Download Evaluación in vitro de actividad antimicrobial de 23 cepas

Evaluación in vitro de actividad antimicrobial
de 23 cepas bacteriales no identificadas en
contra de Burkholderia glumae
María Alejandra Caldera Domínguez
Zamorano, Honduras
Noviembre, 2011
i
ZAMORANO
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
Evaluación in vitro de actividad antimicrobial
de 23 cepas bacteriales no identificadas en
contra de Burkholderia glumae
Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar
al título de Ingeniera Agrónoma en el
Grado Académico de Licenciatura
Presentado por
María Alejandra Caldera Domínguez
Zamorano, Honduras
Noviembre, 2011
ii
Evaluación in vitro de actividad antimicrobial
de 23 cepas bacteriales no identificadas en
contra de Burkholderia glumae
Presentado por:
María Alejandra Caldera Domínguez
Aprobado:
_________________________
Jeffery Pack, D.P.M.
Asesor principal
___________________________
Abel Gernat, Ph.D.
Director
Carrera de Ingeniería Agronómica
__________________________
Singh Raghuwinder, D.P.M.
Asesor
____________________________
Raúl Espinal. Ph.D.
Decano Académico
iii
RESUMEN
Caldera Domínguez, M.A 2011. Evaluación in vitro de actividad antimicrobial de 23
cepas bacteriales no identificadas en contra de Burkholderia glumae. Proyecto especial de
graduación del programa de Ingeniería Agronómica, Escuela Agrícola Panamericana,
Zamorano. Honduras. 24 p.
El añublo bacterial de la panícula del arroz causada por Burkholderia glumae se ha
incrementado en los últimos años, convirtiéndose en una gran amenaza para la producción
de arroz en América Central, el Caribe, Asia, Colombia y estados productores de arroz en
Estados Unidos. El incremento se debe a las altas temperaturas, humedad relativa
favorable para el desarrollo de este patógeno y al alto porcentaje de semillas infectadas
plantadas por los agricultores de arroz. El objetivo de este ensayo fue evaluar la actividad
antimicrobial in vitro de 23 cepas bacteriales aisladas de diferentes variedades de arroz, en
contra de Burkholderia glumae (336 gr-1) y que previamente habían mostrado actividad
antimicrobial contra Rhizoctonia solani. La evaluación se llevó a cabo en incubadoras a
30°C, 37°C y a temperatura ambiente. Se usaron dos testigos, platos Petri con
Burkholderia glumae y con Escherichia coli. Dos experimentos preliminares fueron
analizados mediante estadística descriptiva y luego se utilizó un diseño completamente al
azar en el cual las medias fueron separadas mediante la prueba de Duncan. En el
laboratorio se evaluaron las 23 cepas de las cuales se seleccionaron 7 que mostraron
mayor inhibición en 30°C, 37°C y temperatura ambiente (22°C) en LB agar. La cepa
número 8 fue la que presentó mayor inhibición (0.5 cm) en temperatura ambiente mientras
que las cepas 2, 4 y 9 tuvieron mayor actividad en temperaturas de 30 °C y 37 °C.
Palabras clave: Añublo, Pseudomonas glumae, pudrición de arroz.
iv
CONTENIDO
Portadilla ..............................................................................................................
Página de firmas ...................................................................................................
Resumen ...............................................................................................................
Contenido .............................................................................................................
Índice de cuadros, figuras .....................................................................................
i
ii
iii
iv
v
1.
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 2
2.
MATERIALES Y MÉTODO .................................................................................... 3
3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 9
4.
CONCLUSIONES .................................................................................................... 19
5.
RECOMENDACIONES .......................................................................................... 20
6.
LITERATURA CITADA ......................................................................................... 21
v
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
Cuadros
Página
1. Interacción de cepas de bacterias en tres diferentes temperaturas.............................. 18
Figuras
Página
1. Plaqueado de cepas de bacterias no identificada ........................................................ 4
2. Plaqueado de cepas de bacterias no identificada ........................................................ 4
3. Línea en el centro de B. glumae, acompañada ........................................................... 5
4. Cuatro diferentes tipos de cepas de bacterias. ............................................................ 5
5. (A)Control negativo utilizando Burkholderia glumae (336gr-1) ............................... 6
6. Control negativo con Burkholderia glumae (336gr-1) ............................................... 6
7. Cepa número 13 después de 2 semanas ...................................................................... 10
8. Cepa número 16 después de 2 semanas. ..................................................................... 10
9. La cepa número 23 después de 2 semanas ................................................................. 10
10. Interior del plato Petri con solución de B. glumae y las cepas 2, 3,4 y 5 y reverso
del plato mostrando crecimiento y halo de inhibición marcado en las cepas 2 y 4. ... 11
11. Cepas número 6, 8, 10 y 11 en 30 °C. ........................................................................ 11
12. Cepas 8, 9,10 y 11 en temperatura ............................................................................. 12
13. Cepas número 14, 15 y 16 en ..................................................................................... 12
14. Cepas número 14,15 y 16 en 30 °C. ........................................................................... 12
15. Cepas número 17,19,20 y 22 en temperatura ambiente (22 °C). ................................ 13
16. Cepas número 1,13, 20 y 23 en 30 °C. ....................................................................... 13
17. Cepa número 2 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente ............................................. 14
18. Cepa número 4 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente ............................................. 14
19. Cepa número 8 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente ............................................. 14
20. Cepa nú mero 9 en 37 °C, 30 °C y temperatura ambiente. ......................................... 15
21. Cepa número 9 en 30 °C mostrando un halo de color amarillo fuerte. ...................... 15
22. Cepa número 10 en 37 °C, 30 °C y temperatura ambiente ......................................... 15
23. Cepa número 16 en 37 °C, 30 °C y temperatura ambiente. ........................................ 15
24. Cepa número 23 en 37 °C, 30 °C y temperatura ambiente......................................... 16
25. Evaluación de efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias en 30 °C. Datos en
la gráfica de barra con diferentes letras difieren significativamente entre sí
(P≤0.05) ...................................................................................................................... 16
vi
26. Evaluación de efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias no identificadas en
37° C. Datos en la gráfica de barra con diferentes letras difieren
significativamente entre sí (P≤0.05). .......................................................................... 17
27. Evaluación de efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias no identificadas en
Temperatura ambiente (22 °C). Datos en la grafica de barra con diferentes letras
difieren significativamente entre sí (P≤0.05). ............................................................ 17
1. INTRODUCCIÓN
El arroz es un cereal de gran importancia en la población asiática, así como en
Latinoamérica, el Caribe y África. Ocupa el segundo lugar después del maíz en mayor
producción a nivel mundial y se estima que siga creciendo en producción en los años
siguientes debido a que se ha expandido en 1.8 % por año, arriba del rango de crecimiento
poblacional (Calpe, 2002).Sin embargo, este incremento puede ser reducido en un futuro
por enfermedades que se han venido desarrollando en los últimos años y que se han
considerado como los mayores patógenos del futuro. Entre ellos está Burkholderia glumae
o comúnmente conocida como añublo bacterial de la panícula.
