Download Rapid Detection of Pathogens in Food

Detección de Bacterias Patógenas:
Aislamiento y Confirmación de Resultados
Detección de Salmonella
Norma ISO 6579 para la Detección de Salmonella
Día
1
Día
2
Día
3
Día
4
4 días
25 gr muestra
en 225 ml Agua Peptonada
16 - 20 h / 35 - 37 °C
0.1 ml Agua Peptonada
a 10 ml Caldo RVS
24 h a 41.5°C
1 ml Agua Peptonada
a 10 ml Caldo MKTT
24 h a 37°C
Agar XLD
Cualquier otro
24 h / 35-37°C Salmonella Agar
1 plato 14 cm / 1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
2 platos 9 cm
Agar XLD
Cualquier otro
24 h / 35-37°C Salmonella Agar
1 plato 14 cm / 1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
2 platos 9 cm
Interpretación del crecimiento
11 medios
Día
5
Para confirmación: tome 5 colonias sospechosas de cada
plato y plaquee en Agar Nutritivo 18 - 24 h / 35 - 37 °C
Día
6
Pruebas Bioquímicas/Serológicas de Confirmación
Método FDA-BAM
para la Detección de Salmonella
Día
1
Día
2
1 ml de Caldo Lactosa a
10 ml selenito Cisteina
24 h a 35°C
Agar Hecktoen
Día
3
Día
4
4 días
25 g/ml de muestra
en 225 ml Caldo Lactosa
16 - 20 h / 35 - 37 °C
24± 2 h a 35 °C
3 platos de cada
Caldo selectivo
1 ml de Caldo Lactosa a
10 ml Caldo TT
24 h a 35°C
Agar XLD
Agar Bismuto Sulfito
24± 2 h a 35 °C
24± 2 h a 35 °C
Interpretación del crecimiento
9 medios
Día
5
Para confirmación: tome 5 colonias sospechosas de cada
plato y plaquee en Agar Nutritivo 18 - 24 h / 35 - 37 °C
Día
6
Pruebas Bioquímicas/Serológicas de Confirmación
Enriquecimiento en 24 horas:
Caldo Salmosyst ®
25 g/ml de MUESTRA
en Caldo SALMOSYST®
6 h / 35 - 37 °C
Agregar 1 tableta de
SALMOSYST® SUPLEMENTO
A 10 ml de Caldo SALMOSYST®
y continúe incubando
18 h / 35 - 37 °C
Día
1
AISLE EN AGARES PARA
SALMONELLA
Día
2
Sólo 1
Medio
Agar Rambach®
Los medios de cultivo tradicionales para
Salmonella se basan en la producción de H2S:
Desventaja:
Citrobacter y Proteus enmascaran la Salmonella
Alto número de falsos - positivos
Agar Rambach®
Sistema Diferencial
Rojo
Violeta
Incolora
Salmonella
Coliformes
Otras bacterias
Salmonella
Ssitema Selectivo
Desoxycolato de Sodio
Proteus
Principio
1.
Salmonellae degrada el propilenglicol produciendo ácido.
El Rojo Neutro da el color rojo de las colonias
2.
Las bacterias  galatosidasa positivo degradan el sustrato
cromogénico produciendo colonias azul-violeta
Coliformes
AGAR XLT4
Sistema Diferencial
Negro
Negro con halo amarillo
Incoloras con halo amarillo
Incoloras
Salmonellae
Citrobacter
Bacterias Xilosa-Lactosa-Sucrosa positivo
Otras bacterias ej. Shigella
Salmonella
Sistema Selectivo
Tergitol 4: inhibe Proteus
Principio
Citrobacter
Formación de H2S via tiosulfato
y hierro produce colonias negras
Disimilación de los azúcares produce ácido (rojo fenol cambia de rojo a amarillo
Prueba Rápida Immunológica
Singlepath® Salmonella para la Detección de Salmonella en
Alimentos
25 g/ml de muestra
en 225 ml Agua Peptonada
35-37 °C por 16-20 h
Día
1
Día
2
Día
3
Día
4
sólo
2 días
sólo
2 medios
0.1 ml AP a 10 ml Caldo RVS
42°C por 24 h
Calentar por 15 min a 95°C
NO
SI
Salmonella
presente
Salmonella
presente
Si es positivo, se requiere confirmación por
cultivo y pruebas bioquímicas
SEMBRAR
EN RAMBACH
37 °C POR 24 h
Principio : Singlepath® Salmonella
Evaluación de Singlepath® Salmonella:
aprobación AOAC

