Sea
Sea
Sea
Sea
Sea
Shelf
Sea
Sea
Island
Sea
Shelf
Sea
t
12.88
11.22
10.87
9.90
9.48
9.41
9.47
9.03
8.94
8.84
8.71
8.61
8.62
8.50
8.48
8.49
8.51
8.50
8.37
8.29
8.24
8.20
8.19
8.11
8.11
DBt
0.17
0.15
0.10
0.06
0.10
0.06
0.07
0.07
0.08
0.15
0.12
0.10
0.09
0.06
0.11
0.08
0.13
0.14
0.06
0.06
0.09
0.06
0.12
0.07
0.06
valor.p.adj
5.7E-09
4.7E-08
9.0E-08
8.9E-07
1.5E-06
1.5E-06
1.5E-06
3.1E-06
3.6E-06
5.3E-06
5.8E-06
6.0E-06
6.0E-06
7.6E-06
7.7E-06
7.6E-06
7.9E-06
9.4E-06
9.4E-06
1.1E-05
1.2E-05
1.3E-05
1.5E-05
1.5E-05
1.5E-05
B
21.01
18.96
18.25
15.97
15.07
14.85
14.64
13.92
13.71
13.26
13.03
12.88
12.87
12.64
12.57
12.55
12.50
12.30
12.23
12.07
11.90
11.82
11.67
11.61
11.61
p.value
2.8E-14
4.0E-13
9.5E-13
1.1E-11
3.5E-11
4.2E-11
3.5E-11
1.2E-10
1.5E-10
2.5E-10
3.3E-10
3.7E-10
3.7E-10
5.1E-10
5.4E-10
5.2E-10
5.8E-10
7.4E-10
7.3E-10
9.2E-10
1.1E-09
1.2E-09
1.5E-09
1.5E-09
1.5E-09
dir
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
Abreviaturas: Probe ID: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K. valor.p.adj: valor p
ajustado con FDR (Benjamini & Hochberg, 1995) . Gene Symbol: símbolo único de la base de genes de
NCBI. Chr, cromosoma. CGIn: anotación de localización de la sonda en relación a las Islas CpG. Island: Isla
CpG. Shore, Orilla de Isla CpG, localización a distancia < 2Kb de una Isla CpG. Shelf, plataforma insular
CpG, localización a una distancia entre 2Kb y 4 Kb de una Isla CpG. Sea, localización a una distancia > a
4kb de una Isla CpG. DBt, Delta de Beta. Island, Isla CpG. t: valor en distribución t. B: logaritmo de la
probabilidad de diferencia en los grupos. dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento o
disminución de metilación en EA. Se subrayan genes mencionados en el texto para facilitar su localización.
50
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.2.3.2 CLASIFICACIÓN GÉNICA FUNCIONAL
Los análisis de agrupamiento o clasificación génica funcional no generaron ningún
resultado significativo para los genes diferencialmente hipometilados en el estudio
mostrado en este Capítulo, por tanto, en adelante nos centramos en los genes
diferencialmente hipermetilados en EA. Se realizó un agrupamiento general de genes
basándose en similitudes biológicas para lo cual se analizaron los genes encontrados
hipermetilados y en EA (Anexo 1) utilizando la opción «gene functional classification» de
la herramienta DAVID.
En los resultados (Anexo 2) se encontró un grupo de genes con repeticiones de Ankirina
como principal similitud (Grupo 1). También se agruparon genes de proteínas de regulación
trascripcional relacionados con reconocimiento de secuencias específicas de ADN como
anillos / dedos de zinc (Grupo 2). El siguiente grupo (Grupo 3) se observó relacionado con
activación de GTPasas, incluyendo el gen RABGAP1L (KIAA0471) -reportado como
regulado a la baja en tejido cerebral de EA (de Yebra et al., 2004). Asimismo, se
encontraron genes relacionados con microtúbulos y citoesqueleto (Grupo 4), genes
reguladores de actividad trifosfatasa (Grupo 5) y genes relacionados con división celular
fase M (Grupo 6). En forma afín al grupo 2, se encontró un grupo relacionado con
regulación génica dependiente de unión a ADN, donde llaman la atención los genes MBD1
y CXXC1 en vecindad genómica y estrechamente relacionados entre sí, uniendo en forma
específica ADN en secuencias con CpGs de acuerdo con su estado de metilación (Grupo
7). Finalmente, se encuentran genes con dominios WD (Grupo 8) y en la parte inferior de
la tabla se encuentran agrupaciones de genes asociadas a la localización en región
extracelular (Grupo 9) y al movimiento por microtúbulos (Grupo 10). Los grupos 11 y 12 no
tabulados corresponden a genes relacionados con fosforilación proteica y de vías de
señalización acopladas a proteína G (los cuales presentaron un enriquecimiento < 0.5).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
51
1.2.3.3 RESULTADOS AGRUPAMIENTO GÉNICO FUNCIONAL (TODOS LOS
SUJETOS)
Dentro del análisis de enriquecimiento funcional se utilizó la herramienta bioinformática
Babilomics (Al-Shahrour et al., 2008) con los parámetros señalados en la sección de
métodos numeral 1.1.6 de este capítulo. Se analizaron los genes encontrados
hipermetilados en EA (Anexo 1) en los que se encontraron resultados con enriquecimiento
significativo.
Dentro de las ontologías relacionadas con componentes subcelulares, asociadas con los
genes hipermetilados en EA, se encontró enriquecimiento en varias ontologías con los
respectivos genes (Tabla 4) y la interrelación de las ontologías más destacadas por
significancia estadística se presenta en una red de ontologías (Ilustración 5).
Igualmente, los resultados de agrupación de genes por ontologías relacionadas con
funciones moleculares, presentaron enriquecimiento en las categorías funcionales
mostradas a continuación (Tabla 5).
52
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Tabla 4. Ontologías relacionadas con componente subcelular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales
identificadas para la totalidad de la muestra.
Funt. Term
axon(GO:0030424)
membrane raft
(GO:0045121)
endosome membrane
(GO:0010008)
blood microparticle
(GO:0072562)
myelin sheath abaxonal
region (GO:0035748)
receptor complex
(GO:0043235)
basolateral plasma
membrane(GO:0016323)
apical plasma
membrane(GO:0016324)
neuronal cell
body(GO:0043025)
Synapse
(GO:0045202)
T-tubule(GO:0030315)
cell-cell junction(GO:0005911)
axonal growth
cone(GO:0044295)
brush border(GO:0005903)
cell cortex(GO:0005938)
stereocilium(GO:0032420)
cytoplasmic side of plasma
membrane(GO:0009898)
brush border
membrane(GO:0031526)
Intercalated disc(GO:0014704)
Term
size L
343
Term
size G
359
List
pos
5
List
neg
345
G
pos
338
G
neg
205644
pvalue
adj pvalue
3.28E-04
1.61E-02
308
308
5
345
303
205679
DLG1,KCNN4,ITLN1,TGFBR2,TRPC1
2.29E
2.00E-04
1.59E-02
240
247
5
345
235
205747
MYO1B,TRAF6,ATP6V0A4,
ANKFY1,TMEM165
2.54E
6.27E-05
5.71E-03
311
323
5
345
306
205676
C9,PROS1,FN1,HBG2,HBE1
2.28E
2.10E-04
1.59E-02
7
7
2
348
5
205977
DLG1,EXOC4
5.47E
5.99E-05
5.71E-03
337
339
5
345
332
205650
ITLN1,TGFBR2,ITGB3,TRPC1,LRP5
2.19E
3.03E-04
1.61E-02
2.61E
8.14E-06
1.85E-03
2.38E
2.86E-05
3.26E-03
2.69E
2.44E-08
2.23E-05
2.27E
1.23E-05
2.23E-03
List pos IDs
BIN1,SMURF1,EPHB2,BOC,MME
7DLG1,KCNN4,SLC26A7,JUP,TRPC1,S
LC8A1
KCNN4,GIF,FN1,ATP8B1,ATP6V0A4
,WDPCP
KLHL1,KCNN4,MYO10,RTN4,SMURF1,
PARD3,EPHB2,BOC,ZNF385A
PCDH15,DLG1,RIMS1,GABRA6,CPT1C,
MME,CTNND1
odds ratio
log
2.18E
271
283
6
344
265
205717
339
344
6
344
333
205649
379
379
9
341
370
205612
440
449
7
343
433
205549
74
91
3
347
71
205911
BIN1,CACNA2D1,SLC8A1
3.22E
2.87E-04
1.61E-02
2.64E
1.20E-06
5.45E-04
308
355
7
343
301
205681
SDCCAG8,RLTPR,PRKCH,DLG1,PARD
3,JUP,CTNND1
19
19
3
347
16
205966
PARD3,BOC,AATK
4.71E
4.60E-06
1.40E-03
73
184
32
79
189
37
3
4
3
347
346
347
70
180
29
205912
205802
205953
MYO1B,ATP6V0A4,MME
CTTN,CD302,PARD3,WDPCP
PCDH15,DFNB31,ATP8B1
3.24E
2.58E
4.12E
2.76E-04
2.96E-04
2.31E-05
1.61E-02
1.61E-02
3.01E-03
88
99
4
346
84
205898
CHUK,DLG1,TRAF6,JUP
3.34E
1.70E-05
2.57E-03
78
80
3
347
75
205907
ITLN1,ATP8B1,ATP6V0A4
3.17E
3.35E-04
1.61E-02
75
92
3
347
72
205910
DLG1,JUP,SLC8A1
3.21E
2.98E-04
1.61E-02
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores anotados para ese término. Term size G:
tamaño global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de
identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %:porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G pos: número de
identificadores en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. List pos
IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento
en el término funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de
Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su localización.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
53
+
Ilustración 5. Red funcional de ontologías de «componente subcelular » de análisis principal de hipermetilación diferencial de DNA en capas de neuronas
piramidales. Sólo se representan a relación de las ontologías que mostraron una p corregida por FDR <0.01. Red de ontologías generada como salida grafica de
resultados de la herramienta Babelomics (Alonso et al., 2015). Se conservan en idioma inglés respetando la nomenclatura oficial de GO.
54
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Tabla 5. Ontologías relacionadas con función molecular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales identificadas
para la totalidad de la muestra de sujetos.
Funt. Term
Term
size L
Term .
size G .
List
pos
List neg
List %
G
positives
0.57
3
205979
0.00
ERO1L,ERO1LB
5.98
2.86 E-05 1.44 E-02
G neg
Term
size G
List pos IDs
odds
p-value adj pvalue
ratio log
oxidoreductase activity, acting on a
sulfur group of donors, disulfide as
acceptor (GO:0016671)
5
12
2
oxygen transporter activity
(GO:0005344)
34
40
3
347
0.86
31
205.951
0.02
IPCEF1,HBG2, HBE1
4.05
2.78 E-05 1.44 E-02
Rab GTPase binding
(GO:0017137)
221
253
5
345
1.43
216
205766
0.10
MOBP,RIMS1, USP6NL,ANKFY1,
RABGAP1L
2.63
4.24 E-05 1.60 E-02
GTPase activator activity
(GO:0005096)
382
388
6
344
1.71
376
205606
0.18
ARHGAP9, CHN2, RGS13,
ARHGAP18ANKRD27, RASA3
2.26
5.54 E-05 1.60 E-02
protein disulfide isomerase activity
(GO:0003756)
34
41
3
347
0.86
31
205951
0.02
ERO1L, ITGB3, ERO1LB
4.05
2.78 E-05 1.44 E-02
phosphatidylinositol 3,4,5
trisphosphate binding (GO:0005547)
72
86
4
346
1.14
68
205914
0.03
ARHGAP9, MYO1B, MYO10,
PARD3
3.56
7.64 E-06 1.44 E-02
phosphoprotein phosphatase activity
(GO:0004721)
118
128
4
346
1.14
114
205868
0.06
DLG1, PPAP2C, PPM1H, DUSP16
3.04
5.36 E-05 1.60 E-02
348
Abreviaturas. Funt.Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores anotados para ese término. Term size G:
tamaño global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de
identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G positives: número
de identificadores en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. List pos
IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento
en el término funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de
Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su rápida
localización. Se muestran enriquecimientos con logaritmo de OR > 2.0 y valor p corregido <0.02.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
55
Los resultados del análisis con la totalidad de los sujetos para enriquecimiento de
agrupaciones funcionales de UCSC_TFBS, mostraron ontologías enriquecidas, como se
muestra a continuación (Tabla 6).
Tabla 6. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes diferencialmente
hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, resultados para toda la muestra.
Category
Term
Count
%
PValue
List Total
Pop
Hits
Pop
Total
FoldE
Bonferroni
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
FOXO3
FOXD3
FOXJ2
HFH3
POU3F2
NKX61
NKX3A
CART1
LHX3
CEBPA
132
151
240
169
221
175
182
184
153
114
39
45
71
50
65
52
54
54
45
34
8.4E-14
3.6E-13
6.4E-13
1.9E-12
2.3E-12
8.8E-12
3.3E-11
7.2E-11
8.1E-11
7.90E-7
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
4429
5509
10934
6613
9773
7068
7578
7757
5987
4598
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
1.83
1.68
1.34
1.57
1.38
1.52
1.47
1.45
1.57
1.52
1.48E-11
6.47E-11
1.14E-10
3.34E-10
4.09E-10
1.57E-9
5.92E-9
1.28E-8
1.44E-8
1.39E-4
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
UCSC_TFBS
CDC5
SOX5
S8
CEBPB
HFH1
RSRFC4
POU6F1
NKX22
FREAC7
E4BP4
CDP
SRY
HNF3B
OCT
GATA
HLF
TBP
HNF1
FREAC3
IRF7
FOXO4
HOXA3
NFAT
172
181
174
207
171
176
163
168
179
164
211
159
156
170
162
149
134
192
154
161
186
149
149
51
54
51
61
51
52
48
50
53
49
62
47
46
50
48
44
40
57
46
48
55
44
44
1.42E-9
2.06E-9
2.14E-9
2.60E-9
4.90E-9
8.20E-9
8.60E-9
1.30E-8
1.82E-8
2.03E-8
2.89E-8
3.45E-8
3.70E-8
9.37E-8
7.45E-7
9.63E-7
1.00E-6
1.39E-6
2.62E-6
2.71E-6
4.43E-6
4.53E-6
5.54E-6
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
319
7294
7857
7446
9470
7342
7682
6926
7253
7933
7060
9950
6819
6653
7554
7290
6562
5716
9163
6955
7368
8925
6724
6746
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
19536
1.44
1.41
1.43
1.34
1.43
1.40
1.44
1.42
1.38
1.42
1.30
1.43
1.44
1.38
1.36
1.39
1.44
1.28
1.36
1.34
1.28
1.36
1.35
2.50E-7
3.63E-7
3.76E-7
4.58E-7
8.63E-7
1.44E-6
1.51E-6
2.29E-6
3.20E-6
3.57E-6
5.08E-6
6.07E-6
6.51E-6
1.65E-5
1.31E-4
1.70E-4
1.76E-4
2.45E-4
4.61E-4
4.77E-4
7.79E-4
7.97E-4
9.75E-4
Se utiliza el sistema de anotación utilizado en la base de datos NIH/NIAID para anotación, visualización y
descubrimiento Integrado (DAVID). Convenciones. «Category»: Agrupación funcional. «UCSC_TFBS»: sitios de
unión a factores de transcripción de la base UCSC asociados a los resultados. «Count»: Se refiere al número de
genes «alterados» dentro de cada ontología y su porcentaje correspondiente. P value: es el resultante de la prueba
exacta de Fisher (P ≤ 0.05); «FoldE»: se refiere a la tasa de enriquecimiento encontrado en la lista de resultados
positivos en comparación con el enriquecimiento de esa ontología en el genoma completo. List Total: se refiere al
número toral de genes anotados dentro delos resultados positivos; Pop Hits y Pop Total, se refiere al número de
genes en la base de datos para la categoría, y en general, respectivamente. Bonferroni: valor P corregido mediante
el método de Bonferroni para alejar la probabilidad de falsos descubrimientos. Se muestran ontologías con punto de
corte P<0.01 luego de corrección de Bonferroni. La línea horizontal destaca los resultados por encima de ella con un
enriquecimientoFoldE ⪆1.5. Se muestran enriquecimientos con logaritmo de OR > 2.0 y valor p corregido <0.02. Se
subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su rápida localización
56
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
En el análisis con la totalidad de sujetos, en los genes diferencialmente hipermetilados en
EA, se encontraron 37 ontologías relacionadas con procesos biológicos enriquecidos, entre
los cuales se hallan ontologías relacionadas con transporte de oxígeno, transporte de
calcio, respuesta celular a compuestos orgánicos y activación de función proteína quinasa
(Anexo 3). Igualmente, se hallan los procesos de regulación de la metilación del ADN
(regulation of DNA methylation, GO:0044030) y de regulación positiva de unión a
secuencia especifica de factores de transcripción -positive regulation of sequencespecific DNA binding transcription factor activity, GO:0051091- (Anexo 3) y en una
orientación afín, varias ontologías correspondientes a genes relacionados con la
embriomorfogénesis de diferentes tejidos y el desarrollo de tipos celulares, así como de
señales de proliferación (Anexo 3).
Los resultados en «interPro» para el análisis incluyendo la totalidad de los sujetos, no
alcanzaron el umbral de significancia estadística seleccionado (p corregida < 0.02).
1.2.3.4 SONDAS NO ASIGNADAS DESTACADAS
Se tabulan las sondas diferencialmente metiladas que encabezan la lista por significancia
estadística (Anexo 4); sin embargo, estas sondas no correspondieron con genes de
acuerdo con la búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo sobre el método
de asignación de genes a sondas diferencialmente metiladas.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
57
1.2.4 RESULTADOS DMP EN SUBCONJUNTO HOMBRES
1.2.4.1 CORRESPONDENCIA CON GENES SUBCONJUNTO HOMBRES
El análisis de DMP del subconjunto de hombres mostró 401 sondas diferencialmente
metiladas en EA en comparación con controles con p corregida por FDR <0.01 mediante
la técnica de Benjamini & Hochberg (Benjamini & Hochberg, 1995). Partiendo de las 401
DMP identificadas, sólo 44 sondas se encontraron con una menor metilación en EA y 357
sondas presentaron aumento de metilación. El uso del criterio de asignación descrito en el
numeral 1.1.5 permitió encontrar que las 44 sondas con metilación disminuida
correspondieron con 29 genes y las sondas con metilación aumentada correspondieron
con 253 genes.
A continuación los resultados de las primeras 25 sondas diferencialmente hipermetiladas
(Tabla 7), los resultados completos se muestran en un anexo (Anexo 5). Este análisis es
válido para el subconjunto de muestras de hombres, independiente de si están o no en
intersección con el resultado general del punto 1.2.1 del presente Capítulo.
Tabla 7. Primeras 25 sondas diferencialmente hipermetiladas en capas de neuronas piramidales en EA en
comparación con controles, análisis para el subconjunto hombres ordenadas por sinificancia.
Chr
CGIn
cg16464924
GAA
2548
cg12743416
TRIM24
8805
cg13295614
cg08925882
GSTP1
2950
cg13980266
ZNF169
169841
cg13917577
AGRN
375790
CXXC1
cg21134610
30827
cg03745316
cg09852619
DOCK5
80005
cg01498641
cg21757617
cg15714227
CXXC1
cg11871295
30827
cg12750757 LOC100128993 100128993
cg16206364
CPT1C
126129
cg01055691
GAP43
2596
cg20255370
EIF2AK4
440275
cg02299946
HTRA1
5654
HOXA3
cg21134232
3200
cg24954648
cg23098789
GPR123
84435
cg10432569
MIR196A1
406972
cg10662603
cg15171154
TGFBR2
7048
chr17
chr7
chr2
chr11
chr9
chr1
chr18
chr8
chr8
chr16
chr11
chr5
chr18
chr8
chr19
chr3
chr15
chr10
chr7
chr15
chr10
chr17
chr3
chr3
Island
OpenSea
OpenSea
Shore
Shore
Shore
Shore
OpenSea
OpenSea
Shelf
OpenSea
OpenSea
Shore
Shelf
Shore
Shore
Island
Shelf
Shore
Shelf
Shore
Shore
OpenSea
OpenSea
FDRadj.p.
val
8.36E-11
1.47E-08
1.81E-06
4.86E-06
4.86E-06
4.86E-06
5.38E-06
8.85E-06
9.28E-06
1.09E-05
1.74E-05
2.04E-05
4.26E-05
5.38E-05
1.16E-04
1.74E-04
1.94E-04
2.55E-04
2.97E-04
3.20E-04
3.20E-04
4.13E-04
4.13E-04
4.13E-04
cg19969733 IL18R1, IL1RL1 8809, 9173
chr2
OpenSea
4.56E-04
Probe ID
Gene Symbol Gene ID(s)
logFC
B
DBt p.value
dir
0.15
0.21
0.17
0.12
0.13
0.14
0.10
0.10
0.18
0.07
0.22
0.10
0.13
0.15
0.13
0.17
0.14
0.06
0.09
0.07
0.11
0.08
0.15
0.08
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
2.83
2.23
1.76
1.14
1.74
1.16
1.12
0.71
1.62
1.23
1.63
1.25
1.44
1.85
1.36
1.89
1.15
0.46
0.61
0.94
2.43
0.62
1.49
0.51
22.5
18.6
14.2
13.3
13.3
13.2
13.2
12.8
12.7
12.4
11.7
11.7
11.0
10.7
9.94
9.28
9.25
8.99
8.81
8.69
8.55
8.32
8.37
8.26
3.6E-16
1.2E-13
3.3E-11
1.2E-10
1.2E-10
1.2E-10
1.5E-10
2.6E-10
3.0E-10
3.9E-10
6.7E-10
8.7E-10
2.1E-09
3.1E-09
7.7E-09
1.3E-08
1.6E-08
2.2E-08
2.7E-08
3.0E-08
3.1E-08
4.5E-08
4.6E-08
4.9E-08
1.25
8.18 0.13 5.8E-08
Abreviaturas: Probe ID: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K. valor.p.adj: valor p ajustado
con FDR (Benjamini & Hochberg, 1995) . Gene Symbol: símbolo único de la base de genes de NCBI. Chr,
58
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
cromosoma. CGIn: anotación de localización de la sonda en relación a las Islas CpG. Island: Isla CpG. Shore,
Orilla de Isla CpG, localización a distancia < 2Kb de una Isla CpG. Shelf, plataforma insular CpG, localización a
una distancia entre 2Kb y 4 Kb de una Isla CpG. Sea, localización a una distancia > a 4kb de una Isla CpG. DBt,
Delta de Beta. Island, Isla CpG. t: valor en distribución t. B: logaritmo de la probabilidad de diferencia en los
grupos. dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento o disminución de metilación en EA. Se
subrayan genes mencionados en el texto para facilitar su localización.
1.2.4.2 RESULTADOS DE CLASIFICACIÓN EN GRUPOS FUNCIONALES Y
ENRIQUECIMIENTO EN AGRUPACIONES FUNCIONALES (HOMBRES)
Las tablas de resultados que corresponden al análisis del subconjunto de hombres se
encuentran en anexos de resultados por motivos de espacio. No obstante, tienen
importancia similar a las del análisis principal. Se realizó análisis de agrupamiento funcional
usando la herramienta Babelomics (Al-Shahrour et al., 2006). Los resultados con los 253
genes diferencialmente hipermetilados en EA relacionados con las ontologías de
componentes celulares presentan ontologías relacionadas con prolongaciones sinápticas,
específicamente en el axón (axon, GO: 0030424) donde se halla entre otros genes a BIN1;
el crecimiento de ambos tipos de prolongaciones sinápticas (growth cone, GO:0030426)
con los genes PTPRO, DSCAM, RTN4R y BOC. De igual forma, se halla la categoría
crecimiento de cono axonal (axonal growth cone, GO:0044295) en la que incluye kis
genes BOC y AATK. En la categoría axolema (axolemma, GO:0030673) se encontró
ANK1 y en la categoría de sinapsis (synapse, GO:0045202) se encontraron los genes
GABRA6, PRRT1, CPT1C, AGRN y GAP43 -GAP43, es también conocido como
neuromodulina- (Anexo 6).
Los resultados de ontologías de funciones moleculares para el análisis del conjunto de
hombres se encuentran en forma anexa (Anexo 7), en estos resultados se consideró como
umbral de log-OR > 2.0, entre ellos se encuentra la ontología de actividad de receptor de
orientación axonal (axon guidance receptor activity, GO:0008046).
Para el análisis del conjunto de hombres, se encontraron 27 ontologías destacadas de
procesos biológicos (Anexo 8), entre ellas varias afines con las ontologías, axón,
microtúbulos, respuesta celular a estrés y a compuestos orgánicos. También, la ontología
de regulación positiva de la producción de interferón gama. Así mismo, se encuentran
varias ontologías correspondientes a genes relacionados con la embriomorfogénesis de
diferentes tejidos y el desarrollo de múltiples tipos celulares, incluyendo genes homeobox
(como HOXA5). Igualmente, los resultados de enriquecimiento de interacciones proteicas
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
59
en interPro, mostraron el grupo (Homeobox, IPR020479) que incluye HOXA2, HOXA3,
HOXA5, HLX, NKX6-3, este fue el único resultado que pasó el umbral seleccionado por lo
que no se generó tabla (p corregida por FDR < 0.02, «odds ratio log» 3.44, «pvalue»
9.28e-7, «adj pvalue» 4.02e-3).
Los resultados en RDAVID mostraron enriquecimiento en agrupaciones funcionales de
UCSC_TFBS, en el análisis en el subconjunto de hombres (Anexo 9). Asimismo, los
resultados de agrupación funcional «gene functional classification» de los genes
hipermetilados en el subconjunto de hombres muestran en general la preservación de
grupos para la totalidad de los sujetos descritos en el numeral 1.2.3 del presente capítulo
(Anexo 10).
60
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.2.5 INTERSECCIÓN DE RESULTADOS EN LOS ANÁLISIS DMP
La intersección entre los resultados de DMP en EA en comparación de controles en la
totalidad de los sujetos (numeral 1.2.1, Capítulo 1) y
los resultados de DMP del
subconjunto de hombres (numeral 1.2.4, Capítulo 1), 46% de las 401 DMP del análisis en
el subconjunto hombres se encontraron en intersección, constituyendo 185 posiciones
diferencialmente metiladas (Ilustración 6).
DMPs en enfermedad de Alzheimer .
del análisis con todos los sujetos
DMPs en enfermedad de Alzheimer
del análisis con subconjunto hombres
.
-
Ilustración 6. Diagrama de Venn que muestra la intersección de DMPs encontradas en análisis con todos los
sujetos y el análisis con subconjunto hombres. Circulo en cian representa las DMPs encontradas en el análisis
con la totalidad de los sujetos, el circulo en rosado las encontradas en análisis para el conjunto de hombres y
la intersección de ambos análisis queda en magenta.
De estas 185 sondas diferencialmente metiladas en EA, 174 presentaron aumento de
metilación, y 11, disminución de metilación. 60 sondas no cumplieron con el criterio de
correspondencia de genes numeral 1.1.5 de este capítulo y las restantes 125 si cumplieron
dicho criterio y se les encontró en correspondencia con 130 genes (Tabla 8). De los 130
genes, 122 muestran mayor metilación en EA en comparación con controles y 8 genes
muestran menor metilación en EA (Tabla 8).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
61
Tabla 8. Sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA, encontradas en la
intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de hombres.
Probe ID
cg00426855
cg00756845
cg00966078
cg01120761
cg01303420
cg01413281
cg01441308
cg01539849
cg01539849
cg02119693
cg02775223
cg03406844
cg03853620
cg03886558
cg04126335
cg04126335
cg04126335
cg04212229
cg04395431
cg05858008
cg06022698
cg06546787
cg06709442
cg07056967
cg07584855
cg07665923
cg07683388
cg07731871
cg08485001
cg08486903
cg08925882
cg09490371
cg09852619
cg10001172
cg10432569
cg10815657
cg10976009
cg11657665
cg11724970
cg11724970
cg11750851
cg11793499
cg11871295
cg11879776
cg11938672
Gene ID
10874
26034
2048
170482
152078
1147
274
6688
91252
4430
503835
7130
5166
64333
100132406
100288142
8515
185
57697
122786
222546
245915
56341
4041
3142
84310
91526
783
400685
57154
2950
347694
80005
1763
406972
8612
390443
10053
100133311
3202
3491
10877
30827
10047
253769
cg12750757
100128993
cg13636371
cg13781408
cg13841627
cg14286594
cg14802609
cg14845962
cg14845962
cg14887099
cg14975015
cg15109118
25861
9625
117531
80155
84898
100130776
116986
10301
50617
10667
Gene Symbol
NMU
IPCEF1
EPHB2
CLEC4C
PQLC2L
CHUK
BIN1
SPI1
SLC39A13
MYO1B
DUXA
TNFAIP6
PDK4
ARHGAP9
NBPF10
NBPF20
ITGA10
AGTR1
FANCM
FRMD6
RFX6
DEFB112
PRMT8
LRP5
HLX
C7orf50
ANKRD44
CACNB2
LOC400685
SMURF1
GSTP1
ECEL1P2
DOCK5
DNA2
MIR196A1
PPAP2C
RNASE9
AP1M2
HOXA-AS3
HOXA5
CYR61
CFHR4
CXXC1
CST8
WDR27
LOC1001289
93
DFNB31
AATK
TMC1
NAA15
PLXDC2
AGAP2-AS1
AGAP2
DLEU1
ATP6V0A4
FARS2
dir
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑+
↑
↑
↑
Probe ID
cg17251384
cg17606558
cg17616677
cg17965690
cg17970299
cg18061395
cg18412984
cg18412984
cg18454133
cg18587683
cg18946602
cg19022697
cg19072128
cg19119945
cg19498600
cg19498600
cg19537932
cg19647370
cg19753914
cg19966146
cg19969733
cg19969733
cg19983221
cg20255370
cg20295353
cg20585916
cg20622410
cg20695587
cg20751057
cg20756454
cg20756454
cg20988440
cg20988440
cg20997268
cg21053224
cg21134232
cg21134610
cg21330976
cg21785710
cg21806242
cg22090150
cg22502450
cg22507723
cg22594071
cg22606262
Gene ID
401124
116511
9723
57153
25946
4651
3320
91833
10278
285962
4774
55001
51665
91653
221016
79741
403284
11228
51454
389396
8809
9173
55626
440275
22890
57587
3728
389208
80254
147172
6459
406950
8847
9586
767569
3200
30827
147463
51057
89849
51479
132243
116986
389158
388531
Gene Symbol
DTHD1
MAS1L
SEMA3E
SLC44A2
ZNF385A
MYO10
HSP90AA1
WDR20
EFS
WEE2-AS1
NFIA
TTC22
ASB1
BOC
NA
CCDC7
OR6C68
RASSF8
GULP1
GLYATL3
IL18R1
IL1RL1
AMBRA1
EIF2AK4
ZBTB1
CFAP97
JUP
TMPRSS11F
CEP63
LRRC37BP1
SH3GL1P2
MIR16-1
DLEU2
CREB5
SNORD113-9
HOXA3
CXXC1
ANKRD29
WDPCP
ATG16L2
ANKFY1
H1FOO
AGAP2
PLSCR5
RGS9BP
cg22686716
51592
TRIM33
Dir
↑
↑+
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑+
↑+
↑
↑
↑
↑
↑
↑+
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑+
↑
↑
↑
cg22904711
cg23098789
cg23722778
cg25407540
cg25578728
cg25631092
cg25749982
cg25941682
cg26421169
cg26549831
3783
84435
22875
735
55636
9779
84698
5151
643733
4815
KCNN4
GPR123
ENPP4
C9
CHD7
TBC1D5
CAPS2
PDE8A
LOC643733
NINJ2
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
62
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
cg15147693
cg15171154
cg15255329
cg15951897
cg15974867
cg16023991
cg16056941
cg16150863
cg16201598
cg16206364
cg16404898
cg16656078
cg16748008
51473
7048
3904
29063
595
8848
83699
116511
56521
126129
2559
22936
3200
DCDC2
TGFBR2
LAIR2
ZCCHC4
CCND1
TSC22D1
SH3BGRL2
MAS1L
DNAJC12
CPT1C
GABRA6
ELL2
HOXA3
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑+
↑
↑
↑
↑
↑+
cg27320005
cg00448395
cg02388795
cg09922117
cg10379050
cg10379050
cg14189571
cg15463457
cg17405012
cg20080079
cg20080079
cg26345971
cg26345971
83884
25913
4673
728568
144448
84125
132625
22915
1129
144448
84125
144448
84125
SLC25A2
POT1
NAP1L1
C12orf73
TSPAN19
LRRIQ1
ZFP42
MMRN1
CHRM2
TSPAN19
LRRIQ1
TSPAN19
LRRIQ1
↑
↓
↓
↓
↓+
↓+
↓
↓
↓
↓+
↓+
↓+
↓+
Convenciones. Probe ID: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K. Gene ID: Código
numérico oficial en base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica o National Center
for Biotechnology Information (NCBI) en Estados Unidos. Gene Symbol: símbolo único de la base de genes
de NCBI. dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento o disminución de metilación en EA.
+: representa los genes de los que se encontró cambio concordante en más de una sonda del análisis DMP.
Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su rápida localización.
1.2.5.1 CLASIFICACIÓN EN GRUPOS FUNCIONALES Y ENRIQUECIMIENTO
EN AGRUPACIONES FUNCIONALES DE LAS DMP EN INTERSECCIÓN
Utilizando los 122 genes con aumento de metilación en EA en la intersección, se usó la
herramienta Babelomics para análisis de enriquecimiento funcional. A pesar de que dichos
genes correspondieron a menos de 90 identificadores con anotación para su análisis, se
preservaron las ontologías relacionadas con prolongaciones sinápticas y crecimiento
axonal mostradas en los análisis anteriores, como se muestra a continuación (Tabla 9).
Tabla 9. Ontologías relacionadas con componente subcelular de sondas diferencialmente hipermetiladas para
EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de hombres,
en capas de neuronas piramidales.
Funt. Term
axon(GO:0030424)
axonal growth cone
(GO:0044295)
neuronal
cell body(GO:0043025)
retromer complex
(GO:0030904)
Term Term List
size L sizeG pos
347 359
4
List
neg
118
List %
3.28
G
G neg G %
pos
343 207573 0.16
19
19
2
120
1.64
17
379
379
6
116
4.92
30
34
2
120
1.64
207899 0.01
List pos IDs
BIN1,SMURF1,
EPHB2,BOC
BOC, AATK
odds p-value adj
ratio log
pvalue
3.02 5.72E-5 1.76E-2
5.32
5.79E-5 1.76E-2
373 207543 0.18
3.36
1.19E-7 1.08E-4
28
4.82
1.47E-4 3.34E-2
KCNN4,MYO10,
SMURF1,EPHB2, BOC,
ZNF385A
207888 0.01
TBC1D5,ANKFY1
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de
identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en cuestión en el genoma
completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de
identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %:porcentaje de identificadores de la lista
anotada para el término funcional. G pos: número de identificadores en el genoma, anotados para el término
funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. List pos IDs:
símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de
probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional para la lista en relación al genoma
completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher
luego de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados
mencionados en la discusión, para facilitar su rápida localización.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
63
El resultado de enriquecimiento de ontologías de función molecular y procesos biológicos,
muestra principalmente unión a fosfatidilinositol trifosfato (GO:0005547), respuesta a
componentes orgánicos y desarrollo embrionario, componentes resumidos en conjunto
como se muestra a continuación (Tabla 10). El reporte detallado de este análisis y registro
del
corrido
en
la
web
de
babelomics.org
[/cavargaspoWorkSpace/analysis/
20150507192657/] está disponible para el lector que lo solicite.
Tabla 10. Ontologías relacionadas con procesos biológicos y función molecular de sondas diferencialmente
hipermetiladas para EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el análisis del
subconjunto de hombres, en capas de neuronas piramidales.
Funt. Term
Term Term List
size L size G pos
G
pos
G neg
List pos IDs
odds
ratio
log
pvalue
adj
pvalue
207839
ARHGAP9,
MYO1B,
MYO10
4.22
1.56E-5
2.67E-2
6.67E-5
3.20E-2
3.05E-9
1.76E-5
6.08E-5
3.19E-2
List
neg
List
%
3
119
2.46 77
3
119
2.46 127 207789
4
118
3
119
3
119
2.46 111 207805
121 126
4
118
3.28 117 207799
4.10
9.07E-7
2.62E-3
55
3
119
2.46 52
4.61
5.05E-6
4.91E-3
GO molecular function
phosphatidylinositol-3,4,5trisphosphate binding (GO:0005547)
80
86
GO biological process
smoothened signaling pathway
130 130
(GO:0007224)
mammary gland alveolu development
30 30
(GO:0060749)
response to organic cyclic compound
126 126
(GO:0014070)
response to organic substance
114 114
(GO:0010033)
Palate development
(GO:0060021)
cellular response to starvation
(GO:0009267)
55
BOC,TGFBR2,
3.72
WDPCP
HOXA5,CHUK,C
3.28 26 207890
5.60
CND1, AGAP2
NFIA,CCND1,T
2.46 123 207793
3.75
GFBR2
CHUK,CCND1,
3.85
TGFBR2
CHD7,EPHB2,T
GFBR2,WDPCP
EIF2AK4,PDK4,
207864
CAPS2
4.51E-5 2.60E-2
Arriba ontologías de «funciones moleculares». Abajo ontologías de «procesos biológicos»; se muestran
resultados con más de dos genes (intersección de DMPs de análisis entre sujetos completos y análisis
subconjunto hombres). Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term
size L: Número de identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en
cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término
funcional. List neg: número de identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List
%:porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G pos: número de identificadores
en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no
anotados para el término funcional. List pos IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término
funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el
término funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p de la prueba exacta de
Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples
de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
64
Los
resultados
de
agrupamiento
funcional
usando
la
herramienta
«DAVID-
RDAVIDWebService» específicamente de sitios de unión de factores de trascripción
«UCSC_TFBS» también mostraron enriquecimientos significativos (Tabla 11). De forma
adicional, se muestran los resultados de la clasificación funcional de los genes
correspondientes a la intersección de DMP entre ambos análisis usando la función
funtionalClasification del paquete RdavidWS (Anexo 11).
Tabla 11. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» de sondas hipermetiladas
para EA encontradas en intersección del análisis de la muestra total con el análisis del subconjunto de
hombres, en capas de neuronas piramidales.
UCSC_TFBS
Term
Count %
PValue
List
Total
Pop Hits
Pop Total
Fold E
P Value after
Bonforroni correction
Benjamini
FDR
correction
CART1
70
57
1.38E-06
112
7757
19536
1.57
2.4E-04
2E-04
SOX5
69
57
5.85E-06
112
7857
19536
1.53
1.0E-03
5E-04
TST1
63
52
3.25E-05
112
7189
19536
1.53
5.7E-03
2E-03
HFH3
59
48
4.82E-05
112
6613
19536
1.56
8.5E-03
2E-03
S8
64
52
5.00E-05
112
7446
19536
1.50
8.8E-03
2E-03
HFH1
62
51
1.43E-04
112
7342
19536
1.47
2.5E-02
4E-03
RSRFC4
64
52
1.45E-04
112
7682
19536
1.45
2.5E-02
3E-03
IK3
61
50
1.95E-04
112
7246
19536
1.47
3.4E-02
4E-03
LHX3
53
43
2.38E-04
112
5987
19536
1.54
4.1E-02
4E-03
NKX61
59
48
3.78E-04
112
7068
19536
1.46
6.4E-02
6E-03
FOXO3
42
34
4.62E-04
112
4429
19536
1.65
7.8E-02
7E-03
MRF2
68
56
1.21E-04
112
8325
19536
1.42
2.1E-02
4E-03
Se utiliza el sistema de anotación utilizado en la base de datos NIH/NIAID para anotación, visualización y
descubrimiento Integrado (DAVID). Convenciones. «Category»: Agrupación funcional. «UCSC_TFBS»: sitios
de unión a factores de transcripción de la base UCSC asociados a los resultados. Punto de corte P<0.02
corrección de Bonferroni. «Count»: Se refiere al número de genes «alterados» dentro de cada ontología y su
porcentaje correspondiente. P value: es el resultante de la prueba exacta de Fisher (P ≤ 0.05); «FoldE»: se
refiere a la tasa de enriquecimiento encontrado en la lista de resultados positivos en comparación con el
enriquecimiento de esa ontología en el genoma completo. List Total: se refiere al número toral de genes
anotados dentro delos resultados positivos; Pop Hits y Pop Total, se refiere al número de genes en la base
de daos para la categoría, y en general, respectivamente. Punto de corte valor p corregido < 0.01. La linea
horizontal destaca los resultados por encima de ella con un enriquecimientoFoldE ⪆1.5. Se subrayan
resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
65
1.2.6 RESULTADOS REGIONES DIFERENCIALMENTE
METILADAS (DMR)
1.2.6.1 RESULTADOS GENERALES DE DMR (TODOS LOS SUJETOS)
Se usaron los parámetros explicados en métodos que incluyen el filtro de la corrección de
Bonferroni, agregando un filtro adicional de delta de beta, que fue adicionado al paquete
DMRcate. En relación a este filtro, el autor de esta tesis realizó un aporte al código
bioinformático del paquete DMRcate Open-source, agregándole la posibilidad de usar un
filtro delta de beta neto denominando a dicho parámetro «DeltaBetacutoffNetMean» lo cual
se explica en métodos numeral 1.1.7 de este capítulo. Se encontraron 395 rangos
diferencialmente metilados en EA en comparación con controles para el análisis incluyendo
la totalidad de los sujetos (Anexo 12).
Los rangos con dos o más CpGs tienen adicional al soporte estadístico de cada CpG, un
soporte biológico adicional, pues las CpGs están en vecindad genómica no mayor a 200
pares de bases y tienen dirección concordante de cambio de metilación. A continuación se
muestran las 25 regiones diferencialmente metiladas destacadas en todos los sujetos
(Tabla 12).
Tabla 12. Primeros 25 resultados de análisis de metilación regional diferencial (DMR) en EA en capas de
neuronas piramidales identificados para la totalidad de la muestra de sujetos.
hg19 coord
widt
gene assoc
h
TSPAN19,
312
LRRIQ1
#
minpval
p
1stExon,5'UTR,T 1
5.30E-24
SS200,TSS1500 0
mean
pval
maxb mean
dir
etafc Dbeta
1.55E-13
-0.17 -0.084 ↓
9 4.61E-23
4.16E-04
0.12
0.065
↑
7 6.23E-21
9.01E-07
0.10
0.072
↑
CXXC1
KCNJ1
C12orf73
PDK4
TNFAIP2
ECEL1P2
DTHD1
5'UTR,TSS1500
TSS200,Body,5'U
TR,1stExon
TSS1500
TSS200
TSS1500
Body
Body
TSS200
Body
MAP4K1
Body
MIR196A1
Body
3
6
3
2
3
3
2
3
2
1
1
1
3
2
1.77E-12
3.84E-09
5.68E-09
1.80E-09
3.47E-08
2.05E-07
1.38E-07
4.58E-07
1.78E-06
6.47E-07
6.48E-07
6.71E-07
3.16E-03
1.36E-06
0.14
0.13
-0.08
0.10
0.07
0.14
0.08
0.09
0.10
0.14
0.08
0.11
0.11
0.08
0.104
0.060
-0.065
0.062
0.060
0.120
0.061
0.067
0.101
0.122
0.081
0.112
0.064
0.060
↑
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
1
chr12:85430025-85430336
2
chr7:27154845-27155548
704 HOXA3
3
chr19:10736006-10736355
350 SLC44A2
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
chr18:47815407-47815430
chr11:128737300-128737467
chr12:104351201-104351300
chr7:95222092-95222104
chr14:103593503-103593520
chr2:233251770-233251881
chr4:36333625-36333629
chr19:56061334-56061348
chr19:39087135-39087186
chr2:151284413-151284413
chr17:46709858-46709858
chr17:42029727-42029727
chr5:2225323-2225482
chr8:142986649-142986670
24
168
100
13
18
112
5
15
52
1
1
1
160
22
group
1.76E-12
7.04E-12
1.42E-09
1.73E-09
3.26E-08
3.46E-08
1.37E-07
4.31E-07
5.45E-07
6.47E-07
6.48E-07
6.71E-07
1.05E-06
1.33E-06
66
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
18 chr1:100681010-100681102
19 chr2:192161142-192161142
20 chr12:58131681-58131768
93
1
88
DBT
MYO1B
AGAP2
21 chr7:27153580-27153663
84
HOXA3
22
23
24
25
1
1
1
3
FAM153C
KPNA2
Body
Body
1stExon,Body
5'UTR,1stExon,
TSS200
1stExon,5'UTR
TSS1500
DSG3
TSS1500
chr5:177436178-177436178
chr17:66030553-66030553
chr5:90654191-90654191
chr18:29026301-29026303
2 1.36E-06
1 1.47E-06
2 2.13E-06
2.81E-06
1.47E-06
8.72E-06
0.09
0.11
0.09
0.073
0.090
0.077
↑
↑
↑
5 2.30E-06
2.43E-06
0.10
0.079
↑
1
1
1
2
6.16E-06
6.21E-06
6.48E-06
1.63E-05
0.13
0.11
0.10
0.09
0.107
0.102
0.088
0.068
↑
↑
↑
↑
6.16E-06
6.21E-06
6.48E-06
1.63E-05
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del
UCSC genome Browser (Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia
genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5
de este capítulo. group: anotación de localización génica según anotación original de illumina. #p: número de
sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un conjunto de valores p correspondientes a
sondas adyacentes. meanpval: media de valores p, de un conjunto de valores p correspondientes a sondas
adyacentes. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de Bonferroni. maxbetafc:
máximo valor del cambio relativo en número veces de los «valores M» en las sondas que soportan el rango.
mean Dbet: es la diferencia neta entre los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro
«DeltaBetacutoffNetMean». dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento o disminución de
metilación en EA. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
1.2.6.2 RESULTADOS DMR EN SUBCONJUNTO HOMBRES
Se siguieron los parámetros descritos en métodos numeral 1.1.7. usando como punto de
corte de significancia estadística una p<0.05 luego de corrección para pruebas múltiples
(Benjamini & Yekutieli, 2001). A continuación se tabulan las regiones diferencialmente
metiladas destacadas en el análisis del subconjunto de hombres. En aras de la fluidez en
la lectura del documento la tabla de resultados completa se muestra en resultados anexos
(Anexo 13). A continuación se presentan únicamente los 25 resultados que encabezan la
tabla de rangos diferencialmente metilados (Tabla 13).
Tabla 13. Primeros 25 resultados de análisis de metilación regional diferencial (DMR) en EA en capas de
neuronas piramidales, análisis para el subconjunto de hombres.
hg19 coord
width
1
chr8:335522-335677
156
2
chr19:10736006-10736117
112
3
chr7:27154845-27155173
329
4
chr12:85430025-85430336
312
5
chr12:58119915-58120011
97
6
chr15:40268610-40268777
168
7
chr16:24857497-24857601
105
8
9
10
11
chr18:47815407-47815430
chr5:140683632-140683772
chr8:335281-335353
chr11:128737300-128737467
24
141
73
168
gene
assoc
Group
5
max
netmean
dir
betafc Dbeta
↑
3.17E-20 5.11E-07 0.10
0.07
↑
6.60E-17 2.29E-16 0.10
0.08
7
8.48E-17 5.85E-04
0.13
0.07
↑
10
2.01E-14 9.97E-07
-0.15
-0.08
↓
5
5.70E-14 8.01E-13
0.07
0.06
3
1.44E-12 4.93E-08
0.17
0.16
3
5.01E-11 1.83E-10
0.07
0.07
3
7
3
6
1.55E-08
4.82E-08
7.73E-08
1.25E-07
0.14
0.11
0.08
0.14
0.12
0.06
0.07
0.06
#p
minpval
3
TSS200,
Body
5'UTR,
HOXA3
TSS1500
1stExon,
TSPAN19,L 5'UTR,
RRIQ1
TSS200,
TSS1500
AGAP2,
3'UTR,TSS20
LOC100130
0
776
EIF2AK4
Body
TSS200,
SLC5A11
1stExon,
5'UTR
CXXC1
TSS1500
SLC25A2
TSS200
SLC44A2
KCNJ1
TSS200
meanpval
↑
1.59E-08
1.55E-07
6.10E-07
2.77E-04
↑
↑
↑
↑
↑
↑
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
67
Tabla 13. Primeros 25 resultados de análisis de metilación regional diferencial (DMR) en EA en capas de
neuronas piramidales, análisis para el subconjunto de hombres.
12
13
14
15
16
17
18
hg19 coord
width
chr2:127811805-127811853
chr7:27155548-27155548
chr19:56061334-56061348
chr14:103593503-103593520
chr12:104351201-104351300
chr18:74799495-74799572
chr3:112929830-112929835
49
1
15
18
100
78
6
gene
assoc
BIN1
HOXA3
TNFAIP2
C12orf73
MBP
19 chr7:27153580-27153663
84
HOXA3
20
21
22
23
24
25
52
1
112
145
117
206
MAP4K1
MIR196A1
ECEL1P2
HOXA5
ZNF385A
ARRDC2
chr19:39087135-39087186
chr17:46709858-46709858
chr2:233251770-233251881
chr7:27182493-27182637
chr12:54772688-54772804
chr19:18120614-18120819
Group
Body
5'UTR
Body
TSS1500
Body
5'UTR,
1stExon,
TSS200
Body
Body
TSS200
Body
Body
Body
#p
minpval
meanpval
max
netmean
dir
betafc Dbeta
↑
0.09
0.08
↑
0.09
0.09
↑
0.08
0.08
↑
0.07
0.06
↓
-0.08 -0.07
↑
0.09
0.08
↑
0.13
0.10
2
1
3
3
3
3
2
2.63E-07
4.13E-07
7.13E-07
8.88E-07
1.00E-06
1.06E-06
1.08E-06
5
1.54E-06 1.91E-06
0.10
0.08
↑
2
1
3
2
2
5
1.78E-06
2.07E-06
2.21E-06
2.24E-06
2.32E-06
2.85E-06
0.10
0.08
0.14
0.08
0.09
0.08
0.11
0.08
0.13
0.06
0.07
0.06
↑
↑
↑
↑
↑
↑
4.99E-07
4.13E-07
7.14E-07
8.88E-07
5.02E-06
3.58E-06
1.13E-06
2.51E-06
2.07E-06
6.44E-06
1.92E-02
5.14E-03
1.11E-03
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del
UCSC genome Browser (Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia.
width: corresponde a la amplitud del rango. genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio de
búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo. Group: anotación de localización génica según
anotación original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un
conjunto de valores p correspondientes a sondas adyacentes. meanpval: media de valores p, de un conjunto de
valores p correspondientes a sondas adyacentes. maxbetafc: máximo valor del cambio relativo en número veces
de los «valores M» en las sondas que soportan el rango. netmean Dbeta: es la diferencia neta entre los valores
Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro «DeltaBetacutoffNetMean». dir: flecha roja ↑ o verde
↓, indican la presencia de aumento o disminución de metilación en EA. Los valores de p corresponden a valores
ajustados por la corrección de Bonferroni del análisis en el que se incluyeron todos los sujetos. Las regiones
soportadas por dos o más CpG se marcan en negrilla. La tabla completa se muestra en forma anexa (Anexo 13).
genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de
este capítulo. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
68
1.2.7 RESULTADOS SUPERPOSICIÓN DE RANGOS
Para determinar la superposición de las regiones diferencialmente metiladas (DMR) se
utilizó el entorno de programación R, usando las funciones, subsetByOverlaps y pintersect
del paquete GenomicRanges (Carey, 2013) de acuerdo con lo descrito en el numeral
1.1.8.3 de este capítulo.
Se encontró intersección regional perfecta en 150 DMR entre los análisis del subconjunto
de hombres y el de todos los sujetos. La totalidad de los rangos se muestran de forma
anexa (Anexo 14). De estas regiones, 52 tienen una amplitud mayor a uno, estando
soportadas por más de una sonda y no sólo por posiciones aisladas (Tabla 14).
Tabla 14. 52 Regiones diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales, soportadas por
más de una secuencia CpG, en superposición genómica perfecta entre el análisis del conjunto completo de
sujetos y el del subconjunto de hombres.
Chr Start (hg19)
End (hg19)
width
genes assoc.
group
Admeanpval
dir
chr1
100681010
100681102
93
DBT
Body
2.81E-06
↑
chr1
115003633
115003638
6
TRIM33
Body
1.87E-05
↑
chr1
160856347
160856352
6
ITLN1
TSS1500
1.68E-05
↑
chr2
127811805
127811853
49
BIN1
Body
4.35E-05
↑
chr2
233251770
233251881
112
ECEL1P2
TSS200
2.05E-07
↑
chr4
186350505
186350559
55
C4orf47
TSS200,
1stExon, 5'UTR
3.17E-05
↑
chr5
2225401
2225482
82
3.16E-03
↑
chr5
102465317
102465432
116
PPIP5K2
1stExon,Body
7.25E-04
↑
chr6
26970375
26970418
44
LINC00240
Body
1.75E-04
↑
chr6
29456563
29456577
15
MAS1L
TSS1500
3.24E-05
↑
chr6
121755296
121755306
11
GJA1
TSS1500
7.60E-03
↑
chr6
152130058
152130207
150
ESR1
Body
2.23E-02
↑
chr7
27146237
27146262
26
HOXA3
3'UTR
1.55E-03
↑
chr7
27147513
27147590
78
HOXA3
3'UTR,Body
4.39E-04
↑
5'UTR,1stExon,
TSS200
2.43E-06
↑
chr7
27153580
27153663
84
HOXA3
chr7
27154845
27155173
329
HOXA3
5'UTR,TSS1500
4.16E-04
↑
chr7
27170552
27170554
3
HOXA4
TSS200,TSS1500
1.22E-02
↑
chr7
27179426
27179432
7
HOXA-AS3
TSS500
6.26E-04
↑
chr7
55712936
55712946
11
3.57E-04
↑
1.36E-06
↑
7.73E-04
↑
6.50E-04
↑
chr8
142986649
142986670
22
chr10
96830102
96830111
10
chr10
131631671
131631713
43
chr11
7951216
7951221
6
OR10A6
TSS1500
1.86E-05
↑
9
GSTP1
TSS1500
3.67E-02
↑
chr11
67350491
67350499
CYP2C8
TSS1500
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
69
Tabla 14. 52 Regiones diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales, soportadas por
más de una secuencia CpG, en superposición genómica perfecta entre el análisis del conjunto completo de
sujetos y el del subconjunto de hombres.
Chr Start (hg19)
chr11
73054121
End (hg19)
width
genes assoc.
group
Admeanpval
dir
73054185
65
ARHGEF17
Body
2.34E-02
↑
chr11
77299960
77299962
3
AQP11
TSS1500
3.94E-03
↑
chr11
128737300
128737467
168
KCNJ1
TSS200
3.84E-09
↑
chr12
9903429
9903454
26
5.35E-05
↓
chr12
58131681
58131768
88
AGAP2
1stExon,Body
8.72E-06
↑
chr12
58132093
58132105
13
AGAP2
TSS200,Body
7.03E-04
↑
chr12
104351201
104351300
100
C12orf73
TSS1500
5.68E-09
↓
chr12
75057893
75057913
21
3.96E-03
↑
TSPAN19,LRRIQ1
1stExon,5'UTR,
TSS200,TSS1500
1.55E-13
↓
chr12
85430025
85430336
312
chr12
109678885
109678973
89
ACACB
Body
1.36E-04
↑
chr12
121890864
121890907
44
KDM2B
Body
5.52E-03
↑
chr13
36421844
36421949
106
MIR548F5,DCLK1
Body
2.14E-03
↑
chr13
41593519
41593582
64
ELF1
TSS200
1.03E-04
↑
chr14
103593503
103593520
18
TNFAIP2
Body
3.47E-08
↑
chr17
3848156
3848169
14
ATP2A3
Body
3.01E-05
↑
chr18
29026301
29026303
3
DSG3
TSS1500
1.63E-05
↑
chr18
47815407
47815430
24
CXXC1
TSS1500
1.77E-12
↑
chr18
55400078
55400167
90
ATP8B1
TSS1500
3.60E-03
↑
chr18
64271469
64271503
35
CDH19
TSS1500
1.17E-02
↑
chr18
74799500
74799572
73
MBP
Body
3.65E-02
↑
chr19
1071176
1071208
33
HMHA1
Body
6.00E-05
↑
chr19
6334625
6334635
11
ACER1
TSS1500
9.20E-05
↑
chr19
10736006
10736117
112
SLC44A2
TSS200,Body
9.01E-07
↑
9.01E-07
↑
chr19
10736299
10736355
57
SLC44A2
5'UTR,1stExon,
Body
chr19
39087135
39087186
52
MAP4K1
Body
1.78E-06
↑
chr19
44278551
44278628
78
KCNN4
Body
5.42E-04
↑
chr19
56061334
56061348
15
4.58E-07
↑
chr21
45705618
45705742
125
2.76E-04
↑
AIRE
TSS200
Abreviaturas. chr: cromosoma. «start» y «end»: coordenadas hg19 para inicio y final de los rangos. genes
assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este
capítulo. width: amplitud en pb del rango genómico diferencialmente metilado. genes assoc: asignación
génica corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo. Group:
anotación de localización génica según anotación original de illumina. Admeanpval: valor e p promedio de
los CpGs del rango que corresponde a valores ajustados por la corrección de Bonferroni del análisis en el
que se incluyeron la totalidad de los sujetos. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para
facilitar su localización.
Finalmente, se menciona que un archivo de formato Bed.graph que permite fácil
visualización de regiones diferencialmente metiladas de este análisis, será colocado en
repositorio público para su descarga por investigadores interesados.
70
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.2.8 REVALIDACIONES DE DMP CON DMR Y PRIORIZACIÓN
A manera de revalidación estadística de las DMP encontradas en la intersección entre el
análisis de DMP del conjunto completo de sujetos y el análisis del conjunto completo de
hombres (Tabla 8), se indagó cuáles de éstas, se soportaban además, por los rangos
genómicos coincidentes entre DMR para el conjunto de hombres y el conjunto completo de
sujetos (Anexo 14). En este abordaje se encontraron 59 concordancias reiteradas que
robustecen esas 59 posiciones DMP iniciales junto con sus sondas correspondientes.
Adicionalmente, los genes correspondientes a este análisis fueron clasificados mediante el
uso de un software de priorización -como un valor agregado a esta selección-, con base en
fenotipos asociados a anotaciones de GeneCards/MaLaCards según se describe en el
numeral 1.1.8.3 de la sección de métodos. Los resultados muestran 9 genes como
relacionados con EA (Tabla 15).
Estas 59 posiciones son resultados especialmente robustos, al igual que los 52 rangos
soportados por múltiples sondas del análisis de DMRs (veasé, Tabla 14), por lo cual fueron
analizados por priorización (veasé, Tabla 15 y Anexo 16) y más adelante, en el capítulo 4
de este documento, serán contrastados con los hallazgos en sangre para buscar posibles
similitudes de forma tan robusta como sea posible.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
71
Tabla 15. Resultados ensayo de priorización de 59 posiciones diferencialmente metiladas en EA en capas de
neuronas piramidales corroboradas por rangos y encontradas en la intersección entre el análisis de la muestra
total con el análisis del subconjunto de hombres.
Abreviaturas. Symbol: símbolo del gen en la base de datos de símbolo único de la base de genes de NCBI. Description:
nombre del gen en la base de datos del NCBI. Category: información de la categoría del gen de acuerdo a si codifica una
Proteína, miRNA o es un pseudogen. Score: puntaje que indica la fuerza de la conexión entre el fenotipo de interés y cada gen
en este caso en un rango de 1.7 a 7, dicho puntaje es relativo a cada corrido y tiene como propósito permitir el orden de los
genes por el sistema de priorización usado por el software «VarElect», en relación cercana probable al fenotipo de interés en
este caso «Alzheimer’s Disease». Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
72
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.3 DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO 1
1.3.1 DISCUSIÓN DE ASPECTOS METODOLÓGICOS
El abordaje metodológico utilizado en el presente trabajo, se concentró en obtener
información sobre patrones epigenéticos de metilación de ADN relevantes a la EA, para
ello se obtuvo DNA mayoritariamente de neuronas piramidales corticales las cuales son
particularmente susceptibles a ser afectadas mediante la patología de la EA (Bussiere et
al., 2003; Luebke et al., 2010). Para la selección realizada de corteza frontal, se tuvo en
cuenta que esta corteza presenta una celularidad comprensiblemente más conservada que
regiones con compromiso total como el hipocampo lo que representa una ventaja para su
estudio epigenético y que tiene además disponibilidad suficiente en los bancos de cerebros
de EA. En el presente trabajo se logró conseguir cantidad suficiente de capas de neuronas
piramidales microdisecadas por láser (>500 ng por sujeto), a partir de tejido cerebral
humano criopreservado en fresco y por lo tanto óptimo para el estudio del epigenoma
humano con la plataforma Infinium DNA Methylation 450k.