En los Estados Unidos, el arroz es sembrado en aproximadamente 1 millon de hectáreas y
en dos distintas regiones, California y muchos estados del sur: Arkansas, Louisiana,
Mississipi, Missouri y Texas. Este cereal ha sido cultivado en Louisiana por más de 300
años y hoy en día representa uno de los cultivos más importantes.
El arroz producido en el sur de los Estados Unidos ha tenido un gran historial de pérdidas
por pudrición bacterial de la panícula, pero su etiología era desconocida. Los síntomas de
pudrición ocurrieron durante 1995 y 1998 donde se registraron elevadas temperaturas, con
pérdidas de rendimientos en algunos campos de hasta el 40%. Pérdidas considerables
también fueron experimentadas en Louisiana durante 2000 y 2010.
La enfermedad también fue reportada en Panamá en el 2002 y 2005. Más tarde los
mismos síntomas fueron observados en países de Asia y Latinoamérica y a partir del año
2003 síntomas de vaneamiento en arroz fueron observados en zonas arroceras del pacifico
de Nicaragua causando pérdidas del 70-90% en campo.
La pudrición bacterial de la panícula ha sido atribuida a diferentes factores abióticos
incluyendo altas temperaturas, estrés hídrico y fitotoxicidad cerca de la zona radicular. Sin
embargo, durante 1996 y 1997 el agente causal fue identificado como Burkholderia
glumae en el sur de los Estados Unidos. Los síntomas del añublo bacterial de la panícula
fueron reportados por primera vez en Hungría (Klement, 1955) y el agente causal fue
descrita como Pseudomonas oryzicola, más tarde demostrado por Visnyovszky (1971) a
ser un sinónimo de Pseudomonas syringae pv. syringae (Ou, 1985) y fue descrita por
segunda vez en Japón en 1956 como causante de la pudrición del grano y plántula de
arroz. La Pudrición del grano de arroz se informó que es causada por varias
bacterias,incluyendo Pseudomonas glumae (Burkholderia glumae) de acuerdo con
Hashioka (1969) , la temperatura óptima para el crecimiento de Burkholderia glumae está
en un rango de 30-35 °C y un punto de muerte térmica de 70 ° C (Kurita et al., 1964).
2
Debido a que el arroz es uno de los cultivos más importantes, está claro que una distribución
amplia del añublo bacterial de la panícula se convertiría en una gran desventaja para la
economía mundial. Las consecuencias directas a nivel agronómico serian pérdidas en
rendimiento y estabilidad en producción, ya que este patógeno tiene el potencial de reducir el
rendimiento hasta en un 75% en regiones severamente afectadas debido al peso del grano,
esterilidad de los floretes e inhibición de la germinación de la semilla.
Características de Burkholderia spp. Burkholderia es considerada el mayor agente
bacterial causante de la pudrición del grano de arroz en Japón. B. glumae es una bacteria no
fluorescente que produce un pigmento amarillo-verde en algunos medios. Este
microorganismo tiene forma de barra y posee de 1-3 flagelos polares. La colonia es grisácea
blanca o amarilla debido al pigmento.
Virulencia. En 1989, se aislaron dos sustancias bioactivas de un filtrado proveniente de un
cultivo de B. glumae, identificadas como toxoflavin y fervenulin. Se indicó que estas
fitotoxinas pueden inducir manchas cloróticas en hojas de arroz. Toxoflavin es un sólido
amarillo cristalino que fue aislado por primera vez en 1933 de B. cocovenenans (Buckle et
al., 1990), lo que reduce el alargamiento de los brotes y las raíces de las plántulas de arroz
(Suzuki et al., 1998; Yoneyama et al.1998). Las fitotoxinas también fueron detectadas en
Burkholderia glumae y en algunas cepas de B. gladioli (Suzuki et al. 1998), y no solo de
filtrado de cultivo sino también de plántulas infectadas de arroz.
Síntomas y epidemiología. El estado crítico de infección se presenta en la emergencia de la
panícula y en floración causando esterilidad en los floretes, aborto y decoloración de granos
en desarrollo, pardeamiento de la hoja bandera y descoloración de la espiguilla a un color
grisáceo con la mitad del florete oscuro (Shahjahan, 2000b).
