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Salud Pübl, Méx, Epoca V. Vol. !II, Núm. 6. Noviembre_Diciembre 1961. ESTADO ACTUAL DEL CULTIVO DEL VIRUS DEL SARAMPION Y DE LA PREPARACION DE SU VACUNA ENRIQUETA A pesar de los repetidos esfuerzos llevados a cabo por un gran número de investigadores, durante muchos años, no se había podido encontrar la forma de aislar y cultivar el virus del sarampión en el laboratorio. Fueron innu, merables los intentos que se hícieron para propagar este agente en animales, embriones de pollo y cultivos de tejidos, siempre con resuL tados dudosos o contradictorios. Desde 1759, Home! había sugerido la posibilidad de que el virus se encontrara en la sangre de los pacientes durante la fase aguda de la enfermedad. Plotz, en 19302 mencionó haber cultivado el virus en tejidos de embrión de pollo, y en 1939, Rake y Shaffer'' describieron la propagación del virus del sarampión, en serie, en embrión de pollo. En 1941, Shaffer notó que durante los pases en embrión la virulencia de este agente dismínuía para el hombre y trataron de determinar si este virus ate., nuado podía emplearse como vacuna. Ninguno de los resultados de estos investigadores fue concluyente. No se habían logrado progresos importan; tes en el estudio de la etiología del sarampión. tal vez debido a que no se con taba con un método de laboratorio conveniente para de, mostrar la presencia del virus, el que al desarrollarse no produce carnb'os en los embriones de pollo, hasta que se ha adaptado a estos úl., timos. Todas las tentativas que se habían he,. DEL Il\'STITU'l'O .-S. S. A. NACJONAT. DE VlROLoofA.-D.G.T.L. PIZARRO SUÁREZ y GAMBA" cho para identificarlo por alguna reacción se., rológica habían fallado también. Las únicas técnicas con que se con taba eran la inoculación en el mono y en el hombre; por otra parte, hay un número considerable de monos en cautive; rio que tienen anticuerpos hacia el sarampión, anticuerpos que generalmente no tienen los monos recién capturados, y que indudablemente influyeron en los fracasos ocurridos. CULTIVO DEL VIRUS DEL SARAMPION No fue sino hasta 1954 cuando Enders y Peebles'' cultivaron el virus en células humanas y de mono, empleando los procedimientos que habían aplicado para el cultivo del virus de la poliomielitis en tubo rotatorio. Los cultivos se hícieron con sangre y lavados de garganta de pacientes con sarampión, obtenidos durante las primeras veinticuatro horas de la aparición del exantema; en estos tejidos observaron cambios citopáticos en las células, que consistían en áreas circunscritas en las que podían observarse núcleos y protopla: ma, pero en las que no se veían los límites de las células. el protoplasma se iba vacuolizand-. más y más hasta dar una apariencia espumosa> y observaron tam , bién la inhibición de estos efectos cuando se añadía suero de convalescientes de sarampión. Enders y colaboradores+ lograron el aislamiento del virus haciendo lavados de garganta con lOa 15 mi. de leche estéril, descrema927 E:\"R[QUETA PIZARRO da y neutralizada. Las muestras también pueden tomarse con hisopos de algodón prevía, mente humedecidos en leche y depositados in , medíatamente en tubos con 2 ml, de leche. Se emplearon 100 u/rnl, de penicilina y 50 mícro.. gramos de estreptomicina por mI. de leche, se centrifugaron a 5,450 rpm. durante una hora; el líquido sobrenadante y el sedimento, resus , pendido en un volumen pequeño de leche, se emplearon como inóculos separados para diferentes experimentos, en cantidades que oscilaron entre 0.5 y 3 ml. Para el aislamiento, a partir de sangre, se utilizaron 10 mI. de ésta en 2 ml, de una solución de heparina al 0.05%. Para inocular se emplearon de 0.5 a 2 ml. de sangre ,total. También se hicieron inoculaciones con materias fecales; no se aisló el virus de éstas. Todas