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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
RELACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO
Y EL PATRÓN DE DESCARGA DE LAS
NEURONAS SECRETORAS DE ACOCIL
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE
F I S I O L O G Í A
PRESENTA
Juan José Martínez Hernández
A S E S O R:
Carlos G. Onetti Percello
Colima, Col. 1990
Parte de los resultados de esta tesis fueron presentados en
el XXXII Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas y se enviaron
para publicación:
Martínez, J.J. y Onetti, C. (1989). Dependencia de las
corrientes de potasio con el calcio intracelular en neuronas
secretoras de acocil. Memorias del XXXII Congreso Nacional de
Ciencias Fisiológicas, Res. 0 78;
Martínez, J.J., Onetti, C.G., García, E. & Hernández, S.
Potassium current kinetics in bursting secretory neurons: effects
of intracellular calcium.
A mi compañera:
María Luisa
A mis hijos:
Carlos Manuel y Gustavo Adolfo
dos rodilloncitos muy guapos
AGRADECIMIENTOS
A mis profesores.
A la Universidad de Colima
Investigaciones Biomédicas.
y
al
Centro
Universitario
de
A Carlos Onetti, por su asesoría, paciencia y generosidad durante
el desarrollo del trabajo.
A Esperanza
críticos.
García,
por
su
amistad
y
por
sus
comentarios
Al Dr. Miguel Huerta y al Dr. Jesús Muñiz, por su interés en mi
formación académica.
A Raúl López, con quien comparto la responsabilidad de ser la
primera generación de la maestría.
A mis compañeros de laboratorio Eduardo Pedraza y José Del Río,
por su apoya y solidaridad.
A Saúl Hernández, por la elaboración de los programas de cómputo
que me permitieron hacer un mejor análisis de los resultados
experimentales.
A Juan Carlos Muñoz, por su magnifico trabajo de dibujo y
fotografía lo que contribuyo a mejorar la presentación del
trabajo.
Al personal técnico que labora en el CUIB, en especial a: Jesús
Dueñas, Candelario Uribe, Nieves, Lupita, Maria Elena Martínez y
Ezequiel Viera.
I N D I C E
página
PROLOGO.........................................................4
INTRODUCCIÓN....................................................6
Las corrientes de potasio en las neuronas..................8
El rectificador tardío................................8
La corriente transitoria de salida....................9
La corriente de potasio activada por Cal 2+.............10
El rectificador anómalo...............................11
Otras corrientes de potasio...........................11
Relación de las corrientes de potasio con la
actividad marcapaso en neuronas..........................13
Modulación de las corrientes de potasio....................18
Actividad espontánea y corrientes de potasio
en neuronas del OX de acocil.............................23
OBJETIVOS.......................................................26
MÉTODOS.........................................................27
Preparación................................................27
Sistema de registro........................................30
Métodos de graficación y análisis..........................31
Pipetas....................................................32
Soluciones.................................................32
RESULTADOS......................................................35
1. Caracterización de las corrientes de potasio
en las neuronas del OX de acocil........................ 35
Las corrientes de potasio I K e IA ........................35
2
Cinética de las corrientes de potasio................... 39
Activación de la IK.................................39
Activación de la IA .................................43
Inactivación de la IA ...............................46
2. Relación del patrón de descarga de neuronas
del OX con las corrientes de potasio.................... 50
Diferentes patrones de descarga espontánea.............. 50
Características de las corrientes de potasio
y su relación con el patrón de descarga............... 52
Relación del patrón de descarga con la I K................54
Relación del patrón de descarga con la IA ................55
3. Dependencia de las corrientes de potasio con
el calcio intracelular.................................. 57
Efectos del calcio intracelular sobre el
rectificador tardío................................... 57
Efectos del calcio intracelular sobre el
componente transitorio de la corriente de potasio..... 62
DISCUSIÓN.......................................................68
Separación de dos componentes de la corriente de
Potasio..................................................69
Cinética de las corrientes de potasio......................69
Características de las corrientes de potasio
y su relación con el patrón de descarga..................71
Efectos del aumento del calcio intracelular
sobre las corrientes de potasio..........................72
Importancia fisiológica....................................75
3
RESUMEN Y CONCLUSIONES..........................................78
PERSPECTIVAS....................................................82
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................84
4
P R O L O G O
Hace aproximadamente siete años, y más por curiosidad que
por interés, visité por vez primera el Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas (CUIB). En esa época cursaba el quinto
semestre de la carrera de Medicina y recibí la amable invitación
por
parte
del
Dr.
Jesús
Muñiz
para
cumplir
dentro
de
la
Institución el Servicio Social correspondiente a dicha carrera;
invitación
que
rechacé.
El
motivo
que
me
hizo
denegar
tal
deferencia fue mi convicción de servir a la comunidad y en aquel
entonces
"servicio"
significaba
para
mí
hacer
Medicina
Asistencial.
Durante el año en el cual cumplí con el Servicio Social,
conocí las limitaciones a que se enfrenta la práctica médica en
el medio rural. Cuatro años de estudios teóricos realizados en la
Facultad de Medicina y un año de internado en una clínica del
IMSS
no
fueron
suficientes
para
contestarme
las
siguientes
preguntas: ¿que terapéutica usar en un paciente que cursa con una
neoplasia terminal? ¿qué puede hacer un glucosado al S% en un
paciente de un año de edad que cursa con una desnutrición de III
grado? ¿cómo prescribir medicamentos a un paciente, si sabemos
que éstos son de baja calidad y que
son muchos los efectos
indeseables que ocasionan?. Ante esta situación tomé la decisión
de
buscar
olvidar
cambiar
otras
la
posibilidades
experiencia
tal
vivida,
situación.
Mis
de
trabajo
pudiera
en
las
cuales,
contribuir
posibilidades
en
eran:
sin
algo
a
hacer
5
Medicina
Preventiva
o
hacer
investigación.
El
CUIB
y
la
Universidad de Colima me dieron la oportunidad de aspirar a esta
última posibilidad, por lo que me considero afortunado.
Los
resultados
que
se
presentan
en
este
trabajo
fueron
obtenidos en el laboratorio y bajo la asesoría del Dr. Carlos
Onetti, además de contar con el invaluable apoyo de Esperanza
García.
El
trabajo
de
programación
en
microcomputadora
requerido
para la adquisición y el análisis de información fue realizado
por Saúl Hernández.
Durante los estudios recibí una beca-crédito CONACyT (No. de
registro 055455). Este trabajo fue financiado parcialmente por
donativos
otorgados
por
la
D.G.I.C.S.A.
Educación Pública (89-01-0149).
de
la
Secretaria
de
INTRODUCCIÓN
6
Se ha reportado la existencia de neuronas que tienen la
propiedad de generar potenciales de acción en forma espontánea; a
estas células se les conoce con el nombre de neuronas marcapaso,
y han sido identificadas en diferentes sistemas neuronales de
invertebrados (Alving, 1968, 1969; Gainer, 1972; Tazaki y Cooke,
1979; Nagano y Cooke, 1987) y vertebrados (Gähwiler y Dreifuss,
1979; Llinás y Yarom, 1981; Andrew y Dudek, 1983; Bourque y
Renaud, 1983).
Las
neuronas
descarga:
1)
la
marcapaso
descarga
presentan
tónica
diferentes
que
patrones
consiste
en
de
descargas
repetidas de potenciales de acción a una frecuencia constante, 2)
la
descarga
fásica
que
se
caracteriza
por
tener
ráfagas
de
potenciales de acción y, 3) las células que descargan potenciales
de acción en forma irregular.
Las
neuronas
marcapaso
pueden
distinguirse
de
las
que
descargan potenciales de acción sólo en respuesta a una entrada
sináptica
excitatoria
(controladas)
por:
1)
el
efecto
de
la
polarización del soma: en las neuronas marcapaso la frecuencia de
descarga disminuye cuando el soma se hiperpolariza, en cambio en
las
neuronas
controladas
la
aplicación
de
corrientes
hiperpolarizantes pequeñas hace más prominentes los potenciales
postsinápticos
excitatorios,
sin
afectar
la
frecuencia
de
descarga (Tauc, 1957) y, 2) por la forma del potencial de acción
(figura 1): en las neuronas marcapaso el potencial de acción es
precedido
diferencia
por
una
despolarización
de
espontánea
gradual,
a
las
7
espigas
generadas
sinápticamente
que
son
precedidas
por
un
potencial postsináptico excitatorio (Alving, 1968)
Figura 1.
A y B: registros del potencial transmembrana de una
neurona marcapaso. Nótese: en A, la despolarización
lenta del potencial transmembrana durante el intervalo
entre espigas y en B, la morfología del potencial de
acción. C y D: registros del potencial transmembrana en
una neurona controlada. Nótese: en C, la actividad
sináptica (indicada con una flecha) y en D, la
morfología de una espiga iniciada sinápticamente.
Tomada de Alving (1968).
8
LAS CORRIENTES DE POTASIO EN LAS NEURONAS
En las neuronas de moluscos se han descrito diferentes corrientes
de potasio: entre ellas, la corriente del rectificador tardío
(IK), la corriente transitoria de salida (IA ), la corriente de
potasio activada por calcio intracelular (I C) y la corriente de
potasio del rectificador anómalo (I R).
A
continuación
cinéticas
de
se
activación
describen
y
de
las
características
inactivación,
curso
de
las
temporal
y
sensibilidad a bloqueadores de las corrientes de potasio arriba
mencionadas.
El rectificador tardío.
Esta corriente fue descrita inicialmente en el axón gigante de
calamar por Hodgkin y Huxley (1952). La
IK es una corriente
dependiente de voltaje que se activa a potenciales relativamente
positivos, es bloqueada por el tetraetilamonio (TEA) pero no es
bloqueada por los iones de Co2+, Mn2+ o en presencia de un medio
extracelular carente de Ca2+ (Thompson, 1977). Para identificar a
los canales relacionados con esta corriente, como "rectificadores
tardíos" la corriente macroscópica que pasa a través de estos
canales debe ser semejante a la corriente de potasio descrita por
Hodgkin
y
Huxley
(1952),
dependencia del voltaje.
tanto
en
su
cinética
como
en
su
9
La corriente transitoria de salida.
El componente transitorio de la corriente de potasio fue descrito
originalmente
por
Hagiwara
y
Posteriormente
fue
analizada
por
colaboradores
otros
autores
en
en
1961.
células
nerviosas de invertebrados; Archidoris (Stevens, 1969; Connor y
Stevens 1971a y b) y en neuronas de Helix pomatia (Neher y Lux,
1971). Esta corriente también ha sido identificada en sistemas
neuronales de vertebrados (Belluzzi y cols., 1985a). Connor y
Stevens (1971c) concluyeron que la conductancia asociada a la IA
(gA ) es distinta a la conductancia asociada a la IK (gK) y que
estos dos componentes de la corriente saliente podían separarse
por las características de sus conductancias: la IA se activa y
se inactiva más rápidamente que la IK, e incluso se inactiva
completamente a valores de potencial a los cuales la IK no se
encuentra apreciablemente activada. La IA se activa cuando, a
partir de potenciales de mantenimiento hiperpolarizados (-90 mV)
se aplican pulsos despolarizantes a potenciales más positivos que
-60 mV.
En gasterópodos marinos del género la amplitud de la IA es
dependiente del potencial de mantenimiento y de la magnitud del
pulso de prueba, pero el curso temporal parece ser el mismo a
diferentes potenciales de membrana (Connor y Stevens 1971b). En
Helix pomatia (Neher, 1971) y en el ganglio cervical superior de
rata (Belluzzi y cols., 1985a) el curso temporal de la activación
10
y de la inactivación de la IA son dependientes del potencial de
membrana.
