Download Detección de hipermetilación de promotores de genes supresores

VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
de Anatomía Patológica — Octubre de 2006
Aiala Lorente
Edurne Urdangarín
Paula Lázcoz
Javier Sáez Castresana
Unidad de Biología de Tumores
Cerebrales, Universidad de
Navarra, Pamplona
Correspondencia:
Javier Sáez Castresana
Unidad de Biología de Tumores
Cerebrales, Universidad de Navarra
C/ Irunlarrea 1,
31008 Pamplona, España
Telf: +34 948 425 600
Fax: +34 948 425 652
E-mail: jscastresana@unav.es
http://conganat.cs.urjc.es
Patología Molecular
Detección de hipermetilación de promotores de genes
supresores tumorales en tumores del sistema nervioso
mediante PCR a tiempo real y análisis de la curva de
melting
INTRODUCCIÓN: En este estudio se presenta un método semicuantitativo
de PCR a tiempo real para detectar hipermetilación de promotores utilizando el fluorocromo SYBR Green, basado en el análisis de la curva de melting.
Se utilizan una pareja de cebadores que amplifican la secuencia de ADN independientemente de su estado de metilación. El análisis de la posición y la
altura de los picos obtenidos en la curva de melting, realizada tras el proceso
de amplificación, revela el estado y la cantidad aproximada de metilación de
cada muestra. MATERIAL Y MÉTODOS: El trabajo se realizó sobre 12 astrocitomas, 4 líneas celulares de astrocitoma (GOS3, A172, MOG-G-CCM,
T98G) y 4 de neuroblastoma (SIMA, IMR32, SK-NMC, MC-IXC). Se extrajo DNA, se trató con bisulfito sódico y se realizaron las PCRs (MSP estándar y PCR a tiempo real) para los genes supresores tumorales RASSF1A
(3p21.3), BLU (3p21.3) y MGMT (1q32.1). RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Se consiguió analizar el estado de metilación y no metilación, con
respecto a los picos de los controles de ADN metilado y ADN no metilado, respectivamente, en todos los genes y casos analizados. El 50 % de
las líneas y el 17 % de los tumores revelaron hipermetilación de BLU. Para
RASSF1A, dieron positivas el 100 % de las líneas y el 58 % de los tumores.
En el caso de MGMT, el 88 % de las líneas y el 42 % de los tumores mostraron resultados positivos. Los resultados sugieren que esta técnica puede ser
utilizada para el estudio de hipermetilación de promotores. Los datos obtenidos mediante PCR a tiempo real concuerdan con los obtenidos mediante
MSP estándar en un 72 % de los casos. Estos resultados pueden ser debidos
a la diferente sensibilidad y/o especificidad de ambas técnicas.
Palabras clave: metilación; genes supresores tumorales; PCR a tiempo real;
curva de melting
INTRODUCCIÓN
La hipermetilacion de citosinas en la region promotora
de un gen es un mecanismo por el que algunos genes
pueden verse silenciados. En este estudio se presenta un
método semicuantitativo de PCR a tiempo real para detectar hipermetilación de promotores utilizando el fluorocromo SYBR Green, basado en el análisis de la curva
de melting. Se utiliza una pareja de cebadores que amplifican la secuencia de ADN independientemente de su
estado de metilación. Tras el proceso de amplificacion,
se somete al producto de PCR a un graciente creciente de temperatura a la vez que se detecta la fluorescencia
emitida (curva de melting) Segun incrementa la temperatura, el producto de PCR se desnaturaliza, el flurocromo
se libera y deja de emitir fluorescencia. Una transformacion matematica de la gráfica, realizada por el software,
permite detectar la disminución de fluorescencia como
picos. El ADN que se amplifica está tratado con bilufito
sódico, reactivo que transforma las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que la metilacion proteje a las
citosinas del cambio. Por tanto, tras el tratamiento, habrá un cambio de secuencia entre el ADN que estaba
metilado y el que no lo estaba. Este cambio de secuencia
dará lugar a una diferente temperatura de melting, siendo mayor en el ADN metilado que en el no metilado. El
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análisis de la posición y la altura de los picos obtenidos
en la curva de melting, realizada tras el proceso de amplificación, revela el estado y la cantidad aproximada de
metilación de cada muestra.
MATERIAL Y MÉTODOS
El trabajo se realizó sobre 12 muestras humanas de astrocitoma, 4 líneas celulares de de astrocitoma (GOS3,
A172, MOG-G-CCM, T98G) y 4 de neuroblastoma (SIMA, IMR32, SK-NMC, MC-IXC). Se extrajo DNA, se
trató con bisulfito sódico y se realizaron las PCRs (MSP
estándar y PCR a tiempo real) para los genes supresores
tumorales RASSF1A (3p21.3), BLU (3p21.3) y MGMT
(1q32.1). Se utilizó ADN extraido de sangre como control de ADN no metilado y ADN metilado comercial como control positivo de metilación.
RESULTADOS
Se ha conseguido analizar el estado de metilación y no
metilación, con respecto a los picos de los controles de
ADN metilado y ADN no metilado, respectivamente, en
todos los genes y casos analizados Algunas muestras se
encontraron totalmente metiladas (Figura 1), en otras había mezcla de DNA metilado y DNA no metilado (Figura 2) y en algun caso se encontró un pico intermedio
entre el control metilado y el control no metilado, sugiriendo una proporción intermedia de citosinas metiladas
en su secuencia (Figura 3). El 50 % de las líneas y el
17 % de los tumores dieron hipermetilacón de BLU. Para RASSF1A, dieron positivas el 100 % de las líneas y
el 58 % de los tumores. En el caso de MGMT, el 88 %
de las líneas y el 42 % de los tumores dieron resultados
positivos.
DISCUSIÓN
Estos datos sugieren que esta técnica puede ser utilizada
para el estudio hipermetilación de promotores. Comparando los datos obtenidos se ha encontrado que, en conjunto, los datos obtenidos en la PCR a tiempo real concuerdan con los obtenidos en MSP estándar en un 72 %
de los casos. Estos resultados pueden ser debidos a la diferente sensibilidad y/o especificidad de ambas técnicas
o también a las diferentes parejas de cebadores utilizados en cada una.
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ICONOGRAFÍA
Figura 1.- MCA-Met para el gen BLU en las líneas de astrocitoma T98G y GOS-3. La gráfica muestra el control no
metilado en rojo y el control metilado en verde. A: Línea T98G, en marrón, no metilada. B: Línea GOS-3, en marrón,
metilada.
Figura 2.- Analisis del gen RASSF1A mediante MCA-Met de la muestra tumoral 33. La gráfica muestra el control
no metilado en rojo, el control metilado en verde y la muestra, con ambos picos metilado y no metilado, en marrón.
Figura 3.- MCA-Met del gen MGMT en la línea celular SK-NMC. El pico de la muestra (marrón) aparece entre los
picos metilado (verde) y no metilado (rojo), esto sugiere un estado de metilación intermedio, con una proporción de
CpGs metiladas en su secuencia.
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Tabla 1.- Estudio de hipermetilación por MSP y PCR a tiempo real de los genes BLU, RASSF1A y MGMT en lineas
celulares de astrocitoma y neuroblastoma. a: U, banda o pico no metilado; M, banda o pico metilado; UM, pico o
banda tanto metilado como no metilado. En el caso de la PCR a tiempo real se muestra la cantidad aproximada de
DNA metilado presente en cada línea celular. b: Pico en temperatura intermedia entre el control metilado y el control
no metilado, sugiriendo un estado intermedio de metilación de sus citosinas.
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