las muestras se conservaron en hielo desde el momento de obtenerlas hasta que se inocularon. El tiempo máximo entre la recolección y la inoculación fue de tres horas y media. Las muestras se inocularon en gran di., versidad de tejidos. Enders ha estudiado una cepa, cuyas ca., racterísticas ha determinado perfectamente, la cepa Edmonston; con ella ha llevado a cabo numerosas investigaciones y es la empleada en la preparación de la vacuna. Varios investigadores han repetido las experiencias de Enders y han estudiado también diversos tejidos en los cuales puede ya culti., varse el virus y hacerse el diagnóstico del pa. decimiento. Mílovanovbíó, Enders y Mitus'' cultivaron el virus en células de embrión humano, lograron el cultivo en embrión de pollo y también lo adaptaron a células amnióticas, cultivo este último que presentó muchas difí., cultades. Durante los primeros pases, los cam., bíos citopatoqénicos se extendían lentamente por toda la capa y aparecían tres o cuatro días después que en las células renales. Enders, en 19577, describió los cambios ci; topatoqénicos que san muy característicos para el virus del sarampión. Comparó con mate., rial aislado de otros casos de sarampión que cultivo en células de riñon humano y de mono; en todos los casos encontró agentes con las mismas propiedades citopáticas. Desde el mo., 928 menta del aislamiento, y durante los pases en serie, las nueve cepas dieron lugar a la apa , rición de sincícios o células mu1tinuc1eadas dentro de la capa de células epitelioides normales. Gradualmente" todas o casi todas las células sufren estos cambios y terminan por destruirse. Varios días después de que aparecen los sincicios se ven cuerpos de inclusión eosinófilos en la mayor parte de los núcleos y se acumulan masas de una sustancia" también eosí, nófila, en el protoplasma. Cuando se íntroduce virus que ha sido cultivado en células renales, en cultivos de otros tipos de células, se observan los mismos efectos dtopatogénicos. Después del cultivo prolongado in oitro, las propiedades citopátícas del virus se alteran. Durante el décimo cuarto pase por células amnióticas, se observaron además de las cé., lulas descritas, otras refráctíles, Iusiformes o estrelladas, parecidas a los fíbroblastos. En pases posteriores, estas células tienden a predo., minar y en ciertos cultivos representan la úní, ca manifestación de la multiplicación viral. El que la cepa Edmonston hubiera dado lugar a células fusiformes,. después de varios pases, suqírió la posibilidad de que este efecto pudíera ser el resultado de una mutación que fuera acompañada de un cambio en su capa, cídad para multiplicarse en el embrión de pollo. Se introdujo el virus en la cavidad amniótica y se cosechó el material nueve días después. Este paso era importante por las innumerables .ventajas que ofrece el embrión de pollo vivo o células obtenidas a partir de él. en comparación con otros medios que sírven como fuente de ví., rus para la preparación de las vacunas. No se obtuvo ninguna indicación de actividad viral en el embrión. Posteriormente se seleccionó la cepa Edmonston para someterla a un estudio muy intenso, se pasó veinticuatro veces por cultivos primarios de células renales y veintiocho veces por células amnióticas. Para entonces fue ya posible la adaptación al embrión de pollo, sin dificultad. Después de esta adaptación, Katz y colaboradores'' pudíeron propagar el virus en cé., lulas tripsínizadas de embrión de pollo. Durante los cuatro primeros pases no se observa , VACUNA CONTRA EL ron propiedades citopatogénicas. La presencia del virus se demostraba únicamente por inoculación en células amnióticas. Al octavo día del quinto pase, se observó un aumento en la refractilidad de las células; muchas de las afee, radas mosteaban una configuración Iusíforme, debida a la