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DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE: FIBRINÓLISIS
COMO POTENCIAL INTERVENCIÓN TERAPÉUTICA
Investigadora principal:
Dra. Pura Muñoz Cánoves
ICREA Universitat Pompeu Fabra
Duración: 3 años
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1. Resumen
Objetivo principal
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades
neuromusculares más graves y mortales, que afecta a 1:3.500 niños, y su
causa se debe a defectos en el gen de la distrofina. La inflamación muscular,
necrosis, fibrosis y las alteraciones neuromusculares de la sinapsis ocurren
como consecuencia directa o indirecta de la deficiencia en distrofina, de
modo que los pacientes de DMD experimentan la pérdida grave y progresiva
de masa y función del músculo. No hay terapias que corrijan el defecto
primario en DMD (ausencia de distrofina) en la actualidad. Así, nuestro
objetivo principal es identificar las estrategias y/o los factores nuevos que
pueden contribuir al retraso de la progresión de DMD, usando el ratón del
mdx (un modelo para DMD).
Antecedentes e hipótesis
La conversión del plasminógeno cimógeno en plasmina activa (activación
plasminógena) se ejerce por los activadores del plasminógeno (uPA y tPA), y
está controlada por su inhibidor específico, PAI-1. Dado que la plasmina es
la única enzima capaz de degradar la fibrina, este proceso también se
conoce como fibrinólisis. Hemos detectado una alta deposición de fibrina en
los músculos de pacientes de DMD y de los ratones del mdx. Conforme a
resultados preliminares de nuestro grupo, hipotetizamos que el aumento de
la fibrinólisis (mediante la modulación de la actividad de uPA y PAI-1) o la
reducción directa de los niveles de fibrina, beneficiará la regeneración del
músculo, tanto en modelos de lesión como en la distrofinopatía mdx, por la
vía de dos mecanismos: previniendo la acumulación de fibrina y
contribuyendo a la adecuada respuesta inflamatoria del músculo
degenerante.
Objetivos específicos y plan de trabajo
1- Análisis del papel de la respuesta inflamatoria en la regeneración alterada
de uPA-/- y de los ratones de PAI-1-/- después de lesión, y en la
degeneración exacerbada de los ratones de mdx/uPA-/-: rescate por el
trasplante de la médula ósea.
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2- Análisis de las consecuencias de la deficiencia de PAI-1 en la
regeneración del músculo del mdx: generación de ratones del doble mutante
de mdx/PAI-1-/-.
3- Análisis de la organización de las uniones neuromusculares en ratones del
mdx, mdx/uPA-/- y mdx/PAI-1-/-.
4- Análisis del papel beneficioso de la deficiencia en fibrina del músculo
distrófico del mdx: a) generación de ratones mdx/fibrinógeno deficientes
(mdx/Fib-/-) y b) desfibrinación farmacológica de los ratones del mdx.
5- Análisis del papel de uPA/PAI-1/fibrina en el comportamiento de las
células satélite (células madre del músculo).
2. Resultados
Análisis de las consecuencias de la deficiencia de PAI-1 en la
distrofia muscular del mdx.
El análisis de los músculos de mdx/uPA-/- ha demostrado una miopatía
exacerbada, con una deposición creciente de fibrina, indicando que uPA es
necesario para la regeneración del mdx y para la retirada de la fibrina
(Suelves et al., 2007). El papel de PAI-1 en distrofia muscular del mdx
también ha sido analizado cruzando ratones del mdx con ratones PAI-1-/-, y
generando así ratones mdx/PAI-1 -/-.
Generación de ratones doble mutantes: los ratones macho de PAI-1deficiente fueron cruzados con hembras del mdx. Los ratones macho F1
fueron cruzados a su vez con ratones hembra del mdx, y sus F2
heterocigotos PAI-1 machos y hembras fueron intercruzados. La generación
F3 resultante mostró la distribución mendeliana prevista de los genotipos
deficientes de PAI-1-WT, heterocigotos y homocigotos, todos en fondo mdx.
Los genotipos de PAI-1-/- fueron confirmados por reacción en cadena de
polimerasa (PCR) del DNA genómico de la biopsia de la cola. El genotipo del
mdx fue confirmado por Western blot de las biopsias musculares, usando un
anticuerpo antidistrofina. Todos los experimentos con animales fueron
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aprobados por el Comité Ético para la Manipulación de Animales de
Experimentación de la Generalitat de Catalunya.