Síntomas. La enfermedad bacterial de rayado en la hoja de arroz, con decoloración de grano
se reportó que fue causado por Pseudomonas avenae (Kadota y Ohuchi, 1983). La pudrición
de la vaina y la decoloración del grano en Latinoamérica se creyeron que fueron causadas por
Pseudomonas glumae (Zeigler y Alvarez, 1987). Sin embargo, los diferentes patógenos
comparten síntomas similares entre ellos. Por ejemplo, P. syringae, P. fluorescens y B.
glumae causaron similares síntomas (Goto et al., 1987). Zeigler reportó los síntomas
producidos por Pseudomonas fuscovaginae como partes remojadas (watersoaking), necrosis
con márgenes mal formados y glumas decoloradas antes de que la panícula emergiera de los
botones. Granos infectados variaron de completamente decolorados y estériles a casi
asintomáticos con pequeños puntos café (Zeigler y Álvarez, 1987; Zeigler et al.,1987;
Zeigler y Álvarez, 1989a; Zeigler y Álvarez, 1989c).Síntomas típicamente causados por B.
glumae en Louisiana fueron pudrición de la panícula con decoloración del florete (de
grisáceo a un color pajizo), usualmente en la parte baja de la mitad del grano en desarrollo,
con un claro borde café seguido de esterilidad o llenado parcial de los floretes causando que
las panículas se queden erectas (Shahjahan et al., 1998; Shahjahan et al., 2000b).
Epidemiología. Las bacterias de las plantas existen en muchas partes del ecosistema y son
encontradas usualmente en el aire, suelo y agua. La distribución en el suelo de estos
3
patógenos es afectada por el tipo de PH, plantas cultivadas y condiciones de clima. Se ha
establecido que esta bacteria patogénica se encuentra en los filoplanos de las plantas de arroz
durante la etapa de crecimiento (Matsuda y Sato, 1987; Hikichi, 1993a; Hikichi, 1993b;
Hikichi et al., 1993;Otofuji et al., 1988; Tsushima et al., 1996), o en semillas de arroz
guardadas a temperatura ambiente en invierno (Tsushima et al.1987; Tsushimi et al., 1989)
en malezas en el campo y en tejidos de arroz de cosechas pasadas que se quedaron en el suelo
(Sogou y Tsuzaki, 1983). La enfermedad se puede desarrollar de un inóculo de semillas
infectadas de años previos en el suelo y en malezas en el campo. En el proceso de infección,
la susceptibilidad del hospedero, la densidad del inóculo y los factores climáticos juegan el
principal rol (Tsushima et al., 1985; Tsushima et al., 1987; Tsushima y Naito, 1991;
Tsushima et al., 1995a; Tsushima et al., 1996; Tsushima, 1996).
Esta enfermedad tiende a presentarse en condiciones inusuales con altas temperaturas,
especialmente en la noche y en tiempos de frecuentes lluvias (Tushima et al., 1985; Mew,
1992; Zeigler y Álvarez, 1990).
Las células del patógeno presente en las vainas foliares juegan un rol fundamental ya que
proveen la fuente principal de inóculo para la panícula emergente (Tsushima et al., 1991 and
Tsushima et al., 1996). El primer lugar de infección de B. glumae es aparentemente a través
de las plúmulas (Hikichi, 1993a; Hikichi, 1995b). La bacteria entra a la lema y a la palea a
través de los estomas, se multiplica en las células del parénquima (Tabei et al, 1989) y se
mueve hacia los tejidos y células sanas. La bacteria fue detectada en la epidermis,
parénquima y esclerénquima de las glumas de semillas de arroz naturalmente infectadas
usando un antisuero (Hikichi, 1993b). El movimiento de larga distancia de la bacteria fue
realizado vía sistemas vasculares y fue observada por X. Yuan, saliendo de los sistemas
vasculares de arroz severamente infectado por técnicas de seccionado.
Detección y métodos de identificación. Es difícil diferenciar patógenos que son muy
parecidos en fisiología y taxonomía por los síntomas que producen y por los medios
selectivos donde crecen. Tsuschima en 1986 desarrolló un medio semi selectivo para B.
glumae, sin embargo, otras especies de Burkholderia pueden crecer en este medio (SP-G
medium). La mejor diferenciación se ha dado por el programa Biolog TM (Cottyn et al.,
1996b). Aunque los métodos inmunológicos poseen alta resolución, anticuerpos específicos
para algunos antígenos no se obtienen fácilmente y esto representa una gran limitante en la
aplicación de estos métodos. Recientemente PCR y otras técnicas moleculares se han hecho
más populares debido a su fácil operación, buena precisión y rapidez.
Clasificación y nomenclatura. Por mucho tiempo se ha sabido que algunas especies de
Pseudomonas son patógenas en plantas. Algunas bacterias como Pseudomonas gladioli
fueron identificadas como agente causal de la pudrición floral de gladiolus. Burkholder
describió al causante de la pudrición de la cebolla como Pseudomanas cepaci y hasta 1960
las Pseudomonas también fueron reconocidas como posibles patógenos en humanos. Se ha
confirmado que Burkholderia gladioli y Burkholderia cepacia pueden producir fibrosis
quística y enfermedades pulmonares (Baxter et al., 1997; Parke y Gurian-Sherman, 1998;
Vandamme, 1996, Vandamme et al., 1997, y Vandamme et al., 2000).
4
El género Burkholderia fue establecido hasta 1922 cuando Yabuuchi propuso transferir siete
especies previamente en el grupo Pseudomonas al nuevo género Burkholderia (Yabuuchi et
al., 1992) Pseudomona plantari y Pseudomona glumae fueron transferidos en 1994. Hasta el
2002 se encuentran 28 especies en el género Burkholderia. Muchas de estas especies son
consideradas patógenas de plantas como arroz, tabaco, maíz entre otros cultivos. Los
patógenos establecidos para arroz incluyen P. avenae (Goto y Ohata, 1956), P. fuscovaginae
(Zeigler, 1987,1989, 1990; Rott, 1989 y 1991; Cottyn, 1996 y 2001), P. syringae,
Burkholderia glumae (Goto y Ohata, 1956; Goto,1965 y Goto y Ohata,1987; Hikichi et al.,
1993d, Hikichi et al.,1994, y Hikichi et al.,1995a; Tsushima et al., 1985, Tsushima et
al.,1986, y Tsushima, 1991; Cottyn et al., 1996a, 1996b y 2001), B. plantarii (Azegami et al.