formación de procesos citoplásmicos filamentosos que variaban en longitud y a menudo se veían formados como por cuen.. tas muy finas. En las preparaciones teñidas se observaban cuerpos de inclusión intranucleares, eosínófilos muy parecidos a los que se observan -en las células infectadas de los primates. Más tar.. de estas células se redondeaban, se hadan píc, nóticas y por últímo se desintegraban. En pa., ses posteriores estos cambios aparecíeron más pronto y se llevaron a cabo más rápidamente, Ruckef estudió diferentes tejidos y medios de cultivo para la propagación del virus. Empleó comparativamente membranas amnióticas, tejidos de riñón humano, de mono y de conejo, utilizando siempre los tejidos lo más pronta posible después del desarrollo completo de la capa de células. Se observaron lesiones en to., dos los tejidos, a excepción del riñón de conejo. La exploración de diferentes fuentes de tejido [e hízo, en parte, por la dificultad que presenta la frecuente presencia de virus en los tejidos de mono aparentemente normales y por ~ que el riñón humano no se consigue con suficiente frecuencia. Underwood en 19591 determinó las cur., vas de crecimiento en tres tejidos; encontró que el inóculo inicial del virus puede ser muy bajo, sin que se modifique el título final del ví., rus siempre y cuando la cosecha del material coincida con la máxima citopatogenicidad en 103 tejidos. La temperatura de incubación si parece tener algún efecto; logró obtener titu , los más altos cuando incubó a 32 o 33QC en lugar de hacerlo a 37QC. Berg y Rosenthal!! han cultivado el virus del sarampión en leucocitos humanos y de mo., no y han presentado evidencias de que el vi , rus se multiplica en las células mononuclea , res. Casi todos los cultivos se han hecho con medios enriquecidos, en los cuales se emplean °, SAR_UU'WN sueros de animales y extractos de tejidos y lí; quido amniótico de bovino, Sin embargo, también puede lograrse un buen cultivo con el me., dio 199 que es indudablemente superior en la preparación de vacunas, ya que no tiene proteínas extrañas. El virus probablemente se desarrolla tanto en el protoplasma como en el núcleo de la cé., lulas.? ya que cuando se emplean técnicas con substancias fluorescentes puede observare e una cantidad considerable de este material en am., bos, siete días después de la infección del tejido con el virus del sarampión. Los estudios de ultra filtración indican que la partícula del virus del sarampión tiene un tamaño de 140 milimícrones: en cambio, por irradiación electrónica se encontró un diámc., tro de 60 milimicrones; probablemente tiene forma esférica. La infectividad puede destruirse en media hora a 65?C. El virus sobrevive en la sangr.: y en la leche, por lo menos tres y media horaen refrigerador en los líquidos de cultivos de tejidos; permanece activo después de 38 días a _15QC y por lo menos 35 días a _50 y _60?C. El virus del sarampión concentrado por centrifugación puede emplearse para efectuar reacciones de hemaglutinación y de fijación de complemento, pero únicamente cuando se em , plean células de primates para su cultivo.P Cuando el virus está en presencia de suero se aumenta la estabilidad a diferentes tem , peraturas. Es interesante notar que el suero lo conserva casi en .las mismas condiciones a _300 que a +6?C,13 y también lo es, el ·hecho ele que el virus cultivado en medios sin suero tienen un título inicial relativamente alto mo., mentes después de la cosecha, pero después de algunas semanas, no importando la temperatu., ra a la cual se mantenga. el 90% de la infec, tividad se píerde. En cambio, si el medio COI1tiene suero puede conservarse a _72QC. por lo menos durante tres años. El virus se debe con, servar a dicha temperatura cuando va a guar_ darse por períodos largos, pero cuando se va a utilizar poco