Acabamos el análisis de la deficiencia en PAI-1 en el curso de la distrofia
muscular en ratones del mdx, examinando comparativamente el músculo
del diafragma y los músculos de las extremidades del mdx y los ratones de
mdx/PAI-1-/- a diversas edades (2 a 18 meses). Inesperadamente, hemos
encontrado que la pérdida de PAI-1 exacerba la enfermedad del músculo en
ratones del mdx, como lo evidencia el aumento en inflamación,
degeneración y en el desarrollo de fibrosis en músculos del doble mutante,
junto con una reducida capacidad regenerativa. Analizamos la actividad
funcional del músculo de los ratones de ambos genotipos: los ratones de
mdx/PAI-1-/- de 3,5, 6 y 9 meses de edad respondieron peor en los ensayos
de grip-strength y treadmill que sus hermanos de camada mdx.
Encontramos evidencias mecánicas del control del desarrollo de la fibrosis
muscular en DMD. Particularmente, encontramos que, comparado con los
músculos de controles sanos, la proteína hemostática PAI-1 se acumula en
los músculos distróficos de los pacientes de DMD y de los ratones jóvenes
del mdx en los primeros tiempos de la enfermedad, disminuyendo con la
progresión de la enfermedad en el tiempo. Usando aproximaciones
genéticas y farmacológicas, hemos demostrado que la pérdida de PAI-1 en
etapas avanzadas de la enfermedad tiene un gran impacto en la creciente
conversión fibrótica del músculo en ratones distróficos. De hecho, la pérdida
genética de PAI-1 avanzó y exacerbó la fibrosis en ratones jóvenes del mdx,
mientras que la neutralización farmacológica de su sustrato uPA invirtió este
efecto. Hemos demostrado que PAI-1 es un nuevo inhibidor de la fibrosis en
músculo distrófico por la vía de la inhibición de la activación proteolítica de
TGFb mediada por uPA y de las consecuentes funciones pro-fibrogénicas de
TGFb, según los resultados siguientes: la pérdida PAI-1 (mediante la
descontrolada actividad proteolítica del plasminógeno mediada por uPA)
estimula la activación de TGFb de su forma latente en macrófagos del mdx,
induciendo así la producción de colágeno (el componente principal del tejido
fibrótico) en fibroblastos del mdx mediante la señalización de Smad. Estos
resultados se han enviado y están siendo revisados para su publicación.
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Análisis del efecto genético de la deficiencia en fibrina en distrofia
muscular del mdx.
Generación de ratones doble mutante del mdx/fib-/-: análisis comparativo de
la degeneración/regeneración/inflamación muscular en ratones del mdx y
del mdx/fib-/- doble mutante. Habíamos observado que la deposición de
fibrina/fibrinógeno (fibrina/ógeno) se asocia específicamente con
distrofinopatía mdx. Para analizar la importancia de la deposición de la
fibrina/ógeno en músculo mdx, criamos los ratones del mdx en el fondo
fibrina/ógeno deficiente, y analizamos las consecuencias de la deficiencia de
fibrina/ógeno en la enfermedad distrófica en músculo gastrocnemio. No se
observaron diferencias fenotípicas entre los ratones de Fib-/-mdx y de
Fib+/+mdx a 14 días de edad. Consistente con la ausencia de depósitos de la
fibrina/ógeno en músculo del mdx antes de inicio de la enfermedad, no se
encontraron muestras de la distrofia en ningún genotipo a esta edad. Según
lo esperado, a un mes de edad, Fib+/+mdx pero no los ratones de Fib-/-mdx
exhibieron la deposición de fibrina/ógeno en áreas dañadas del músculo.
Comparando con los ratones de Fib+/+mdx, encontramos, por análisis
cuantitativo de las secciones del tejido, menos degeneración muscular y
grandes miofibras centronucleadas durante la regeneración en ratones de
Fib-/-mdx. La inflamación muscular también se ve atenuada en ratones de
Fib-/-mdx, como lo evidencia el reducido número de macrófagos infiltrados.
Notablemente, una atenuación similar de la inflamación y un mayor tamaño
de las fibras regenerantes fueron observados en músculos de los ratones
Fib-/-, con respecto a ratones de Fib+/+ en un modelo de regeneración
muscular controlada en el tiempo inducida por cardiotoxina. Así, en la
ausencia de fibrina/ógeno, la inflamación y la degeneración muscular se
reducen en ratones del mdx, mientras que se realza la regeneración.
Papel directo de la fibrina en la regeneración inducida por lesión del músculo
esquelético: Se realizó el análisis comparativo de la regeneración inducida
por lesión con cardiotoxina del músculo esquelético en ratones WT y Fib-/-.