En el presente estudio la búsqueda de genes candidatos de patrones de metilación
diferencial en EA se realizó mediante un abordaje enfocado en resultados con significado
biológico e interpretación biológica dentro de la enfermedad. Por esta misma razón, la
forma en que se asignaron los genes a las sondas se basó en criterios genómicos
funcionales, en lugar de limitarse a tomar la anotación de illumina que se basa en la
cercanía génica para dar una asignación. Una estrategia usada previamente fue la de
tomar un rango mucho más amplio como fue dispuesto en el importante trabajo realizado
por De Jager y colaboradores (De Jager et al., 2014), en el que se buscaron genes hasta
a 50kb de distancia de las sondas, de lo cual pensamos es un rango problemático que hace
plausible que se genere ruido en los datos dificultando la interpretabilidad biológica de los
patrones de metilación obtenidos (De Jager et al., 2014).
Dentro de las muestras de cerebros humanos obtenidas el subconjunto de hombres
compone un universo importante en el que se ameritó hacer todos los análisis en forma
paralela, a los realizados con la totalidad de los sujetos debido a que, como se puede
observar claramente (Tabla 1), las muestras a las que se logró disponibilidad fueron en su
mayoría hombres. Si se considera la ventaja que implica eliminar por completo el factor de
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
73
género en los análisis de metilación de ADN, los resultados del grupo de hombres
representan un valor agregado dentro del presente trabajo.
Además, teniendo en cuenta la diferencia entre el grupo de EA y el grupo de controles, en
cuanto a la composición de género por grupo (Tabla 1) se realizaron análisis de metilación
diferencial al interior del subconjunto de hombres también con el fin de poder identificar los
resultados concordantes entre los análisis realizados usando todos los sujetos y los análisis
equivalentes usando únicamente los hombres. Es decir, los análisis de DMP y de DMR
fueron corridos con los datos del conjunto completo de sujetos, paralelamente se corrieron
los mismos análisis para el subconjunto de sujetos de género masculino y finalmente se
logró identificar los resultados en intersección de ambos universos (Ilustración 6) que sin
dejar de ser válidos para la totalidad de los sujetos, persisten después de eliminarse
cualquier posibilidad de sesgo por discrepancia en la composición de género entre los
grupos. De esta forma se descarta totalmente que estos resultados de metilación
diferencial entre EA y controles pudieran deberse a una discrepancia de género.
Respecto al análisis de enriquecimiento génico funcional, se utilizaron dos tipos de
abordajes complementarios, en primer lugar usando la herramienta «Gene functional
classification» que provee una clasificación de los genes de forma más inclusiva, útil como
lectura general, que permite agrupar mayor cantidad de genes dentro de grandes grupos
definidos por anotaciones aglomeradas con ciertas similitudes (D. W. Huang et al., 2007).
En segundo lugar y en forma complementaria, realizamos un abordaje usando «functional
annotation clustering», para un análisis centrado en grupos funcionales más estrictos que
evalúa cuáles anotaciones de módulos funcionales, no aglomerados, se encuentran
enriquecidas en la lista de genes. Esta estrategia permite una interpretación más fina pues
provee anotaciones más específicas que están enriquecidas respecto al genoma completo
y permite la inclusión de un gen en más de un módulo funcional (Huang da et al., 2009).
Igualmente, cabe mencionar que es posible realizar análisis funcionales que circunscriban
tanto los genes hipermetilados como los hipometilados, aproximación que ha sido usada
por algunos autores (Ibragimova et al., 2013), sin embargo, en aras de tener resultados
con la mejor interpretabilidad biológica posible, en este trabajo se prefiere no mezclar el
grupo de genes/sondas diferencialmente hipermetilados con el grupo de genes/sondas
diferencialmente hipometilados para análisis de agrupamiento funcional, lo que se conoce
como análisis de sondas direccionalmente correlacionadas (Cruickshank et al., 2013).
74
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.3.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS GLOBALES DE METILACIÓN
DE ADN EN CEREBROS
En el presente estudio en capas de neuronas piramidales de cerebros humanos, la gran
mayoría de los genes encontrados «diferencialmente metilados» con diferencias
estadísticamente significativas, se encontraron con metilación más alta en el grupo de EA,
es decir «diferencialmente hipermetilados en EA», lo cual es concordante con lo observado
en los resultados de un reciente trabajo que estudió la metilación de ADN en homogenados
totales de tejido cortical en EA (De Jager et al., 2014). Además, estos resultados no se
deben a un aumento indiscriminado en la metilación global que fue similar al de los sujetos
control (EA 0.5371± 0.008 NM vs. controles 0.5313 ± 0.01 NM, valor p > 0.05).
Además, en el presente estudio se encontró una mayor cantidad de posiciones
diferencialmente metiladas presentes en orillas de islas CpG, en comparación con las
mismas islas CpG (Ilustración 4), este resultado concuerda con hallazgos reportados
previamente en cáncer y en otros trastornos en los que las orillas de islas CpG han
mostrado mayor posibilidad que las Islas CpG de ser encontradas diferencialmente
metiladas en anormalidad en comparación con el estado control, ratificando la importancia
de estudiar las orillas de islas CpG, también en la EA (Irizarry et al., 2009; Kim et al., 2014).
Cabe mencionar que a diferencia de los genes asignados a loci diferencialmente
hipermetilados en EA, los genes correspondientes a los loci diferencialmente hipometilados
encontrados en el presente estudio no se encontraron funcionalmente enriquecidos dado
su escaso número. Además, en su mayoría correspondieron con genes con función
desconocida por lo que al momento no es posible dar una lectura funcional a estos
hallazgos de hipometilación diferencial. Igualmente, cabe resaltar que las tres regiones más
notorias como patrones diferencialmente hipometilados se hallaron en el cromosoma 12
(Tabla 12): una región asignada a dos genes TSPAN19 y LRRIQ1, otra asignada al gen
C12orf73 y otra sin asignación génica (coordenadas chr12:9903429-54). Por tanto, en
adelante se discuten únicamente los patrones de hipermetilación diferencial.
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
75
1.3.3 DISCUSIÓN DE HALLAZGOS DE ENRIQUECIMIENTO
FUNCIONAL
Incluyéndose la totalidad de los sujetos, nuestros resultados de agrupamiento génico de
ontologías funcionales de localización subcelular de los genes encontrados en un estado
de hipermetilación diferencial en EA, mostraron de forma destacada la ontología axón
(axon, GO:0030424), agrupación en la que se incluye el gen BIN1 (Tabla 4). En forma
similar, se encontraron las ontologías cono de crecimiento axonal (axonal growth cone,
GO:0044295), soma neural (neuronal body, GO:0043025), donde se incluye ZNF385A,
túbulos T (GO:0030315) y sinapsis (synapse, GO:0045202), donde se incluyen los genes
BIN1 y GABRA6 respectivamente, además de otras ontologías dadas principalmente por
componentes de membranas y mielina abaxonal. Estos resultados muestran perfiles de
hipermetilación diferencial en genes relacionados con ontologías funcionales de
prolongaciones neuronales sinápticas y sugieren que la existencia de una alteración
epigenética de los patrones de metilación de ADN encontrados en las capas de neuronas
piramidales corticales en EA, se relaciona con disrupción sináptica (Ilustración 5).
De forma interesante, para el subconjunto de hombres se encontraron no menos ontologías
relacionadas con prolongaciones sinápticas, específicamente, sinapsis (synapse,
GO:0045202), axón (axon, GO: 0030424), cono de crecimiento (growth cone,
GO:0030426), cono de crecimiento axonal (axonal growth cone, GO:0044295) y axolema
(axolemma, GO:0030673). Los resultados encontrados en nuestro «subestudio» del
subconjunto de hombres, muestran una clara correspondencia con ontologías relacionadas
con prolongaciones sinápticas y sinapsis (Anexo 6) a pesar de tener menor número de
sujetos y reitera la relación de los patrones de metilación de la EA con disrupción sináptica.
Dicho «subestudio» representa una fortaleza de este trabajo que muestra como las
diferencias de género pueden afectar este tipo de trabajos de metilación en EA, e indica
que, en futuros trabajos, puede ser útil realizar análisis para los géneros por separado
siempre que el poder estadístico lo permita.
En las ontologías asociadas a «funciones moleculares» en el análisis con la totalidad de
los sujetos (Tabla 5) se encuentra la ontología de actividad oxidoreductasa con capacidad
aceptora de oxígeno por grupos disulfuro (oxidoreductase activity, acting on a sulfur
group of donors, disulfide as acceptor, GO:0016671) y de transporte de oxígeno
76
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
(oxygen transporter activity, GO:0005344) también relacionada con estrés oxidativo
(Perry et al., 2008), revelando la presencia de patrones de metilación de ADN en genes
relacionados con actividad antioxidante en EA. También se encontraron genes agrupados
por su función activadora Tasa y de proteínas Ras-related in brain (Rab) Tasa G
relacionadas con el transporte vesicular altamente específico dependiente de tubulina y
disulfuro isomerasas. Finalmente, se agruparon genes de proteínas fosfatasas, de unión a
grupos fosfato y de unión a fosfatidil inositol 3, 4, 5 trifosfato (Tabla 5) de los cuales MYO10
y PARD3 tienen un papel en desarrollo y diferenciación neuronal (Blasky, Pan, Moens, &
Appel, 2014; Sousa, Berg, Robertson, Meeker, & Cheney, 2006). Para el subconjunto de
hombres, dentro de los resultados de enriquecimiento funcional de ontologías de funciones
moleculares en los genes afectados (Anexo 7), se encuentra la ontología de actividad de
receptor de orientación axonal (axon guidance receptor activity, GO:0008046).
De forma similar, en los resultados de enriquecimiento de las ontologías de «procesos
biológicos» en la totalidad de los sujetos mostrados (véase, numeral 1.2.3.3 de este
Capítulo en la página 51 y Anexo 3), se encontraron ontologías de procesos como
transporte de oxígeno, transporte de calcio y regulación de la metilación del ADN. Para el
análisis del subconjunto de hombres, como se detalló en resultados (véase, numeral
1.2.4.2, en la página 58 y Anexo 6) se encontraron ontologías en relación con
prolongaciones sinápticas, tal como morfogénesis de árbol dendrítico (dendrite
morphogenesis, GO:0048813) y regulación de la axogénesis (regulation of
axonogenesis GO:0050771), asimismo, se encontraron ontologías de procesos biológicos
afines con los encontrados para la totalidad de los sujetos (Anexo 8). Todos estos
resultados en conjunto, presentan una relación con las vías fisiopatológicas del estrés
oxidativo y la disrupción sináptica, mecanismos fisiopatológicos contribuyentes en EA.
Finalmente, los agrupamientos encontrados usando RDAVID en agrupaciones funcionales
de UCSC_TFBS para el análisis en la totalidad de los sujetos (Tabla 6), encontraron en los
primeros 5 lugares los siguientes sitios de unión a factores de transcripción FOXJ2 del cual
se evidenció la importancia en la sobrevivencia en neuronas adultas (Wijchers, Hoekman,
Burbach, & Smidt, 2006); POU3F2 que está involucrado en el destino celular neuronal y
lleva a la transformación directa de fibroblastos a neuronas funcionales en combinación
con otros 2 factores de transcripción (Vierbuchen et al., 2010); FOXO3 el cual ha mostrado
tener papeles en la regulación génica neuronal relacionados con apoptosis (H. K. Wong et
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
77
al., 2013) y puede conferir neuroprotección (Caballero-Caballero et al., 2013); FOXI1 está
implicado en neurodesarrollo de células sensoriales (Fritzsch, Beisel, & Hansen, 2006) y
FOXD3 que está implicado en neurodesarrollo de la cresta neural (Simoes-Costa,
McKeown, Tan-Cabugao, Sauka-Spengler, & Bronner, 2012). De forma similar, para el
subconjunto hombres, el análisis de enriquecimiento en ontologías funcionales de sitios
de unión a factores de transcripción realizado con los genes diferencialmente
hipermetilados en EA, halló en los primeros lugares los grupos funcionales de los sitios
para los factores HFH3, TST1, CART1, FOXO4, FOXD3, OCT, TBP, NKX61, S8, LHX3 y
FOXO3, que se relacionan con neurodesarrollo y expresión génica neuronal (Anexo 9)
(Bhat, Kwon, & Riley, 2013; Lai et al., 2008; W. Lu et al., 2010). El hecho de encontrar el
grupo de genes diferencialmente hipermetilados, asociados a estos sitios de unión a
factores de transcripción, pudiera indicar una posible alteración de la regulación génica
relacionada con las vías en las que están involucrados dichos factores, como
orquestadores de la transcripción génica.
78
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.3.4 DISCUSIÓN ANÁLISIS REGIONALES E INTERSECCIONES
En el análisis para la totalidad de sujetos, mediante DMRcate se encontraron 237 regiones
diferencialmente metiladas de las cuales 232 mostraron cambios hacia hipermetilación.
Asimismo, en el análisis del subconjunto de hombres, se encontraron 395 regiones
diferencialmente metiladas de las cuales
371 regiones mostraron cambios hacia
hipermetilación, tendencia similar a la de los análisis de DMP. De estas DMR, un grupo de
52 regiones mostraron concordancia total en intersección regional perfecta entre los
análisis del subconjunto de hombres y el de todos los sujetos, y adicionalmente una
amplitud mayor a uno, estando soportadas por más de una sonda y no sólo por posiciones
aisladas, entre las cuales se encuentran regiones correspondientes a BIN1, HOXA3,
HOXA4, GSTP1, KDM2B (CXXC2), CXXC1 y MBP(CXXC3), entre otros genes (Tabla 14).
De hecho la importancia de un abordaje que selecciona regiones genómicas DMR, es que
estas tienen plausiblemente más importancia biológica que posiciones genómicas aisladas
y ayuda a evitar falsos descubrimientos mejorando el poder del estudio (Jones, 2012;
Peters et al., 2015; Robinson et al., 2014). Asimismo, se encontró un grupo de 59 sondas
diferencialmente metilados en EA en intersección entre el análisis de sujetos completos y
el del subconjunto de hombres «sobrelapadas» por DMR (Anexo 15). Los patrones de
metilación encontrados por los análisis de intersección fueron reiterativos en un conjunto
de genes y se consideran los hallazgos más destacados del presente estudio.
Usando la intersección de los resultados de DMP del estudio de la totalidad de sujetos y
los resultados DMP del subconjunto de hombres realizamos los análisis de enriquecimiento
funcional. A pesar de que encontramos un bajo número de identificadores con anotación
en todas las ontologías evaluadas por Babelomics (< 90 genes) y que Gene Ontology
Consortium advierte que es difícil encontrar resultados en estos análisis si se incluyen
menos de 150 identificadores (Consortium, 2015) -consultado en http://geneontology.org-;
en el análisis de enriquecimiento en ontologías de componente subcelular de dicha
intersección, continuaron dominando las ontologías relacionadas con prolongaciones
sinápticas, soma neuronal y crecimiento axonal (Tabla 9). De forma similar, utilizando la
lista de DMPs de la mencionada intersección, los análisis de enriquecimiento de las
ontologías encontradas en funciones moleculares y procesos biológicos, mostraron
preservación general de los módulos funcionales encontrados previamente (Tabla 10).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
79
Igualmente, los resultados de sitios de unión a factores de transcripción que encabezan la
lista de enriquecimiento en categorías UCSC_TFBS correspondientes a la mencionada
intersección (Tabla 11), se relacionan con el desarrollo y regulación de la expresión génica
neuronal (Bhat et al., 2013; Lai et al., 2008; W. Lu et al., 2010). Los resultados observados
en el análisis del conjunto de hombres y los encontrados en el análisis de la intersección,
muestran que una vez descartados los datos correspondientes a las mujeres de ambos
grupos (EA y Controles), se mantiene la tendencia de los hallazgos funcionales generales.
80
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1.3.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS MÁS DESTACADOS
Dentro de la lista de genes destacados están BIN1, CXXC1, HOXA3 y GSTP1 que se
encontraron altamente soportados de forma reiterada en los presentes análisis y su
significancia estadística supera incluso la corrección de Bonferroni que es la corrección
más rigurosa para pruebas múltiples. Además de los hallazgos de hipermetilación
diferencial en los genes BIN1 y HOXA3 los cuales fueron reportados recientemente en EA
asociados al diagnóstico y estadio neuropatológico (De Jager et al., 2014) destaca la
presencia de tres genes con función reguladora epigenética, CXXC1, CXXC2 y CXXC3,
encontrados diferencialmente hipermetilados en el presente estudio.
BIN1
El gen BIN1 se encontró diferencialmente hipermetilado en el presente estudio. Este
resultado se encontró en dos posiciones que están a sólo 49 pares de bases entre sí y en
el intrón 12 de BIN1 y se ubican a ~2 kb corriente abajo de un SIT de BIN1 código
CHR2_M0747_R3 de la base «SwitchGear Transcription Start Sites TSS» del UCSC
Genome Browser; la cual define la localización de los TIS canónicos y putativos a lo largo
de todo el genoma en base a evidencia experimental (Karolchik et al., 2014). Este resultado
es consistente con lo encontrado respecto a la expresión transcripcional disminuida en EA
en neuronas piramidales corticales, también en corteza frontal, encontrada en el Capítulo
2 (Tabla 8) y en otros estudios (Glennon et al., 2013).
BIN1 codifica para la proteína «bridging integrator 1» que ha sido implicada en el proceso
de endocitosis mediada por clatrina y sus isoformas proteicas que incluyen su exón 12,
interactúan con clatrina (Tan, Yu, & Tan, 2013). En contexto de su función conocida en la
endocitosis y estabilización de microtúbulos, se ha propuesto que BIN1 puede intervenir en
EA a través de la modulación de tau, en la homeóstasis del calcio, con un posible papel
en neuronas (Evergren et al., 2004; Tan et al., 2013; Taylor, Perrais, & Merrifield, 2011). El
KO de Bin1 lleva a muerte perinatal causada por cardiomiopatía hipertrófica en ratones; sin
embargo, el KO en mosaico de BIN1 en modelo murino llevó a un aumento en la
inflamación en el envejecimiento, lo que también se propuso como un componente en su
contribución a la susceptibilidad a la EA (M. Y. Chang et al., 2007; Tan et al., 2013).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
81
Distintas variaciones genéticas de BIN1 han sido altamente asociadas a EA (Hu et al.,
2011) y actualmente se considera que este gen, luego de APOE, es el segundo en la
contribución genética al riesgo de la EA (H. L. Li et al., 2015). Sin embargo, debido a que
las variantes genéticas han mostrado ser insuficientes para explicar el cambio de expresión
génica de BIN1 encontrado en EA esporádica (Karch et al., 2012) se planteó sobre una
posible importancia de variaciones epigenéticas de BIN1 en EA (Tan et al., 2013).
Concordantemente, nuestros resultados indican una alteración en los patrones de
metilación de ADN en BIN1 en capas de neuronas piramidales corticales en EA por lo que
la región identificada en el presente estudio debe ser considerada como potencial blanco
modulatorio de BIN1 dentro de la EA, a ser evaluada en futuros estudios.
ANK1
El gen ANK1 se encontró diferencialmente hipermetilado en el presente estudio. Esto se
vio tanto en nuestro análisis realizado en el subconjunto de hombres, donde ANK1 se
encontró diferencialmente hipermetilado en EA en comparación de controles en la posición
DMP correspondiente a la sonda «cg05066959» -Anexo 5- (p corregida por FDR = 9.83E03) y en menor grado en los resultados de nuestro análisis con la totalidad de los sujetos,
en el que mostró aumento de metilación en el análisis de DMP y DMR (Anexo 14 y Anexo
24; p corregida por FDR = 0.018).
Concordantemente, en los dos trabajos recientemente publicados conducidos en forma
independiente a este estudio para el estudio de metiloma humano en EA, se reportó el gen
ANK1 hipermetilado en relación con la patología de EA (De Jager et al., 2014; Lunnon et
al., 2014) lo que convalida los hallazgos de ANK1 en los tres estudios. En el presente
trabajo, la localización de la concordancia con los estudios citados, se superpone en una
región genómica exacta (coordenadas hg19, chr8:41519308-41519399). Cabe resaltar que
las diferencias netas del nivel de metilación para ese locus de ANK1 halladas en nuestro
estudio (~0.070), son cerca de 2 veces más claras que las reportadas recientemente
(~0.037), en un estudio de homogenados totales de corteza frontal (Lunnon et al., 2014).
Lo cual se puede relacionar comprensiblemente con el tipo de muestra evaluado, pues
gracias al abordaje de microdisección láser utilizado por nosotros, nuestro estudio tiene
mayor especificidad celular en cuanto a perfiles de metiloma de ADN en cerebros con EA.
82
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANK1 es un gen complejo con múltiples isoformas (Lunnon et al., 2014), en ratones se
conoce que una isoforma de Ank1 se localiza en cuerpos neuronales, nodos de Ranvier,
cono axónico y en segmentos iniciales del axolema (Kordeli & Bennett, 1991). En un
modelo mutante con deficiencia de Ank1 se produce normoblastocis acompañada de
deficiencias
neurológicas
y
se
encontró
expresada
en
neuronas
piramidales,
correlacionando inversamente con su muerte neuronal, por lo cual se propuso que la ANK1
fuera necesaria para la supervivencia neuronal en dicho modelo (Kordeli & Bennett, 1991).
Cabe aclarar que aunque se sabe que la isoforma humana ANK1b, es expresada
abundantemente en cerebros humanos, lo mencionado antes para el modelo murino en
cuanto a su papel y localización en prolongaciones sinápticas (Kordeli & Bennett, 1991),
no es extrapolable a humanos dadas las diversas isoformas humanas de este gen (Yocum,
2012). Considerando lo anteriormente mencionado los resultados aquí encontrados,
evidencian la necesidad de realizar nuevas investigaciones que permitan estudiar tanto los
niveles de expresión así como la localización de cada una de las isoformas de ANK1 en
cerebros humanos con EA.
CREB1
En el presente estudio se observó hipermetilación diferencial del gen CREB1 en capas de
neuronas piramidales de la corteza frontal (Anexo 1). Este resultado es concordante con
el estudio de Rao y colaboradores (Rao et al., 2012) en el cual –con una muestra de 10
sujetos por grupo- se encontró aumento de metilación en EA en el promotor de CREB1 en
homogenados de lóbulo frontal, como se indicó en el Marco Teórico (véase, página 28.
CREB1 tiene un papel epigenético dado por su unión a la proteína de unión a CREB (CBP
del inglés, CREB binding protein), que tiene actividad histona acetiltransferasa (HAT)
funcionando igual que otras HAT catalizando la acetilación causando aumento en la
transcripción de genes relacionados con memoria (Teich et al., 2015). La acetilación de las
histonas H3 y H4 se aumenta durante el aprendizaje espacial y asociativo en hipocampo y
corteza rinal y la inhibición de la actividad HAT lleva a pérdida de memoria (Teich et al.,
2015). Teniendo en cuenta nuestros resultados de hipermetilación diferencial en EA en
CREB1 y que CREB1 desempeña un papel en la consolidación de la memoria dependiente
de su expresión, se sugiere que una regulación de su expresión mediante modulación
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
83
epigenética sería una diana terapéutica en EA (R. Y. Liu, Cleary, & Byrne, 2011; Saura &
Valero, 2011; Teich et al., 2015; Zhou et al., 2015).
HOXA3, HOXA4 y HOXA5
HOXA3, HOXA4 y HOXA5, son genes que se encontraron diferencialmente hipermetilados
en el presente estudio, los cuales codifican factores de transcripción Homeobox-A.
Además, dentro de los módulos funcionales de UCSC_TFBS que presentaron
enriquecimiento se encontró sitios de unión a HOXA3 (Tabla 6 y Anexo 9) y también en el
presente trabajo se encontró enriquecimiento del módulo homeobox (Homeobox,
IPR020479) en los grupos funcionales de interacciones proteicas «Interpro» (véase,
numeral 1.2.4.2 de este Capítulo, en la página 58).
La expresión de HOXA3 ha sido encontrada en neuronas post-mitóticas (Wylie et al., 2010).
HOXA3, junto con HOXA4 y HOXA5 entre otros factores de la familia Homeobox-A, se
relacionan con desarrollo neural y se encuentran en neuronas postmitóticas y durante el
desarrollo embrionario son indispensables en la embriogénesis del sistema nervioso y de
múltiples órganos (Chojnowski et al., 2014; Diman, Chauvier, Pacico, Picard, & Rezsohazy,
2004; W. H. Huang et al., 2012; Karumbayaram et al., 2009; Philippidou & Dasen, 2013).
En un trabajo de otros autores, la expresión de HOXA3 -específicamente su transcrito
«NM_030661.3»-, se encontró asociada al proceso de diferenciación neuronal de un
modelo celular humano (Wakamatsu, Imai, Watanabe, & Isogai, 2010).
Teniendo en cuenta lo mencionado, nuestros resultados de patrones de hipermetilación
diferencial del presente estudio en capas de neuronas piramidales, confirman y amplían el
hallazgo reportado por Jager y Colaboradores (De Jager et al., 2014). En el presente
estudio mostramos con alto soporte estadístico en varias DMR (véase, Tabla 14) que una
región dentro de la banda p15.2 del cromosoma 7 que corresponde a HOXA3 hace parte
de la disrupción epigenética/transcripcional en corteza cerebral en EA. Este hallazgo pasa
de ser un hallazgo puntual (De Jager et al., 2014) a un patrón francamente establecido
(véase, Tabla 14) a ser considerado por futuros estudios que se encarguen de investigar
el papel que pueda tener en el cuadro fisiopatológico de la EA.
84
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
CXXC1 y MBD1
CXXC1, CXXC2 y MBD1, son tres genes directamente involucrados en los mecanismos
regulatorios epigenéticos, los cuales se encontraron diferencialmente hipermetilados en
EA, en los resultados en cerebros humanos del presente trabajo. El primero, el gen CXXC1
(conocido también como CFP1), es un «regulador epigénetico» central (J. H. Lee & Skalnik,
2005); está relacionado en su secuencia y localización con MBD1 siendo su vecino
genómico más cercano (Xu et al., 2011). CXXC1 tiene la propiedad interactuar, mediante
dominios independientes, tanto con la maquinaria de la metilación de histonas, en
específico con H3-Lys4 y H3K4me3, como con la maquinaria de metilación de ADN, en
específico con DNMT1, por tanto, CXXC1 se considera como integrador de ambos tipos de
mecanismos epigenéticos principales (Butler, Lee, & Skalnik, 2008). Por otro lado, el efecto
in vivo de la ausencia de CXXC1 en cerebros no ha sido estudiado, sin embargo, se sabe
que su perdida condicional, en un modelo murino, lleva a disrupción en la diferenciación de
linajes hematopoyéticos, aplasia medular y muerte (Chun et al., 2014). Los resultados
encontrados en el presente trabajo, sugieren la importancia de realizar una investigación
en cerebros murinos con perdida condicional de CXXC1, para lo cual sería necesario evitar,
con trasfusión de medula ósea, la muerte de los ratones producida por la aplasia medular
que implica la ausencia de CXXC1.
En segundo lugar, el gen MBD1 junto con sus dominios proteicos tiene un papel central en
orquestar mecanismos epigenéticos y constituye otro regulador epigenético (Li, Chen, &
Chan, 2015). En ensayos de cotransfección se encontró que el dominio 1 CXXC rico en
cisteína de la proteína MBD1 es un activador transcripcional (J. H. Lee & Skalnik, 2002).
Asimismo, se encontró que MBD1 es unido por el ADN por distintos dominios, si se trata
de ADN metilado o de ADN no metilado (Jorgensen, Ben-Porath, & Bird, 2004; Portela &
Esteller, 2010). De forma interesante, se encontró que la ausencia de MBD1 produce
perdida de neurogénesis, en células madre y progenitoras neuronales y de memoria, en
cerebros murinos (L. Li et al., 2015; X. Zhao et al., 2003). Además, se encontró que MBD1
regula el balance entre proliferación y diferenciación, en la neurogénesis en cerebros de
ratones adultos, mediante supresión génica de varios miRNA, entre ellos el miRNA-185 (C.
Liu et al., 2010).
CAPÍTULO 1: ESTUDIO DE METILACIÓN DE ADN EN CORTEZA CEREBRAL
(CAPAS DE NEURONAS PIRAMIDALES)
85
El presente trabajo muestra con un alto soporte estadístico, tanto en el análisis de DMP
como en el de DMR, la presencia de metilación diferencial en la región genómica 18q21.1
en la que los genes CXXC1 y MBD1 presentan hipermetilación diferencial en EA, en
comparación con controles en capas de neuronas piramidales corticales. Considerando los
resultados del presente trabajo y teniendo en cuenta que a nivel de corteza cerebral, se
mostró que la neurogénesis se encuentra alterada en un modelo de EA se propone la ruta
de la regulación epigenética mediada por MBD1 para potenciales terapéuticas en EA
(Anderson & Vanderhaeghen, 2014; Kamphuis, Orre, Kooijman, Dahmen, & Hol, 2012; L.
Li et al., 2015).
CXXC2 (KDM2B)
El gen CXXC2 (comúnmente llamado KDM2B, NDY1 o FBXL10) se encontró
diferencialmente hipermetilado en el presente estudio. CXXC2, es un regulador
epigénetico y entre los papeles de CXXC2 está contribuir a la activación génica mediante
unión y desmetilación de los promotores, lo cual se encontró le permite promover el
desarrollo de células madres pluripotenciales (G. Liang, He, & Zhang, 2012). Asimismo,
CXXC2 tiene actividad histona desmetilasa y es requerido por el «complejo Policomb»,
clave en la renovación cromática en desarrollo y diferenciación celular (X. Wu, Johansen,
& Helin, 2013). La ausencia de CXXC2 (FBXL10) lleva a una tendencia de aumento
anormal de metilación mediada por «el complejo Policomb» durante el desarrollo (Boulard,
Edwards, & Bestor, 2015) y. de forma interesante, CXXC2 ha mostrado contrarrestar los
efectos de senescencia de aquellos miRNAs que flanquean a EZH2 (Tzatsos et al., 2011).
Considerando que los resultados encontrados en el presente trabajo indican patrones de
metilación en cerebros con EA específicos de regiones génicas concretas e incluyen
hipermetilación diferencial de CXXC2 (KDM2B), acompañada de baja expresión
transcripcional (Capítulo 1 y Capítulo 2), de forma concordante con estudios recientes (De
Jager et al., 2014) y que se sabe que dicho «complejo Policomb» puede regular la
metilación de ADN a «islas CpG» direccionando los factores de transcripción
Homeobox-A, por ejemplo HOXA5, de forma dependiente de CXXC2 y de forma
funcionalmente redundante a MBD1 (Farcas et al., 2012; Sakamoto et al., 2007; Tzatsos
et al., 2013). Lo expuesto permitiría delinear una posible relación entre baja expresión de
CXXC2 y el aumento de metilación de ADN en genes específicos en EA, como propuesta
86
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
mecanística para el entendimiento de la alteración de los patrones epigenéticos de
metilación de ADN que se presentan en EA esporádica en corteza cerebral.
GSTP1
El gen GSTP1 se encontró diferencialmente hipermetilado en el presente estudio con alto
soporte por análisis en DMP y DMR. Como se discutió dentro de las agrupaciones
funcionales más destacadas encontramos la actividad oxido recductasa utilizando el grupo
disulfuro como aceptor (oxidoreductase activity, acting on a sulfur group of donors,
disulfide as acceptor, GO:0016671) relacionada con estrés oxidativo (Tabla 5).
El gen GSTP1, no se encuentra agrupado en dicha ontología, sin embargo hace parte de
las glutatión transferasas, tiene actividad antioxidante conocida, su silenciamiento lleva a
aumento de especies reactivas de oxigeno (ROS), ha mostrado tener un efecto protector
ante el estrés oxidativo y tiene importancia en detoxificación de componentes endógenos
y por xenobióticos (Kanwal et al., 2014). Por lo mencionado y considerando que
recientemente se han encontrado variaciones genéticas de GSTP1 asociadas a la
aparición de la EA (M. Wang, Li, Lin, Song, & Deng, 2015; T. Wang, 2015) se formula que
los patrones de metilación de GSTP1 aquí encontrados pueden tener relación con la
respuesta alterada frente al estrés oxidativo en EA, pues el silenciamiento epigenético de
GSTP1 se relaciona con estrés oxidativo en cáncer y su expresión es necesaria en
regeneración tisular (Litovkin et al., 2015; Pajaud et al., 2015).
Finalmente, se concluye que los resultados del presente trabajo manifiestan una presencia
de patrones de metilación de ADN relacionados con las vías fisiopatológicas de la EA lo
cual indica que merece la pena realizar el esfuerzo adicional para hacer microdisección
láser en este tipo de estudios de metilación de DNA en el presente trabajo, que igualmente
constituye el primer estudio que realiza este tipo de abordaje y adicionalmente aportan
actores epigenéticos antes no conocidos en el cuadro de la EA.
87
2 CAPÍTULO 2: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA CON
DATOS DE EXPRESIÓN GÉNICA NEURONAL
La aproximación de validación funcional aquí presentada es equivalente a la utilizada por
el estudio de mayor impacto en el área de metiloma en EA (De Jager et al., 2014) y se basa
en el contraste de las diferencias de metilación de ADN encontradas con los datos de
perfiles trascripcionales disponibles en EA. Lo mencionado en este capítulo está en
referencia total a la aproximación que va en favor de la validación funcional de los
resultados mostrados en el capítulo 1, que es el capítulo principal en este trabajo.
2.1 MÉTODOS
2.1.1 MUESTRAS
Se usó la base disponible en el repositorio de GEO código de acceso GSE5281. La base
seleccionada contiene datos de transcripción génica de neuronas piramidales tomadas por
microdisección láser, de la cual seleccionamos datos correspondientes con expresión de
neuronas piramidales del giro frontal superior en EA y sus respectivos controles medidos
mediante la plataforma U133+2 (Affymetrix). Las muestras seleccionadas tuvieron un
Intervalo postmortem de ~2.5 horas, el cual a diferencia del utilizado en la gran mayoría de
los estudios realizados en cerebros humanos en EA, es óptimo para mediciones confiables
de transcritos (Birdsill et al., 2011). Los datos de expresión fueron seleccionados de los
publicados en el repositorio por Liang y colaboradores (W. S. Liang et al., 2010). Las
características generales de los sujetos evaluados se muestran a continuación (Tabla 16).
Tabla 16. Características y distribución general de muestras de estudio de expresión transcripcional en
neuronas piramidales corticales de giro frontal superior.
CT
EA
Edad (Media ± DE)
79.8 ± 10.2
79.16 ± 7.5
Género
M: 7; F: 4
M: 13; F: 10
n de muestras
11
23
Abreviaturas. CT: Grupo de sujetos controles, EA: grupo de sujetos con EA. Edad: edad en años. DE:
desviación estándar M: género masculino, F: género femenino. n de muestras: número de muestras totales
utilizadas. No se presentan diferencias significativas entre los grupos en cuanto a su edad (t de Student p>0.05)
ni para su distribución de género (Xi cuadrado p>0.05).
88
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
2.1.2 ANÁLISIS Y BASES DE DATOS
En el estudio se realizó un análisis de expresión diferencial en neuronas piramidales de
giro frontal superior de sujetos con EA y respectivos controles, usando los datos disponibles
en
el
repositorio
GEO
código
GSE5281,
contenidos
en
el
archivo
«GSE5281_series_matrix.gz» que incluye tanto las características de la muestra como los
valores normalizados mediante Affymetrix GeneChip Operating Software v1.2 (GCOS) y
MAS 5.0.
Se realizó la importación de los datos en el entorno de programación de R, incluyendo los
datos
fenotípicos
mediante
el
paquete
bioinformático
GEOQuery.
Teniendo en cuenta los resultados discutidos en el capítulo 1, evaluamos la expresión
diferencial en los genes correspondientes a las 59 posiciones soportadas por rangos
(Anexo 15) y de los rangos soportados por múltiples sondas del análisis de DMR (Tabla
14, numeral 1.2.7, Capítulo 1).
Se utilizó el paquete limma en el entorno R de Bioconductor para contrastar los datos de
expresión diferencial en EA. La corrección de pruebas múltiples FDR
(Benjamini &
Hochberg, 1995) se realizó considerando las sondas que pasaron el control de calidad
asignadas a genes presentes en cromosomas somáticos. Seleccionamos los datos
normalizados de giro frontal superior con idéntica localización anatómica a la de nuestros
estudios de metilación en cerebros en las que se estandarizaron las señales normalizadas
en escala de 150 de acuerdo con lo descrito previamente (W. S. Liang et al., 2010).
Se usaron filtros de control de calidad de acuerdo con las sondas que pasaron el control
reportado en el estudio de Liang y colaboradores (W. S. Liang et al., 2010), por lo que se
excluyeron las sondas que no tuvieran un mínimo de 10% de lecturas presentes, por lo que
quedaron 30442 sondas para un análisis ulterior. De forma adicional, se realizó un análisis
«Minimum Connected Network» (MCN) mediante la herramienta de redes de interacción
«SNOW» del Software «Babelomics» (Minguez et al., 2009), para evaluar las conexiones
de los genes que se encontraran multisoportados en cerebros que además fueran
encontrados con una expresión concordante incluyendo conexiones que requirieran al
CAPÍTULO 2: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA CON DATOS DE EXPRESIÓN
GÉNICA NEURONAL
89
menos una validación experimental; por lo demás se utilizaron los parámetros
predeterminados de dicha herramienta (Minguez et al., 2009).
2.2 RESULTADOS CAPÍTULO 2
Se evaluaron los genes seleccionados de acuerdo a lo descrito en métodos. De los genes
seleccionados fue posible realizar comparaciones en 41 genes que presentaron
anotaciones no ambiguas en la base de datos de expresión transcripcional que fue
utilizada. Los genes en los que no fue posible el contraste, no presentaban sonda
específica en los microarreglos «U133 plus 2» de Afimetrix presentes en el repositorio
utilizado o bien la sonda correspondiente no pasaba el filtro de control de calidad.
Adicionalmente, se usaron los datos de control de calidad asociados al repositorio para
seleccionar las sondas según los criterios descritos (W. S. Liang et al., 2010).
En la mayoria de las 41 comparaciones posibles, se encontraron sondas con expresión
transcripcional concordantemente disminuida, en relación con el aumento de metilación de
ADN hallado en los microarreglos de metiloma de ADN en capas de neuronas piramidales
(Tabla 17). Encontramos sondas de expresión transcripcional que presentaron clara
dirección de cambios esperada -disminución de expresión-, superando un FC absoluto de
~1.5 y una significancia estadística p<0.05 correspondientes a los genes, AMBRA1,
ANKRD29, BIN1, KDM2B (CXXC2), DCLK1, FARS2, CYP2C8, AQP11, NMU, MYO1B,
PPIP5K2, WDPCP, MBP, CXXC1/MBD1, TRIM33, TNFAIP2, DCDC2, CPT1C, CDH19,
ZBTB1, TBC1D5, ZNF385A, HOXA3, DBT, GSTP1, ARHGEF17, DBT y AGAP2 (Tabla 17).
Después de la corrección FDR (Benjamini & Hochberg, 1995) para pruebas múltiples, se
encontró en 4 genes una significancia cercana a la limítrofe, GSTP1 (p corregido=0.055) y
ARHGEF17 (p corregido=0.0547) principalmente, y DBT (p corregido =0.0619) y AGAP2
(p corregido=0.066) con p< 0.1. Además, 3 genes presentaron cierta tendencia hacia baja
expresión ESR1, NINJ2 y NFIA.
Los valores p no fueron corregidos para un número más bajo de pruebas estadísticas que
las evaluadas en el genoma (luego de descartar los cromosomas sexuales), considerando
que se requiere continuar haciendo varios contrastes más adelante, por lo que no se
90
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
consideraría adecuado corregir por FDR, para cada subconjunto de pruebas estadísticas.
Una menor parte de genes no mostraron cambios concordantes de expresión, C4orf47,
ACACB, GJA1, DNA2, MAP4K1, SLC44A2, DOCK5, EFS, CCDC7, ATP8B1 y LINC00240.
Los resultados de redes de interacción MCN con herramienta «SNOW» presentaron una
evaluación topológica favorable y se muestran a continuación (Ilustración 7, página 22).
91
Tabla 17. Genes / sondas expresados diferencialmente a la baja en neuronas piramidales corticales de giro
frontal superior en EA en concordancia con los genes destacados diferencialmente hipermetilados en EA.
Gen
AMBRA1
AMBRA1
ANKRD29
ANKRD29
BIN1
BIN1
BIN1
BIN1
BIN1
CDH19
CYP2C8
DCDC2
DCLK1
DCLK1
DCLK1
DCLK1
FARS2
FARS2
HOXA3
HOXA3
KDM2B
MBD1
MBD1
MBP
MBP
MBP
MBP
MYO1B
MYO1B
NMU
PPIP5K2
TBC1D5
TBC1D5
TNFAIP2
TRIM33
TRIM33
WDPCP
ZBTB1
AQP11
CPT1C
ZNF385A
GSTP1
AGAP2
DBT
ARHGEF17
Probe Id
t
P.Value
adj.P.Val
219141_s_at
52731_at
238332_at
229308_at
214439_x_at
210201_x_at
214643_x_at
202931_x_at
210202_s_at
235639_at
208147_s_at
222925_at
230962_at
215303_at
205399_at
229800_at
204283_at
204282_s_at
235521_at
208604_s_at
226215_s_at
203353_s_at
226862_at
207323_s_at
225407_at
1554544_a_at
210136_at
212365_at
212364_at
206023_at
203253_s_at
201814_at
201813_s_at
202510_s_at
212435_at
210266_s_at
224180_x_at
213376_at
229526_at
227468_at
226111_s_at
200824_at
206152_at
244687_at
203756_at
-3.239
-2.111
-4.615
-3.391
-3.540
-3.011
-2.592
-2.558
-2.340
-2.705
-4.345
-3.017
-4.902
-4.436
-4.000
-2.773
-4.478
-2.971
-2.466
-1.628
-4.536
-3.096
-2.5176
-3.198
-2.945
-2.616
-2.324
-3.752
-2.475
-3.797
-3.711
-2.596
-2.476
-3.089
-3.138
-2.678
-3.588
-2.694
-4.148
-2.709
-2.585
-2.244
-2.144
-2.181
-2.249
0.0027
0.0425
0.0001
0.0018
0.0012
0.0050
0.0141
0.0153
0.0255
0.0107
0.0001
0.0049
0.0000
0.0001
0.0003
0.0091
0.0001
0.0055
0.0190
0.1131
0.0001
0.0040
0.0169
0.0031
0.0059
0.0133
0.0264
0.0007
0.0186
0.0006
0.0008
0.0140
0.0186
0.0041
0.0036
0.0115
0.0011
0.0110
0.0002
0.0106
0.0143
0.0317
0.0395
0.0365
0.0313
9.23E-03
6.97E-02
1.95E-03
7.21E-03
5.68E-03
1.38E-02
2.95E-02
3.14E-02
4.65E-02
2.41E-02
2.24E-03
1.36E-02
1.68E-03
2.07E-03
3.05E-03
2.13E-02
2.07E-03
1.48E-02
3.70E-02
1.56E-01
2.01E-03
1.18E-02
3.37E-02
9.91E-03
1.55E-02
2.83E-02
4.78E-02
4.15E-03
3.64E-02
3.88E-03
4.40E-03
2.93E-02
3.64E-02
1.20E-02
1.10E-02
2.53E-02
5.29E-03
2.46E-02
2.66E-03
2.39E-02
2.98E-02
5.52E-02
6.60E-02
6.19E-02
5.47E-02
mean
Eset.CT
493.89
637.40
536.48
1010.56
1118.76
1576.24
533.15
996.40
262.89
121.03
334.28
106.74
2932.09
2675.80
11490.86
1117.88
200.41
339.64
54.30
91.30
939.65
1'335.99
164.50
421.10
527.85
203.00
1341.93
148.56
280.36
97.80
623.60
1321.89
439.39
107.55
2364.99
1427.33
263.04
261.40
325.02
770.61
332.81
327.29
138.86
249.62
352.32
mean
Eset. EA
261.53
414.72
142.06
275.28
454.50
862.02
241.52
576.64
134.27
54.86
114.24
43.37
593.93
532.46
3080.27
539.83
52.28
172.97
24.70
54.18
428.01
617.51
105.17
212.47
161.21
89.20
688.59
66.80
161.11
14.28
192.64
784.05
221.83
61.30
1288.78
915.45
137.96
114.07
78.06
440.03
203.53
201.75
98.52
134.04
232.33
FC
-1.89
-1.54
-3.78
-3.67
-2.46
-1.83
-2.21
-1.73
-1.96
-2.21
-2.93
-2.46
-4.94
-5.03
-3.73
-2.07
-3.83
-1.96
-2.20
-1.68
-2.20
-2.16
-1.56
-1.98
-3.27
-2.28
-1.95
-2.22
-1.74
-6.85
-3.24
-1.69
-1.98
-1.75
-1.84
-1.56
-1.91
-2.29
-4.16
-1.75
-1.64
-1.62
-1.41
-1.86
-1.52
Abreviaturas. Gen: Símbolo oficial en base de datos del NCBI. Probe Id: código alfanumérico de Affimetrix
para la sonda evaluada. t: valor en distribución t. p.Value: valor p nominal. adj.P.Val: valor de p ajustado a
múltiples pruebas por la técnica de Benjamini y Hochberg (Benjamini & Hochberg, 1995). mean Eset.EA:
media de señal de fluorescencia normalizada para el grupo de EA. meanEset.CT:media de señal de
fluorescencia normalizada para el grupo de controles. FC: cambio relativo de señal de la expresión entre los
grupos. Significancia estadística después de corrección de FDR de pruebas múltiples con p <0.1.
92
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
2.3 DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO 2
En la mayor parte de los genes evaluados se observa congruencia entre los hallazgos de
hipermetilación diferencial en regiones cercanas al sitio de inicio de transcripción en capas
de neuronas piramidales en EA (Tabla 14) y los niveles de expresión diferencial a la baja
detectados de neuronas piramidales en EA (Tabla 17), lo cual sugiere que el presente
abordaje de microdisección láser, es útil para estudiar en forma más cercana que lo
realizado a la fecha, el nivel epigenético neuronal en enfermedades neurodegenerativas.
Hallamos disminución de la expresión génica para AMBRA1, ANKRD29, BIN1, KDM2B
(CXXC2), DCLK1, FARS2, CYP2C8, AQP11, NMU, MYO1B, PPIP5K2, WDPCP, MBP,
CXXC1/MBD1, TRIM33, TNFAIP2, DCDC2, CPT1C, CDH19, ZBTB1, TBC1D5, ZNF385A,
HOXA3, DBT, GSTP1, ARHGEF17, DBT y AGAP2. Encontramos una disminución para
GSTP1 en el límite de la significancia luego de corrección de pruebas múltiples. Asimismo,
aunque CXXC1 presentó una disminución del 33 % de la expresión, esta no fue
estadísticamente significativa (p=0.18). Por otro lado, MBD1 en total vecindad genómica
de CXXC1 (a 200 pares de bases), si presentó disminución clara de la expresión neuronal
(Tabla 17). CXXC1/MBD1 en conjunto tienen una función epigenética clave y reconocen
secuencias específicas de ADN que contienen CpG (Blattler & Farnham, 2013).
Una vez se obtuvieron los resultados se realizó la ilustración de análisis por redes de
interacción en la herramienta «SNOW» del Software «Babelomics» (Minguez et al., 2009),
evaluando las conexiones de los genes que se encontraran multisoportados en cerebros
que fueron encontrados además con una expresión concordante (Tabla 17). Para esto, se
incluyeron búsquedas de interacciones proteicas soportadas con al menos una evidencia
experimental. El resultado de las redes de interacción con la herramienta «SNOW» mostró
que estos hallazgos presentaron una evaluación topológica favorable en comparación con
resultados aleatorios «Relative betweenness»: List > Random (p-value = 0.0003);
«Connections»: List > Random (p-value = 0.0002) y «Clustering»: List > Random (p-value
= 0.0014). Estos resultados indican que las conexiones y relaciones entre los genes
encontrados son claramente más altos que las explicables por resultados estocásticos. La
red como tal permite además, observar relaciones putativas a ser evaluadas por futuros
trabajos por ejemplo la relación entre MBD1 y AMBRA1 mediada por la histona
desacetilasa HDAC1 (Ilustración 7).
93
Minimal Connected Network
Ilustración 7. Ilustración de «Minimal Connected Network» MCN de genes multisoportados como diferencialmente hipermetilados, encontrados con tendencia a
expresión transcripcional disminuida. «Topological evaluation»: Relative betweenness: List1 > Random p-value = 0.0003. Red realizada mediante la herramienta
bioinformática SNOW del entorno Babelomics.
94
A diferencia de la enorme mayoría de trabajos de expresión transcripcional en EA, el
presente estudio seleccionó datos de muestras con un intervalo postmortem de alrededor
de 2.5 horas. Por el contrario, realizar estudios de expresión transcripcional en corteza
cerebral humana con un intervalo postmortem mayor a 4 horas demostró producir
degradación no uniforme de diferentes transcritos en las distintas muestras, generando
resultados de poca confiabilidad (Birdsill et al., 2011)
95
3 CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN
LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA POR
MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN INFINIUM
DNA METHYLATION 450K
3.1 MÉTODOS
3.1.1 SELECCIÓN DE MUESTRAS
Teniendo en cuenta que varios trabajos indican la utilidad de estudiar el epigenoma de EA
en sangre periférica (Horvath et al., 2012; Y. Li et al., 2014), realizamos un estudio de
diseño comparable al de cerebros (Capítulo 1), mediante el análisis de metiloma de ADN de muestras de sangre periférica- disponible en diferentes repositorios públicos. Para
nuestro estudio se realizó una cuidadosa selección de sujetos integrando dos diferentes
bases de datos del GEO –con idéntica versión de la plataforma Infinium DNA Methylation
450K- la base de código GEO: GSE53740, de donde se seleccionaron pacientes con EA
en estado avanzado y algunos controles, y la de código GEO: GSE59685, de la cual se
tomaron la mayor parte de los controles (Y. Li et al., 2014; Lunnon et al., 2014).Se
importaron los datos crudos de intensidades -señal roja, señal verde y valor p de detecciónde cada uno de los microarreglos. Para esto se usaron diferentes paquetes de R
especializados en manejo de grandes volúmenes de datos como «data.table».
3.1.2 CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS
Todos los sujetos seleccionados fueron de origen caucásico -al igual que para el estudio
de cerebros- y no se encontraron diferencias de la proporción de género entre grupos (xi
cuadrado, p>0.05). Se tomaron datos crudos correspondientes a 33 sujetos con EA en
estadio avanzado entre 67 y 96 años (73% mujeres); y 48 sujetos controles, entre 70 y 96
años (58% mujeres), 8 de ellos seleccionados de la base GEO:GSE59685. Se tuvo en
cuenta el hecho de que se presentaron diferencias entre las edades de los grupos
(EA:76.25 ± 6.5 vs CT:83.15 ±7.3 p<0.05), por lo cual, se empleó un abordaje de
modelamiento lineal para eliminar el efecto de la edad, como se explica más adelante
96
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
(véase, numeral 3.1.4 de este capítulo en la página 97). De forma adicional para aumentar
la rigurosidad, se realizó un re-muestreo con un número menor de sujetos con el fin de
igualar totalmente las edades y se verificó la concordancia de los hallazgos más
destacados del análisis principal descrito en este capítulo –reduciendo el poder estadístico
dado el menor número de sujetos-. El análisis del submuestreo tiene edades de 82.16 ±
8.2 años en EA vs 79.8 ± 7.2 años en controles, 28% mujeres en EA versus 34% mujeres
en CT y está disponible en caso que el evaluador lo solicite.
3.1.3 PROCESAMIENTO Y NORMALIZACIÓN DE DATOS
Los datos crudos de intensidades de las bases de datos GEO, no contienen los archivos
IDAT que son requeridos para la normalización de SWAN –como se explicó anteriormente–
(numeral 1.1.4.1 del capítulo 1, en la página 37). Como alternativa, se realizó BMIQ en
combinación de normalización cuartil (QN + BMIQ), debido a que tal combinación ha
mostrado eliminar considerablemente el efecto de lote permitiendo adecuada comparación
de muestras no corridas durante el mismo ensayo (Heiss & Brenner, 2015) .
El efecto de lote está dado por ligeras variaciones debidas a efectos del tiempo, la
temperatura y las concentraciones durante el paso de hibridación (Heiss & Brenner, 2015).
El proceso de BMIQ incluye una normalización al interior de cada muestra, considerando
la presencia de los controles de hemimetilación que proveen las regiones conocidas de
«imprinting» –de las que se sabe constituyen un estado de metilación de 50%-. Este
parámetro está incluido de forma predeterminada en el argumento «th1.v» del «proceso
BMIQ» del paquete «WaterMelon» (Wong, Pidsley, & Schalkwyk, 2013). La presencia de
los mencionados controles al interior de cada muestra, permite a BMIQ una adecuada y
eficiente eliminación de efectos por variaciones técnicas (Teschendorff et al., 2013).
Así mismo, el proceso de BMIQ supone normalización de los valores Beta, de forma
independiente para cada tipo de diseño de sonda de illumina, sin mezclarlos (Teschendorff
et al., 2013). Lo explicado tiene el mismo principio teórico expuesto para la normalización
de SWAN y mostró controlar el efecto de lote, asunto central en la comparación de
muestras no corridas durante el mismo ensayo (Teschendorff et al., 2013). Además, para
eliminar cualquier posible efecto de lote restante, se realizó la corrección de COMBAT,
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
97
diseñada específicamente con este fin y que mostró ser aún más eficaz en combinación
con BMIQ (T. J. Morris & Beck, 2014; Teschendorff et al., 2013).
3.1.4 ANÁLISIS DE DMP EN SANGRE PERIFÉRICA
En el presente estudio de metiloma en leucocitos de sangre periférica, se realizó un análisis
con un diseño y un flujo de trabajo similar al del análisis en cerebros -salvo el sistema de
normalización– usando iguales filtros de sondas e incluyendo también el filtro de
cromosoma sexual, aplicado antes de la normalización. El filtro Delta de beta para DMPs
se situó en 0.09 y el punto de corte seleccionado para la significancia estadística fue un
valor p<0.05 luego de corrección de pruebas múltiples por la técnica de Benjamini y
Hochberg (Benjamini & Hochberg, 1995).
Con el fin de contrastar los sujetos con EA con los controles, se incluyó la edad y el género
de los individuos evaluados en el modelamiento lineal usando el paquete limma de forma
que fuera posible excluir los resultados atribuibles a dichas variables. Se ha probado la
utilidad de la integración al modelo estadístico de variables numéricas que modifiquen la
medición de metilación de ADN, por ejemplo la edad, para evaluar de forma confiable los
cambios de metilación de ADN eliminando los cambios atribuibles a dicho tipo de variables
numéricas (Robinson et al., 2014; Smyth, 2005).
3.1.5 ANÁLISIS DE DMR EN SANGRE PERIFÉRICA
De forma similar al estudio de cerebros (Capítulo 1), se realizó búsqueda de regiones
diferencialmente metiladas
utilizando
el
paquete
DMRcate
incluyendo
el
filtro
«DeltaBetacutoffNetMean» explicado en la sección 1.1.7 del capítulo 1 (en la página 42).
Se fijó el parámetro de «distancia máxima entre CpGs de una misma región», en 200 pb.
Asimismo, el punto de corte para la significancia estadística de regiones DMR fue un valor
p<0.01 luego de corrección de Benjamini y Hochberg (Benjamini & Hochberg, 1995).
98
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
3.1.6 ANÁLISIS DE CONVALIDACIÓN CRUZADA DMP CON DMR
De forma similar al estudio de cerebros (Capítulo 1), para determinar la superposición de
las regiones DMR se utilizó el paquete GenomicRanges (Carey, 2013) usando las
funciones «findOverlaps», «subsetByOverlaps» y «pintersect». Además, mediante
codificación en R, se generaron objetos de rangos a partir de las DMP, de tal forma que
también pudieran usarse las funciones mencionadas para encontrar superposición entre
las DMP y las DMR. Como se mencionó previamente (véase, numeral 1.1.8.2 del capítulo
1), los resultados de regiones encontradas en análisis de DMR, resaltan la importancia de
los CpG consecutivos diferencialmente metilados contenidos en ellas (Peters et al., 2015;
Robinson et al., 2014).
3.1.7 SELECCIÓN FINAL DE DMR/DMP
De los resultados de las regiones DMR en sangre periférica, centramos nuestra atención
en aquellos con rangos soportados por 3 o más posiciones CpGs consecutivas para
garantizar que los resultados diferencialmente metilados de este análisis en sangre,
corresponden a la realidad biológica -excluyendo así la posibilidad de resultados aislados
generados por estocástica-. Subsecuentemente, como se explica en el siguiente capítulo
(Capítulo 4) la selección de rangos diferencialmente metilados con soporte en múltiples
posiciones CpG, fue usada para buscar superposición de los resultados DMR de sangre
con los del metiloma de ADN que realizamos en cerebros con EA.
3.1.8 ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL
El análisis de enriquecimiento funcional de genes en sangre periférica se realizó utilizando
los parámetros descritos para el análisis en cerebros mediante la herramienta FatiGOBabelomics y el paquete RdavidWS (véase, numeral 1.1.6 del Capítulo 1, en la página 40)
con las DMP que estuvieran convalidadas con DMR excluyendo así la posibilidad de
resultados aislados generados por estocástica.
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
99
3.2 RESULTADOS CAPÍTULO 3
3.2.1 RESULTADOS DMP
Siguiendo los parámetros explicados en la sección de métodos, los resultados del análisis
DMP seleccionaron a 283 sondas diferencialmente metiladas con un valor p < 0.05, luego
de corrección para pruebas múltiples (Benjamini & Hochberg, 1995), las cuales se
tabularon en archivo anexo disponible en la versión digital (formato Word) del presente
documento (Anexo digital 1).
3.2.2 RESULTADOS DMR
Se realizó el análisis DMR de acuerdo con lo explicado en la sección de métodos (numeral
3.1.5 de este capítulo). Se encontraron 126 rangos diferencialmente metilados que
cumplieron con las condiciones señaladas (Anexo digital 2). Asimismo, se destacan los
rangos con mayor soporte dado por 3 o más CpG diferencialmente metiladas (Tabla 18) y
diferencialmente hipermetiladas (Tabla 19).
Tabla 18. Regiones genómicas diferencialmente hipermetiladas del análisis de metilación regional
diferencial (DMR) para EA en comparación con controles en leucocitos de sangre periférica.
hg19 coord
gene assoc
group
chr1:146649770-146649851
PDIA3P
Body
chr1:174843754-174843971
chr3:148664701-148664839
chr3:44802549-44802604
chr5:110062343-110062417
RABGAP1L
TSS1500,Body
chr6:1604081-1604212
chr6:28984234-28984374
chr6:29520698-29520774
chr6:30039239-30039524
chr6:30079090-30079307
chr6:31275551-31275881
chr6:32632565-32632694
chr6:168714673-168714709
chr8:2591207-2591411
chr8:11141365-11141424
chr10:101824920-101825185
KIF15, KIAA1143
TMEM232
RNF39
TRIM31
Body
Body
MTMR9
CPN1
TSS1500
Body
chr15:99548859-99549047
PGPEP1L
chr15:99789622-99789855
TTC23
chr16:30572912-30573013
chr17:13506186-13506284
chr17:185102-185263
chr18:74799495-74799572
HS3ST3A1
RPH3AL
MBP
3
3
3
TSS1500,Body 3
1stExon,5'UTR, 4
TSS200
4
6
3
12
Body
12
Body
11
HLA-DQB1
DACT2
chr15:31115839-31115871
#p
5
3
3
3
5
3
5'UTR,1stExon,
4
TSS200
1stExon,5'UTR,
5
TSS200
3
TSS1500
3
5'UTR
4
Body
3
Adjusted
meanpval
1.60E-03 1.69E-03
2.88E-06 5.66E-04
9.77E-07 3.82E-06
3.26E-03 4.28E-03
6.76E-03
7.26E-03
6.18E-05 3.32E-04
3.16E-10 9.56E-05
5.22E-08 2.20E-07
3.59E-05 1.02E-03
3.12E-05 1.03E-03
2.12E-06 2.30E-04
1.38E-03 2.93E-03
1.19E-03 1.32E-03
1.38E-04 6.61E-04
8.64E-04 1.47E-03
2.41E-07 9.91E-05
0.12
mean
Dbet
0.10
0.10
0.12
0.11
0.12
0.07
0.10
0.07
0.08
0.12
0.14
0.15
0.13
0.11
0.11
0.08
0.08
0.11
0.10
0.08
0.08
0.17
0.09
0.18
0.14
0.11
0.08
0.08
0.13
0.08
0.07
4.02E-06 4.23E-06
0.16
0.12
3.81E-08 4.08E-05
0.12
0.08
1.16E-03 2.53E-03
0.09
0.07
3.05E-03
4.54E-04
6.12E-06
3.88E-04
0.07
0.11
0.20
0.11
0.07
0.08
0.09
0.07
minpval
3.59E-03
7.99E-04
4.10E-05
4.46E-04
Maxbetafc
100
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
chr19:54515169-54515341
CACNG6
Body
4
2.75E-04 8.90E-04 0.08
0.08
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del UCSC genome
Browser (Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia. genes assoc: asignación génica
corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo. group: anotación de localización
génica según anotación original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un
conjunto de valores p correspondientes a sondas adyacentes. Adjusted meanpval: media de valores p, de un conjunto de
valores p correspondientes a sondas adyacentes. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de
Bonferroni. maxbetafc: máximo valor del cambio relativo en número de veces de los «valores M» en las sondas que soportan
el rango. Netmean Dbeta: es la diferencia neta entre los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro
«DeltaBetacutoffNetMean» en promedio para las sondas que conforman el rango. Los valores de p corresponden a valores
ajustados por la corrección de Bonferroni. Las lineas horizontales separan los cromosomas. Se subrayan resultados
mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
Tabla 19. Regiones genómicas diferencialmente hipometiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) para EA en comparación con controles en leucocitos de sangre periférica.