tiempo después debe preferirse la temperatura de 6?C; es muy inestable a 25 y a 37QC; su inactivación es muy rápida a estas temperaturas, pero después se mantiene en un 929 E~HIQUETA PIZAIUW título bajo durante un tiempo largo; pierde su trataron de adaptar el virus del sarampion al actividad muy fácilmente por medio de las ra.. ratón; aún después de varios pases" en ratones diaciones beta o gamma. El pH de máxima es- recién nacidos, no se aumentó la virulencia. A tabilidad es de 7 a 8. diferencia de lo que sucede con muchos otros El virus del sarampión produce anticuervirus, no se alteró el título para el cerebro de pos en los monos. Cuando se inocula en ellos ratón, ni tampoco el coeficiente de mortalidad. el virus adaptado a embrión de pollo o a culTal vez se necesiten muchos más pases antes tivo de tejidos también da lugar a la aparición de que se presente una infección letal de manede anticuerpos. En los monos inoculados con ra uniforme en todos los ratones. el virus modificado, no se presenta viremía, ni ningún otro signo de infección; en los estu., PREPARACION DE VACUNA CONdios histológicos de los animales sacrificados TRA EL SARAMPION que se han inoculado por vía íntracerebral, no se demuestra ninguna lesión en cerebro ni en Desde 1948 Arakawa (citado por Enders) 19 médula espinal. Los anticuerpos fijadores de intentó la producción de una vacuna; describe complemento aparecen entre el décimo quinto y la adaptación del virus del sarampión a rato; el vigésimo tercer días y los neutralízantes panes muy pequeños; después de varios pases ín., ra el trigésimo quinto. En cambio, cuando se tracerebrales, en serie, por ratón, encontró que inoculan monos con virus recientemente aís., el agente casi no producía síntomas en los ní., lado, por las vías intracerebral o intravenosa. ños y propuso que se utilizara, como vacuna. se presenta una infección que semeja saram., En 1959 Taniguchi aisló agentes íntimamente pión ligero,14 con los síntomas característicos: relacionados con la cepa de Arakawa y encon, viremía, leucopenia moderada, exantema y tró que estaban relacionados ínmunolóqicamen., aparición de anticuerpos fijadores de complete con la cepa Edmonston. mento y neutralizantes; el virus adaptado a Los investigadores rusos han tenido gran pollo se puede distinguir de su progenitor, por interés en la preparación de una vacuna. En su capacidad reducida para proliferar en el 1956, emplearon como vacuna el virus cultivado sistema nervioso central de los simios. en pulmón de embrión humano y en embrión Ninguno de los monos inoculados por vía de pollo, pero cuando los niños inoculados fueintranasal respondió formando anticuerpos. Es., expuestos a la enfermedad, casi no se en con, te resultado llamó la atención puesto que el vi., tró ninguna protección. Entre muchas otras va, rus pudo aislarse de la garganta de los aní, cunas ensayadas, encontraron que podía pro., ducirse ír.munídad absoluta al sarampión por males hasta cinco días después de la inocula , ción. Puede concluirse, en vista de la ausencia inyección subcutánea con el virus atenuado por cultivo en células amnióticas humanas. de respuesta antigénica, que el virus no logró Smorodíntsev, del Laboratorio de Virología penetrar la barrera presentada por las mem , de Stalingrado, consiguió la atenuación del vi, branas mucosas. rus por un procedimiento semejante al utilíza., Adaras e Imaqawa's encontraron semejando por Enders, con la cepa Edmonston; pero. zas inmunológicas entre los virus del saram., pión y del moquillo; sin embargo Cabasso y a diferencia de los resultados de Enders, encuentra virus en la sangre y en las secreciones colaboradores.lf realizando pruebas de inmu; de la garganta de los individuos vacunados. nidad cruzada en cultivos de tejidos de diverEnders'" preparó y estudio dos tipos