Mientras que la inflamación se reduce a 2 y 5 días después de la lesión en
ratones Fib-/-, el crecimiento de las nuevas miofibras regenerantes se ve
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aumentado a 5 y 10 días después de la lesión en estos ratones, comparados
con sus hermanos de camada WT.
Análisis del papel de la fibrina en la regeneración del músculo esquelético:
para confirmar nuestros experimentos genéticos y, más importante, para
evaluar si los compuestos dirigidos a la fibrina/ógeno pudieran tener efectos
beneficiosos en ratones del mdx, examinamos el grado de distrofia muscular
después del bloqueo farmacológico de la fibrina/ógeno. La administración
del agente desfibrinogenante ancrod se sabe que reduce drásticamente los
niveles de fibrinógeno en plasma y la deposición de fibrina/ógeno
(Akassoglou et al., 2002; Bell et al., 1978; Lluis et al., 2001). Por lo tanto,
tratamos ratones del mdx de 12 días de edad al azar con solución salina o
con ancrod, hasta la edad de 2,5 meses, y analizamos la gravedad de la
enfermedad distrófica en muestras del músculo gastrocnemio. La
administración de ancrod dio lugar a una reducción significativa de la
acumulación de la fibrina/ógeno en músculos del mdx, según lo esperado.
Comparado con la solución salina, los ratones del mdx fueron claramente
protegidos contra la distrofia muscular grave tras el tratamiento con ancrod,
basado en análisis morfológicos cuantitativos de las secciones del músculo.
El tratamiento con ancrod redujo el área de la degeneración del músculo en
aproximadamente el 40%. Además, ratones mdx tratados con ancrod –así
como ratones Fib-/-mdx– presentan mayores miofibras centronucleadas
comparado con los controles tratados con solución salina, sugiriendo que la
pérdida de la fibrina/ógeno por aproximaciones genéticas o farmacológicas
también promueve la regeneración de las miofibras. Los análisis funcionales
(por ejemplo, ensayos grip strength y treadmill) se han realizado también
en grupos de ratones de ambos genotipos, y han revelado que el
funcionamiento del músculo está mejorado con la reducción de la fibrina.
Además, ratones del mdx de 3 meses de edad se han tratado con solución
salina o ancrod durante 3 meses –hasta la edad de 6 meses– para su
análisis. Hemos hallado diferencias en la
degeneración/regeneración/inflamación y fibrosis muscular en ratones
tratados con ancrod, disminuyendo la inflamación y la fibrosis por el
tratamiento con ancrod, y mejorando la regeneración del músculo. Los
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análisis funcionales se han realizado después del tratamiento usando
ensayos de grip strength y treadmill y han confirmado la mejora del
funcionamiento del músculo de los ratones del mdx tratados con ancrod.
Análisis de los mecanismos controladores del papel pro-inflamatorio de la
fibrina en músculo distrófico del mdx: el eje fibrina/Mac-1: el daño en
músculo distrófico del mdx está estrechamente asociado a la inflamación
persistente (Hodgetts et al., 2006; Pizza et al., 2005; Tidball, 1995).
Encontramos que el número de células inflamatorias (neutrófilos,
macrófagos y células T) está reducido en músculos del mdx después del
tratamiento con ancrod. Así, la reducción de los niveles de fibrina/ógeno en
ratones del mdx bloquea el desarrollo y/o la persistencia de la inflamación y,
por lo tanto, la degeneración en músculo distrófico. Los macrófagos proinflamatorios, clásicamente activados, son el principal tipo de célula
inflamatoria en músculo degenerante y están involucrados críticamente en
promover el daño muscular del mdx (Tidball, 2005; Wehling et al., 2001).
Puesto que las matrices de fibrina/ógeno dentro de los tejidos inflamados
pueden regular la expresión de citocinas por los macrófagos, mediante su
acoplamiento con el receptor de la integrina Mac-1 (Adams et al., 2007;
Flick et al., 2004b), intentamos investigar los efectos potenciales de la
fibrina/ógeno sobre los macrófagos del mdx. De hecho, la fibrina/ógeno
indujo rápidamente, en el plazo de 6 horas, la expresión de varias
quimiocitocinas, tales como IL-1b, IL-6, MIP-2 (el homólogo funcional del
rIL-8 humano en ratón), así como citocinas citotóxicas tales como TNFa, en
los macrófagos primarios derivados de la médula del mdx (BM), como una
respuesta inflamatoria clásica. Además, los macrófagos del mdx
respondieron a la fibrina/ógeno en un análisis de migración en transwell de
modo con Mac-1, sugiriendo que la fibrina/ógeno ejerce su efecto a través
de ligamiento con Mac-1. Así, la fibrina/ógeno induce la expresión de
quimiocinas y de citocinas citotóxicas en macrófagos del mdx in vitro.