Adjusted
maxbetaf mean
meanpval
c
Dbet
chr2:129659633-129659946
4 2.24E-04
2.89E-03
- 0.10
- 0.08
chr3:98376390-98376574
4 1.04E-09
6.21E-07
- 0.10
- 0.07
chr6:32063774-32064032
TNXB
Body
8 4.74E-06
1.12E-03
- 0.14
- 0.07
chr6:170478393-170478454
3 3.37E-05
5.55E-05
- 0.19
- 0.10
chr7:16505589-16505664
SOSTDC1
TSS200
5 6.29E-09
1.23E-08
- 0.12
- 0.09
chr8:145162905-145163136
KIAA1875
Body
4 2.40E-04
1.39E-03
- 0.13
- 0.10
chr8:65711522-65711658
CYP7B1
TSS200,TSS1500
3 1.26E-04
1.02E-03
- 0.07
- 0.08
chr10:133558786-133558971
3 4.81E-04
2.50E-03
- 0.12
- 0.10
chr10:133793442-133793527 BNIP3
Body
3 1.34E-03
2.35E-03
- 0.11
- 0.10
chr10:34061612-34061705
3 1.02E-07
1.80E-07
- 0.13
- 0.11
chr11:1918744-1918783
3 1.29E-05
1.45E-05
- 0.09
- 0.08
chr11:27015519-27015656
FIBIN
TSS200,5'UTR,1stExon 3 3.49E-07
1.69E-06
- 0.13
- 0.08
chr11:7110074-7110196
RBMXL2
TSS200,5'UTR,1stExon 5 2.59E-05
3.03E-03
- 0.17
- 0.08
chr16:303165-303192
ITFG3
5'UTR
3 1.28E-07
1.28E-07
- 0.14
- 0.11
chr19:49077983-49078119
SULT2B1
Body,TSS1500
3 8.51E-05
1.81E-04
- 0.10
- 0.09
chr19:55476665-55476717
NLRP2
TSS1500
3 2.48E-03
2.79E-03
- 0.10
- 0.08
chr19:55477653-55477810
NLRP2
TSS200,5'UTR,1stExon 4 1.67E-03
2.34E-03
- 0.11
- 0.09
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del UCSC genome Browser
(Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia genes assoc: asignación génica corregida de
acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo. group: anotación de localización génica según
anotación original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un conjunto de valores p
correspondientes a sondas adyacentes. Adjusted meanpval: media de valores p, de un conjunto de valores p correspondientes a
sondas adyacentes. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de Bonferroni. maxbetafc: máximo valor del
cambio relativo en número de veces de los «valores M» en las sondas que soportan el rango. mean Dbet: es la diferencia neta entre
los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro «DeltaBetacutoffNetMean». Se subrayan resultados
mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
hg19 coord
gene assoc
Group
#p minpval
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
101
3.2.3 COINCIDENCIA ENTRE DMR y DMP
Se hallaron los resultados de la superposición entre las regiones correspondientes al
análisis de las DMR, teniendo en cuenta el filtro «delta de beta neto» -en el paquete
DMRcate- y los sitios CpG correspondientes al análisis de los DMP. Los resultados más
destacables son rangos convalidados con 3 o más sitios CpGs contiguos y concordantes
en la dirección de diferencia del estado de metilación entre sujetos con EA y los controles
respectivos como se muestran a continuación (Tabla 20).
Tabla 20. Resultados regionales destacados con validación cruzada de hallazgos de análisis de regiones
diferencialmente metiladas (DMR) y posiciones diferencialmente metiladas para EA en sangre periférica.
Adjustd
Adjusted
max
Dbet dir
minpval meanpval
betaFC
chr6:28984234-28984374
6
3.16E-10 9.56E-05
0.14
0.08 ↑
chr15:99548859-99549047 PGPEP1L 5'UTR,1stExon,TSS200 4
3.81E-08 4.08E-05
0.12
0.08 ↑
chr15:31115839-31115871
3
4.02E-06 4.23E-06
0.16
0.12 ↑
chr6:29520698-29520774
3
5.22E-08 2.20E-07
0.15
0.11 ↑
chr3:148664701-148664839
3
9.77E-07 3.82E-06
0.12
0.10 ↑
chr18:74799495-74799572 MBP
Body
3
3.88E-04 4.46E-04
0.11
0.07 ↑
MTMR9
chr8:11141365-11141424
TSS1500
3
8.64E-04 1.47E-03
0.14
0.08 ↑
-0.12
chr7:16505589-16505664
SOSTDC1 TSS200
5
6.3E-09
1.2E-08
-0.09 ↓
-0.17
chr11:7110074-7110196
RBMXL2 TSS200,5'UTR,1stExon 5
2.6E-05
3.0E-03
-0.08 ↓
-0.10
chr3:98376390-98376574
4
1.0E-09
6.2E-07
-0.07 ↓
-0.13
chr10:34061612-34061705
3
1.0E-07
1.8E-07
-0.11 ↓
-0.13
chr11:27015519-27015656 FIBIN
TSS200,5'UTR,1stExon 3
3.5E-07
1.7E-06
-0.08 ↓
-0.09
chr11:1918744-1918783
3
1.3E-05
1.5E-05
-0.08 ↓
-0.14
chr16:303165-303192
ITFG3
5'UTR
3
1.3E-07
1.3E-07
-0.11 ↓
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del UCSC genome
Browser (Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia genes assoc: asignación génica
corregida de acuerdo al criterio de búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 de este capítulo. group: anotación de localización
génica según anotación original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un
conjunto de valores p correspondientes a sondas adyacentes. Adjusted meanpval: media de valores p, de un conjunto de
valores p correspondientes a sondas adyacentes. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de
Bonferroni. maxbetafc: máximo valor del cambio relativo en número de veces de los «valores M» en las sondas que soportan
el rango. mean Dbet: es la diferencia neta entre los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro
«DeltaBetacutoffNetMean». dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican aumento o disminución de metilación en EA. Se subrayan
resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
hg19 coord
gene
assoc
group
#p
102
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
3.2.4 RESULTADOS DE AGRUPAMIENTO FUNCIONAL
Se realizó un análisis de enriquecimiento en ontologías funcionales utilizando las 138
sondas hipermetiladas en EA que cumplieron los criterios explicados en la sección de
métodos descrita en el numeral 3.1.8 de este capítulo (Anexo digital 1), mediante el uso
de FatiGO-Babelomics. En el estudio se encuentran ontologías de componente subcelular
(Tabla 21) y procesos biológicos (Tabla 22). Los análisis en UCSC_TFBS en DAVID con
los genes diferencialmente hipermetilados mostraron enriquecimiento en módulos
funcionales (Anexo 17).
Tabla 21. Ontologías relacionadas con componente subcelular de los genes identificados diferencialmente
hipermetilados en EA en leucocitos de sangre periférica.
Funt. Term
Term Term
size L size G
List
pos
List List % G
neg
pos
G%
List pos IDs
odds
ratio
log
pvalue
adj
pvalue
neuron
projection(GO:0043005)
411
411
4
85
4.49
407 0.2
ASIC2, KLC3,
3.18
AHCY,MAP2
3.2E-5 1.46E-2
neuronal cell
body(GO:0043025)
379
379
4
85
4.49
375 0.18
ASIC2, MBP,
3.26
CRHR1, MAP2
2.3E-5 1.46E-2
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores
anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número
de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de identificadores de la lista no anotados
para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G pos: número
de identificadores en el genoma anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genomano
anotados para el término funcional. List pos IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. G %:
porcentaje de identificadores dentro del genoma para el término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad
o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p
de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para pruebas
múltiples de Benjamini & Hochberg.
En el análisis de enriquecimiento funcional en ontologías del componente subcelular, se
encontró una ontología relacionada con el axón (juxtaparanode region of axon,
GO:0044224), a la cual corresponden los genes CNTNAP2 y DLG4 (valor de p ajustado
1.50E-02, odds ratio log= 6), que no se tabula por ser el único resultado. Los análisis en
UCSC_TFBS en DAVID y el análisis de enriquecimiento en InterPro no arrojaron resultados
significativos, exceptuando los asociados a una sola sonda, cg03828328 que corresponde
con 7 genes, todos Protocaderinas (PCDHGB2, PCDHGB1, PCDHGA5, PCDHGA4,
PCDHGA3, PCDHGA2 y PCDHGA1) que se consideran un artefacto, dado que esos 7
genes están asignados a una sola sonda. En el análisis de enriquecimiento en procesos
biológicos se encontró una ontología relacionada con el desarrollo dentario (odontogenesis
of dentin-containing tooth, GO:0042475), que contiene los genes NFIC, WNT7B, SOSTDC
(valor de p ajustado 66E-03, odds ratio log = 5), no se tabula por ser el único resultado.
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
103
Tabla 22. Ontologías relacionadas con procesos biológicos de los genes identificados diferencialmente hipermetilados en EA en leucocitos de sangre
periférica.
Funt. Term
Term size List
G
pos
44
3
List neg List %
G%
List pos IDs
86
3.37
0.02
SALL1,CRHR1,WNT11
9
9
2
87
2.25
0
RARB,WNT11
6.53
6E-06
4.2E-03
9
9
2
87
2.25
0
COMP,RARB
6.53
6E-06
4.2E-03
264
264
4
85
4.49
0.12
CRHR1,NOS2,NOX4,AHCY
3.63
6E-06
4.2E-03
73
73
3
86
3.37
0.03
ASIC2,PTCH1,FOSB
4.64
5E-06
4.2E-03
76
76
3
86
3.37
0.04
ISL1,TFAP2A,WNT11
4.60
5E-06
4.2E-03
250
253
4
85
4.49
0.12
ISL1,ASIC2,LMX1B,VAV2
3.68
5E-06
4.2E-03
189
191
4
85
4.49
0.09
ISL1,LMX1B,BHLHE22,WNT11
3.97
2E-06
2.9E-03
homophilic cell adhesion via plasma
membrane adhesion molecules
(GO:0007156)
pharyngeal system development
(GO:0060037)
spinal cord motor neu differentiation
(GO:0021522)
response to drug (GO:0042493)
415
418
5
84
5.62
0.2
PCDHGA3,PCDHGA2,PCDHGA1,PCDHG
B1,DCHS2
3.41
1E-06
2.9E-03
24
35
2
87
2.25
0.01
ISL1,PTCH1
5.38
5E-05
1.8E-02
25
25
2
87
2.25
0.01
ISL1,PTCH1
5.34
5E-05
1.8E-02
407
407
4
85
4.49
0.19
RPH3AL,PTCH1,FOSB,TERF1
3.19
3E-05
1.2E-02
forelimb morphogenesis (GO:0035136)
16
16
2
87
2.25
0.01
TFAP2A,SALL1
5.83
2E-05
8.9E-03
114A
114
3
86
3.37
0.05
TFAP2A,SALL1,PTCH1
4.18
2E-05
7.8E-03
hindlimb morphogenesis (GO:0035137)
11
11
2
87
2.25
0
SALL1,PTCH1
6.28
1E-05
5.2E-03
response to nutrient (GO:0007584)
105
105
3
86
3.37
0.05
SSTR1,ERCC1,AHCY
4.26
1E-05
6.6E-03
adrenal gland development
(GO:0030325)
negative regulation of cartilage
development (GO:0061037)
growth plate cartilage development
(GO:0003417)
response to hypoxia (GO:0001666)
response to mechanical stimulus
(GO:0009612)
outflow tract morphogenesis
(GO:0003151)
regulation of gene expression
(GO:0010468)
neuron differentiation (GO:0030182)
neural tube closure (GO:0001843)
Term
size L
43
odds pvalue adj pvalue
ratio log
5.20
9E-07 2.9E-03
in utero embryonic development
304
306
4
85
4.49
0.14
LMX1B,RESP18, PTCH1, SLC34A2
3.48
1E-05 5.2E-03
(GO:0001701)
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño global del
término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de identificadores de la lista no anotados
para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G pos: número de identificadores en el genoma, anotados para el término
funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. List pos IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. G
%: porcentaje de identificadores dentro del genoma para el término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término
funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para
pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en la discusión, para facilitar su localización.
104
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
3.3 DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO 3
3.3.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS GLOBALES
A diferencia de lo encontrado en cerebros (Capítulo 1), en el presente estudio en sangre
periférica de EA hallamos cantidades similares de loci genómicos diferencialmente
hipermetilados que los que encontramos diferencialmente hipometilados (Tabla 20).
Por otro lado, la relación entre pruebas que evalúan orillas de islas CpG y las que evalúan
islas CpG (orillas/islas), pasó de 0.75 en el total de las sondas evaluadas a 1.1 en las
sondas encontradas diferencialmente metiladas, indicando que las orillas de islas CpG
tienen mayor importancia que las islas CpG en los patrones de metilación de ADN en EA
en sangre periférica, en concordancia con lo encontrado en cerebros (Ilustración 4).
Asimismo, los niveles globales de metilación de ADN de EA en comparación con controles
no mostraron diferencias significativas entre los grupos (EA 0.5335 ± 0.007 NM vs. 0.5334
± 0.006 NM, valor p > 0.05), lo cual concuerda con lo encontrado en cerebros (Capítulo 1)
e indica que las diferencias de metilación a nivel de loci genómicos, no se explican por un
cambio de metilación de ADN a nivel global, sino que son específicas de loci concretos.
3.3.2 LOCI DIFERENCIALMENTE HIPERMETILADOS
3.3.2.1
PATRONES DE
CROMOSOMA 6 Y RELACIONADOS CON INFLAMACIÓN
METILACIÓN
EN
En el análisis de metilación regional DMR se encontró que el 29% (7 de 24) de las regiones
diferencialmente hipermetiladas con soporte por varias CpG, se localizan en el cromosoma
6 dentro del rango del complejo mayor de histocompatibilidad (Tabla 18). En el complejo
mayor de histocompatibilidad clase II, se encontró al gen HLA-DQB1 recientemente
asociado a EA (Mansouri et al., 2015) y en el complejo mayor de histocompatibilidad clase I,
se encontraron los genes, TRIM31 y RNF39. Cabe anotar que la disminución de expresión
RNF39 se asoció con su pobre recuperación cognitiva en un modelo murino de ECV, y que
por tanto, su modulación se propone como posible blanco terapéutico en tal recuperación
cognitiva (Buga et al., 2012).
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
105
Igualmente, el 21% (5 de 24) de las regiones diferencialmente hipermetiladas con soporte
por varias CpG (Tabla 18) corresponden a genes involucrados en mecanismos
inflamatorios que no se limitan al cromosoma 6, a saber: (a) CACNG6, asociado a
respuesta inflamatoria eosinofílica en asma (David et al., 2015), (b) la carboxipectidasa
CPN1, también involucrada en el sistema inmune y relacionada con el shock anafiláctico
mediado por C5a (Mueller-Ortiz et al., 2009), (c) TMEM232, cuyas variaciones genéticas
han sido relacionadas con respuesta alérgica inflamatoria (Bonnelykke et al., 2013;
Bunyavanich & Schadt, 2015), (d) PDIA3P, cuya expresión génica se encontró alterada en
el desarrollo de la respuesta alérgica (Rädler, 2014) y (e) MBP que se encuentra entre los
genes diferencialmente hipermetilados con mayor soporte en el presente estudio (Tabla 18
y Tabla 20), el cual se discute más adelante (página 109). Los resultados mencionados
indican que los patrones de hipermetilación diferencial en sangre periférica de EA
encontrados por nosotros, se relacionan con inflamación sistémica y algunos (CACNG6,
CPN1, PDIA3P) con respuesta alérgica inflamatoria.
3.3.2.2
ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL
En los análisis de enriquecimiento funcional para los genes diferencialmente hipermetilados
se encontraron varias ontologías de procesos biológicos que se relacionan con el desarrollo
y morfogénesis de múltiples órganos. Se destaca la ontología de desarrollo de la glándula
adrenal (adrenal gland development, GO:0030325) en la que se halla CRHR1, entre otros
genes. Asimismo, se halló la ontología de respuesta a hipoxia (response to hypoxia,
GO:0001666), donde se encuentran cuatro genes a saber: NOS2 y NOX4 relacionados con
el proceso metabólico de superóxidos de forma protectiva (Colton et al., 2006; Schroder et
al., 2012), el gen AHCY y nuevamente el gen CRHR1. Lo mencionado indica que existe un
componente de los patrones de hipermetilación diferencial relacionado con estrés
oxidativo, de forma similar a lo encontrado en cerebros.
A diferencia de lo encontrado en cerebros, de las 5 primeras ontologías del análisis de
enriquecimiento de módulos TFBS_USCS (TIFF, MSX1, CHX10, HFH3, P53), solo una
(HFH3) se relaciona con diferenciación neuronal o expresión neuronal. Cabe recordar que,
con el fin de excluir la posibilidad de resultados derivados de simple estocástica, se
consideraron aquellos resultados de metilación diferencial de EA en comparación con
106
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
controles soportados por el análisis regional, de forma que los genes dentro del análisis de
enriquecimiento cuentan con un soporte por DMR.
Adicionalmente, en el análisis de enriquecimiento por ontologías funcionales, los genes
MAP2 y los ya mencionados CRHR1, MBP, y AHCY se relacionan con ontologías
neuronales a saber: (Tabla 21) la ontología de cuerpo celular neuronal (GO:0043025,
neuronal cell body) y la ontología de proyección neuronal (GO:0043005, neuron projection);
sin embargo, este resultado debe interpretarse en el contexto de sangre periférica, de
hecho, las proteínas codificadas por estos genes son expresadas transcripcionalmente en
leucocitos, en células precursoras hematopoyéticas y circulan en sangre periférica
cumpliendo un papel diferente, al que se presenta en un tejido enriquecido en neuronas.
MAP2 presenta modulación ante la exposición a citoquinas a nivel de sangre periférica,
CRHR1 se relaciona funcionalmente con actividad inflamatoria, MBP tiene componente
neuroinflamatorio e inflamatorio periférico y AHCY participa en el metabolismo de carbono
sencillo, clave en las reacciones de metilación del ADN. A continuación se detalla cada
gen:
MAP2
En el presente estudio de sangre periférica encontramos mayor metilación de MAP2 en EA
en comparación con controles. La proteína codificada por MAP2, es una proteína asociada
a microtúbulos cuya función exacta no está totalmente esclarecida, sin embargo, su papel
en cerebro se relaciona con neurogénesis y neuroinflamación (C.-R. Chen & Young, 2008;
Mitra, Gupta, Poddar, & Bhattacharyya, 2015). MAP2 fue encontrada en leucocitos de
adultos a diferencia de otros marcadores neuronales como TUBB3 o NES; e igualmente,
mostró expresión transcripcional en células mononucleares de sangre umbilical y
modulación de la misma por exposición a citoquinas inflamatorias indicando la existencia
de un papel de MAP2 en procesos inflamatorios en sangre (Korbling et al., 2006; Yan et
al., 2005). Teniendo en cuenta la interacción de MAP2 con citoquinas en sangre, la
hipermetilación diferencial de MAP2 en sangre, debe interpretarse como parte de los
patrones de metilación de ADN aquí encontrados en EA relacionados con inflamación
sistémica.
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
107
CRHR1
En el presente estudio de sangre periférica, encontramos aumento de metilación de
CRHR1 en una región promotora no canónica en EA. CRHR1 es el gen del receptor 1 de
la hormona liberadora de corticotropina y tiene actividad inflamatoria autocrina y paracrina
(Karalis et al., 1991). En leucocitos de sangre periférica humana, se ha probado la
presencia de expresión transcripcional de CRHR1, lo cual indicó la utilidad de estudiar la
regulación de este gen en sangre periférica (Ben Simon et al., 2003). Además, se sabe que
CRHR1 tiene regulación epigenética basada en metilación de ADN (Sotnikov et al., 2014).
En un modelo murino de ansiedad, los ratones mutantes de CRHR1 que fueron expuestos
a un ambiente favorable, mostraron un aumento de la metilación en un CpG en la isla CpG
del promotor génico convencional de CRHR1, mejorando a la par el comportamiento
ansioso de dicho modelo murino (Sotnikov et al., 2014). Asimismo, en humanos, las
variantes genéticas de CRHR1 y otros genes pueden provocar respuestas psicopatológicas
frente a condiciones adversas del ambiente, como el maltrato, con plausible mediación
epigenética (Rogers et al., 2013; Weder et al., 2014). En este contexto, las diferencias de
metilación en CRHR1 halladas a nivel de sangre periférica en EA en el presente trabajo,
deberán ser tenidas en cuenta y su utilidad debe evaluarse en estudios longitudinales.
AHCY
En este estudio de sangre periférica encontramos mayor metilación de AHCY en EA en
comparación concontroles. AHCY codifica la adenosilhomocisteinasa 1, se sabe que se
expresa en sangre periférica y de hecho su expresión está disminuida en leucocitos de
sangre periférica en enfermedad de Huntington (K. H. Chang, Chen, Wu, Lee, & Chen,
2012). AHCY cataliza la hidrólisis que convierte la S-adenosilhomocisteína (SAH) en los
componentes, adenosina y L-homocisteína regulando la concentración de SAH e
influenciando los niveles de homocisteína en la vía del metabolismo de carbono sencillo y
se ha propuesto que la disminución de su expresión interviene en la neurodegeneración en
enfermedad de Huntington (K. H. Chang et al., 2012). Adicionalmente, su deficiencia causa
hipermetionemia -altos niveles de metionina en sangre- y compromete ampliamente el
desarrollo neurológico (Baric et al., 2004). Asimismo, los niveles de homocisteína suelen
estar aumentados en sangre periférica de pacientes con EA, alterando el metabolismo de
carbono sencillo y por tanto, de la metilación de ADN (Fuso, 2013). Teniendo en cuenta lo
108
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
anterior, la metilación del locus de AHCY que encontramos diferencialmente hipermetilado
en EA, puede ser un indicador de especial interés a ser estudiado en sangre periférica de
pacientes con EA.
Adicionalmente, ASIC2 encontrado diferencialmente hipermetilado en el presente estudio
codifica para un canal iónico de compuerta de protones sensible a ácido del cual se sabe
está expresado en cerebro y relacionado con densidad sináptica y que su ausencia en
ratones altera la respuesta comportamental en diferentes tipos de paradigmas de miedo
(Price et al., 2014). La expresión de ASIC2 ha sido reportada en tejidos periféricos como
en barorreceptores (Y. Lu et al., 2009) y según datos de RNAseq de la base GTEx
(Lonsdale et al., 2013) la sangre periférica está dentro de los tejidos donde se encuentra
expresada. Aunque no se conoce ningún papel de ASIC2 en sangre periférica, hace parte
de los patrones de metilación diferencial reportados en el presente estudio relacionados
indirectamente con función neuronal, lo mismo es valido para RABGAP1L también
conocido como KIAA0471 (Tabla 18), que se sabe se encuentra en células sanguíneas y
ha presentado alteraciones en cerebros con EA (de Yebra et al., 2004).
3.3.3 LOCI DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS
3.3.3.1 PATRONES DE METILACIÓN GENES DESTACADOS ENCONTRADOS
DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS
En el análisis mediante DMR con soporte por múltiples CpG, encontramos 11 genes
diferencialmente hipometilados (Tabla 19); entre ellos el gen NLRP2, que está
diferencialmente expresado a la alta en células madre pluripotenciales de sujetos con una
mutación en PSEN1 -modelo celular de EAMF- (Sproul et al., 2014). En sangre periférica,
NLRP2 se encuentra expresado transcripcionalmente y tanto sus niveles de metilación de
ADN como de expresión mostraron correlación con el fenotipo de lupus eritematoso
sistémico (Mele et al., 2015; Sproul et al., 2014; M. Zhao et al., 2014).
Igualmente, se encuentra el gen BNIP3 (Tabla 19). Este hallazgo cubre 3 CpG
consecutivas en la playa de la isla CpG dentro de su región promotora que se localiza ~2Kb
corriente arriba del SIT canónico (código CHR10_M0801_R). Se sabe que este gen está
expresado en sangre periférica y su expresión se encontró directamente asociada a la
forma activa del síndrome inflamatorio de Churg–Strauss; exactamente, dentro de los
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
109
eosinófilos de la forma activa de dicha enfermedad inflamatoria, se halló aumento de la
expresión, en comparación con los eosinófilos de la forma inactiva (Jakiela et al., 2009).
Un aumento de la expresión de BNIP3 también ha sido relacionado con estrés oxidativo en
EA y su bloqueo reduce la muerte neuronal en un modelo de la EA (S. Zhang et al., 2007).
Los patrones de hipometilación diferencial de estos genes en sangre se suman a los ya
mencionados que tienen relación con inflamación sistémica y en parte a respuesta alérgica
inflamatoria (Tabla 18 y Tabla 19).
3.3.3.2 ENRIQUECIMIENTO DE LOCI DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS
En el análisis de enriquecimiento funcional con los genes diferencialmente hipometilados
llama la atención la única ontología concerniente a componente subcelular la cual se
encontró relacionada con el axón (juxtaparanode region of axon, GO:0044224), con dos
genes, CNTNAP2 y DLG4. CNTNAP2 está asociado a Parkinson y autismo (Bakkaloglu et
al., 2008; Zweier et al., 2009), sin embargo, dada la ausencia de expresión de CNTNAP2
en sangre, ciertamente se precluye el significado funcional del patrón de metilación de
dicho gen (Bakkaloglu et al., 2008; Zweier et al., 2009).
Por su parte, DLG4 se expresa en sangre periférica y en el SNC. A nivel de sangre
periférica se encuentra dentro de la respuesta de los linfocitos T mediada por CD46
(Kemper, Verbsky, Price, & Atkinson, 2005) y a nivel central está involucrado con la
densidad sináptica excitatoria/inhibitoria, y su metilación de ADN y expresión
transcripcional mostraron correlación con el fenotipo de sujetos con esquizofrenia (Cheng
et al., 2010).
3.3.4 DISCUSIÓN DE RESULTADOS MÁS DESTACADOS
SOSTDC1, RBMXL2, FIBIN, ITFG3 son los 4 genes encontrados en los rangos
diferencialmente hipometilados más destacados (Tabla 20) en sangre periférica de
pacientes con EA. De acuerdo a los datos de RNAseq de la base GTEx, estos cuatro genes
se expresan en varios tejidos incluyendo sangre periférica (Lonsdale et al., 2013).
SOSTDC1, RBMXL2 y FIBIN, además de su valor como patrones de metilación en sangre
110
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
(Tabla 20), tienen funciones regulatorias génicas en distintos contextos (Collette et al.,
2013; Lakner, Seyer, Hermsdorf, & Schoneberg, 2011; Y. Liu et al., 2009), por lo que en
futuros estudios valdría la pena indagar su función que hasta ahora es desconocida en
células sanguíneas. ITFG3 no tiene ninguna función conocida, sin embargo, los presentes
resultados de patrones de metilación que están altamente soportados (Tabla 20) son en sí
mismos, fuente potencial de marcadores a ser considerados en estudios longitudinales.
Por su parte, MTMR9, MBP y PGPEP1L, son los 3 genes encontrados en los rangos
diferencialmente hipermetilados de mayor soporte estadístico en sangre periférica de
pacientes con EA (Tabla 20). MTMR9 se encuentra dentro de los genes altamente
soportados diferencialmente hipermetilados más destacados en el presente estudio (Tabla
20). MTMR9, tiene un polimorfismo genético asociado a resistencia a la insulina (Tang et
al., 2014). MTMR9 presenta alteraciones tanto en sangre periférica como a nivel del
sistema nervioso central. MTMR9 mostró una expresión disminuida en corteza cerebral de
sujetos con esquizofrenia, lo cual concordó con lo encontrado en sangre periférica dentro
del mismo trabajo condonantes diferentes para cada tejido (Bowden, Scott, & Tooney,
2008).
A su vez, PGPEP1L codifica a una proteína (Pyroglutamyl Peptidase I Like) con función
peptidasa inferida, pero sin ninguna evidencia experimental. Tiene vecindad inmediata con
el promotor del gen LUNAR1 que corresponde a RNA no codificante activador de IGFI1
(Insulin-Like
Growth
Factor
1
Receptor),
el
cual
fue
recientemente
validado -www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/104564224- (Trimarchi et al., 2014). Teniendo en
cuenta que la región DMR correspondiente al locus de los genes PGPEP1L y LUNAR1 es
uno de los patrones de metilación de ADN visiblemente robustos en EA hallados en el
presente trabajo, valdría la pena investigar en futuros estudios si la metilación del ADN en
ese locus tiene significado en sangre periférica para alguno de los dos genes.
MBP
En el presente estudio de sangre periférica, el gen de la proteína básica de mielina (MBP)
mostró aumento de metilación de ADN en un rango genómico (Tabla 18 y Tabla 20). MBP
aparece en tercer lugar, justo después de BIN1, en el análisis de priorización de genes
encontrados en rangos diferencialmente hipermetilados, del estudio en capas de neuronas
piramidales de EA (Anexo 16, Capítulo 1) y mostró disminución en la expresión génica
CAPÍTULO 3: ESTUDIOS DE METILACIÓN DE ADN EN LEUCOCITOS DE
SANGRE PERIFÉRICA POR MICROARREGLOS DE METILACIÓN DE ADN
INFINIUM DNA METHYLATION 450K
111
(Capítulo 2). Otros autores probaron la expresión de MBP en sangre periférica, tanto en
linajes sanguíneos diferenciados como en células progenitoras hematopoyéticas (Marty et
al., 2002). Igualmente, se encontraron anticuerpos contra MBP aumentados en EA
indicando que la MBP puede tener adicionalmente un papel en el componente
neuroinflamatorio de la EA (Singh, 1994). De forma interesante, la administración sistémica
de MBP y recientemente de análogos de MBP causó mejoría en encefalomielitis
autoinmune experimentalmente inducida, indicando el papel de este gen en la modulación
inflamatoria sistémica (Kant, Pasi, & Surolia, 2015; Leadbetter et al., 1998). La discusión
de MBP se amplía más adelante en los apartados pertinentes (Capítulo 4 y Discusión
General).
En conjunto, los resultados de sangre periférica encontrados en el presente capítulo
muestran asociaciones de los patrones de metilación presentes en sangre periférica de EA
con alto soporte estadístico en respuesta inflamatoria, y en menor grado en estrés
oxidativo. Lo anterior indica la relación de la metilación de ADN con una respuesta
inflamatoria alterada presente en la fisiopatología de la EA (Manev, Chen, Dzitoyeva, &
Manev, 2011) y señala potenciales marcadores a ser investigados en futuros estudios (Mori
et al., 2015; Zenaro et al., 2015). Los patrones epigenéticos encontrados en el presente
estudio podrían proporcionar marcadores útiles para evaluar desde el punto de vista
epigenético el componente inflamatorio que se sabe se encuentra presente en sangre
periférica en la EA. Finalmente, se encontró una sutil pero interesante relación con módulos
funcionales neuronales, los cuales en su interpretación biológica se deben razonar en el
contexto de sangre periférica, como se discutió para cada gen que fuera pertinente.
112
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
4 CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA ENTRE
RESULTADOS DE CEREBRO Y SANGRE PERIFÉRICA
4.1 MÉTODOS
4.1.1 DATOS USADOS PARA LA BÚSQUEDA DE CONCORDANCIA
Se realizó un análisis de concordancia entre los resultados de metilación diferencial en EA
del estudio de cerebros (Capítulo 1) y el estudio en sangre periférica (Capítulo 3) mediante
los microarreglos de metilación Infnium DNA Methylation 450K. Del estudio en cerebros,
se usaron los loci genómicos mencionados anteriormente en el numeral 1.2.8 (en la página
70). Conformados por 59 posiciones soportadas por rangos (Anexo 15) y 52 rangos
soportados por múltiples sondas del análisis de DMR (Tabla 14, Capítulo 1) debido a que
son resultados especialmente robustos.
Del estudio en sangre periférica, se usaron los loci genómicos mencionados anteriormente
en concordancias de DMR con DMP numeral 3.2.3 del capítulo 3, en la página 101 (Tabla
20) porque son los resultados de mayor robustez en dicho estudio, donde fue necesaria tal
rigurosidad, dadas las diferencias de lote que hicieron imperativos procesamientos de
normalización y corrección.
CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA ENTRE RESULTADOS DE
CEREBRO Y SANGRE PERIFÉRICA
113
4.1.2 BÚSQUEDA DE CONCORDANCIAS
Se usaron las funciones, FindOverlaps, pinintersect y SubSetByOverlaps del paquete
GenomicRanges en el entorno de programación de R Bioconductor, para la búsqueda de
concordancias genómicas respecto a la localización de coordenadas perfectamente
coincidentes y con igual dirección de la diferencia de metilación de ADN entre ambos
estudios, en forma similar a lo realizado en otros apartados de este trabajo (numeral 1.1.8
del Capítulo 1, en la página 43).
Asimismo, se realizó una búsqueda escueta de los genes coincidentes con igual dirección
de diferencia de metilación en EA entre ambos estudios, para lo cual se utilizó codificación
básica de comparación del entorno estadístico de programación de R. Sin embargo, los
resultados que consideramos más interesantes están dados por la intersección de
coordenadas perfectamente coincidentes. Finalmente, se discutieron algunas similitudes
en análisis de enriquecimiento de ontologías funcionales y la significancia plausible de los
hallazgos encontrados.
114
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
4.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN CAPÍTULO 4
4.2.1 HALLAZGO EN MBP
Más allá de las comparaciones de los análisis funcionales o una concordancia de genes
específicos, en este estudio de patrones de metilación de ADN en EA, buscamos posibles
concordancias perfectas de la metilación diferencial, centrándonos estrictamente en los
rangos genómicos con mayor soporte biológico y estadístico de ambos análisis, como se
explica en la sección de métodos de este capítulo.
De forma interesante, como resultado positivo en este análisis de concordancia,
encontramos un rango genómico de 78 pares de bases comprendido por tres CpG
consecutivos, en el gen MBP que codifica la proteína básica de mielina (coordenadas hg19:
chr18:74799495-572), mostrado en gráfico correspondiente (Anexo 21) de herramienta
UCSC Browser (Karolchik et al., 2014). De forma reiterada por los análisis presentados
previamente, en la misma dirección de cambio de metilación y en tres CpG consecutivos,
se encontró concordancia perfecta de los análisis en cerebro análisis de capas de neuronas
piramidales y en sangre periférica de EA en comparación con controles. Adicionalmente,
en el estudio en cerebros en el análisis de priorización de los genes provenientes de los
rangos genómicos diferencialmente metilados en intersección, se encontró a MBP en los
primeros lugares de la priorización (Anexo 16).
Este resultado tiene un valor especial, pues se trata de un hallazgo reiterado de patrones
de metilación de ADN de EA, en estudios de cerebro y en sangre periférica; se encuentra
en vecindad inmediata del sitio SIT de MBP código CHR18_M0304_R8 de la base
«SwitchGear Transcription Start Sites TSS» del UCSC Genome Browser (Karolchik et al.,
2014). Análogamente, en un promotor putativo del gen que codifica la alfa sinucleína, se
encontró metilación de ADN diferencial, en enfermedad de Parkinson (Jowaed, Schmitt,
Kaut, & Wullner, 2010). Dada la estrategia utilizada, es más que plausible que estos
hallazgos reflejen un escenario biológico real en lugar de resultados que se expliquen
únicamente por estocástica. La discusión de este hallazgo en específico, se amplía en la
discusión general del presente documento.
CAPÍTULO 4: ANÁLISIS DE CONCORDANCIA ENTRE RESULTADOS DE
CEREBRO Y SANGRE PERIFÉRICA
115
4.2.2 OTROS RESULTADOS
En ambos análisis, aparecen grupos funcionales relacionados con localización subcelular
de soma neuronal (neuronal cell body, GO:0043025), en sangre periférica (Tabla 21) y en
cerebros (Ej: Anexo 6). Asimismo, se encontraron ontologías de procesos biológicos
relacionadas con estrés oxidativo, en sangre (response to hypoxia, GO:0001666) -Tabla
22- y en cerebros (oxidoreductase activity, acting on a sulfur group of donors, disulfide as
acceptor, GO:0016671 / oxygen transport, GO:0015671), además de GSTP1, no agrupado,
pero con actividad antioxidante (Tabla 5). Igualmente, el módulo funcional de UCSC_TFBS
HFH3 (sitios de unión del factor de transcripción HFH3, también conocido como FOXI1),
se encuentra encabezando las listas de ambos análisis de enriquecimiento en cerebros
(Tabla 6) y en sangre (Anexo 17). La pérdida de FOXI1 evita la formación de células
precursoras neuronales, y HFH3 induce competencia neuronal durante el neurodesarrollo
del oído interno en ratones y en peces cebra (Hans, Irmscher, & Brand, 2013; Hulander et
al., 2003).
Teniendo en cuenta todos los resultados de DMP sin exigir coincidencia perfecta de locus
genómico, hay se evidencian doce genes diferencialmente hipermetilados en común entre
el estudio de cerebros y el de sangre periférica a saber: CACNA2D3, MAP4K4, MBP,
PCDHA3, PCDHA2, PCDHA1, HS3ST4, HLA-DOA, TRIM10, SOX2-OT, TGFBR2 y
RABGAP1L. Por el contrario, no hay ni un solo gen diferencialmente hipometilado en EA
coincidente para ambos estudios. Estos resultados son válidos para el grupo de sujetos
evaluados y merecen ser puestos a prueba en cuanto a su utilidad como biomarcador en
futuros estudios con seguimiento longitudinal de pacientes con TCL y EA de diferentes
latitudes en un número mayor de sujetos. Los sujetos estudiados en todos los análisis de
microarreglos en cerebro y en sangre fueron de origen caucásico y aunque esto no impide
que en otras poblaciones se espere un comportamiento similar, si supone una llamada a
evaluar su utilidad como biomarcador especialmente en dicha población. Los resultados
obtenidos muestran concordancias en los análisis de enriquecimiento funcional y en genes
diferencialmente hipermetilados.
En conjunto, los resultados encontrados en el presente capítulo, muestran interesantes
cambios concordantes en EA detectados entre el análisis en las capas de neuronas
piramidales corticales de importancia biológica en la EA y en leucocitos de sangre
116
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
periférica, de importancia práctica, pues permite potencialmente ensayos implementables
en laboratorios clínicos o genéticos convencionales. Las similitudes parciales entre ambos
análisis, concuerdan con lo reportado recientemente en investigaciones en Parkinson y en
esquizofrenia (Masliah et al., 2013; Walton et al., 2015) y por tanto, reitera la utilidad de los
patrones de metilación de ADN en sangre periférica como subrogado parcial de lo ocurrido
en cerebro; dando valor a los potenciales marcadores encontrados en sangre periférica, en
especial, para los que se encuentren alterados tanto en sangre periférica como en cerebros
(Walton et al., 2015).
Por lo anterior, consideramos que nuestro principal hallazgo en sangre periférica es la
concordancia en MBP, pues además de que no se trata de una coincidencia parcial sino
de una coincidencia exacta en cuanto a la región genómica, MBP tiene implicaciones en
inflamación tanto en SNC como en sangre periférica. La sangre y el SNC podrían parecer
sitios no relacionados haciendo difícil interpretar cualquier similitud, sin embargo, se ha
propuesto de manera reciente que la inflamación sistémica puede exacerbar síntomas
conductuales mediante el paso de ROS y posiblemente de citoquinas inflamatorias al SNC,
por lo que se señala que la inflamación sistémica puede entenderse como parte de la
fisiopatología de la EA, incluso de su neurodegeneración (Holmes, 2013).
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
117
5 CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR
PCR DE METILACIÓN EN GENES ALTAMENTE
ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
5.1 INTRODUCCIÓN
La presente sección concierne a trabajos en sangre periférica para implementación de
técnicas realizables a costo moderado en laboratorios convencionales, para evaluar la
metilación del ADN en genes asociados a la EA, a lo cual suele referirse como trabajo de
laboratorio húmedo o «wet lab» (Mentzel et al., 2014). En conjunto con las presentes
implementaciones de «wet lab», se consiguió la publicación de un artículo científico con
revisión crítica de diferentes técnicas para estudio de metilación de ADN (Hernandez et
al., 2013), el cual es parte integral del presente capítulo (Anexo 19).
La aplicación del conocimiento de las técnicas basadas en PCR para metilación de ADN,
para laboratorios convencionales se consolidó en la implementación de dos técnicas
diferentes; la técnica «Methylation Specific High Resolution Melting» (MS-HRM) y la técnica
«Bisulfite Sequencing PCR» (BSP) en APOE, APP, CLU, TOMM40 y LINE1. Las
metodologías de PCR para metilación de ADN, difícilmente cubren de forma exacta la
misma región, dificultad discutida en estudios comparativos (Quillien et al., 2012). Sin
embargo, en el presente estudio se diseñaron «primers» totalmente concordantes o
adyacentes en cuanto a la región evaluada por las dos metodologías utilizadas.
Como se explica en el artículo científico anexo de este capítulo (Anexo 19), la técnica de
MS-HRM mide las diferencias de «melting » detectables entre el ADN metilado y el ADN
no metilado, para encontrar el nivel de metilación de cada muestra en estudio. Dentro de
la doble hélice de ADN, cada Citosina (C) se une con una Guanina (G) complementaria,
mediante un triple enlace de hidrógeno, y cada de Timina (T) se une a una Adenina (A)
complementaria, mediante un doble enlace. Por lo tanto, luego del proceso de la conversión
de bisulfito explicado previamente (Ilustración 1), las diferencias de los patrones de
«meltign» medidos en la MS-HRM permiten extrapolar los niveles de metilación de ADN
(Hernandez et al., 2013).
118
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
La técnica de BSP tiene dos modalidades, una conocida como BSP directa y otra como
BSP mediante clonación (Hernandez et al., 2013). Las ventajas y desventajas se
discutieron en detalle en el artículo científico anexo de este capítulo (Anexo 19), sin
embargo, cabe mencionar que la modalidad de BSP directa, siempre que se acompañe de
un adecuado análisis, es de menor costo, manteniendo el nivel de precisión de otras
técnicas de secuencia (Jiang et al., 2010; Lewin, Schmitt, Adorjan, Hildmann, &
Piepenbrock, 2004). Por lo tanto, en el presente trabajo se usó la modalidad de BSP directa
en los estudios de implementación, que hubiesen costado 10 veces o más, por la
modalidad de clonación, sin incremento mayor de su sensibilidad (Jiang et al., 2010).
LINE1
LINE1 se refiere a secuencias retrotrasposónicas de elementos nucleares intercalados
largos 1, los cuales representan una importante proporción del genoma, por lo cual
permiten tener un estimativo de la metilación global en sangre periférica en EA, y su estudio
nos llevó a una segunda publicación en revista científica (Hernandez et al., 2014).
APOE
El gen que codifica la Apolipoproteina E (APOE), es el gen de mayor importancia asociado
a la aparición de la EA, excepto en la EAMF (Arboleda et al., 2001; Roses, 1996; Saunders
et al., 1993). La isla CpG de APOE, ubicada en su exón III, se asocia con dicha importancia,
en el sentido que dentro de la secuencia de la isla CpG se encuentran los polimorfismos
genéticos que confieren el mayor riesgo de EA (Arboleda et al., 2001). Adicionalmente, un
estudio indica que la metilación de ADN de dicha isla CpG en APOE, muestra una
correlación positiva con la expresión de APOE y produce efectos modulatorios duales tejido
dependiente, con efecto potenciador / supresor génico en la expresión de TOMM40 (C.-E.
Yu et al., 2013). Por lo tanto, se seleccionó la isla CpG de APOE para ser estudiada durante
el proceso de implementación de técnicas de PCR en laboratorio convencional, en sangre
periférica.
APP
También se seleccionó la región promotora canónica de APP para los ensayos de
implementación de PCR. APP codifica la proteína precursora de amiloide y se relaciona
con la causalidad genética de la EAMF. En cerebros humanos, se encontró una
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
119
disminución de la metilación de ADN de APP, asociada al incremento de la edad de los
sujetos (Mastroeni et al., 2011; Tohgi et al., 1999). En leucocitos de sangre periférica, fue
demostrada la expresión génica transcripcional y proteica de APP, dando posibilidad de
evaluar su utilidad como biomarcador en EA (Delvaux, Bentley, Stubbs, Sabbagh, &
Coleman, 2013). Adicionalmente, en un estudio inicial en EA, para leucocitos de sangre
periférica, la metilación en el promotor de APP, se mostró prometedora en curvas ROC (S.
C. Wang et al., 2008), aunque tenía un número muy limitado de muestras de sangre
periférica.
TOMM40
TOMM40 es un gen relacionado epigenéticamente con APOE del cual se encuentra a sólo
2 Kilobases de distancia (C.-E. Yu et al., 2013). La expresión transcripcional de TOMM40
se ha encontrado menor en pacientes con EAMF de progresión rápida en comparación con
controles, indicando la utilidad potencial de estudiar la regulación génica de TOMM40 como
biomarcador (Chong et al., 2013; T. S. Lee et al., 2012). Asimismo, en un estudio realizado
-independientemente a esta tesis- en el Instituto de Genética de la Universidad Nacional
de Colombia, se encontró TOMM40 asociado a EA en nuestra población, en concordancia
con lo encontrado en otros estudios (Ma et al., 2013; Ortega-Rojas et al., 2015). Por lo
tanto, se seleccionó la región promotora de TOMM40 para los ensayos de implementación
de técnicas de PCR en laboratorio convencional, en sangre periférica.
CLU
CLU corresponde a la apolipoproteina J (o clusterina), con semejanza funcional de APOE.
Además, se encontraron polimorfismos genéticos de CLU asociados a EA de forma
destacada en estudios de GWAS (J. C. Lambert et al., 2009). Por su cercanía funcional y
considerando su correlación con los niveles de expresión de APOE (Bertrand, Poirier, Oda,
Finch, & Pasinetti, 1995), se incluyó al promotor de CLU para los presentes ensayos de
implementación de técnicas de PCR en laboratorio convencional, en sangre periférica.
120
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
5.2 MÉTODOS DE PCR PARA METILACIÓN DE ADN EN
SANGRE
5.2.1 REGIONES ESTUDIADAS
Se logró la implementación de dos tipos diferentes de técnicas basadas en PCR para
metilación de ADN, la técnica «Methylation Specific High Resolution Melting» (MS-HRM) y
la técnica «Bisulfite Sequencing PCR» (BSP) para los genes mencionados y resumidos a
continuación (Tabla 23). Estas implementaciones tienen un grado de complejidad mayor a
las implementaciones de PCR convencionales (Hernandez et al., 2013). Se realizaron
ensayos en regiones específicas cuyas características se consignan a continuación (Tabla
23):
Tabla 23. Regiones seleccionadas y características de las islas CpG correspondientes a las regiones
seleccionadas, estudio de implementación de técnicas de metilación de ADN basadas en PCR.
Comentario
localización de la
Rango estudiado
número de
Isla CpG más
(hg19) por
CpGs
cercana
secuenciación
Isla CpG /
Orilla CpG
Región
estudiada en
MS-HRM
(hg19)
APOE
Única isla CpG de
APOE en Exón IV
chr19:45,411,72190 CpGs
45,412,600
chr19:45,412,44545,412,630
Isla CpG
chr19:45,411,7
82-45,411,910
APP
Promotor canónico
chr21:27,541,894168 CpGs
27,543,524
chr21:27,543,47027,543,622
Isla CpG y
Orilla de Isla
CpG
chr21:27,543,4
66-27,543,575
CLU
Promotor canónico
chr8:27,471,95527,472,523
chr8:27,472,12627,472,299
Isla CpG
chr8:27,472,15
0-27,472,240
TOMM40
Promotor canónico
chr19:45,393,83486 CpGs
45,394,992
chr19:45,393,07345,393,288
Orilla de Isla
CpG
chr19:45,393,1
15-45,393,252
LINE-1
Loci que reflejan la
de metilación
global de ADN
múltiples
loci en
genoma
múltiples loci en
genoma
elementos
nucleares
intercalados
largos 1
142 pb
(múltiples loci
en genoma)
Símbolo
oficial
retrotransposones
46 CpGs
Convenciones. Símbolo oficial: símbolo oficial en base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica o
National Center for Biotechnology Information (NCBI) en USA. localización de la Isla CpG más cercana, el rango estudiado
por secuenciación y la región estudiada en MS-HRM, se escriben en nomenclatura de coordenadas genómicas hg19. El
rango estudiado por secuenciación es de mayor extensión que el cubierto por la técnica MS-HRM.
Excepto en el caso de APOE donde la isla CpG es de importancia conocida, el diseño de
«primers» fue orientado en lo posible, hacia orillas de islas CpGs. En el caso de CLU, se
logró la implementación en la isla CpG propiamente dicha dentro de la región promotora.
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
121
5.2.2 MUESTRAS
Se estudiaron por MS-HRM un total de 120 sujetos, sesenta pacientes con EA y sesenta
sujetos controles. Los mencionados sujetos donaron muestras de sangre periférica al
biobanco del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Los pacientes
con EA y controles se asemejaron en cuanto a su edad y género. Sesenta (60) sujetos,
15% hombres, conformaron el grupo de EA (con media de edad de 75.18 ± 8.1 años), y
sesenta (60) sujetos, 13.3% hombres, integraron el grupo de controles (con media de edad
74.61 ± 6.23 años). No se encontraron diferencias en la edad (prueba t de Student, p>0.05),
ni en la distribución de géneros (prueba Xi2, p>0.05).
Para cada gen evaluado por MS-HRM una parte de las muestras (al menos el 10%) fue
analizada por BSP, esto permite evaluar el grado de metilación de ADN a nivel de
secuencia en sujetos con EA en comparación con controles. Así mismo, para los genes
APOE y TOMM40, dada su especial importancia, se realizó un número mayor de corridos
de BSP incluyendo la mayoría de las muestras. Los subconjuntos de muestras
seleccionados tampoco mostraron diferencias significativas en cuanto su edad o su
composición de género (prueba t de Student, p>0.05; prueba Xi2, p>0.05).
Los pacientes con EA cumplieron los criterios de diagnóstico clínico de NINCDCS-ADRDA
(Blacker et al., 1994) en la evaluación por un neurólogo especializado. Los sujetos contaron
con genotipificación para los alelos de riesgo de APOE y del SNP rs2075650 de TOMM40
-como parte de un proyecto matriz de Colciencias código 110154531720- (Tabla 24). El
consentimiento informado verbal y escrito fue tomado en todos los casos y siguiendo la
normatividad colombiana ("Normas Científicas, técnicas y administrativas para la
investigación en salud: Resolución 8430," 1993) y de acuerdo a lo descrito en la sección
de aspectos éticos de este trabajo.
Tabla 24. Frecuencias relativas de genotipos TOMM 40 y APOE, muestras de sangre periférica de
estudio de implementación de técnicas basadas en PCR.
CT
EA
Genotipos TOMM40 .
rs2075650
AA
GA
GG
81.6% 16.6% 1.7%
48.3% 41.7% 10%
Genotipos ε de APOE
23
5%
3.3%
24
1.6%
6.7%
33
66.6%
50%
34
25%
33.3%
44
1.7%
6.7%
Convenciones. CT: grupo de sujetos controles. EA: grupo de sujetos con EA. Las frecuencias relativas para cada genotipo
se escriben en porcentaje.
122
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
5.2.3 EXTRACCIÓN DE ADN Y «CONVERSIÓN» POR BISULFITO
DE SODIO
El ADN fue aislado de las muestras de sangre periférica usando el kit Relia Prep Blood
gDNA Miniprep System (A5082-PROMEGA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La
«conversión» con bisulfito de sodio del ADN extraído se realizó usando el sistema EZ DNA
Methylation-Direct Kit (D5021-Zymmo-Research) con ligeras modificaciones al protocolo
las cuales se muestran en un anexo de este documento (Anexo 19)
5.2.4 DISEÑO DE PRIMERS
Los «primers» para la técnica de MS-HRM para las regiones estudiadas fueron diseñados
acorde con las recomendaciones para esta metodología (Hernandez et al., 2013; Tse et
al., 2011; Wojdacz, Dobrovic, & Hansen, 2008). Se realizaron ensayos por BSP en los
genes mencionados, lo cual tiene utilidad a la hora de encontrar cambios específicos a
nivel de secuencia. Sin embargo, para LINE-1 sólo se realizó MS-HRM (Hernandez et al.,
2014) debido a que dicho ensayo fue intencionado para estimar el estado de metilación
global (Tse et al., 2011). Para el diseño de los «primers» de MS-HRM se siguió el protocolo
expuesto más adelante (véase, en el numeral 5.4.2.2 del presente Capítulo y el Anexo 25).
Los «primers» para la técnica de BSP, fueron diseñados siguiendo las indicaciones de los
creadores de la técnica y con ayuda del programa informático Bi-Search, módulo «Simple
search», se evaluó su especificidad la cual estuvo por debajo de 3000 correspondencias,
de acuerdo a lo recomendado (Aranyi & Tusnady, 2007; Clark, Harrison, Paul, & Frommer,
1994; Hernandez et al., 2013). Para el diseño se siguió el protocolo expuesto más adelante
(véase, numeral 5.4.2.2 del presente Capítulo y Anexo 26).
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
123
Tabla 25. Lista de «primers» para ensayos de implementación por técnicas basadas en PCR para
metilación de ADN.
Promedio de posibles
#
uniones de primers por
CpGs
hebra
Región
estudiada
«Primer Foward»
«Primer Reverse»
LINE-1
MS-HRM
GCGAGGTATTGTTTTATTTGGGA
CGCCGTTTCTTAAACC
APP
MS-HRM
GTCGTATAAAGGATTGTTGTTA
CTTCACTCGTTCTCATTCTCT
381
APOE
MS-HRM
GTCGTAGGGCGTTGATGGA
CTACGCCGCCTACAACTCC
21
CLU
MS-HRM
GGGAAGACGGGGATATTTTAT
CGACGCCTCCCAATACC
121
TOMM40
MS-HRM
GTATTTCGGGAAATTGAGG
TCCAAAATAACTAAACTACAAAT
2351
APP BSP
TATAAAGGATTGTTGTTAGGGTG
AAAATTTTACTATCTCAACAAAC
353
APOE
BSP
TGGAGAAGGTGTAGGTT
TTTATTAAACTAAAATCCACCCC
368
CLU BSP
TTGGTGTGGTTTTGTTTAAGG
CATACAAATTTACAACCAAC
1058
TOMM40
BSP
ATAGTAATTGGTTAGATGT
AAACTTCTAACCTCAATC
422
NA, Múltiples copias
en genoma
En la parte superior de la tabla los «primers» para MS-HRM, en la inferior los «primers» para BSP. Región estudiada: se
refiere al gen o secuencia transposónica evaluado y al abordaje utilizado al que corresponde la región descrita previamente
con coordenadas genómicas (Tabla 23). El promedio de posibles uniones de «primers» por hebra fue evaluado por la
herramienta Simple search de BiSearch (Aranyi & Tusnady, 2007).
5.2.5 CONTROLES DE ADN METILADO Y NO METILADO
Se utilizaron controles de ADN genómico humano no metilado estándar (Zymo-Research)
que corresponden a ADN de células doble mutantes para DNMT1 y DNMT3b, dado que
una tercera mutación en DNMT3a haría inviable a estas células. Asimismo, se utilizó ADN
metilado del mismo fabricante (Zymo-Research); el cual se prepara mediante metilación
enzimática sobre ADN genómico -de células de igual clase que el ADN no metiladofavoreciendo la equivalencia entre ambos tipos de controles (Hernandez et al., 2014;
Hernandez et al., 2013).
124
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
5.2.6 DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE DE METILACIÓN POR
MS-HRM
Después de tratar el ADN de las muestras con la técnica de «conversión» por bisulfito de
sodio, se cuantificó su concentración. La cuantificación se realizó mediante la opción para
ADN de cadena sencilla del equipo de espectrometría Nanodrop C2000 (Thermo), lo cual
mostró adecuada reproducibilidad siempre y cuando se garantizara ADN libre de impurezas
(Hernandez et al., 2013; Tse et al., 2011). Posteriormente, dicha concentración se
normalizó a 14 ng/µl para todas las muestras (Hernandez et al., 2014).
El ADN «convertido» y puesto a una concentración homogénea, fue usado en ensayos de
«MethylationSpecific High Resolution Melting» (MS-HRM) en el sistema de tiempo real
CFX96 (BioRad) de acuerdo a parámetros anexos (Anexo 20) y los datos obtenidos fueron
analizados con PrecisionMelt Analysis Software (BioRad). Esta metodología consiste en
una PCR de tiempo real que determina el porcentaje de metilación de una región de interés
basada en el análisis de las curvas de melting del ADN tratado con bisulfito de
sodio -Ilustración 1- (Hernandez et al., 2013; Tse et al., 2011; Wojdacz et al., 2008).
Para cada uno de los ensayos de MS-HRM, se generaron curvas estándares mediante el
uso de ADN humano control metilado y no metilado (Zymo-Research), normalizados a la
misma concentración que las muestras (14 ng/µl) que luego fueron mezclados entre sí a
diferentes medidas de metilación (0%, 25%, 50%, 75% y 100%). Para cada muestra, se
obtuvo un valor de Porcentaje de Metilación (PM), por región de interés, el cual se calculó
por interpolación lineal en el programa MS Excel (Microsoft), usando los datos
normalizados de fluorescencia de las «curvas estándares» tomados del programa
PrecisionMelt Analysis Software (BioRad) desde el cual fueron exportados (Hernandez et
al., 2013; Tse et al., 2011; Wojdacz et al., 2008).
5.2.7 DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE METILACIÓN POR
ANÁLISIS DE SECUENCIAS
En los ensayos de BSP (BisulfiteSequencing PCR) el ADN fue tratado con bisulfito de igual
forma que para la técnica de MS-HRM. Se utilizó el ADN tratado para amplificar regiones
de interés que coinciden en gran parte con las analizadas por MS-HRM (Tabla 23), en
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
125
termociclador Thermal Cycler C1000™ (BioRad) de acuerdo a los parámetros anexos
(Anexo 20). Los productos de PCR obtenidos fueron purificados y secuenciados en el
servicio de secuenciación SSIGMol del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de
Colombia.
Las secuencias fueron analizadas con el paquete informático Epigenetic Sequencing
Methylation Software (ESME), con las opciones predeterminadas (Eckhardt et al., 2006).
Este «software» (disponible en http://www.epigenome.org/index.php?page=download)
realiza varios controles de calidad (Anexo 27), permitiendo identificar individualmente y de
forma confiable los porcentajes de metilación de cada dinucleótido CpG (Eckhardt et al.,
2006; Hernandez et al., 2013; Lewin et al., 2004).
5.2.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizaron comparaciones estadísticas del estado de metilación de ADN -medido por
las técnicas basadas en PCR utilizadas- de pacientes con EA, en comparación de
controles. El resultado de las pruebas de normalidad de Shapiro Wilks, indicó distribución
normal y se realizó una «prueba T de Student» de dos colas para las comparaciones.
En el análisis de BSP, cada CpG se analizó de forma individual. Asimismo, se analizó el
promedio de todas las CpG de cada gen, para estudiar el estado de metilación regional
diferencial correspondiente.
En los análisis regionales por BSP, se incluyeron las secuencias CpG que contaron con 10
o más registros de alta calidad en cada grupo (EA y CT) -de acuerdo a los controles de
ESME 3.2- (Eckhardt et al., 2006; Lewin et al., 2004). Así mismo, se tuvo en cuenta de
forma focalizada una subregión de 27 pares de bases (pb) de la isla CpG de APOE, debido
a que sobre esa subregión, se encontraron diferencias de metilación particularmente claras
entre EA y controles. Por lo tanto, se agruparon CpG adyacentes del rango correspondiente
a dicha sub-región en un análisis de metilación diferencial regional, de forma análoga a lo
realizado, con el paquete DMRcate, para los datos de metiloma de ADN humano.
Finalmente, se realizaron comparaciones adicionales de la metilaciones de ADN en sujetos
con EA contrastándolas con las de un subgrupo específico de los sujetos controles que
presentaron un puntaje particularmente alto (~29/30) en la prueba de tamizaje de
126
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
minimental (Perneczky et al., 2006). Esta subselección se hizo con el fin de evaluar si el
uso de controles con alto nivel de funcionamiento cognitivo, pudiera hacer más claras las
diferencias de la metilación de ADN presentes en el grupo con EA. En las subselecciones
correspondientes se conservaron las distribuciones de edad (EA: 72.6±8.8 años vs CT:
70.6±8.1 años; prueba t de Student, p>0.05) y géneros (EA: 33% hombres vs CT: 36%
hombres; prueba Xi2, p>0.05). Además, se realizó un análisis estratificado según la
presencia o ausencia de genotipos de riesgo de TOMM40 y APOE en los sujetos para los
datos de BSP y de MS-HRM.
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
127
5.3 RESULTADOS
1.1 RESULTADOS MS-HRM
En cada una de las regiones estudiadas por MS-HRM, las curvas de los estándares de
metilación de ADN utilizados presentaron un r2 mayor a >0.8, mostrando una adecuada
linearidad en todos los ensayos. Se presenta a continuación un ejemplo de gráfica de MSHRM correspondiente a la región de APP estudiada, la cual muestra una linealidad
prácticamente perfecta (Ilustración 8). En un anexo se muestran las gráficas y los valores
r2 correspondientes para todos los genes (Anexo 21).