de va., sas especies animales, no lograron confirma: cunas que ha designado A y B; difieren entre esta relación, ni tampoco obtuvíeron anticuer., sí esencialmente en el número de pases en em, pos hacia el sarampión en los individuos va., brión de pollo, a los cuales se sometieron. cunados con virus del moquillo o viceversa. La vacuna B fue producida con virus que Los resultados de Schwarz y colaboradores'? había sido pasado algunas veces más en síste, tampoco indicaron ninguna relación inmunoló., gica entre ambos virus. Imagawa y Adams" mas de embrión de pollo, con la esperanza de 930 VACUNA CONTRA. EL SAHA~IPIO" que prcdujera reacciones que se habían observado más ligeras que las con la vacuna A. El virus. modificado en cultivos de tejidos. se caracteriza por una atenuación marcada de su virulencia para el mono. en el que no cau., sa enfermedad clínica, no se produce viremia, ni se encuentran lesiones ni cambios en el sís., tema nervioso central. Para la preparación de la vacuna se ha empleado el material cosechado del décimo segundo pase del virus por células de pollo; se mezcla y se mantíene a ...72QC; esta mezcla se consideró como semilla. Los cultivos del virus se hacen en un medio que contiene 5% de ex, tracto de embrión de bovino. 45% de líquido amniótico de bovino y 45% de solución ba, lanceada de Hanks. A partir de la semi; lla, se hace una síembra, se reparte en pe., queñas porciones que se utilizan como inóculo para la preparación de la vacuna; se emplean para el cultivo células tripsinizadas de embrión de pollo nutridas con líquido amniótico de bo., vino. Se inoculan las células y tres días después se les cambia el líquido. por el medio 199. lavando antes con Hanks. El líquido se cosecha a los 11 días. se centrifuga en refrí., qeraclón. a 2000 rpm durante 15 minutos. pa., ra eliminar detritus celulares; se añade albú., l~ina humana para estabilizar el virus. en una concentración de 5%. porque su infectividad baja rápidamente cuando se conserva sin es., tabíliaador. Se hacen pruebas de seguridad que consisten en síembras en medios de cultivo. inoculación intraperítoneal de ratones de 15 g ... inoculación intracerebral de ratones de 1 día de nacidos e inoculación intraperitoneal de cobayos. También se inocula en células L de ratón para comprobar la ausencia de or., ganismos pleurocneumonoides. y se inoculan monos por vía íntracerebral e intracisternal. sacrificándolos tres semanas después para buscar lesiones histológicas. La vacuna preparada por Enders fue en , viada a varias ciudades para hacer estudios sobre las características de las reacciones pro , ducídas, su efectividad y su valor inmunoló , g!CO 20 a 25. La vacuna se inoculó por todas las vías posíbles.é" tanto para estudiar cuál era el me., jor método para producir inmunidad. como para conocer cuál sería la capacidad del virus para infectar a los contractos de los individuos vacunados. La vacunación por las vías sub, cutánea. intradérrníca e intramuscular fue íqual, mente efectiva. aunque la vía subcutánea pa., rece producir reacciones más leves; no se obtuvo respuesta inmunológica por las vías oral. intranasal ni percutánea, y sólo un ní, ño entre 11 respondió cuando la inoculación se hizo por vía conjuntival. Además de estudiarse la vía más adecuada. se hicíeron también estudios de la dosis óptima para la administración de la vacuna'", Se emplearon cantidades de 0.05 a 0.5 ml.: no se observó ninguna diferencia clínica ni seroló , gica y se adoptó por conveniencia la de 0.25 mI. En los nmos vacunados se presenta gene_ ralmente una elevación de temperatura que puede durar de 2 a 5 días; esta elevación pue., de ser pequeña. de 37QC. pero en ocasiones puede llegar a 409C. En algunos niños aparece un exantema que generalmente es ligero y persiste de 1 a 3 días; éste se presenta