Nos preguntamos después si la reducción de la fibrina/ógeno puede también
modular la producción del citocinas dentro del músculo del mdx. Consistente
con los resultados, el TNFa, el IL-6, el MIP-2 y el IL-1b fueron inducidos in
vitro en el músculo gastrocnemio degenerante de ratones de 2,5 meses de
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edad, respecto a controles WT de la misma edad, y esta inducción fue
atenuada por el tratamiento con ancrod. Así, la reducción de los niveles de
fibrina/ógeno en ratones del mdx disminuye la activación de los macrófagos
mediada por la fibrina/ógeno y la expresión subsiguiente de quimiocinas y
de citocinas citotóxicas.
Análisis del papel de la fibrina en el desarrollo de la fibrosis en diafragma del
mdx: la deposición del colágeno (fibrosis) era prominente en músculos de
DMD y fue encontrada particularmente en las mismas áreas ocupadas por la
fibrina/ógeno. Además, encontramos una fuerte correlación entre la
acumulación de fibrina/ógeno y la fibrosis en músculos de DMD. En
diafragma del mdx, la deposición de fibrina/ógeno y la fibrosis fueron
aumentando constantemente con la edad. Mientras que la deposición de la
fibrina/ógeno ya era considerablemente elevada a 1 mes de edad, la
acumulación de colágeno mostró un aumento claro solamente a partir de
2,5 meses de edad en adelante, indicando que la deposición de la
fibrina/ógeno precede a la de colágeno en músculo del mdx, de manera
semejante a lo que hallamos en músculos de DMD. Estas observaciones
sugieren una asociación entre la acumulación de fibrina/ógeno y la
deposición de colágeno en músculo distrófico.
Para profundizar en el análisis del papel de la deposición de la fibrina/ógeno
en el desarrollo de la fibrosis durante la progresión de la distrofia muscular,
cruzamos los ratones del mdx con ratones fibrinógeno deficientes para
generar los ratones del doble mutante de Fib-/-mdx. Según lo esperado,
después de inicio de la enfermedad (a un mes de edad), los músculos de
ratones de Fib-/-mdx no exhibieron ninguna deposición de la fibrina/ógeno.
Notablemente, encontramos el contenido de colágeno en el diafragma de los
ratones Fib-/-mdx significativamente reducido comparado con los ratones de
Fib+/+mdx. Para corroborar nuestros experimentos genéticos usando una
aproximación farmacológica, tratamos ratones mdx de 12 días de edad con
solución salina o con ancrod, hasta la edad de 2,5 o 6,5 meses. Comparado
con solución salina, el tratamiento con ancrod dio lugar a una reducción
significativa de la acumulación de la fibrina/ógeno en músculos del mdx. En
consonancia con nuestros resultados en los ratones de Fib-/-mdx, ancrod
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disminuyó significativamente el grado de fibrosis en los diafragmas de
ratones mdx de 2,5 y 6,5 meses de edad. Estos datos indican que la
fibrina/ógeno, aunque no es estrictamente necesaria, acelera el desarrollo
de la fibrosis en músculo distrófico de mdx. Cabe destacar que la depleción
de fibrina/ógeno también reduce la regeneración muscular y protege el
músculo distrófico de mdx del deterioro funcional.
Análisis del papel de uPA/PAI-1/fibrina en el comportamiento de las
células satélite.
Obtuvimos las células satélite de ratones WT y ratones deficientes en uPA y
PAI-1. Analizamos comparativamente los diferentes parámetros miogénicos
entre los diversos tipos celulares: proliferación, migración, diferenciación y
fusión. Los resultados no demuestran ninguna diferencia funcional en las
células satélite en ausencia de uPA/PAI-1. También hemos analizado el
comportamiento miogénico de las células satélite del WT in vitro cuando
están plaqueadas con o sin fibrina (o con alto contenido de fibrinógeno).
Nuestros resultados demuestran que la fibrina/ógeno induce una reducción
en la proliferación de células satélite.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los
resultados finales obtenidos
En este estudio revelamos un nuevo papel del sistema de activación del
plasminógeno y de la deposición de la fibrina/ógeno, al promover la
degeneración del músculo y la transición fibrótica del músculo distrófico.