En estudios realizados en neuronas de Tritonia diomedia por
Thompson
(1977)
mostraron
que
la
IA
difiere
de
la
IK
en
su
sensibilidad a los bloqueadores de canales de potasio y que la
corriente
de
componentes
potasio
por
sus
puede
ser
diferencias
separada
en
su
en
sus
distintos
sensibilidad
a
la
4-
aminopiridina (4-AP), al TEA y a los iones de Co2+ o Mn2+. El
componente transitorio de la corriente de potasio es bloqueado
por agregar a la solución externa 3 mM de 4-AP, concentración que
no
afecta
apreciablemente
al
rectificador
tardío,
la
IK
es
bloqueada al agregar a la solución externa 50 mM de TEA.
La corriente de potasio activada por Ca2+
La IC es una corriente de potasio activada por un aumento en la
concentración intracelular de calcio. Los canales para la IC se
abren y cierran dependiendo de la actividad del calcio en el
citoplasma celular y son dependientes del tiempo y del voltaje. A
concentraciones intracelulares del orden de 10-8 a 10-5 M de Ca2+,
el potencial de reposo es considerado como voltaje de cierre, en
el cual los canales para esta corriente se encuentran cerrados.
Existen diferentes tipos de canales de potasio activados por
calcio
que
sensibilidad
voltaje
difieren
a
los
en
iones
su
de
transmembranal.
conductancia
calcio
y
En
en
unitaria,
su
en
su
dependencia
del
neuronas
de
11
Tritonia diomedia, la IC se activa a potenciales positivos, es
bloqueada por agregar 30 mM de CO2+ o Mn2+ al medio extracelular y
es insensible al TEA y a la 4-AP (Thompson, 1977).
El rectificador anómalo.
En
contraste
con
las
corrientes
de
potasio
descritas
anteriormente, la corriente del rectificador anómalo disminuye
con la despolarización de la membrana a potenciales más positivos
que el potencial de equilibrio del potasio (EK). En neuronas de
Aplasia
la
IR
tiene
las
siguientes
características:
es
una
corriente entrante, la conductancia de los canales aumenta con la
hiperpolarización,
se
activa
muy
rápido
a
potenciales
más
negativos que el EK su inactivación es rápida e incompleta, se
reduce al disminuir la concentración extracelular de potasio, y
se bloquea al agregar sales de Ba, Cs y Rb al medio extracelular
(Adams y Benson, 1985).
Otras corrientes de potasio
En estudios recientes se ha reportado la existencia de otras
corrientes
de
muscarínicos
corrientes
potasio
(I M),
la
sensibles
al
como
son:
modulada
la
por
trifosfato
modulada
la
de
por
serotonina
adenosina
agonistas
(I S),
(IATP)
y
las
la
corriente de potasio activada por sodio.
La
corriente
muscarínicos
es
de
una
potasio
activada
corriente
lenta,
por
los
agonistas
dependiente
del
12
voltaje,
que
no
se
inactiva
y
que
se
activa
a
potenciales
hiperpolarizados o cercanos al potencial de reposo. Los canales
que conducen esta corriente son cerrados por la unión de la
acetilcolina a los receptores muscarínicos, esto se ha reportado
en neuronas centrales y en células simpáticas de vertebrados
(Adams y cols., 1983).
En las neuronas sensoriales de Aplysia se ha descrito una
corriente de potasio dependiente de voltaje que contribuye a la
repolarización del potencial de acción y recibe el nombre de
corriente-S (Siegelbaum y cols., 1982). Los canales para la IS
difieren de los del rectificador tardío en que se abren cuando el
potencial de membrana es igual al potencial de reposo de estas
células
(-40
mV)
y
que
su
cinética
de
apertura
es
poco
dependiente del voltaje. La serotonina y algunos neuropéptidos
endógenos
incremento
producen
en
la
el
cierre
duración
del
de
estos
canales
potencial
de
e
acción
induce
(Abrams
un
y
cols., 1984; Siegelbaum y cols., 1986).
Los canales de potasio que son sensibles al trifosfato de
adenosina (K ATP) permiten el enlace entre el estado metabólico de
la célula y su excitabilidad (Ashcroft, 1988). En las células
beta del páncreas estos canales se encuentran abiertos en el
potencial
de
reposo
de
la
célula;
el
incremento
en
la
concentración intracelular de ATP, que ocurre como consecuencia
del metabolismo de la glucosa, bloquea los canales KATP. De esta
manera
la
célula
se
despolariza
y
activa
los
canales
de
Ca
13
dependientes del voltaje y finalmente, la liberación de insulina
(Ashcroft, 1988). Se ha observado que los canales de la IATP de
diferentes tejidos presentan propiedades distintas, de tal manera
que la conductancia unitaria varía de 50 pS, en células beta del
páncreas, células del corazón y músculo esquelético a más de 150
pS, en tejido cerebral y en músculo liso (Quast y Cook, 1989).
En
neuronas
de
invertebrados
(Hartung,
1985)
y
de
vertebrados (Martín y Dryer, 1989) se ha descrito una corriente
de potasio que es dependiente de la entrada de Na+ a la célula.
Es una corriente igual o más rápida que la corriente transitoria
de salida (IA ). Hartung (1985) reportó que la amplitud de la
corriente decrece al reducir la concentración extracelular de
Na+, un efecto semejante se observa al agregar TTX a la solución
del baño. La conductancia unitaria de estos canales en células
del tallo cerebral de embriones de pollo es de 50 pS, para
concentraciones intracelulares de Na+ entre 10 y 100 mM (Martín y
Dryer, 1989).
RELACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO CON LA ACTIVIDAD MARCAPASO
DE LAS NEURONAS
En las neuronas, las corrientes de potasio tienen una acción
principalmente inhibitoria, proporcionando parte de la, corriente
saliente que se opone a las corrientes entrantes de Na + y Ca2+
activadas durante un estímulo despolarizante. Como resultado de
esto,
los
canales
para
el
potasio
juegan
14
un
papel
neuronal.
importante
La
en
diversidad
la
de
regulación
canales
de
de
la
excitabilidad
potasio
podría
tener
relación con los diferentes patrones de descarga que presentan
las células marcapaso.
Diferentes autores han establecido que las corrientes de
potasio en las neuronas tienen una función preponderante en la
regulación
de
la
actividad
marcapaso.
En
particular,
las
corrientes I K, IA, IC e I R han sido relacionadas con la modulación
de
las
descargas
espontáneas
de
potenciales
de
acción.
La
diferencia en su participación como reguladores de la frecuencia
de descarga y de la duración del potencial de acción depende de
su
curso
temporal
y
de
su
cinética
de
activación
y
de
inactivación.
La tabla 1 resume las principales características de las
corrientes
de
potasio
actividad marcapaso.
mencionadas,
y
su
participación
en
la
15
TABLA 1
CORRIENTES DE POTASIO, CARACTERÍSTICAS Y EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD MARCAPASO
-----------------------------------------------------------------------------------------CORRIENTE DE
CARACTERÍSTICAS
EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD
POTASIO
PRINCIPALES
MARCAPASO.
-----------------------------------------------------------------------------------------RECTIFICADOR
TARDIO (IK).
1 DEPENDIENTE DE VOLTAJE.
1 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
2 NO INACTIVA.
DE ACCIÓN DETERMINANDO ASÍ SU
3 BLOQUEADA POR TEA (ext.)
DURACIÓN.
Y POR TEA, Ca Y Ba (int.)
-----------------------------------------------------------------------------------------CORRIENTE "A"
1 DEPENDIENTE DE VOLTAJE.
1 LATENCIA DE LA PRIMERA ESPIGA
(IA).
2 INACTIVA.
2 REGULACIÓN DE LA FRECUENCIA
3 BLOQUEADA POR 4-AP (ext.)
DE DESCARGA.
Y POR Cs Y TEA (int.).
3 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
DE ACCIÓN?
-----------------------------------------------------------------------------------------ACTIVADA POR
CALCIO (IC).
1 ACTIVADA POR CONCENTRA1 REPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL
CIONES pM DE Ca INTERNO
DE ACCIÓN.
2 LA DEPENDENCIA DE TIEMPO
2 HIPERPOLARIZACIÓN POSTPOTENY VOLTAJE ESTA CORRELACIAL.
CIONADA CON LA ENTRADA
3 REGULACIÓN DE LA FRECUENCIA
DE CALCIO.
DE DESCARGA.
3 BLOQUEADA POR TEA Y Cd
4 TERMINACIÓN DE LAS RÁFAGAS.
(ex t.).
-----------------------------------------------------------------------------------------RECTIFICADOR
ANOMALO (IR).
1 CORRIENTE ENTRANTE.
1 MANTIENE LA MESETA DURANTE
2 AUMENTO DE SU CONDUCTANCIA
EL POTENCIAL DE ACCIÓN.
CON HIPERPOLARIZACIÓN
2 REGULA LA FRECUENCIA DE
3 BLOQUEADA POR TEA (int.)
DISPARO.
Cs Y Ba (ext.)
-----------------------------------------------------------------------------------------Modificada de: Rudy (1988).
16
A
continuación
se
describe
la
participación,
de
las
corrientes de potasio que han sido relacionadas con la regulación
de la actividad marcapaso en diferentes preparaciones.
La
IK
es
la
corriente
que
responsable
de
la
repolarización
durante el potencial de acción (Neher y Lux, 1972) Una reducción
en la amplitud de la IK produce un incremento en la duración del
potencial de acción dando como consecuencia un aumento en la
duración
del
período
refractario
y
un
por
lo
tanto
una
disminución de la frecuencia de descarga.
La
IA
latencia
regula
de
la
la
frecuencia
primera
espiga
de
descarga
cuando
la
determinando
neurona
se
la
activa
espontáneamente o cuando responde a una despolarización sostenida
(Connor y Stevens, 1971c).
La hiperpolarización posterior a cada potencial de acción
reactiva una parte de los canales para la IA . Al ser activada la
IA
prolonga
potencial
el
tiempo
umbral,
que
tarda
prolongando
el
la
célula
intervalo
en
entre
alcanzar
el
espigas
y
reduciendo la frecuencia de descarga (Connor y Stevens, 1971c).
Las corrientes de potasio dependientes de calcio contribuyen
a la hiperpolarización que sigue a una ráfaga de potenciales de
acción (Kaczmarek, 1988). En las células excitables, la IC es
activada
por
la
entrada
de
calcio
que
17
ocurre
durante
el
potencial
de
acción.
Esta
corriente
es
responsable en gran medida de la hiperpolarización postpotencial
(Pennefather y cols., 1985) que sigue a una espiga y juega un
papel importante en la modulación de la frecuencia de descarga ya
que aleja a la célula del potencial umbral. En algunas neuronas
contribuye a la repolarización del potencial de acción (Adams y
cols., 1982; MacDermott y Weight, 1982).
La contribución de la IR a la corriente neta de membrana es
pequeña para potenciales de membrana (Vm) entre 5 y 35 mV más
positivos que el EK. Esto es muy importante porque en condiciones
fisiológicas el E K es mas negativo que el Vm. A potenciales entre
-80 y -50 mV, la curva corriente voltaje (I-Em) en estado estable
pasa
cerca
subumbrales
del
para
eje
de
las
voltaje.
corrientes
Estos
de
valores
potasio
de
Vm
dependientes
son
de
voltaje. Las corrientes que se activan a estos valores de voltaje
no afectan al potencial de acción por sí mismas, pero controlan
el patrón de su generación durante las ráfagas, específicamente
durante el intervalo entre ráfagas. Un pequeño aumento en la
corriente
saliente
puede
desplazar
a
la
curva
I-Em
del
rectificador anómalo más cerca o sobre el eje de voltaje (véase:
Adams y Benson, 1985).
