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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 40, No. 1, 2009.
Evaluación de los efectos del policosanol
sobre manifestaciones del daño pulmonar inducido
por monocrotalina en ratas
Vivian Molina, Rosa Mas, Miriam Noa, Yazmín Ravelo, Daisy Carbajal, Maikel Valle, Lourdes
Arruzazabala y Nilda Mendoza.
Dpto. Farmacología, Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Avenida 25 y calle
158, Playa, Apartado Postal 6414, Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: vivian.molina@cnic.edu.cu
Recibido: 2 de julio de 2008.
Aceptado: 6 de octubre de 2008.
Palabras clave: daño pulmonar, ratas, monocrotalina, policosanol.
Key words: pulmonar injury, rats, monocrotaline, policosanol.
RESUMEN. La hipertensión arterial pulmonar, (HTAP) enfermedad crónica que afecta frecuentemente a la población adulta,
conduce a una discapacidad importante y progresiva. Las estatinas, agentes hipolipemiantes que inhiben la síntesis de colesterol
mediante la inhibición competitiva de la HMG-CoA reductasa que además inhiben la proliferación de las células musculares
lisas (CML), han sido referidas como una opción actual para tratar esta enfermedad. El policosanol es una mezcla de alcoholes
alifáticos superiores obtenida de la cera de caña que también inhibe la síntesis de colesterol mediante la regulación indirecta
de la actividad de la HMG-CoA reductasa, con acción antiproliferativa sobre las CML. Resulta racional investigar si el policosanol protege el daño pulmonar inducido en modelos experimentales en los cuales las estatinas han mostrado ser efectivas. Este
estudio investigó los efectos del tratamiento oral con policosanol sobre el daño pulmonar inducido por monocrotalina (MCT)
en ratas. Para ello, las ratas se distribuyeron en cuatro grupos: un control negativo tratado vía subcutánea (s.c.) con disolución
salina y por vía oral con el vehículo tween 20/agua y tres inyectados con dosis s.c. únicas de MCT (60 mg/kg), uno tratado por vía
oral con el vehículo (control positivo) y dos con policosanol (20 y 200 mg/kg). Los tratamientos comenzaron el día de la inyección con MCT y se administraron por 28 d . Se cuantificó el porcentaje de supervivencia, el peso corporal, el peso del pulmón
completo, la hipertrofia ventricular y se realizó el estudio histológico. La MCT aumentó significativamente el peso del pulmón,
redujo significativamente el peso corporal y produjo marcada hipertrofia ventricular derecha y severa hipertrofia de la capa
media arterial, mostrando la validez del modelo. Contrario a lo esperado, al compararse con los datos del control positivo, el
policosanol (20 y 200 mg/kg) no modificó significativamente ninguna de las variables de daño pulmonar y sistémico evaluadas,
lo cual fue consistente con los datos histológicos. En conclusión, el policosanol no mostró efecto protector sobre el daño pulmonar
y sistémico inducido por MCT.
ABSTRACT. Pulmonary arterial hypertension, (PAHT) a chronic disease that frequently affects the adult population, leads to
a relevant and progressive disability. Statins, lipid-lowering agents that inhibit cholesterol synthesis through the competitive
inhibition of HMG-CoA reductase activity that also inhibit the proliferation of smooth muscle cells (SMC), have been referred as
a current option to treat such a disease. Policosanol is a mixture of higher aliphatic alcohols purified from sugar cane wax that
inhibits cholesterol synthesis through the indirect regulation of HMG-CoA activity with antiproliferative effect on SMC. It seems
to be rationale, therefore, to research whether policosanol can project against induced-pulmonary injury in experimental models
in which statins have shown to be effective. This study researched the effects of oral treatment with policosanol on the pulmonary
injury induced with monocrotaline (MCT) in rats. For that, rats were distributed in four groups: a negative control treated with saline
solution subcutaneously (s.c.) and orally with the vehicle Tween 20/water, and three injected with a single dose s.c. of MCT (60 mg/kg),
one of them treated orally with the vehicle (positive control) and two with policosanol (20 and 200 mg/kg, respectively). Treatments
started the day of MCT injected and were given for 28 d . Survival rates, bodyweights, whole lung weight and ventricular hypertrophy were quantified, and histological study of the lung was performed. MCT (60 mg/kg, sc.) significantly increased lung
weight and reduced bodyweights, producing a marked right ventricular hypertrophy and a severe hypertrophy of the media
arterial layer, thus showing the validity of this model. Contrary to that expected, compared with the positive control, policosanol
did not produce significant changes of the indicators of pulmonary and systemic injury here assessed, which was consistent with
histological data. In conclusion, policosanol (20 and 200 mg/kg) did not show protective effect on the pulmonary and systemic
injury induced with MCT.