1985, Azegami et al.,1987 y Azegami et al.1988), B. gladioli (Cheng et al., 2001), y B.
vietnamiensis (Trung et al., 1993).
Control químico. Existen bactericidas disponibles en el mercado que ayudan a controlar el
efecto de B.glumae incluyendo antibióticos, cobre y cobre conteniendo compuestos (Yuan,
2004). El ácido oxolínico es un derivado del quinolone con actividad antibacterial en contra
de bacterias gram negativas incluyendo B. glumae. Cuando las semillas y las plantas con
panículas de arroz son tratadas con el ácido oxolínico, el crecimiento de B. glumae se ve
inhibido en las plúmulas y en las espiguillas, resultando en un eficaz control. Sin embargo, en
los experimentos realizados por Hikichi (2001) demuestran que hay ciertas cepas de B.
glumae que están demostrando resistencia hacia este ácido. Incluso un grupo de cepas
presentaron resistencia en dosis de 1000 μg/ml. Otra de las limitantes es que su uso no es
designado para arroz en los Estados Unidos.
El calentamiento global ha generado el incremento en temperaturas y como consecuencia se
han desarrollado nuevos patógenos. Burkholderia glumae se está esparciendo por todo el
mundo y hasta ahora solo se conocen pocas variedades resistentes a ellas y mínimas medidas
de control. Es por eso que el uso de microorganismos con actividad antagonista en contra de
este patógeno sería una buena solución, si se pudiera utilizar en campo como un pesticida
natural que no daña al ambiente y puede funcionar en diferentes temperaturas.
El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antimicrobial in vitro de 23 cepas de
bacterias no identificadas en contra de Burkholderia glumae a temperatura ambiente (22°C),
30 y 37°C.
2. MATERIALES Y MÉTODO
El estudio fue realizado en el laboratorio del centro de diagnóstico de plantas de la
universidad estatal de Louisiana (LSU).
Diseño experimental y análisis de datos. Se empleó un Diseño Completamente al Azar
(DCA) para analizar las 23 cepas en tres temperaturas (22°, 30° y 37°C) con tres
repeticiones en tiempo y una separación de medias Duncan. Se utilizó un modelo lineal
general (GLM) del programa estadístico SAS® (Statistical Analysis System) versión 9.1,
con un nivel de significancia de P < 0.05. La variable estudiada fue el halo de inhibición
en el plato Petri. Los primeros experimentos realizados fueron analizados mediante
estadística descriptiva y las cepas que no presentaban halo o inhibición eran descartadas
para el último experimento.
Preparación de medio de cultivo. Se utilizó un protocolo estándar para la producción de
medio Kings B agar y LB, cuidando de no contaminar los medios.
Producción de inoculante de Burkholderia glumae (336 gr-1). Se esterilizó la
superficie de semillas contaminadas con cloro al 10% o etanol al 70% y se lavó con agua
destilada. Después se mantuvo por unos 2 minutos en agua doble destilada (dd H20) y se
movió vigorosamente. El agua de la mezcla se utilizó para hacer un plaqueado en KB agar
y se incubó a 37 °C por 24 horas. Cuando se identifica que tipo de cepa es, se rotula y es
mantenida a 37 °C hasta su uso. Normalmente se hacía producción de inóculo nuevo,
agarrando una colonia aislada y haciendo una placa en un medio de crecimiento nuevo.
Almacenamiento de inoculante de cepas de bacterias no identificadas. Las 23 cepas
de bacterias fueron recolectadas de variedades de arroz (CL131, Catahoula, Cheniere,
Neptune, Cocodrie, Cl261, Cl151, M201, Cl111) y fueron conservadas en glicerol al 30%
en tubos individuales a - 4°C.
6
Plaqueado de cepas de bacterias no identificadas. Cuando se utilizaron las cepas de
bacterias guardadas en glicerol, se evitó un choque térmico mediante la introducción de
los tubos en hielo. El plaqueado (Figura 1.) se realizó en una cámara de flujo laminar y se
utilizaron platos estériles de plástico tamaño estándar con Kings B agar como medio de
cultivo. Se flameó la lupa en el mechero y se realizó un plaqueado por cada cepa de
bacteria. Los platos Petri fueron sellados con parafilm y luego se incubaron a 30°C por 24
horas.
Figura 1. Plaqueado de cepas de bacterias no identificada en medio KB.
A las 24 horas los platos fueron extraídos de la incubadora, se flameó la lupa en el
mechero y se tomó una colonia aislada para realizar un rayado en todo el plato Petri
(Figura 2). Luego fueron incubadas a 30°C. Las incubadoras usadas fueron Heratherm
Microbiological Incubators y provienen de la empresa Thermoscientific.
Figura 2. Plaqueado de cepas de bacterias no identificada en medio KB.
Veinte y cuatro horas después se extrajeron los platos y con la lupa se realizó una línea en
el centro del plato Petri con Burkholderia glumae (336 gr-1) y una línea abajo y arriba con
la cepa de la bacteria que se quería evaluar (Figura 3). Por cada bacteria se realizaron tres
platos uno por cada temperatura correspondiente (temperatura ambiente, 30°C, 37°C) y
por cada temperatura se realizó un control con una línea en el centro, uno abajo y arriba
de Burkholderia glumae (336 gr-1)
7
Figura 3. Línea en el centro de B. glumae, acompañada de una línea abajo y arriba de la
cepa de bacteria a evaluar.