Aunque las corrientes IM, IS, IATP y la corriente de potasio
activada
por
sodio,
hasta
el
momento
no
han
sido
18
relacionadas
directamente
con
la
actividad
marcapaso,
podrían
participar en la modulación de la frecuencia y duración de los
potenciales de acción.
MODULACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO
Las
características
electrofisiológicas
de
las
neuronas
están
determinadas por el cierre y la apertura de los canales fónicos
en la membrana plasmática. Una vez que los canales han sido
sintetizados
e
activación
y
constante
sino
membrana,
por
incorporados
a
de
inactivación
que
pueden
ser
neurotransmisores
la
membrana,
no
cinética
necesariamente
moduladas
y
su
por
por
el
procesos
de
permanece
potencial
de
intracelulares
(Kaczmarek, 1988). Algunos autores han reconocido la existencia
de un mecanismo de control por compuestos intracelulares como el
calcio (Meech, 1978).
A continuación se describe la modulación de las corrientes
de
potasio
que
se
han
relacionado
con
la
regulación
de
la
actividad marcapaso.
A partir de evidencias recientes se ha sugerido que las
propiedades del rectificador tardío en el axón gigante de calamar
son moduladas por una reacción dependiente de ATP, esto puede ser
por una fosforilación del canal. En axones en los cuales se ha
dializado el medio interno, la adición de ATP a la solución
intracelular
origina
un
cambio
en
la
19
dependencia
al
voltaje
y
en
la
cinética
de
activación
y
de
inactivación de la IK (Kaczmarek, 1988). Después del tratamiento
con ATP la corriente, activada por despolarizaciones grandes de
la
membrana,
se
incrementa
en
amplitud
y
se
activa
más
lentamente.
La
aplicación
sistemas
de
de
segundos
neurotransmisores,
mensajeros
y
la
la
manipulación
inyección
de
de
proteínas
cinasas al interior celular, en diferentes sistemas neuronales,
producen una disminución en la amplitud de la IA acompañada por
cambios en la velocidad de su inactivación (Kaczmarek, 1988).
Las
neuronas
neurosecretoras
"bag"
que
en
(en
su
forma
de
potencial
bolsa)
de
de
reposo
son
no
células
presentan
actividad espontánea. Se despolarizan y descargan potenciales de
acción en forma repetitiva durante 60 minutos en respuesta a un
estimulo
breve.
incremento
cíclico
de
de
activador
Esta
la
la
posterior
concentración
adenosina
de
descarga
(AMPC)
ciclasa
La
de
es
modulada
intracelular
aplicación
adenilato)
y
de
de
por
el
monofosfato
forscolina
(un
R020-1724
(un
de
inhibidor de la fosfodiesterasa) reducen la amplitud de la IA y
aceleran
el
proceso
de
la
inactivación.
Los
procesos
de
activación y de inactivación en estado estable no son alterados
por
estos
fármacos.
Se
ha
sugerido
que
estos
cambios
en
la
cinética de inactivación de la IA pueden explicar la capacidad de
las
neuronas
"bag"
de
20
Aplysia para descargar potenciales de acción en forma repetitiva
después de aplicar estímulos (Strong, 1984).
Los distintos tipos de canales para el potasio activados por
el calcio intracelular son aparentemente regulados por segundos
mensajeros a través de diferentes vías como son: el AMPC, la
subunidad catalítica de la proteína cinasa dependiente de AMPC
(proteína cinasa A), así como por proteína cinasa C (Kaczmarek,
1988).
En experimentos realizados en neuronas intactas de Helix
pomatia, se ha encontrado que estos canales son regulados por la
proteína cinasa A. La adición de 0.1 µM de proteína cinasa A a la
solución
interna
aumenta
la
amplitud
de
la
IC
durante
la
despolarización de la membrana celular (DePeyer y cols., 1982).
En
canales
reconstituidos
en
bicapas
lipídicas,
la
aplicación de proteína cinasa A en presencia de ATP, produce un
incremento en la probabilidad de apertura de estos canales (Ewald
y cols., 1985). Estos resultados sugieren que la regulación de
estos canales por la proteína cinasa A ocurre directamente por la
fosforilación del canal.
La IR aumenta por los neurotransmisores que actúan a través
de segundos mensajeros como el AMPC. La serotonina (Benson y
Levitan, 1983; Lotshaw y cols., 1986) aumenta la IR en neuronas
R15 de Aplysia. Hay evidencias de que dicho efecto es mediado por
un
incremento
en
los
niveles
de
AMPC
21
(Drummond y cols., 1980; Benson y Levitan, 1983; Levitan y cols.,
1987). Más aún la hiperpolarización entre ráfaga que ocurre al
agregar serotonina a neuronas R15 de Aplysia es mediada por AMPC
(Drummond y cols., 198O).
La activación de la ciclasa de adenilato, la inhibición de
la fosfodiesterasa, y la aplicación de análogos no hidrolizables
de AMPc incrementan la IR (Kramer y Levitan, 1988).
Los
efectos
específicamente
de
a
la
la
despolarización
entrada
y
a
la
sobre
la
IR
acumulación
se
de
deben
calcio
intracelular durante una descarga en ráfaga espontánea o inducida
por
pulsos
despolarizantes,
que
inactiva
a
la
IR
(Kramer
y
Levitan, 1988).
El
aumento
del
calcio
intracelular
producido
por
despolarizaciones repetidas suprime la respuesta de la IR a dosis
pequeñas de serotonina, esto sugiere que el calcio interfiere con
la activación dependiente del AMPC de la IR, el calcio reduce la
concentración
de
AMPC
por
la
activación
de
fosfodiesterasas
sensibles a calcio/calmodulina (Kramer y cols., 1988). Por otra
parte,
la
inhibición
de
la
fosfodiesterasa
suprime
la
inactivación dependiente de calcio de la IR (Kramer y cols.,
1988). Con la técnica de radioinmunoanálisis se ha observado que
la concentración de AMPC aumenta en los somas de neuronas R15 de
Aplysia que han tenido largos periodos de hiperpolarización, lo
que no ocurre después de una ráfaga, esto apoya la hipótesis de
que la entrada de calcio reduce la concentración de AMP C (Kramer
22
y cols., 1988). Asimismo, se ha concluido que la inactivación de
la IR dependiente de calcio se debe a la interacción entre el Ca
intracelular y el metabolismo del AMPc, y que la estimulación de
una fosfodiesterasa dependiente de calcio/calmodulina contribuye
a la inactivación de la I R (Kramer y cols., 1988).
Los efectos de la despolarización sobre la IR son bloqueados
por la sustitución del calcio del medio extracelular, agregando
3mM de Mn2+ para bloquear los canales de calcio o inyectando un
quelante de Ca2+ (EGTA) (Kramer y Levitan, 1988). En resumen, la
IR
es
modulada
mensajeros
en
direcciones
intracelulares:
es
opuestas
aumentada
por
por
dos
el
segundos
AMPC
y
es
inactivada por Ca2+ intracelular.
En resumen, en las neuronas marcapaso las corrientes de
potasio participan en el control de la duración y la frecuencia
de los potenciales de acción. Además, pueden ser moduladas por
neurotransmisores
y
segundos
mensajeros
intracelulares.
En
particular el calcio que entra a la célula con cada potencial de
acción durante una ráfaga (Gorman y Thomas, 1978), inactiva a las
corrientes de potasio del rectificador tardío (Heyer y Lux, 1976;
Hofmeir
y
Lux,
Levitan, 1988).
1981)
y
del
rectificador
anómalo
(Kramer
y
23
ACTIVIDAD ESPONTÁNEA Y CORRIENTES DE POTASIO EN NEURONAS DEL OX
DE ACOCIL
Las neuronas del sistema órgano X-glándula sinusal (OX-GS) de los
crustáceos
decápodos
son
potenciales
de
producidos
acción
células
secretoras
por
que
estimulación
descargan
(Iwasaki
y
Satow, 1971) o en forma espontánea (Nagano y Cooke, 1987).
En
el
neuronales
OX
con
de
base
acocil
en
el
pueden
diferenciarse
patrón
de
descarga
tres
grupos
espontánea,
similares a los descritos en otras preparaciones: 1) neuronas que
disparan en forma regular; 2) irregular y; 3) en ráfagas (Onetti,
1989). En las neuronas del OX de acocil se han identificado dos
componentes de la corriente de potasio: un componente transitorio
rápido que se inactiva (figura 2D), al cual se le ha denominado
IA y que se bloquea con 4-AP (figura 2E), y un componente lento
que no se inactiva (figura 2A), al cual se le conoce como IK o
rectificador tardío y que se bloquea con TEA (figura 2C).
Sin embargo, dichos componentes de la corriente de potasio
en las neuronas del OX no han sido caracterizados completamente,
en particular en lo referente a las cinéticas de activación y de
inactivación,
ni
se
ha
estudiado
su
modulación
por
segundos
mensajeros (en particular por Ca 2+ intracelular).
El propósito del presente trabajo de tesis fue estudiar: a)
la
cinética
de
activación
y
de
inactivación
de
24
la IA y de la IK en las neuronas del OX de acocil, b) su posible
relación con los diferentes patrones de descarga y, c) el efecto
del calcio intracelular sobre la cinética de dichas corrientes.
25
Figura 2.
Registros de corrientes de potasio, en una neurona
axotomizada, en respuesta a pulsos despolarizantes,
aplicados cada 3 s, a potenciales de membrana de -40, 28, -16, -4 y 8 mV. Potencial de mantenimiento: -50 mV
(A y C), -90 mV (B, D y E). Solución de la pipeta: K/Ca
5 x 10 -9. Los registros (A y B) fueron obtenidos
prefundiendo la preparación con una solución carente de
sodio, (C y D) añadiendo 20 mM TEA a la solución sin Na
y E añadiendo 20 mM de TEA y 2 mM de 4-AP a la solución
sin sodios. Barra de calibración vertical: 3 nA (A, B,
C y D) y 0.6 nA (E). Tomada de Onetti (1989).
OBJETIVOS
26
Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron los
siguientes:
1)
Estudiar la cinética de las corrientes de potasio en
las neuronas del OX de acocil, en particular la del
rectificador tardío (I K) y de la corriente transitoria
de salida (IA )
2)
Relacionar
las
características
de
la
cinética
de
activación y de inactivación de dichas corrientes, con
el patrón de descarga.
3)
Estudiar la dependencia de la IK y de la IA , con la
concentración intracelular de calcio.
MÉTODOS
27
Preparación:
Los experimentos se realizaron en neuronas del OX de acociles
Procambarus clarkii adultos, machos y hembras, fuera de la época
de muda. Para obtener la preparación se practicó la ablación del
tallo ocular, el cual se colocó en una caja de Petri que contenía
solución salina normal (tabla 3). Se retiró el exoesqueleto que
cubre el tallo ocular y se extirparon los músculos y el tejido
conectivo que cubren la región donde se encuentra el OX. De esta
manera los cuerpos neuronales del OX quedaban expuestos y podían
observarse
al
microscopio
(figura
3B).