Quality control in MS-HRM assays
100%
APP
120
100
50%
25%
0%
R² = 0.9999
100
80
60
50
40
25
20
0
-20 0.0
0
0.2
0.4
Ilustración 8. Control de calidad de curvas de melting para MS-HRM. La gráfica ilustra las curvas de la diferencia de
la primera derivada de las señales de fluorescencia relativa normalizadas, usada para el cálculo de la metilación mediante
los trazados de diluciones estándares a diferentes niveles de metilación conocidos (0%, 25%, 50%, 75% y 100%). Curvas
de melting normalizadas mediante «Pressision Melt analisis Software» (Bio-Rad). Ejemplo corresponde a MS-HRM de
orilla de la isla CpG de APP.
Usando MS-HRM, se encontraron diferencias con menor metilación de DNA en EA en
comparación de controles en APOE (75.7 PM vs 80.8 PM, p<0.05), dentro del rango
genómico estudiado (coordenadas hg19, chr19:44,908,525-653). Este rango se encuentra
al interior de la única isla de APOE (Tabla 23, en la página 120). Para las demás regiones
genómicas evaluadas por MS-HRM, TOMM40, APP, CLU y LINE-1, no se encontraron
diferencias significativas en los niveles de metilación de DNA entre el grupo de pacientes
con EA y el grupo de controles (Tabla 26).
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
128
Tabla 26. Resultados de metilación de DNA por la técnica MS-HRM en muestras de sangre periférica
de estudio de implementación de técnicas basadas en PCR.
Región estudiada
usando MS-HRM
Media nivel de
metilación EA %
Media nivel
de metilación CT %
valor p
CLU
7.1
4.2
0.1553
APP
1.9
1.8
0.7313
LINE-1
70.6
73.8
0.2799
TOMM40
73.8
74.3
0.7395
APOE
75.7
80.8
0.0261 *
Convenciones: Región estudiada: se refiere al gen o secuencia transposónica evaluado y al abordaje utilizado
al que corresponde la región descrita previamente con coordenadas genómicas (Tabla 23). Media nivel de
metilación EA y de CT, se refieren al nivel de metilación encontrado en formato de porcentaje para el grupo de
EA y el grupo control respectivamente. valor p: valor p de prueba t de dos colas, entre el grupo de pacientes con
EA y el grupo de controles (CT). * p <0.05.
1.2 RESULTADOS BSP
A continuación se muestran los resultados de metilación de DNA por secuenciación (BSP)
a nivel de CpG individual que se encuentran encabezando la significancia estadística
(Tabla 27). Dentro de los resultados encontrados por BSP destaca el CpG en la isla CpG
de APOE con código «APOE CpG 12», como hallazgo con claro soporte estadístico
(p=0.0001).
Tabla 27. Resultados de metilación de DNA por secuenciación (BSP) a nivel de CpG, encabezando la lista de
significancia estadística, estudio de implementación por técnicas basadas en PCR.
MP
MP
n
Pri
Gen
Posición CpG
Valor p
DE
DE
n CT código CpG
EA
CT
EA
mer
APOE
APOE CpG 9
APOE:101
0.0632
0.76 0.16 0.83
0.12 29
27
R
APOE
APOE:130
0.0001**
0.94
0.06
0.99
0.02 30
32
APOE CpG 12
F
CLU
CLU:33
0.0372*
0.04
0.05
0.12
0.09 13
10
CLU CpG 1
R
TOMM
TOMM:72
0.0581
0.88
0.09
0.91
0.04 48
45
TOMM40 CpG 3
R
Abreviaturas. Posición CpG: posición del CpG en pb dentro del rango genómico de la secuencia estudiada (coordenadas
hg19 en la Tabla 23), código CpG: código arbitrario para numerar los CpGs de cada gen del estudio, media de metilación,
desviación estándar (DE) y valor p de la diferencia entre el grupo con EA y el grupo de controles (CT). n: número de lecturas
exitosas por grupo. Primer: oligonucleótido Foward o Reverse usado para la comparación correspondiente por secuenciación
directa. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su localización. Se tabulan CpGs que presentaron
diferencias significativas o cercanas al umbral de significancia. * p <0.5. **p<0.001.
En forma anexa se muestran los demás resultados negativos (Anexo 22). Se obtuvieron
resultados a nivel de CpG para cada uno de los genes mencionados. El número de corridos
por BSP analizados para cada CpG dependió del número de secuencias que lograron
pasar los filtros de calidad de ESME (Anexo 22); como sucede habitualmente en
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
129
secuenciación, hay pérdida de información al inicio del corrido de cada secuencia
(Hernandez et al., 2013).
A continuación se muestran los resultados a nivel regional de BSP, tomando secuencias
con más de 20 lecturas, que tuvieran un mínimo de diez lecturas de calidad por grupo,
según los filtros de calidad predeterminados del «software» ESME. La región genómica
correspondiente al promotor de TOMM40, muestra tendencia hacia la hipometilación de
EA en comparación con controles en la zona estudiada por secuenciación, cercana al límite
de la significancia (Tabla 28).
Tabla 28. Resultados a nivel de promedio regional por secuenciación BSP, estudio de implementación por
técnicas basadas en PCR.
Gen
CLU
Valor p
Met
Región EA
0.2244
0.044
Met
Región
CT
CpGs Promediados
0.062
CLU:40, CLU:47, CLU:61, CLU:63, CLU:65, CLU:77,
CLU:80, CLU:83, CLU:85
APOE
0.7151
0.879
0.884
APOE CpG 1, APOE CpG 2, APOE CpG 3, APOE
CpG 4, APOE CpG 5, APOE CpG 6, APOE CpG 7,
APOE CpG 8, APOE CpG 9, APOE CpG 10, APOE
CpG 11, APOE CpG 12, APOE CpG 13
TOMM40
0.0525
0.879
0.909
TOMM40 CpG 1, TOMM40 CpG 2, TOMM40 CpG 3,
TOMM40 CpG 4, TOMM40 CpG 5, TOMM40 CpG 6,
TOMM40 CpG 7, TOMM40 CpG 8
APP
0.1635
0.018
0.044
APP CpG 3, APP CpG 4, APP CpG 5
Convenciones. Gen: se refiere al gen evaluado en la localización estudiada por secuencia que corresponde a la región
descrita previamente con coordenadas genómicas (Tabla 23). Met Región EA: Nivel de metilación tomando el promedio
regional de todos los CpG para EA. Met Región CT: Nivel de metilación tomando el promedio regional de todos los CpG
para CT. «CpGs Promediados»: códigos corresponden a los CpG que pasaron los controles de calidad de ESME, en
rango genómico estudiado. Valor p: el valor de p correspondiente a prueba t de Student de dos colas. * p<0.5.
130
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Adicionalmente, haciendo una sub-selección de sujetos control con puntaje de
«minimental» particularmente alto alrededor de 29/30, los resultados muestran que la
comparación de los EA con dichos sujetos, existen diferencias más claras en el nivel de
metilación del gen APOE (Tabla 29). Estos resultados no se asocian a una diferencia
estadísticamente significativa de distribución de géneros (Xi2, p>0.05) y de edad (prueba t
de Student, p>0.05), se presentan con un número más bajo de sujetos evaluados, por lo
que se relacionan de forma inherente con una potencia estadística menor.
Tabla 29. Resultados destacados de secuenciación a nivel de CpG de EA, en comparación de subselección de
controles con puntaje minimental ~29/30.
APOE
APOE:51
Met
EA
0.927
0.120
Met
sCT
0.948
APOE
APOE:65
APOE
APOE:68
0.864
0.095
0.920
0.086
APOE
APOE
APOE:85
0.965
APOE:93
0.924
APOE
APOE:101
APOE
APOE:116
APOE
APOE
DE
n EA
n sCT código CpG
Valor p
0.079
30
12
APOE CpG 4
0.5293
0.888
0.068
31
12
APOE CpG 5
0.3723
0.954
0.090
31
12
APOE CpG 6
0.2751
0.061
0.937
0.060
31
12
APOE CpG 7
0.1731
0.058
0.899
0.103
31
12
APOE CpG 8
0.4502
0.915
0.047
0.962
0.021
30
11
APOE CpG 9
0.0001***
0.971
0.037
0.985
0.010
30
11
APOE CpG 10
0.0585
APOE:118
0.964
0.033
0.957
0.024
31
11
APOE CpG 11
0.4522
APOE:130
0.941
0.056
0.984
0.024
30
11
APOE CpG 12
0.0015**
APOE
APOE:146
0.914
0.062
0.958
0.021
30
11
APOE CpG 13
0.0016**
APOE
APOE:155
0.876
0.065
0.939
0.024
30
11
APOE CpG 14
0.0001***
Gen
Posición CpG
DE
Convenciones. Gen: se refiere al gen evaluado en la localización estudiada por secuencia que corresponde a la región
descrita previamente con coordenadas genómicas (Tabla 23). Posición CpG: posición del CpG en pb dentro del rango
genómico de la secuencia estudiada en dirección positiva de APOE. Met CT: Nivel de metilación del respectivo CpG para CT.
Met EA: Nivel de metilación del respectivo CpG para EA. DE: desviación estándar. Código CpG: código arbitrario para numerar
los CpG de cada gen del estudio. Valor p: el valor de p correspondiente a prueba t de Student de dos colas. *: p <0.5,
**:p<0.001, ***:p = 0.0001. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su rápida localización.
Los dinucleótidos CpG diferencialmente metilados en APOE, se observan particularmente
en un sector concreto de 26 pares de bases continuas dentro de la región estudiada de
APOE (Tabla 29). En dicha subregión se encuentran tres CpG consecutivas de códigos,
APOE CpG 12, APOE CpG 13 y APOE CpG 14, correspondientes a su orden de ubicación
dentro del rango estudiado por BSP.
Los análisis regionales de la mencionada subregión de 26 pares de bases, mostraron
diferencias del nivel de metilación promedio en el grupo de EA (0.92) en comparación con
el grupo CT (0.95), mostrando una tendencia estadísticamente significativa hacia la
hipometilación en el análisis de BSP incluyendo todos los controles (P=0.02), y tales
diferencias se hicieron más claras en el subanálisis realizado limitando el grupo control a
los sujetos con un minimental particularmente alto (P<0.001).
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
131
Finalmente, por MS-HRM el análisis estratificado por subgrupos de polimorfismos
genéticos de APOE, mostró tendencia hacia hipometilación de la isla CpG de APOE en EA
en comparación de controles en presencia o ausencia del haplotipo de riesgo E4, sin
alcanzar la significancia estadística (prueba t de Student, p ~ 0.10). Tal comportamiento se
encontró equivalente con la técnica BSP. Así mismo, la metilación en TOMM40 no mostró
diferencias de APOE en EA en comparación de controles en presencia o ausencia del
haplotipo de riesgo E4. De igual forma, en la metilación de TOMM40 no se encontró
diferencia en presencia o ausencia del genotipo de riesgo del SNP rs2075650 (Anexo 18).
Igualmente, ni al interior de los pacientes con EA ni al interior de los sujetos controles, se
encontró diferencia alguna en la metilación entre sujetos con el alelo de riesgo GG en
rs2075650 en comparación con sujetos con genotipo GA (valor p > 0.05). Estos resultados
son concordantes con una independencia del estado de metilación de la isla CpG de APOE
con tales polimorfismos genéticos encontrados previamente (C.-E. Yu et al., 2013).
En resumen, al comparar los niveles de metilación de la isla CpG de APOE de los pacientes
con EA en comparación con los controles, encontramos cambios en los niveles de
metilación entre los grupos, observándose una tendencia hacia la menor metilación en la
isla de APOE en el grupo con EA, de forma concordante, tanto para la técnica de MS-HRM
como para la técnica de BSP y de forma no relacionable con los polimorfismos genéticos.
132
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
5.4 DISCUSIÓN DE CAPITULO 5
Se realizaron implementaciones de dos diferentes tipos de pruebas MS-HRM y BSP,
factibles en laboratorios de genética convencionales, para las cinco regiones genómicas
estudiadas APP, APOE, LINE1, CLU y TOMM40, y se evaluó su metilación de ADN en EA
y controles en sangre periférica. Estas implementaciones, en conjunto con la revisión crítica
publicada de dichas técnicas (Hernandez et al., 2013) se relacionan con la capacidad de
proyectar los hallazgos del presente trabajo con estudios longitudinales ulteriores que
puedan ser de utilidad para el diagnóstico y seguimiento de la EA y el DCL.
Nuestros resultados de metilación de DNA para LINE1 en EA, indican ausencia de
diferencias significativas entre la metilación global entre EA y controles, sugieren que
eventuales diferencias de metilación entre EA y controles no se deben a una tendencia
global de aumento o disminución de la metilación del ADN que afecte el genoma en forma
indiscriminada y se encuentran publicados en una revista científica revisada por pares
(Hernandez et al., 2014). Adicionalmente, estos resultados concuerdan con la ausencia
de metilación diferencial global encontrada en los estudios de metiloma completo del
presente trabajo (Capítulos 1 y 2). Por otro lado, en una de las demás regiones genómicas
estudiadas, la isla CpG de APOE, se encontraron hallazgos que se discuten a continuación.
5.4.1 HIPOMETILACIÓN DIFERENCIAL EN LA ISLA CpG DE APOE
El hallazgo más claro en nuestros estudios por PCR en sangre periférica fue la disminución
de metilación en la isla CpG de APOE que fue encontrada tanto por MS-HRM (Tabla 26),
como por BSP (Tabla 27). Los niveles promedio de la metilación de ADN encontrados en
la isla CpG de APOE se observan dentro del rango esperado según lo reportado
previamente -niveles de metilación entre 54% y 100%- (C.-E. Yu et al., 2013).
Los resultados mediante secuenciación (BSP), mostraron hipometilación diferencial en la
secuencia CpG de código APOE CpG 12 y una tendencia en APOE CpG 9, analizando la
totalidad de los sujetos. De forma interesante, en el análisis en el que se contrastó el grupo
de pacientes con EA con un subconjunto de los controles con alto puntaje en minimental,
se encontró que a pesar de disminuirse el número de sujetos, el hallazgo hacia
hipometilación diferencial en APOE, se presentó con más claridad en varios CpG
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
133
incluyendo APOE CpG 9 (Tabla 29). Esto no se debió a diferencias en la composición de
género en los grupos (p > 0.05), e igualmente no se encontraron diferencias en presencia
o ausencia del genotipo de riesgo (Anexo 18) lo cual es concordante con una
independencia reportada previamente del estado de metilación de la isla CpG de APOE
con tales polimorfismos genéticos (C.-E. Yu et al., 2013).
Además, se observa una subregión que contiene los resultados más claros de BSP (Tabla
29), dentro de la cual a solo 26 pares de bases de APOE CpG 12, se encuentra APOE
CpG14, este último CpG presentó tendencia hacia la hipometilación diferencial tanto en el
análisis con todos los controles (valor p=0.083), como en el análisis con dicha selección
más estricta de controles mediante puntaje minimental (Tabla 29).
Los análisis de metilación diferencial de la subregión de 26 pb que fue identificada,
presentaron diferencias del nivel de metilación promedio en el grupo de EA en comparación
con el grupo CT, mostrando hipometilación diferencial regional (p=0.02), además, en el
análisis realizado tomando como referencia el subconjunto de controles con minimental
más alto, tal diferencia se hizo más clara (P<0.001). Cabe mencionar que los niveles de
metilación encontrados en BSP en el presente estudio fueron cercanos a los reportados
mediante piro-secuenciación en células sanguíneas para la Isla CpG de APOE de otro
estudio media 0.928± 0.74 (C.-E. Yu et al., 2013).
Teniendo en cuenta que la expresión de APOE se encontró más baja en sujetos con EA
en comparación con controles, lo cual es independiente del genotipo de riesgo Épsilon de
base (Siest et al., 2000) y en segundo lugar, que existe una correlación positiva de la
expresión de APOE con los niveles de metilación de ADN en su única isla CpG (C.-E. Yu
et al., 2013), los presentes resultados de hipometilación diferencial en leucocitos de sangre
periférica en EA en comparación con controles, pueden proponerse como un marcador
epigenético relacionado con la expresión de APOE, con potencial utilidad biomédica en el
seguimiento de pacientes con EA y TCL a ser evaluada en estudios longitudinales.
134
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Asimismo, se conoce que una mayor metilación de APOE potencialmente se puede traducir
en una mayor expresión de TOMM40 (C.-E. Yu et al., 2013) y en sangre periférica,
TOMM40 se encuentra con menor expresión transcripcional en sujetos con EA en
comparación con controles (Chong et al., 2013; T. S. Lee et al., 2012), lo que sugiere que
la menor metilación de la isla CpG de APOE en EA encontrada en el presente estudio, lleve
a un menor efecto «enhancer» en la expresión de TOMM40 en sangre periférica, en forma
similar como se reportó para cerebros humanos (Ilustración 9).
Relative mRNA expression levels and their correlation with APOE CpG island DNA methylation
Ilustración 9. Figura de correlación entre la metilación de la isla CpG de APOE y la expresión de TOMM40.
Ilustración extraída de la referencia (C.-E. Yu et al., 2013) conservando idioma original. «Relative mRNA
expression levels and their correlation with APOE-CGI DNA methylation levels in human postmortem brains.
Positive correlation between the levels of methylation and TOMM40 expression was observed (Pearson’s
correlation, r2=0.347, n=59, P<0.007) ».
Por lo tanto, la existencia de una hipometilación diferencial de la isla de APOE en EA es
compatible con una menor expresión de APOE y de TOMM40 encontrada en estudios
previos. Adicionalmente, este hallazgo resulta en la importancia de evaluar de forma
longitudinal la metilación de la isla de APOE, tanto en sujetos con DCL, en su posible
progresión hacia EA, como en sujetos con EA –durante la progresión de su enfermedad-,
poniendo así a prueba su potencial utilidad en la biomedicina aplicada.
Desafortunadamente, la región exacta correspondiente a la isla CpG de APOE, encontrada
diferencialmente metilada dentro de nuestros análisis en muestras del biobanco del
Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia, no se encuentra
representada en las Sondas del microarreglo de metilación de ADN Infinium DNA
Methylation 450K. Por tanto, para el resultado a nivel de secuencia encontrado positivo de
APOE en las muestras mencionadas, es imposible evaluar su concordancia con ningún
estudio realizado con los microarreglos mencionados.
CAPÍTULO 5: IMPLEMENTACIÓN Y ESTUDIO POR PCR DE METILACIÓN EN
GENES ALTAMENTE ASOCIADOS A EA EN SANGRE PERIFÉRICA
135
5.4.2 OTROS HALLAZGOS Y APORTES
5.4.2.1 RESULTADOS NEGATIVOS
Las regiones genómicas exactamente coincidentes entre las estudiadas por PCR y los
microarreglos en sangre periférica analizados en el presente trabajo, correspondientes a
APOE, presentaron resultados concordantes mostrando ausencia de diferencias
significativas de metilación de ADN en EA tanto en el estudio de análisis de microarreglos
en sangre Infinium DNA Methylation 450K realizado en este trabajo, como en el estudio
usando secuenciación convencional (detalles de estos análisis negativos disponibles a
solicitud).
Se encontró una tendencia hacia hipometilación en el promotor de TOMM40 y el de CLU,
limitados a CpG de códigos, TOMM40 CpG 3 y CLU CpG1, con un resultado mayor al límite
de la significancia estadística en TOMM40 CpG 3 y solo por debajo del punto de corte para
CLU CpG1 (p=0.04); no se considera un resultado de importancia, al ser un hallazgo
aislado, además, con soporte estadístico claramente inferior al encontrado para la isla CpG
de APOE que por el contrario tiene claros resultados (Tabla 29) y que visiblemente
superarían una corrección por el número de pruebas evaluadas que fue de 76 CpG.
5.4.2.2 REVISIÓN CRÍTICA DE
LAS
TÉCNICAS
PARA ESTUDIO
DE
METILACIÓN EN LABORATORIO CONVENCIONAL
En el artículo anexo a este capítulo, se revisan críticamente los diferentes tipos y subtipos
de metodologías basadas en PCR disponibles en laboratorios de genética convencionales,
útiles en la evaluación de la metilación de ADN. Asimismo, se revisa el proceso de diseño,
las herramientas para evaluar la calidad del diseño y la interpretación de los resultados de
dichos análisis de metilación de ADN. Las páginas 247 a 258, contienen el artículo
publicado en la revista científica «Journal of BioTechniques». Dicho artículo fue escrito con
aportes de los coautores y con revisión crítica por parte de los pares evaluadores.
El planteamiento global, las gráficas y las respuestas a los pares evaluadores, fueron
abordadas casi en su totalidad por el primer autor dentro del proceso de su trabajo de
formación doctoral, con aportes de los profesores participantes. En la discusión del artículo
se abordan las ventajas, desventajas, diferentes tipos de cubrimiento y costos de los
diversos tipos de técnicas disponibles (Anexo 19). Estas técnicas se basan en un paso
inicial en común dado por el tratamiento de bisulfito, también conocido como «conversión
136
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
con bisulfito» mediante el cual, las citosinas no metiladas se «convierten» en uracilo,
transformación que es mediada por varias reacciones químicas. El conocimiento
implementado de las técnicas de metilación de ADN en laboratorios convencionales, así
como el diseño de las pruebas para la región más destacada de MBP en sangre periférica
con base a los resultados presentados, permitirá en el futuro que estudios longitudinales,
puedan situar su utilidad en la biomedicina aplicada.
5.4.2.3
«SRIPT» Y PROTOCOLO DE DISEÑO DE «PRIMERS» PARA MSHRM Y BSP
Durante el proceso de revisión (Hernandez et al., 2013), se detectó un vacío destacado en
el área de diseño de PCR para metilación de ADN, el cual está dado por falta de programas
que permitan el fácil diseño de los «primers» para la técnica MS-HRM, por lo tanto, dentro
del presente trabajo, se programó un «script» en lenguaje Java-html, para facilitar el diseño
de los «primers» para dicha técnica.
El mencionado «script» realiza los procesos de conversión «in sllico» de la secuencia
genómica, emulando la conversión por bisulfito y arroja la secuencia «convertida» con un
formato que indica fácilmente la localización de los sitios CpG, las Timinas (T) provenientes
de Citosinas(C), las regiones con series de nucleótidos repetidos y las regiones con
complejidad lingüística, facilitando así (con un solo «click») un diseño semimanual más
rápido de «primers» para MS-HRM. Este aporte será puesto a servicio público como
«Detailled bisulfite converter script for MS-HRM desing», haciendo disponible su uso en
internet; será reportado brevemente a la comunidad científica mediante una carta al editor
de una revista del área y se suma a lo aportes del presente trabajo.
Se anexa un ejemplo del proceso de diseño de «primers» por la técnica MS-HRM -para la
región de interés de MBP-. En dicho ejemplo, se usa el «script» mencionado, siguiendo un
protocolo del Laboratorio de Neurociencias del Instituto de Genética de la Universidad
Nacional de Colombia (Anexo 25). Análogamente, se anexa un ejemplo para el diseño de
«primers» de BSP, en igual región de interés de MBP (Anexo 26). Se desarrolla el
protocolo equivalente valiéndose del mismo «script» para BSP.
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
137
6 CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
6.1 HALLAZGOS GENERALES
Para facilitar su relación con los diferentes resultados, las discusiones por capítulos fueron
ubicadas inmediatamente después de los resultados correspondientes, sin embargo, son
un presupuesto previo indispensable que hace parte integral de la discusión general. La
presente discusión retoma en forma global todos los resultados, con el fin de resaltar los
principales hallazgos y desarrollar en un contexto general las discusiones parciales de cada
capítulo.
En un contexto metodológico, consideramos que el principal aporte del presente trabajo
fue que se realizó por primera vez un abordaje de microdisección asistida por láser de
capas de neuronas piramidales, para estudiar el metiloma de ADN en el genoma humano
en EA, mediante la combinación de capacidades de diferentes laboratorios especializados
en los cuales trabajó el autor de esta tesis. De esta forma, se demostró la factibilidad de
dicho abordaje que aporta rigurosidad a lo realizado previamente en el campo de los
estudios de metilación de ADN en EA.
Otros aportes generales del presente trabajo, fueron que mediante el manejo riguroso de
millones de datos, se logró compilar e integrar información de diferentes repositorios
públicos, en un estudio de metiloma de ADN en EA; el cual es hasta la fecha, el más grande
que se haya realizado en sangre periférica de sujetos con EA en comparación con
controles. Igualmente, se realizó una revisión de las técnicas para estudios de metilación
de DNA en laboratorios convencionales (Hernandez et al., 2013), además, de la
implementación de MS-HRM y BSP, en sangre periférica (Hernandez et al., 2014) y
encontramos disminución de metilación en la isla CpG de APOE en EA, discusión abordada
en su totalidad en el apartado específico para ese resultado (Discusión del Capítulo 5,
página 132).
En la realización experimental del presente trabajo, se produjeron en números crudos, más
de 17 millones de datos inéditos sobre el mapa epigenético humano de capas de neuronas
piramidales de la corteza cerebral de sujetos con EA y sus respectivos controles. Estos
138
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
datos equivalen a varios Gigabytes de información y son una cuota de los aportes
asociados a este trabajo. Asimismo, se reanalizaron en una forma novedosa otros 33
millones de datos del epigenoma, para completar los más de 50 millones de datos de
metilación de ADN que fueron estudiados por parte del autor de esta tesis, permitiéndole
aportar resultados originales de metilación diferencial en EA a nivel del genoma humano.
A nivel de metilación global, los resultados no mostraron diferencias significativas en los
niveles generales de metilación de DNA (media ± DE) de los cerebros con EA comparados
con los controles (EA 0.5371± 0.008 NM vs. 0.5313 ± 0.01 NM, valor p > 0.05). Tales
hallazgos son concordantes con otro trabajo en el cual no encontramos diferencias
significativas globales de metilación de ADN en hipocampo de un modelo animal estudiado
de EA en comparación con ratones WT (Sandoval-Hernandez et al., 2015).
Análogamente, en el estudio en sangre periférica realizado mediante un abordaje por PCR
mediante la técnica MS-HRM (Hernandez et al., 2014), tampoco se encontraron
diferencias significativas de la estimación global de metilación de ADN en EA en
comparación con CT, lo cual fue concordante por lo encontrado a nivel del metiloma en EA
(EA 0.5335 ± 0.007 NM vs. CT 0.5334 ± 0.006 NM, valor p > 0.05). Estos resultados de
metilación global son negativos e indican de forma concordante que eventuales resultados
de metilación diferencial a nivel de loci específicos, no se explicarían por diferencias
globales de metilación de ADN (Hernandez et al., 2014).
6.2 HALLAZGOS DE GENES DIFERENCIALMENTE
METILADOS EN EA EN CAPAS DE NEURONAS
PIRAMIDALES CORTICALES
En contraste a los numerosos genes encontrados diferencialmente hipermetilados en el
presente estudio en cerebros, los genes diferencialmente hipometilados, fueron muy
escasos en número (Anexo 1) y en los resultados de los análisis de enriquecimiento no
presentaron ninguna correspondencia con módulos u ontologías funcionales (véase,
numeral 1.2.3.3, Capítulo 1, en la página 51). Por tal razón, para el estudio de cerebros nos
centramos únicamente en discutir los genes diferencialmente hipermetilados encontrados
en EA (véase, discusión del Capítulo 1 y del Capítulo 2).
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
139
6.3 GENES DIFERENCIALMENTE HIPERMETILADOS EN
CEREBROS HUMANOS CON EA
Como hallazgos principales encontramos genes diferencialmente metilados en cerebros
humanos con EA, dentro de los que se destacan BIN1 y HOXA3, que al igual que KDM2B
(también conocido como CXXC2) y el gen ZNF385A, se corroboraron con hallazgos
recientemente reportados dando fuerza a los hallazgos del presente trabajo (De Jager et
al., 2014). Cabe destacar que ANK1, se encontró dentro de genes asociados con la
ontología «axolema» y BIN1 se agrupó dentro de las ontologías «axón» y «microtúbulos».
Para el mencionado gen ZNF385A, no se conoce su función y no se ha estudiado su papel
en EA; sin embargo, según la base de datos «uniprot» se infiere una localización en
proyecciones neuronales en cerebro y según datos de RNAseq de la base GTEx, la corteza
cerebral está dentro de los tejidos en donde está transcripcionalmente expresado
(Lonsdale et al., 2013).
CXXC1, KDM2B (también conocido como CXXC2) y MBD1 (también conocido como
CXXC3), presentaron un nivel de metilación mayor en EA en comparación con controles
en el presente estudio. Los tres genes tienen papeles epigenéticos y son necesarios para
el desarrollo, como fue mencionado y discutido para MBD1 y CXXC1 (véase, Discusión del
Capítulo 1). Además, en un análisis realizado en este trabajo (véase, Discusión del Capítulo
2) MBD1 al igual que CXXC2, se encontraron con una menor expresión transcripcional, en
EA, en comparación con controles.
En el presente trabajo, se encontró CXXC2 diferencialmente hipermetilado y con una
disminución significativa de su expresión en neuronas piramidales (Tabla 17, Capítulo 2).
En cáncer, CXXC2 presenta aumento de la expresión generando fenotipos cancerígenos
en un proceso mediado por «el complejo Policomb» (Tzatsos et al., 2013). Análogamente,
en cáncer, MBD1 y CXXC1 han presentado una disminución en la metilación del ADN, que
es exactamente contrario a lo encontrado en el presente trabajo de EA. Además, el
silenciamiento de MBD1 mediante RNA de interferencia lleva a regresión tumoral (Derks et
al., 2009). Estas observaciones podrían ser interesantes en la discusión actual de la
relación inversa encontrada entre cáncer y la EA, en estudios de incidencia clínica (J. M. Li
et al., 2014; Musicco et al., 2013).
140
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
De forma interesante, un estudio en ratas mostró inhibición de la DNMT, enzima
responsable de la metilación del DNA, que se relaciona con CXXC1-3, impide la formación
de memoria comportamental en ratas adultas maduras y se encontraba en relación con el
mecanismo de acetilación de la histona H3 (Miller et al., 2008). En conjunto, nuestros
hallazgos mencionados de aumento de metilación en capas de neuronas piramidales en
los genes CXXC1-3, sugieren que la metilación de ADN puede aportar dentro del desarrollo
de los procesos fisiopatológicos en EA, mediante posibles actores epigenéticos de una
manera no contemplada por trabajos anteriores.
En el presente trabajo fueron encontrados múltiples genes asociados con ontologías de
prolongaciones sinápticas hipermetilados en EA, los cuales fueron tratados en la discusión
del Capítulo 1; a estos se agrega el gen EIF2AK4 (también conocido como GCN2) que se
encontró diferencialmente hipermetilado (p corregida=1.94E-04, Delta de beta 0.14)
soportado en el análisis DMR por 3 sondas (valorPminimo=1.44E-12, luego de corrección
para pruebas múltiples). GCN2 participa igualmente en la consolidación de la memoria
(Devi & Ohno, 2013) y ratones GCN2 -/-, tienen alteraciones tanto en su respuesta al
entrenamiento en la prueba de Morris de memoria espacial, como en el umbral de
potenciación a largo plazo (Costa-Mattioli et al., 2005; Roffe, Hajj, Azevedo, Alves, &
Castilho, 2013). La expresión transcripcional de GCN2 en neuronas piramidales (Capítulo
2) fue menor en EA en comparación con la encontrada en controles (FC= -1.96, valor p=
0.024, luego de corrección). Además, su «KO» declina el déficit de memoria en un modelo
murino de EA y su reducción se propuso como factor partícipe en la patogénesis de la EA
(Devi & Ohno, 2013).
En conjunto lo mostrado en el presente documento, permite proponer que la metilación de
ADN y posiblemente los componentes de metilación de ADN en los que se involucre
CXXC1-3, tienen relación con el proceso fisiopatológico de la EA -interactuando con otros
actores del problema- e interviniendo en genes que se relacionan con la sinapsis,
disrupción de las prolongaciones neuronales y estrés oxidativo. El presente estudio aporta
novedosos resultados que contribuyen al conocimiento actual de la complejidad del cuadro
fisiopatológico de la EA, conseguidos gracias al abordaje metodológico realizado.
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
141
6.4 HALLAZGO EN REGIÓN DE MBP EN CEREBROS
Otro hallazgo importante, corresponde al gen de la proteína básica de mielina (MBP) que
fue encontrado diferencialmente hipermetilado en cerebros con EA en el presente estudio.
Este gen aparece después junto a BIN1 en una priorización de genes encontrados en
rangos altamente soportados por varias CpG (Anexo 16).
Paralelamente, otro trabajo mostró que la MBP bioencapsulada, cruzó la barrera
hematoencefálica en una investigación con un modelo murino 3xTgAD y este tratamiento
llevó a una reducción de la fracción A-Beta42 y de acúmulos proteicos teñidos con tioflavina
(Kohli et al., 2014). Asimismo, en un reciente estudio de espectrometría de masas se
encontró que la forma degradada de MBP coinmunoprecipita con AB 1-42 rebelándose que
MBP tiene implicaciones en daño axonal y formación de placas (Zhan et al., 2015). En ese
contexto, nuestro hallazgo de hipermetilación de ADN de MBP en EA, en capas corticales
específicas, señala el valor de cuantificar MBP en EA mediante neuroimágenes en tales
capas corticales con protocolos de resonancia magnética nuclear (Spencer et al., 2013) y
lleva a retomar un modelo de la EA, que sostiene que el vínculo de la susceptibilidad de
ciertos axones piramidales a la pérdida o al daño de la mielina, contribuye a la progresión
tanto de la patología amiloidea como del declive cognitivo (Bartzokis, 2004).
Los hallazgos en cerebros humanos del presente trabajo discutidos en esta sección y en
las discusiones de los Capítulos 1 y 2 (páginas 72 y 92, respectivamente), en conjunto
indican que la alteración epigenética dada por la metilación de ADN aumentada en capas
corticales de neuronas piramidales, se relaciona con genes involucrados con componentes
de sinapsis y de prolongaciones neuronales que se saben se encuentran comprometidos
dentro de la fisiopatología de la EA.
6.5 GENES DIFERENCIALMENTE HIPOMETILADOS EN
CEREBROS HUMANOS CON EA
Como hallazgo rescatable de los patrones de metilación hacia hipometilación diferencial en
EA, los resultados para el subconjunto hombres del análisis de metilación regional
diferencialincluyen el rango genómico encontrado como hipometilado de coordenadas
chr6:29910912-29911104 asociado al gen HLA-A (Anexo 13). En estudios de asociación
142
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
genética a la EA, las variantes genéticas de HLA-A han mostrado resultados contradictorios
en cuanto a su posible asociación a la EA (Araria-Goumidi, Lambert, Cottel, Amouyel, &
Chartier-Harlin, 2002). Sin embargo, una débil asociación genética, no suprime del todo la
posibilidad de que el estado epigenético de HLA-A, o de los otros genes diferencialmente
hipermetilados aquí reportados en cerebros (Anexo 1) tengan importancia dentro de la EA.
6.6 CONCORDANCIA CON LOS ESTUDIOS PREVIOS
Mediante el abordaje realizado en esta tesis se encontró concordancia a nivel de CpGs
exactos, con el estudio de mayor impacto publicado en el área (De Jager et al., 2014),
dando validez cruzada entre los estudios. De hecho, en un examen por sondas
seleccionadas (Anexo 24), se encontró para nuestro estudio concordancia parcial con casi
la totalidad de las 14 sondas presentadas en la tabla principal del estudio citado (De Jager
et al., 2014). Además, 5 de las 14 sondas coinciden, presentando un Delta Beta >0.06 y
una significancia, luego de corrección por pruebas múltiples p <0.05 corregida por FDR al
número total de sondas del genoma (Anexo 24). Posiblemente, debido al gran número de
muestras utilizadas por el estudio citado (De Jager et al., 2014), dicho trabajo pudo lograr,
al igual que el nuestro, un poder estadístico adecuado.
6.7 METILACIÓN DIFERENCIAL EN LEUCOCITOS
En
los principales hallazgos encontramos los genes MBP, PGPEP1L y MTMR9
diferencialmente hipermetilados en EA en el presente estudio en sangre (Tabla 20).
En el análisis de DMR, una cuarta parte de las regiones diferencialmente hipermetiladas
destacadas se localizaron en el cromosoma 6p21-p22.1, dentro de la región del complejo
mayor de histocompatibilidad (Tabla 18). Por ejemplo TRIM31 y RNF39, del complejo
mayor de histocompatibilidad clase I y HLA-DQB1 de clase II. En concreto, la mitad de las
24 regiones encontradas diferencialmente hipermetiladas que tuvieran 3 o más CpG
consecutivas en el análisis de DMR de sangre periférica se encontraron relacionadas con
inflamación sistémica. Además, el 21.53% de los genes que se encuentran en dicha tabla
están relacionados con respuesta alérgica inflamatoria (CACNG6, TMEM232 y PDIA3P).
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
143
De forma interesante, HLA-DQB1, recientemente se encontró asociado a la EA (Mansouri
et al., 2015) indicando que un componente inflamatorio influye en el riesgo genético de
desarrollar la EA. En conjunto con lo anterior, la hipermetilación diferencial en EA hallada
en el presente estudio en genes con papel inflamatorio (Tabla 18), por ejemplo, CACNG6,
CPN1, TMEM232, PDIA3P y MBP (Discución del Capítulo 3, página 104), indica un patrón
epigenético en EA claramente relacionado con inflamación presente a nivel periférico.
Los resultados de agrupamiento funcional con los genes diferencialmente hipermetilados
en EA en sangre periférica incluyeron componentes relacionados con el estrés oxidativo
que se vincula a su vez con la inflamación periférica en EA. Asimismo, un pequeño grupo
de genes dados por ACHY, MBP, MAP2 y CRHR1 encontrados diferencialmente
hipermetilados en sangre periférica en pacientes con EA se agruparon en ontologías
neuronales, y tienen función conocida en sangre periférica asociada con respuesta
inflamatoria a excepción de AHCY cuya función se relaciona con el metabolismo de SAH.
Por otro lado, los genes destacados en rangos de hipometilación diferencial en sangre
periférica de pacientes con EA (SOSTDC1, RBMXL2, FIBIN y ITFG3) no tienen ningún
papel conocido en sangre periférica. Pese a esto y a su falta de relación con los patrones
en cerebro, dichos resultados son fuente potencial de marcadores a ser considerados en
futuros estudios longitudinales, pues presentan un soporte estadístico y regional a tener en
cuenta (Tabla 20). Otros resultados de metilación diferencial encontrados en el presente
estudio en sangre periférica, corresponden a genes relacionados con inflamación, tales
como el gen NLRP2 y los genes encontrados en enriquecimiento funcional -DLG4 y BNIP3(numerales 3.3.3.2, Capítulo 3, página 108 a 109).
Los patrones de metilación diferencial en sangre periférica de EA encontrados en el
presente estudio, se relacionan con inflamación y con estrés oxidativo, procesos
contribuyentes en EA. Por tanto, dentro de ellos podría existir un subrogado parcial de la
inflamación y estrés oxidativo que ocurre en cerebros con EA y constituyen potenciales
marcadores a ser evaluados en relación a la evolución de la enfermedad y en especial, los
hallados en genes con relación funcional, tanto a nivel de sangre periférica como a nivel de
SNC. De hecho, en esquizofrenia y en Parkinson se señaló recientemente la utilidad del
tejido sanguíneo como subrogado parcial del SNC (Walton et al., 2015). A continuación, se
discute el hallazgo más importante que encontramos en concordancia para ambos tejidos.
144
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
6.8 MBP PRESENTÓ IGUALES PATRONES DE
METILACIÓN EN EA, EN SANGRE Y EN CEREBROS
El gen MBP fue encontrado diferencialmente hipermetilado en una región genómica que
fue perfectamente concordante entre el estudio de sangre y el de cerebros del presente
trabajo. En sangre periférica y en cerebros, el gen MBP, al igual que otros genes discutidos
a lo largo de los capítulos, se relacionan con la respuesta inflamatoria asociada a EA. En
específico se encontró que los ratones MBP-/- presentan un incremento de neuroinflamación asociada a un modelo murino de EA 5xFAD (Ou-Yang & Van Nostrand, 2013).
La discusión de este hallazgo se encuentra en la sección correspondiente (numeral 4.2.1
del Capítulo 4, en la página 114). El resultado de MBP aunque especialmente interesante,
es concordante con lo reportado en otros contextos para diferentes genes con alteraciones,
tanto en sangre periférica como a nivel del SNC, por ejemplo, MTMR9 mostró una
expresión disminuida en cerebros con esquizofrenia, reflejada a su vez, en el estudio de
sangre periférica (Bowden et al., 2008). MTMR9 junto con MBP se encuentran
encabezando la lista de genes diferencialmente hipermetilados en sangre periférica (Tabla
20).
6.9 APLICABILIDAD
Considerando que, nuestros resultados indican que la región genómica de MBP está
diferencialmente hipermetilada en EA, tanto en sangre periférica como en cerebros; se
sugiere que a futuro se realicen estudios longitudinales de MBP en EA y TCL, de forma
que se puedan hacer mediciones periódicas por varios años de seguimiento en sangre
periférica, y así evaluar la utilidad de MBP como marcador del progreso de la EA de manera
similar a lo realizado en otras enfermedades (Houseman, Kim, Kelsey, & Wiencke, 2015;
Quillien et al., 2012).
Sin embargo, se debe plantear que incluso si los hallazgos de metilación en sangre no
tienen un patrón idéntico al encontrado en cerebros, las regiones génicas diferencialmente
metiladas representan una fuente válida de
biomarcadores en enfermedades
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
145
neurodegenerativas (Houseman et al., 2015). Además, la medición de la metilación de ADN
implica obtener valores que pueden informar sobre la evolución de la EA de forma más
estable que las mediciones de expresión transcripcional de microRNA o RNAm (Birdsill et
al., 2011; Horvath et al., 2012). Por todo lo anterior, los resultados encontrados de patrones
de metilación en sangre periférica tendrían valor como biomarcadores potenciales en EA.
Como se mencionó previamente, una interesante investigación encontró un cambio
epigenético en la metilación de un sitio CpG del receptor 1 de corticotropina CRHR1 en
ratones proclives a trastorno de ansiedad. Aún en presencia del genotipo causante, esta
alteración epigenética y comportamental, fue reversible mediante el enriquecimiento del
ambiente de los ratones mutantes del modelo de ansiedad, evidenciándose la posibilidad
de modular fenotipos neuropsiquiátricos mediante modificadores epigenéticos, que pueden
ser tanto ambientales como farmacológicos (Sotnikov et al., 2014). Se reitera que en el
citado caso en particular, la causa del fenotipo es una alteración en su secuencia genética,
lo cual no impidió que fuera epigenéticamente modulable (Sotnikov et al., 2014).
En el presente estudio, usando capas de neuronas piramidales, encontramos varios genes
de factores transcripcionales / proteínas con dominios de dedos de zinc, diferencialmente
hipermetilados en EA, por ejemplo, ZCCHC4, ZNF385A, TRIM33, CXXC1, CXXC2, MBD1
(CXXC3) y HOXA3, los cuales presentaron una menor expresión transcripcional en
neuronas piramidales con EA y que por su naturaleza implican actividad moduladora de
expresión génica. Desde el punto de vista farmacológico, nuevos medicamentos que
modulen
alteraciones
epigenéticas
en
diferentes
enfermedades
muestran
ser
prometedores, -independiente de si la enfermedad tiene o no un origen genético- (Huisman
et al., 2015; Stefanska & MacEwan, 2015). Tal como lo demuestran varias investigaciones
actuales en esa área, se proyecta el uso clínico de medicamentos diseñados contra sitios
específicos del ADN que puedan «encender» o «apagar» interruptores genéticos de
secuencias específicas que presenten patrones potencialmente perjudiciales. Esto se logra
emulando artificialmente factores transcripcionales / proteínas con dominios de dedos de
zinc (Grimmer et al., 2014; Heller et al., 2014; Huisman et al., 2015; Stefanska & MacEwan,
2015). El papel del conjunto de factores transcripcionales afectados, puede ejercer un
efecto modulador dentro de la fisiopatología de la EA y entre ellos, será posible buscar
efectores candidatos que pudieran estar dentro de una nueva generación de medicamentos
con efectos benéficos para la EA, asociados a blancos genómicos específicos.
146
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
En presentaciones internacionales de los resultados de este trabajo donde se mostraron
también algunos de los estudios de metiloma publicados recientemente, se discutió sobre
cuál es la dirección causal de la metilación de ADN en la instauración de la EA. Esta
pregunta fue en parte diseccionada por un estudio recién publicado (Chibnik et al., 2015)
en el cual se evaluó la metilación de ADN en 11 genes asociados a EA (entre ellos CLU,
APOE y BIN1) y su correlación con los hallazgos patológicos en presencia y en ausencia
del genotipo de riesgo, estudio realizado usando los resultados de Infinium DNA
Methylation 450k de dos cohortes de estudios previos (Chibnik et al., 2015).
Los resultados del citado estudio mostraron que luego de eliminar la influencia de las
variaciones genéticas, asociadas a la patología de EA, se encontró que el nivel de
metilación de ADN en múltiples CpG estaba efectivamente asociado a la patología de EA
(Chibnik et al., 2015). Dichos autores sugieren un modelo en el que existe una considerable
independencia de la metilación diferencial de estos genes en sus variantes genéticas y en
la cual pueden esperarse marcadores de metilación antes de la instauración del deterioro
cognitivo en EA (Chibnik et al., 2015). Además, dichos hallazgos se localizaron en regiones
muy delimitadas dentro de cada gen, resaltando un único dinucleótido CpG, al interior la
isla CpG de APOE que no había sido asociado a la patología de EA en estudios anteriores
(Chibnik et al., 2015).
Medicamentos que generan cambios epigenéticos en el genoma han sido efectivos en
múltiples contextos neurológicos (R. S. Lee et al., 2015; Wright et al., 2015). Asimismo,
considerando los efectos adversos relacionados con los medicamentos epigenéticos
iniciales con blancos terapéuticos muy inespecíficos, en la actualidad en farmacología
epigenética se procura lograr la mayor especificidad posible, lo cual se puede lograr
racionalmente, en tanto se conozcan patrones de loci específicos alterados, aun cuando
no fuera posible dar de antemano respuesta inequívoca a la pregunta sobre si una
alteración epigenética específica es la causa o no de la enfermedad, para que una
modulación epigenética sea efectiva (Melchardt et al., 2013; Sotnikov et al., 2014;
Stefanska & MacEwan, 2015).
Los resultados presentados pretenden contribuir, más allá de todo lo realizado
previamente, a delinear las diferencias epigenéticas poco entendidas que se asocian a la
CAPÍTULO 6: DISCUSIÓN GENERAL
147
EA esporádica, en las cuales hoy la metilación de ADN reclama tener una participación
substancial. Adicionalmente, la utilidad del conocimiento más claro de patrones de
metilación de ADN alterados en la EA se proyecta a que en un futuro será factible el diseño
de posibles reguladores génicos, mucho más específicos que los actuales, que interrumpan
o retrasen la progresión de la neurodegeneración asociada.
A diferencia de la «secuencia genética» de un paciente con DLC o con EA, la cual no
podemos modificar, para inclinar la balanza hacia los fenotipos neurológicamente sanos,
el «componente epigenético» si es susceptible de modificarse de forma estable y en ese
sentido puede ser una herramienta más útil que la genética en el diseño de nuevas
estrategias terapéuticas tendientes a prevenir o frenar la devastante historia natural de la
EA (Melchardt et al., 2013; Sotnikov et al., 2014; Stefanska & MacEwan, 2015).
En conjunto, los hallazgos aquí reportados constituyen aportes importantes al área con
potenciales aplicaciones en biomedicina y su correspondiente publicación se hará en
revista(s) científica(s) con alto nivel de impacto. Adicionalmente, los datos del presente
trabajo serán puestos a disponibilidad de la comunidad científica de acuerdo a la política
exigida por las revistas científicas más prestigiosas respecto a la «liberación» de datos
genómicos, lo cual permite que el impacto final de lo aportado se amplíe en futuras
investigaciones en la EA o en otras enfermedades relacionadas.
Hasta el momento, en más de 100 años de investigación ningún medicamento modificador
del curso de la enfermedad ha tenido éxito en la etapa III de ensayos clínicos controlados
en EA esporádica (Folch et al., 2015; Roberson & Mucke, 2006), a pesar de que una gran
cantidad han superado las etapas iniciales, siempre con promisorios resultados en modelos
animales (Folch et al., 2015). Esto posiblemente se debe a que el entendimiento basado
en modelos simplificados de lo que ocurre dentro de la instauración de la EA, debe ser
mejor entendido y enfrentado no de forma simple sino concibiendo que es un ciclo complejo
fisiopatogénico de múltiples vértices, que se retroalimenta constantemente a sí mismo y
que por tanto, debe ser atacado en forma simultánea en múltiples puntos críticos con el fin
de evitar que siga llevando a las personas a un estado devastador, sin que hasta ahora se
tenga disponible ningún tratamiento realmente efectivo para cambiar el curso de la EA
esporádica.
148
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
7 LIMITACIONES
Una limitación del presente trabajo es que no se pueden identificar los CpG en los cuales
la metilación de ADN encontrada, presenta o no un grupo hidroxilo unido al grupo metilo,
representando así, hidroximetilación. Esta es una limitación del estado del arte de las
técnicas disponibles. Se requerirá una implementación futura de tecnologías de
metilación e hidroximetilación genómicas a costos que permitan concebir trabajos que
puedan identificar la presencia de este tipo de modificaciones epigenéticas, para
estudios futuros con múltiples cerebros humanos (lo cual en el conocimiento del autor
de esta tesis, no se ha realizado en ningún otro trabajo). Tales implementaciones
técnicas, en un futuro traerán información valiosa en enfermedades neurodegenerativas
(Al-Mahdawi, Virmouni, & Pook, 2014).
Asimismo, al igual que los demás estudios publicados hasta el momento en EA, no fue
posible conseguir en el BioBanco NavarraBiomed y en otros bancos de tejidos
consultados, muestras de sangre de los mismos individuos de las muestras de cerebro.
En un proyecto que participó el autor del presente documento y presentado a
Colciencias se planea la construcción de un nuevo BioBanco en Colombia que tendrá,
si es financiado, muestras no solo de cerebros sino de diferentes tejidos del mismo
individuo, incluyéndose sangre periférica para que tal escenario sea posible en futuros
estudios.
Una limitación metodológica se basa en que la plataforma disponible más costo efectiva
para este tipo de estudios es actualmente Infinium DNA methylation 450K. Aunque esta
plataforma provee valiosa información de cada gen del genoma, en el futuro,
plataformas de secuenciación de metiloma completo proporcionarán información no solo
de cada gen, sino de cada uno de los CpG del genoma humano, lo que las hará más
informativas. Por otro lado, una fortaleza de este estudio fue que con un costo
relativamente bajo, logramos un poder adecuado en los hallazgos que reportamos, lo
cual puede explicarse en parte, en que los estudios recién publicados del epigenoma en
EA, que suponian un poder estadístico teóricamente mayor, no realizaron
microdisección láser, sino tomaron el tejido completo -sin enriquecimiento alguno de
células afectadas- de la región estudiada.
LIMITACIONES
149
La cuantificación exacta de los componentes celulares, puede ser útil para eliminar
matemáticamente cualquier posible ruido dado por alguna diferencia de distribución en
la población celular (Kozlenkov et al., 2014; Y. Liu et al., 2013). Dicha rigurosidad
adicional, que fue planeada por el doctorando, no ha sido utilizada en ningún estudio
previo de EA. De igual manera, se aclara que todas las microdisecciones fueron
visiblemente ricas en neuronas piramidales y libres de patología amiloidea local
considerable, lo cual fue posible gracias a que se escogió la corteza frontal para su
estudio y que esto provee a su vez, una fortaleza para su interpretación. Asimismo,
utilizando microscopía por fluorescencia el estudio de De Jager y colaboradores (De
Jager et al., 2014) no encontró diferencias en la distribución de la tinción NeuN, en las
muestras utilizadas, no microdisecadas. Con mayor razón, no se esperaría una
diferencia de distribución en nuestro estudio de muestras microdisecadas. Por
consiguiente, no se esperarían cambios importantes en los resultados, una vez se
puedan realizar las cuantificaciones de distribución celular neuronal versus no neuronal.
Igualmente, a la fecha los trámites gestionados para importaciones de muestras desde
España no han sido fructíferos afectando el traslado de placas de criocongelados de
cada muestra de corteza frontal utilizada en los microarreglos, los cuales estaban
destinados para la cuantificación de neuronas versus no neuronas, por microscopía
confocal en la Universidad Nacional de Colombia y aún no está prevista ninguna fecha
probable para su envío.
El tamaño de la muestra de este trabajo el cual, aunque adecuado para el área de
investigación de neurociencias humanas, en el que un tamaño de 10 cerebros humanos
por grupo es ampliamente aceptado (Humphries et al., 2015), podría verse como una
limitación para los neurocientíficos ajenos a realizar investigaciones en esta área.
Con relación al estudio de cerebros, las muestras solicitadas al neurobanco fueron de
intermedia a alta probabilidad en la clasificación NIA–Reagan, pero las muestras
finalmente entregadas por el neurobanco de cerebros NavarraBiomed en España fueron
de alta probabilidad y todas tienen una clasificación neuropatológica equivalente. Si se
hubiesen conseguido muestras con diferentes estadios, hubiese sido posible una
comparación y correlación con estadios intermedios. De igual forma, esto no es una
150
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
clara desventaja pues hasta ahora el centrar la investigación biomédica en una
disminución de agregados patológicos amiloideos en EA, no ha mostrado utilidad. Los
resultados de metilación de ADN en cerebros de este trabajo, corresponden a
microdisección láser de capas ricas en neuronas piramidales de corteza frontal, sin
incluir regiones donde es evidente la presencia de gliosis y agregados proteicos y
representan patrones de metilación en muestras de EA, que son homogéneos en su
estado clínico y patológico.
CONCLUSIONES
151
8 CONCLUSIONES
En conjunto, nuestros resultados en cerebros humanos dan soporte a regiones y
posiciones diferencialmente metiladas (todas diferencialmente hipermetiladas) en EA
en los genes BIN1, HOXA3, CXXC1/MBD1, CXXC2, MBP, CXXC3 y GSTP1 como
patrones de metilación en capas de neuronas piramidales de corteza frontal; dado el
alto soporte estadístico encontrado en los análisis regionales DMR, para estos genes
(y algunos otros), en adelante sería importante tener en cuenta los patrones de
metilación de ADN identificados, en el estudio de la instauración de la EA.
En capas de neuronas piramidales de la corteza frontal se encontraron diferencias de
metilación de ADN en regiones genómicas específicas, constituyendo patrones de
metilación relacionados con módulos funcionales, tales como el estrés oxidativo,
prolongaciones sinápticas y diferenciación neuronal, constantemente asociados con la
fisiopatología de la EA esporádica, dando a estos una perspectiva de modulación
epigenética.
Las relaciones mencionadas en el punto anterior no se deben a discrepancias de
género entre grupos, pues se encontraron también para un análisis solo con el
subconjunto hombres y además se conservó después de un análisis de intersección
entre el análisis con todos los sujetos y el análisis del subconjunto de hombres.
El presente estudio permite concebir un vínculo de los patrones de metilación de ADN
en capas de neuronas piramidales corticales, con la regulación epigenética en genes
relacionados con la disfunción sináptica en la EA (Ej: BIN1). Asimismo, de forma
novedosa, se establece una relación de los mencionados patrones, con CXXC1-3, tres
genes centrales en la regulación de la metilación de ADN, aportando nuevo
conocimiento del cuadro de la epigenética en la EA.
Los resultados encontrados en el presente estudio permiten proponer de forma
hipotética que la metilación de ADN y los mecanismos de metilación de ADN en los que
se involucre CXXC1-3, pueden tener un papel en el proceso fisiopatológico de la EA,
interactuando con otros actores del problema, e interviniendo en genes que se
152
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
relacionan con la sinapsis, disrupción de las prolongaciones neuronales y estrés
oxidativo.
En la mayoría de los genes evaluados para expresión se observó considerable
concordancia entre los hallazgos de hipermetilación en regiones cercanas al sitio de
inicio de transcripción en capas de neuronas piramidales en EA y diferencias en niveles
de expresión detectados de neuronas piramidales en EA, lo cual sugiere que la
presente aproximación de microdisección láser es útil para estudiar en forma más
cercana el nivel epigenético neuronal en enfermedades neurodegenerativas. Nuestro
estudio beneficiado de microdisección láser, en conjunto con el análisis de metilación
regional aportado, logran el objetivo de tener un alto poder con mayor especificidad
respecto a lo publicado hasta hoy, sobre las neuronas blanco a ser afectadas por
neurodegeneración en EA esporádica y pretende constituir un aporte en los estudios
de metilación de ADN en EA a nivel del genoma.
A un costo relativamente bajo, nuestro estudio consiguió un poder suficiente para
detectar en forma clara patrones de metilación de ADN en EA, lo cual, se relaciona
posiblemente con el hecho que a diferencia de estudios que tomaron lisados tisulares
de corteza cerebral, el presente trabajo se esforzó considerablemente en situarse en
una subregión enriquecida en tipos celulares de susceptibilidad conocida en la EA la
cual logró proveer patrones epigenéticos claramente relacionables a la EA.
Encontramos una región genómica de 78 pares de bases diferencialmente
hipermetilada en EA, en concordacia total en cerebros y en sangre periférica que
corresponde al gen MBP. La metilación de ADN en dicho locus genómico (coordenadas
hg19: chr18:74799495-572) puede constituir un marcador epigenético de importancia
en la EA, evaluable en sangre periférica.
En sangre periférica, dentro de los genes con mayor soporte estadístico se halla un
grupo de genes relacionados con inflamación a nivel periférico y central, indicando que
los patrones epigenéticos encontrados en el presente estudio pueden proveer
marcadores útiles para evaluar la regulación epigenética del componente inflamatorio
CONCLUSIONES
153
sistémico, que se sabe se encuentra presente en la EA y podrían proveer marcadores
útiles relacionados con EA a ser evaluados en futuros estudios longitudinales.
El presente trabajo identificó patrones de metilación de ADN de EA en sangre periférica
principalmente en regiones correspondientes a los genes MTMR9 y MBP
(diferencialmente hipermetilados) y a los genes SOSTDC1, RBMXL2 y FIBIN,
(diferencialmente hipometilados), estos últimos sin función conocida en sangre
periférica.
En sangre periférica en el presente trabajo no se encontraron diferencias a nivel de
metilación global, ni en los microarreglos de metilación Infinium illumina DNA
methyation 450K (Capítulo 4), ni en el estudio de LINE-1 (Capítulo 5), lo que sugiere
que los patrones de metilación aquí reportados no son explicables por cambios
generales indiscriminados de la metilación de ADN en EA en el genoma humano
(Hernandez et al., 2014).
Se encontró hipometilación diferencial en la isla CpG de APOE, tanto por la técnica de
BSP, como por la técnica de MS-HRM, por lo cual puede ser un marcador de potencial
importancia en EA a ser evaluado en futuros estudios longitudinales.
En comparación con lo realizado hasta la fecha, el análisis del epigenoma humano en
EA en sangre periférica, realizado dentro del presente trabajo, permite tener resultados
con el mayor poder en la evaluación de patrones de metilación de ADN en EA.
En la formación del doctorando se logró un entrenamiento para el manejo de alta
producción de resultados y el manejo de las técnicas basadas en PCR, para el estudio
a nivel de locus único, aptitudes útiles para los requerimientos del área de investigación.
Como valor agregado, se realizaron aportes al código bioinformático del paquete
DMRcate para agregar un filtro haciendo más estrictos sus resultados. Igualmente, se
aportó un «script» que facilita el diseño de los «primers» de MS-HRM y dichos códigos
van a ser divulgados a los investigadores interesados mediante comunicación corta o
carta al editor en una revista del área.
154
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
9 RECOMENDACIONES
Se debe considerar para futuros estudios que en EAMF, los modelos animales son muy
útiles para mejorar el entendimiento a nivel molecular de las vías que se relacionan con la
enfermedad. Considerando el hecho que el modelo disponible triple transgénico tiene
mutaciones en los genes, PS1M146V, APPSwe, y tauP301L (Oddo et al., 2003), se destaca su
utilidad para el entendimiento de procesos patológicos de instauración en EAMF. Sin
embargo, considerando también que estos tres genes no se encuentran mutados en la
forma esporádica de EA, se considera menos adecuado para tratar de modelar el contexto
de la susceptibilidad epigenética relacionada con el proceso de la instauración de la EA no
mendeliana, que difiere claramente de la EAMF y aún más de los modelos murinos (en
cuanto a su genómica de base).
El campo del conocimiento de la EA esporádica, una enfermedad médica humana, de alto
costo y compleja, puede enriquecerse de investigaciones realizadas en muestras de
cerebros adecuadamente criopreservadas, que sean capaces de obtener información
directamente de la enfermedad, imposible de conseguir mediante el uso de modelos
animales, aun siendo conscientes que investigar la enfermedad en humanos, carece de las
claras ventajas, que provee el uso de modelos, las cuales son necesarias para abordar
determinadas preguntas de investigación.
155
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CONSIDERACIONES ÉTICAS
179
11 CONSIDERACIONES ÉTICAS
Se tuvieron en cuenta los lineamientos de la Resolución 008430 del 4 de octubre de 1993,
en la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la
investigación en salud ("Normas Científicas, técnicas y administrativas para la investigación
en salud: Resolución 8430," 1993). Además, en los países involucrados se siguieron las
pautas éticas internacionales CIOMS, para investigación biomédica en seres humanos
(Organización Mundial de la Salud - Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ci
encias Médicas, 2002).
