Download métodos para la detección del rotavirus

11. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DEL ROTAVIRUS
Actualmente existen diversos métodos en el mercado que pueden utilizarse
para el diagnóstico de rotavirus, las cuales pueden realizarse directamente a partir
de la materia fecal, fundamentalmente buscando antígenos específicos del grupo
A (VP6).54
De tal forma que la técnica de elección dependerá del equipo y reactivos
con que se disponga cada laboratorio de análisis clínicos.54
Varios métodos para la identificación del rotavirus o antígeno del mismo en
heces han sido desarrollados en la actualidad. Los métodos más usados son:
microscopia electrónica, inmunoensayos enzimáticos como ELISA (Inmunoensayo
ligado a la absorción de enzimas), y aglutinación en látex, en ciertas ocasiones se
llega a utilizar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .55-57
11.1Microscopía Electrónica
El descubrimiento de rotavirus mediante inmunoelectromicroscopia permitió
caracterizar la morfología del virus y, consecuentemente utilizar la microscopia
electrónica.58
Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los
viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del
costo del microscopio.59
Es necesaria una alta concentración de viriones (aproximadamente 109
partículas virales/mL. dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es
poco sensible.59
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Esto hace que sea una técnica poco utilizada, más aún con el desarrollo de
técnicas alternativas de utilidad similar.59
El microscopio electrónico nos permite obtener resultados positivos rápidos
de muestras de materias fecales de pacientes con diarrea, ya que tanto los
rotavirus como los adenovirus, coronavirus y calcivirus pueden ser visualizados e
identificados como causantes de enfermedad.59
También existen otras muestras en las que puede ser de gran utilidad la
microscopia electrónica ellas son: líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas,
orina o suero es posible obtener resultados positivos, mediante coloración
negativa.59
Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja, y por tanto no
visible directamente por microscopio electrónico, se pueden utilizar técnicas que
aumenten la visualización, como lo es la inmunoelectromicroscopia, que consiste
en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados
de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas solas.59
11.2 Inmunocromatografía
Son inmunoensayos en fase solida donde se fijan los anticuerpos
específicos para el virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca.60
Se emplea como sistema de amplificación del conjugado, el oro coloidal
para aumentar la sensibilidad del método. Posteriormente se pone en presencia
del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez
que ocurre la reacción antígeno-anticuerpo la cual es observada por la
acumulación de oro coloidal del conjugado en el papel de nitrocelulosa), se hace
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un lavado y se agrega un anticuerpo marcado de captura, que depende de la
marcación del anticuerpo observar figura 11.60
Los más conocidos son: ELISA (Inmunoensayo ligado a la absorción de
enzimas), y la aglutinación en látex dependiendo del trazador que se utilice para
evidenciar la reacción.60
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C
T
Fundamento de inmunocromatografía para detección
de antígenos
Anticuerpos de detección
Marcados con oro coloidal
G
G
Antígenos en
muestra
Anticuerpo de
captura
Contra anticuerpo
Anticuerpo de
captura
Contra anticuerpo
Figura 11. Técnica de inmunocromatografía.60
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11.3 Elisa (Inmunoensayo ligado a la absorción de enzimas) El método de
Elisa es capaz de detectar 106 partículas virales por gramo de heces, lo cual lo
hace más sensible que el microscopio electrónico.60
El uso de anticuerpos monoclonales incrementa aún más la sensibilidad y
especificidad de esta prueba.60
Existen una gran cantidad de métodos de ELISA comerciales los cuales
varían en cuanto a sensibilidad y especificidad dependiendo de la casa comercial
y si la prueba está hecha con anticuerpos monoclonales, policlonales o ambos.60
Los ELISA comerciales detectan únicamente rotavirus del grupo A (utilizan
anticuerpos anti-VP6). Los cuales tienen como finalidad el diagnóstico de la
infección por rotavirus mediante el uso de anticuerpos monoclonales que detectan
la existencia del antígeno vírico VP6 (cápside interna del virión) en muestras de
heces fecales.60
Los cuales generan complejos inmunes que pueden ser visibles incluso
mediante microscopia electrónica. Con esta técnica se es posible procesar una
gran cantidad de muestras clínicas de forma rápida y sencilla.60
No obstante puede haber resultados falsos positivos, por lo que se
recomienda que aquellas muestras positivas obtenidas fuera del periodo
epidémico se repitan nuevamente, la figura 12 muestra la placa donde se realiza el
estudio para la detección de RV. Las ventajas de esta prueba permiten obtener
resultados de una forma rápida y fácil, tiene poca complejidad técnica, es de fácil
manipulación, emplea pocos reactivos y proporciona una información diagnóstica
rápida, debido a que los resultados se obtienen en un periodo de 30 minutos, lo
cual resulta muy conveniente para el tratamiento de esta enfermedad.60,61
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Figura 12. ELISA. Detección de antígeno viral en heces para Rotavirus.62
Pozos color amarillo positivos a rotavirus. Pozos incoloros negativos a
rotavirus.