En
algunos
de
los
experimentos se cortó el tracto OX-GS, el corte se realizó en la
región proximal a los somas neuronales en el sitio que se indica
en la figura 3A con una flecha.
Una
vez
obtenida
la
preparación
se
colocó
en
la
parte
central de una cámara de lucita de tres compartimientos, con un
volumen total de 1 ml. Los compartimientos estaban conectados
entre sí, lo que permitía el flujo de soluciones entre ellos,
como se muestra en el esquema de la figura 4A. La preparación fue
prefundida con la solución salina normal durante 30 minutos antes
de efectuar las mediciones experimentales.
Los experimentos se realizaron a la temperatura de 22 a 24
ºC.
28
Figura 3.
A: Esquema del sistema neurosecretor del tallo ocular
de
acocil
mostrando
las
principales
estructuras
anatómicas: OX, tracto axónico y glándula sinusal. La
flecha indica el sitio donde se cortó el tracto en
algunos experimentos.
B: Microfotografía de los cuerpos neuronales de un OX
de acocil expuestos después de la disección del tejido
conectivo que los cubre. Tomadas de Onetti (1989).
29
Figura 4.
A: Esquema de la cámara de perfusión. La preparación se
colocaba en el compartimiento central. B: Esquema del
dispositivo de registro: I/V, convertidor corriente a
voltaje; Rf, resistencia de retroalimentación (100 MΩ);
a, amplificador de ganancia variable; I m=V/aRf , medición
de la corriente transmembranal; Vm, potencial de
mantenimiento;
VCOM,
pulsos
comandados
por
el
estimulador; Vm, medición del potencial de membrana;
A/D, convertidor analógico a digital. Tomadas de Onetti
(1989).
30
Sistemas de registro:
1). Se realizaron registros del potencial de membrana con la
técnica
convencional
de
microelectrodos
utilizando
un
amplificador de alta impedancia de entrada (DAGAN 8100), que
permitía la aplicación de pulsos de corriente a través del mismo
electrodo.
La
caída
de
voltaje
ocasionada
por
el
paso
de
corriente por el microelectrodo podía restarse de la diferencia
de
potencial
transmembranal
con
un
amplificador
diferencial
("puente").
2). Se registró la corriente transmembranal y el potencial
de membrana con la técnica de fijación de voltaje en células
completas o "whole-cell clamp" (Hamill y cols., 1981), tanto en
la configuración de fijación de voltaje como en la configuración
de fijación de corriente. Para ello se utilizó un amplificador
construido en la Universidad de Colima (Onetti, 1989) basado en
el
diseño
de
Sigworth
corrigieron
restando
capacitiva.
La
(1983).
las
figura
Las
señales
corrientes
4B
muestra
de
el
de
fuga
y
esquema
corriente
la
del
se
corriente
dispositivo
experimental utilizado.
3).
Las
utilizando
señales
un
filtro
de
voltaje
pasabajas
y
de
tipo
corriente
Bessel
de
se
filtraron
cuatro
polos
(Frequency Devices), a las frecuencias de corte (-3dB) de 0.05,
1.2 y 3.2 kHz. Las señales restadas, filtradas y amplificadas se
adquirieron
en
una
microcomputadora
(IBM-AT),
utilizando
un
convertidor analógico-digital de 12 bits (TECHEN), a 50, 2500 y
10000 muestras por segundo.
31
4).
Los
utilizando
pulsos
un
de
generador
microcomputadora
voltaje
de
(Rockwell
y
pulsos
AIM65).
de
corriente
programable
Las
curvas
se
aplicaron
basado
I-Em en
en
una
estado
estable, en la configuración de fijación de voltaje se obtuvieron
mediante
la
aplicación
de
rampas
de
voltaje
utilizando
un
"generador de rampas" analógico comandado por el generador de
pulsos. El generador de rampas fue diseñado por el Ing. Gilberto
Ornelas y construido en la Universidad de Colima (Onetti, 1989).
Métodos de graficación y análisis:
Las
figuras
fueron
hechas
en
un
graficador
(Hewlett
Packard
ColorPro). Los trazos de corriente contienen 512 puntos.
La
densidad
de
corriente
fue
determinada
dividiendo
la
amplitud de la corriente por la capacidad de membrana (Cm) en vez
de considerar el área de l a superficie celular. Para medir C m se
aplicó un pulso de voltaje de 10 mV. La capacidad de membrana se
calculó a partir de la ecuación: Cm=It/V, donde "It" corresponde
al área del transiente capacitivo y V a la amplitud del escalón
de voltaje (10 mV).
Las
cinéticas
analizadas
de
activación
y
de
inactivación
fueron
de acuerdo con las ecuaciones de Hodgkin y Huxley
(1952).
El ajuste de los datos experimentales se realizó usando el
método de mínimos cuadrados para modelos no lineales, con la
rutina
"Patternsearch"
(Colquhoun,
1971)
escrita
en
32
lenguaje Turbo-Pascal en una microcomputadora (IBM-AT) por Saúl
Hernández, en la Universidad de Colima.
Pipetas:
Los
microelectrodos
fabricaron
con
utilizados
tubos
para
capilares
de
registro
1.2
mm
intracelular
de
diámetro
se
con
filamento interior (AM System). Para fabricarlos se utilizó un
estirador vertical (David Kopf) y se llenaron con una solución de
KCl 3M. Las resistencias de los microelectrodos utilizados fueron
del orden de 30 MΩ. Las pipetas para los experimentos de fijación
de voltaje y de corriente fueron construidas con tubos capilares
para
hematocrito
(S/P,
1.1
1.2
mm
diámetro
interno).
Estas
pipetas fueron llenadas con las soluciones cuya composición se
muestra en la tabla 2. El valor de la resistencia de las pipetas
fue de 0.8 a 1.2 MΩ. La resistencia del sello entre las pipetas y
la membrana fue mayor que 10 GΩ.
Soluciones:
La
composición
de
las
soluciones
internas
y
las
externas
se
muestran en las tablas 2 y 3, respectivamente. Las soluciones
internas se filtraron utilizando membranas con poros de 0.22 µm
(MILLIPORE GS-type).
La
concentración
de
calcio
en
el
citoplasma
de
células
animales se encuentra entre de 10 -8 y 10-5 M (Baker y cols., 1970;
Rasmussen,
1970).
Por
esta
razón
se
consideró
como
33
bajo calcio a la solución interna K/Ca 10-8 y como alto calcio a
la solución K/Ca 10 -6.
TABLA 2: Composición de las soluciones internas (en mmol/l)
----------------------------------------------------------------K/Ca 10 -8
KCl
K/Ca 10 -6
216
209
MgCl2
2
2
CaCl2
0.5
5
EGTA
5.5
5.5
HEPES
10
10
-----------------------------------------------------------------
El pH de estas soluciones se ajustó a 7.2
Suponiendo una constante de unión Ca-EGTA de 107, la [Ca] de
las soluciones fue de 10-8 y de 10-6 mol/l, respectivamente.
34
TABLA 3: Composición de las soluciones externas (en mmol/l)
----------------------------------------------------------------Normal
NaCl
200
KCl
CaCl 2
O-Na/Cd
O-Na/Cd/TEA
--
--
5.4
5.4
5.4
13.5
13.5
13.5
MgCl2
2
--
--
HEPES
10
--
--
TRIS-HCl
--
208
188
CdCl 2
--
2
2
TEA-Cl
--
--
20
----------------------------------------------------------------El pH de estas soluciones se ajustó a 7.4.
RESULTADOS
CAPITULO 1
35
CARACTERIZACIÓN DE LAS CORRIENTES DE POTASIO EN LAS NEURONAS DEL
OX DE ACOCIL.
LAS CORRIENTES DE POTASIO I K E IA
Se registraron las corrientes de potasio en las membranas de las
neuronas axotomizadas, con el medio intracelular dializado con
una solución que contenía una concentración de calcio de 10-8
mol/l (tabla 2) y prefundiendo la preparación con solución ONa/Cd
(tabla
mantenimiento
3).
Para
ello,
de
-50
y
a
partir
-100
mV
de
se
potenciales
aplicaron
de
pulsos
despolarizantes cada 3s, con una duración de 160 ms, a diferentes
potenciales de membrana entre -62 y 22 mV. La figura 5 muestra
registros
representativos
de
las
corrientes
obtenidas
en
una
célula axotomizada. Se observa que el pico de corriente aumenta
en cada caso cuando se lleva a la célula a potenciales más
positivos. La corriente saliente (I K) obtenidas a partir de un
potencial de mantenimiento de -50 mV (figura 5a) tenían un curso
temporal sigmoidal y no inactivaban apreciablemente. El umbral de
activación de la IK fue de -38.4 ± 3.5 mV (media ± desviación
estándar, n=5). En la figura 5B se muestran registros obtenidos a
partir de un potencial de mantenimiento de -100 mV, donde pueden
observarse dos de los componentes de la corriente saliente (IK e
IA). El componente tardío (al final del pulso) era prácticamente
el
mismo
que
el
que
se
obtuvo
cuando
el
potencial
de
mantenimiento era de -50 mV (figura 5A). Debido a que la IA se
encuentra
inactivada
a
-60
mV,
potencial
al
36
cual la lK aún no se activa, es posible obtener el componente
transitorio neto (IA ) si se restan los trazos de corriente de la
figura 5A de los correspondientes de la figura 5B (5B - 5A). El
resultado
de
observarse
rápidamente,
que
la
la
resta
IA,
alcanzaba
se
muestra
obtenida
un
de
en
esta
máximo
la
figura
manera,
para
5C.
Puede
se
activaba
luego
decaer
exponencialmente en pocos milisegundos. El umbral de activación
de la IA fue de -52.2 ± 4.3 (n=5). La figura 6 muestra las
relaciones entre la corriente al pico y el potencial de membrana
para los dos componentes de la corriente de potasio: IK e
IA.
Entre de -50 y 22 mV para la IA y entre -35 y 22 mV para la IK,
el pico de corriente se incrementa a medida que se despolariza la
membrana.
37
Figura 5.
Registro de corrientes salientes (trazos inferiores de
A y B) en una neurona axotomizada del OX, en respuesta
a pulsos despolarizantes (trazos superiores) a -26,
-14, -1, 10 y 22 mV. Potencial de mantenimiento: -50 mV
(A) y -100 mV (B). Los registro mostrados en C resultan
de restar trazo a trazo los registros A y B (A y B).
Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de la pipeta:
K/Ca-10-8.
38
Figura 6.
Relaciones I-Em de la corriente saliente transitoria IA
(círculos blancos) y de la corriente tardía IK
(círculos negros). En ambos casos se midió el valor
máximo de la corriente. Las líneas punteada y continua
fueron ajustadas a ojo. Los puntos representan el valor
promedio de 4 neuronas. Las barras representan el error
estándar de la media. Solución de perfusión: O-Na/Cd.
Solución de las pipetas: K/Ca-10-8.
39
CINÉTICAS DE LAS CORRIENTES DE POTASIO.
Activación de la IK.
El componente transitorio de la corriente de potasio se encuentra
inactivada a un potencial de membrana de -50 mV, por lo tanto si
se
fija
el
voltaje
a
ese
nivel
y
se
aplican
pulsos
despolarizantes es posible obtener la IK no contaminada por la
IA.