Los estudios aquí realizados contaron con la aprobación del Comité de Ética de la Facultad
de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia en Colombia y en España fue
aprobada por el Comité Ético y Científico de Navarra.
Esta investigación se clasifica como una investigación sin riesgo, según la Resolución
008430 de 1993, en el Artículo 11 del Capítulo 1, porque se utilizaron muestras del
Biobanco de cerebros y de riesgo mínimo porque se utilizaron muestras de sangre
periférica tomadas por venopunción ("Normas Científicas, técnicas y administrativas para
la investigación en salud: Resolución 8430," 1993).
En todo momento se ocultaron las identidades de las personas donantes de las muestras,
siguiendo el principio ético de confidencialidad en las investigaciones en biomedicina y de
igual forma, se respetaron durante el proyecto los principios de veracidad, justicia y
beneficencia.
Los resultados del presente documento serán publicados en medios de calidad científica
internacionalmente reconocida y en varias ponencias de igual carácter, considerando los
derechos morales y patrimoniales correspondientes. Posibles derechos patrimoniales
estarán a nombre de la Universidad Nacional de Colombia y las entidades que
contribuyeron directamente en alguna parte específica del trabajo y comparten derecho en
específico sobre la respectiva contribución. Los derechos de autor de carácter moral del
presente trabajo, son inalienables, por tanto, le pertenecen al autor del presente trabajo y
a su dirección, al Doctor Humberto Arboleda.
180
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
12 ANEXOS
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
14
Sea
39.53
0.32
FDR
adj.p.val
6.7E-25
B
p.value
dir
45.88
1.4E-30
↑
1
cg18239511
2
cg23098789
GPR123
84435
10
Shore
12.88
0.17
5.7E-09
21.01
2.8E-14
↑
3
cg09852619
DOCK5
80005
8
Sea
11.22
0.15
4.7E-08
18.96
4.0E-13
↑
4
cg21134610
CXXC1
30827
18
Shore
10.87
0.10
9.0E-08
18.25
9.5E-13
↑
5
cg19718360
CD84
8832
1
Sea
9.90
0.06
8.9E-07
15.97
1.1E-11
↑
6
cg19498600
CCDC7
79741
10
Sea
9.48
0.10
1.5E-06
15.07
3.5E-11
↑
7
cg02630914
ZBTB46G
140685
20
Shelf
9.41
0.06
1.5E-06
14.85
4.2E-11
↑
8
cg00452039
PRKAG2
51422
7
Shore
9.47
0.07
1.5E-06
14.64
3.5E-11
↑
9
cg01498641
16
Shelf
9.03
0.07
3.1E-06
13.92
1.2E-10
↑
10
cg06709442
PRMT8
56341
12
Sea
8.94
0.08
3.6E-06
13.71
1.5E-10
↑
11
cg15255329
LAIR2
3904
19
Sea
8.84
0.15
5.3E-06
13.26
2.5E-10
↑
12
cg16206364
CPT1C
126129
19
Shore
8.71
0.12
5.8E-06
13.03
3.3E-10
↑
13
cg19983221
AMBRA1
55626
11
Sea
8.61
0.10
6.0E-06
12.88
3.7E-10
↑
14
cg08925882
GSTP1
2950
11
Shore
8.62
0.09
6.0E-06
12.87
3.7E-10
↑
15
cg20622410
JUP
3728
17
Sea
8.50
0.06
7.6E-06
12.64
5.1E-10
↑
16
cg07579107
WDR72
256764
15
Sea
8.48
0.11
7.7E-06
12.57
5.4E-10
↑
17
cg12785183
6
Sea
8.49
0.08
7.6E-06
12.55
5.2E-10
↑
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26034
ANEXOS
181
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
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182
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
70
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TEX29
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Shore
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100
cg01413281
CHUK
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10
Shore
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101
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102
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103
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Sea
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Shelf
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104
cg07569293
105
cg22493397
NINJ2
185
Chr
4815
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RNF169
143570,
254225
ANEXOS
183
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
106
cg00389785
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108
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Sea
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109
cg20255370
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110
cg23562675
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Sea
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111
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TSPAN19,
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Sea
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112
cg10617782
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113
cg03737475
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114
cg02937966
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Sea
-6.70
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↓
115
cg19966146
GLYATL3
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Sea
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116
cg02775223
DUXA
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19
Sea
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117
cg11599793
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Sea
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↑
118
cg14975015
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Sea
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1.4E-07
↑
119
cg08095359
12
Sea
6.61
0.08
1.6E-04
7.47
1.3E-07
↑
120
cg26337566
CEP170
9859
1
Sea
6.63
0.09
1.6E-04
7.46
1.4E-07
↑
121
cg22691257
GABRA6
2559
5
Sea
6.57
0.06
1.6E-04
7.43
1.4E-07
↑
122
cg14192188
9
Shore
6.59
0.09
1.6E-04
7.39
1.3E-07
↑
123
cg26346797
3
Shelf
6.69
0.12
1.8E-04
7.37
1.5E-07
↑
124
cg25941682
PDE8A
5151
15
Sea
6.54
0.08
1.8E-04
7.35
1.5E-07
↑
125
cg02177950
CLUAP1
23059
16
Shelf
6.54
0.07
1.8E-04
7.34
1.5E-07
↑
126
cg00573140
1
Shelf
6.56
0.06
1.7E-04
7.32
1.5E-07
↑
127
cg20864326
XRCC2
7516
7
Shore
6.55
0.08
1.8E-04
7.31
1.6E-07
↑
128
cg07803864
TUBAL3
79861
10
Sea
6.56
0.09
1.7E-04
7.26
1.4E-07
↑
129
cg26235990
2
Sea
6.51
0.07
1.9E-04
7.23
1.7E-07
↑
130
cg17405012
CHRM2
1129
7
Shore
-6.52
0.08
1.9E-04
7.22
1.7E-07
↓
131
cg22904711
KCNN4
3783
19
Island
6.53
0.11
1.9E-04
7.22
1.7E-07
↑
132
cg13636371
DFNB31
25861
9
Shelf
6.50
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7.22
1.7E-07
↑
133
cg16201598
DNAJC12
56521
10
Sea
6.57
0.13
1.9E-04
7.21
1.8E-07
↑
134
cg13781408
AATK
9625
17
Island
6.49
0.06
1.9E-04
7.20
1.8E-07
↑
135
cg23507031
C11orf63
79864
11
Sea
6.49
0.07
1.9E-04
7.20
1.8E-07
↑
136
cg03975271
TEX37
200523
2
Sea
6.49
0.06
1.9E-04
7.19
1.8E-07
↑
137
cg06881132
4
Sea
6.48
0.08
1.9E-04
7.18
1.8E-07
↑
138
cg13504410
DYNC1I2
1781
2
Shelf
6.52
0.11
1.9E-04
7.18
1.8E-07
↑
139
cg14805382
EXOC4
60412
7
Sea
6.48
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2.0E-04
7.16
1.9E-07
↑
140
cg22429852
KPNA2
3838
17
Shore
6.47
0.10
2.0E-04
7.16
1.9E-07
↑
141
cg13841627
TMC1
117531
9
Sea
6.47
0.07
2.0E-04
7.14
1.9E-07
↑
142
cg20689742
8
Shelf
6.47
0.07
2.0E-04
7.14
1.9E-07
↑
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
6
NUDT6, FGF2
ATP6V0A4
11162, 2247
50617
CGIn
Shelf
t
DBt
6.76
B
7.76
p.value
dir
184
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
143
cg16895672
PARD3
56288
10
Sea
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0.06
FDR
adj.p.val
2.0E-04
144
cg21434081
4
Shelf
6.46
0.07
145
cg20988440
MIR16-1,
DLEU2
406950, 8847
13
Sea
6.45
146
cg03911306
DAZL
1618
3
Shore
147
cg19905270
5
148
cg02693156
149
cg25631092
TBC1D5
150
cg20751057
151
B
p.value
dir
7.12
1.9E-07
↑
2.0E-04
7.11
2.0E-07
↑
0.09
2.0E-04
7.09
2.0E-07
↑
6.44
0.11
2.0E-04
7.06
2.0E-07
↑
Sea
6.43
0.08
2.1E-04
7.04
2.1E-07
↑
12
Sea
-6.46
0.08
2.1E-04
7.01
2.2E-07
↓
9779
3
Shore
6.41
0.07
2.2E-04
6.99
2.2E-07
↑
CEP63
80254
3
Sea
6.41
0.07
2.2E-04
6.98
2.3E-07
↑
cg00502469
RASA3
22821
13
Island
6.67
0.11
2.2E-04
6.96
2.4E-07
↑
152
cg01277072
ADARB2
105
10
Sea
6.40
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6.94
2.4E-07
↑
153
cg08967391
11
Sea
6.41
0.06
2.2E-04
6.94
2.3E-07
↑
5166
7
Shelf
6.38
0.08
2.3E-04
6.91
2.4E-07
↑
4651
5
Sea
6.48
0.12
2.3E-04
6.90
2.5E-07
↑
1
Sea
6.37
0.06
2.3E-04
6.88
2.5E-07
↑
154
cg03853620
PDK4
155
cg18061395
MYO10
156
cg26011615
157
cg03312984
SOAT1
6646
1
Sea
6.40
0.07
2.2E-04
6.86
2.3E-07
↑
158
cg08240466
ASIP
434
20
Sea
6.37
0.07
2.3E-04
6.86
2.6E-07
↑
159
cg02708185
2
Sea
6.37
0.07
2.3E-04
6.85
2.6E-07
↑
160
cg20889904
13
Sea
6.37
0.08
2.3E-04
6.85
2.6E-07
↑
161
cg20598808
1
Shore
6.37
0.09
2.3E-04
6.81
2.5E-07
↑
162
cg14795572
AGAP2
116986
12
Island
6.35
0.07
2.4E-04
6.79
2.7E-07
↑
163
cg08867707
KBTBD11
9920
8
Shore
6.35
0.09
2.4E-04
6.76
2.7E-07
↑
164
cg16056941
SH3BGRL2
83699
6
Sea
6.32
0.07
2.5E-04
6.73
3.0E-07
↑
165
cg25109396
14
Sea
6.31
0.06
2.5E-04
6.70
3.0E-07
↑
166
cg20385708
VIT
5212
2
Sea
6.32
0.06
2.5E-04
6.70
3.0E-07
↑
167
cg25235770
PPM1H
57460
12
Sea
6.31
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2.5E-04
6.70
3.0E-07
↑
168
cg00966078
EPHB2
2048
1
Sea
6.32
0.10
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6.69
3.1E-07
↑
169
cg14189571
ZFP42
132625
4
Shore
-6.30
0.06
2.5E-04
6.68
3.1E-07
↓
170
cg10001172
DNA2
1763
10
Shelf
6.31
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6.68
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↑
171
cg03406844
TNFAIP6
7130
2
Sea
6.31
0.07
2.5E-04
6.68
3.1E-07
↑
172
cg07187607
NDUFB4
4710
3
Shore
6.29
0.06
2.6E-04
6.65
3.2E-07
↑
173
cg01614839
15
Sea
6.32
0.06
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6.63
3.3E-07
↑
174
cg14286594
NAA15
80155
4
Sea
6.29
0.06
2.6E-04
6.63
3.3E-07
↑
175
cg22090150
ANKFY1
51479
17
Sea
6.31
0.07
2.5E-04
6.63
3.1E-07
↑
176
cg22507723
AGAP2
116986
12
Island
6.28
0.09
2.6E-04
6.62
3.3E-07
↑
177
cg07024439
4
Sea
6.28
0.09
2.6E-04
6.61
3.3E-07
↑
178
cg20295353
ZBTB1
22890
14
Sea
6.28
0.09
2.7E-04
6.60
3.4E-07
↑
179
cg01062020
SH2D1B
117157
1
Sea
6.28
0.06
2.7E-04
6.60
3.4E-07
↑
ANEXOS
185
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
180
cg09269090
NBEA
26960
13
Sea
6.33
0.08
FDR
adj.p.val
2.7E-04
181
cg00426855
NMU
10874
4
Sea
6.27
0.08
2.7E-04
182
cg08743303
CCDC149
91050
4
Sea
6.26
0.06
183
cg22730029
ELF1
1997
13
Sea
6.26
184
cg18708402
4
Sea
185
cg11724970
HOXA-AS3,
HOXA5
100133311,
3202
7
186
cg21053224
SNORD113-9
767569
187
cg00009523
SNTG2
54221
188
B
p.value
dir
6.59
3.4E-07
↑
6.59
3.4E-07
↑
2.7E-04
6.56
3.5E-07
↑
0.10
2.7E-04
6.53
3.7E-07
↑
6.25
0.09
2.7E-04
6.52
3.7E-07
↑
Shore
6.24
0.07
2.8E-04
6.51
3.7E-07
↑
14
Sea
6.31
0.10
2.8E-04
6.50
3.7E-07
↑
2
Shore
6.52
0.22
2.9E-04
6.47
4.0E-07
↑
cg27082426
7
Shelf
6.23
0.07
2.8E-04
6.47
3.9E-07
↑
189
cg13826058
6
Shelf
6.23
0.07
2.8E-04
6.47
3.9E-07
↑
190
cg15197050
10
Sea
6.22
0.07
2.9E-04
6.45
4.0E-07
↑
191
cg11993439
4
Sea
6.21
0.07
2.9E-04
6.42
4.1E-07
↑
192
cg07731871
CACNB2
783
10
Sea
6.21
0.06
2.9E-04
6.40
4.2E-07
↑
193
cg07186765
GARS,
LOC401320
2617, 767610
7
Shore
-6.28
0.07
3.0E-04
6.38
4.4E-07
↓
194
cg00304785
7
Shore
6.35
0.12
3.0E-04
6.37
4.5E-07
↑
195
cg19817215
7
Shelf
6.19
0.06
3.0E-04
6.34
4.4E-07
↑
196
cg25407540
C9
735
5
Sea
6.22
0.07
2.9E-04
6.34
4.0E-07
↑
197
cg21784716
KLHL1,
ATXN8OS
57626, 6315
13
Shore
6.18
0.08
3.0E-04
6.33
4.5E-07
↑
198
cg26349484
SORCS3
22986
10
Sea
6.18
0.07
3.0E-04
6.33
4.5E-07
↑
199
cg09930167
12
Sea
6.18
0.06
3.1E-04
6.32
4.6E-07
o
k
↑
200
cg21489565
5
Shore
6.19
0.09
3.1E-04
6.31
4.6E-07
↑
201
cg10388017
ITLN1
55600
1
Sea
6.19
0.07
3.0E-04
6.31
4.3E-07
↑
202
cg14820213
MBOAT2
129642
2
Sea
6.17
0.06
3.1E-04
6.29
4.7E-07
↑
203
cg03886558
ARHGAP9
64333
12
Island
6.20
0.07
3.0E-04
6.28
4.5E-07
↑
204
cg27367066
15
Shelf
6.16
0.06
3.1E-04
6.28
4.8E-07
↑
205
cg01303420
PQLC2L
152078
3
Sea
6.17
0.10
3.1E-04
6.27
4.8E-07
↑
206
cg21945989
CSN2
1447
4
Sea
6.24
0.11
3.2E-04
6.26
5.0E-07
↑
207
cg26831184
ZNF124
7678
1
Sea
6.24
0.11
3.3E-04
6.24
5.1E-07
↑
208
cg14489199
SNORD114-26,
SNORD114-27
767606,
767608
14
Sea
6.14
0.08
3.3E-04
6.21
5.1E-07
↑
209
cg05904806
14
Shelf
6.14
0.07
3.3E-04
6.21
5.2E-07
↑
210
cg13224855
TXNDC16
57544
14
Sea
6.14
0.06
3.3E-04
6.20
5.0E-07
↑
211
cg17203119
HIPK3
10114
11
Shelf
6.27
0.12
3.4E-04
6.19
5.4E-07
↑
212
cg08788712
MSI2
124540
17
Sea
6.13
0.07
3.3E-04
6.19
5.2E-07
↑
213
cg24893035
TRIM5
85363
11
Sea
6.21
0.10
3.4E-04
6.17
5.5E-07
↑
186
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
214
cg03709925
AATK
9625
17
Island
6.12
0.06
FDR
adj.p.val
3.4E-04
215
cg07683388
ANKRD44
91526
2
Island
6.12
0.08
216
cg06953454
CSH2
1443
17
Sea
6.11
217
cg06943561
SCGB2B2
284402
19
Sea
218
cg06852037
13
219
cg25749982
220
cg17187439
221
cg24499688
CAPS2
84698
B
p.value
dir
6.17
5.4E-07
↑
3.4E-04
6.14
5.4E-07
↑
0.06
3.4E-04
6.13
5.6E-07
↑
6.11
0.06
3.4E-04
6.12
5.6E-07
↑
Shelf
6.11
0.06
3.4E-04
6.12
5.6E-07
↑
12
Shelf
6.21
0.11
3.4E-04
6.12
5.8E-07
↑
2
Sea
6.13
0.09
3.4E-04
6.11
5.7E-07
↑
7
Sea
6.12
0.09
3.4E-04
6.11
5.7E-07
↑
cg22686716
TRIM33
51592
1
Sea
6.25
0.12
3.4E-04
6.11
5.9E-07
↑
223
cg20597409
SLC25A21-AS1,
SLC25A21
100129794,
89874
14
Shore
6.10
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3.4E-04
6.09
5.7E-07
↑
224
cg25035332
PCDH15
65217
10
Sea
6.19
0.11
3.4E-04
6.09
5.9E-07
↑
225
cg21785710
WDPCP
51057
2
Sea
6.09
0.08
3.5E-04
6.07
6.0E-07
↑
226
cg02388795
P1L1
4673
12
Shelf
-6.09
0.08
3.5E-04
6.07
6.0E-07
↓
227
cg17606558
MAS1L
116511
6
Sea
6.10
0.09
3.5E-04
6.06
6.0E-07
↑
228
cg16852357
LOC100505549,
ATP8B1
100505549,
5205
18
Sea
6.09
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3.5E-04
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6.0E-07
↑
229
cg08486903
SMURF1
57154
7
Shore
6.11
0.06
3.4E-04
6.04
5.6E-07
↑
230
cg03014882
ARRDC2
27106
19
Island
6.07
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3.5E-04
6.03
6.2E-07
↑
231
cg04058837
3
Sea
6.08
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3.5E-04
6.03
6.2E-07
↑
232
cg10803816
5
Shelf
6.10
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3.4E-04
6.02
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↑
233
cg09897656
SLC26A7
115111
8
Sea
6.08
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6.2E-07
↑
234
cg22613769
SMYD2
56950
1
Sea
6.07
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3.5E-04
6.02
6.3E-07
↑
235
cg06546787
DEFB112
245915
6
Sea
6.07
0.07
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6.02
6.3E-07
↑
236
cg15192146
5
Sea
6.07
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6.4E-07
↑
237
cg20134271
8
Sea
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6.4E-07
↑
238
cg25473910
7
Sea
6.08
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↑
239
cg10106639
2
Sea
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↑
240
cg02456218
BTNL9
153579
5
Shelf
6.05
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5.95
6.8E-07
↑
241
cg23847843
ZSCAN23
222696
6
Sea
6.05
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↑
242
cg18862260
MSTN
2660
2
Sea
6.04
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6.8E-07
↑
243
cg25310205
5
Sea
6.05
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5.94
6.7E-07
↑
244
cg25878131
ELF1
1997
13
Sea
6.04
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6.9E-07
↑
245
cg17631424
TMPRSS11E
28983
4
Sea
6.04
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7.0E-07
↑
246
cg14096042
9
Shelf
6.03
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5.90
7.2E-07
↑
247
cg27038198
KIAA1324L
222223
7
Shelf
6.00
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7.7E-07
↑
248
cg20585916
CFAP97
57587
4
Sea
6.10
0.11
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5.82
8.0E-07
↑
249
cg16150863
MAS1L
116511
6
Sea
6.14
0.12
4.1E-04
5.80
8.2E-07
↑
222
RNF139
11236
ANEXOS
187
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
FDR
adj.p.val
B
p.value
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AGAP2
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12
Island
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7.9E-07
↑
251
cg08663653
MROH9
80133
1
Sea
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4.0E-04
5.79
8.1E-07
↑
252
cg26345971
TSPAN19,
LRRIQ1
144448,
84125
12
Sea
-6.15
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4.1E-04
5.78
8.4E-07
↓
253
cg27462988
DCLRE1A
9937
10
Sea
6.14
0.12
4.2E-04
5.77
8.5E-07
↑
254
cg05082550
4
Sea
5.98
0.07
4.1E-04
5.77
8.2E-07
↑
255
cg19753914
GULP1
51454
2
Sea
5.98
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5.76
8.2E-07
↑
256
cg26166177
FN1
2335
2
Sea
5.98
0.06
4.1E-04
5.76
8.3E-07
↑
257
cg06038342
RASA3
22821
13
Shelf
5.97
0.06
4.2E-04
5.74
8.5E-07
↑
258
cg19317807
RABGAP1L
9910
1
Sea
5.99
0.08
4.2E-04
5.74
8.5E-07
↑
259
cg27528091
6
Sea
-5.97
0.07
4.2E-04
5.73
8.6E-07
↓
260
cg01201151
2
Shelf
5.97
0.08
4.2E-04
5.72
8.6E-07
↑
261
cg07522918
6
Shelf
5.96
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4.2E-04
5.71
8.8E-07
↑
262
cg13076843
RHBDF2
79651
17
Island
5.96
0.07
4.2E-04
5.71
8.7E-07
↑
263
cg12371147
PCSK6
5046
15
Sea
5.96
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4.2E-04
5.70
8.9E-07
↑
264
cg26684050
STAU2
27067
8
Sea
5.95
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5.68
9.0E-07
↑
265
cg23803709
10
Sea
5.95
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9.2E-07
↑
266
cg08147094
6
Shore
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↑
267
cg12098665
8
Shelf
5.95
0.06
4.3E-04
5.66
9.2E-07
↑
268
cg11117438
7
Sea
5.94
0.07
4.3E-04
5.66
9.2E-07
↑
269
cg13289431
VTA1
51534
6
Shelf
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9.2E-07
↑
270
cg22217533
RNF212
285498
4
Shore
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5.64
9.5E-07
↑
271
cg27413643
RGS9BP,
ANKRD27
388531,
84125
19
Island
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9.5E-07
↑
272
cg19139092
FRMD4B
23150
3
Shelf
5.94
0.07
4.4E-04
5.62
9.5E-07
↑
273
cg07584855
HLX
3142
1
Island
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4.5E-04
5.62
9.7E-07
↑
274
cg10261226
LOC100133315
100133315
11
Sea
5.92
0.07
4.6E-04
5.58
1.0E-06
↑
275
cg10393086
SYT14
255928
1
Sea
5.93
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5.56
9.5E-07
↑
276
cg04342881
TMEM165
55858
4
Sea
5.93
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4.7E-04
5.55
1.0E-06
↑
277
cg14153356
6
Sea
5.91
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4.6E-04
5.54
1.0E-06
↑
278
cg14552441
RAD51AP1
10635
12
Shelf
5.90
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5.52
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↑
279
cg16529799
MCTP1
79772
5
Sea
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5.51
9.9E-07
↑
280
cg23610447
6
Sea
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1.1E-06
↑
281
cg20429763
7
Shelf
5.89
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4.7E-04
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1.1E-06
↑
282
cg03488113
22
Shore
5.89
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4.8E-04
5.50
1.1E-06
↑
283
cg20964082
ERO1LB
56605
1
Shelf
5.88
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4.8E-04
5.48
1.1E-06
↑
284
cg13237740
OR10A6
390093
11
Sea
6.09
0.18
4.9E-04
5.48
1.2E-06
↑
285
cg22353755
19
Shelf
5.88
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4.8E-04
5.47
1.1E-06
↑
MARS2
HLA-DOA
LOC100289561,
LOC100630923
92935
3111
100289561,
100630923
188
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
286
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12
Shore
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FDR
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287
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2
Sea
5.87
0.07
288
cg17965690
19
Island
5.87
289
cg05475575
15
Sea
290
cg17376299
17
291
cg01961025
292
cg14766448
293
cg23484515
SLC44A2
MGAT5B
BOLL
57153
146664
66037
B
p.value
dir
5.47
1.2E-06
↓
4.9E-04
5.45
1.2E-06
↑
0.09
4.9E-04
5.44
1.2E-06
↑
5.89
0.06
4.7E-04
5.43
1.1E-06
↑
Shelf
5.92
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1.2E-06
↑
12
Shelf
5.86
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1.2E-06
↑
3
Shelf
6.00
0.13
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1.2E-06
↑
5
Shelf
5.87
0.07
5.0E-04
5.41
1.2E-06
↑
2
Sea
5.85
0.08
5.0E-04
5.41
1.2E-06
↑
5
Sea
5.92
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5.40
1.2E-06
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294
cg18267436
295
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296
cg05736633
ZNF365
22891
10
Shelf
5.93
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↑
297
cg15171154
TGFBR2
7048
3
Sea
5.84
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298
cg00010672
2
Shelf
5.84
0.07
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299
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RFX6
222546
6
Shelf
5.83
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1.3E-06
↑
300
cg13225511
TMED5
50999
1
Shelf
5.88
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5.2E-04
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↑
301
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CLEC4C
170482
12
Sea
5.98
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5.33
1.4E-06
↑
302
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GSTA2
2939
6
Sea
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1.3E-06
↑
303
cg12557278
6
Sea
5.95
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5.32
1.4E-06
↑
304
cg01539849
SPI1,
SLC39A13
6688, 91252
11
Island
5.82
0.06
5.3E-04
5.31
1.4E-06
↑
305
cg22539390
TGDS
23483
13
Sea
5.86
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5.30
1.3E-06
↑
306
cg23295985
5
Sea
5.83
0.07
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5.30
1.3E-06
↑
307
cg16357382
18
Shore
5.81
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5.4E-04
5.29
1.4E-06
↑
308
cg06140138
7
Sea
5.81
0.07
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5.27
1.4E-06
↑
309
cg09999096
SMEK1
55671
14
Shelf
5.81
0.07
5.5E-04
5.27
1.4E-06
↑
310
cg10623213
TMF1
7110
3
Sea
5.80
0.07
5.5E-04
5.26
1.4E-06
↑
311
cg00705894
ZNF83
55769
19
Shelf
5.80
0.07
5.5E-04
5.25
1.4E-06
↑
312
cg01244520
10
Sea
5.80
0.06
5.6E-04
5.24
1.4E-06
↑
313
cg06276978
7
Sea
5.80
0.07
5.6E-04
5.24
1.4E-06
↑
314
cg12788923
SOX2-OT
347689
3
Sea
5.79
0.08
5.6E-04
5.22
1.5E-06
↑
315
cg11062420
ZNF107
51427
7
Shore
5.80
0.07
5.5E-04
5.22
1.4E-06
↑
316
cg09181738
C21orf91
54149
21
Shelf
5.79
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1.5E-06
↑
317
cg09883573
NDUFV3
4731
21
Shore
5.79
0.09
5.7E-04
5.21
1.5E-06
↑
318
cg19538917
FAM153C
653316
5
Shelf
5.80
0.11
5.6E-04
5.21
1.5E-06
↑
319
cg08616654
MIR548AA2,
MIR548D2
100500895,
693131
16
Sea
5.78
0.07
5.7E-04
5.19
1.5E-06
↑
320
cg12798311
13
Shelf
5.77
0.06
5.8E-04
5.17
1.6E-06
↑
321
cg22166900
6
Sea
5.77
0.09
5.8E-04
5.15
1.6E-06
↑
ANEXOS
189
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
322
cg10306963
16
Sea
5.76
0.07
FDR
adj.p.val
5.8E-04
5.15
1.6E-06
↑
323
cg20003635
CAPS2
84698
12
Sea
5.86
0.10
5.9E-04
5.14
1.6E-06
↑
324
cg16023991
TSC22D1
8848
13
Sea
5.80
0.10
5.9E-04
5.14
1.6E-06
↑
325
cg24129820
LRFN5
145581
14
Sea
5.86
0.11
5.8E-04
5.14
1.6E-06
↑
326
cg14284630
OR5T3
390154
11
Sea
5.76
0.09
5.9E-04
5.13
1.6E-06
↑
327
cg20997268
CREB5
9586
7
Sea
5.76
0.08
5.9E-04
5.13
1.6E-06
↑
328
cg03112777
7
Shelf
5.87
0.14
6.1E-04
5.12
1.7E-06
↑
329
cg11750851
CYR61
3491
1
Shore
5.75
0.06
6.0E-04
5.10
1.7E-06
↑
330
cg25349066
LY75-CD302,
CD302
100526664,
84125
2
Shelf
5.83
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5.10
1.7E-06
↑
331
cg18430465
TRPS1
7227
8
Sea
5.74
0.08
6.0E-04
5.09
1.7E-06
↑
332
cg00415389
TRIM24
8805
7
Sea
5.74
0.08
6.1E-04
5.08
1.7E-06
↑
333
cg18336878
SULT1E1
6783
4
Sea
5.77
0.08
6.1E-04
5.08
1.7E-06
↑
334
cg10625488
ICA1L
130026
2
Shelf
5.73
0.08
6.1E-04
5.06
1.7E-06
↑
335
cg15874425
RTN1
6252
14
Shelf
5.73
0.07
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5.05
1.8E-06
↑
336
cg08553963
12
Shelf
5.73
0.06
6.2E-04
5.04
1.8E-06
↑
337
cg14927083
9
Island
5.72
0.06
6.2E-04
5.03
1.8E-06
↑
338
cg22585255
TMX2-CTNND1,
BTBD18
100528016,
1500, 643376
11
Shore
5.72
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6.2E-04
5.03
1.8E-06
↑
339
cg03843493
SEC24D
9871
4
Sea
5.72
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6.2E-04
5.02
1.8E-06
↑
340
cg11374977
ZNF800
168850
7
Sea
5.76
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5.02
1.8E-06
↑
341
cg00074313
MIR548N
100302152
2
Sea
5.74
0.08
6.3E-04
5.00
1.9E-06
k
↑
342
cg10521596
12
Sea
5.71
0.06
6.3E-04
4.99
1.9E-06
↑
343
cg09321965
NEK7
140609
1
Sea
5.79
0.08
6.4E-04
4.99
1.9E-06
↑
344
cg24330650
ACTR6
64431
12
Sea
5.70
0.06
6.4E-04
4.98
1.9E-06
↑
345
cg03424554
WWP2
11060
16
Sea
5.70
0.07
6.4E-04
4.97
1.9E-06
↑
346
cg25578728
CHD7
55636
8
Sea
5.70
0.07
6.4E-04
4.96
1.9E-06
↑
347
cg16189976
7
Sea
5.71
0.08
6.4E-04
4.96
1.9E-06
↑
348
cg27280279
FAM98A
25940
2
Shelf
5.70
0.09
6.5E-04
4.96
2.0E-06
↑
349
cg03138863
TAS2R10
50839
12
Sea
5.70
0.07
6.4E-04
4.96
1.9E-06
↑
350
cg10608636
5
Shelf
5.71
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6.5E-04
4.94
2.0E-06
↑
351
cg11793499
CFHR4
10877
1
Sea
5.71
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4.94
2.0E-06
↑
352
cg02961798
RLTPR
146206
16
Island
5.72
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6.7E-04
4.91
2.1E-06
↑
353
cg09888186
RGL1
23179
1
Sea
5.68
0.06
6.7E-04
4.90
2.1E-06
↑
354
cg10551809
13
Sea
5.68
0.07
6.7E-04
4.89
2.1E-06
↑
355
cg16698470
11
Sea
5.68
0.07
6.7E-04
4.89
2.1E-06
↑
356
cg10131808
8
Sea
5.68
0.07
6.7E-04
4.89
2.1E-06
↑
357
cg15463457
4
Sea
-5.70
0.08
6.8E-04
4.88
2.2E-06
↓
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
MMRN1
22915
Chr
CGIn
t
DBt
B
p.value
dir
190
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
FDR
adj.p.val
B
p.value
dir
358
cg09848114
TRIM10,
TRIM15
10107, 89870
6
Sea
5.67
0.07
6.8E-04
4.87
2.1E-06
↑
359
cg10131879
GLCCI1
113263
7
Shelf
5.67
0.07
6.8E-04
4.87
2.1E-06
↑
360
cg21913787
5
Sea
5.66
0.07
6.8E-04
4.87
2.2E-06
↑
361
cg05858008
14
Sea
5.67
0.09
6.8E-04
4.86
2.1E-06
↑
362
cg05969298
8
Sea
5.67
0.06
6.8E-04
4.85
2.2E-06
↑
363
cg04310180
1
Sea
5.66
0.06
6.8E-04
4.85
2.2E-06
↑
364
cg10284115
3
Sea
5.67
0.07
6.8E-04
4.85
2.1E-06
↑
365
cg15535683
7
Sea
5.65
0.07
6.9E-04
4.83
2.2E-06
↑
366
cg18894552
14
Sea
5.65
0.08
6.9E-04
4.83
2.2E-06
↑
367
cg08276752
11
Sea
5.72
0.10
7.0E-04
4.83
2.3E-06
↑
368
cg08094135
8
Sea
5.65
0.07
7.0E-04
4.82
2.3E-06
↑
FRMD6
ANKRD28
OR10A6
122786
23243
390093
369
cg18587683
WEE2-AS1
285962
7
Shelf
5.67
0.10
7.0E-04
4.82
2.3E-06
↑
370
cg10503359
TRPC1
7220
3
Sea
5.65
0.07
7.0E-04
4.82
2.3E-06
↑
371
cg22133826
RAPGEF6
51735
5
Sea
5.65
0.07
7.0E-04
4.81
2.3E-06
↑
372
cg12008613
MBD1
4152
18
Shelf
5.64
0.07
7.0E-04
4.80
2.3E-06
↑
373
cg23293256
USP6NL
9712
10
Sea
5.65
0.07
7.0E-04
4.78
2.3E-06
↑
374
cg23069120
SMAP1
60682
6
Sea
5.66
0.09
6.8E-04
4.77
2.2E-06
↑
375
cg11657665
AP1M2
10053
19
Island
5.63
0.06
7.1E-04
4.76
2.4E-06
↑
376
cg02011981
CTTN
2017
11
Shore
5.63
0.08
7.1E-04
4.76
2.4E-06
↑
377
cg26420444
MLLT10
8028
10
Sea
5.64
0.08
7.1E-04
4.76
2.4E-06
↑
378
cg14607894
CACNA2D1
781
7
Sea
5.69
0.10
7.2E-04
4.76
2.5E-06
↑
379
cg04194432
10
Island
5.85
0.25
7.4E-04
4.75
2.6E-06
↑
380
cg08485001
LOC400685
400685
19
Shelf
5.62
0.07
7.2E-04
4.75
2.4E-06
↑
381
cg06678567
HS3ST4
9951
16
Sea
5.62
0.06
7.2E-04
4.74
2.5E-06
↑
382
cg26728382
QKI
9444
6
Sea
5.62
0.08
7.2E-04
4.74
2.5E-06
↑
383
cg16404898
GABRA6
2559
5
Sea
5.64
0.08
7.2E-04
4.74
2.5E-06
↑
384
cg03871140
5
Shore
-5.77
0.17
7.4E-04
4.73
2.6E-06
↓
385
cg20695587
TMPRSS11F
389208
4
Sea
5.68
0.11
7.2E-04
4.73
2.5E-06
↑
386
cg22594071
PLSCR5
389158
3
Sea
5.62
0.07
7.2E-04
4.73
2.5E-06
↑
387
cg03451959
PROS1
5627
3
Sea
5.64
0.08
7.0E-04
4.71
2.3E-06
↑
388
cg25575520
MIER3
166968
5
Shelf
5.61
0.06
7.3E-04
4.71
2.5E-06
↑
389
cg21806242
ATG16L2
89849
11
Island
5.61
0.10
7.3E-04
4.71
2.5E-06
↑
390
cg16579136
3
Sea
5.61
0.08
7.4E-04
4.70
2.6E-06
↑
391
cg06948588
AK9
221264
6
Sea
5.63
0.08
7.4E-04
4.69
2.6E-06
↑
392
cg26421169
LOC643733
643733
11
Sea
5.72
0.13
7.6E-04
4.68
2.7E-06
↑
393
cg18199266
CLEC4F
165530
2
Sea
5.60
0.06
7.5E-04
4.67
2.7E-06
↑
ANEXOS
191
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
FDR
adj.p.val
B
p.value
dir
394
cg20756454
LRRC37BP1,
SH3GL1P2
147172, 6459
17
Sea
5.62
0.10
7.6E-04
4.66
2.7E-06
↑
395
cg10819274
14
Sea
5.61
0.08
7.6E-04
4.65
2.7E-06
↑
396
cg23722778
ENPP4
22875
6
Sea
5.59
0.09
7.6E-04
4.62
2.8E-06
↑
397
cg10046893
SNORD114-30
767611
14
Sea
5.58
0.09
7.6E-04
4.62
2.8E-06
↑
398
cg10000195
4
Sea
5.58
0.08
7.7E-04
4.62
2.8E-06
↑
399
cg11938672
6
Sea
5.58
0.08
7.6E-04
4.62
2.8E-06
↑
400
cg15841378
1
Sea
5.58
0.09
7.6E-04
4.61
2.8E-06
↑
401
cg15564000
TRIM33
51592
1
Sea
5.57
0.07
7.7E-04
4.61
2.8E-06
↑
402
cg19651291
LRFN5
145581
14
Sea
5.57
0.07
7.8E-04
4.60
2.9E-06
↑
403
cg16656078
ELL2
22936
5
Sea
5.56
0.07
7.9E-04
4.57
2.9E-06
↑
404
cg15223157
CHEK1
1111
11
Shelf
5.58
0.09
7.9E-04
4.57
3.0E-06
↑
405
cg15929135
PPAPDC1A
196051
10
Sea
5.60
0.08
7.9E-04
4.56
3.0E-06
↑
406
cg02403292
6586
5
Island
5.68
0.10
8.0E-04
4.56
3.1E-06
s
↑
407
cg17428185
RFPL4B
442247
6
Sea
5.56
0.07
7.9E-04
4.55
3.0E-06
↑
408
cg00789793
RASA2
5922
3
Sea
5.65
0.11
8.1E-04
4.55
3.1E-06
↑
409
cg10516012
TPSD1
23430
16
Shore
5.59
0.14
8.0E-04
4.54
3.1E-06
↑
410
cg02403031
5
Sea
5.56
0.09
8.0E-04
4.54
3.0E-06
↑
411
cg14010852
NPFFR2
10886
4
Sea
5.55
0.09
8.0E-04
4.53
3.1E-06
↑
412
cg15529551
MNAT1
4331
14
Sea
5.64
0.10
8.2E-04
4.52
3.2E-06
↑
413
cg12443030
1
Sea
5.59
0.10
8.1E-04
4.52
3.2E-06
↑
414
cg19640029
5
Sea
5.54
0.07
8.1E-04
4.51
3.1E-06
↑
415
cg16347917
SDCCAG8
10806
1
Sea
5.66
0.11
8.2E-04
4.51
3.3E-06
↑
416
cg19321615
CCDC90B
60492
11
Sea
5.54
0.07
8.1E-04
4.51
3.2E-06
↑
417
cg10495393
CREB1
1385
2
Sea
5.54
0.06
8.1E-04
4.50
3.2E-06
↑
418
cg23557755
7
Sea
5.54
0.06
8.2E-04
4.50
3.2E-06
↑
419
cg25454931
2
Shore
5.59
0.09
8.2E-04
4.49
3.3E-06
↑
420
cg18835078
5
Island
5.54
0.09
8.2E-04
4.49
3.2E-06
↑
421
cg27101153
11
Sea
5.53
0.06
8.2E-04
4.49
3.2E-06
↑
WDR27
SLIT3
PCDHGA1
253769
56114
422
cg19933320
ZNF107
51427
7
Shore
5.56
0.10
8.3E-04
4.48
3.3E-06
↑
423
cg00637826
DUSP16
80824
12
Sea
5.53
0.08
8.3E-04
4.47
3.3E-06
↑
424
cg14292424
NOL6
65083
9
Sea
5.54
0.08
8.3E-04
4.47
3.3E-06
↑
425
cg12601142
KDM5A
5927
12
Shelf
5.52
0.09
8.3E-04
4.46
3.3E-06
↑
426
cg14286546
LOC440173
440173
9
Sea
5.52
0.06
8.3E-04
4.46
3.3E-06
↑
427
cg19399100
UGT2A1
10941
4
Sea
5.56
0.10
8.3E-04
4.46
3.3E-06
↑
428
cg11640146
CDK13
8621
7
Sea
5.51
0.07
8.4E-04
4.44
3.4E-06
↑
429
cg16729794
MOBP
4336
3
Sea
5.51
0.07
8.4E-04
4.44
3.4E-06
↑
430
cg19679302
7
Shelf
5.61
0.09
8.6E-04
4.43
3.5E-06
↑
192
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
8
Shelf
5.63
0.14
FDR
adj.p.val
8.6E-04
B
p.value
dir
4.43
3.5E-06
↑
431
cg01515574
432
cg20080079
TSPAN19,
LRRIQ1
144448, 9173
12
Sea
-5.66
0.12
8.6E-04
4.43
3.6E-06
↓
433
cg06930513
ZMYM2
7750
13
Sea
5.52
0.07
8.4E-04
4.42
3.4E-06
↑
434
cg20201971
2
Shore
5.51
0.08
8.5E-04
4.42
3.4E-06
↑
435
cg26461710
10
Sea
5.56
0.11
8.5E-04
4.41
3.5E-06
↑
436
cg03892815
7
Sea
5.53
0.06
8.6E-04
4.41
3.5E-06
↑
437
cg22747501
7
Shore
5.50
0.06
8.6E-04
4.41
3.5E-06
↑
438
cg05528339
2
Shelf
5.50
0.06
8.6E-04
4.40
3.5E-06
↑
439
cg19119945
BOC
91653
3
Shore
5.51
0.10
8.6E-04
4.40
3.6E-06
↑
440
cg16445007
DNAH7
56171
2
Sea
5.53
0.06
8.6E-04
4.40
3.6E-06
↑
441
cg23687909
GCM1
8521
6
Sea
5.50
0.07
8.6E-04
4.39
3.6E-06
↑
442
cg05187247
SNORD114-28,
SNORD114-29
767609,
767610
14
Sea
5.56
0.09
8.7E-04
4.39
3.6E-06
↑
443
cg22606129
7
Sea
5.50
0.07
8.7E-04
4.38
3.6E-06
↑
KIF20B
CHN2, CPVL
9585
1124, 84125
cg19537932
OR6C68
403284
12
Sea
5.50
0.06
8.6E-04
4.38
3.6E-06
↑
445
cg00448395
POT1
25913
7
Shore
-5.55
0.12
8.8E-04
4.37
3.7E-06
↓
446
cg18111500
PRKCH
5583
14
Sea
5.49
0.07
8.8E-04
4.36
3.7E-06
↑
447
cg26600753
TRIM7
81786
5
Island
5.49
0.06
8.7E-04
4.36
3.7E-06
↑
448
cg06223080
2
Shelf
5.49
0.07
8.8E-04
4.36
3.7E-06
↑
449
cg13590966
MME
4311
3
Shelf
5.49
0.06
8.8E-04
4.36
3.7E-06
↑
450
cg20523891
ANKRD18DP
348840
3
Shelf
5.49
0.08
8.7E-04
4.36
3.6E-06
↑
451
cg16353568
MIS18A
54069
21
Sea
5.52
0.10
8.9E-04
4.35
3.8E-06
↑
452
cg07665923
C7orf50
84310
7
Shelf
5.52
0.09
8.9E-04
4.35
3.8E-06
↑
453
cg13079633
8
Shelf
5.55
0.09
8.9E-04
4.35
3.8E-06
↑
454
cg02645710
12
Sea
-5.64
0.16
9.1E-04
4.35
3.9E-06
↓
455
cg21045824
5
Sea
5.59
0.12
9.0E-04
4.35
3.9E-06
↑
456
cg00096806
17
Sea
5.60
0.12
9.0E-04
4.35
3.9E-06
↑
457
cg20176098
3
Sea
5.49
0.07
8.8E-04
4.34
3.7E-06
↑
458
cg08817693
TMEM263
90488
12
Shore
5.48
0.07
8.9E-04
4.34
3.8E-06
↑
459
cg15700487
GOLPH3L
55204
1
Sea
-5.48
0.06
8.9E-04
4.34
3.8E-06
↓
460
cg04998498
USP28
57646
11
Sea
5.48
0.06
8.9E-04
4.33
3.8E-06
↑
461
cg17948986
KCNRG, DLEU2
283518, 8847
13
Sea
5.47
0.07
9.0E-04
4.32
3.9E-06
↑
462
cg14639562
CENPP, ASPN
401541,
54829
9
Sea
5.48
0.07
9.0E-04
4.32
3.9E-06
↑
463
cg07056967
LRP5
4041
11
Shelf
5.52
0.07
9.1E-04
4.31
4.0E-06
↑
464
cg17970299
ZNF385A
25946
12
Island
5.47
0.08
9.1E-04
4.30
3.9E-06
↑
465
cg13827458
ERO1L
30001
14
Sea
5.53
0.09
9.2E-04
4.30
4.0E-06
↑
444
TSPAN19,
LRRIQ1
TANC2
144448,
91252
26115
ANEXOS
193
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
gene Id
Gene ID(s)
Chr
CGIn
t
DBt
466
cg16565890
RIMS1
22999
6
Sea
5.48
0.07
FDR
adj.p.val
9.1E-04
467
cg20993754
RTN4
57142
2
Sea
5.47
0.06
9.1E-04
468
cg15955772
CPA6
57094
8
Sea
5.47
0.07
469
cg19004538
KCMF1
56888
2
Sea
5.47
470
cg09318721
1
Sea
471
cg22606262
RGS9BP
388531
19
472
cg25030018
STATH
6779
473
cg26631437
TEX15
56154
474
cg17370319
475
cg22953731
476
cg11122170
477
cg06298244
KRT23
478
cg20469507
479
B
p.value
dir
4.30
4.0E-06
↑
4.30
3.9E-06
↑
9.1E-04
4.30
3.9E-06
↑
0.06
9.1E-04
4.30
4.0E-06
↑
5.46
0.08
9.1E-04
4.29
4.0E-06
↑
Shore
5.46
0.07
9.2E-04
4.27
4.1E-06
↑
4
Sea
5.47
0.08
9.1E-04
4.27
3.9E-06
↑
8
Sea
5.46
0.06
9.2E-04
4.27
4.0E-06
↑
2
Sea
5.46
0.07
9.2E-04
4.27
4.1E-06
↑
4
Sea
5.48
0.10
9.3E-04
4.27
4.1E-06
↑
14
Sea
5.50
0.08
9.4E-04
4.25
4.2E-06
↑
25984
17
Sea
5.45
0.08
9.4E-04
4.25
4.2E-06
↑
POLD3
10714
11
Sea
5.45
0.07
9.4E-04
4.24
4.2E-06
↑
cg07660664
CREB5
9586
7
Sea
5.45
0.06
9.4E-04
4.24
4.2E-06
↑
480
cg09933401
B3GNT6
192134
11
Sea
5.54
0.10
9.5E-04
4.24
4.3E-06
↑
481
cg24493120
FAM3B
54097
21
Shelf
5.44
0.06
9.4E-04
4.24
4.2E-06
↑
482
cg07568314
ARHGAP18
93663
6
Sea
5.53
0.10
9.6E-04
4.23
4.4E-06
↑
483
cg02945019
CD84
8832
1
Sea
5.45
0.09
9.5E-04
4.23
4.3E-06
↑
484
cg21749275
SEC24B
10427
4
Sea
5.44
0.06
9.5E-04
4.22
4.3E-06
↑
485
cg00166653
SLC8A1-AS1,
SLC8A1
100128590
6546
2
Sea
5.44
0.07
9.5E-04
4.22
4.3E-06
↑
486
cg06620541
GALNT13
114805
2
Sea
5.58
0.13
9.8E-04
4.21
4.6E-06
↑
487
cg11387073
DLG1-AS1,
DLG1
100507086,
1739
3
Shore
5.43
0.06
9.5E-04
4.21
4.4E-06
↑
488
cg00377591
TRAF6
7189
11
Shelf
5.43
0.06
9.7E-04
4.19
4.4E-06
↑
489
cg15773893
DOCK10
55619
2
Sea
5.42
0.07
9.8E-04
4.17
4.5E-06
↑
490
cg03087996
CCDC162P
221262
6
Shelf
5.52
0.09
9.9E-04
4.17
4.7E-06
↑
491
cg16454587
11
Sea
5.42
0.07
9.8E-04
4.17
4.5E-06
↑
492
cg15312323
17
Sea
5.50
0.09
9.9E-04
4.17
4.6E-06
↑
493
cg24954648
15
Shelf
5.43
0.07
9.8E-04
4.17
4.6E-06
↑
494
cg20939319
TEX15
56154
8
Sea
5.43
0.07
9.8E-04
4.17
4.6E-06
↑
495
cg05783384
TNS1
7145
2
Island
5.42
0.07
9.8E-04
4.16
4.5E-06
↑
496
cg06902828
8
Sea
5.42
0.07
9.9E-04
4.15
4.6E-06
↑
497
cg22450933
1
Shelf
5.47
0.12
1.0E-03
4.15
4.7E-06
↑
498
cg04475095
12
Sea
5.45
0.06
1.0E-03
4.15
4.7E-06
↑
499
cg04229820
1
Sea
5.41
0.06
9.9E-04
4.14
4.7E-06
↑
500
cg01130991
17
Shelf
5.41
0.06
9.9E-04
4.14
4.7E-06
↑
501
cg25764131
19
Sea
5.41
0.07
9.9E-04
4.14
4.7E-06
↑
502
cg09461792
7
Sea
5.42
0.08
1.0E-03
4.13
4.7E-06
↑
KLB
KRTAP4-4
RGS13
ZNF254
152831
84616
6003
9534
,
194
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 1. 504 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales identificadas para la totalidad
de la muestra de sujetos.
Probe ID
503
cg06777815
504
cg19022697
gene Id
TTC22
Gene ID(s)
55001
Chr
CGIn
t
DBt
8
Sea
5.41
0.06
FDR
adj.p.val
1.0E-03
1
Island
5.41
0.07
1.0E-03
B
p.value
dir
4.13
4.7E-06
↑
4.13
4.7E-06
↑
Abreviaturas. Sonda =código de la sonda de illumina. Valor.P.Adj=valor p ajustado FDR <0.001. CGIn= Anotación de
localización de la sonda en relación a las Islas CpG. Island=Isla CpG. Shore= Orilla CpG, localización a distancia < 2Kb
de una Isla CpG. Shelf= Plataforma insular, localización a una distancia > 2Kb y < a 4 Kb de una Isla CpG. O.Sea =
localización a una distancia > a 4kb de una Isla CpG. Otras convenciones y abreviaturas definidas en la sección
correspondiente (en la página X). La línea horizontal en la fila 113 indica un punto de corte con corrección de Bonferroni.
Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su rápida localización.
ANEXOS
195
Anexo 2. Resultados de clasificación funcional de genes diferencialmente hipermetilados en EA en
capas de neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID»,
resultados para toda la muestra.
Gene Group 1
Gene Symbol
ANKRD29
TANC2
KIDINS220
ANKRD44
ANKRD27
ANKRD28
ANKFY1
Gene Group 2
Gene Symbol
RNF169
RNF212
RFPL4B
TRIM7
ZNF365
TRIM10
SMYD2
TRIM15
ZCCHC4
RNF139
TRIM5
KCMF1
ZNF800
KCNRG
ZBTB46
ZBTB1
MLLT10
Gene Group 3
Gene Symbol
TBC1D5
USP6NL
RABGAP1L
SMAP1
ARHGAP18
Gene Group 4
Gene Symbol
SDCCAG8
SMEK1
CEP170
ACTR6
FRMD4B
CEP63
Gene Group 5
Gene Symbol
RASA2
RASA3
SMAP1
CHN2
AGAP2
Gene Group 6
Gene Symbol
CEP63
MAD1L1
DCLRE1A
KIF20B
SDCCAG8
SMEK1
CEP170
Gene Group 7.
Enrichment Score: 2.771787995954862
Gene name (Ankyrin repeat)
ankyrin repeat domain 29
tetratricopeptide repeat, ankyrin repeat and coiled-coil containing 2
kinase D-interacting substrate, 220kDa
ankyrin repeat domain 44
ankyrin repeat domain 27 (VPS9 domain)
ankyrin repeat domain 28
ankyrin repeat and FYVE domain containing 1
Enrichment Score: 1.6446613459568693
Gene name (regulation of transcription, DNA-dependent)
ring finger protein 169
ring finger protein 212
ret finger protein-like 4B
tripartite motif-containing 7
zinc finger protein 365
tripartite motif-containing 10
SET and MYND domain containing 2
tripartite motif-containing 15
zinc finger, CCHC domain containing 4
ring finger protein 139
tripartite motif-containing 5
potassium channel modulatory factor 1
zinc finger protein 800
potassium channel regulator
zinc finger and BTB domain containing 46
zinc finger and BTB domain containing 1
myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax homolog, Drosophila);
translocated to, 10
Enrichment Score: 1.4024213430972001
Gene name (GTPase activator activity)
TBC1 domain family, member 5
USP6 N-terminal like
RAB GTPase activating protein 1-like
small ArfGAP 1
Rho GTPase activating protein 18
Enrichment Score: 1.2476607317500406
Gene name (microtubule /cytoskeleton)
serologically defined colon cancer antigen 8
SMEK homolog 1, suppressor of mek1 (Dictyostelium)
centrosomal protein 170kDa
ARP6 actin-related protein 6 homolog (yeast)
FERM domain containing 4B
centrosomal protein 63kDa
Enrichment Score: 1.244702592694447
Gene name (nucleoside-triphosphatase regulator activity)
RAS p21 protein activator 2
RAS p21 protein activator 3
small ArfGAP 1
chimerin (chimaerin) 2
ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 2
Enrichment Score: 0.83125080087242
Gene name (Cell division / M phase cellcycle)
centrosomal protein 63kDa
MAD1 mitotic arrest deficient-like 1 (yeast)
DNA cross-link repair 1A (PSO2 homolog, S. cerevisiae)
kinesin family member 20B
serologically defined colon cancer antigen 8
SMEK homolog 1, suppressor of mek1 (Dictyostelium)
centrosomal protein 170kDa
Enrichment Score: 0.68119353879199
Gene Symbol
Gene name (regulation of transcription, DNA-dependent , BP)
ZSCAN23
ZNF800
ZNF124
zinc finger and SCAN domain containing 23
zinc finger protein 800
196
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ZBTB1
ZNF83
ZNF506
ZNF385A
ZBTB46
ZNF404
CREB5
CXXC1
GCM1
ZNF254
ZNF107
MLLT10
RNF169
ZNF365
DUX1
TRPS1
KCNQ1
ZMYM2
RNF212
SMYD2
TSC22D1
NFIA
TMF1
ZCCHC4
MBD1
RFPL4B
RFX6
MIER3
Gene Group 8
Gene Symbo
WDR72
WDR20
WDR27
ATG16L2
DYNC1I2
AMBRA1
NBEA
Gene Group 9
Gene Symbol
RNASE9
DEFB112
TXNDC16
LAIR2
CST8
VIT
CFHR4
CSH2
FAM3B
KIAA1324L
TPSD1
SEMA3E
TNFAIP6
Gene Group 10
Gene Symbol
TUBA3D
TUBAL3
KIF6
ARL13B
zinc finger and BTB domain containing 1
zinc finger protein 83
zinc finger protein 506
zinc finger protein 385A
zinc finger and BTB domain containing 46
zinc finger protein 404
cAMP responsive element binding protein 5
CXXC finger 1 (PHD domain)
glial cells missing homolog 1 (Drosophila)
zinc finger protein 254
zinc finger protein 107
myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia (trithorax,homolog drosophila);
translocated to, 10
ring finger protein 169
zinc finger protein 365
double homeobox A
trichorhinophalangeal syndrome I
potassium channel modulatory factor 1
zinc finger, MYM-type 2
ring finger protein 212
SET and MYND domain containing 2
TSC22 domain family, member 1
nuclear factor I/A
TATA element modulatory factor 1
zinc finger, CCHC domain containing 4
methyl-CpG binding domain protein 1
ret finger protein-like 4B
regulatory factor X, 6
mesoderm induction early response 1, family member 3
Enrichment Score: 0.6215648153417765
Gene name (autophagy / WD motives)
WD repeat domain 72
WD repeat domain 20
WD repeat domain 27
ATG16 autophagy related 16-like 2 (S. cerevisiae)
similar to dynein cytoplasmic 1 intermediate chain 2; dynein, cytoplasmic 1,
intermediate chain 2
autophagy/beclin-1 regulator 1
Neurobeachin
Enrichment Score: 0.5606649668841733
Gene name (extracellular region)
ribonuclease, RNase A family, 9 (non-active)
defensin, beta 112
thioredoxin domain containing 16
leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 2
cystatin 8 (cystatin-related epididymal specific)
Vitrin
complement factor H-related 4
chorionic somatomammotropin hormone 2
family with sequence similarity 3, member B
KIAA1324-like
tryptase delta 1
sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted,semaphorin
3E
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 6
Enrichment Score: 0. 5439859386904867
Gene name (microtubule)
tubulin, alpha 3d; tubulin, alpha 3c
tubulin, alpha-like 3
kinesin family member 6
ADP-ribosylation factor-like 13B
Abreviaturas. Gene Group: Agrupaciones génicas que tienen términos funcionales similares
ordenadas de acuerdo a su puntuación de enriquecimiento. Enrichment Score: puntuación de
enriquecimiento génico del grupo. Gene Symbol: símbolo único de la base de genes de NCBI. Gene
Name: nombre del gen de la base de genes de NCBI. Se subrayan genes mencionados en el texto
para facilitar su rápida localización. En paréntesis se colocan algunos de los términos relacionados
de forma descriptiva que no son parte del resultado como tal del corrido de «gen functional
classification / DAVID».
ANEXOS
197
Anexo 3. Ontologías relacionadas con procesos biológicos del análisis de genes diferencialmente hipermetilados
en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas para la totalidad de la muestra.