Producción de solución de Burkholderia glumae (336 gr-1). Para realizar una dilución
de 100x se escogió un cultivo fresco y puro de Burkholderia glumae (336gr-1) y con la
lupa flameada se agarró un poco del patógeno y se mezcló vigorosamente con 100 micro
litros de agua destilada en un tubo de plástico. Después se chequeó en el
espectrofotómetro si la concentración de células era de 10 7celulas/ml.
Una vez cuantificado el número de células (10 7celulas/ml), se tomaron 100 micro litros
con una pipeta y se esparció en los platos Petri con el medio de LB agar. Luego se
ubicaron cuatro cepas desconocidas por cada plato (Figura 4.) y se realizó una repetición
por temperatura correspondiente (temperatura ambiente, 30°C, 37°C) de 24-48 horas.
Durante este experimento se hicieron dos controles negativos por cada temperatura,
utilizando el mismo proceso pero con Escherichia coli y Burkholderia glumae (Figura 5.),
ya que se ha confirmado que Escherichia coli no tiene actividad antimicrobial con
Burkholderia glumae y B. glumae no tiene actividad antagonista contra ella misma.
Figura 4. Cuatro diferentes tipos de cepas de bacterias.
8
A
B
Figura 5. (A) Control negativo utilizando Burkholderia glumae (336gr-1), (B) control
negativo utilizando Escherichia coli.
Para las cepas que presentaron actividad antimicrobial se realizó el mismo proceso, pero
sin dilución y solo ubicando una bacteria en el centro con una repetición y un control con
Burkholderia glumae (Figura 6.) por temperatura (30 °C, 37 °C y temperatura ambiente).
Se realizó un último experimento que consistía en el mismo proceso, pero con tres
repeticiones por cepa y por temperatura
Figura 6. Control negativo con Burkholderia glumae (336gr-1) en 30 °C.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ensayo de líneas. En el primer ensayo de tres líneas se observó que el halo que producía
B. glumae no pasaba la barrera de algunas cepas no identificadas y que los primeros
indicios de actividad antimicrobial se presentaron hasta las 43 horas en 37°C y 30°C y
hasta los 5 días se presentó crecimiento de B. glumae y actividad antimicrobial con
algunas cepas en temperatura ambiente.
La mayoría de cepas mostraron actividad antimicrobial en este experimento, exceptuando
las cepas número1, 7, 18, 21, y 22. Estas fueron descartadas por no presentar el halo de
inhibición o por recubrir el plato.
La cepas número 13 (Figura 7) no mantuvo la actividad después de las 48 horas en 30,
37°C y temperatura ambiente (22°C).
Con la cepa número 16 (Figura 8) la línea de Burkholderia glumae no creció
adecuadamente, sin embargo, se observó un halo alrededor que no pasó las barreras de la
cepa número 16 después de dos semanas.
La cepa número 23 (Figura 9) después de 2 semanas todavía mostraba actividad
antimicrobial ya que el halo no pasó las barreras y la coloración del halo alrededor de la
línea de B. glumae era más fuerte.
10
Resultados después de 2 semanas
Figura 7. Cepa número 13 después de 2 semanas
Figura 8. Cepa número 16 después de 2 semanas.
Figura 9. La cepa número 23 después de 2 semanas.
11
Ensayo de cuatro cepas diferentes con Burkholderia glumae en dilución. Las cepas
número 3 y 5 (Figura 10) no mostraron actividad antimicrobial en comparación con la
cepa número 2 y 4 en 30°C que mostraron un fuerte halo de inhibición. Las cepas número
6, 8, 10 y 11 (Figura 11) mostraron actividad antimicrobial en 30 ° C. Las cepas número
8,10 y 11 (Figura 12) también mostraron actividad antimicrobial en temperatura ambiente
(22° C) e incluso cuando se ubicaron en conjunto con la cepa número 9 mostraron mayor
inhibición al punto que Burkholderia glumae solo creció en pocas partes del plato Petri.
Las cepas número 14, 15 y 16 en 37°C (Figura 13) presentaron actividad antimicrobial.
Durante este experimento se utilizó Escherichia coli como control negativo ya que según
la literatura esta bacteria no tiene actividad antimicrobial en contra de Burkholderia
glumae. En el experimento en 30°C (Figura 14) y sin Escherichia coli el halo de
inhibición fue mayor que en 37°C. También se mostró un mayor crecimiento de las cepas
en 30 °C. Las cepas número 19 y 20 (Figura 15) mostraron actividad antimicrobial en
temperatura ambiente (22°C). La cepa número 19 creció menos que la 20, sin embargo,
fue la que presentó la mayor inhibición. Las cepas número 13 y 23 (Figura 16) también
mostraron actividad antimicrobial en 30 ° C.
A
B
Figura 10. (A) Interior del plato Petri con solución de B. glumae y las cepas 2, 3, 4 y 5 (B)
reverso del plato mostrando crecimiento y halo de inhibición marcado en las cepas 2 y 4.
Figura 11. Cepas número 6, 8, 10 y 11 en 30°C.
12
Figura 12. Cepas 8, 9, 10 y 11 en temperatura ambiente (22°C).
Figura 13. Cepas número 14, 15 y 16 en 37°C con Escherichia coli.
Figura 14. Cepas número 14,15 y 16 en 30° C.
13
Figura 15. Cepas número17, 19, 20 y 22 en temperatura ambiente (22°C).
Figura 16. Cepas número 1,13, 20 y 23 en 30 ° C.
Ensayo de cepas individuales con B. glumae sin dilución. Cuando las cepas fueron
ubicadas individualmente en LB agar con la solución de B. glumae (336gr-1) sin
dilución, el halo de inhibición fue menor en comparación al ensayo con dilución de 100x.