Para
el
análisis
de
la
cinética
de
activación
de
las
corrientes de potasio se utilizaron las ecuaciones de Hodgkin y
Huxley
(1952).
potenciales
de
Si
se
supone
membrana
que
la
estudiados,
IK
esta
no
inactiva
corriente
a
los
puede
ser
descrita por una ecuación de la forma:
IK = I K∞ [1-exp (-t/ϒn>]N..........................(1),
donde IK∞ es la amplitud de la corriente a tiempos prolongados y
ϒn
es la constante de tiempo de activación.
Los
registros
de
corriente
obtenidos
a
potenciales
de
membrana entre -26 y 22 mV como los de la figura 5A, fueron
ajustados con la ecuación (1). Se probaron diferentes valores
para N y se obtuvo el mejor ajuste para N=4.
Los valores de gK se calcularon a partir de:
gK = IK/(V-EK)....................................(2),
donde EK = -92 mV es el potencial de inversión de IK calculado a
partir de la ecuación de Nernst y V es el potencial de membrana.
De esta manera, se calculó el valor promedio experimental de las
gK de 4 neuronas para cada potencial de membrana. La relación gKEm en
estado
Boltzmann:
estable
puede
ser
descrita
por
la
ecuación
de
40
gK = G K{1+exp[(VO-Em)k*]}-1.........................(3),
donde GK es la conductancia máxima de la membrana asociada a la
IK, VO es el potencial al cual se encuentra el valor medio de la
conductancia, V el potencial de membrana y k*=zF/RT; donde z es
la valencia de la compuerta de activación de IK, F la constante
de Faraday, R la constante de los gases y T la temperatura
absoluta. Ajustando la ecuación (3) a los valores experimentales
de gK se encontró: GK=0.357 mS/µF, Vo=-6.9 mV y K*=0.1037 mV -1; es
decir, z=2.62.
La figura 7 muestra la gK como una función del
potencial de membrana así como la curva de ajuste.
La
potencial
activación
de
en
membrana
estado
se
estable
obtuvo
(n∞)
suponiendo
en
que
función
nO=O
a
del
un
potencial de membrana de -50 mV. Así,
n∞ = [IK∞/(V-EK)]1/4(GK)-1/4..........................(4).
La figura 8 muestra los valores de n∞ y de la constante de
tiempo de activación como funciones del potencial de membrana, en
la misma neurona presentada en la figura 5.
41
Figura 7.
Dependencia
de
voltaje
de
las
conductancias
gA
(círculos blancos) y gK (círculos negros). Los valores
de gK y gA fueron calculados a partir de: gK,A = I/(VEK,A). Las líneas punteada y continua corresponden al
ajuste de los datos experimentales a la ecuación de
Boltzmann, para gA y gK respectivamente. Las barras
representan el error estándar de la media obtenida de 4
neuronas diferentes. Solución de perfusión: O-Na/Cd.
Solución de las pipetas: K/Ca 10 -8.
42
Figura 8.
Activación en estado estable (n8 , círculos negros) y
constante de tiempo de activación (TAUn, círculos
blancos) de la IK como funciones del potencial de
membrana (Em) en una neurona (la misma de la figura 5).
Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución de las
pipetas: K/Ca 10-8.
43
Activación de la IA .
Connor y Stevens (1971b) describieron en neuronas de moluscos al
componente
transitorio
de
la
corriente
de
potasio,
como
el
producto de la cinética de activación y de inactivación; estos
procesos son independientes entre sí. Por lo tanto, la corriente
puede ser descrita por la ecuación:
IA = K[1-exp(-t/ϒ m)]Nexp(-t/ϒ h)..................(5),
donde k es un factor de escalamiento y
ϒm
y
ϒh
son las constantes
de tiempo de activación y de inactivación respectivamente. Como
se describió anteriormente (figura 5C) las corrientes obtenidas a
diferentes potenciales de membrana se ajustaron utilizando la
ecuación (5). El mejor ajuste se obtuvo para N=4.
Para cada potencial de membrana, se ajustó el decaimiento de
la IA a una función exponencial simple (figura 1OC). La función
de ajuste se extrapoló al inicio del pulso de prueba para obtener
la amplitud instantánea de la IA (I0). Con los valores de lo
obtenidos
a
potenciales
de
membrana
entre
-62
y
22
mV,
se
calcularon los valores de gA utilizando la siguiente ecuación:
gA = I O(V-EA ).....................................(6),
donde V es el potencial de membrana y EA =-89 mV el potencial de
inversión medido para IA (datos no presentados). De esta manera
se
obtuvo
el
corrientes
de
ajustaron
con
promedio
4
de
neuronas
la
gA
a
partir
diferentes.
ecuación
de
de
los
Dichos
Boltzmann
registros
de
promedios
se
(ecuación
3),
44
obteniéndose los siguientes valores: GA =0.924 mS/µF, VO=-7.0 mV.
y K*=O.O689 mV -1 (z=1.74). La figura 7 muestra la relación gA-Em y
la curva de ajuste.
Si
se
supone
que
mO=O
y
hO=1,
a
un
potencial
de
mantenimiento de -100 mV, y que h∞=O a potenciales más positivos
que
-40
mV,
entonces
m8
puede
ser
obtenido
a
partir
de
la
ecuación:
m∞ = [I O/(V-EA)]1/4(GA )-1/4.......................(7).
En la figura 9 se muestran los valores de m ∞ y de la constante de
tiempo de la activación como funciones del potencial de membrana,
en la misma neurona representada en la figura 5.
45
Figura 9.
Activación en estado estable (m∞, círculos negros) y
constante de tiempo de activación (TAUm, círculos
blancos) de la IA como funciones del potencial de
membrana (Em). Solución de perfusión: O-Na/Cd. Solución
de las pipetas: K/Ca 10-8.
46
Inactivación de la IA .
El estudio del curso temporal de la inactivación de la corriente
transitoria se realizó bloqueando el rectificador tardío, por
agregar TEA (20 mmol/l) al medio extracelular. La inactivación en
estado estable fue estudiada condicionando a la membrana de la
neurona
durante
mantenimiento
tres
(Vm)
segundos
y
a
aplicando
diferentes
pulsos
despolarizantes (a 0 mV) como se ilustra en
potenciales
de
prueba
de
(PP)
la figura 10A. Se
midió el pico de la corriente durante los pulsos de prueba y se
construyó la gráfica de la amplitud relativa (con respecto al
valor máximo) de la corriente al pico (1/Imáx) en función del
potencial
de
mantenimiento.
La
figura
11
muestra
el
valor
promedio de la inactivación en estado estable como una función
del potencial de membrana. Dichos valores promedio se ajustaron a
una distribución de Boltzmann, de la forma:
h∞ = {1+exp[(V-Vh)k*]}-1............................(8),
donde Vh es el punto medio de la inactivación en estado estable y
k*=zF/RT; en este caso z representa la valencia de la compuerta
de inactivación de la IA . A partir del ajuste se obtuvo: Vh=-85.3
mV y k*=D.1532 mV-1 (z=3.87).
La
constante
ajustando
el
de
tiempo
decaimiento
de
de
la
inactivaciún
la
IA
a
una
fue
obtenida
exponencial
simple
(figura 10C). La figura 11 muestra los valores de las constantes
de tiempo de la inactivación a diferentes potenciales de membrana
obtenidos en la misma neurona representada en la figura 10C.
47
Para estudiar el curso temporal de la inactivación de la IA
a potenciales más negativos, es decir cuando la IA no se activa,
se utilizó un protocolo similar al desarrollado por Neher en 1971
(figura
10B).
Tanto
el
desarrollo
(figura
10B1)
como
la
desaparición (figura 10B2) de la inactivación fueron estudiados
midiendo
el
pico
de
corriente
durante
el
pulso
de
prueba
(usualmente a 0 mV) a diferentes tiempos después de llevar a la
neurona a los potenciales condicionantes (VM) comprendidos en el
intervalo de -45 a -120 mV. Las constantes de tiempo para estos
procesos se obtuvieron ajustando a una exponencial simple el
valor del pico de la corriente en función del tiempo. En la
figura 11 se muestran los valores de las constantes de tiempo
(n=3) del desarrollo y de la desaparición de la inactivación en
función del potencial de membrana.
48
Figura 10.
A: Registros de corriente (trazos inferiores) y
protocolo de pulsos (trazos superiores) utilizados para
estudiar
la
inactivación
en
estado
estable.
B:
Registros de corriente (trazos 2 y 4) y protocolos de
pulsos (trazos 1 y 3) utilizados para estudiar el
desarrollo
(2)
y
la
desaparición
(4)
de
la
inactivación,
respectivamente.
Vm:
potencial
de
mantenimiento, VM: potencial condicionante y PP: pulso
de prueba. C: Registros de corrientes, obtenidos con el
protocolo mostrado en la figura 5C, graficados en una
escala de tiempo más expandida para ilustrar el
resultado del ajuste de la caída de la corriente a una
exponencial simple (trazos superpuestos). Solución de
la pipeta: K/Ca-10-8. Solución de perfusión: A y B, ONa/Cd/TEA, C, O-Na/Cd.
49
Figura 11.
Inactivación en estado estable (I/Imáx, triángulos
negros) y constantes de tiempo (TAU) del desarrollo
(círculos negros) y de la desaparición (círculos
blancos) de la inactivación y del decaimiento (cuadros
negros) de la IA . Los datos se obtuvieron con los
protocolos mostrados en la figura 10. Las barras
representan el error estándar de la media obtenida de
tres neuronas. La línea continua que pasa a través de
los triángulos negros resulta del ajuste de los datos
experimentales a la ecuación 8 (véase en el texto). La
línea a través de los datos correspondientes a TAU se
ajustó a ojo.
CAPITULO 2
50
RELACIÓN DEL PATRÓN DE DESCARGA DE NEURONAS
DEL OX CON LAS CORRIENTES DE POTASIO.
DIFERENTES PATRONES DE DESCARGA ESPONTÁNEA
Se registró el potencial de membrana en los somas neuronales del
OX utilizando las técnicas de microeléctrodos intracelulares y de
registro
en
célula
completa
(whole-cell
clamp)
en
la
configuración de fijación de corriente. La figura 12 muestra los
registros
de
potencial
de
membrana
obtenidos
en
6
células
diferentes. Los registros de la figura 12A fueron obtenidos con
microelectrodos
en
tres
células
que
presentaban
actividad
espontánea: regular (trazo superior), irregular (trazo medio) y
en ráfagas (trazo inferior). La figura 12B muestra registros de
potencial de membrana obtenidos con la técnica de fijación de
corriente
en
célula
completa
en
tres
neuronas
que
presentan
actividad espontánea: regular (trazo superior), irregular (trazo
medio) y en ráfagas (trazo inferior).
51
Figura 12.
Registros del potencial de membrana obtenidos con
microeléctrodos (A) y con la técnica de "whole-cell
clamp" en la configuración de fijación de corriente
(B), en los somas de 6 neuronas con actividad
espontánea. Solución de perfusión: Normal. Solución de
las pipetas (B): K/Ca-10-8.
52
CARACTERÍSTICAS DE LAS CORRIENTES DE POTASIO Y SU
RELACIÓN CON EL PATRÓN DE DESCARGA.
A fin de estudiar la relación entre las corrientes de potasio y
las descargas espontáneas de potenciales de acción, se registró
el potencial de membrana en neuronas completas (no axotomizadas)
en
la
configuración
de
fijación
de
corriente,
cuando
la
preparación se prefundía con solución normal (tabla 3). De esta
manera
se
identificó
posteriormente
se
el
cambió
patrón
a
la
de
descarga
configuración
(figura
de
12B)
fijación
y
de
voltaje y, en solución O-Na/Cd (tabla 3), se registraron las
corrientes salientes manteniendo a la neurona a un potencial de
membrana de -50 mV (figura 13A). A continuación se prefundió la
preparación
con
registraron
las
la
solución
corrientes
O-Na/Cd/TEA
salientes
en
(tabla
3)
respuesta
a
y
se
pulsos
despolarizantes a partir de un potencial de mantenimiento de -100
mV (figura 13).