Demostramos que la alteración del equilibrio uPA/PAI-1 y la acumulación de
fibrina/ógeno reduce la regeneración y la fibrosis en ratones del mdx. La
distrofia muscular de Duchenne (DMD) sigue siendo una enfermedad
incurable, y los tratamientos son actualmente solo paliativos. Así, actuando
sobre la activación por el plasminógeno de fibrina/ógeno, podemos reducir
la fibrosis mediada por la inflamación facilitando la incorporación de las
células madre del donante en el músculo y, por lo tanto, el éxito de las
terapias basadas en células madre y primarias.
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4. Publicaciones
Suelves M, Vidal B, Serrano AL, Tjwa M, Roma J, López-Alemany R, Luttun
A, Martínez de Lagrán M, Díaz MA, Jardí M, Roig M, Dierssen M, Dewerchin
M, Carmeliet P, Muñoz-Cánoves P
uPA deficiency exacerbates muscular dystrophy in mdx mice.
J. Cell Biol. 178: 2007 IF 9.598
Serrano AL, Baeza-Raja B, Perdiguero E, Jardí M, Muñoz-Cánoves P
Interleukin-6 is an essential regulator of satellite cell-mediated skeletal
muscle hypertrophy.
Cell Metab. 7:33-44, 2008 IF 16.107
Vidal B, Serrano AL, Tjwa M, Suelves M, Ardite E, De Mori R, Baeza B,
Martínez de Lagrán M, Ruiz-Bonilla V, Jardí M, Gherardi R; Degen J, Christov
C, Dierssen M, Dewerchin M, Carmeliet P, Muñoz-Cánoves P
Fibrinogen drives dystrophic muscle fibrosis via a TGFb/alternative
macrophage activation pathway.
Genes & Development, 22:1747-52, 2008. IF 13.623
Serrano AL, Muñoz-Cánoves P
Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.
Experimental Cell Research, 18:3050-8, 2010 IF 27.822
Serrano AL, Mann CJ, Vidal B, Ardite E, Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P.
Cellular and molecular mechanisms regulating fibrosis in skeletal muscle
repair and disease.
Current Topics in Developmental Biology (in press, 2011) IF 27.822
Ardite E, Perdiguero E, Vidal E, Gutarra S, Serrano AL, Muñoz-Cánoves P
PAI-1-regulated TGFbeta defines a novel fibrogenic pathway in muscular
dystrophy
(Nature Medicine, en revisió, 2011. Manuscript # NMED-A54436) IF 27.822
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Altres publicacions derivades indirectament d’aquest projecte
Perdiguero E, Ruiz-Bonilla V, Gresh L, Hui L, Ballestar E, Sousa-Victor P,
Baeza-Raja B, Jardi M, Bosch-Comas A, Esteller M, Caelles C, Serrano AL,
Wagner EF, Muñoz-Cánoves P
Genetic analysis of p38 MAP kinases in myogenesis: fundamental role of
p38alpha in abrogating myoblast proliferation.
EMBO J. 26:1245-56, 2007. IF 8.662
Perdiguero E, Ruiz-Bonilla V, Serrano AL, Muñoz-Cánoves P
Genetic Deficiency of p38alpha Reveals its Critical Role in Myoblast Cell
Cycle Exit: The p38alpha-JNK Connection.
Cell Cycle 6: 1298-303, 2007 IF 3.314
Serrano AL, Jardi M, Suelves M, Klotman PE, Muñoz-Cánoves P
HIV-1 transgenic expression in mice induces selective atrophy of fastglycolytic skeletal muscle fibers.
Front Biosci. 13:2797-805, 2008
IF 3.308
Ruiz-Bonilla V, Perdiguero E, Gresh L, Serrano AL, Zamora M, Sousa-Victor
P, Jardí M, Wagner EF, Muñoz-Cánoves P.
Efficient adult skeletal muscle regeneration in mice deficient in p38beta,
p38gamma and p38delta MAP kinases.
Cell Cycle 7:2208-14, 2008. IF 4.120
Perdiguero E, Muñoz-Cánoves P
Volume on "SAPKs". Chapter by the Authors: Transcriptional regulation by
the p38 MAPK signaling pathway in mammalian cells.
Topics in Current Genetics. 2008 (Posas F & Nebreda AR, Editors)
Perdiguero E, Sousa-Victor P, Ballestar E, Muñoz-Cánoves P
Epigenetic regulation of myogenesis.
Epigenetics 4:541-50, 2009 IF 4.584
11
Cuadrado A, Corrado N, Perdiguero E, Lafarga V, Muñoz-Cánoves P,
Nebreda AR.
Essential role of p18Hamlet/SRCAP-mediated histone H2A.Z chromatin
incorporation in muscle differentiation.
EMBO J. 12:2014-25, 2010 IF 8.993
12