La cepa número 2 (Figura 17) obtuvo un halo de inhibición de 0.33 cm a 30°C, 0.27 cm a
37 °C y 0.30 cm a temperatura ambiente. La cepa número 4 tuvo 0.33 cm de inhibición en
30°C, 0.33cm en 37°C y 0.37 cm en temperatura ambiente. La cepa número 8 se
comportó igual en 30°C y 37°C (0.20 cm), pero en temperatura ambiente obtuvo 0.5 cm
de inhibición. La cepa número 9 obtuvo 0.30 cm en 30°C, 0.40 cm en 37 °C y 0.37 cm de
inhibición en temperatura ambiente que puede estar relacionado con la fitotoxina
toxoflavin que es producida por B. glumae. La cepa número 10 obtuvo 0.13 cm en 30 °C,
0.23 cm en 37°C y 0.30 cm en temperatura ambiente. La cepa número 16 obtuvo 0.20 cm
en 30°C, 0.33 cm en 37°C y 0.37 cm en temperatura ambiente.
La cepa número 23 obtuvo 0.33 cm en 30 °C, 0.1 cm en 37 °C y 0.30 cm en temperatura
ambiente.
14
Figura 17. Cepa número 2 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
Figura 18. Cepa número 4 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
Figura 19. Cepa número 8 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
15
Figura 20. Cepa número 9 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
Figura 21. Cepa número 9 en 30 °C mostrando un halo de color amarillo fuerte.
Figura 22. Cepa número 10 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
Figura 23. Cepa número 16 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C)
16
Figura 24. Cepa número 23 en 37°C, 30°C y temperatura ambiente (22°C).
Comportamiento de actividad antimicrobial por temperatura de cepas de bacterias
no identificadas. Las cepas que presentaron más inhibición en 30 ° C fueron las cepas
número 2, 4,9 y 23; las cuales no presentaron diferencia significativa entre si. En esta
temperatura, el halo de inhibición de las cepas 8, 10 y 16 fue menor que las
mencionadas anteriormente y no presentaron diferencia significativa entre si.
0.40
a
a
a
Inhibición (cm)
0.30
a
b
0.20
b
b
0.10
0.00
2
4
8
9
10
16
23
Cepas de bacterias no identificadas
Figura 25. Evaluación del efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias en 30° C. Barra
con diferentes letras difieren significativamente entre sí (P≤0.05)
En 37° C la actividad antimicrobial fue mayor que a 30° C obteniendo hasta 0.40 cm de
halo de inhibición. Las cepas que mejor se comportaron en esta temperatura fueron las
cepas número 4, 9 y 16 y la cepa con menor inhibición fue la número 23 con 0.10 cm de
halo de inhibición.
17
0.50
a
Inhibición(cm)
0.40
0.30
a
a
ab
b
b
0.20
c
0.10
0.00
2
4
8
9
10
16
23
Cepas de bacterias no identificadas
Figura 26. Evaluación de efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias no identificadas
en 37° C. Barra con diferentes letras difieren significativamente entre sí (P≤0.05).
En temperatura ambiente (22° C) se presentó mayor inhibición que a 30 y 37 ° C. Siendo
la cepa de mejor comportamiento la cepa número 8 con 0.50 cm., la cepa que peor se
comportó a esta temperatura fue la cepa número 9 que en 30° C había presentado un buen
comportamiento de inhibición.
0.60
a
Inhibición(cm)
0.50
0.40
0.30
b
b
b
b
b
c
0.20
0.10
0.00
2
4
8
9
10
Cepas de bacterias no identificadas
16
23
Figura 27. Evaluación de efecto antimicrobial de siete cepas de bacterias no identificadas
en Temperatura ambiente (22°C). Datos en la gráfica de barra con diferentes letras
difieren significativamente entre sí (P≤0.05).
18
Cuadro 1. Interacción de cepas de bacterias en tres diferentes temperaturas.
Temperatura (°C)
Número de cepa
Halo de inhibición (cm)
0.30 cde
22°C
2
0.36 bc
22°C
4
0.50 a
22°C
8
0.20 fg
22°C
9
0.30 cde
22°C
10
0.36 bc
22°C
16
0.30 cde
22°C
23
0.33 bcd
30°C
2
0.33 bcd
30°C
4
0.20 fg
30°C
8
0.33 bcd
30°C
9
0.13 gh
30°C
10
0.20 fg
30°C
16
0.33 bcd
30°C
23
0.26 def
37°C
2
0.33 bcd
37°C
4
0.20 fg
37°C
8
0.40 b
37°C
9
0.23 ef
37°C
10
0.33 bcd
37°C
16
0.10 h
37°C
23
Haciendo una interacción entre cepa y temperatura (Cuadro 1), la mejor inhibición se
presentó en la cepa número 8 a temperatura ambiente (22°C), sin embargo, a 30°C y 37
°C esta presento inhibición menor. La cepa número 16 y 9 no difieren entre si y tampoco
difieren entre si las cepas número 2, 10 y 23 en temperatura ambiente. La cepa número 10
en 30°C y la 23 en 37°C son las que presentaron la menor inhibición siendo la 23
diferente a todas las demás.
4. CONCLUSIONES
•
Las cepas de bacterias no identificadas que presentaron actividad antimicrobial en las
tres temperaturas fueron: 2, 4, 8, 9, 10, 16 y 23.
•
La cepa con mayor actividad antimicrobial es la cepa número 8 a temperatura
ambiente y la que presentó menos inhibición fue la 23 a 37°C.
•
Después de las 48 horas el halo de inhibición no continúa creciendo.
•
La cepa número 8 no tiene buena actividad antimicrobial en 30°C ni en 37°C.
•
El efecto de estas cepas de bacterias es preventivo y no curativo ya que el halo de
inhibición a las 2 semanas no eliminó la presencia de Burkholderia glumae.
•
Se presentó mayor actividad antimicrobial en los ensayos realizados con dilución
(100x) de B. glumae
5. RECOMENDACIONES
•
Continuar estudiando el comportamiento de estas cepas con las temperaturas más
comunes de los lugares de incidencia.