has., ta que pasa la fiebre. A pesar de la fiebre y de la erupción. usualmente los niños no aparentan estar enfermos. No se han observa, do síntomas catarrales, ni complicaciones res., piratorias ni tampoco trastornos del sistema nervioso central. No se logra aislar el vi; rus de la sangre ni se encuentra en el aparato respiratorio superior. Los controles no presentan ningún síntoma. ni se encuentra en ellos elevación de anticuerpos. El resultado de los efectos antigénicos de la vacuna en estos estudios fue el siguiente: el 54% de los niños vacunados tuvo respues. ta inmunológica; 45% de ellos eran resísten.. tes inicialmente; de los niños susceptibles úní., camente uno no presentó respuesta a la vacuna. Para determinar el grado de protección con , ferida por la vacuna atenuada, tres semanas más tarde vo1vieron a vacunarse 29 de estos niños; ninguno de ellos presentó reacciones clínicas ni serológicas. 931 I'JNltIQlJE'l'A PIZAIUtO Dolgin y colaboradores-? han aplicado va., cunas preparadas por ellos en embrión de pollo y en cultivos de tejidos del mismo tipo de embrión. La reacción febril fue menor en los niños que obtuvíeron esta última. nalm ente se presentan trastornos del sistema nervioso central. morbilidad ampliamente exten , dída y virulencia muy alta en poblaciones aisla, das, con efectos graves en algunas enferme; dades pre-existentes. Cuando las personas no son susceptibles no se elevan los anticuerpos con la aplicación de la vacuna; esto demuestra que el virus ac; túa multiplicándose y una pequeña cantidad de anticuerpos, presente en el individuo, eví., ta la multiplicación del virus modificado. Kruqman-s estudió una epidemia que se presentó siete semanas después de la vacuna; ción en un grupo de niños internados; hubo 46 casos en 73 niños no vacunados; fue una epidemia muy severa. en la que hubo muchas complicaciones y cuatro muertes. Los 23 niños que habían sido vacunados quedaron proteqí., dos sólidamente. A pesar de que la vacuna produce una en., Iermedad modificada y en algunos casos severa, es de cualquier manera aceptable por los siguientes motivos: facilidad de aplicación, alto índice y uniformidad de la respuesta se., rológica, eliminación de complicaciones bac, terianas y por su eficacia. La fiebre que se produce, por lo general no es mucho más aL .ta que la que se presenta en muchos individuos después de la vacunación antivariolosa o en las inyecciones con la vacuna triple. En 27 niños vacunados se hícieron electroencefalogramas los cuales fueron completamente nor., males. En los niños vacunados los anticuerpos fijadores de complemento empiezan a elevarse entre el segundo y séptimo días después de la aparición del exantema, se mantienen en un nivel alto y, después de tres o cuatro meses, descíenden y tienden a conservarse en un nivel bajo. Estos anticuerpos 1--.. aparecer aún en ausencia de la fiebre y del exantema. No se conoce su persistencia en las personas va., cunadas, pero los niveles siguen la misma se., cuela que en la enfermedad natural. por 10 que se cree que es posible que tambíén se conserven indefinidamente. La respuesta a la vacuna tiene un período de incubación más corto que la enfermedad; los efectos de la vacuna administrada al prin , cipío de una epidemia han sido estudiados por Hoekenga y colaboradores= en Panamá: 453 personas fueron vacunadas con vacuna de ví., rus vivo modificada dejando 356 como testi., gas; únicamente 3 personas del grupo vacunado adquirieron la enfermedad, en contraste con 32 del grupo testigo. Una vacuna que produce inmunidad com , parable a la que se instala con la enfermedad natural es importante, sobre todo en los casos como el, sarampión, enfermedad en la que la mortalidad es elevada. hay una frecuencia grande de complicaciones bacterianas y ocasío.. 