La curva de la inactivación de la IA en estado estable fue
obtenida en respuesta a pulsos despolarizantes de igual magnitud
aplicados
cada
mantenimiento,
3s
como
a
partir
se
muestra
de
en
diferentes
potenciales
de
la
10A,
la
figura
cuando
preparación era prefundida con la solución O-Na/Cd/TEA (tabla 3).
Se consideraron, con base a la actividad espontánea, dos
grupos neuronales: I) células que descargaban en ráfaga y II)
células que no descargaban en ráfaga.
53
Figura 13
Registros de corrientes salientes, en una neurona no
axotomizada en respuesta a pulsos despolarizantes.
Solución de perfusión: O-Na/Cd (A) y O-Na/Cd/TEA (B).
Solución de la pipeta: K/Ca-l0-8.
54
Relación del patrón de descarga con la IK
Para la I K, se midieron el umbral de activación y la conductancia
a
O
mV,
en
diferencias
16
neuronas
no
significativas,
axotomizadas.
en
dichos
No
se
parámetros,
encontraron
entre
las
neuronas del grupo I (n=6) y del grupo II (n=10). Para comparar
las medias se utilizó la prueba "t" de Student.
La
tabla
4
resume
los
valores
de
los
parámetros
de
activación del rectificador tardío encontrado en esos dos grupos
neuronales.
TABLA 4
PARÁMETROS DE LA ACTIVACIÓN DE LA I K
----------------------------------------------------------------GRUPO I (n=6)
GRUPO II (n=10)
MEDIA ± D.S.
MEDIA ± D.S.
----------------------------------------------------------------UMBRAL DE
ACTIVACIÓN
-45.0 ± 0.5
-44.5 ± 1.6
0.75<p<0.80 (*)
(mV)
----------------------------------------------------------------gK (nS)
26.5 ± 9.1
25.6 ± 17.7
0.80<p<0.90 (*)
a O mV
----------------------------------------------------------------(*) Probabilidades de la distribución "t" de Student.
55
Relación del patrón de descarga con la IA
Para
estudiar
la
dependencia
de
voltaje
de
la
corriente
transitoria, en relación con el patrón de descarga, se midieron:
el umbral de activación, la conductancia a O mV, el punto medio
de
la
inactivación en estado estable
(Vh) y la constante de
tiempo del decaimiento de la IA a O mV (TAUdec ). Para medir TAUdec
se ajustó sólo la primera fase de la caída de la corriente a una
exponencial simple, porque, los registros se hicieron en neuronas
no axotomizadas y aparecía un componente de corriente tardío (al
final del pulso) debido probablemente a la falta de control de
voltaje en regiones alejadas del soma neuronal (véase la figura
13B).
Utilizando
diferencias
la
prueba
"t"
significativas,
de
en
Student,
ninguno
no
de
se
encontraron
los
parámetros
mencionados, entre las neuronas del grupo I (n=6) y del grupo II
(n=10).
La
tabla
5
resume
los
valores
de
los
parámetros
activación y de inactivación encontrados en estos dos grupos.
de
56
TABLA 5
PARÁMETROS DE ACTIVACIÓN E INACTIVACIÓN DE LA I A
----------------------------------------------------------------GRUPO I (n=6)
GRUPO II (n=10)
MEDIA ± D.S.
MEDIA ± D.S.
----------------------------------------------------------------UMBRAL DE
ACTIVACIÓN
-61.7 ± 0.8
-59.1 ± 7.5
0.75<p<0.80 (*)
(mV)
----------------------------------------------------------------gA (nS)
89.7 ± 35.9
71.2 ± 26.1
0.80<p<0.90 (*)
a O mV
----------------------------------------------------------------Vh (mV)
-71.6 ± 10.3
-73.5 ± 9.0
0.60<p<0.70 (*)
----------------------------------------------------------------TAUdec (ms)
53.7 ± 34.7
38.2 ± 11.3
0.80<p<0.90 (*)
a O mV
----------------------------------------------------------------(*) Probabilidades de la distribución "t" de Student.
CAPITULO 3
57
DEPENDENCIA DE LAS CORRIENTES DE POTASIO CON EL
CALCIO INTRACELULAR.
Los resultados mostrados hasta el momento sugieren que en las
neuronas del OX, las cinéticas de las corrientes de potasio IK e
IA en condiciones de bajo calcio intracelular no difieren entre
las células que descargan ráfagas de potenciales de acción y las
que
no
lo
hacen.
Sin
embargo
en
otras
preparaciones
se
ha
encontrado que la concentración intracelular de calcio aumenta
después
de
cada
potencial
de
acción
durante
una
ráfaga,
produciendo la inactivación de las corrientes de potasio del
rectificador tardío y del rectificador anómalo. Por esta razón se
estudiaron
los
efectos
del
aumento
en
la
concentración
intracelular de calcio sobre las cinéticas de las corrientes de
potasio
en
dializaron
neuronas
con
concentración
axotomizadas.
una
solución
10-6
de
mol/l
Para
que
(tabla
ello
contenía
2)
y
se
las
células
calcio
a
se
una
registraron
las
corrientes de potasio como se describió anteriormente.
EFECTOS DEL CALCIO INTRACELULAR SOBRE EL RECTIFICADOR TARDÍO.
Durante
los
pulsos
de
prueba,
la
corriente
del
rectificador
tardío se activaba más rápidamente que en condiciones de bajo
calcio,
alcanzaba
un
máximo
y
luego
decaía
lentamente
hasta
alcanzar la mitad de su amplitud en aproximadamente 0.55 s, a 16
mV. La figura 14A muestra registros de corrientes salientes, a
tres
potenciales
de
membrana
58
diferentes,
en
una
neurona
en
condiciones
de
alto
calcio
intracelular (10 -6 mol/l) y en otra célula a una concentración
intracelular
de
calcio
menor
(1O-8
mol/l).
Los
trazos
fueron
escalados y superpuestos para su comparación. En este caso, no
fue posible ajustar los registros de corrientes al modelo de
Hodgkin y Huxley. Por lo tanto, la gK obtenida en condiciones de
alto calcio intracelular, se calculó a partir de los valores
obtenidos de la medición de la corriente al pico utilizando la
ecuación (2), en 4 neuronas a diferentes potenciales de membrana.
Los valores promedio de gK (n=4) se ajustaron con la ecuación de
Boltzmann (ecuación 3). Las relaciones gK-Em, obtenidas en bajo y
en alto calcio intracelular, se ilustran en la figura 15.
59
Figura 14.
Registros de corriente saliente, IK (A) e IA (B)
obtenidos de dos neuronas con diferente concentración
intracelular de calcio, 10 -8 mol/l y 10-6 mol/l (trazos
señaladas con un punto), a los potenciales de membrana
indicados. Los registros de corriente se escalaron a su
valor máximo y se sobrepusieron para su comparación.
Solución de perfusión: O-Na/Cd.
60
Figura 15.
Relaciones gK-Em obtenidas en bajo (círculos blancos) y
alto (círculos negros) calcio intracelular. Las barras
representan la desviación estándar de la media obtenida
de 4 neuronas diferentes en cada caso. Las curvas
(línea punteada, bajo calcio; línea continua, alto
calcio) son los resultados de los ajustes de los datos
experimentales a la ecuación 3 (véase en el texto).
Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y
K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: ONa/Cd.
61
En la tabla 6 se resumen los valores de los parámetros de
activación de la IK obtenidos a partir de los ajustes con la
ecuación
de
Boltzmann,
en
condiciones
de
bajo
y
intracelular.
TABLA 6: EFECTOS DEL CALCIO SOBRE LA ACTIVACIÓN DE I K
----------------------------------------------------BAJO Ca
ALTO Ca
----------------------------------------------------GK (mS/µF)
VO (mV)
z (*)
0.357
-6.9
2.62
0.327
-10.2
2.55
----------------------------------------------------(*) z=k *RT/F.
alto
calcio
62
EFECTOS DEL CALCIO INTRACELULAR SOBRE EL COMPONENTE
TRANSITORIO DE LA CORRIENTE DE POTASIO.
Cuando se aumentó la concentración de calcio intracelular (10-6
mol/l) aumento el valor al pico de la IA , que se alcanzaba en un
tiempo menor. No se encontraron cambios significativos en la
constante
de
tiempo
rápidamente
que
potenciales
de
registros
en
de
activación
condiciones
membrana
superpuestos
de
condiciones
de
alto
y
potenciales
de
membrana
(ϒ m)
de
bajo
la
IA
bajo
calcio
La
figura
estudiados.
la
y
corriente-A
calcio
diferentes.
de
dos
a
decaía
más
todos
los
14B
neuronas
intracelular,
Los
muestra
registros
a
en
tres
fueron
escalados a su valor máximo, para comparar el curso temporal de
la activación y de la inactivación.
Efectuando el mismo análisis que se utilizó para bajo calcio
intracelular, se obtuvo la relación gA -Em para la media de los
valores obtenidos de 4 neuronas en condiciones de alto calcio
intracelular.
Del
ajuste
con
la
obtuvieron los siguientes valores:
ecuación
de
Boltzmann
se
GA=1.567 mS/µF , VO=3.9 mV y
K*=0.0673 (z=1.70). En la figura 16 se muestran las relaciones gAEm en bajo y en alto calcio intracelular, así como las curvas
obtenidas con la ecuación de Boltzmann.
63
Figura 16.
Relaciones gA -Em obtenidas en bajo (círculos blancos) y
alto (círculos negros) calcio intracelular. Las barras
representan la desviación estándar de la media obtenida
de 4 neuronas diferentes en cada caso. Las curvas
(línea punteada, bajo calcio; línea continua, alto
calcio) son los resultados de los ajustes de la
ecuación 3 a los datos experimentales (véase en el
texto). Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos
blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de
perfusión: O-Na/Cd.
64
Para
el
estudio
de
los
procesos
de
inactivación
se
utilizaron protocolos similares a los que se muestran en las
figuras l0A y 10C. La curva de inactivaciún en estado estable con
una concentración de alto calcio interno fue menos "inclinada" y
se desplazó hacia potenciales más positivos con respecto a bajo
calcio. Los valores de los parámetros de inactivación en estado
estable
k*=0.0899
en
condiciones
mV-1
de
(z=2.27).
alto
La
calcio
figura
17
fueron:
muestra
Vh=-75.O
las
mV
curvas
y
de
inactivación en estado estable obtenidas en bajo y en alto calcio
intracelular.
La constante de tiempo de la inactivación (ϒ h) de la I A en
alto calcio fue menor que la obtenida en bajo calcio para todos
los
potenciales
membrana
entre
de
-32
membrana
y
22
mV,
estudiados.
la
ϒh
fue
Para
53
potenciales
±
8%
menor
de
en
condiciones de alto calcio en relación al valor obtenido en bajo
calcio. En la figura 18 se muestran las relaciones entre ϒ h y el
potencial de membrana obtenidas en dos células representativas en
condiciones de bajo y alto calcio intracelular.
65
Figura 17.
Inactivación en estado estable de la IA en bajo
(círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio
intracelular. Las barras representan la desviación
estándar de la media obtenida de 3 neuronas diferentes.