Funt. Term
Term Term
size L size G
List List
pos neg
List
%
G
pos
G
%
activation of protein kinase
activity(GO:0032147)
57
59
4
346
1.14
53
0.03
anatomical structure
regression(GO:0060033)
5
5
2
348
0.57
3
atrioventricular valve
morphogenesis(GO:0003181)
7
9
2
348
0.57
auditory receptor cell
morphogenesis(GO:0002093)
5
5
2
348
auditory receptor cell stereocilium
organization(GO:0060088)
10
10
2
calcium ion
transport(GO:0006816)
222
232
cell-substrate junction
assembly(GO:0007044)
10
cellular response to
starvation(GO:0009267)
List pos IDs
odds
adj
ratio p-value
pvalue
log
DLG1,TRAF6,TGFBR2,ITGB3
3.8 2.99E-6 4.30E-3
0
SPI1,LRP5
5.9 2.86E-5 1.09E-2
5
0
JUP,CYR61
5.4 5.99E-5 1.38E-2
0.57
3
0
WDPCP,SEC24B
5.9 2.86E-5 1.09E-2
348
0.57
8
0
PCDH15,SEC24B
5.0 1.28E-4 1.99E-2
5
345
1.43
217
0.11
KCNN4,CSN2,CACNA2D1,TRPC
1,SLC8A1
2.6 4.34E-5 1.32E-2
11
3
347
0.86
7
0
FN1,ITGB3,TNS1
5.5 5.76E-7 1.10E-3
55
55
3
347
0.86
52
0.03
EIF2AK4,PDK4,CAPS2
3.5 1.19E-4 1.90E-2
regulation of
DNA methylation(GO:0044030)
7
8
2
348
0.57
5
0
MIS18A,H1FOO
5.4 5.99E-5 1.38E-2
positive regulation of sequencespecific DNA binding
transcription factor activity
(GO:0051091)
227
244
5
345
1.43
222
0.11
TRAF6,JUP,TRIM15,LRP5,TRIM5 2.6 4.82E-5 1.33E-2
regulation of Double-strand
break repair via homologous
recombination(GO:0010569)
34
40
3
347
0.86
31
0.02
RAD51AP1,CHEK1,TEX15
4.0 2.78E-5 1.09E-2
establishment of epithelial cell
polarity(GO:0090162)
9
17
2
348
0.57
7
0
FRMD4B,PARD3
5.1 1.02E-4 1.79E-2
394
409
6
344
1.71
388
0.19
8
2
348
0.57
6
0
G2/M transition of mitotic cell
cycle(GO:0000086)
gastric acid
secretion(GO:0001696)
8
SDCCAG8,CEP63,DYNC1I2,MNA
2.2 6.57E-5 1.45E-2
T1,CHEK1, HSP90AA1
SLC26A7,NMU
5.2 7.98E-5 1.53E-2
in utero embryonic
development(GO:0001701)
304
306
6
344
1.71
298
0.14
XRCC2,KIDINS220,CHD7,TANC2
2.4 1.56E-5 1.09E-2
,TGFBR2,SEC24D
lactation(GO:0007595)
102
102
4
346
1.14
98
0.05
CHUK,CSN2,CREB1,CCND1
3.1 3.03E-5 1.09E-2
locomotory
behavior(GO:0007626)
115
115
4
346
1.14
111
0.05
KLHL1,PCDH15,CHD7,ZNF385A
3.0 4.85E-5 1.33E-2
mammary gland alveolus
development(GO:0060749)
30
30
4
346
1.14
26
0.01
HOXA5,CHUK,CCND1,AGAP2
4.5 2.15E-7 1.10E-3
meiotic nuclear
division(GO:0007126)
46
49
3
347
0.86
43
0.02
XRCC2,MKI67,BOLL
3.7 6.96E-5 1.46E-2
myeloid dendritic cell
differentiation(GO:0043011)
29
30
3
347
0.86
26
0.01
TRAF6,SPI1,TGFBR2
4.2 1.71E-5 1.09E-2
organ
morphogenesis(GO:0009887)
260
260
5
345
1.43
255
0.12
TRAF6,FGF2,EPHB2,TGFBR2,SL
2.4 9.13E-5 1.64E-2
IT3
oxygen transport(GO:0015671)
30
36
3
347
0.86
27
0.01
IPCEF1,HBG2,HBE1
4.1 1.90E-5 1.09E-2
palate development(GO:0060021)
121
126
4
346
1.14
117
0.06
CHD7,EPHB2,TGFBR2,WDPCP
3.0 5.91E-5 1.38E-2
198
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
positive regulation of mammary
gland epithelial cell proliferation
(GO:0033601)
5
positive regulation of protein
phosphorylation(GO:0001934)
5
2
348
0.57
3
0
CCND1,AGAP2
5.9 2.86E-5 1.09E-2
271
271
5
345
1.43
266
0.13
CCND1,FGF2,ITLN1,ITGB3,CYR
61
2.4 1.11E-4 1.85E-2
positive regulation of smooth
muscle cell
proliferation(GO:0048661)
87
87
4
346
1.14
83
0.04
TRAF6,FGF2,TGFBR2,MNAT1
3.3 1.62E-5 1.09E-2
regulation of actin filament-based
process(GO:0032970)
5
5
2
348
0.57
3
0
FRMD6,PARD3
5.9 2.86E-5 1.09E-2
3.0 4.37E-5 1.32E-2
response to organic
substance(GO:0010033)
112
114
4
346
1.14
108
0.05
CHUK,CREB1,CCND1,TGFBR2
processing and presentation of
exogenous peptide antigen via
MHC class II(GO:0019886)
292
308
6
344
1.71
286
0.14
TRAF6,DYNC1I2,SEC24B,SEC24
2.5 1.24E-5 1.09E-2
D,AP1M2,HLA-DOA
saliva secretion(GO:0046541)
10
11
3
347
0.86
7
0
sensory perception of
smell(GO:0007608)
98
100
4
346
1.14
94
0.05
OR10A5,UGT2A1,OR51M1,OR51
3.2 2.59E-5 1.09E-2
B5
sensory perception of
sound(GO:0007605)
258
265
5
345
1.43
253
0.12
PCDH15,CHD7,DFNB31,ATP8B1
,ATP6V0A4
2.4 8.80E-5 1.63E-2
smoothened signaling
pathway(GO:0007224)
127
130
4
346
1.14
123
0.06
ARL13B,BOC,TGFBR2,WDPCP
2.9 7.13E-5 1.46E-2
KCNN4,STATH,TRPC1
5.5 5.76E-7 1.10E-3
stem cell
development(GO:0048864)
8
8
2
348
0.57
6
0
MSI2,FGF2
5.2 7.98E-5 1.53E-2
process apoptotic involved in
patterning of blood
vessels(GO:1902262)
6
6
2
348
0.57
4
0
SPI1,LRP5
5.7 4.28E-5 1.32E-2
adult walking
behavior(GO:0007628)
42
42
3
347
0.86
39
0.02
KLHL1,PCDH15,CHD7
3.8 5.29E-5 1.38E-2
wound healing(GO:0042060)
143
144
4
346
1.14
139
0.07
FGF2,FN1,TGFBR2,ITGB3
2.8 1.13E-4 1.85E-2
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de
identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en cuestión en el genoma
completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de
identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista
anotada para el término funcional. G pos: número de identificadores en el genoma, anotados para el término
funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. List pos IDs:
símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de
probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional para la lista en relación al genoma
completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego
de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en
la discusión, para facilitar su rápida localización.
ANEXOS
199
Anexo 4. Sondas diferencialmente metiladas, no asignadas a ningún gen en el estudio de posiciones
diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA, análisis con la totalidad de los sujetos.
probeId
cg01498641
cg12785183
cg10662603
cg15714227
cg22861317
cg13189008
cg13860785
cg08450021
cg04565216
cg20737259
cg24465935
cg06238004
Chr
chr16
chr6
chr3
chr5
chr19
chr10
chr9
chr11
chr3
chr4
chr6
chr17
nearest gene 50
KB USCS browser CGIn
LINC00311
Shelf
LINC00473
O.Sea
FAM19A4
O.Sea
none50KBneargen O.Sea
ZNF599
Shelf
LINC00701
O.Sea
none50KBneargen O.Sea
C11orf53
O.Sea
FNDC3B
O.Sea
LOC101929210
O.Sea
none50KBneargen O.Sea
PYY
Shore
cg23904955 chr10 LINC01475
Cg18239511‡ chr14 C14orf132
Island
O.Sea
browser
veriff
Shore
O.Sea
O.Sea
O.Sea
CGIShelf
O.Sea
O.Sea
O.Sea
O.Sea
O.Sea
O.Sea
Shore
logFC
1.14691
0.84210
1.47924
1.24239
0.81497
1.44213
1.55333
0.74516
0.90266
0.9048
1.03179
0.65492
CGI
O.Sea2
0.62575 -2.236
4.08040 -1.747
AveExpr
2.565
1.520
1.568
2.445
1.689
2.741
2.839
-2.188
2.131
0.735
2.161
-0.366
P.Value
1.183E-10
5.160E-10
7.369E-10
1.927E-09
1.951E-09
2.166E-09
3.015E-09
8.521E-09
1.076E-08
1.402E-08
2.122E-08
2.730E-08
adj.P.Val
3.092E-06
7.585E-06
9.369E-06
1.799E-05
1.799E-05
1.887E-05
2.313E-05
4.361E-05
4.915E-05
5.572E-05
6.681E-05
7.256E-05
B
deltaB
13.921464 0.07
12.54548
0.08
12.297964 0.14
11.403
0.10
11.382954 0.08
11.284924 0.09
10.901302 0.09
10.015267 0.07
9.809675
0.07
9.551037
0.11
9.136574
0.09
8.953993
0.11
2.802E-08 7.326E-05 8.923151
1.416E-30 6.663E-25 45.881902
0.07
0.32
Abreviaturas. ‡: La sonda cg18239511 corresponde al SNP C/T común rs6575572 por lo cual se descarta
como resultado de metilación diferencial. Otras convenciones y abreviaturas definidas en la sección
correspondiente (en la página X). Aunque estas sondas no fueron asignadas a genes (según lo explicado en
el numeral 1.1.5 del capítulo 1 ), como referencias descriptivas se hizo la búsqueda en el UCSC Genome
Browser del gen más cercano hasta de 50KB (rango de búsqueda usado por De Jager y colaboradores (De
Jager et al., 2014). Asimismo, se verificó en el browser la posición reportada por el paquete Ilumina anotación
respecto islas CpGs. Las cuales que superan la corrección de Benjamini & Yekutieli<0.001. Las primeras 5
sondas, además superan una corrección de Bonferroni con un alfa < 0.001.
200
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
1
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg18239511 †
chr14
OpenSea
6.34E-19
4.12
30.9 0.37
1.3E-24 ↑
2
cg16464924 GAA
2548
chr17
Island
8.36E-11
2.83
22.5 0.15
3.6E-16 ↑
3
cg12743416 TRIM24
8805
chr7
OpenSea
1.47E-08
2.23
18.6 0.21
1.2E-13 ↑
4
cg13295614
chr2
OpenSea
1.81E-06
1.76
14.2 0.17
3.3E-11 ↑
5
cg08925882 GSTP1
2950
chr11
Shore
4.86E-06
1.14
13.3 0.12
1.2E-10 ↑
6
cg13980266 ZNF169
169841
chr9
Shore
4.86E-06
1.74
13.3 0.13
1.2E-10 ↑
7
cg13917577 AGRN
375790
chr1
Shore
4.86E-06
1.16
13.2 0.14
1.2E-10 ↑
8
cg21134610 CXXC1
30827
chr18
Shore
5.38E-06
1.12
13.2 0.10
1.5E-10 ↑
9
cg03745316
chr8
OpenSea
8.85E-06
0.71
12.8 0.10
2.6E-10 ↑
10
cg09852619 DOCK5
chr8
OpenSea
9.28E-06
1.62
12.7 0.18
3.0E-10 ↑
11
cg01498641
chr16
Shelf
1.09E-05
1.23
12.4 0.07
3.9E-10 ↑
12
cg21757617
chr11
OpenSea
1.74E-05
1.63
11.7 0.22
6.7E-10 ↑
13
cg15714227
chr5
OpenSea
2.04E-05
1.25
11.7 0.10
8.7E-10 ↑
14
cg11871295 CXXC1
chr18
Shore
4.26E-05
1.44
11.0 0.13
2.1E-09 ↑
15
cg12750757 LOC100128993 100128993
chr8
Shelf
5.38E-05
1.85
10.7 0.15
3.1E-09 ↑
16
cg16206364 CPT1C
126129
chr19
Shore
1.16E-04
1.36
9.94 0.13
7.7E-09 ↑
17
cg01055691 GAP43
2596
chr3
Shore
1.74E-04
1.89
9.28 0.17
1.3E-08 ↑
18
cg20255370 EIF2AK4
440275
chr15
Island
1.94E-04
1.15
9.25 0.14
1.6E-08 ↑
19
cg02299946 HTRA1
5654
chr10
Shelf
2.55E-04
0.46
8.99 0.06
2.2E-08 ↑
20
cg21134232 HOXA3
3200
chr7
Shore
2.97E-04
0.61
8.81 0.09
2.7E-08 ↑
21
cg24954648
chr15
Shelf
3.20E-04
0.94
8.69 0.07
3.0E-08 ↑
22
cg23098789 GPR123
84435
chr10
Shore
3.20E-04
2.43
8.55 0.11
3.1E-08 ↑
23
cg10432569 MIR196A1
406972
chr17
Shore
4.13E-04
0.62
8.32 0.08
4.5E-08 ↑
24
cg10662603
chr3
OpenSea
4.13E-04
1.49
8.37 0.15
4.6E-08 ↑
25
cg15171154 TGFBR2
chr3
OpenSea
4.13E-04
0.51
8.26 0.08
4.9E-08 ↑
26
cg19969733 IL18R1, IL1RL1 8809, 9173
chr2
OpenSea
4.56E-04
1.25
8.18 0.13
5.8E-08 ↑
27
cg13853450 CDH19
28513
chr18
OpenSea
5.41E-04
0.55
7.93 0.07
7.3E-08 ↑
28
cg15711240 CCDC7
79741
chr10
OpenSea
5.41E-04
1.51
7.96 0.13
7.3E-08 ↑
29
cg18462033 ASPH
444
chr8
OpenSea
5.41E-04
0.99
7.89 0.08
7.5E-08 ↑
30
cg01413281 CHUK
1147
chr10
Shore
5.41E-04
0.42
7.85 0.07
7.6E-08 ↑
31
cg23011194 SORBS1
10580
chr10
OpenSea
5.72E-04
0.46
7.79 0.07
8.3E-08 ↑
32
cg03112777
chr7
Shelf
5.72E-04
1.35
7.83 0.15
8.3E-08 ↑
33
cg11748187 TCF7L2
6934
chr10
Shore
5.77E-04
0.54
7.83 0.06
8.5E-08 ↑
34
cg11793499 CFHR4
10877
chr1
OpenSea
5.86E-04
0.93
7.72 0.08
9.0E-08 ↑
35
cg24499688
chr7
OpenSea
6.07E-04
1.01
7.68 0.10
9.6E-08 ↑
36
cg22606262 RGS9BP
388531
chr19
Shore
6.09E-04
0.61
7.67 0.08
9.8E-08 ↑
37
cg21785710 WDPCP
51057
chr2
OpenSea
6.31E-04
0.68
7.62 0.08
1.0E-07 ↑
38
cg15147693 DCDC2
51473
chr6
Shelf
6.31E-04
1.80
7.64 0.16
1.0E-07 ↑
39
cg14887099 DLEU1
10301
chr13
OpenSea
6.47E-04
0.56
7.59 0.08
1.1E-07 ↑
40
cg08450021
chr11
OpenSea
6.52E-04
0.68
7.57 0.06
1.1E-07 ↑
41
cg27320005 SLC25A2
chr5
Island
6.69E-04
0.47
7.45 0.09
1.2E-07 ↑
42
cg07110379
chr3
OpenSea
7.14E-04
0.64
7.45 0.07
1.3E-07 ↑
43
cg15255329 LAIR2
3904
chr19
OpenSea
7.94E-04
1.41
7.33 0.17
1.5E-07 ↑
44
cg19072128 ASB1
51665
chr2
Shore
8.72E-04
1.21
7.24 0.08
1.6E-07 ↑
45
cg19983221 AMBRA1
55626
chr11
OpenSea
8.72E-04
0.74
7.20 0.11
1.7E-07 ↑
46
cg13781408 AATK
9625
chr17
Island
8.72E-04
0.53
7.18 0.07
1.7E-07 ↑
Sonda
80005
30827
7048
83884
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
ANEXOS
201
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
47
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg07077735 FUK
197258
chr16
48
cg01072550
49
cg24064173 RASA3
50
cg06513375 ZNF251
51
cg10168726
52
cg06209897 PRKG1
53
54
55
57
cg25941682 PDE8A
AGAP2-AS1,
cg14845962
AGAP2
cg19119945 BOC
58
cg15951897 ZCCHC4
59
cg07581999
Sonda
56
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
OpenSea
8.72E-04
0.46
7.19 0.07
1.7E-07 ↑
chr1
Shelf
8.72E-04
0.96
7.13 0.10
1.8E-07 ↑
22821
chr13
Shelf
1.03E-03
0.58
6.94 0.07
2.2E-07 ↑
90987
chr8
Island
1.03E-03
1.16
6.86 0.14
2.2E-07 ↑
chr5
OpenSea
1.03E-03
0.53
6.95 0.07
2.2E-07 ↑
chr10
OpenSea
1.10E-03
0.62
6.88 0.06
2.4E-07 ↑
cg05782888
chr8
OpenSea
1.12E-03
0.49
6.80 0.07
2.5E-07 ↑
cg21434081
chr4
Shelf
1.15E-03
0.73
6.82 0.07
2.6E-07 ↑
5151
chr15
100130776,
chr12
116986
91653
chr3
OpenSea
1.20E-03
0.49
6.73 0.08
2.8E-07 ↑
Island
1.24E-03
0.76
6.62 0.10
3.0E-07 ↑
Shore
1.24E-03
0.92
6.69 0.14
3.0E-07 ↑
29063
chr4
Shelf
1.25E-03
0.76
6.57 0.06
3.2E-07 ↑
chr2
OpenSea
1.25E-03
0.96
6.64 0.09
3.2E-07 ↑
chr17
OpenSea
1.25E-03
0.95
6.62 0.11
3.2E-07 ↑
chr19
Island
1.29E-03
0.54
6.56 0.08
3.5E-07 ↑
5592
61
LRRC37BP1,
cg20756454
SH3GL1P2
cg11657665 AP1M2
62
cg24638453
chr6
Island
1.31E-03
1.04
6.45 0.07
3.5E-07 ↑
63
cg19905270
chr5
OpenSea
1.34E-03
0.63
6.45 0.08
3.7E-07 ↑
64
cg11616592
chr7
OpenSea
1.34E-03
0.86
6.47 0.07
3.7E-07 ↑
65
cg17016678
chr8
OpenSea
1.36E-03
0.65
6.50 0.10
3.8E-07 ↑
66
cg02119693 MYO1B
chr2
OpenSea
1.38E-03
0.72
6.46 0.09
3.9E-07 ↑
67
cg20733077 DLEU1, DLEU2 10301, 8847 chr13
Island
1.40E-03
0.61
6.38 0.06
4.0E-07 ↑
68
cg25749982 CAPS2
84698
chr12
Shelf
1.40E-03
1.37
6.40 0.12
4.1E-07 ↑
69
cg06709442 PRMT8
56341
chr12
OpenSea
1.40E-03
0.78
6.37 0.07
4.1E-07 ↑
70
cg17187439
chr2
OpenSea
1.40E-03
0.96
6.39 0.08
4.2E-07 ↑
71
cg04756594 SLC5A11
chr16
OpenSea
1.40E-03
0.54
6.39 0.07
4.2E-07 ↑
72
cg22861317
chr19
Shelf
1.40E-03
0.72
6.38 0.07
4.2E-07 ↑
73
cg10815657 PPAP2C
chr19
Shore
1.44E-03
0.64
6.35 0.11
4.4E-07 ↑
74
cg24465935
chr6
OpenSea
1.47E-03
0.93
6.26 0.07
4.6E-07 ↑
75
cg12785183
chr6
OpenSea
1.47E-03
0.90
6.31 0.11
4.6E-07 ↑
Shore
1.48E-03
0.77
6.29 0.06
4.7E-07 ↑
Shore
1.49E-03
0.64
6.25 0.08
4.9E-07 ↑
60
147172,
6459
10053
4430
115584
8612
78
HSP90AA1,
cg18412984
WDR20
HOXA-AS3,
cg11724970
HOXA5
cg15226275 FRK
OpenSea
1.54E-03
0.38
6.16 0.07
5.1E-07 ↑
79
cg11879776 CST8
10047
chr20
OpenSea
1.57E-03
1.08
6.18 0.09
5.3E-07 ↑
80
cg08038033 FOXP1
27086
chr3
OpenSea
1.64E-03
0.38
6.13 0.06
5.6E-07 ↑
81
cg13636371 DFNB31
25861
chr9
Shelf
1.64E-03
0.54
6.15 0.09
5.6E-07 ↑
82
cg20689742
chr8
Shelf
1.64E-03
0.82
6.12 0.07
5.6E-07 ↑
83
cg17616677 SEMA3E
9723
chr7
OpenSea
1.65E-03
0.98
6.07 0.10
5.9E-07 ↑
84
cg08486903 SMURF1
57154
chr7
Shore
1.73E-03
0.59
5.83 0.07
6.2E-07 ↑
85
cg27657459
chr17
Shelf
1.77E-03
0.99
5.96 0.11
6.5E-07 ↑
86
cg25772418 GPR133
chr12
Shelf
1.78E-03
0.58
5.96 0.10
6.6E-07 ↑
87
cg00389785
chr6
Shelf
1.81E-03
1.03
5.95 0.15
6.8E-07 ↑
88
cg19498600 CCDC7
chr10
OpenSea
1.86E-03
0.96
5.93 0.11
7.1E-07 ↑
89
cg23904955
chr10
Island
1.86E-03
0.63
5.90 0.06
7.1E-07 ↑
90
cg21822635
chr7
OpenSea
1.86E-03
1.07
5.89 0.10
7.2E-07 ↑
chr13
OpenSea
1.86E-03
0.82
5.85 0.09
7.3E-07 ↑
chr3
Shore
1.86E-03
0.69
5.88 0.07
7.4E-07 ↑
76
77
91
92
3320, 91833 chr14
100133311,
chr7
3202
2444
chr6
283383
79741
406950,
cg20988440 MIR16-1, DLEU2
8847
cg25631092 TBC1D5
9779
202
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
93
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg21330976 ANKRD29
147463
chr18
Shelf
1.93E-03
1.31
5.82 0.12
7.7E-07 ↑
94
cg22594071 PLSCR5
389158
chr3
OpenSea
1.98E-03
0.67
5.81 0.08
8.1E-07 ↑
95
cg02663945 SAMD11
148398
chr1
Island
1.99E-03
1.09
5.78 0.16
8.1E-07 ↑
96
cg03792839
chr12
Shelf
1.99E-03
0.98
5.75 0.07
8.4E-07 ↑
97
cg15974867 CCND1
595
chr11
Shelf
1.99E-03
0.81
5.75 0.08
8.4E-07 ↑
98
cg09490371 ECEL1P2
347694
chr2
Island
1.99E-03
0.88
5.76 0.12
8.4E-07 ↑
99
cg19204924 ZNF826P
664701
chr19
OpenSea
2.00E-03
0.62
5.74 0.10
8.5E-07 ↑
100
cg08485001 LOC400685
400685
chr19
Shelf
2.00E-03
0.49
5.72 0.08
8.6E-07 ↑
101
cg13860785
chr9
OpenSea
2.13E-03
1.50
5.61 0.09
9.5E-07 ↑
102
cg01056467 CROCC
9696
chr1
Island
2.15E-03
0.62
5.58 0.06
1.0E-06 ↑
103
cg16748008 HOXA3
3200
chr7
Island
2.25E-03
0.70
5.51 0.06
1.1E-06 ↑
104
cg01441308 BIN1
274
chr2
OpenSea
2.25E-03
0.74
5.53 0.07
1.1E-06 ↑
105
cg07683388 ANKRD44
91526
chr2
Island
2.26E-03
0.66
5.45 0.08
1.1E-06 ↑
106
cg18887230 SMURF1
57154
chr7
Shore
2.33E-03
0.66
5.44 0.06
1.2E-06 ↑
107
cg17606558 MAS1L
116511
chr6
OpenSea
2.37E-03
0.97
5.43 0.09
1.2E-06 ↑
108
cg09033376 ASPRV1
151516
chr2
Island
2.38E-03
0.49
5.34 0.06
1.2E-06 ↑
109
cg16150863 MAS1L
116511
chr6
OpenSea
2.40E-03
1.44
5.39 0.13
1.3E-06 ↑
110
cg06012748
chr11
OpenSea
2.40E-03
1.18
5.38 0.07
1.3E-06 ↑
111
cg22418668
chr13
OpenSea
2.40E-03
1.35
5.38 0.11
1.3E-06 ↑
112
cg13600364
chr6
OpenSea
2.40E-03
0.93
5.38 0.08
1.3E-06 ↑
113
cg19139343 EPHA6
chr3
OpenSea
2.40E-03
0.36
5.33 0.07
1.3E-06 ↑
114
chr7
Island
2.41E-03
0.56
5.35 0.07
1.3E-06 ↑
chr6
Island
2.42E-03
0.57
5.28 0.07
1.3E-06 ↑
116
cg04778178 HOXA3
3200
HLA-DPA1, HLAcg14801692
3113, 3115
DPB1
cg07584855 HLX
3142
chr1
Island
2.44E-03
1.14
5.32 0.07
1.4E-06 ↑
117
cg13189008
chr10
OpenSea
2.48E-03
1.30
5.29 0.07
1.4E-06 ↑
118
cg01303420 PQLC2L
152078
chr3
OpenSea
2.48E-03
0.71
5.28 0.10
1.4E-06 ↑
119
cg02775223 DUXA
503835
chr19
OpenSea
2.48E-03
1.66
5.30 0.14
1.4E-06 ↑
120
cg00756845 IPCEF1
26034
chr6
OpenSea
2.49E-03
1.26
5.26 0.12
1.5E-06 ↑
121
8034
56145,
56146
54714
chr10
OpenSea
2.49E-03
0.50
5.25 0.06
1.5E-06 ↑
chr5
Shore
2.49E-03
0.93
5.19 0.13
1.5E-06 ↑
123
cg16214034 SLC25A16
PCDHA3,
cg10526897
PCDHA2
cg14224760 CNGB3
chr8
OpenSea
2.53E-03
0.87
5.19 0.07
1.5E-06 ↑
124
cg16056941 SH3BGRL2
83699
chr6
OpenSea
2.54E-03
0.64
5.20 0.08
1.6E-06 ↑
125
cg04565216
chr3
OpenSea
2.55E-03
0.80
5.17 0.07
1.6E-06 ↑
126
cg18454133 EFS
chr14
Island
2.55E-03
0.40
5.19 0.06
1.6E-06 ↑
127
cg20737259
chr4
OpenSea
2.55E-03
0.80
5.17 0.10
1.6E-06 ↑
128
cg02832915 ASPRV1
151516
chr2
Island
2.55E-03
0.52
5.17 0.07
1.6E-06 ↑
129
cg27517446 C7orf60
154743
chr7
OpenSea
2.71E-03
0.85
5.08 0.07
1.8E-06 ↑
130
cg06881132
chr4
OpenSea
2.71E-03
0.80
5.09 0.09
1.8E-06 ↑
131
cg12152540 MKX
283078
chr10
Shelf
2.71E-03
0.64
5.07 0.07
1.8E-06 ↑
132
cg12462078 PDE11A
50940
chr2
OpenSea
2.74E-03
0.83
5.04 0.07
1.8E-06 ↑
133
cg06957003
chr8
Shelf
2.80E-03
0.79
5.04 0.10
1.9E-06 ↑
134
cg26381452
chr3
Island
2.84E-03
1.25
5.00 0.13
2.0E-06 ↑
135
cg05904806
chr14
Shelf
2.88E-03
0.49
4.97 0.07
2.0E-06 ↑
136
cg17965690 SLC44A2
57153
chr19
Island
2.88E-03
0.79
4.96 0.10
2.0E-06 ↑
137
cg25162451 DOCK5
80005
chr8
OpenSea
2.88E-03
0.52
4.95 0.06
2.1E-06 ↑
138
cg01120761 CLEC4C
170482
chr12
OpenSea
2.94E-03
1.65
4.94 0.16
2.1E-06 ↑
Sonda
115
122
285220
10278
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
ANEXOS
203
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
141
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg20245362
chr7
SPI1, SLC39A13, 6688, 91252,
cg01539849
chr11
ITGA10
8515
cg15686105
chr7
142
cg15659052 ELMO1
143
cg16585946
144
cg06546787 DEFB112
145
cg16579136
146
cg17970299 ZNF385A
147
Sonda
139
140
B
DBt
p.value
dir.
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
Shore
3.05E-03
0.50
4.85 0.07
2.3E-06 ↑
Island
3.12E-03
0.43
4.83 0.07
2.4E-06 ↑
Shelf
3.20E-03
1.14
4.79 0.11
2.5E-06 ↑
chr7
OpenSea
3.24E-03
0.43
4.77 0.06
2.5E-06 ↑
chr1
OpenSea
3.30E-03
0.40
4.72 0.06
2.6E-06 ↑
chr6
OpenSea
3.33E-03
0.58
4.71 0.06
2.7E-06 ↑
chr3
OpenSea
3.33E-03
0.76
4.70 0.09
2.7E-06 ↑
25946
chr12
Island
3.36E-03
0.74
4.70 0.09
2.7E-06 ↑
cg16404898 GABRA6
2559
chr5
OpenSea
3.47E-03
0.87
4.64 0.07
2.8E-06 ↑
148
cg22090150 ANKFY1
51479
chr17
OpenSea
3.60E-03
0.79
4.54 0.07
3.1E-06 ↑
149
cg17219660 GPR37L1
9283
chr1
OpenSea
3.60E-03
0.38
4.57 0.07
3.1E-06 ↑
150
cg20622410 JUP
3728
chr17
OpenSea
3.60E-03
0.69
4.57 0.08
3.1E-06 ↑
151
cg25407540 C9
735
chr5
OpenSea
3.62E-03
0.70
4.52 0.07
3.2E-06 ↑
152
cg13177458 ANXA13
312
chr8
OpenSea
3.63E-03
0.47
4.54 0.06
3.2E-06 ↑
153
cg15441831 CLDN4
1364
chr7
Shore
3.70E-03
1.02
4.54 0.15
3.2E-06 ↑
154
cg05969298
chr8
OpenSea
3.70E-03
0.95
4.53 0.07
3.3E-06 ↑
155
cg16329782 SLC9A3
6550
chr5
Shore
3.80E-03
0.46
4.50 0.06
3.4E-06 ↑
156
cg07734514 GPX5
2880
chr6
OpenSea
3.90E-03
0.46
4.46 0.07
3.5E-06 ↑
157
cg19397037 SYTL2
54843
chr11
OpenSea
4.03E-03
0.44
4.41 0.07
3.7E-06 ↑
158
cg06238004
chr17
Shore
4.03E-03
0.74
4.41 0.12
3.7E-06 ↑
159
cg06223080
chr2
Shelf
4.22E-03
0.76
4.32 0.09
4.1E-06 ↑
160
cg11599793
chr2
OpenSea
4.22E-03
1.02
4.32 0.12
4.1E-06 ↑
161
cg22528069
chr7
OpenSea
4.25E-03
0.77
4.30 0.09
4.1E-06 ↑
162
cg07933234
chr10
OpenSea
4.27E-03
0.57
4.29 0.08
4.2E-06 ↑
163
91653
chr3
100132406,
100288142, chr1
56147
57587
chr4
Shore
4.28E-03
0.43
4.26 0.07
4.2E-06 ↑
OpenSea
4.34E-03
1.04
4.28 0.09
4.3E-06 ↑
165
cg23091117 BOC
NBPF10,
cg04126335 NBPF20,
PCDHA1
cg20585916 CFAP97
OpenSea
4.37E-03
1.28
4.26 0.12
4.4E-06 ↑
166
cg23931381 ARRDC2
27106
chr19
Shore
4.37E-03
0.59
4.26 0.06
4.4E-06 ↑
167
cg19440553 KIAA0825
285600
chr5
OpenSea
4.42E-03
1.07
4.22 0.10
4.6E-06 ↑
168
cg20067138
chr6
OpenSea
4.49E-03
0.92
4.20 0.09
4.7E-06 ↑
169
cg25320763
chr2
OpenSea
4.53E-03
0.70
4.19 0.07
4.7E-06 ↑
170
cg03853620 PDK4
chr7
Shelf
4.54E-03
0.84
4.19 0.08
4.8E-06 ↑
171
cg10617782
chr7
OpenSea
4.58E-03
0.39
4.16 0.07
4.9E-06 ↑
172
cg25606773 ENPP4
22875
chr6
OpenSea
4.63E-03
1.32
4.15 0.11
5.0E-06 ↑
173
cg26049187 CFHR5
81494
chr1
OpenSea
4.72E-03
1.08
4.10 0.09
5.2E-06 ↑
174
cg25310205
chr5
OpenSea
4.75E-03
0.77
4.09 0.09
5.2E-06 ↑
175
cg14802609 PLXDC2
84898
chr10
OpenSea
4.84E-03
0.47
4.07 0.08
5.4E-06 ↑
176
cg11598403 MBP
4155
chr18
Island
4.94E-03
0.65
4.04 0.09
5.6E-06 ↑
177
cg23112188 NRL, PCK2
4901, 5106
chr14
Shore
5.06E-03
0.57
4.01 0.09
5.8E-06 ↑
178
cg06524213 DDR2
4921
chr1
OpenSea
5.08E-03
0.95
3.99 0.06
5.9E-06 ↑
179
cg04262505
chr2
OpenSea
5.08E-03
0.46
3.98 0.06
5.9E-06 ↑
180
cg00710972 UCMA
221044
chr10
OpenSea
5.08E-03
0.50
3.98 0.08
5.9E-06 ↑
181
cg09596958 AGAP2
116986
chr12
Shore
5.08E-03
0.97
3.99 0.11
5.9E-06 ↑
182
cg13841627 TMC1
117531
chr9
OpenSea
5.08E-03
0.61
3.98 0.07
5.9E-06 ↑
183
cg02856768
chr12
OpenSea
5.08E-03
0.47
3.98 0.08
5.9E-06 ↑
184
cg18894552
chr14
OpenSea
5.08E-03
0.51
3.97 0.09
6.0E-06 ↑
164
9844
245915
5166
204
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
185
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg07056967 LRP5
4041
chr11
Shelf
5.14E-03
1.13
3.95 0.08
6.2E-06 ↑
186
cg23722778 ENPP4
22875
chr6
OpenSea
5.14E-03
0.88
3.93 0.09
6.2E-06 ↑
187
cg01703291 PDE8A
5151
chr15
OpenSea
5.22E-03
0.46
3.92 0.07
6.4E-06 ↑
188
cg14791639 ATXN1
6310
chr6
OpenSea
5.24E-03
0.49
3.90 0.06
6.5E-06 ↑
189
cg24041556 SLC44A2
57153
chr19
Island
5.24E-03
0.69
3.90 0.09
6.5E-06 ↑
190
cg14321777
chr10
OpenSea
5.26E-03
0.79
3.88 0.06
6.6E-06 ↑
191
cg10415021
chr11
OpenSea
5.36E-03
2.12
3.77 0.23
6.7E-06 ↑
192
cg08967391
chr11
OpenSea
5.39E-03
0.79
3.84 0.06
6.8E-06 ↑
193
cg03395044
chr6
OpenSea
5.47E-03
0.72
3.81 0.08
7.0E-06 ↑
194
cg15415945 C6orf47
chr6
Shore
5.49E-03
3.66
3.88 0.16
7.1E-06 ↑
195
cg21386414
chr1
OpenSea
5.52E-03
0.47
3.81 0.08
7.2E-06 ↑
196
cg26421169 LOC643733
chr11
OpenSea
5.59E-03
1.32
3.79 0.13
7.4E-06 ↑
197
cg07024439
chr4
OpenSea
5.59E-03
0.78
3.76 0.08
7.5E-06 ↑
198
cg13857678
chr9
OpenSea
5.63E-03
0.51
3.72 0.07
7.6E-06 ↑
199
cg10976009 RNASE9
390443
chr14
OpenSea
5.65E-03
0.76
3.74 0.08
7.7E-06 ↑
200
cg10001172 DNA2
1763
chr10
Shelf
5.65E-03
0.86
3.75 0.08
7.7E-06 ↑
201
cg09860047 RHBDD1
84236
chr2
OpenSea
5.68E-03
0.48
3.73 0.08
7.8E-06 ↑
202
cg15089491 LOC100507537 100507537
chr3
OpenSea
5.69E-03
0.58
3.73 0.07
7.9E-06 ↑
203
cg22904711 KCNN47
chr19
Island
5.70E-03
1.04
3.73 0.12
7.9E-06 ↑
204
cg14020285
chr2
OpenSea
5.74E-03
0.55
3.70 0.07
8.1E-06 ↑
205
cg10306963
chr16
OpenSea
5.74E-03
0.45
3.69 0.06
8.1E-06 ↑
206
cg05002165 WASF2
10163
chr1
Shelf
5.95E-03
0.46
3.61 0.07
8.7E-06 ↑
207
cg00339695 SLC5A11
115584
chr16
OpenSea
6.10E-03
0.55
3.60 0.07
9.1E-06 ↑
208
cg18604929
chr19
Shelf
6.16E-03
0.53
3.58 0.08
9.2E-06 ↑
209
cg06154311 RBBP8NL
140893
chr20
OpenSea
6.20E-03
0.49
3.56 0.06
9.3E-06 ↑
210
cg26831158 ANKRD17
26057
chr4
OpenSea
6.20E-03
0.63
3.57 0.06
9.4E-06 ↑
211
cg20350165 NDUFB2
4708
chr7
OpenSea
6.20E-03
1.08
3.56 0.10
9.4E-06 ↑
212
cg03577460 NFATC4
4776
chr14
Island
6.22E-03
0.48
3.45 0.07
9.5E-06 ↑
213
cg19253743 ACACB
32
chr12
OpenSea
6.23E-03
0.92
3.54 0.06
9.5E-06 ↑
214
cg18587683 WEE2-AS1
285962
chr7
Shelf
6.35E-03
0.77
3.52 0.08
9.8E-06 ↑
215
cg01614839
chr15
OpenSea
6.38E-03
1.07
3.51 0.07
9.9E-06 ↑
216
cg23281432 SAMD3
154075
chr6
OpenSea
6.43E-03
0.45
3.50 0.06
1.0E-05 ↑
217
cg17251384 DTHD1
401124
chr4
OpenSea
6.49E-03
0.98
3.48 0.07
1.0E-05 ↑
218
390790
chr17
100507547,
100532746, chr6
9374
57697
chr14
Shore
6.50E-03
0.49
3.48 0.07
1.0E-05 ↑
Shore
6.50E-03
0.75
3.47 0.07
1.0E-05 ↑
220
cg07330481 ARL5C
LOC100507547,
cg25426302 PPT2-EGFL8,
PPT2
cg04395431 FANCM
OpenSea
6.50E-03
0.89
3.47 0.10
1.0E-05 ↑
221
cg06271190 TMEM100
55273
chr17
OpenSea
6.54E-03
0.43
3.46 0.06
1.1E-05 ↑
222
cg16746770 PTPRO
5800
chr12
OpenSea
6.55E-03
1.28
3.46 0.10
1.1E-05 ↑
223
cg15197050
chr10
OpenSea
6.55E-03
0.43
3.45 0.07
1.1E-05 ↑
224
cg03886558 ARHGAP9
chr12
Island
6.56E-03
1.03
3.42 0.08
1.1E-05 ↑
225
cg11122170
chr14
OpenSea
6.59E-03
1.01
3.44 0.08
1.1E-05 ↑
226
cg01105418 ZBTB18
10472
chr1
Shore
6.59E-03
0.53
3.44 0.07
1.1E-05 ↑
227
cg07600548 VPS41
27072
chr7
OpenSea
6.60E-03
0.96
3.43 0.08
1.1E-05 ↑
228
cg18061395 MYO10
AGAP2-AS1,
cg23387569
AGAP2
cg03897095 GPR123
4651
chr5
100130776,
chr12
116986
84435
chr10
OpenSea
6.73E-03
1.19
3.40 0.12
1.1E-05 ↑
Island
6.77E-03
0.48
3.38 0.07
1.1E-05 ↑
Island
6.80E-03
0.59
3.37 0.06
1.2E-05 ↑
Sonda
219
229
230
57827
643733
3783
64333
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
ANEXOS
205
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
231
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg18259348
chr5
232
cg19647370 RASSF8
233
cg22821574
234
cg13411923 WDR66
HOXA-AS3,
cg23936031
HOXA5
cg16406967 HOXA3
Sonda
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
OpenSea
6.80E-03
0.43
3.36 0.07
1.2E-05 ↑
chr12
OpenSea
6.82E-03
0.64
3.35 0.08
1.2E-05 ↑
chr3
OpenSea
6.85E-03
0.96
3.35 0.07
1.2E-05 ↑
144406
chr12
100133311,
chr7
3202
3200
chr7
OpenSea
6.88E-03
0.43
3.34 0.06
1.2E-05 ↑
Island
6.90E-03
0.69
3.34 0.07
1.2E-05 ↑
Island
6.91E-03
1.12
3.34 0.13
1.2E-05 ↑
1826
chr21
56928,
chr19
645191
100127889,
chr10
728558
chr8
OpenSea
6.91E-03
1.04
3.32 0.07
1.2E-05 ↑
Island
6.91E-03
0.80
3.31 0.09
1.2E-05 ↑
OpenSea
6.92E-03
0.70
3.23 0.06
1.2E-05 ↑
240
cg08729447 DSCAM
SPPL2B,
cg21869609
LINGO3
C10orf131,
cg11111859
ENTPD1-AS1
cg20641423
Shore
6.96E-03
0.64
3.30 0.07
1.2E-05 ↑
241
cg21053224 SNORD113-9
767569
chr14
OpenSea
6.98E-03
1.13
3.29 0.11
1.3E-05 ↑
242
cg26878734 KIAA1715
80856
chr2
OpenSea
6.99E-03
0.87
3.29 0.08
1.3E-05 ↑
243
cg26549831 NINJ2
4815
chr12
OpenSea
7.01E-03
0.67
3.29 0.08
1.3E-05 ↑
244
cg14975015 ATP6V0A4
50617
chr7
OpenSea
7.07E-03
1.08
3.28 0.14
1.3E-05 ↑
245
cg11650460 RAB35
11021
chr12
Shore
7.09E-03
0.45
3.26 0.06
1.3E-05 ↑
246
cg04392234 CXCL8
3576
chr4
OpenSea
7.10E-03
1.37
3.27 0.10
1.3E-05 ↑
247
cg06537526
chr4
Shelf
7.13E-03
0.64
3.23 0.07
1.3E-05 ↑
248
cg22686716 TRIM33
51592
chr1
OpenSea
7.13E-03
1.21
3.24 0.10
1.3E-05 ↑
249
cg19109130 MTERF3
51001
chr8
Shelf
7.13E-03
0.83
3.23 0.07
1.3E-05 ↑
250
cg11949335 TTC22
55001
chr1
Island
7.19E-03
0.53
3.22 0.09
1.4E-05 ↑
251
cg19875532 VENTX
27287
chr10
Island
7.24E-03
0.38
3.20 0.07
1.4E-05 ↑
252
cg01067983 SERPINB6
5269
chr6
OpenSea
7.25E-03
0.63
3.21 0.09
1.4E-05 ↑
253
cg14067524 MYO16
23026
chr13
OpenSea
7.25E-03
1.16
3.15 0.12
1.4E-05 ↑
254
cg08094135
chr8
OpenSea
7.25E-03
0.65
3.20 0.08
1.4E-05 ↑
255
cg01048187 RAB35
chr12
Shore
7.25E-03
0.38
3.20 0.06
1.4E-05 ↑
256
cg21118780 MAP4K4
OpenSea
7.25E-03
0.46
3.20 0.08
1.4E-05 ↑
OpenSea
7.27E-03
0.56
3.14 0.07
1.4E-05 ↑
258
9448
chr2
100506627,
cg24556252 DCDC5, DCDC1
chr11
341019
cg23694490 TNS3
64759
chr7
OpenSea
7.28E-03
0.47
3.18 0.06
1.4E-05 ↑
259
cg17456616
chr10
Shelf
7.29E-03
0.88
3.17 0.07
1.4E-05 ↑
260
cg03222176
chr1
OpenSea
7.29E-03
0.46
3.15 0.07
1.5E-05 ↑
261
cg04212229 AGTR1
chr3
OpenSea
7.29E-03
0.63
3.16 0.07
1.5E-05 ↑
262
cg05475575
chr15
OpenSea
7.30E-03
0.82
3.07 0.07
1.5E-05 ↑
263
cg05667581
chr21
Shore
7.33E-03
0.92
3.15 0.08
1.5E-05 ↑
264
cg21806242 ATG16L2
89849
chr11
Island
7.35E-03
0.69
3.14 0.11
1.5E-05 ↑
265
cg16201598 DNAJC12
56521
chr10
OpenSea
7.37E-03
0.98
3.14 0.12
1.5E-05 ↑
266
cg18946602 NFIA
4774
chr1
Shore
7.39E-03
0.43
3.14 0.07
1.5E-05 ↑
267
cg16175768
chr8
OpenSea
7.41E-03
0.62
3.13 0.07
1.5E-05 ↑
268
cg12572665 EXOC6B
23233
chr2
OpenSea
7.44E-03
0.47
3.13 0.07
1.5E-05 ↑
269
cg23317857 TFEB
7942
chr6
OpenSea
7.46E-03
0.51
3.11 0.08
1.5E-05 ↑
270
cg03406844 TNFAIP6
7130
chr2
OpenSea
7.47E-03
0.49
3.11 0.07
1.5E-05 ↑
271
cg18710412
chr5
OpenSea
7.48E-03
0.97
3.10 0.09
1.5E-05 ↑
272
cg16127683 EIF2AK4
440275
chr15
Island
7.48E-03
0.94
3.10 0.15
1.6E-05 ↑
273
cg22845855 MYOF
26509
chr10
OpenSea
7.50E-03
0.44
3.10 0.07
1.6E-05 ↑
274
cg08553963
chr12
Shelf
7.53E-03
0.46
3.09 0.07
1.6E-05 ↑
275
cg05800416 CSGALNACT1
55790
chr8
Island
7.53E-03
0.66
3.07 0.08
1.6E-05 ↑
276
cg00966078 EPHB2
2048
chr1
OpenSea
7.53E-03
0.90
3.08 0.10
1.6E-05 ↑
235
236
237
238
239
257
11228
11021
185
206
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
277
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
cg20295353 ZBTB1
22890
chr14
OpenSea
7.53E-03
0.77
3.08 0.09
1.6E-05 ↑
278
cg00267323 ANLN
54443
chr7
OpenSea
7.53E-03
0.76
3.08 0.06
1.6E-05 ↑
279
cg07665923 C7orf50
84310
chr7
Shelf
7.53E-03
0.85
3.08 0.09
1.6E-05 ↑
280
cg11938672 WDR27
253769
chr6
OpenSea
7.62E-03
0.71
3.03 0.10
1.6E-05 ↑
281
cg13079633
chr8
Shelf
7.62E-03
1.00
3.05 0.08
1.6E-05 ↑
282
cg20751057 CEP63
80254
chr3
OpenSea
7.63E-03
0.81
3.04 0.06
1.7E-05 ↑
283
274
chr2
100130776,
chr12
116986
11184
chr19
OpenSea
7.65E-03
0.58
3.03 0.09
1.7E-05 ↑
Island
7.67E-03
0.45
3.02 0.07
1.7E-05 ↑
285
cg24587400 BIN1
AGAP2-AS1,
cg16823042
AGAP2
cg05258935 MAP4K1
Island
7.67E-03
0.76
3.02 0.06
1.7E-05 ↑
286
cg02798280 MAP4K1
11184
chr19
Island
7.76E-03
0.77
2.98 0.11
1.7E-05 ↑
287
cg17266581 MBP
4155
chr18
Island
7.91E-03
0.75
2.97 0.09
1.8E-05 ↑
288
OpenSea
7.96E-03
0.82
2.96 0.08
1.8E-05 ↑
OpenSea
8.04E-03
1.06
2.94 0.09
1.9E-05 ↑
290
cg19966146 GLYATL3
CA13,
cg03225502
MIR486-1
cg10319053 HOXA2
Island
8.04E-03
0.70
2.94 0.07
1.9E-05 ↑
291
cg19753914 GULP1
51454
chr2
OpenSea
8.07E-03
0.75
2.92 0.06
1.9E-05 ↑
292
cg12173409 CACNA2D3
55799
chr3
Island
8.14E-03
0.50
2.92 0.07
1.9E-05 ↑
293
cg05858008 FRMD6
122786
chr14
OpenSea
8.15E-03
0.78
2.90 0.08
1.9E-05 ↑
294
cg21657334
chr8
OpenSea
8.16E-03
0.80
2.91 0.07
1.9E-05 ↑
295
cg27653901 NCOR2 ç
9612
chr12
Shore
8.24E-03
0.49
2.87 0.06
2.0E-05 ↑
296
cg19036773 KMT2C
58508
chr7
OpenSea
8.30E-03
0.36
2.86 0.06
2.0E-05 ↑
297
cg16597537 RTN4R
65078
chr22
Shelf
8.33E-03
0.39
2.85 0.07
2.0E-05 ↑
298
cg19022697 TTC22
55001
chr1
Island
8.39E-03
0.79
2.85 0.08
2.0E-05 ↑
299
cg00892742
chr3
OpenSea
8.40E-03
0.40
2.84 0.06
2.1E-05 ↑
300
cg12874219 TM4SF4
7104
chr3
OpenSea
8.60E-03
1.02
2.81 0.11
2.1E-05 ↑
301
cg09382492 AANAT
15
chr17
OpenSea
8.66E-03
0.39
2.80 0.06
2.2E-05 ↑
302
cg25578728 CHD7
55636
chr8
OpenSea
8.66E-03
0.48
2.79 0.06
2.2E-05 ↑
303
cg16656078 ELL2
22936
chr5
OpenSea
8.68E-03
0.61
2.79 0.07
2.2E-05 ↑
304
cg22502450 H1FOO
132243
chr3
OpenSea
8.68E-03
0.57
2.79 0.09
2.2E-05 ↑
305
10667
283692,
64506
chr6
OpenSea
8.77E-03
0.85
2.75 0.07
2.3E-05 ↑
chr15
Island
8.77E-03
0.47
2.75 0.06
2.3E-05 ↑
307
cg15109118 FARS2
LOC283692,
cg08688548
CPEB1
cg23295985
chr5
OpenSea
8.80E-03
0.61
2.74 0.07
2.3E-05 ↑
308
cg10501093 TNFAIP2
7127
chr14
Island
8.82E-03
0.47
2.74 0.06
2.3E-05 ↑
309
cg11434762 ROBO2
6092
chr3
OpenSea
8.85E-03
1.14
2.73 0.10
2.3E-05 ↑
310
cg16023991 TSC22D1
8848
chr13
OpenSea
8.85E-03
0.88
2.72 0.09
2.3E-05 ↑
311
cg12656851 FAM19A1
407738
chr3
Shelf
8.85E-03
0.85
2.73 0.07
2.3E-05 ↑
312
cg03998053
chr5
Shelf
8.88E-03
0.86
2.72 0.06
2.4E-05 ↑
313
cg13802506 NINJ1
4814
chr9
OpenSea
8.94E-03
0.66
2.70 0.09
2.4E-05 ↑
314
cg16258854 RHOB
388
chr2
Shore
8.96E-03
0.81
2.70 0.10
2.4E-05 ↑
315
cg20695587 TMPRSS11F
389208
chr4
OpenSea
8.96E-03
1.27
2.72 0.10
2.4E-05 ↑
316
cg11157691 HTRA1
5654
chr10
OpenSea
8.96E-03
0.54
2.69 0.08
2.4E-05 ↑
317
cg11993439
chr4
OpenSea
8.99E-03
0.53
2.69 0.07
2.4E-05 ↑
318
cg09461792
chr7
OpenSea
8.99E-03
0.78
2.69 0.08
2.4E-05 ↑
319
cg19537932 OR6C68
chr12
OpenSea
9.01E-03
0.90
2.69 0.06
2.4E-05 ↑
320
cg15630458
chr8
Shore
9.02E-03
0.54
2.68 0.08
2.5E-05 ↑
321
cg23270582 UGT2A1
10941
chr4
OpenSea
9.12E-03
1.28
2.67 0.08
2.5E-05 ↑
322
cg08145292 KCNQ5
56479
chr6
Island
9.12E-03
1.41
2.69 0.16
2.5E-05 ↑
Sonda
284
289
306
389396
chr6
CA1, 377677, 759,
chr8
619554
3199
chr7
403284
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
B
DBt
p.value
dir.
ANEXOS
207
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
324
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
AGAP2-AS1,
100130776,
cg11511175
chr12
AGAP2
116986
cg21045824
chr5
325
cg23280807 SLC5A11
115584
chr16
OpenSea
9.16E-03
0.55
2.65 0.07
2.6E-05 ↑
326
cg07731871 CACNB2
783
chr10
OpenSea
9.16E-03
0.49
2.64 0.08
2.6E-05 ↑
327
cg17492152 AKIRIN1
79647
chr1
Shelf
9.18E-03
0.55
2.63 0.07
2.6E-05 ↑
328
cg18315312 DCAF6
55827
chr1
Shore
9.19E-03
0.89
2.63 0.07
2.6E-05 ↑
329
cg13058868 SLC6A15
55117
chr12
OpenSea
9.21E-03
0.86
2.63 0.08
2.6E-05 ↑
330
cg07722722 C1orf228
339541
chr1
Shelf
9.24E-03
0.49
2.62 0.07
2.6E-05 ↑
331
cg06693983 TMEM190
147744
chr19
Island
9.29E-03
0.42
2.62 0.06
2.6E-05 ↑
332
cg20997268 CREB5
9586
chr7
OpenSea
9.30E-03
0.45
2.60 0.07
2.6E-05 ↑
333
cg03580358
chr8
OpenSea
9.30E-03
0.54
2.60 0.08
2.7E-05 ↑
334
cg18770029
chr6
OpenSea
9.31E-03
0.44
2.60 0.06
2.7E-05 ↑
335
cg22507723 AGAP2
116986
chr12
Island
9.36E-03
0.72
2.60 0.09
2.7E-05 ↑
336
cg11750851 CYR61
3491
chr1
Shore
9.39E-03
0.44
2.58 0.06
2.7E-05 ↑
337
cg12862820 SEMA3A
10371
chr7
OpenSea
9.41E-03
0.84
2.58 0.06
2.7E-05 ↑
338
cg00426855 NMU
10874
chr4
OpenSea
9.53E-03
0.83
2.56 0.08
2.8E-05 ↑
339
cg01903440
chr13
OpenSea
9.60E-03
0.54
2.54 0.09
2.8E-05 ↑
340
cg24107899 PARK2
chr6
OpenSea
9.60E-03
1.09
2.55 0.06
2.8E-05 ↑
341
cg20892919
chr12
OpenSea
9.60E-03
0.36
2.53 0.06
2.9E-05 ↑
342
cg20953510 LYPLA2P2
388499
chr19
OpenSea
9.63E-03
0.83
2.53 0.08
2.9E-05 ↑
343
cg13539591 ZNF286B
729288
chr17
Shore
9.63E-03
0.80
2.52 0.08
2.9E-05 ↑
344
cg20336222 ZNF107
51427
chr7
OpenSea
9.64E-03
1.09
2.54 0.11
2.9E-05 ↑
345
cg14286594 NAA15
80155
chr4
OpenSea
9.68E-03
0.66
2.53 0.07
2.9E-05 ↑
346
cg06653026
chr7
OpenSea
9.73E-03
0.45
2.51 0.07
2.9E-05 ↑
347
Shelf
9.76E-03
0.94
2.51 0.09
2.9E-05 ↑
OpenSea
9.79E-03
0.43
2.51 0.07
3.0E-05 ↑
OpenSea
9.83E-03
0.76
2.50 0.07
3.0E-05 ↑
OpenSea
9.83E-03
0.78
2.50 0.07
3.0E-05 ↑
351
cg11212589 ZPBP2
124626
chr17
MYLK-AS1,
100506826,
cg16212219
chr3
MYLK
4638
cg10925915
chr3
NKX6-3, ANK1, 157848, 286,
cg05066959
chr8
PRRT1
80863
cg06022698 RFX6
222546
chr6
Shelf
9.83E-03
0.79
2.49 0.07
3.0E-05 ↑
352
cg02776119 MKLN1
4289
chr7
Shelf
9.88E-03
1.16
2.50 0.10
3.0E-05 ↑
353
cg02417360 ATP11A
23250
chr13
OpenSea
9.88E-03
0.48
2.49 0.07
3.0E-05 ↑
354
cg26227225 C1orf86
199990
chr1
Island
9.89E-03
0.64
2.47 0.09
3.0E-05 ↑
355
cg01986648
chr6
OpenSea
9.92E-03
0.49
2.48 0.06
3.0E-05 ↑
100529240,
chr19
125893
Island
9.92E-03
0.58
2.47 0.09
3.1E-05 ↑
9518
chr19
Shore
9.92E-03
0.56
0.07
3.1E-05 ↑
10086
chr8
OpenSea
5.43E-10
-1.94
0.14
3.5E-15 ↓
chr2
OpenSea
2.28E-07
-1.76
0.18
2.4E-12 ↓
chr17
Shore
4.22E-07
-2.03
2.47
21.1
3
16.4
7
15.6
7
14.7
7
14.4
8
11.7
6
10.7
9
0.21
5.4E-12 ↓
0.12
2.4E-11 ↓
0.11
3.5E-11 ↓
0.18
7.7E-10 ↓
0.40
2.2E-09 ↓
Sonda
323
348
349
350
5071
valor.p.adj logFC
Island
9.12E-03
0.41
2.65 0.06
2.5E-05 ↑
OpenSea
9.14E-03
1.16
2.66 0.11
2.5E-05 ↑
357
ZNF816cg20149571 ZNF321P,
ZNF816
cg21088460 GDF15
358
cg17635970 HHLA1
359
cg02479782
360
cg01978703 ABR
361
cg10439896
chr8
Island
1.63E-06
-1.15
362
TSPAN19,
cg10379050
LRRIQ1
144448,
84125
chr12
OpenSea
1.81E-06
-1.29
363
cg26077133 MSRA
4482
chr8
OpenSea
1.90E-05
-2.57
364
cg04028540
chr8
OpenSea
4.26E-05
-3.41
356
29
B
DBt
p.value
dir.
CpG Loc.
208
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 5. 401 sondas diferencialmente metiladas en capas de neuronas piramidales en EA en comparación
con controles, análisis para el subconjunto hombres
Sonda
Símbolo oficial de Identificador
Chr
gen(es)
Entrez
CpG Loc.
valor.p.adj logFC
chr11
Island
5.25E-05
-2.64
B
DBt
p.value
dir.
365
cg20147224 DDB2
366
cg02693156
chr12
OpenSea
1.17E-04
-0.98
10.4
0.21
8
9.92 0.08
367
cg03119308 RBM28
55131
chr7
OpenSea
1.18E-04
-2.66
9.76 0.33
8.3E-09 ↓
368
cg05038210 ZNF317
57693
chr19
Shore
1.70E-04
-1.21
9.54 0.08
1.2E-08 ↓
369
cg15248972
chr4
OpenSea
1.86E-04
-1.45
9.25 0.20
1.4E-08 ↓
370
cg15463457 MMRN1
chr4
OpenSea
2.26E-04
-0.87
9.00 0.08
1.9E-08 ↓
371
cg02937966
chr16
OpenSea
4.13E-04
-1.10
8.34 0.10
4.8E-08 ↓
372
cg13413744 NOL6
65083
chr9
OpenSea
4.13E-04
-1.01
8.32 0.10
4.9E-08 ↓
373
cg03066009 CYP7B1
9420
chr8
OpenSea
4.37E-04
-1.83
8.07 0.12
5.5E-08 ↓
374
cg17405012 CHRM2
1129
chr7
Shore
8.72E-04
-0.92
7.18 0.08
1.8E-07 ↓
375
cg09922117 C12orf73
728568
chr12
Shore
1.20E-03
-1.03
6.75 0.07
2.8E-07 ↓
376
cg14189571 ZFP42
132625
chr4
Shore
1.40E-03
-0.57
6.45 0.08
4.0E-07 ↓
377
cg23986375
chr8
Island
1.48E-03
-0.77
6.29 0.09
4.7E-07 ↓
378
cg13127920 NCOR2 ç
9612
chr12
Shore
1.86E-03
-1.16
5.83 0.11
7.3E-07 ↓
379
8940
144448,
84125
3612
chr22
Island
2.05E-03
-0.66
5.71 0.07
9.0E-07 ↓
chr12
OpenSea
2.65E-03
-1.43
5.14 0.13
1.7E-06 ↓
381
cg03229183 TOP3B
TSPAN19,
cg20080079
LRRIQ1
cg16746631 IMPA1
chr8
Shore
3.42E-03
-0.89
4.69 0.07
2.8E-06 ↓
382
cg16099169
chr2
Island
3.42E-03
-0.81
4.67 0.13
2.8E-06 ↓
383
cg18707028
chr14
Shelf
4.08E-03
-1.78
4.40 0.20
3.9E-06 ↓
384
cg20311868 WBSCR27
155368
chr7
Shore
4.48E-03
-1.31
4.22 0.13
4.7E-06 ↓
385
cg25450121 ATP5G1
516
chr17
Shore
4.63E-03
-0.55
4.10 0.15
5.0E-06 ↓
386
cg27531366 WDTC1
23038
chr1
OpenSea
5.54E-03
-0.42
3.80 0.06
7.3E-06 ↓
387
cg18041277
chr8
Island
5.84E-03
-0.54
3.65 0.07
8.4E-06 ↓
388
cg02388795 NAP1L1
4673
chr12
Shelf
5.95E-03
-0.59
3.64 0.09
8.7E-06 ↓
389
cg02653117 BRD2
6046
chr6
Shore
6.38E-03
-0.55
3.52 0.06
9.9E-06 ↓
390
cg19188297
chr12
OpenSea
6.61E-03
-0.67
3.43 0.07
1.1E-05 ↓
391
cg22744587 BARX2
8538
chr11
OpenSea
6.97E-03
-1.04
3.31 0.14
1.3E-05 ↓
392
cg21838488 RNF219
79596
chr13
Shore
7.16E-03
-0.48
3.22 0.07
1.4E-05 ↓
393
cg20976286 OCA2
4948
chr15
Shelf
7.16E-03
-3.16
3.25 0.29
1.4E-05 ↓
394
cg02752932
chr2
OpenSea
7.27E-03
-0.96
3.15 0.09
1.4E-05 ↓
395
cg00365499 SRPK2
chr7
OpenSea
7.44E-03
-0.80
3.13 0.07
1.5E-05 ↓
396
cg16541869
chr11
OpenSea
7.62E-03
-0.96
3.04 0.07
1.6E-05 ↓
397
cg00448395 POT1
chr7
Shore
8.14E-03
-0.86
2.92 0.12
1.9E-05 ↓
398
cg00684529
chr2
Shelf
8.61E-03
-0.69
2.81 0.06
2.1E-05 ↓
chr12
OpenSea
9.18E-03
-1.31
2.67 0.10
2.6E-05 ↓
chr19
Shore
9.86E-03
-0.52
2.45 0.06
3.0E-05 ↓
chr5
Island
1.00E-02
-2.42
2.53 0.14
3.1E-05 ↓
380
1643
22915
6733
25913
400
TSPAN19,
cg26345971
LRRIQ1
cg24452181 CYTH2
144448,
84125
9266
401
cg08422420 SDHAP3
728609
399
2.9E-09 ↓
8.0E-09 ↓
Abreviaturas y convenciones. Sonda: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K. valor.p.adj,
valor p ajustado con FDR (Benjamini & Hochberg, 1995) <0.01. Símbolo oficial de gen, símbolo único de la
base de genes de NCBI. Chr, cromosoma. CGI Loc, anotación de localización de la sonda en relación a las
Islas CpG. B, logaritmo de la probabilidad de diferencia en los grupos. DBt, Delta de Beta. Island, Isla CpG.