•
Evaluar estas cepas en campo para ver si produce alguna fitotoxicidad en diferentes
variedades de arroz.
•
Utilizar estas cepas en material infectado para medir el grado de inhibición.
•
Estudiar la aplicación de esta bacteria durante la etapa de floración y la fase
vegetativa.
6. LITERATURA CITADA
Azegami, K., K. Nishiyama, Y. Watanabe, T. Suzuki, M. Yoshida, K. Nose and S. Toda.
1985. Tropolone as a root growth-inhibitor produced by a plant pathogenic Pseudomonas
sp. Causing seedling blight of rice. Ann. Phyto. Soc. Japan. 51: 315-317.
Azegami, K., K. Nishiyama, Y. Watanabe, I. Kadota, A. Ohuchi, and C. Fukazame. 1987.
Pseudomonas plantarii sp. Now., the causal agent of rice seedling blight. Int. J. Syst.
Bacteriol. 17: 144-152.
Azegami, K., K. Nishiyama, and H. Tabei. 1988a. Infection courts of rice seedlings with
Pseudomonas plantarii and Pseudomonas glumae. Annals of the Phytopathological
Society of Japan. 54 (3): 337-341
Baxter, I. A., P. I. Lamber and I. N. Simpson. 1997. Isolation from clinical sources of
Burkholderia cepacia possessing characteristics of Burkholderia gladioli. Journ. of
Antimicrobial Chemotherapy. 39: 169-175
Buckle, K. A. and E. Kartadarma. 1990. Inhibition of bongkrek acid and toxoflavin
production in tempe bongkrek containing Pseudomonas cocovenenans. Journal of
Applied Bacteriology 68: 571-576.
Calpe,C .2002. Rice in world trade. Status of the world rice market in 2002. 35-40.
Cheng, G., A. K. M. Shahjahan, X. L. Yuan, and M. C. Rush. 2001. Distinguishing
among isolates of Burkholderia glumae, B. gladioli, B. plantarii, and B. cepacia from
Rice. Proc. 29th RTWG. 29: 94.
Cottyn, B., M. T. Cerez, M. F. Van Outryve, J. Barroga, J. Swings, and T. W. Mew.
1996a. Bacterial diseases of rice. I. Pathogenic bacteria associated with sheath rot
complex and grain discoloration of rice in the Philippines. Plant Dis. 80 (4): 429-437
Cottyn, B., M. F. van. Outryve, M. T. Cerez, M. de. Cleene, J. Swings, and T. W. Mew.
1996b. Bacterial disease of rice. II. Characterization of pathogenic bacteria associated
with sheath rot complex and grain discoloration of rice in the Philippines. Plant Dis. 80
(4): 438-445.
22
Cottyn, B., E. Regalado, B. Lanoot, M. de. Cleene, T. W. Mew, and J. Swings. 2001.
Bacterial populations associated with rice seed in the tropical environment.
Phytopathology 91 (3): 282-292.
Goto, K., and K. Ohata. 1956. New bacterial disease of rice (brown stripe and grain rot).
Ann. Phyto. Soc. Jap. 21: 46-47
Goto, T., K. Nishiyama and K-I. Ohata. 1987. Bacteria causing grain rot of rice. Ann.
Phytopath. Soc. Jap. 53: 141-149.
Hikichi, Y. 1993a. Mode of action of oxolinic acid against bacterial seedling rot of rice
caused by Pseudomonas glumae. I. Relationship between population dynamics of P.
glumae on seedling of rice and disease severity of bacterial seedling rots of rice. Ann.
Phyto. Soc. Jap. 59: 441-446.
Hikichi, Y. 1993b. Relationship between population dynamics of Pseudomonas glumae
on rice plants and disease severity of bacterial grain rot of rice. J. Pesticide Sci.18: 319324.
Hikichi, Y., T. Okuno, and I. Furusawa. 1994. Susceptibility of rice spikelets to infection
with pseudomonas-glumae and its population-dynamics. J. of Pest. Sci. 19 (1): 11-17
Hikichi, Y. 1995a. Mode-of-action of oxolinic acid against bacterial seedling rot of rice
caused by Pseudomonas glumae. II. Efficacy of oxolinic acid against secondary infection.
Annals of the Phytopath. Soc. of Jap. 59 (4): 447-451
Hikichi, Y. 1995b. The spread of bacterial grainrot of rice and its control in the paddy
fields. J. Pest. Sci. 20: 329-331
Kadota, I. And A. Ohuchi. 1983. Symptoms of bacterial brown stripe of rice seedlings in
nursery boxes. Ann. Phyto. Soc. Jap. 49: 561-564.
Matsuda, I. And Z. Sato. 1987. Ecology of P. glumae, cause bacterial grain rot of rice,
from planting to the mature stage. Ann. Phyto. Soc. Jap. 53:122.
Mew, T. W. 1992. Grain Rot. p.9. In: Compendium of Rice Diseases. (Ed.) Webster,
R.K. and P.S. Gunnell. APS Press, St. Paul, MN. 62p.
Otofuji, M., K. Kadoshige and K. Yoshida. 1988. Persistent part of Pseudomonas glumae
Jurita et Tabei in rice plant. Proc. Assoc. Plant Prot. Kyushu. 34: 1-4.
Parke, J. L. and D. Gurian-Sherman.1998. Diversity of the Burkholderia cepacia
complex and implications for risk assessment of biological control strains. Annu. Rev.
Phytopathol. 39: 225-258.