Evaluada con 105 especies de Salmonella y 58 no Salmonella

Demostró la detección de Salmonella sp a niveles bajos de contaminación:
1-10 ufc/25 gr, a partir de las siguientes matrices:
- Leche descremada en polvo
- Pimienta negra
- Alimento deshidratado de mascotas
- Coco deshidratado
- Langostinos congelados
- Carne cruda molida de res
- Carne cruda molida de pavo

Sensibilidad y especificidad: >98%

Certificate of Performance Tested Status : Certificate N° 060401
Metodologías: Patógenos/Bacterias
Muestra
1.-
= Patógeno
2.-
Caldo enriquecimiento selectivo
Caldo enriquecimiento
PCR Tiempo Real
3.- Aislamiento/identificación
Introducción del qPCR (cuantitativo PCR)
Caldo de Enriquecimiento + muestra
(metodología tradicional, FDA, ISO)
En solamente 100 minutos desde el comienzo hasta el resultado
Comienzo
Cultivo
enriquecido o
colonia aislada
20 min
40 min
Preparación
muestra
PCR-set up
90 min
PCR
100 min
Detección
y Análisis
De la Muestra al Resultado - Salmonella
Convencional
PCR
Enriquecimiento No-selectivo
16 – 20h
Enriquecimiento Noselectivo
16 – 24h
Enriquecimiento Selectivo
24h
1. Medio Sólido
24h
2. Medio Sólido
24h
Aislamiento/Incubación
24h
Baterias
Bioquímicas
4h
Verificación
Serológica
4h
Preparacion Muestra
0.5h
Amplificación/Detección
1h
Tiempo ahorrado: neg. result > 2 d
pos. result > 4 d
Métodos de Detección para
Listeria y L. monocytogenes
Medios para el aislamiento de Listeria
• Agar PALCAM
– Listeria spp.
• Agar OXFORD
– Listeria spp.
• Agar Selectivo para Listeria acc. to AGOSTI & OTTAVIANI
– Listeria monocytogenes
– Medio cromogénico
– Nuevo medio obligatorio en el ISO Standard 11290 ( 2004 )
Medios para el aislamiento de Listeria
* Los Agares PALCAM y OXFORD se basan en el desarrollo del
color negro por la hidrólisis de la esculina.
* El Agar PALCAM contiene manitol
para diferenciar Enterococci por la
fermentación del manitol (color amarillo)
Agar Base Selectivo para Listeria ChromoCULT ALOA
Principio de funcionamiento
• Formulado bajo norma ISO 11290 (2004) y FDA-BAM 2003
• Principio de detección de Listeria monocytogenes:
1. “sustrato definido” o “sustrato cromogénico” :
detección de la enzima -D-glucosidasa
2. sustrato L-alfa fosfatidilinositol:
detección del factor de virulencia de L. monocytogenes (PI-PLC)
- D Glucosidasa
PI-PLC
Agar Chromocult® para Listeria
L. innocua
L. monocytogenes
Agar Chromocult ALOA acc. a la Norma ISO
Listeria spp.
Listeria monocytogenes.
Método ISO 11290-Parte 1
Día
1
Día
3-4
SEMBRAR
EN ALOA® +
PALCAM
37°C POR 24 - 48h
25 g/ml MUESTRA
EN 225 ml CALDO FRASER A ½
CONCENTRACIÓN
30°C POR 24h
0.1 ml EN 10 ml FRASER
35 ó 37°C POR 48h
SEMBRAR
EN ALOA® + PALCAM
37°C POR 24 - 48h
Día
3-6
Día
4-7
Todas las colonias que muestran color azul verdoso con halo opaco y/o color gris/verdoso con una
zona negra, son presuntivas de L. monocytogenes (colonias típicas).
Las colonias sospechosas deben ser confirmadas.
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA: GRAM (+), CATALASA (+), MOVILIDAD (+),