Shore, Orilla de Isla CpG, localización a distancia < 2Kb de una Isla CpG. LogFC, logaritmo en base 2 de fold
change del valor M comparado (equivale a las veces, que aumentó el valor M de uno u otro grupo respecto a
su contraparte). Shelf, plataforma insular CpG, localización a una distancia entre 2Kb y 4 Kb de una Isla CpG.
OpenSea, localización a una distancia > a 4kb de una Isla CpG. Se subrayan resultados mencionados en el
texto para facilitar su rápida localización. ç: señala las filas con dos sondas del gen NCOR2 una presentó
aumento y otra disminución de metilación. dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento o
disminución de metilación en EA.
ANEXOS
209
Anexo 6. Ontologías relacionadas con componente subcelular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales,
identificadas para el subconjunto hombres.
Funt. Term
Term
size L
Term
size G
Li
st
po
8
s
List
neg
List %
List
pos
G neg
List pos IDs
oddsrat
io log
p-value
adj
pvalue
axon(GO:0030424)
341
359
245
3.16
333
206145
3.01E
1.32E-08
6.00E-06
344
8
245
3.16
325
206153
3.03E
1.10E-08
6.00E-06
180
186
4
249
1.58
176
206302
BIN1,SMURF1,PTPRO,EPHB2,SEMA3A,
BOC,DSCAM,GAP43
DDR2,KCNN4,PTPRO,ATP6V0A4,CLDN4,
WDPCP,ANXA13,SLC9A3
PTPRO,BOC,DSCAM,RTN4R
apical plasma membrane(GO:0016324)
333
growth cone(GO:0030426)
2.94E
7.82E-05
1.01E-02
membrane raft(GO:0045121)
exocytic vesicle(GO:0070382)
axolemma(GO:0030673)
endosome membrane(GO:0010008)
myelin sheath(GO:0043209)
trans-Golgi network membrane(GO:0032588)
protein-DNA complex(GO:0032993)
Fanconi anaemia nuclear complex(GO:0043240)
basolateral plasma membrane(GO:0016323)
lateral plasma membrane(GO:0016328)
apicolateral plasma membrane(GO:0016327)
neuronal cell body(GO:0043025)
extracellular matrix(GO:0031012)
296
12
16
240
25
141
28
32
275
84
29
379
308
22
17
247
25
156
34
37
283
90
29
379
4
2
2
5
2
4
2
2
4
3
2
7
249
251
251
248
251
249
251
251
249
250
251
246
1.58
0.79
0.79
1.98
0.79
1.58
0.79
0.79
1.58
1.19
0.79
2.77
292
10
14
235
23
137
26
30
271
81
27
372
206186
206468
206464
206243
206455
206341
206452
206448
206207
206397
206451
206106
2.43E
5.10E
4.77E
2.87E
4.27E
3.19E
4.15E
4.00E
2.50E
3.42E
4.11E
2.76E
5.19E-04
9.77E-05
1.77E-04
1.33E-05
4.39E-04
3.03E-05
5.52E-04
7.22E-04
3.94E-04
1.60E-04
5.93E-04
5.42E-07
2.48E-02
1.11E-02
1.46E-02
3.01E-03
2.21E-02
5.50E-03
2.50E-02
2.85E-02
2.21E-02
1.45E-02
2.56E-02
1.64E-04
454
454
5
248
1.98
449
206029
SORBS1,KCNN4,TGFBR2,ANXA13
ANXA13,SYTL2
ANK1,ROBO2
MYO1B,RHOB,ATP6V0A4,RAB35,ANKFY
CA13,MBP
1
MYO1B,HLA-DPA1,HLA-DPB1,AP1M2
TCF7L2,JUP
C1orf86,FANCM
KCNN4,ANXA13,JUP,ANK1
PTPRO,CLDN4,JUP
CLDN4,JUP
KCNN4,MYO10,SMURF1,EPHB2,BOC,M
BP,ZNF385A
IL1RL1,AGRN,HTRA1,UCMA,CYR61
2.22E
2.65E-04
1.60E-02
retromer complex(GO:0030904)
synapse(GO:0045202)
zonula adherens(GO:0005915)
axonal growth cone(GO:0044295)
brush border(GO:0005903)
30
430
19
19
76
34
449
32
19
79
2
5
2
2
3
251
248
251
251
250
0.79
1.98
0.79
0.79
1.19
28
425
17
17
73
206450
206053
206461
206461
206405
TBC1D5,ANKFY1
PRRT1,GABRA6,CPT1C,AGRN,GAP43
SORBS1,JUP
BOC,AATK
MYO1B,ATP6V0A4,SLC9A3
4.07E
2.28E
4.57E
4.57E
3.52E
6.34E-04
2.07E-04
2.52E-04
2.52E-04
1.19E-04
2.62E-02
1.56E-02
1.60E-02
1.60E-02
1.20E-02
early endosome(GO:0005769)
cell periphery(GO:0071944)
279
65
283
67
4
3
249
250
1.58
1.19
275
62
206203
206416
VPS41,MYO1B,RHOB,ANKFY1
MYO1B,MBP,GAP43
2.49E
3.69E
4.16E-04
7.48E-05
2.21E-02
1.01E-02
Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño
global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el término funcional. List neg: número de
identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista anotada para el término funcional. G pos: número de
identificadores en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para el término funcional. G %:
porcentaje de identificadores dentro del genoma para el término funcional. List pos IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds
ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor
p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se
subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su rápida localización.
210
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 7. Ontologías relacionadas con función molecular del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales, identificadas
para el subconjunto hombres.
Funt. Term
Term
size L
Term
size G
List pos List neg
List %
G pos
G neg
G%
List pos IDs
oddsratio p-value
log
adj
pvalue
cGMP binding(GO:0030553)
34
38
3
250
1.19
31
206447
0.02
PRKG1,CNGB3,PDE11A
4.38
1.05E-05
2.12E-02
axon guidance receptor activity
11
(GO:0008046)
12
2
251
0.79
9
206469
0
EPHB2,ROBO2
5.21
8.15E-05
4.65E-02
protein self-association (GO:0043621) 77
78
3
250
1.19
74
206404
0.04
SAMD11,ATXN1,TMEM190 3.51
1.24E-04
4.65E-02
protein complex binding(GO:0032403) 315
315
5
248
1.98
310
206168
0.15
MYO16,CCND1,BIN1,
NCOR2,WASF2
2.60
4.85E-05
4.65E-02
86
3
250
1.19
77
206401
0.04
ARHGAP9,MYO1B,MYO10
3.47
1.39E-04
4.65E-02
19
2
251
0.79
11
206467
0.01
IL1RL1,IL18R1
5.01
1.15E-04
4.65E-02
phosphatidylinositol-3,4,580
trisphosphate binding(GO:0005547)
interleukin-1
receptor
13
activity(GO:0004908)
Agrupamiento por enriquecimiento génico en categorías funcionales relacionadas para genes diferencialmente hipermetilados en EA usando la herramienta
FatigoBabelomics con opciones predeterminadas. Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número de identificadores
anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de la lista anotado para el
término funcional. List neg: número de identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores de la lista anotada para el
término funcional. G pos: número de identificadores en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores en el genoma, no anotados para
el término funcional. G %: porcentaje de identificadores dentro del genoma para el término funcional. List pos IDs: símbolos de identificadores en la lista, anotados al
término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término funcional para la lista en relación al genoma
completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini
& Hochberg. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su localización.
ANEXOS
211
Anexo 8. Ontologías relacionadas con procesos biológicos del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales,
identificadas en el subconjunto de hombres.
Funt. Term
List
pos
List
neg
List %
5
2
251
0.79
3
475
479
6
247
2.37
469 206009
6
6
2
251
0.79
4
206474
7
9
2
251
0.79
5
55
55
4
249
1.58
7
13
2
251
285
300
5
64
67
173
64
67
177
in utero embryonic development(GO:0001701)
304
locomotory behavior(GO:0007626)
anatomical structure regression(GO:0060033)
Term
size L
Term
size G
5
G G neg
pos
1.5E-05 8.37E-03
2.4
3.0E-05 1.12E-02
SPI1, LRP5
6
2.2E-05 1.07E-02
206473
JUP, CYR61
5.8
3.1E-05 1.12E-02
51
206427
TCF7L2, EIF2AK4, PDK4, CAPS2
4.2
7.1E-07 6.81E-04
0.79
5
206473
RHBDD1, PARK2
5.8
3.1E-05 1.12E-02
248
1.98
280 206198
2.7
3.0E-05 1.12E-02
3
3
4
250
250
249
1.19
1.19
1.58
61
206417
64
206414
169 206309
3.7
3.7
3
7.1E-05 1.78E-02
8.2E-05 1.81E-02
6.7E-05 1.75E-02
306
5
248
1.98
299 206179
2.6
4.1E-05 1.39E-02
115
115
5
248
1.98
110 206368
CHD7, GAA, PARK2, DSCAM,
ZNF385A
3.6
3.6E-07 6.56E-04
lung alveolus development(GO:0048286)
mammary gland alveolus
development(GO:0060749)
N-terminal protein amino acid
acetylation(GO:0006474)
67
67
3
250
1.19
64
206414
HOXA5, TNS3, ATXN1
3.7
8.2E-05 1.81E-02
30
30
4
249
1.58
26
206452
HOXA5, CHUK, CCND1, AGAP2
4.8
5.9E-08 1.68E-04
9
10
2
251
0.79
7
206471
AANAT, NAA15
5.5
5.3E-05 1.61E-02
palate development(GO:0060021)
121
126
5
248
1.98
116 206362
CHD7, EPHB2, TGFBR2, ASPH,
WDPCP
3.6
4.7E-07 6.56E-04
patterning of blood vessels(GO:0001569)
positive regulation of interferon-gamma
production(GO:0032729)
positive regulation of mammary gland epithelial
cell proliferation(GO:0033601)
regulation of axonogenesis(GO:0050771)
regulation of pH(GO:0006885)
response to organic cyclic
compound(GO:0014070)
regulation BMPsignaling pathway(GO:0030514)
57
59
3
250
1.19
54
206424
NFATC4, SEMA3E, TGFBR2
3.8
5.1E-05 1.61E-02
61
73
3
250
1.19
58
206420
HLA-DPA1, HLA-DPB1, IL18R1
3.8
6.2E-05 1.69E-02
5
5
2
251
0.79
3
206475
CCND1, AGAP2
6.3
1.5E-05 8.37E-03
39
34
39
37
3
3
250
250
1.19
1.19
36
31
206442
206447
4.2
4.4
1.6E-05 8.37E-03
1.1E-05 7.57E-03
126
126
5
248
1.98
121 206357
3.5
5.7E-07 6.56E-04
66
68
4
249
1.58
62
EPHB2, MBP, RTN4R
ATP6V0A4, PDK4, SLC9A3
NFIA, CCND1, AANAT, ACACB,
TGFBR2
TCF7L2, SMURF1, TRIM33, HTRA1
4
1.5E-06 1.22E-03
apoptotic process involved in patterning of blood
vessels(GO:1902262)
atrioventricular valve
morphogenesis(GO:0003181)
cellular response to starvation(GO:0009267)
cellular response to unfolded
protein(GO:0034620)
central nervous system
development(GO:0007417)
dendrite morphogenesis(GO:0048813)
embryonic digit morphogenesis(GO:0042733)
glucose homeostasis(GO:0042593)
206416
SPI1, LRP5
HOXA3, RHOB, TNFAIP2, EPHB2,
NAA15, TMEM100
odds pvalue
adj
ratio log
pvalue
6.3
angiogenesis(GO:0001525)
206475
List pos IDs
CHD7, PARK2, GSTP1, MBP,
ROBO2
SEMA3A, DSCAM, DCDC2
WDPCP, LRP5, KIAA1715
TCF7L2, RFX6, NCOR2, PDK4
CHD7, NCOR2, TGFBR2, ZBTB18,
TMEM100
212
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 8. Ontologías relacionadas con procesos biológicos del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en capas de neuronas piramidales,
identificadas en el subconjunto de hombres.
Funt. Term
skin development(GO:0043588)
somatic stem cell maintenance(GO:0035019)
tissue regeneration(GO:0042246)
transforming growth factor beta receptor signaling
pathway(GO:0007179)
Term
size L
Term
size G
List
pos
List
neg
List %
G G neg
pos
70
59
24
72
59
27
3
3
4
250
250
249
1.19
1.19
1.58
67
56
20
206411
206422
206458
350
354
5
248
1.98
345 206133
List pos IDs
ASPRV1, TCF7L2, JUP
TCF7L2, SPI1, LRP5
TM4SF4, GAP43, NINJ2, NINJ1
GDF15, NCOR2, SMURF1, TGFBR2,
TRIM33
odds pvalue
adj
ratio log
pvalue
3.6
3.8
5.1
9.3E-05 1.99E-02
5.6E-05 1.61E-02
2.3E-08 1.31E-04
2.5
8.0E-05 1.81E-02
Análisis realizado usando la herramienta FatigoBabelomics. Abreviaturas. Funt. Term: Identificador del término de agrupamiento funcional. Term size L: Número
de identificadores anotados para ese término. Term size G: tamaño global del término en cuestión en el genoma completo. List pos: número de identificadores de
la lista anotado para el término funcional. List neg: número de identificadores de la lista no anotados para el término funcional. List %: porcentaje de identificadores
de la lista anotada para el término funcional. G pos: número de identificadores en el genoma, anotados para el término funcional. G neg: número de identificadores
en el genoma, no anotados para el término funcional. G %: porcentaje de identificadores dentro del genoma para el término funcional. List pos IDs: símbolos de
identificadores en la lista, anotados al término funcional. odds ratio log: logaritmo de la tasa de probabilidad o «ods ratio» entre el enriquecimiento en el término
funcional para la lista en relación al genoma completo. p-value: valor p de la prueba exacta de Fisher. adj pvalue: valor p de la prueba exacta de Fisher luego de
usar la corrección para pruebas múltiples de Benjamini & Hochberg. Se muestran resultados con valor de p ajustado <0.02. Se subrayan resultados mencionados
en la discusión, para facilitar su localización.
213
Anexo 9. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes
diferencialmente hipemetilados en EA en capas de neuronas piramidales, análisis en subconjunto hombres
Category
Term
Count
l%
PValue
List
Total
Pop
Hits
Pop
Total
Fold
Enrich
ment
Bonf
UCSC_TFBS
HFH3
130
53
4.69E-12
232
6613
19536
1.66
8.30E-10
UCSC_TFBS
TST1
132
53
4.99E-10
232
7189
19536
1.55
8.82E-08
UCSC_TFBS
CART1
136
55
5.71E-09
232
7757
19536
1.48
1.01E-06
UCSC_TFBS
FOXO4
149
60
1.20E-08
232
8925
19536
1.41
2.13E-06
UCSC_TFBS
FOXD3
106
43
1.48E-08
232
5509
19536
1.62
2.62E-06
UCSC_TFBS
OCT
130
53
7.94E-08
232
7554
19536
1.45
1.41E-05
UCSC_TFBS
TBP
106
43
1.18E-07
232
5716
19536
1.56
2.08E-05
UCSC_TFBS
NKX61
123
50
1.57E-07
232
7068
19536
1.47
2.78E-05
UCSC_TFBS
S8
127
51
2.57E-07
232
7446
19536
1.44
4.56E-05
UCSC_TFBS
LHX3
108
44
3.56E-07
232
5987
19536
1.52
6.31E-05
UCSC_TFBS
FOXO3
87
35
3.59E-07
232
4429
19536
1.65
6.36E-05
UCSC_TFBS
FREAC2
96
39
1.28E-06
232
5220
19536
1.55
2.26E-04
UCSC_TFBS
NFE2
100
40
8.08E-06
232
5738
19536
1.47
1.43E-03
UCSC_TFBS
HSF1
88
36
1.31E-05
232
4890
19536
1.52
2.32E-03
UCSC_TFBS
STAT5B
93
38
2.13E-05
232
5326
19536
1.47
3.77E-03
UCSC_TFBS
AP1FJ
85
34
3.30E-05
232
4779
19536
1.50
5.82E-03
UCSC_TFBS
CEBPA
82
33
4.62E-05
232
4598
19536
1.50
8.15E-03
UCSC_TFBS
TAL1BETAE47
84
34
2.57E-05
232
4674
19536
1.51
4.54E-03
UCSC_TFBS
GATA6
55
22
3.16E-05
232
2642
19536
1.75
5.59E-03
UCSC_TFBS
TAL1BETAITF2
141
57
2.01E-06
232
8860
19536
1.34
3.55E-04
UCSC_TFBS
SRY(SOX2)
116
47
2.12E-06
232
6819
19536
1.43
3.75E-04
UCSC_TFBS
IK3
121
49
2.64E-06
232
7246
19536
1.41
4.68E-04
UCSC_TFBS
FREAC7
129
52
3.51E-06
232
7933
19536
1.37
6.20E-04
UCSC_TFBS
CDC5
121
49
3.84E-06
232
7294
19536
1.40
6.80E-04
UCSC_TFBS
CHX10
115
47
3.95E-06
232
6818
19536
1.42
6.99E-04
UCSC_TFBS
E4BP4
118
48
4.05E-06
232
7060
19536
1.41
7.16E-04
UCSC_TFBS
HFH1
121
49
5.55E-06
232
7342
19536
1.39
9.81E-04
UCSC_TFBS
FREAC4
123
50
6.08E-06
232
7516
19536
1.38
1.08E-03
UCSC_TFBS
RSRFC4
125
51
6.23E-06
232
7682
19536
1.37
1.10E-03
UCSC_TFBS
TATA
139
56
7.74E-06
232
8874
19536
1.32
1.37E-03
UCSC_TFBS
NFAT
113
46
7.74E-06
232
6746
19536
1.41
1.37E-03
UCSC_TFBS
E2F
145
59
9.31E-06
232
9411
19536
1.30
1.65E-03
UCSC_TFBS
MRF2
132
53
1.01E-05
232
8325
19536
1.34
1.79E-03
UCSC_TFBS
TGIF
114
46
1.21E-05
232
6885
19536
1.39
2.14E-03
UCSC_TFBS
SOX5
126
51
1.23E-05
232
7857
19536
1.35
2.18E-03
UCSC_TFBS
MSX1
111
45
3.03E-05
232
6772
19536
1.38
5.35E-03
UCSC_TFBS
NKX3A
121
49
3.06E-05
232
7578
19536
1.34
5.41E-03
214
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
UCSC_TFBS
IRF7
119
48
2.19E-05
232
7368
19536
1.36
3.88E-03
UCSC_TFBS
NFKAPPAB
98
40
2.45E-05
232
5726
19536
1.43
4.33E-03
UCSC_TFBS
MEIS1B,HOXA9
129
52
3.55E-05
232
8257
19536
1.32
6.27E-03
UCSC_TFBS
HLF
108
44
3.70E-05
232
6562
19536
1.39
6.53E-03
UCSC_TFBS
NCX
117
47
4.70E-05
232
7316
19536
1.35
8.29E-03
UCSC_TFBS
CREBP1
122
49
4.72E-05
232
7723
19536
1.33
8.32E-03
UCSC_TFBS
COMP1
127
51
5.35E-05
232
8153
19536
1.31
9.43E-03
UCSC_TFBS
POU3F2
146
59
5.90E-05
232
9773
19536
1.26
1.04E-02
UCSC_TFBS
BRACH
138
56
6.30E-05
232
9099
19536
1.28
1.11E-02
UCSC_TFBS
HOXA3
109
44
6.59E-05
232
6724
19536
1.37
1.16E-02
UCSC_TFBS
HNF3B
108
44
6.99E-05
232
6653
19536
1.37
1.23E-02
UCSC_TFBS
MEIS1A,HOXA9
95
38
7.10E-05
232
5638
19536
1.42
1.25E-02
UCSC_TFBS
GFI1
115
47
8.68E-05
232
7246
19536
1.34
1.53E-02
UCSC_TFBS
ROR4A2
121
49
8.70E-05
232
7734
19536
1.32
1.53E-02
UCSC_TFBS
RP58
131
53
8.82E-05
232
8563
19536
1.29
1.55E-02
UCSC_TFBS
BACH1
127
51
9.16E-05
232
8236
19536
1.30
1.61E-02
UCSC_TFBS
CDP
147
60
1.04E-04
232
9950
19536
1.24
1.82E-02
UCSC_TFBS
FREAC3
111
45
1.06E-04
232
6955
19536
1.34
1.86E-02
UCSC_TFBS
IRF2
107
43
1.10E-04
232
6641
19536
1.36
1.93E-02
Abreviaturas. Se utiliza el sistema de anotación utilizado en la base de datos NIH/NIAID para anotación,
visualización y descubrimiento Integrado (DAVID). Convenciones: «Category»: Agrupación funcional. «TFBS
UCSC»: sitios de unión a factores de transcripción de la base UCSC asociados a los resultados. «Count»: Se
refiere al número de genes «alterados» dentro de cada ontología y su porcentaje correspondiente. P value: es
el resultante de la prueba exacta de Fisher (P ≤ 0.02); «FoldE»: se refiere a la tasa de enriquecimiento
encontrado en la lista de resultados positivos en comparación con el enriquecimiento de esa ontología en el
genoma completo. List Total: se refiere al número toral de genes anotados dentro delos resultados positivos;
Pop Hits y Pop Total, se refiere al número de genes en la base de daos para la categoría y en general.
Bonferroni: valor P corregido mediante el método de Bonferroni para alejar la probabilidad de altos
descubrimientos. Punto de corte P<0.02 luego de corrección de Bonferroni. La línea horizontal destaca los
resultados por encima de ella con un enriquecimientoFoldE ⪆1.5. Se subrayan resultados mencionados en el
texto para facilitar su localización.
ANEXOS
215
Anexo 10. Resultados de clasificación funcional de genes encontrados diferencialmente hipermetilados en
EA en capas de neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID»,
análisis del subconjunto de hombres.
Gene Group 1
Gene Symbol
ANKRD44
ANK1
ANKRD17
ANKFY1
Gene Group 2
Gene Symbol
EPHB2
MAP4K4
PRKG1
AATK
PDK4
CHUK
FUK
MYLK
DDR2
MAP4K1
FRK
EIF2AK4
EPHA6
Gene Group 3
Gene Symbol
DUXA
NFIA
MKX
NKX6-3
TSC22D1
VENTX
HOXA3
HOXA5
RFX6
Gene Group 4
Gene Symbol
PCDHA3
HLA-DPA1
PRRT1
SLC6A15
TMC1
SPPL2B
TMEM100
RHBDD1
GPR133
OR6C68
TMEM190
GPR37L1
NINJ1
SLC44A2
CDH19
TM4SF4
PCDHA2
IL18R1
PLXDC2
Enrichment Score: 2.423997895536854
Gene Name (ankyrin repeat domain)
ankyrin repeat domain 44
ankyrin 1, erythrocytic
ankyrin repeat domain 17
ankyrin repeat and FYVE domain containing 1
Enrichment Score: 1.1728626125737227
Gene Name (Protein kinase, ATP binding site/serine-threonine-protein kinase)
EPH receptor B2
mitogen-activated protein kinase 4
protein kinase, cGMP-dependent, type I
apoptosis-associated tyrosine kinase
pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4
conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase
fucokinase
myosin light chain kinase
discoidin domain receptor tyrosine kinase 2
mitogen-activated protein kinase 1
fyn-related kinase
eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 4
EPH receptor A6
Enrichment Score: 1.1375734495946646
Gene Name (Homeobox/DNA-binding region/regulation of transcription, DNA-dependent)
double homeobox A
nuclear factor I/A
mohawk homeobox
NK6 homeobox 3
TSC22 domain family, member 1
VENT homeobox homolog (Xenopus laevis)
homeobox A3
homeobox A5
regulatory factor X, 6
Enrichment Score: 1.0828346543705196
Gene Name (Integral to membrane)
protocadherin alpha 3
major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
proline-rich transmembrane protein 1
solute carrier family 6 (neutral amino acid transporter), member 15
transmembrane channel-like 1
signal peptide peptidase-like 2B
transmembrane protein 100
rhomboid domain containing 1
G protein-coupled receptor 133
olfactory receptor, family 6, subfamily C, member 68
transmembrane protein 190
G protein-coupled receptor 37 like 1
ninjurin 1
solute carrier family 44, member 2
cadherin 19, type 2
transmembrane 4 L six family member 4
protocadherin alpha 2
interleukin 18 receptor 1
plexin domain containing 2
216
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ASPRV1
NINJ2
HLA-DPB1
GPR123
PPAP2C
TMPRSS11F
CLDN4
CLEC4C
RGS9BP
ENPP4
KIAA1715
MAS1L
PCDHA1
ITGA10
UGT2A1
LRRC37BP1
Gene Group 5
Gene Symbol
LINGO3
GPR37L1
IL18R1
BOC
PLXDC2
DSCAM
IL1RL1
Gene Group 6
Gene Symbol
WDR27
DCAF6
AMBRA1
WDR20
ATG16L2
WDR66
Gene Group 7
Gene Symbol
CST8
CFHR4
LAIR2
DEFB112
RNASE9
GDF15
Gene Group 8
Gene Symbol
ZBTB18
ZNF816
ZNF385A
TFEB
ZNF826P
TRIM24
NRL
ZBTB1
CXXC1
TRIM33
ZNF169
ZNF251
aspartic peptidase, retroviral-like 1
ninjurin 2
major histocompatibility complex, class II, DP beta 1
G protein-coupled receptor 123
phosphatidic acid phosphatase type 2C
transmembrane protease, serine 11F
claudin 4
C-type lectin domain family 4, member C
regulator of G protein signaling 9 binding protein
ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4 (putative function)
KIAA1715
MAS1 oncogene-like
protocadherin alpha 1; protocadherin alpha 4
integrin, alpha 10
UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide A1
leucine rich repeat containing 37, member B2
Enrichment Score: 1.0337644553138836
Gene Name (transmembrane/integral to membrane/Extracellular)
leucine rich repeat and Ig domain containing 3
G protein-coupled receptor 37 like 1
interleukin 18 receptor 1
Boc homolog (mouse)
plexin domain containing 2
Down syndrome cell adhesion molecule
interleukin 1 receptor-like 1
Enrichment Score: 0.7148453285710119
Gene Name (repeat:WD 3,2,2 50 / repeat:WD/autophagy)
WD repeat domain 27
IQ motif and WD repeats 1
autophagy/beclin-1 regulator 1
WD repeat domain 20
ATG16 autophagy related 16-like 2 (S. cerevisiae)
WD repeat domain 66
Enrichment Score: 0.662834325200652
Gene Name (disulfide bond/extracellular region//signal peptide/signal/Secreted)
cystatin 8 (cystatin-related epididymal specific)
complement factor H-related 4
leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 2
defensin, beta 112
ribonuclease, RNase A family, 9 (non-active)
growth differentiation factor 15
Enrichment Score: 0.5356206321599943
Gene Name (regulation of transcription, DNA-dependent)
zinc finger protein 238
zinc finger protein 816ª
zinc finger protein 385ª
transcription factor EB
zinc finger protein 826
tripartite motif-containing 24
neural retina leucine zipper
zinc finger and BTB domain containing 1
CXXC finger 1 (PHD domain)
tripartite motif-containing 33
zinc finger protein 169
zinc finger protein 251
ANEXOS
ZNF107
NCOR2
CREB5
SPI1
217
zinc finger protein 107
nuclear receptor co-repressor 2
cAMP responsive element binding protein 5
spleen focus forming virus (SFFV) proviral integration oncogene spi1
Abreviaturas. Gene Group: Agrupaciones génicas que tienen términos funcionales similares ordenadas de
acuerdo a su puntuación de enriquecimiento. Enrichment Score: puntuación de enriquecimiento génico del
grupo. Gene Symbol: símbolo único de la base de genes de NCBI. Gene Name: nombre del gen de la base
de genes de NCBI. Se subrayan genes mencionados en el texto para facilitar su rápida localización. En
paréntesis se colocan algunos términos relacionados de forma descriptiva no son parte del resultado como
tal del corrido de «gen functional classification / DAVID».
218
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 11. Resultados de clasificación funcional de genes correspondientes a sondas diferencialmente
hipermetiladas para EA encontradas en la intersección del análisis de la muestra total con el del subconjunto
de hombres en capas de neuronas piramidales, usando la herramienta «gen functional classification / DAVID».
Gene Group 1
Gene Symbol
WDR27
AMBRA1
WDR20
ATG16L2
Gene Group 2
Gene Symbol
SLC44A2
LRRC37BP1
ADGRA1
ENPP4
IL18R1
PPAP2C
CLEC4C
MAS1L
PLXDC2
Gene Group 3
Gene Symbol
CST8
FHR4
LAIR2
DEFB112
RNASE9
Gene Group 4
Gene Symbol
ZNF385A
CXXC1
CREB5
ZBTB1
Enrichment Score: 0.750
Gene name (WD repeat domain)
WD repeat domain 27
autophagy/beclin-1 regulator 1
WD repeat domain 20
ATG16 autophagy related 16-like 2 (S. cerevisiae)
Enrichment Score: 0.3817
Gene name (signal transduction )
solute carrier family 44, member 2
leucine rich repeat containing 37, member B2
G protein-coupled receptor 123
ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 4 (putative function)
interleukin 18 receptor 1
phosphatidic acid phosphatase type 2C
C-type lectin domain family 4, member C
MAS1 oncogene-like
plexin domain containing 2
Enrichment Score: 0.3389
Gene name (extracellular region)
cystatin 8 (cystatin-related epididymal specific)
complement factor H-related 4
leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 2
defensin, beta 112
ribonuclease, RNase A family, 9 (non-active)
Enrichment Score: 0.2998
Gene name (regulation of transcription, DNA-dependent)
zinc finger protein 385A
CXXC finger 1 (PHD domain)
cAMP responsive element binding protein 5
zinc finger and BTB domain containing 1
Abreviaturas. Gene Group: Agrupaciones génicas que tienen términos funcionales similares ordenadas de
acuerdo a su puntuación de enriquecimiento. Enrichment Score: puntuación de enriquecimiento génico del
grupo. Gene Symbol: símbolo único de la base de genes de NCBI. Gene Name: nombre del gen de la base de
genes de NCBI. Se subrayan genes mencionados en el texto para facilitar su rápida localización. En paréntesis
se colocan algunos términos relacionados de forma descriptiva no son parte del resultado como tal del corrido
de «gen functional classification / DAVID». Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su
localización.
ANEXOS
219
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
chr12:8543002585430336
chr7:2715484527155548
chr19:1073600610736355
chr18:4781540747815430
chr11:128737300128737467
chr12:104351201104351300
chr7:9522209295222104
chr14:103593503103593520
chr2:233251770233251881
chr4:3633362536333629
chr19:5606133456061348
chr19:3908713539087186
chr2:151284413151284413
chr17:4670985846709858
chr17:4202972742029727
chr5:22253232225482
chr8:142986649142986670
chr1:100681010100681102
chr2:192161142192161142
chr12:5813168158131768
chr7:2715358027153663
chr5:177436178177436178
chr17:6603055366030553
chr5:9065419190654191
chr18:2902630129026303
chr4:186350505186350559
chr1:160856347160856352
chr11:79512167951221
chr1:115003633115003638
chr11:4643942046439420
chr17:38481563848169
chr2:127811805127811853
width
gene assoc
group
#p
minpval
mean
pval
maxbe mean
tafc Dbeta
312
TSPAN19,
LRRIQ1
1stExon,5'UTR,TSS
10
200,TSS1500
5.30E-24
1.55E-13
-0.17
-0.084
704
HOXA3
5'UTR,TSS1500
9
4.61E-23
4.16E-04
0.12
0.065
350
SLC44A2
TSS200,Body,5'UT
R,1stExon
7
6.23E-21
9.01E-07
0.10
0.072
24
CXXC1
TSS1500
3
1.76E-12
1.77E-12
0.14
0.104
168
KCNJ1
TSS200
6
7.04E-12
3.84E-09
0.13
0.060
100
C12orf73
TSS1500
3
1.42E-09
5.68E-09
-0.08
-0.065
13
PDK4
Body
2
1.73E-09
1.80E-09
0.10
0.062
18
TNFAIP2
Body
3
3.26E-08
3.47E-08
0.07
0.060
112
ECEL1P2
TSS200
3
3.46E-08
2.05E-07
0.14
0.120
5
DTHD1
Body
2
1.37E-07
1.38E-07
0.08
0.061
3
4.31E-07
4.58E-07
0.09
0.067
2
5.45E-07
1.78E-06
0.10
0.101
1
6.47E-07
6.47E-07
0.14
0.122
1
6.48E-07
6.48E-07
0.08
0.081
1
1
6.71E-07
6.71E-07
0.11
0.112
160
3
1.05E-06
3.16E-03
0.11
0.064
22
2
1.33E-06
1.36E-06
0.08
0.060
15
52
MAP4K1
Body
1
1
MIR196A1
Body
93
DBT
Body
2
1.36E-06
2.81E-06
0.09
0.073
1
MYO1B
Body
1
1.47E-06
1.47E-06
0.11
0.090
88
AGAP2
1stExon,Body
2
2.13E-06
8.72E-06
0.09
0.077
84
HOXA3
5'UTR,1stExon,TSS
5
200
2.30E-06
2.43E-06
0.10
0.079
1
FAM153C
1stExon,5'UTR
1
6.16E-06
6.16E-06
0.13
0.107
1
KPNA2
TSS1500
1
6.21E-06
6.21E-06
0.11
0.102
1
6.48E-06
6.48E-06
0.10
0.088
2
1.63E-05
1.63E-05
0.09
0.068
2
1.64E-05
3.17E-05
0.11
0.068
1.68E-05
1.68E-05
0.10
0.071
1.86E-05
1.86E-05
0.20
0.141
1.87E-05
1.87E-05
0.14
0.098
2.21E-05
2.21E-05
0.10
0.098
2.68E-05
3.01E-05
0.08
0.073
0.08
0.064
1
3
DSG3
TSS1500
55
C4orf47
6
ITLN1
TSS200,1stExon,5'
UTR
TSS1500
6
OR10A6
TSS1500
2
6
TRIM33
Body
2
1
AMBRA1
Body
1
14
ATP2A3
Body
2
49
BIN1
Body
2
2
3.07E-05
4.35E-05
220
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
<
50
51
52
53
54
4
56
57
58
59
60
61
62
63
64
chr6:2945656329456577
chr19:10711761071208
chr11:4737675447376754
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221
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
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222
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
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ANEXOS
223
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
129
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224
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
161
162
163
164
165
166
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191
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1
1
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1
MAD1L1
Body
ANEXOS
225
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
193
194
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197
198
199
200
201
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222
223
224
225
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2
4.32E-02
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0.063
226
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 12. 225 Regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales identificadas para la totalidad de la muestra.
hg19 coordinates
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
chr3:182529148182529148
chr12:6855467368554684
chr8:124081578124081578
chr6:6428996964289969
chr2:178042468178042468
chr3:167191837167191873
chr6:154678593154678593
chr18:7755458377554583
chr1:170904596170904596
chr6:9240148692401486
chr5:9106543491065434
chr3:1778531217785312
width
gene assoc
group
#p
minpval
mean
pval
maxbe mean
tafc Dbeta
1
ATP11B
Body
1
4.33E-02
4.33E-02
0.10
0.085
12
IFNG
TSS1500
2
4.39E-02
4.43E-02
0.08
0.060
1
4.59E-02
4.59E-02
0.10
0.087
1
4.62E-02
4.62E-02
0.09
0.085
1
4.64E-02
4.64E-02
0.09
0.073
1
1
PTP4A1
Body
1
37
SERPINI2
TSS200
2
4.68E-02
4.77E-02
0.13
0.100
1
IPCEF1
TSS1500
1
4.74E-02
4.74E-02
0.15
0.126
1
4.78E-02
4.78E-02
0.08
0.063
1
4.81E-02
4.81E-02
0.09
0.075
1
1
4.82E-02
4.82E-02
0.09
0.078
1
1
4.90E-02
4.90E-02
0.08
0.066
1
4.98E-02
4.98E-02
0.09
0.068
1
1
1
C1orf129
TBC1D5
TSS200
TSS1500
Abreviaturas. hg19 coord: coordenadas de localización del genoma humano HG19 de la base de datos del
UCSC genome Browse (Karolchik et al., 2014), compuesta por cromosoma y rango genómico de referencia.
width: corresponde a la amplitud del rango. genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio de
búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 del capítulo 1. group: anotación de localización génica según anotación
original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval: valor p mínimo, de un conjunto de
valores p correspondientes a sondas adyacentes. meanpval: media de valores p, de un conjunto de valores p
correspondientes a sondas adyacentes. Se resaltan resultados mencionados en el texto para facilitar su
localización. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de Bonferroni. maxbetafc:
máximo valor del cambio relativo en número veces de los «valores M» en las sondas que soportan el rango.
mean Dbet: es la diferencia neta entre los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro
«DeltaBetacutoffNetMean».
ANEXOS
227
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
width gene assoc
1
chr8:335522-335677
156
2
chr19:10736006-10736117
3
chr7:27154845-27155173
4
chr12:85430025-85430336
5
chr12:58119915-58120011
6
chr15:40268610-40268777
7
chr16:24857497-24857601
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
chr18:47815407-47815430
chr5:140683632-140683772
chr8:335281-335353
chr11:128737300-128737467
chr2:127811805-127811853
chr7:27155548-27155548
chr19:56061334-56061348
chr14:103593503-103593520
chr12:104351201-104351300
chr18:74799495-74799572
chr3:112929830-112929835
19
chr7:27153580-27153663
20
21
22
23
24
25
26
chr19:39087135-39087186
chr17:46709858-46709858
chr2:233251770-233251881
chr7:27182493-27182637
chr12:54772688-54772804
chr19:18120614-18120819
chr17:42029727-42029727
27
chr15:70994632-70994672
28
29
30
31
chr1:55247356-55247408
chr2:192161142-192161142
chr12:120538681-120538792
chr21:45705618-45705742
32
chr12:58132093-58132105
33
34
35
chr16:89461734-89461803
chr6:29910912-29911104
chr19:44278551-44278628
36
chr12:58131681-58131768
37
38
39
chr12:57869421-57869490
chr1:55247140-55247140
chr6:2961157-2961157
40
chr7:27147513-27147590
41
42
43
44
chr12:131519906-131519998
chr2:233253024-233253024
chr8:142986649-142986670
chr7:27179426-27179432
group
#p minpval
3 3.17E-20
TSS200,Bo
112 SLC44A2
5 6.60E-17
dy
5'UTR,TSS
329 HOXA3
7 8.48E-17
1500
1stExon,5'
UTR,
312 TSPAN19,LRRIQ1
10 2.01E-14
TSS200,TS
S1500
AGAP2,
3'UTR,TSS
97
5 5.70E-14
LOC100130776
200
168 EIF2AK4
3 1.44E-12
Body
TSS200,1st
105 SLC5A11
3 5.01E-11
Exon,5'UT
R
24
CXXC1
3 1.55E-08
TSS1500
141 SLC25A2
7 4.82E-08
TSS200
73
3 7.73E-08
168 KCNJ1
6 1.25E-07
TSS200
49
BIN1
2 2.63E-07
Body
1
HOXA3
5'UTR
1 4.13E-07
15
3 7.13E-07
18
TNFAIP2
3 8.88E-07
Body
100 C12orf73
3 1.00E-06
TSS1500
78
MBP
3 1.06E-06
Body
6
2 1.08E-06
5'UTR,1stE
84
HOXA3
xon,TSS20 5 1.54E-06
0
52
MAP4K1
2 1.78E-06
Body
1
MIR196A1
Body
1 2.07E-06
112 ECEL1P2
3 2.21E-06
TSS200
145 HOXA5
2 2.24E-06
Body
117 ZNF385A
2 2.32E-06
Body
206 ARRDC2
5 2.85E-06
Body
1
1 3.04E-06
Body,TSS2
41
UACA
2 3.27E-06
00
53
TTC22
2 8.52E-06
Body
1
MYO1B
Body
1 9.75E-06
112 RAB35
2 1.00E-05
Body
125 AIRE
7 1.03E-05
TSS200
TSS200,Bo
13
AGAP2
2 1.17E-05
dy
70
ANKRD11
2 1.28E-05
5'UTR
193 HLA-A
10 1.69E-05
Body
78
KCNN4
2 2.03E-05
Body
1stExon,Bo
88
AGAP2
2 2.09E-05
dy
70
ARHGAP9
2 2.50E-05
Body
1
TTC22
Body
1 2.54E-05
1
SERPINB6
5'UTR
1 3.85E-05
3'UTR,Bod
78
HOXA3
2 4.65E-05
y
93
GPR133
2 4.71E-05
Body
1
ECEL1P2
TSS1500
1 4.73E-05
22
2 5.79E-05
7
2 6.50E-05
2.29E-16
max netmean di
betafc Dbeta
r
↑
0.10 0.07
↑
0.10 0.08
5.85E-04
0.13
0.07
↑
9.97E-07
-0.15
-0.08
↓
8.01E-13
0.07
0.06
↑
4.93E-08
0.17
0.16
1.83E-10
0.07
0.07
1.59E-08
1.55E-07
6.10E-07
2.77E-04
4.99E-07
4.13E-07
7.14E-07
8.88E-07
5.02E-06
3.58E-06
1.13E-06
0.14
0.11
0.08
0.14
0.09
0.09
0.08
0.07
-0.08
0.09
0.13
0.12
0.06
0.07
0.06
0.08
0.09
0.08
0.06
-0.07
0.08
0.10
1.91E-06
0.10
0.08
2.51E-06
2.07E-06
6.44E-06
1.92E-02
5.14E-03
1.11E-03
3.04E-06
0.10
0.08
0.14
0.08
0.09
0.08
0.13
0.11
0.08
0.13
0.06
0.07
0.06
0.12
4.02E-06
0.07
0.07
9.09E-06
9.75E-06
1.12E-05
2.75E-05
0.10
0.09
0.07
0.11
0.10
0.09
0.06
0.09
1.21E-05
0.11
0.10
1.80E-05
1.12E-04
6.90E-05
0.07
-0.16
0.12
0.07
-0.09
0.09
5.06E-04
0.09
0.07
3.54E-04
2.54E-05
3.85E-05
0.08
0.08
0.10
0.06
0.08
0.09
1.91E-04
0.08
0.07
↑
↑
↑
↑
6.85E-05
4.73E-05
5.89E-05
6.86E-05
0.10
0.12
0.08
0.08
0.09
0.12
0.08
0.08
↑
↑
↑
↑
meanpval
5.11E-07
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↓
↑
↑
228
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
width gene assoc
group
45
46
47
48
chr17:78079608-78079795
chr9:97022269-97022269
chr4:36333625-36333629
chr7:27146237-27146262
188
1
5
26
GAA
ZNF169
DTHD1
HOXA3
49
chr19:10736299-10736355
57
SLC44A2
Body
5'UTR
Body
3'UTR
5'UTR,1stE
xon,Body
50
51
52
53
54
chr7:2660962-2660962
chr11:70256556-70256681
chr2:70188512-70188605
chr7:127911258-127911367
chr11:46439420-46439420
1
126 CTTN
94
ASPRV1
110
1
AMBRA1
55
chr5:102898648-102898733
86
NUDT12
56
chr9:34457440-34457500
61
C9orf25, DNAI1
57
58
chr2:151284413-151284413
chr19:1071176-1071208
1
33
HMHA1
59
chr22:31318103-31318373
271 C22orf27
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
chr12:76474635-76474635
chr2:63662027-63662027
chr8:25217537-25217537
chr11:47376754-47376754
chr10:53635551-53635551
chr17:3848156-3848169
chr6:37012640-37012716
chr12:9903429-9903454
chr7:9053450-9053450
chr12:107974897-107974897
chr7:29233468-29233476
1
1
1
1
1
14
77
26
1
1
9
NAP1L1
C2orf86
DOCK5
SPI1
PRKG1
ATP2A3
71
chr2:20648194-20648194
1
RHOB
72
chr7:27162294-27162401
108 HOXA3
73
chr9:117264095-117264095
1
74
75
76
chr8:216578-216788
chr2:109030597-109030597
chr6:152130058-152130207
211
1
150 ESR1
77
chr10:102222582-102222660
79
WNT8B
78
79
80
81
82
83
84
chr19:6334625-6334635
chr11:128560240-128560328
chr5:90654191-90654191
chr6:166445460-166445460
chr2:102379567-102379567
chr6:29456563-29456577
chr14:96563269-96563269
11
89
1
1
1
15
1
ACER1
Body
TSS1500,T
SS200
TSS1500
MAP4K4
MAS1L
Body
TSS1500
85
chr3:195310883-195310936
54
APOD
86
chr1:2005132-2005260
129 PRKCZ
87
88
chr8:19092406-19092406
chr5:2225401-2225482
1
82
89
chr9:33474169-33474169
1
SUGT1P1,NOL6
90
chr17:43318900-43318900
1
FMNL1
BTBD11
CHN2
DFNB31
Body
1stExon
Body
TSS200,TS
S1500
Body,TSS1
500
Body
TSS200,Bo
dy
5'UTR
Body
Body
3'UTR
Body
Body
Body
TSS1500
1stExon,3'
UTR
5'UTR
Body,5'UT
R
1stExon,5'
UTR
1stExon,Bo
dy, 5'UTR
Body,TSS1
500
Body
5
1
2
2
6.81E-05
8.60E-05
9.83E-05
1.02E-04
6.99E-03
8.60E-05
9.84E-05
1.72E-04
2
1.11E-04
1.36E-04 0.08
netmean di
Dbeta
r
↑
0.07
↑
0.13
↑
0.06
↑
0.07
↑
0.07
1
3
3
2
1
1.22E-04
1.24E-04
1.33E-04
1.43E-04
1.52E-04
1.22E-04
3.58E-04
2.42E-04
2.92E-03
1.52E-04
0.08
0.07
0.06
0.06
0.11
3
1.77E-04
2.39E-04 -0.12
-0.08
↑
↑
↑
↑
↑
↓
2
1.82E-04
6.25E-04 0.07
0.06
↑
1
2
1.93E-04
2.09E-04
1.93E-04 0.13
2.21E-04 0.11
0.12
0.10
7
2.15E-04
4.21E-03 0.11
0.08
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
2
2.32E-04
2.33E-04
2.64E-04
2.86E-04
2.91E-04
3.09E-04
3.21E-04
3.62E-04
3.86E-04
4.01E-04
4.23E-04
2.32E-04
2.33E-04
2.64E-04
2.86E-04
2.91E-04
3.38E-04
2.82E-03
3.93E-04
3.86E-04
4.01E-04
4.28E-04
-0.09
0.08
0.18
0.07
0.06
0.07
0.07
-0.08
0.10
0.14
0.07
1
4.99E-04
4.99E-04 0.09
0.10
2
5.12E-04
4.86E-03 0.07
0.07
1
5.31E-04
5.31E-04 0.09
0.09
4
1
2
5.39E-04
5.45E-04
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↑
↑
↑
↑
↑
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↑
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↓
↑
↑
↑
ANEXOS
229
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
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Body
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y
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↑
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↑
↑
↑
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↑
↑
↑
↑
↑
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↓
↑
↑
↓
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↑
↑
↑
↑
↑
#p minpval
meanpval
230
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
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group
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Body
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Body,3'UT
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↑
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↑
↑
↑
↑
ANEXOS
231
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
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↑
232
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
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↑
↑
↑
↓
↑
1
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2.75E-02
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2.78E-02
2.80E-02
2.86E-02
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0.07
0.07
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↑
↑
↑
↑
↑
↑
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↑
↑
ANEXOS
233
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
width gene assoc
chr2:127868745-127868745
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1
MKX
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Body
TSS200
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Body
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RGS10
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Body
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TSS1500
3'UTR
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Body
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ELF1
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Body
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Body
Body
Body
Body
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1stExon,5'
UTR,Body
TSS1500
Body,3'UT
R
3'UTR
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TSS200
1stExon,Bo
dy
Body
Body
Body
TSS200
TSS1500
Body
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↑
↑
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↓
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↓
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↓
-0.14
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↑
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↑
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↑
↑
↑
↑
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↑
↑
234
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
width gene assoc
338 chr17:2626991-2626991
339 chr12:124832755-124832755
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group
Body
5'UTR
1stExon,3'
UTR
Body
Body
TSS200
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DENND1C
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500,TSS20
0
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EPHA2
PHTF1
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Body
Body
Body
5'UTR
ENAH
EPHA6
BMI1
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1
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Body
Body
3'UTR
5'UTR
Body,5'UT
R
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1
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365
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1
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DGKD
SLC25A16
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Body
5'UTR,1stE
xon,
Body
Body
Body
Body
Body
TSS1500
WDR11
SCHIP1
CYP2C8
Body
Body
TSS1500
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1
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1
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1
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1
1
1
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EFS
PTP4A1
TSS1500
1stExon,3'
UTR
TSS200
Body,5'UT
R
TSS1500
Body
MYCBP2
TBC1D16
Body
Body
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MOBP
5'UTR,1stE
xon,Body
chr19:6477033-6477033
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chr17:77924371-77924371
chr7:139995984-139995984
384 chr3:39509081-39509081
SMC4,MIR162,MIR15B
MLL3
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1
1
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2
1
3.95E-02
3.98E-02
3.98E-02
3.99E-02
3.95E-02
3.98E-02
4.29E-02
3.99E-02
-0.22
0.08
-0.13
0.15
1
4.00E-02
4.00E-02 0.10
0.09
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4.00E-02
4.02E-02
4.02E-02
4.03E-02
4.07E-02
4.08E-02
4.09E-02
4.10E-02
4.12E-02
4.14E-02
4.15E-02
4.15E-02
4.00E-02
4.02E-02
4.02E-02
4.03E-02
4.07E-02
4.08E-02
4.09E-02
4.10E-02
4.12E-02
4.14E-02
4.15E-02
4.15E-02
0.09
0.06
0.07
0.06
0.09
0.07
0.08
0.08
0.07
0.09
0.10
0.08
0.09
0.06
0.07
0.06
0.08
0.06
0.07
0.07
0.07
0.08
0.08
0.07
1
4.15E-02
4.15E-02 0.11
0.11
1
2
1
4.15E-02
4.16E-02
4.16E-02
4.15E-02 0.08
4.31E-02 0.09
4.16E-02 0.07
0.08
0.07
0.06
↑
↑
↑
1
4.17E-02
4.17E-02 -0.08
-0.07
↓
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
4.18E-02
4.20E-02
4.24E-02
4.32E-02
4.32E-02
4.35E-02
4.40E-02
4.40E-02
4.47E-02
4.50E-02
4.50E-02
4.25E-02
4.20E-02
4.24E-02
4.32E-02
4.32E-02
4.35E-02
4.40E-02
4.40E-02
4.48E-02
4.50E-02
4.50E-02
0.07
0.08
0.13
0.06
0.10
0.09
0.08
0.08
0.13
0.16
0.06
0.07
0.07
0.12
0.06
0.09
0.08
0.07
0.07
0.12
0.14
0.06
1
4.51E-02
4.51E-02 0.07
0.07
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
2
4.51E-02
4.59E-02 0.09
0.07
1
4.55E-02
4.55E-02 0.07
0.07
↑
↑
1
1
1
1
1
1
4.56E-02
4.58E-02
4.58E-02
4.60E-02
4.62E-02
4.62E-02
4.56E-02
4.58E-02
4.58E-02
4.60E-02
4.62E-02
4.62E-02
0.06
0.10
0.09
0.08
0.07
0.08
0.06
0.09
0.09
0.06
0.07
0.07
↑
↑
↑
↑
↑
↑
1
4.63E-02
4.63E-02 0.08
0.07
↑
#p minpval
meanpval
-0.23
0.09
-0.13
0.15
↓
↑
↓
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
ANEXOS
235
Anexo 13. 395 regiones genómicas diferencialmente metiladas del análisis de metilación regional diferencial
(DMR) en EA en capas de neuronas piramidales corticales, análisis del subconjunto de hombres.
hg19 coord
width gene assoc
chr13:77063526-77063526
chr17:54853771-54853771
chr22:20252617-20252617
chr6:137315116-137315116
chr5:140712209-140712209
chr5:74199422-74199422
chr14:24563095-24563095
chr1:3266440-3266440
chr13:38370060-38370060
1
1
1
1
1
1
1
1
1
394 chr3:180644451-180644451
1
395 chr5:74908170-74908170
1
385
386
387
388
389
390
391
392
393
group
RTN4R
NHEG1
PCDHGA1
Body
TSS1500
1stExon
PCK2
PRDM16
TRPC4
TSS1500
Body
5'UTR
Body,5'UT
R
FXR1
#p minpval
meanpval
1
1
1
1
1
1
1
1
1
4.68E-02
4.68E-02
4.79E-02
4.80E-02
4.81E-02
4.87E-02
4.93E-02
4.93E-02
4.95E-02
4.68E-02
4.68E-02
4.79E-02
4.80E-02
4.81E-02
4.87E-02
4.93E-02
4.93E-02
4.95E-02
max
betafc
0.09
0.13
0.07
0.08
0.12
0.08
0.09
0.07
0.08
1
4.99E-02
4.99E-02
0.07
netmean di
Dbeta
r
↑
0.09
↑
0.11
↑
0.07
↑
0.07
↑
0.11
↑
0.07
↑
0.09
↑
0.07
↑
0.07
↑
0.06
1
4.99E-02
4.99E-02
0.12
0.11
↑
Las filas destacadas en negrilla marcan las regiones con dos o más CpGs continuas y concordantes en dirección.
Abreviaturas. Chr: cromosoma. «start» y «end»: coordenadas hg19 para inicio y final de los rangos. width:
corresponde a la amplitud del rango. genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio del
asignación de acuerdo a la búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 del capítulo 1. group: anotación de
localización génica según anotación original de illumina. #p: número de sondas que soportan el rango. minpval:
valor p mínimo, de un conjunto de valores p correspondientes a sondas adyacentes. meanpval: media de valores
p, de un conjunto de valores p correspondientes a sondas adyacentes. maxbetafc: valor del cambio relativo en
número veces de los «valores M» en las sondas que soportan el rango. Netmean Dbeta: es la diferencia neta
entre los valores Beta del grupo CT y del grupo EA hallada mediante el filtro «DeltaBetacutoffNetMean» en
promedio para las sondas que conforman el rango. dir: flecha roja ↑ o verde ↓, indican la presencia de aumento
o disminución de metilación en EA. Se resaltan resultados mencionados en el texto para facilitar su localización.
236
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 14. Rangos diferencialmente metilados en EA en capas de neuronas piramidales corticales, en
intersección entre el análisis de la totalidad de la muestra y el del subconjunto de hombres.
Chr
start
end
with
genes assoc.
chr1
61549982
61549982
1
NFIA
Body
6.02E-03
↑
chr1
100681010
100681102
93
DBT
Body
2.81E-06
↑
chr1
115003633
115003638
6
TRIM33
Body
1.87E-05
↑
chr1
145525223
145525223
1
ITGA10
Body
1.09E-03
↑
chr1
160856347
160856352
6
ITLN1
TSS1500
1.68E-05
↑
chr1
243391613
243391613
1
CEP170
5'UTR
3.94E-03
↑
chr2
11813553
11813553
1
1.32E-02
↑
chr2
20648194
20648194
1
1.15E-04
↑
chr2
55281781
55281781
1
3.77E-03
↑
chr2
63662027
63662027
1
5.19E-05
↑
chr2
66926669
66926669
1
5.57E-03
↑
chr2
102927898
102927898
1
1.42E-03
↑
chr2
109030597
109030597
1
1.70E-03
↑
chr2
127811805
127811853
49
4.35E-05
↑
chr2
151284413
151284413
1
6.47E-07
↑
chr2
156787418
156787418
1
3.59E-02
↑
chr2
175693153
175693153
1
CHN1
Body
1.58E-02
↑
chr2
176793622
176793622
1
KIAA1715
3'UTR
1.25E-02
↑
chr2
178042468
178042468
1
4.64E-02
↑
chr2
192161142
192161142
1
MYO1B
Body
1.47E-06
↑
chr2
203733187
203733187
1
ICA1L
5'UTR
1.05E-02
↑
chr2
233251770
233251881
112
ECEL1P2
TSS200
2.05E-07
↑
chr2
233252170
233252170
1
ECEL1P2
TSS1500
5.05E-03
↑
chr2
233253024
233253024
1
ECEL1P2
TSS1500
1.79E-02
↑
chr3
15841404
15841404
1
ANKRD28
Body
5.07E-03
↑
chr3
17785312
17785312
1
TBC1D5
TS
S1500
4.98E-02
↑
chr3
39509081
39509081
1
MOBP
5'UTR,1stExon,
Body
2.53E-02
↑
chr3
68992252
68992252
1
3.32E-04
↑
chr3
97158712
97158712
1
EPHA6
5'UTR,Body
2.28E-03
↑
chr3
129261478
129261478
1
H1FOO
TSS1500
6.15E-03
↑
SMC4,MIR15B,
MIR16-2
Body,TSS1500,
TSS200
2.95E-03
↑
RHOB
C2orf86
IL1RL1
BIN1
group
1stExon,3'UTR
Body
TSS200
Body
Admeanpval
dir
chr3
16022245
160122245
1
chr3
171728208
171728208
1
7.12E-03
↑
chr3
174539089
174539089
1
3.35E-02
↑
chr4
22590411
22590411
1
2.43E-02
↑
chr4
26806179
26806179
1
2.09E-02
↑
chr4
36333625
36333629
5
DTHD1
Body
1.38E-07
↑
chr4
56496836
56496836
1
NMU
Body
2.04E-02
↑
chr4
69312514
69312514
1
TMPRSS11E
TSS1500
2.62E-04
↑
C4orf47
TSS200,
1stExon, 5'UTR
3.17E-05
↑
3.16E-03
↑
chr4
186350505
186350559
55
chr5
2225401
2225482
82
ANEXOS
237
Anexo 14. Rangos diferencialmente metilados en EA en capas de neuronas piramidales corticales, en
intersección entre el análisis de la totalidad de la muestra y el del subconjunto de hombres.
Chr
start
end
with
chr5
17664567
17664567
1
chr5
39284814
39284814
1
genes assoc.
group
C9
3'UTR
Admeanpval
dir
2.97E-02
↑
1.67E-03
↑
chr5
90654191
90654191
1
6.48E-06
↑
chr5
102465317
102465432
116
HISPPD1
1stExon,Body
7.25E-04
↑
chr5
177436178
177436178
1
FAM153C
1stExon,5'UTR
6.16E-06
↑
chr5
180622446
180622446
1
TRIM7
Body
1.66E-02
↑
chr6
362095
362095
1
2.96E-03
↑
chr6
2961157
2961157
1
SERPINB6
5'UTR
1.18E-02
↑
FARS2
Body
2.45E-03
↑
9.40E-03
↑
chr6
5431669
5431669
1
chr6
24362928
24362928
1
chr6
26970375
26970418
44
C6orf41
Body
1.75E-04
↑
chr6
29456563
29456577
15
MAS1L
TSS1500
3.24E-05
↑
chr6
46110412
46110412
1
ENPP4
Body
2.13E-02
↑
chr6
64289969
64289969
1
PTP4A1
Body
4.62E-02
↑
chr6
109614293
109614293
1
CCDC162
TSS1500
7.07E-03
↑
chr6
121755296
121755306
11
GJA1
TSS1500
7.60E-03
↑
chr6
137315116
137315116
1
NHEG1
TSS1500
3.49E-02
↑
chr6
143661941
143661941
1
2.56E-02
↑
chr6
152130058
152130207
150
2.23E-02
↑
chr7
9053450
9053450
1
4.18E-02
↑
chr7
23623273
23623273
1
7.50E-03
↑
chr7
24627522
24627522
1
MPP6
5'UTR
5.47E-03
↑
chr7
27146237
27146262
26
HOXA3
3'UTR
1.55E-03
↑
chr7
27147513
27147590
78
HOXA3
3'UTR,Body
4.39E-04
↑
chr7
27153580
27153663
84
HOXA3
5'UTR,1stExon,
TSS200
2.43E-06
↑
chr7
27154845
27155173
329
HOXA3
5'UTR,TSS1500
4.16E-04
↑
chr7
27155358
27155358
1
HOXA3
5'UTR
4.16E-04
↑
chr7
27155548
27155548
1
HOXA3
5'UTR
4.16E-04
↑
chr7
27163929
27163929
1
HOXA3
5'UTR
7.92E-03
↑
chr7
27170552
27170554
3
HOXA4
TSS200,TSS1500
1.22E-02
↑
chr7
27179426
27179432
7
6.26E-04
↑
chr7
48108684
48108684
1
2.78E-02
↑
chr7
55712936
55712946
11
3.57E-04
↑
ESR1
LOC442308
Body
TSS1500
chr7
80750194
80750194
1
3.59E-02
↑
chr7
139995984
139995984
1
3.93E-02
↑
chr7
149391785
149391785
1
6.24E-03
↑
chr8
19092406
19092406
1
3.18E-04
↑
chr8
25217537
25217537
1
1.45E-03
↑
chr8
64851070
64851070
1
4.01E-02
↑
chr8
125313940
125313940
1
3.26E-02
↑
chr8
142986649
142986670
22
1.36E-06
↑
chr9
14643897
14643897
1
ZDHHC21
Body
3.60E-02
↑
chr9
34457440
34457440
1
C9orf25,DNAI1
Body,TSS1500
3.10E-03
↑
DOCK5
Body
238
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 14. Rangos diferencialmente metilados en EA en capas de neuronas piramidales corticales, en
intersección entre el análisis de la totalidad de la muestra y el del subconjunto de hombres.