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11.4 Aglutinación de Látex.
Esta técnica se usa comúnmente para la
demostración de antígenos de rotavirus en materias fecales.63
Las partículas de látex son esferas de poliestireno que se unen fácilmente
al fragmento cristalizable (Fc) de moléculas de inmunoglobulina G (IgG) o
inmunoglobulina M (IgM), esta última es mucho más eficiente en aglutinar
partículas naturales.63
Los fragmentos de unión del anticuerpo (FAb) quedan expuestos y son
capaces de unirse al antígeno que se encuentra en la muestra.63
Cuando los antígenos tienen varios epítopes (o estructuras antigénicas
repetitivas), los anticuerpos multivalentes acoplados a múltiples partículas de látex
se unen al antígeno y se produce un entramado de las partículas de látex que dan
como resultado una aglutinación visible.63
Esta es fácil de realizar, requiere sólo unos minutos y no necesita equipo, la
imagen 13 muestra donde el resultado se puede leer a simple vista. Sin embargo,
ofrece como desventaja la presencia de reacciones cruzadas sobre todo con otros
antígenos en la muestra y también ocurren interferencias por el fenómeno de
prozona, en el que un exceso de anticuerpos no permite la formación del
entramado.63
Esta técnica se usa comúnmente para la demostración de antígenos de
rotavirus en materias fecales.63
53
Figura 13. Aglutinación de látex62
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11.5 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Conocida como PCR
(siglas en inglés de polymerase chain reaction) mediante esta técnica se pueden
encontrar cantidades mínimas del ácido nucleído del rotavirus en muestras de
heces fecales gracias a la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de
nucleótidos de un microorganismo determinado que hace un proceso de síntesis
de ADN.64
En la Actualidad se han desarrollado técnicas de PCR para muchos de los
virus productores de gastroenteritis, aunque no se utilizan de forma rutinaria.64
Estas técnicas son más sensibles que los métodos de inmunoensayo, se
suelen utilizar para confirmar los resultados de otras técnicas y son también útiles
para el estudio de muestras como LCR o suero y muestras ambientales, como
ocurre en el caso de rotavirus con las técnicas de transcripción inversa y reacción
en cadena de la polimerasa (RT-PCR).64
Vemos en la figura 14 los tres pasos fundamentales de la PCR:
a) La desnaturalización del ADN en la muestra, lo que se logra al someterlo a
altas temperaturas (95º C) para lograr la separación de las cadenas.
b) La hibridización de los cebadores (a 55º C) que son unos fragmentos cortos de
ADN complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias por amplificar y a
partir de los cuales se inicia la síntesis.
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1= Primer paso. Mezcla de reacción
5= Desnaturalización
2= Desnaturalización
6= Hibridación y extensión
3= Hibridación y extensión
7= ADN duplicado
4= ADN duplicado
FIGURA 14. PCR
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c) La extensión de estos cebadores por la enzima ADN polimerasa (a 72º C)
termoestable (polimerasa extraída de la bacteria Thermus aquaticus) que produce
dos bandas de ADN que son idénticas a la banda blanco original.64, 65
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