CAMP (+),  HEMOLISIS (+), GLUCOSA (+), RHAMNOSA (+), XYLOSA (-)
Método para Recuento ISO 11290-Parte 2
L. monocytogenes en Alimentos
Día
1
MUESTRA
0,1 ml
Inocule en AgarALOA®
37°C
24 - 48 h
Día
2-3
Contar todas las colonias azulverdoso con halo opaco
Día
4-5
Confirmación Bioquímica
Método FDA-BAM
Día
1
Día
2-3
25 g/ml MUESTRA
EN 225 ml Buffered LEB
30 °C por 4 h
Después 24 h
SEMBRAR
EN ALOA®
37 °C
Por 24 – 48 h
Día
3-5
Día
6
Agregar agentes
selectivos
30 oC por 44 h
SEMBRAR
EN OXFORD
35°C
Por 24 – 48 h
Después de 48 h
SEMBRAR
EN ALOA®
37 °C
por 24 – 48 h
SEMBRAR
EN OXFORD
35°C
po 24 –48 h
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Método IDF-FIL para leche y productos lácteos
Día
1
25 g/ml MUESTRA
en 225 ml LEB
30 °C por 48h
Día
2
Día
3-5
Día
6
SEMBRAR
EN AGAR
OXFORD
30, 35 ó 37 °C
por 24 – 48 h
ó
SEMBRAR
EN AGAR
PALCAM
30, 35 ó 37 °C
por 24 – 48 h
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Método USDA para carnes rojas, pollo, huevos y
medio ambiente
Día
1
Día
2
25 g/ml de MUESTRA
en 225 ml Caldo UVM I
30 °C por 24 h
0.1 ml a 10 ml de
Caldo UVM II ó FRASER
35 oC por 24 h
SEMBRAR EN
AGAR OXFORD
35 °C por 24-48h
Día
3-5
Día
6
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Singlepath® L´mono
-
Primera prueba rápida en el mundo para la detección específica de
Listeria monocytogenes
-
Para el tamizaje de muestras ambientales y de alimentos, como productos
lácteos, salmón ahumado, hígado de ganso
-
Para la confirmación de colonias sospechosas de Listeria,
aisladas de agares selectivos como PALCAM, Chromocult®
Listeria Agar, ALOA
-
Límite de Detección: 2x 106 ufc/ml
-
Medio de enriquecimiento usado: Fraser, LEB, UVM
Detección Rápida Immunológica de Listeria monocytogenes en Alimentos con Singlepath® L ´ mono
25 g/ml muestra
en 225 ml LEB o UVM II
a 30 °C por 21-24 h
Día
1
0,1 ml en 10 ml LEB,
UVM II 30oC por 21- 24h
Día
2
Día
3
NO
SI
Listeria mono
presente
Listeria mono
presente
Solo en 20
minutos
Si es positivo, se requieren
confirmación por cultivo o pruebas bioquímicas
ALOA
30, 35 o 37 °C
por 24 h
Singlepath L’ Mono® y Chromocult ALOA
Confirmación perfecta
Suspender 1 - 5 colonias
sospechosas en 250 µl de
Caldo BHI
Agar ALOA®
1 h at 37°C
Agar PALCAM Agar OXFORD
180 µl
L. monocytogenes
no confirmada
L. monocytogenes
confirmada
De la Muestra al Resultado – Listeria monocytogenes
Convencional
Enriquecimiento No-selectivo
24 h
PCR
Enriquecimiento
Selectivo
Enriquecimiento Noselectivo
24 – 48h
24 – 48 h
Preparacion Muestra
0.5h
1. Medio Sólido
24 h
Amplificación/Detección
1h
Aislamiento/Incubación
24 h
Baterias
Bioquímicas
4h
Verificación
Serológica
4h
Tiempo ahorrado: neg. result > 2 d
pos. result > 4 d
Introducción del qPCR (cuantitativo PCR)
Caldo de Enriquecimiento + muestra
(metodología tradicional, FDA, ISO)
En solamente 100 minutos desde el comienzo hasta el resultado
Comienzo
Cultivo
enriquecido o
colonia aislada
20 min
40 min
Preparación
muestra
PCR-set up
90 min
PCR
100 min
Detección
y Análisis