932 En los niños con inmunidad materna no se presentan síntomas cuando se aplica la vacuna= y no se eleva el título de anticuerpos presen., tes; el virus que se emplea en la vacuna no se reproduce aún en presencia de pequeñas can , tídades de anticuerpos maternos. Es ímpor., tante hacer notar que el nivel de anticuerpos requerido para proteger contra el sarampión puede ser muy bajo, Stokes y colaboradores'" encontraron que los niños con títulos de antí., cuerpos de 1:2 no contrajeron la enfermedad aún estando en contacto íntimo con pacientes que la sufrieron. Será interesante determinar si estos niños vacunados, en los cuales no hay respuesta antigénica, se convíerten en susceptibles al perder los anticuerpos de la madre, y sería también importante determinar si un virus modificado" con un título mayor, es ca., paz de trasponer la barrera de anticuerpos preformados. El título del virus, en la vaeuna, es de -1 x 10_1• El hecho de que no se produzca infección por la vacuna cuando hay anticuerpos, presen., ta el problema de la revacunación, A menos de que una sola vacuna confíera inmunidad permanente, sería necesario repetir las vacu., naciones efectivas durante toda la vida del in , dividuo, porque de otra manera solamente se VACUNA retardaría la enfermedad natural y ésta podría presentarse en forma más grave. Hay, desde luego, un peligro potencial en el empleo de cultivos de células de primates para la producción de vacunas elaboradas con virus modificados, pues en los tejidos hay la posibilidad de que existan en forma latente otros virus que no pueden eliminarse. Los tejidos de embrión de pollo son superiores por este concepto; sin embargo" todavía falta de, terminar si la multiplicación del virus puede continuarse indefinidamente en este tejido, si se produce suficiente antígeno viral para ser inmunogénico y si la atenuación del agente no prcsique, modificándose aún mas el virus. No cabe duda que una vacuna muerta no puede ser la solución para la prevenc.ón de muchas de las enfermedades producidas por virus, pero el control de las vacunas vivas de; be ser extraordinariamente cuidadow;. cuan., do se emplean por vía oral. la probabilidad de infección es menor; por vía parenteral el riesgo es mayor y por otro lado subsiste aún el peligro de nefrosis con tejidos obtenidcs a partir de riñón; por esto sería de desearse que todos los virus pudíeran adaptarse a cé., lulas obtenidas de embrión de pollo, cultivadas en medios sintéticos en los cuales se encuentre la menor cantidad posible de proteínas ex, trañas. RESUMEN Se ha ce una descripción de los pasos lle., vados a cabo para el cultivo y preparación de una vacuna de virus modificado contra el sarampion. Se presentan algunos datos sobre la acción de la vacuna en diversos estudios practicados, y sobre las propiedades del virus. Se ha ce mención de las ventajas de la produc., ción de inmunidad aunque en algunos casos se produzca una respuesta exagerada. REFERENCIAS 1. BIBLIOGRAFICAS Citado por IC~Tz, S .• ::\IEDEARIS, D. N. "" ENDERfl. J. F., Symp. No. 10. 'rhe New York Acad. of ::\[ed.. 215-224. iooo. CONTHA EL SAHA)IPION Citado pOlO EKDEllS, .J. F .. PEEBLES, T. C., MeCA1:· TH\", K., I1IlLOvANOVIÓ, 111., 1\IITUS, A. & Hor.r.oWAY, A., Am. JOUl·. Puh, Hlth., ,1')' 275-282. 1957. 3. lLn¡E, G., & SfIAFn:I:, .T., J. Iunnunol., 38, 177· ·]82, 1940. 4. ENDERS, J. F., & I'EE/lU:S, T. C., .J. Irmuunol .. 86. 277-. 19iJ4. 5. E¡\-m:Rs, J. F., 'I'he Am . .Iour. of the I1Ied. Sci .. 231, 622-637, 1956. G. )IU.oVAKOVIÓ, IIl. V., J<;XlJERS, .J. F. & Mrl'us, .ti .• PI·OC. Soc. Exper. Biol. ,~ Med., .'15, 120·127, 19iJ7. EKm:I:, :r. F. Aru .. /OH;·. l 'u». 111th.. 47, 27iJ· 27!.l, 1957. 8. KATZ, S. L .• I1hr,~)L\XOVTÚ. )1. V. & BKDElIS, .T. 1<'., Proc. Soc. Exper. Biól. & Med., 97, 25'·29, lD58. D. 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