23
Pérez, C. 2010.Avances en el manejo integrado de la bacteria Burkholderia glumae en el
Caribe colombiano. Disponible en: http://www.slideshare.net/xescobar/004-avances-enel-manejo-integrado-de-la-bacteria-burkholderia-glumae-en-el-caribe-colombiano-cristoperez
Shahjahan, A. K. M., M. C. Rush, C. E. Clark, and D. E. Groth. 1998. Bacterial sheath rot
and panicle blight of rice in Louisiana. Proc. 27th RTWG. 27: 31-32.
Shahjahan, A. K., M. C. Rush, D. Groth, and C. Clark. 2000b. Panicle Blight. Rice Journ.
15: 26-29
Suzuki, F., Y. F. Zhu, H. Sawada, and I. Matsuda. 1998. Identification of proteins
involved in toxin production by Pseudomonas glumae. Annals of the Phytopath. Soc. of
Jap. 64 (2): 75-79
Tabei, H., K. Azegami, T. Fukuda, and T. Goto. 1989. Stomatal infection of rice grain
with Pseudomonas glumae, the causal agent of the bacterial grain rot of rice. Ann. Phyto.
Soc. Jap. 55 (2): 224-228
Trung, H. M., N. V. Van, N. V. Vien, D. T. Lam, and M. Lien. 1993. Occurrence of rice
grain rot disease in Vietnam. Int. Rice Res. Notes 18 (3): 30
Tsushima, S., S. Mogi and H. Saito. 1985. Effects of inoculum density, incubation
temperature and incubation period on the development of rice bacterial grain rot. Proc.
Assoc. Plant Prot. Kyushu. 31: 11-12.
Tsushima, S., S. Wakimoto and S. Mogi. 1986. Selective medium for detecting
Pseudomonas glumae Jurita et Tabei, the causal bacterium of grain rot of rice.
Ann.Phytopath. Soc. Japn. 52: 253-259.
Tsushima, S., K. Tsuno, S. Mogi, S. Wakimoto and H. Saito. 1987. The multiplication of
Pseudomonas glumae on rice grains. Ann. Phyto. Soc. Japan. 53: 663-667.
Tsushima, S., S. Mogi, and H. Naito, and H. Saito. 1989. Existence of Pseudomonas
glumae on the rice seeds and development of the simple method for detecting P. glumae
from the rice seeds. Bull. of the Kyushu Nat. Agric. Expt. Sta. 25 (3): 261-270.
Tsushima, S. and H. Naito. 1991. Spatial distribution and dissemination of bacterial grain
rot of rice caused by Pseudomonas glumae. Ann. Phyto. Soc. Jap. 57 (2): 180-187.
Tsushima, S., H, Naito, and M. Koitabashi. 1995a. Change in panicle susceptibility
associated with flowering rate of spikelets in bacterial grain rot of rice caused by
Pseudomonas glumae. Annals of the Phytopath. Soc. of Jap. 61 (2): 109-113.
Tsushima, S. 1996. Epidemiology of bacterial grain rots of rice caused by Pseudomonas
glumae. JARQ 30 (2): 85-89.
24
Vandamme, P. A. R. 1996. Polyphasic taxonomy in practice: the Burkholderia cepacia
challenge. Available: online: http://www.wfcc.info/NEWSLETTER/.
Vandamme, P., B. Holmes, M. Vancanneyt, T. Coenye, B. Hoste, R. Coopman, H.
Revets, S. Lauwers, M. Gillis, K. Kersters, and J. R. W. Govan. 1997. Occurrence of
multiple genomovars of Burkholderia cepacia in cystic fibrosis patients and proposal of
Burkholderia multivorans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 1188-1200.
Vandamme, P., E. Mahenthiralingam, B. Holmes, T. Coenye, B. Hoste, P. D. Vos, D.
Henry, and D. P. Speert. 2000. Identification and population structure of Burkholderia
stabilis sp. nov. (formerly Burkholderia cepacia genomovar IV). Journ. of Clinical
Microbiol. 38 (3): 1042-1047
Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, Y. Hashimoto, T. Ezaki, and M.
Arakawa. 1992. Proposal of Burkholderia gen. Nov. and transfer of seven species of the
genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species
Burkholderia cepacia (Palleroni and Holmes 1981) comb. Nov. Microbial. Immun.
36:1251-1275.
Yoneyama, K., Y. Kono, I. Yamaguchi, M. Horikoshi, and T. Hirooka. 1998. Toxoflavin
is an essential factor for virulence of Burkholderia glumae causing rice seedling rot
disease. Annals of the Phytopath. Soc. of Jap. 64 (2): 91-96.
Zeigler, R. S., and E. Alvarez. 1987. Bacterial sheath brown rot of rice caused by
Pseudomonas fuscovaginae in Latin America. Plant Dis. 71: 592-597.
Zeigler, R. S., G. Aricapa, and E. Hoyos. 1987. Distribution of fluorescent Pseudomonas
spp. causing grain and sheath discoloration of rice in Latin American. Plant Dis. 71: 896900.
Zeigler, R. S. and E. Alvarez. 1989a. Differential culture medium for Pseudomonas
species causing sheath rot (ShR) and grain discoloration (GID) of rice. Int. Rice Res. Inst.
Newsl. 14: 27-28.
Zeigler, R. S. and E. Alvarez. 1989b. Grain discoloration of rice caused by Pseudomonas
glumae in LatinAmerica. Plant Dis. 73 (4): 368.
Zeigler, R. S. and E. Alvarez. 1989c. Pseudomonas species causing rice sheath rot (ShR)
and grain discoloration (GID). Int. Rice Res. Newsletter 14 (1): 26.
Ziegler, R. S. 1990. Nonfluorescent Pseudomonas strains causing rice sterility and grain
discoloration in Colombia. Int. Rice Res. Newsletter 15 (3): 28-29.
Zeigler, G. S. and E. Alvarez. 1990. Characteristics of Pseudomonas spp. causing grain
discoloration and sheath rot of rice, and associated Pseudomonas epiphytes. Plant Dis. 74
(11): 917-922.
25