Las
curvas
(línea
punteada,
bajo
calcio;
línea
continua, alto calcio) son los resultados de los
ajustes de la ecuación 8 a los datos experimentales
(véase en el texto). Solución de las pipetas: K/Ca-10-8
(círculos blancos) y K/Ca-10-6 (círculos negros).
Solución de perfusión: O-Na/Cd/TEA.
66
Figura 18.
Constantes de tiempo de inactivación (TAU dec) de la IA
en dos neuronas diferentes en condiciones de bajo
(círculos blancos) y alto (círculos negros) calcio
intracelular, a diferentes potenciales de membrana. Las
líneas punteada y continua fueron ajustadas a ojo.
Solución de las pipetas: K/Ca-10-8 (círculos blancos) y
K/Ca-10-6 (círculos negros). Solución de perfusión: ONa/Cd.
67
En la tabla 7 se resumen los valores de los parámetros de
activación y de inactivación de la IA , en bajo y alto calcio
intracelular, los cuales fueron obtenidos a partir de la ecuación
de Boltzmann.
TABLA 7:
EFECTOS DEL CALCIO SOBRE LA IA
----------------------------------------------------------------ACTIVACIÓN
BAJO Ca
ALTO Ca
INACTIVACIÓN
BAJO Ca
ALTO Ca
----------------------------------------------------------------GA (mS/µF)
VO,Vh (mV)
z (*)
0.924
-7.0
1.74
1.567
-----
3.9
-85.3
-75.0
3.87
2.27
1.70
-----
----------------------------------------------------------------(*) z=k *RT/F.
DISCUSIÓN
68
Separación de dos componentes de la corriente de potasio.
En el presente estudio se muestra que en las neuronas del OX de
acocil, pueden ser separados dos corrientes de potasio, IK e IA,
con base en su dependencia del tiempo y del voltaje, en forma
similar a lo descrito en otras preparaciones: Anisodoris (Connor
y Stevens, 1971b), Helix pomatia (Neher, 1971) y neuronas del
ganglio cervical superior de la rata (Belluzzi y cols., 1985a y
b).
Los
resultados
mostrados
en
este
trabajo
confirman
las
propiedades del rectificador tardío y de la corriente transitoria
de potasio reportadas previamente (Onetti, 1989, Dnetti y cols.,
1990). El componente rápido y transitorio (IA) de la corriente
saliente es semejante al descrito en varias especies de moluscos
(Hagiwara y cols., 1961; Stevens, 1969; Connor y Stevens, 1971b;
Gola y Romey, 1971; Neher, 1971) y de vertebrados (Belluzzi y
cols.,
1985a).
El
componente
lento
(IK)
es
semejante
al
rectificador tardío descrito por otros autores (Hodgkin y Huxley,
1952; Connor y Stevens, 1971a; Thompson, 1977; Belluzzi y cols.,
1985b).
Es importante señalar que los pulsos condicionantes (a -100
mV) aplicados para reactivar parte de los canales de la IA no
modificaron la amplitud ni el curso temporal del rectificador
tardío, lo que permitió obtener la IA pura restando los trazos de
la corriente obtenidos a un potencial de mantenimiento de -50 mV
de
los
correspondientes
obtenidos
a
-100
mV.
Otra
manera
de
obtener la IA sería agregando TEA (20 mM) al baño, para bloquear
69
el rectificador tardío, con el inconveniente de que el bloqueo no
es total y depende del potencial de membrana (Onetti, 1989).
Cinética de las corrientes de potasio
En este trabajo se muestra que, en las neuronas del OX, la
conductancia de los canales del rectificador tardío puede ser
descrita por la ecuación de Hodgkin y Huxley (1952): g K = GKn4. La
conductancia en estado estable (como una función del potencial de
membrana) puede ser descrita por una distribución de Boltzmann
para una partícula única con una valencia efectiva de 2.62. La gK
alcanza un valor máximo de 0.357 mS/µF a un potencial de membrana
cercano a 40 mV. La constante de tiempo de la activación de la IK
es dependiente de voltaje; los valores encontrados fueron de 17.5
a 0.9 ms para potenciales de membrana entre -20 y 22 mV. Estos
datos son similares a los reportados en neuronas simpáticas de la
rata (Galvan y Sedlmeir, 1994; Belluzzi y cols., 1985b), de la
rana toro (Adams y cols., 1982) y en las neuronas piramidales del
hipocampo (Segal y Barker, 1984). El rectificador tardío del OX
no se inactiva apreciablemente durante un pulso de 160 ms. Sin
embargo,
otros
corriente
del
autores
han
rectificador
reportado
tardío
un
decaimiento
durante
de
la
despolarizaciones
prolongadas (Heyer y Lux, 1976; Thompson, 1977; Aldrich y cols,
1978; Adams y cols. 1982).
Los resultados presentados en este trabajo muestran que, en
neuronas
del
OX,
la
gA
puede
ser
descrita
como
un
70
producto de los parámetros de activación e inactivación, por la
ecuación: gA =GAm4h. Ambos procesos son dependientes del tiempo y
del voltaje. Tanto la activación como la inactivación en estado
estable
de
la
gA
pueden
ser
descritas
por
distribuciones
de
Boltzmann para partículas únicas con valencias de 1.74 y 3.87,
respectivamente.
La
gA
alcanza
un
máximo
de
0.924
mS/µF
a
potenciales de membrana más positivos que 50 mV. La IA presenta
una fase de subida sigmoidal y un decaimiento exponencial. La
constante de tiempo de activación de la IA es dependiente del
voltaje,
los
valores
obtenidos
fueron
de
3.5
a
1.5
ms
para
potenciales entre -32 y 22 mV. En diversas preparaciones se han
reportado valores que varían entre 2 y 20 ms (Rudy, 1988). En
somas neuronales de Anisodoris, Connor (1980) reportó un valor de
la constante de tiempo de activación de 3 ms para todos los
potenciales de membrana. En los axones de crustáceos, los valores
varían entre 3.4 y 1.6 ms para potenciales entre
(Connor,
1980).
En
neuronas
del
OX,
el
punto
-80 y 20 mV
medio
de
la
inactivación en estado estable se encuentra a potenciales de
membrana
alrededor
de
-85
mV.
En
otras
preparaciones
se
ha
calculado el punto medio de la inactivación en estado estable de
la IA ; así, en neuronas del ganglio simpático de rata se reportó
un valor de -78 mV (Belluzzi y cols. 19B5a), -65 mV en el Helix
pomatia (Neher, 1971) -75 mV en Anisodoris (Connor y Stevens,
1971c) y -65 mV en Tritonia (Getting, 1983). Las constantes de
tiempo de la inactivación de la IA en las neuronas del OX, variaron
71
entre 125.5 y 9.3 ms para potenciales de membrana entre -32 y 22
mV. Para potenciales de membrana entre -60 y -40 mV, los valores
de
la
fueron
constante
de
869
de
a
tiempo
162
del
ms,
desarrollo
y
para
la
de
la
inactivación
desaparición
de
la
inactivación, entre -120 y -70 mV, fueron de 62.3 a 347 ms. Estos
valores
de
las
constantes
de
tiempo
del
desarrollo
y
la
desaparición de la inactivación son semejantes a los obtenidos
por Neher (1971) en neuronas de Helix pomatia.
Características de las corrientes de potasio y su relación con el
patrón de descarga.
Los diferentes patrones de actividad eléctrica en las neuronas
del OX de acocil reportados en este trabajo, son similares a los
reportados previamente por Onetti (1989).
El umbral de activación y la conductancia en estado estable
(a O mV) del rectificador tardío de las células del grupo I (que
descargan en ráfagas) es prácticamente el mismo que para las
células del grupo II (que no descargan ráfagas). El umbral de
activación, la conductancia en estado estable a O mV, el punto
medio de la inactivación en estado estable y la constante de
tiempo
del
decaimiento
de
la
IA
no
fueron
significativamente
diferentes entre las neuronas de los grupos I y II.
Aunque
las
mediciones
realizadas
para
comparar
las
diferencias entre las neuronas de ambos grupos se efectuaron en
células
que
no
fueron
axotomizadas,
lo
que
dificulta
la
72
medición
de
dichos
parámetros,
los
resultados
presentados
permiten sugerir hasta este momento que la cinética de activación
de la IK e IA y la cinética de inactivación de la IA, en bajo
calcio intracelular, no difieren entre las neuronas del OX con
diferentes patrones de actividad.
Efectos del aumento del calcio intracelular sobre las corrientes
de potasio.
Para
estudiar
los
efectos
del
aumento
de
la
concentración
intracelular de calcio sobre la cinéticas de las corrientes de
potasio IK e IA se utilizó una solución interna que contenía
calcio
a
una
encuentra
concentración
dentro
de
los
de
10-6 M.
valores
Dicha
concentración
fisiológicos.
Hofmeir
y
se
Lux
(1981) encontraron que l a concentración de Ca 2+ intracelular
medida
con
microelctrodos
a
cierta
distancia
de
la
membrana
aumentaba de un valor menor que 3x10 -7 M en reposo a 10-6 M al
aplicar
pulsos
proximidades
despolarizantes
de
la
cara
y
interna
de
estimaron
la
que
membrana
en
celular
las
la
concentración de Ca2+ podría elevarse hasta alcanzar un valor de
30x10-6 M después de un pulso de voltaje de 20 ms de duración.
En el presente estudio se muestra que el calcio intracelular
modula la cinética de las corrientes de potasio en las neuronas
del OX de acocil, acelerando los procesos de inactivación. En
condiciones
de
alto
calcio
intracelular
se
observa
una
considerable inactivación de la IK durante los pulsos de prueba
(50%
del
pico
de
corriente
en
550
ms
a
73
16
mV,
veáse
intracelular.
figura
La
14A)
que
inactivación
no
de
aparece
las
en
bajo
calcio
de
potasio
corrientes
dependientes de voltaje por el Ca 2+ intracelular y por otros
cationes
divalentes
ha
sido
descrita
en
diferentes
(Eckert y Lux, 1977; Matsuda y cols., 1987;
células
Kramer y Levitan,
198B). El estudio de la modulación del componente lento de la
corriente de potasio por el calcio intracelular en diferentes
preparaciones ha generado resultados opuestos; en axón gigante de
calamar los cambios en la concentración intracelular de calcio no
alteran la corriente del rectificador tardío (Begenisich y Lynch,
1974), mientras que en neuronas de Helix pomatia, la inyección de
calcio
intracelular
reduce
la
corriente
neta
de
salida
y
especialmente la del rectificador tardío (Heyer y Lux, 1976). Por
otro lado, se ha sugerido que el aumento en la concentración
intracelular de calcio que ocurre durante un tren de impulsos en
las neuronas de Helix aspersa, incrementa la conductancia para el
potasio (Meech y Standen, 1975) Sin embargo, el incremento del
calcio intracelular en neuronas del OX de acocil no afecta la
conductancia máxima ni la valencia efectiva de la compuerta de
activación
de
observaciones
concentración
la
corriente
sugieren
de
1
que
µM
no
del
el
es
rectificador
calcio
suficiente
tardío.
intracelular
para
activar
Estas
a
una
alguna
posible conductancia a potasio dependiente de calcio.