Chr
start
end
with
genes assoc.
chr10
32855610
32855610
1
CCDC7,C10orf68
chr10
70229028
70229028
1
chr10
96830102
96830111
10
chr10
129920257
129920257
1
MKI67
chr10
131631671
131631713
43
group
Admeanpval
dir
Body,TSS1500
8.97E-03
↑
DNA2
Body
2.52E-02
↑
CYP2C8
TSS1500
7.73E-04
↑
Body
2.72E-03
↑
6.50E-04
↑
1.86E-05
↑
9.75E-03
↑
chr11
7951216
7951221
6
chr11
31149217
31149217
1
OR10A6
TSS1500
chr11
46439420
46439420
1
AMBRA1
Body
2.21E-05
↑
chr11
47376754
47376754
1
SPI1
3'UTR
3.53E-05
↑
chr11
67350491
67350499
9
GSTP1
TSS1500
3.67E-02
↑
chr11
73054121
73054185
65
ARHGEF17
Body
2.34E-02
↑
chr11
77299960
77299962
3
AQP11
TSS1500
3.94E-03
↑
chr11
107977510
107977510
1
CUL5
3'UTR
8.55E-03
↑
chr11
122776303
122776303
1
C11orf63
Body,3'UTR
6.98E-04
↑
chr11
128737300
128737467
168
KCNJ1
TSS200
3.84E-09
↑
chr12
495079
495079
1
KDM5A
Body
9.93E-03
↑
chr12
773616
773616
1
NINJ2
TSS1500
1.17E-02
↑
chr12
12673150
12673150
1
DUSP16
Body
5.66E-03
↑
chr12
54772804
54772804
1
ZNF385A
Body
8.14E-03
↑
chr12
58120237
58120237
1
AGAP2, LOC100130776
3'UTR,Body
6.90E-04
↑
chr12
58131681
58131768
88
AGAP2
1stExon,Body
8.72E-06
↑
chr12
58132093
58132105
13
AGAP2
TSS200,Body
7.03E-04
↑
chr12
75057893
75057913
21
3.96E-03
↑
chr12
107348944
107348944
1
C12orf23
TSS1500
1.09E-02
↑
chr12
107974897
107974897
1
BTBD11
Body
1.31E-04
↑
chr12
109678885
109678973
89
ACACB
Body
1.36E-04
↑
chr12
121890864
121890907
44
KDM2B
Body
5.52E-03
↑
chr13
36421844
36421949
106
MIR548F5,DCLK1
Body
2.14E-03
↑
chr13
41593519
41593582
64
ELF1
TSS200
1.03E-04
↑
chr13
77886261
77886261
1
MYCBP2
Body
3.98E-02
↑
chr13
80670608
80670608
1
5.54E-03
↑
chr14
23835870
23835870
1
EFS
TSS1500
8.23E-03
↑
chr14
54182750
54182750
1
1.75E-03
↑
chr14
64989846
64989846
1
ZBTB1
Body
1.60E-03
↑
chr14
102604722
102604722
1
WDR20,HSP90AA1
TSS1500,Body
2.48E-03
↑
chr14
103593503
103593520
18
TNFAIP2
Body
3.47E-08
↑
chr15
40423445
40423445
1
3.14E-03
↑
chr15
53910786
53910786
1
WDR72
Body
1.34E-04
↑
chr16
67687392
67687392
1
RLTPR
Body
2.26E-02
↑
chr17
3848156
3848169
14
ATP2A3
Body
3.01E-05
↑
chr17
30676863
30676863
1
ZNF207,MIR632
TSS1500
9.72E-04
↑
chr17
39930302
39930302
1
JUP
5'UTR
1.42E-04
↑
ANEXOS
239
Anexo 14. Rangos diferencialmente metilados en EA en capas de neuronas piramidales corticales, en
intersección entre el análisis de la totalidad de la muestra y el del subconjunto de hombres.
Chr
start
end
with
genes assoc.
group
Admeanpval
dir
chr17
42029727
42029727
1
6.71E-07
↑
chr17
43318900
43318900
1
FMNL1
Body
8.60E-05
↑
chr17
46709858
46709858
1
MIR196A1
Body
6.48E-07
↑
chr17
548537471
54853771
1
8.21E-03
↑
chr17
66030553
66030553
1
KPNA2
TSS1500
6.21E-06
↑
chr18
21195665
21195665
1
ANKRD29
Body
5.92E-03
↑
chr18
29026301
29026303
3
DSG3
TSS1500
1.63E-05
↑
chr18
47815407
47815430
24
CXXC1
TSS1500
1.77E-12
↑
chr18
55400078
55400167
90
ATP8B1
TSS1500
3.60E-03
↑
chr18
64271469
64271503
35
CDH19
TSS1500
1.17E-02
↑
chr18
74799500
74799572
73
MBP
Body
3.65E-02
↑
chr19
1071176
1071208
33
HMHA1
Body
6.00E-05
↑
chr19
6334625
6334635
11
ACER1
TSS1500
9.20E-05
↑
chr19
10736006
10736117
112
SLC44A2
TSS200,Body
9.01E-07
↑
chr19
10736299
10736355
57
SLC44A2
5'UTR,1stExon,
Body
9.01E-07
↑
chr19
39087135
39087186
52
MAP4K1
Body
1.78E-06
↑
chr19
44278551
44278628
78
KCNN4
Body
5.42E-04
↑
chr19
48283760
48283760
1
SEPW1
Body
2.69E-03
↑
chr19
50205634
50205634
1
CPT1C
Body
2.13E-03
↑
chr19
55021799
55021799
1
LAIR2
3'UTR
4.76E-03
↑
chr19
56061334
56061348
15
4.58E-07
↑
chr19
57679590
57679590
1
DUXA
TSS1500
1.57E-02
↑
chr20
23470274
23470274
1
CST8
TSS1500
2.40E-02
↑
chr21
19188942
19188942
1
C21orf91
Body
4.31E-03
↑
chr21
45705618
45705742
125
AIRE
TSS200
2.76E-04
↑
chr9
33474169
33474169
1
SUGT1P1,NOL6
Body,TSS1500
2.25E-02
↓
chr12
9903429
9903454
26
5.35E-05
↓
chr12
76474635
76474635
1
NAP1L1
5'UTR
2.99E-03
↓
chr12
85430025
85430336
312
TSPAN19,LRRIQ1
1stExon,5'UTR,
TSS200,TSS1500
1.55E-13
↓
chr12
104351201
104351300
100
C12orf73
TSS1500
5.68E-09
↓
Abreviaturas. Chr: cromosoma. «start» y «end»: coordenadas hg19 para inicio y final de los rangos. width:
corresponde a la amplitud del rango. genes assoc: asignación génica corregida de acuerdo al criterio del
asignación de acuerdo a la búsqueda explicada en el numeral 1.1.5 del capítulo 1 (se agregó anotación al gen
HOXA-AS3 no incluída en anotación original). group: anotación de localización génica según anotación original
de illumina. Los valores de p corresponden a valores ajustados por la corrección de Bonferroni del análisis en
el que se incluyeron todos sujetos. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su
localización.
240
Anexo 15. 59 sondas diferencialmente metiladas en EA en capas de neuronas piramidales encontradas en la intersección entre el análisis de la muestra total con el del
subconjunto de hombres y corroboradas por rangos.
Probe ID
genome location
hg19
gene
CGIn
p.Value
Btadf
adj.P.Val Bta CT
Bta
EA
cg16748008
chr7:27155002
HOXA3
Island
1.2E-09
0.06
1.29E-05
0.13
0.19
cg21134232
chr7:27155548
Shore
2.5E-08
0.08
6.97E-05
0.26
0.34
cg17965690
chr19:10736049
SLC44A2
Island
1.2E-06
0.09
4.93E-04
0.20
0.29
cg22507723
chr12:58131768
AGAP2
Island
3.3E-07
0.09
2.63E-04
0.21
0.29
cg15714227
chr5:2225482
-
Open Sea
1.9E-09
0.10
1.80E-05
0.78
0.87
cg22904711
chr19:44278628
KCNN4
Island
1.7E-07
0.11
1.89E-04
0.16
0.27
cg01441308
chr2:127811853
BIN1
Open Sea
1.5E-09
0.06
1.52E-05
0.80
0.86
cg21134610
chr18:47815407
CXXC1
Shore
9.5E-13
0.10
8.97E-08
0.72
0.82
cg11871295
chr18:47815430
Shore
2.0E-09
0.11
1.81E-05
0.69
0.79
cg17606558
chr6:29456563
Open Sea
6.0E-07
0.09
3.47E-04
0.71
0.80
cg16150863
chr6:29456577
Open Sea
8.2E-07
0.12
4.06E-04
0.70
0.82
cg08925882
chr11:67350491
GSTP1
Shore
3.7E-10
0.094 6.01E-06
0.66
0.75
cg22686716
chr1:115003638
TRIM33
Open Sea
5.9E-07
0.12
3.45E-04
0.76
0.88
cg17251384
chr4:36333629
DTHD1
Open Sea
8.5E-08
0.06
1.35E-04
0.85
0.91
cg10432569
chr17:467098584
MIR196A1
Shore
9.96E-09
0.081 4.80E-05 0.241
0.321
cg06238004
chr17:420297274
Shore
2.73E-08
0.112 7.26E-05 0.375
0.487
cg16206364
chr19:502056344
CPT1C
Shore
3.27E-10
0.119 5.84E-06 0.694
0.813
cg18412984
chr14:102,604,722
HSP90AA1,
WDR20
Shore
1.41E-08
0.065 5.57E-05 0.772
0.837
cg25631092
chr3:177853124
TBC1D5
Shore
2.24E-07
0.068 2.16E-04 0.703
0.771
cg11879776
chr20:234702744
CST8
OpenSea
4.09E-09
0.095 2.87E-05 0.737
0.832
MAS1L
Range
that Supor the
probe
chr7:2715500227155548
chr19:1073600610736355
chr12:5813168158131768
chr5:22253232225482
chr19:4427855144278628
chr2:127811805127811853
chr18:4781540747815430
chr6:2945656329456577
chr11:6735049167350499
chr1:115003633115003638
chr4:3633362536333629
chr17:4670985846709858
chr17:4202972742029727
chr19:5020563450205634
chr14:102604722102604722
chr3:1778531217785312
chr20:2347027423470274+
min p.val mean p.val
Adj. min
pval
Adj. Mean mean
width
pval
Dbeta
9.8E-29
8.8E-10
4.61E-23
4.16E-04
0.07
9.8E-29
8.8E-10
4.61E-23
4.16E-04
0.07
1.3E-26
1.9E-12
6.23E-21
9.01E-07
0.07
350
4.5E-12
1.9E-11
2.13E-06
8.72E-06
0.08
88
2.2E-12
6.7E-09
1.05E-06
3.16E-03
0.06
160
8.3E-10
1.2E-09
3.91E-04
5.42E-04
0.08
78
6.5E-11
9.3E-11
3.07E-05
4.35E-05
0.06
49
3.7E-18
3.8E-18
1.76E-12
1.77E-12
0.10
3.7E-18
3.8E-18
1.76E-12
1.77E-12
0.10
6.9E-11
6.9E-11
3.23E-05
3.24E-05
0.11
6.9E-11
6.9E-11
3.23E-05
3.24E-05
0.11
7.0E-08
7.8E-08
3.31E-02
3.67E-02
0.07
9
4.0E-11
4.0E-11
1.87E-05
1.87E-05
0.10
6
2.9E-13
2.9E-13
1.37E-07
1.38E-07
0.06
5
1.4E-12
1.4E-12
6.48E-07
6.48E-07
0.08
1
1.4E-12
1.4E-12
6.71E-07
6.71E-07
0.11
1
4.5E-09
4.5E-09
2.13E-03
2.13E-03
0.12
1
5.3E-09
5.3E-09
2.48E-03
2.48E-03
0.07
1
1.1E-07
1.1E-07
4.98E-02
4.98E-02
0.07
1
1.3E-09
5.1E-08
6.23E-04
2.40E-02
0.10
1
704
24
15
ANEXOS
241
Probe ID
genome location
hg19
cg11599793
chr2:1512844134
cg02119693
chr2:192161142
cg18710412
chr5:90654191
cg19983221
chr11:46439420
cg01539849
gene
Btadf
adj.P.Val Bta CT
Bta
EA
Range
Adj. min
that Supor the min p.val mean p.val
pval
probe
chr2:1512844131.4E-12 1.4E-12
6.47E-07
151284413
CGIn
p.Value
OpenSea
1.23E-07
0.122 1.56E-04 0.696
0.819
OpenSea
9.23E-09
0.090 4.54E-05 0.686
0.776
chr2:192161142192161142
3.1E-12
3.1E-12
OpenSea
2.23E-09
0.088 1.90E-05 0.762
0.850
chr5:9065419190654191
1.4E-11
AMBRA1
OpenSea
3.70E-10
0.098 6.01E-06 0.634
0.731
chr11:4643942046439420
chr11:47376754
SPI1,SLC39
A13
Island
1.35E-06
0.063 5.35E-04 0.344
0.406
cg21785710
chr2:63662027
WDPCP
OpenSea
6.00E-07
0.076 3.46E-04 0.720
cg20622410
chr17:39930302
JUP
OpenSea
5.05E-10
cg12750757
chr8:19092406
LOC1001289
93
Shelf
cg10662603
chr3:68992252
cg14845962
chr12:58120237
AGAP2AS1,AGAP2
cg04126335
chr1:145525223
cg19969733
Adj. Mean mean
width
pval
Dbeta
6.47E-07
0.12
1
1.47E-06
1.47E-06
0.09
1
1.4E-11
6.48E-06
6.48E-06
0.09
1
4.7E-11
4.7E-11
2.21E-05
2.21E-05
0.10
1
chr11:4737675447376754
7.5E-11
7.5E-11
3.53E-05
3.53E-05
0.06
1
0.796
chr2:6366202763662027
1.1E-10
1.1E-10
5.19E-05
5.19E-05
0.08
1
0.065 7.59E-06 0.767
0.832
chr17:3993030239930302
3.0E-10
3.0E-10
1.42E-04
1.42E-04
0.06
1
3.03E-08
0.140 7.65E-05 0.709
0.849
chr8:1909240619092406
6.8E-10
6.8E-10
3.18E-04
3.18E-04
0.14
1
OpenSea
7.37E-10
0.141 9.37E-06 0.655
0.796
chr3:6899225268992252
7.1E-10
7.1E-10
3.32E-04
3.32E-04
0.14
1
Island
7.89E-07
0.071 4.01E-04 0.224
0.296
chr12:5812023758120237
1.5E-09
1.5E-09
6.90E-04
6.90E-04
0.07
1
NBPF10,NBP
OpenSea
F20,ITGA10
3.89E-09
0.085 2.86E-05 0.770
0.855
chr1:145525223145525223
2.3E-09
2.3E-09
1.09E-03
1.09E-03
0.09
1
chr2:102927898
IL18R1,IL1R
L1
OpenSea
1.46E-09
0.121 1.52E-05 0.676
0.798
chr2:102927898102927898
3.0E-09
3.0E-09
1.42E-03
1.42E-03
0.12
1
cg09852619
chr8:25217537
DOCK5
OpenSea
4.00E-13
0.146 4.71E-08 0.620
0.766
chr8:2521753725217537
3.1E-09
3.1E-09
1.45E-03
1.45E-03
0.15
1
cg20295353
chr14:64989846
ZBTB1
OpenSea
3.38E-07
0.086 2.66E-04 0.707
0.793
chr14:6498984664989846
3.4E-09
3.4E-09
1.60E-03
1.60E-03
0.09
1
cg25407540
chr5:39284814
C9
OpenSea
4.04E-07
0.068 2.88E-04 0.777
0.845
chr5:3928481439284814
3.6E-09
3.6E-09
1.67E-03
1.67E-03
0.07
1
cg07581999
chr2:109030597
OpenSea
3.48E-08
0.075 7.84E-05 0.760
0.835
chr2:109030597109030597
3.6E-09
3.6E-09
1.70E-03
1.70E-03
0.07
1
MYO1B
242
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Probe ID
genome location
hg19
gene
CGIn
p.Value
Adj. min
pval
Adj. Mean mean
width
pval
Dbeta
cg15109118
chr6:5431669
FARS2
OpenSea
4.68E-08
0.072 9.39E-05 0.793
0.865
5.2E-09
5.2E-09
2.45E-03
2.45E-03
0.07
1
cg13600364
chr6:362095
OpenSea
3.39E-08
0.087 7.84E-05 0.749
0.836
chr6:362095362095
6.3E-09
6.3E-09
2.96E-03
2.96E-03
0.09
1
cg05475575
chr15:40423445
OpenSea
1.08E-06
0.065 4.71E-04 0.800
0.865
chr15:4042344540423445
6.7E-09
6.7E-09
3.14E-03
3.14E-03
0.06
1
cg15255329
chr19:55021799
LAIR2
OpenSea
2.48E-10
0.147 5.31E-06 0.532
0.679
chr19:5502179955021799
1.0E-08
1.0E-08
4.76E-03
4.76E-03
0.15
1
cg21330976
chr18:21195665
ANKRD29
Shelf
5.56E-09
0.115 3.40E-05 0.723
0.839
chr18:2119566521195665
1.3E-08
1.3E-08
5.92E-03
5.92E-03
0.12
1
cg18946602
chr1:61549982
NFIA
Shore
6.13E-09
0.065 3.58E-05 0.422
0.487
chr1:6154998261549982
1.3E-08
1.3E-08
6.02E-03
6.02E-03
0.06
1
cg22502450
chr3:129261478
H1FOO
OpenSea
3.17E-08
0.076 7.77E-05 0.557
0.633
chr3:129261478129261478
1.3E-08
1.3E-08
6.15E-03
6.15E-03
0.08
1
cg04565216
chr3:171728208
OpenSea
1.08E-08
0.071 4.91E-05 0.767
0.838
chr3:171728208171728208
1.5E-08
1.5E-08
7.12E-03
7.12E-03
0.07
1
cg15686105
chr7:23623273
Shelf
3.17E-08
0.110 7.77E-05 0.698
0.809
chr7:2362327323623273
1.6E-08
1.6E-08
7.50E-03
7.50E-03
0.11
1
cg17970299
chr12:54772804
ZNF385A
Island
3.93E-06
0.078 9.07E-04 0.185
0.263
chr12:5477280454772804
1.7E-08
1.7E-08
8.14E-03
8.14E-03
0.08
1
cg18454133
chr14:23835870
EFS
Island
2.41E-08
0.065 6.91E-05 0.509
0.574
chr14:2383587023835870
1.7E-08
1.7E-08
8.23E-03
8.23E-03
0.06
1
cg19498600
chr10:32855610
CCDC7
OpenSea
3.50E-11
0.104 1.52E-06 0.642
0.747
chr10:3285561032855610
1.9E-08
1.9E-08
8.97E-03
8.97E-03
0.10
1
cg15147693
chr6:24362928
DCDC2
Shelf
4.97E-09
0.160 3.16E-05 0.665
0.826
chr6:2436292824362928
2.0E-08
2.0E-08
9.40E-03
9.40E-03
0.16
1
cg26549831
chr12:773616
NINJ2
OpenSea
6.06E-08
0.066 1.12E-04 0.740
0.806
chr12:773616773616
2.5E-08
2.5E-08
1.17E-02
1.17E-02
0.07
1
cg02775223
chr19:57679590
DUXA
OpenSea
1.25E-07
0.133 1.57E-04 0.719
0.852
chr19:5767959057679590
3.3E-08
3.3E-08
1.57E-02
1.57E-02
0.13
1
cg09490371
chr2:233253024
ECEL1P2
Island
7.98E-08
0.112 1.31E-04 0.256
0.369
chr2:233253024233253024
3.8E-08
3.8E-08
1.79E-02
1.79E-02
0.11
1
adj.P.Val Bta CT
Bta
EA
Range
that Supor the
probe
chr6:54316695431669
min p.val mean p.val
Btadf
ANEXOS
243
Probe ID
genome location
hg19
gene
CGIn
p.Value
cg00426855
chr4:56496836
NMU
OpenSea
3.43E-07
0.076 2.67E-04 0.777
0.854
cg06881132
chr4:22590411
OpenSea
1.82E-07
0.077 1.94E-04 0.669
0.747
cg10001172
chr10:70229028
Shelf
3.05E-07
0.076 2.53E-04 0.726
cg10168726
chr5:17664567
OpenSea
3.34E-08
cg21822635
chr7:80750194
OpenSea
cg08094135
chr8:64851070
cg24499688
chr7:9053450
DNA2
Adj. min
pval
Adj. Mean mean
width
pval
Dbeta
4.3E-08
4.3E-08
2.04E-02
2.04E-02
0.08
1
chr4:2259041122590411
5.2E-08
5.2E-08
2.43E-02
2.43E-02
0.08
1
0.802
chr10:7022902870229028
5.4E-08
5.4E-08
2.52E-02
2.52E-02
0.08
1
0.061 7.84E-05 0.653
0.715
chr5:1766456717664567
6.3E-08
6.3E-08
2.97E-02
2.97E-02
0.06
1
7.03E-08
0.098 1.22E-04 0.729
0.827
chr7:8075019480750194
7.6E-08
7.6E-08
3.59E-02
3.59E-02
0.10
1
OpenSea
2.26E-06
0.069 6.96E-04 0.714
0.783
chr8:6485107064851070
8.5E-08
8.5E-08
4.01E-02
4.01E-02
0.07
1
OpenSea
5.73E-07
0.089 3.43E-04 0.767
0.856
chr7:90534509053450
8.9E-08
8.9E-08
4.18E-02
4.18E-02
0.09
1
adj.P.Val Bta CT
Bta
EA
Range
that Supor the
probe
chr4:5649683656496836
min p.val mean p.val
Btadf
Abreviaturas: Probe ID: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K, genome location hg19: coordenadas hg19 de posición genómica correspondiente. gene:
símbolo correspondiente de la base de genes de NCBI. CGIn: anotación de localización de la sonda en relación a las Islas CpG. Btadf: Delta de beta correspondiente a
análisis en todos los sujetos. adj.P.Val: valor p ajustado con FDR (Benjamini & Hochberg, 1995) correspondiente a análisis en todos los sujetos. Bta CT: media de valor
Bta para el grupo con EA en esa posición genómica. Bta EA: media de valor Bta para el grupo control en esa posición genómica. Range that Supor the probe: coordenadas
hg19 del rango que da soporte a la posición diferencialmente metilada. min p.val: el valor de p mínimo del conjunto de posiciones CpG del rango ue da soporte a la posición.
mean p.val: el valor de p promedio del conjunto de posiciones CpG del rango que da soporte a la posición. Adj. min pval: el valor mínimo de p ajustado por FDR del conjunto
de posiciones CpG del rango correspondiente. mean Dbeta: el delta de beta neto del conjunto de posiciones CpG del rango que da soporte a la posición. width: corresponde
a la amplitud del rango. Se subrayan genes mencionados en el texto para facilitar su localización.
244
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 16. Análisis de priorización de genes correspondientes con los 52 rangos soportados por múltiples posiciones
Abreviaturas. Symbol / Description: Símbolo del gen y nombre del gen. Category: Clasificación categórica del gen de acuerdo a si codifica una Proteína,
miRNA o es un pseudogen. Score. Puntaje que indica la fuerza de la conexión entre el fenotipo de interés y cada gen en este caso en un rango de 1.7 a 7,
dicho puntaje es relativo a cada corrido y tiene como propósito permitir el orden de los genes por el sistema de priorización usado por el software «VarElect»,
en relación más cercana probable con el fenotipo en este caso «Alzheimer’s Disease».
245
Anexo 17. Módulos relacionados con agrupaciones funcionales «UCSC_TFBS» del análisis de genes diferencialmente hipermetilados en EA en sangre periférica
Category
Term
Count
%
PValue
List Total
Pop Hits
Pop Total
FoldE
Bonferroni
UCSC_TFBS
TGIF
50
63
3.52E-07
78
6885
19536
1.82
6.20E-05
UCSC_TFBS
MSX1
47
59
5.94E-06
78
6772
19536
1.74
1.04E-03
UCSC_TFBS
CHX10
47
59
7.29E-06
78
6818
19536
1.73
1.28E-03
UCSC_TFBS
HFH3
46
58
8.29E-06
78
6613
19536
1.74
1.46E-03
UCSC_TFBS
P53
62
78
1.94E-05
78
10980
19536
1.41
3.41E-03
Se utiliza el sistema de anotación utilizado en la base de datos NIH/NIAID para anotación, visualización y descubrimiento Integrado (DAVID). Convenciones.
«Category»: Agrupación funcional. «UCSC_TFBS»: sitios de unión a factores de transcripción de la base UCSC asociados a los resultados. «Count»: Se refiere
al número de genes «alterados» dentro de cada ontología y su porcentaje correspondiente. P value: es el resultante de la prueba exacta de Fisher (P ≤ 0.05);
«FoldE»: se refiere a la tasa de enriquecimiento encontrado en la lista de resultados positivos en comparación con el enriquecimiento de esa ontología en el
genoma completo. List Total: se refiere al número toral de genes anotados dentro de los resultados positivos; Pop Hits y Pop Total, se refiere al número de genes
en la base de datos para la categoría, y en general, respectivamente. Se subrayan resultados mencionados en el texto para facilitar su localización. Se muestran
ontologías con punto de corte P<0.01 luego de corrección de Bonferroni. La linea horizontal destaca los resultados por encima de ella con un enriquecimiento
FoldE ⪆1.5.
246
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
Anexo 18. Tabla resumen de resultados de estratificación por el SNP rs2075650 de TOMM40, muestras de estudio
de implementación por técnicas basadas en PCR.
Gen evaluado por MS-HRM
Genotipo GA
EA vs CT
Valor-p
Genotipo GG
EA vs CT
Valor-p
APOE MS-HRM
0.265 (ns)
0.052
TOMM40 MS-HRM
0.817 (ns)
0.989
Abreviaturas. Gen evaluado por MS-HRM: Símbolo oficial del gen en el que se evaluaron los niveles de metilación
entre el grupo EA y el grupo CT. EA: grupo con EA. CT grupo de controles. Valor-p: valor de p de prueba t a dos colas
GG: genotipo de riesgo del SNP rs2075650 de TOMM40. estudio de implementación en muestras de sangre periférica.
(ns): no significativo.
247
Anexo 19. Artículo de implementación de técnicas de PCR de estudios de metilación de
ADN (Hernandez et al., 2013).
248
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANEXOS
249
250
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANEXOS
251
252
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANEXOS
253
254
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANEXOS
255
256
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
ANEXOS
257
258
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
1. .
259
Anexo 20. Protocolos para conversión de bisulfito y parámetros utilizados en técnicas basadas en PCR del laboratorio del Instituto de Genética de la Universidad Nacional
de Colombia.
Protocolo de conversión tomado a partir de protocolo de fabricante, con modificaciones (conservando su idioma original).
DNA conversion using Zymo-DNA Methylation Kit
1. After reliable DNA sample quantification, add 500 ng of DNA to a PCR tube, add water for complete 20 μl, if necessary. Add 130 μl of CT Conversion
Reagent solution to the tube, previously prepared.
2. Mix the sample and then centrifuge briefly to ensure no droplets are in the cap or sides of the tube.
3. Place the PCR tube(s) in a thermal cycler and perform the following steps: 98 °C for 8 minutes, 64 °C for 3.5 hours 4 °C storage for up to 20 hours
4. Add 600 μl of M-Binding Buffer into a Zymo-Spin™ Column and place the column into a provided Collection Tube.
5. Load the sample (from Step 2) into the Zymo-Spin™ Column containing the M-Binding Buffer. Close the cap and mix by inverting the column12 times.
6. Centrifuge at full speed (17,000 x g) for 30 seconds. Discard the flow-through.
7. Add 100 μl of M-Wash Buffer to the column and centrifuge at full speed for 30 seconds.
9. Add 200 μl of M-Desulphonation Buffer to the column and let stand at room temperature (20°C – 30°C) for 20 minutes.
10. After the incubation, centrifuge at full speed for 30 seconds
11. Add 200 μl of M-Wash Buffer to the column. Centrifuge at full speed for 30 seconds. Add another 200 μl of M-Wash Buffer and centrifuge for an
additional 40 seconds and place the column into a 1.5 ml microcentrifuge tube with the respective identification and date.
14. Add 10 μl of M-Elution Buffer directly to the column matrix. Centrifuge for 30 seconds at full speed to elute the DNA.
15. The DNA is ready for immediate PCR analysis or can be stored at or below -20°C for later use. Use 2 of eluted DNA for each PCR.
Parámetros utilizados para estudios de metilación de ADN basados en PCR
Parametros BSP
Parametros MS-HRM
Cálculos mezcla BSP (vol µl)
Cálculos mezcla MS-HRM(vol µl)
TAº
GEN
DMSO+ Agua + Bff +MgCl +DNTp + F+ R +taq+ ADN
LINE-1
APP
1.25 + 7.45 + 2 + 1.5 + 1.6 + 2 + 2 + 0.2 + 2
APOE
1.25 + 7.45 + 2 + 1.5 + 1.6 + 2 + 2 + 0.2 + 2
CLU
1.00 + 6.90 + 2 + 2.4 + 1.5 + 2 + 2 + 0.2 + 2
TOMM40 1.25 + 7.45 + 2 + 1.5 + 1.6 + 2 + 2 + 0.2 + 2
Mix +
51.0º
53.6º
54.5º
54.0º
F
+ R
5 + 0.2 +
5 + 0.2 +
5.5 + 0.22 +
6 + 0.22 +
5 + 0.2 +
+ Agua
0.2 + 3.6
0.2 + 3.8
0.22 + 3.26
0.22 + 3.76
0.2 + 3.8
+ Tcn
+ 1
+ 1.8
+ 1.8
+ 1.8
+ 1.8
Volumen final
TAº
microlitros(µl)
10
11
11
12
11
48º
48
50º
50º
4º
Abreviaturas. «º»: Denota grados Celsius. TAº: Temperatura de anillamiento. A la izquierda para BSP, el volumen total es 20 µl en todos los casos y el
protocolo termodinámico es así, 95º:5 min, 40 ciclos de 95º:30 segundos, TAº:30 segundos, 72º30 segundos y extensión final 72º: 30 segundos.
DMSO: dimetilsulfóxido. Bff: buffer máxima (fermentas, cat EP0603), MgCl: MgCl2 a 25 mM (Thermo Scientific™ , CAT R0971). DNTp (fermentas, CAT
EP0603), F y R: primer forward y reverse a 10uM, respectivamente. Taq: enzima taq hot-start kit fermentas (CAT EP0603), ADN: ADN convertido a 20 ng/µl.
Tcn: ADN convertido a 14 ng/µl. Mx: Precision melt supermix (Biorad CAT 172-5112). Agua: H2O tipo A1. A la derecha para MS-HRM, se indica volumen fina
260
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
de cada ensayo y el protocolo termodinámico es, 95º:2 min, 43 ciclos de 95º:10 s, TA: 30 segundos, 72º30 segundos, lectura de fluorescencia y una extensión
final 72º: 30 segundos, luego curva de meting de alta resolución de 63º a 83º con lecturas de fluorescencia cada 0.2ºC por 10 segundos.
ANEXOS
261
Anexo 21. Controles de calidad de MS-HRM. Ilustraciones de curvas de melting. Dentro de los ensayos realizados para cada gen se presentan de izquierda a derecha las
curvas de melting normalizadas de los estándares, las curvas de las lecturas de fluorescencia normalizadas de la diferencia de melting y el respectivo gráfico de linealidad.
De arriba hacia abajo, ensayos correspondientes a APP, LINE-1, TOMM40, APOE y CLU.
APP
APP
100%
120
100
80
60
40
20
0
0
-20 0.0
100%
50%
50%
25%
0%
25%
0%
R² = 0.9999
100
50
25
0.2
0.4
MS-HRM de APP mostró un comportamiento lineal con valores de r2 = 0.999. Ejes como en Ilustración 8.
LINE1
100%
75%
50%
0%
100%
75%
50%
0%
MS-HRM de LINE1 mostró un comportamiento lineal con valores de r2 0.988. Ejes como en Ilustración 8.
LINE1
120
100 R² = 0.9881
100
80
75
60
50
40
20
0
0
0.20
0.40
-20 0.00
262
Estudio de patrones genómicos de metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado
hacia neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica
TOMM40
TOMM40
100%
75%
50%
100%
75%
50%
120
100
100
R² = 0.85
80
75
60
50
40
0%
20
0%
0
-20 -
0
0.50
1.00
MS-HRM de TOMM40 mostró un comportamiento lineal con valores de r2 0.849. Ejes como en Ilustración 8.
APOE
APOE
100%
75%
120
50%
100
100%
75%
50%
100
R² = 0.9138
80
60
75
50
40
20
0%
0%
. . MS-HRM de APOE mostró un comportamiento lineal con valores de r2 0.913. Ejes como en Ilustración 8.
-0.50
0
-20
0.00
0
0.50
1.00
ANEXOS
263
CLU
100%
100%
50%
25%
0%
CLU
1
0.8
50%
25%
0%
MS-HRM de CLU mostró un comportamiento lineal con valores de r2 = = 0.991. Ejes como en Ilustración 8.
0.6
0.4
0.2
0
0
0.5
1
1.5
264
Anexo 22. Resultados de secuenciación (BSP) del análisis principal en sangre periférica en sujetos con EA, en
comparación con controles. Sólo se muestran resultados analizables luego de los controles de calidad de ESME.
Primer
Gen
CpG pos
p.value
EA mean
EA sd
CT mean
CT sd
nEA
nCT
CpGNm
APOE
APOE:51
0.499
0.927
0.120
0.946
0.095
30
33
APOE CpG 4
F
APOE
APOE:65
0.401
0.864
0.095
0.881
0.065
31
33
APOE CpG 5
F
APOE
APOE:68
0.176
0.920
0.086
0.946
0.063
31
33
APOE CpG 6
F
APOE
APOE:85
0.930
0.965
0.061
0.967
0.045
31
33
APOE CpG 7
F
APOE
APOE:93
0.504
0.924
0.058
0.913
0.069
31
33
APOE CpG 8
F
APOE
APOE:101
0.090
0.915
0.047
0.934
0.035
30
31
APOE CpG 9
F
APOE
APOE:116
0.628
0.971
0.037
0.963
0.079
30
32
APOE CpG 10
F
APOE
APOE:118
0.798
0.964
0.033
0.967
0.035
31
32
APOE CpG 11
F
APOE
APOE:130
0.000
0.941
0.056
0.988
0.018
30
32
APOE CpG 12 ***
F
APOE
APOE:146
0.721
0.914
0.062
0.920
0.075
30
31
APOE CpG 13
F
APOE
APOE:155
0.083
0.876
0.065
0.904
0.061
30
32
APOE CpG 14
F
APOE
APOE:21
0.805
0.790
0.078
0.785
0.066
30
28
APOE CpG 1
R
APOE
APOE:33
0.564
0.915
0.054
0.924
0.054
28
25
APOE CpG 2
R
APOE
APOE:36
0.900
0.834
0.071
0.831
0.094
30
28
APOE CpG 3
R
APOE
APOE:51
0.923
0.937
0.043
0.935
0.073
30
30
APOE CpG 4
R
APOE
APOE:65
0.612
0.908
0.045
0.897
0.103
29
29
APOE CpG 5
R
APOE
APOE:68
0.478
0.841
0.071
0.829
0.063
28
27
APOE CpG 6
R
APOE
APOE:85
0.405
0.974
0.026
0.980
0.032
29
28
APOE CpG 7
R
APOE
APOE:93
0.179
0.954
0.040
0.967
0.030
29
28
APOE CpG 8
R
APOE
APOE:101
0.063
0.758
0.164
0.830
0.120
29
27
APOE CpG 9
R
APOE
APOE:116
0.838
0.925
0.080
0.930
0.087
28
27
APOE CpG 10
R
APOE
0.539
0.846
0.155
0.819
0.162
28
27
APOE CpG 11
R
APP
APOE:118
APP:76
0.363
0.000
0.000
0.002
0.004
5
6
APP CpG 5
F
APP
APP
APP:98
APP:25
NA
0.363
0.000
0
0.000
0
0.000
0.1
0.000
0.245
3
3
4
6
APP CpG 6
APP CpG 1
F
R
APP
APP:35
0.251
0
0
0.085
0.160
3
6
APP CpG 2
R
APP
APP:42
0.425
0.1025
0.205
0.008
0.018
4
5
APP CpG 3
R
APP
APP:54
0.354
0
0
0.268
0.489
3
4
APP CpG 4
R
APP
APP:76
0.5
0.02
0.0282
0
0
2
2
APP CpG 5
R
TOMM40
TOMM40:50
0.299
0.940
0.141
0.965
0.082
49
40
TOMM40 CpG 1
F
TOMM40
TOMM40:63
0.806
0.973
0.048
0.970
0.037
50
41
TOMM40 CpG 2
F
TOMM40
TOMM40:72
0.826
0.960
0.083
0.963
0.053
46
41
TOMM40 CpG 3
F
TOMM40
TOMM40:122
0.354
0.903
0.136
0.926
0.089
45
38
TOMM40 CpG 4
F
TOMM40
TOMM40:130
0.355
0.953
0.049
0.942
0.055
38
36
TOMM40 CpG 5
F
TOMM40
TOMM40:141
0.365
0.933
0.068
0.946
0.056
49
38
TOMM40 CpG 6
F
TOMM40
TOMM40:145
0.819
0.950
0.068
0.954
0.069
49
38
TOMM40 CpG 7
F
TOMM40
TOMM40:155
0.215
0.901
0.083
0.922
0.069
49
39
TOMM40 CpG 8
F
TOMM40
TOMM40:198
0.419
0.848
0.103
0.867
0.098
43
36
TOMM40 CpG 9
F
TOMM40
TOMM:50
0.214
0.9
0.109
0.920
0.031
48
44
TOMM40 CpG 1
R
TOMM40
TOMM:63
0.7799
0.967
0.024
0.966
0.025
46
43
TOMM40 CpG 2
R
TOMM40
TOMM:72
0.058
0.880
0.093
0.908
0.037
48
4
TOMM40 CpG 3
R
ANEXOS
265
TOMM40
TOMM:122
0.979
0.855
0.155
0.856
0.186
44
42
TOMM40 CpG 4
R
TOMM40
TOMM:130
0.393
0.920
0.107
0.939
0.090
45
41
TOMM40 CpG 5
R
TOMM40
TOMM:141
0.218
0.937
0.096
0.957
0.051
46
41
TOMM40 CpG 6
R
TOMM40
TOMM:145
0.321
0.740
0.204
0.780
0.163
44
40
TOMM40 CpG 7
R
TOMM40
TOMM:155
0.179
0.900
0.111
0.926
0.060
46
41
TOMM40 CpG 8
R
CLU
CLU:47
NA
0.000
0.000
0.000
0.000
8
3
CLU CpG 2
F
CLU
CLU:54
NA
0.000
0.000
0.000
0.000
9
7
CLU CpG 3
F
CLU
CLU:68
0.087
0.076
0.116
0.000
0.000
9
6
CLU CpG 4
F
CLU
CLU:70
0.240
0.016
0.037
0.000
0.000
9
6
CLU CpG 5
F
CLU
CLU:72
0.304
0.013
0.036
0.000
0.000
9
6
CLU CpG 6
F
CLU
CLU:84
0.347
0.003
0.010
0.000
0.000
9
7
CLU CpG 7
F
CLU
CLU:87
0.179
0.017
0.034
0.000
0.000
9
7
CLU CpG 8
F
CLU
CLU:90
NA
0.000
0.000
0.000
0.000
9
7
CLU CpG 9
F
CLU
CLU:92
NA
0.000
0.000
0.000
0.000
9
7
CLU CpG 10
F
CLU
CLU:26
0.037
0.043
0.046
0.118
0.092
13
10
CLU CpG 1
R
CLU
CLU:47
NA
0
0
0
0
12
10
CLU CpG 2
R
CLU
CLU:54
0.339
0.005
0.017
0
0
12
10
CLU CpG 3*
R
CLU
CLU:68
0.819
0.088
0.061
0.081
0.083
12
10
CLU CpG 4
R
CLU
CLU:70
0.997
0.171
0.075
0.171
0.107
12
10
CLU CpG 5
R
CLU
CLU:72
0.346
0.085
0.045
0.116
0.088
12
10
CLU CpG 6
R
CLU
CLU:84
0.347
0
0
0.017
0.052
11
9
CLU CpG 7
R
CLU
CLU:87
NA
0
0
0
0
11
9
CLU CpG 8
R
CLU
CLU:90
0.347
0.001
0.003
0
0
9
9
CLU CpG 9
R
CLU
CLU:92
NA
0
0
0
0
9
9
CLU CpG 10
R
Abreviaturas. Gen: símbolo oficial del gen. CpG pos: posición del CpG dentro del rango genómico de la secuencia
estudiada por BSP. p.value: valor p de las medias de metilación (prueba t de dos colas). EA mean y EA sd: media y
desviación estándar de la tasa de metilación del grupo con EA. CT mean y CT sd: media y desviación estándar de la tasa
de metilación del grupo CT. nEA y nCT número de lecturas exitosas en los grupos EA y CT correspondientes a cada CpG
evaluado. CpGNm: código arbitrario para numerar los CpGs de cada gen del estudio, media de metilación. Primer:
oligonucleótido Forward o Reverse usado para la comparación correspondiente por secuenciación directa. *: p <0.5,
**:p<0.001, ***:p = 0.0001. NA: no se calcula valor de p, pues todas las mediciones de metilación fueron consistentemente
cero NM para todos los sujetos.
266
Anexo 23. Ilustración de mapa genómico de región de interés de MBP encontrada diferencialmente metilada en sangre periférica y en cerebros.
Gráfico correspondiente a región chr18:74799458-74799612 en coordenadas hg19 en el UCSC Genome Browser. Diferentes renglones muestran características
genómicas correspondientes. De la línea superior a la inferior, la escala, coordenadas, secuencias nucleótidos, sondas de microarreglos de metilación en diferentes
tipos celulares, genes de referencia en base RefSeq, anotación de Islas CpG, elementos repetitivos, densidad de sensibilidad a DNAasa, densidad de motivos de
unión a factores de transcripción y de splicing alternativo.
267
ANEXOS
Anexo 24. Análisis de concordancia con la tabla principal de resultados del estudio recientemente
publicado en NatureNeuroscience (De Jager et al., 2014).
Probe ID
cg13076843
gene symbol
RHBDF2
Chromosome P.Val Ajust
chr17
4.22E-04
deltaB CGI Region
0.07
Island
nominal P.Val
8.70E-07
cg05810363
cg22962123
RHBDF2
HOXA3
chr17
chr7
1.99E-03
1.77E-03
0.06
0.11
Island
Island
1.83E-05
1.45E-05
cg02308560
cg11724984
ABCA7
RNF34
chr19
chr12
2.84E-03
5.11E-03
0.08
0.06
Island
Island
3.54E-05
1.07E-04
cg05066959
cg22883290
cg23968456
cg16733298
ANK1
BIN1
CDH23
COQ7
chr8
chr2
chr10
chr16
1.82E-02
7.80E-03
6.74E-03
2.08E-03
0.07
0.03
0.03
0.04
O.Sea
O.Sea
O.Sea
Island
1.05E-03
2.36E-04
cg00621289
cg03169557
PCNT
ANKRD11/RPL13
chr21
chr16
3.81E-03
1.76E-03
0.02
0.04
Island
O.Sea
Island
6.20E-05
1.43E-05
1.80E-04
1.98E-05
2.37E-05
2.29E-03
cg19803550 PRPF8
chr17
0.04
1.45E-03
2.20E-02
0.05
cg15821544 SLC2A1
chr1
Shore
–
cg25594100 FOXK1
chr7
ns
0.03
Island
Abreviaturas. Resultados de metilación de ADN en nuestro estudio principal en cerebros, de las 14 sondas
previamente reportadas en el citado estudio. Probe ID: código alfanumérico único de la sonda de Illumina 450K.
Gene ID: Código numérico oficial en base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica o
National Center for Biotechnology Information (NCBI) en Estados Unidos. Gene Symbol: símbolo único de la
base de genes de NCBI. Chromosome: Cromosoma. Ad.p.val: Valor P ajustado por la corrección FDR. DBt:
Delta de Beta. CGIn:Anotación referente a localización de las sondas o regiones en islas CpG, orillas de islas
CpG, plataformas de islas CpG, o que estén fuera de estos elementos. P.Val: valor p nominal, antes de la
corrección por FDR.
268
Título de Tesis: Estudio de Metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia
neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica:
identificación de perfiles en el epigenoma humano
Anexo 25. Ejemplo de diseño usando región de MBP y desarrollo del protocolo de diseño
de primers para MS-HRM usando las herramientas «Detailled bisulfite converter for MSHRM desing» (Capítulo 5 de este trabajo) y «bi-search» (Aranyi & Tusnady, 2007).
PASO 1
En el primer paso se extrae la secuencia del UCSC Genome Browser (Karolchik et al.,
2014) tomando por lo menos 100 pares de bases corriente arriba y corriente debajo de la
región de franco interés. A continuación se muestra la secuencia de interés de MBP,
resaltada en amarillo. Se tomaron 136 pares de bases, corriente arriba y corriente abajo
para facilitar la búsqueda de «primers» que estudie por lo menos una parte de dicha región,
se toma la hebra sentido.
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
GCTTTGGCCACCCGCGGCAGGTGGTGCAGCAGCCCCGCTCTGAGCAGGGATCCGCGGAGCTCGCCA
GCCCTAGACCGGATCCCAGGGAGGAGGCGCGGCCGGAGCCAAAGCGCAGAGGCCTCCCTCCCTCGC
GCGCCGGGTCGCACTTCATTCCTGCACAGGCAGAATCATCTGGCTTCTGCAAAGCAGTCGCGCAGC
GCTGTAGGGTGAGGCCGGCGTGGGAATCTAGGGAAGGCTGGAGGCAAACACCGCAGGAGGAGGGGA
GGGGAGGGGAGGCGAGCCGGGAGGCCTGGGGAGGGGAGCCTGGGCGCGCCCCGGGCAGCTCCTCTT
GGGCCGGGTTCCTCCTTCCAG
PASO 2
Se utiliza la herramienta «Detailled bisulfite converter for MS-HRM desing» ingresando la
secuencia mostrada en el paso 1 y se obtiene la siguiente secuencia; la secuencia de
interés de MBP, resaltada en amarillo:
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
gTtttggTTaTTCGCGgTaggtggtgTagTagTTTCGTtTtgagTagggatTCGCGgagTtCGTTa
gTTTtagaTCGgatTTTagggaggaggCGCGgTCGgagTTaaagCGTagaggTTtTTTtTTTtCGC
GCGTCGggtCGTaTttTattTTtgTaTaggTagaatTatTtggTttTtgTaaagTagtCGCGTagC
GTtgtagggtgaggTCGgCGtgggaatTtagggaaggTtggaggTaaaTaTCGTaggaggagggga
ggggaggggaggCGagTCGggaggTTtggggaggggagTTtgggCGCGTTTCGggTagTtTTtTtt
gggTCGggttTTtTTttTTag
En esta secuencia obtenida se usa para el diseño semi-manual de los «primers», las
regiones de repeticiones de nucleótidos quedan tachadas y representan la más baja
complejidad lingüística. Por el contrario, las cuartetas de bases con mayor complejidad
lingüística quedan subrayadas (cuartetas en las que no se repiten nucleótidos más de una
vez). Las secuencias CpG quedan en rojo y negrilla, y no sufren conversión «in silico» en
ANEXOS
269
este caso. Las T en mayúscula y verde, son producto de las T que no son naturales -sino
que provienen de la conversión de citosinas no metiladas fuera de las secuencias CpG-.
PASO 3
Siguiendo los parámetros para este tipo de «primers» descritos en otro lugar (Wojdacz et
al., 2008) se buscan regiones en la secuencia «forward» que sigan el parámetro adicional
de incluir uno o máximo dos CpG en la región 3’ del «primer» y se resaltan en verde y
superíndice. Este tipo de resaltado de doble código, permite usar los colores facilitando la
rápida localización, pero así mismo, permite no depender de ellos si se requiere imprimir
en blanco y negro.
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
gTtttggTTaTTCGCGgTaggtggtgTagTagTTTCGTtTtgagTagggatTCGCGgagTtCGTTagTTTta
gaTCGgatTTTagggaggaggCGCGgTCGgagTTaaagCGTagaggTTtTTTtTTTtCGCGCGTCGg
gtCGTaTttTattTTtgTaTaggTagaatTatTtggTttTtgTaaagTagtCGCGTagCGTtgtag
ggtgaggTCGgCGtgggaatTtagggaaggTtggaggTaaaTaTCGTaggaggaggggaggggagg
ggaggCGagTCGggaggTTtggggaggggagTTtgggCGCGTTTCGggTagTtTTtTttgggTCGg
gttTTtTTttTTag
PASO 4
Siguiendo los parámetros para este tipo de «primers» (Wojdacz et al., 2008) se buscan
regiones en la secuencia «reverse» que sigan los siguientes parámetros que incluyen tener
uno o máximo dos CpG en la región 3’ del «primer» que en este caso es el inverso
complementario del sitio de unión y se resaltan en azul claro y subíndice. Este tipo de
resaltado de doble código, permite usar los colores facilitando rápida localización, pero así
mismo no depender de ellos si se requiere imprimir (o publicar) en blanco y negro.
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
gTtttggTTaTTCGCGgTaggtggtgTagTagTTTCGTtTtgagTagggatTCGCGgagTtCGTTagTTTta
gaTCGgatTTTagggaggaggCGCGgTCGgagTTaaagCGTagaggTTtTTTtTTTtCGCGCGTCGg
gtCGTaTttTattTTtgTaTaggTagaatTatTtggTttTtgTaaagTagtCGCGTagCGTtgtagggtgaggTC
GgCGtgggaatTtagggaaggTtggaggTaaaTaTCGTaggaggaggggaggggaggggaggCGag
TCGggaggTTtggggaggggagTTtgggCGCGTTTCGggTagTtTTtTttgggTCGggttTTtTTt
tTTag
PASO 5
Se evalúa la especificidad de los «primers» candidatos luego de tomar el inverso
complementario de la región de unión del «primer reverse» usando el software en línea
«bi-search» (Ver artículo anexo integrado dentro del capítulo 5, tabla 3). Para eso se usa
la opción «Primer search, ePCR» (Aranyi & Tusnady, 2007).
270
Título de Tesis: Estudio de Metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia
neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica:
identificación de perfiles en el epigenoma humano
1 PCR product(s) on the bisulfite transformed sense chain
None PCR product(s) on the bisulfite transformed antisense chain
MBP MS-HRM F1a:
MBP MS-HRM R1: AATAATTCTACCTATAC
1. Chromosome 18 (len: 117)
77087458
GAGTTCGT TAGTTTTAGA TCGGATTTTA
GGGAGGAGGC GCGGTCGGAG TTAAAGCGTA GAGGTTTTTT TTTTTCGCGC
GTCGGGTCGT ATTTTATTTT TGTATAGGTA GAATTATTT
77087575
PASO 6
Una vez verificada la especificidad se usa la herramienta «Primer score» del citado
software (Aranyi & Tusnady, 2007). La salida del programa se muestra en la tabla a
continuación.
Como muestra la tabla en este caso el problema mayor es que hay un anillamiento de
«primers» formando heterodímeros y comprometiendo la región 3’ de la secuencia. Los
cuales se detallan en la siguiente tabla:
PASO 7
En este caso es posible solicitar «primers» alternativos en los cuales se sacrifica una de
las T en región 3’ del «primer forward» para evitar esa formación de dímeros y se evalúa
la alternativa repitiendo el paso 5 y el 6.
(Resultados de paso 5 alternativa 2)
1 PCR product(s) on the bisulfite transformed sense chain
None PCR product(s) on the bisulfite transformed antisense chain
MBP MS-HRM F1B: GAGTTCGTTAGTTTTAGA
ANEXOS
271
MBP MS-HRM R1: AATAATTCTACCTATAC
1. Chromosome 18 (len: 116)
77087458
GAGTTTGT TAGTTTTAGA TTGGATTTTA
GGGAGGAGGT GTGGTTGGAG TTAAAGTGTA GAGGTTTTTT TTTTTTGTGT
GTTGGGTTGT ATTTTATTTT TGTATAGGTA GAATTATT
77087574
(Resultados de paso 6 alternativa 2)
Abreviaturas en BiSearch. Sc: Score; Fpcr: Do Fast (electronic) PCR with the primer pairs; Pseq: Primer
sequence; Pos: Position of the primer; Plen: Primer length; %GC: Content of G and C in percent; Tm: Melting
temperature; oTm: Melting temperature of original primer (C are not translated to T); CpG: Number of CpG
islands in the unmodified PCR product; Sa: Self annealing; Sea: Self end annealing; Pa: Pair annealing; Pea:
Pair end-annealing; Len: Length of the PCR product.
Los «primers» diseñados no muestran dimerización importante y son altamente específicos
de la secuencia de interés. Igualmente deben ser evaluados «in vitro» para probar su
funcionamiento. Se recomienda solicitar y evaluar ambas alternativas. De igual forma las
dos alternativas tienen un puntaje menor a 40 en este software (Aranyi & Tusnady, 2007),
lo cual hemos observado (observación empírica) promete tener una tasa de éxito cercana
al 50%. El diseño se facilita con el «script» creado en este trabajo doctoral gracias a lo cual
en este caso, tomó menos de 2 horas de trabajo.
272
Título de Tesis: Estudio de Metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia
neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica:
identificación de perfiles en el epigenoma humano
Anexo 26. Ejemplo de diseño usando región de MBP y desarrollo del protocolo de diseño
de primers para BSP utilizando la herramienta «bi-search» (Aranyi & Tusnady, 2007)
PASO 1
En el primer paso se extrae la secuencia del UCSC Genome Browser tomando por lo
menos 100 pares de bases corriente arriba y corriente debajo de la región de franco interés.
A continuación se muestra la secuencia de interés de MBP, resaltada en amarillo. Se
tomaron 136 pares de bases, corriente arriba y corriente abajo para facilitar la búsqueda
de «primers» que estudie por lo menos una parte de dicha región, se toma la hebra sentido.
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
GCTTTGGCCACCCGCGGCAGGTGGTGCAGCAGCCCCGCTCTGAGCAGGGATCCGCGGAGCTCGCCA
GCCCTAGACCGGATCCCAGGGAGGAGGCGCGGCCGGAGCCAAAGCGCAGAGGCCTCCCTCCCTCGC
GCGCCGGGTCGCACTTCATTCCTGCACAGGCAGAATCATCTGGCTTCTGCAAAGCAGTCGCGCAGC
GCTGTAGGGTGAGGCCGGCGTGGGAATCTAGGGAAGGCTGGAGGCAAACACCGCAGGAGGAGGGGA
GGGGAGGGGAGGCGAGCCGGGAGGCCTGGGGAGGGGAGCCTGGGCGCGCCCCGGGCAGCTCCTCTT
GGGCCGGGTTCCTCCTTCCAG
No fue posible diseñar primers dentro de los parámetros ideales mediante Bi-Search para
la región de interés resaltada en amarillo y evitando caer sobre CpGs para seguir el criterio
de independencia de Clark (Hernandez et al., 2013).
PASO 2
Se utiliza la herramienta «Detailled bisulfite converter for MS-HRM desing» ingresando la
secuencia mostrada en el paso 1 y se obtiene la siguiente secuencia; la secuencia de
interés de MBP, resaltada en amarillo:
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
gTtttggTTaTTCGCGgTaggtggtgTagTagTTTCGTtTtgagTagggatTCGCGgagTtCGTTa
gTTTtagaTCGgatTTTagggaggaggCGCGgTCGgagTTaaagCGTagaggTTtTTTtTTTtCGC
GCGTCGggtCGTaTttTattTTtgTaTaggTagaatTatTtggTttTtgTaaagTagtCGCGTagC
GTtgtagggtgaggTCGgCGtgggaatTtagggaaggTtggaggTaaaTaTCGTaggaggagggga
ggggaggggaggCGagTCGggaggTTtggggaggggagTTtgggCGCGTTTCGggTagTtTTtTtt
gggTCGggttTTtTTttTTag
273
ANEXOS
PASO 3
>chr18:74799359-74799709 (dirección 5' – 3')
gTtttggTTaTTCGCGgTaggtggtgTagTagTTTCGTtTtgagTagggatTCGCGgagTtCGTTagTTTta
gaTCGgatTTTagggaggaggCGCGgTCGgagTTaaagCGTagaggTTtTTTtTTTtCGCGCGTCG
ggtCGTaTttTattTTtgTaTaggTagaatTatTtggTttTtgTaaagTagtCGCGTagCGTtgta
gggtgaggTCGgCGtgggaatTtagggaaggTtggaggTaaaTaTCGTaggaggaggggaggggaggggaggCGa
gTCGggaggTTtggggaggggagTTtgggCGCGTTTCGggTagTtTTtTttgggTCGggttTTtTT
ttTTag
1 PCR product(s) on the bisulfite transformed sense chain
Forward primer: GTAGGTGGTGTAGTAG
M 166 + 209
U 246 + 285
Reverse primer: CCTCCAACCTTCCCTAA
M 409 + 436
U 463 + 497
1. Chromosome 18 (len: 227)
77087418
GTAGGTGG TGTAGTAGTT
TTGTTTTGAG TAGGGATTTG TGGAGTTTGT TAGTTTTAGA TTGGATTTTA
GGGAGGAGGT GTGGTTGGAG TTAAAGTGTA GAGGTTTTTT TTTTTTGTGT
GTTGGGTTGT ATTTTATTTT TGTATAGGTA GAATTATTTG GTTTTTGTAA
AGTAGTTGTG TAGTGTTGTA GGGTGAGGTT GGTGTGGGAA TTTAGGGAAG
GTTGGAGGT
77087645
Calculating the score of a primer pair
No
Sc
Primer sequences
1.
25.30
Plen
%GC
Tm
Sa
Sea
Pa/Pea
GTAGGTGGTGTAGTAG
16
50.0
51.7
8
0
22
CCTCCAACCTTCCCTAA
17
52.9
58.2
8
4
6
Abreviaturas en BiSearch. Sc: Score; Fpcr: Do Fast (electronic) PCR with the primer pairs; Pseq: Primer
sequence; Pos: Position of the primer; Plen: Primer length; %GC: Content of G and C in percent; Tm: Melting
temperature; oTm: Melting temperature of original primer (C are not translated to T); CpG: Number of CpG
islands in the unmodified PCR product; Sa: Self annealing; Sea: Self end annealing; Pa: Pair annealing; Pea:
Pair end-annealing; Len: Length of the PCR product.
274
Título de Tesis: Estudio de Metilación de ADN en enfermedad de Alzheimer orientado hacia
neuronas piramidales corticales y su concordancia con leucocitos de sangre periférica:
identificación de perfiles en el epigenoma humano
Anexo 27. Ilustración de controles de calidad de software Epigenetic Sequencing
MEthylation (ESME) creado para el proyecto epigenoma humano (Eckhardt et al., 2006;
Lewin et al., 2004) y utilizado en el presente trabajo.
Epigenetic Sequencing MEthylation (ESME)
Quality Controls (QCs)
La gráfica esquematiza este proceso que consta en resumen, el archivo de lectura del trazado generado por
el secuenciador automático ABI, es cargado en un entorno de línea de la consola de comandos en Linux, se
realizan controles de orden (o entropía), verificación de alineamiento perfecto con la secuencia evaluada,
posteriormente, se realiza la corrección de los picos del electroferograma, pues su comportamiento difiere del
de la secuenciación convencional, dado el desbalance de dinucleósidos requeridos durante este tipo de
secuencias y finalmente se realiza una estimación matemática del porcentaje, o tasa, de metilación basada en
la altura de los picos en las citosinas únicamente en el interior de secuencias dinucleotídicas CpGs que
superaron los controles de calidad, considerados resultados confiables de metilación de ADN (Eckhardt et al.,
2006; Lewin et al., 2004). Figura tomada de la referencia sin modificaciones (Lewin et al., 2004).
275
ANEXOS DIGITALES
13 ANEXOS DIGITALES
Blood_Sig_Table_Q
N_+_.BMIQ_+_COMBAT.xlsx
Anexo digital 1. Archivo de tablas en formato Excel de resultados DMPs en estudio en sangre periférica. Hoja
1. Los resultados completos de las sondas diferencialmente metiladas con estadísticos (valor de p crudo y
corregido, Delta de Beta y valor B). Hoja 2. Muestra las asignaciones génicas para sondas diferencialmente
hipermetiladas. Hoja 3. Muestra asignaciones génicas de sondas diferencialmente hipometiladas. Hoja 4 y
Hoja 5. Muestran las sondas con soporte de DMR hipermetiladas e hipometiladas respectivamente. Archivo
en formato Excel 2013.
Blood_Ranges_DM
Rcate.xlsx
Anexo digital 2. Archivo de tablas en formato Excel de resultados DMRs en estudio en sangre periférica. Hoja
1. Los resultados completos de las sondas diferencialmente metiladas con estadísticos (valor de p cruda y
corregido, Delta de Beta y valor B). Hoja 2. Muestra las asignaciones génicas para las regiones
diferencialmente hipermetiladas. Hoja 3. Muestra asignaciones génicas de las sondas diferencialmente
hipometiladas. Archivo en formato Excel 2013.