El
aumento
transitorio
(GA )
de
en
la
conductancia
presencia
de
máxima
alto
del
calcio
componente
intracelular
74
(de 0.9 a 1.5 mS/µF) sin cambio en la valencia de la compuerta de
activación, puede ser debido al desplazamiento positivo de la
curva de inactivación (10.3 mV); es decir que, en condiciones de
alto
calcio
se
encontraría
una
mayor
proporción
de
canales
disponibles para ser activados que los que se encuentran en bajo
calcio para los mismos potenciales de membrana. Otra posibilidad
es
que
el
aumento
del
calcio
intracelular
desenmascare
una
población de canales con cinética semejante a los canales "A".
Varios
autores
(véase,
han
Rudy,
reportado
1988),
en
diferentes
corrientes
tipos
dependientes
celulares
de
calcio
intracelular similares a la IA.
Por otro lado, la inactivación de los canales para la IA por
calcio
intracelular
estudiada
en
y
algunas
por
otros
segundos
preparaciones.
En
mensajeros
ha
fotorreceptores
sido
de
Hermissenda, la disminución en la amplitud y la aceleración de la
cinética
de
inactivación
de
la
IA
pueden
ser
causadas
por
despolarizaciones prolongadas y por el influjo de calcio (Alkon y
cols., 1982).
En
neuronas
"bag"
de
Aplysia
se
ha
reportado
que
la
forscolina, un activador de la ciclasa de adenilato, disminuye la
constante de tiempo de la inactivaciún de la IA, pero no afecta
el proceso de activación ni el de inactivaciún en estado estable
(Strong, 1984).
Los cambios en las corrientes de potasio, producidos por un
aumento en la concentración intracelular de calcio, reportados en
el
presente
trabajo
pueden
ser
debidos
a
75
modificaciones de la compuerta de inactivación más que a cambios
en los procesos de activación. Tales modificaciones pudieran ser
el resultado de la unión del calcio a un sitio específico de la
compuerta
de
la
inactivación
o
a
cambios
en
el
estado
de
fosforilación de los canales de potasio, mediados por cinasas o
fosfatasas dependientes de calcio.
Sin
embargo,
como
en
las
neuronas
de
moluscos
(Strong,
1984), la IA en el OX puede ser registrada durante mucho tiempo
dializando
el
interior
celular
sin
sufrir
una
disminución
importante en su amplitud, esto sugiere que el mantenimiento de
esta
corriente
no
requiere
de
la
activación
continua
de
una
cinasa.
Importancia fisiológica.
En
las
neuronas
de
moluscos,
los
potenciales
de
acción
repetitivos dan como resultado la inactivación del rectificador
tardío; asimismo, los pulsos de voltaje repetidos que inactivan a
la IK producen un aumento en la duración del potencial de acción
(Aldrich
y
cols.,
1979).
La
IA
parece
ser
la
corriente
predominante que determina la duración del intervalo entre los
potenciales
de
acción,
ya
que:
1)
se
encuentra
parcialmente
inactivada al potencial de reposo, 2) parte de esa inactivación
desaparece durante la hiperpolarización posterior al potencial de
acción y 3) el curso temporal de la despolarización lenta durante
el intervalo entre espigas está determinado por la amplitud y
76
la cinética de activación y de inactivación de la IA (Connor,
1978).
De los resultados presentados en este trabajo se sugiere que
los diferentes patrones de descarga de las neuronas del OX, no se
deben a diferencias en las cinéticas de los canales de potasio,
sino
que
el
calcio
libre
intracelular,
al
modificar
la
inactivación de las corrientes de potasio, regularía la duración
y la frecuencia de los potenciales de acción. En particular en
las células que descargan ráfagas, el calcio que entra durante
cada
potencial
rectificador
espiga,
2)
de
acción
tardío,
el
produciría:
aumentando
desplazamiento
la
de
1)
la
inactivación
duración
la
curva
de
de
la
del
siguiente
inactivación
en
estado estable de la IA a potenciales de membrana más positivos,
lo
que
quitaría
parte
de
la
inactivación
de
esa
corriente
"permitiendo" su participación en los potenciales de acción y 3)
la disminución de la constante de tiempo de inactivación de la
IA, acortando el retardo del siguiente potencial de acción. Este
proceso podría ser acumulativo hasta el final de la ráfaga.
En neuronas del OX, se ha observado un aumento progresivo en
la
duración
del
potencial
de
acción
y
un
incremento
en
la
frecuencia de descarga durante una ráfaga (datos no presentados).
Estas
observaciones
concuerdan
con
las
modificaciones
de
la
cinética de las corrientes de potasio observadas al aumentar el
calcio intracelular.
77
Si bien el calcio intracelular parecería modular la cinética
de las corrientes de potasio, se desconocen los mecanismos que
regulan su concentración.
Aunque
en
el
presente
trabajo
sólo
se
describen
dos
corrientes de potasio en relación al patrón de descarga, no puede
descartarse la participación de otras corrientes de potasio como
se ha descrito en diferentes preparaciones neuronales.
RESUMEN
Y
CONCLUSIONES
78
En las neuronas del OX de acocil, pueden separase dos corrientes
de potasio : corriente del rectificador tardío (IK) y corriente
transitoria (I A), con las siguientes características:
1) La IK se activa a potenciales más positivos que -40 mV y no se
inactiva apreciablemente para valores del potencial de membrana
entre -40 y 22 mV.
2) La conductancia de los canales del rectificador tardío puede
ser descrita por la ecuación: gK = Gkn4, donde "n" representa el
parámetro de activación.
3) El proceso de activación de la IK es dependiente de voltaje.
Las constantes de tiempo de activación fueron de 17.5 a 0.9 ms
para potenciales de membrana entre -20 y 22 mV.
4) La conductancia en estado estable de la IK puede ser descrita
por una distribución de Boltzmann:
gK = GK{1+exp[(V O-V)zF/RT]}-1, para una partícula única con una
valencia efectiva z
de 2.62, conductancia máxima GK de 0.357
mS/µF y V O de -6.9 mV.
5)
No
existen
diferencias
significativas
en
el
umbral
de
activación ni en la conductancia (a O mV) de la IK entre las
neuronas
que
descargan
en
ráfagas
y
las
que
no
lo
hacen.
79
6) Al aumentar la concentración intracelular de Ca2+ (de 10-8 a 10-6
M) no se modifican apreciablemente la GK (0.327 mS/µF) ni la
valencia (2.55); mientras que el punto medio de la activación en
estado estable se desplaza a potenciales más negativos (-10.2
mV).
7) La IA se activa a partir de potenciales más negativos que -50
mV y se inactiva totalmente a potenciales más positivos que -50
mV.
8) La gA puede ser descrita como el producto independiente de los
parámetros de activación y de inactivación, por la ecuación:
gA=GA m4h,
donde
"m"
representa
el
parámetro
de
tiempo
de
activación y "h" el de inactivación.
9) Los procesos de activación y de inactivación de la IA son
dependientes del tiempo y del voltaje. Las constantes de tiempo
de
la
activación
potenciales
entre
de
la
IA
varían
entre
3.5
y
1.5
ms
para
-32 y 22 mV. Las constantes de tiempo del
desarrollo de la inactivación varían entre 669 y 9.3 ms para
potenciales de membrana entre -60 y 22 mV; y para la desaparición
de la inactivación varían entre 62.3 y 869 ms, para potenciales
de membrana entre -120 y -60 mV.
10) La activación de la gA en estado estable, puede ser descrita
por
una
distribución
de
Boltzmann
para
una
80
partícula única con valencia de 1.74, GA de 0.924 mS/µF y VO de 7 mV.
11)
La
inactivación
de
la
gA
en
estado
estable,
puede
ser
descrita por una distribución de Boltzmann:
h∞ = (1+exp[(V-Vh)zF/RT]} -1, con z de 3.87 y V h de -85.3 mV.
12)
No
existen
diferencias
significativas
en
el
umbral
de
activación, en la conductancia (a O mV), en el punto medio de la
inactivación en estado estable ni en la constante de tiempo de la
inactivación de la IA entre las neuronas que descargan en ráfagas
y las que no lo hacen.
13) Al aumentar la concentración intracelular de Ca (de 10-8 a 10-6
M) no se modifica apreciablemente la valencia de la compuerta de
activación
de
la
IA
(1.70);
mientras
que
la
valencia
de
la
compuerta de la inactivación disminuye (2.27), la GA aumenta un
69%
(1.567
inactivación
mS/µF)
en
y
estado
los
puntos
estable
se
medios
de
desplazan
activación
a
valores
e
de
potencial más positivos (3.9 y -75 mV, respectivamente).
14) Al aumentar la concentración intracelular de Ca (de 10-8 a 10-6
M), las constantes de tiempo de la inactivación de la IA se
reducen en aproximadamente un 53% a potenciales de membrana entre
-32 y 22 mV.
81
De
los
resultados
presentados
en
este
estudio
se
puede
concluir lo siguiente:
1) Las propiedades cinéticas de las corrientes de potasio en las
neuronas del OX de acocil, son semejantes a las reportadas por
otros autores para la corriente del rectificador tardío y para la
corriente
transitoria
de
potasio
en
otras
preparaciones
neuronales.
2) La cinética de activación de la IK e IA y la cinética de la
inactivación
de
la
IA ,
en
bajo
calcio
intracelular,
no
son
determinantes para la generación de los diferentes patrones de
actividad de las neuronas del OX de acocil.
3)
El
calcio
intracelular
puede
modular
la
duración
y
la
frecuencia de los potenciales de acción en las neuronas del OX de
acocil, en particular en las neuronas que tienen la capacidad de
descargar
ráfagas
de
potenciales
de
acción,
acelerando
los
procesos de inactivaciún de las corrientes de potasio (IK e I A).
PERSPECTIVAS
82
El sistema neurosecretor OX-GS del acocil y en particular
las
neuronas
del
OX
constituyen
un
excelente
modelo
para
el
estudio de los fenómenos involucrados en la actividad marcapaso y
su correlación con la secreción de hormonas.
Con el fin de entender mejor la importancia fisiológica de
este acumulo de neuronas y de los diferentes patrones de descarga
que presentan, es conveniente profundizar en el estudio de los
factores
que
se
encuentran
relacionados
con
su
actividad
electrofisiológica.
Se sabe que existe una estrecha relación entre la cinética
de las corrientes de potasio y la morfología de los potenciales
de acción espontáneos, por lo que los cambios en la cinética de
estas
corrientes
dan
como
resultado
cambios
en
el
patrón
de
descarga.
En el OX del acocil sólo se han reportado dos componentes de
la corriente saliente, pero no se puede descartar la posibilidad
de que en estas células participen otras corrientes salientes en
la modulación de la actividad eléctrica.
Por otro lado es probable que las hormonas peptídicas que
libera el sistema OX-GS puedan modular las corrientes de potasio
de las propias neuronas del OX.
El estudio de la modulación de las corrientes por segundos
mensajeros puede realizarse manipulando los principales sistemas
de proteínas cinasas como son la proteína cinasa C, las cinasas
dependientes de nucleótidos cíclicos y/o las cinasas dependientes
de calcio/calmodulina.
83
El
estudio
de
la
cinética
de
estas
corrientes
y
de
su
modulación puede complementarse con el estudio de la cinética de
los canales unitarios que permitan establecer los mecanismos de
acción de los diferentes agentes moduladores.
A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo
y de los obtenidos por otros autores en diferentes preparaciones,
se sugieren al menos tres líneas de estudio:
1. Estudiar otras corrientes de potasio y su relación con el
patrón de descarga.
2. Estudiar la modulación de la cinética de las corrientes
de potasio por neurotransmisores, segundos mensajeros y hormonas.
3. Estudiar la cinética y modulación de canales unitarios de
potasio.
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