INTRODUCCIÓN
La hipertensión arterial pulmonar (HTAP), enfermedad crónica que afecta frecuentemente a la población adulta, conduce a una discapacidad importante
y progresiva.1 La fisiopatología de la HTAP no está
aún totalmente dilucidada, pero ha sido asociada a
diferentes mecanismos. Así, la vasoconstricción de las
arterias de pequeño y mediano calibre desempeña un
papel importante en los estadios tempranos de la enfermedad y luego aparece el remodelado vascular, con
cambios estructurales determinados por la proliferación
de músculo liso, lo que lleva a la oclusión vascular2-4 y
19
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20
a la consecuente hipertensión pulmonar, insuficiencia
ventricular derecha y muerte.2
Aunque existe considerable conocimiento de los
cambios anátomo patológicos y moleculares que ocurren
en la HTAP, su tratamiento es casi empírico, pues el mecanismo íntimo que lleva a la proliferación de músculo
liso no ha sido del todo dilucidado. En la búsqueda de
opciones para su tratamiento, se ha demostrado que
diversos agentes como los antagonistas de calcio,5 las
prostaciclinas y sus análogos,6 los antagonistas de la
endotelina-1,7 los estimuladores de la liberación de óxido nítrico,8 los antagonistas del receptor del factor de
crecimiento plaquetario,9 inhibidores de la recaptación
de serotonina,10 y los inhibidores de la 5-fosfodiesterasa
presentan efectos beneficiosos sobre la HTAP inducida
experimentalmente.11
Como parte de estas opciones, se ha conferido
especial interés a las estatinas, agentes que inhiben
la síntesis de colesterol mediante la inhibición competitiva de la HMG-CoA reductasa, ampliamente
utilizados en la clínica como agentes hipolipemiantes. Las estatinas presentan además, un conjunto de
efectos pleiotrópicos dentro de los que se destacan sus
acciones anti-inflamatoria, antiproliferativa, antioxidante, antitrombogénica y restauradora de la función
vascular,12,13 que pueden contribuir a contrarrestar la
inflamación crónica del pulmón.14, 15
La inhibición competitiva de la actividad de la HMGCoA reductasa causada por las estatinas no sólo da lugar
a la reducción de la síntesis de mevalonato que no sólo
disminuye la formación de colesterol, sino de la síntesis
posterior de isoprenoides requeridos para la prenilación
de proteínas, muchas de ellas indispensables en diversos
procesos inflamatorios, por lo cual la inhibición de la
prenilación puede conducir a la aparición de efectos antiinflamatorios.16 Este mecanismo parece ser relevante en
los efectos protectores que las estatinas ejercen sobre el
daño pulmonar.
Uno de los modelos experimentales más utilizados
para evaluar sustancias con efecto beneficioso potencial
sobre la HTAP es la HTAP inducida por inyección subcutánea (sc.) de monocrotalina (MCT) en ratas. La MCT
es un alcaloide tóxico obtenido de plantas pertenecientes a la especie crotalaria17 que causa daño a las células
endoteliales de las arterias pulmonares y subsecuente
hipertrofia de la musculatura lisa arterial pulmonar, con
persistente hipertensión pulmonar.18
El policosanol es una mezcla de alcoholes alifáticos
primarios de alto peso molecular purificada de la cera
de caña (Saccharum officinarum L.)19 que posee propiedades hipolipemiantes,20 y efectos pleiotrópicos, tales
como antiagregante plaquetario,21 antiproliferativo,22
antitrombótico,23 anti-isquémico,24 antioxidante,25 protector del endotelio vascular26 y estabilizador de la placa
aterosclerótica.27
El policosanol reduce las concentraciones plasmáticas de colesterol a través de la inhibición de su síntesis,
lo que ocurre como consecuencia de una regulación
de la actividad de la HMG-CoA reductasa,28 al parecer
por activación de la AMPkinasa.29 El policosanol administrado por vía oral inhibe la proliferación de células
musculares lisas (CML) en modelos experimentales,22,30
en concordancia con los efectos anti-proliferativos reportados para las estatinas.31
Teniendo en cuenta que el policosanol inhibe la síntesis del colesterol mediante la regulación de su enzima
limitante, la HMG-CoA reductasa y que inhibe la proliferación de las CML; efectos que muestran similitud con
los ejercidos por las estatinas. Por tanto, resulta racional
investigar si el policosanol protege del daño pulmonar
inducido en modelos experimentales en los cuales las
estatinas han mostrado ser efectivas.
Teniendo en cuenta los antecedentes planteados, el
objetivo de este estudio consistió en evaluar los efectos
de la administración oral de policosanol sobre el daño
pulmonar inducido por MCT en ratas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se utilizaron ratas Sprague Dawley machos (200 a 250 g)
provenientes del Centro Nacional para la Producción
de Animales de Laboratorio, La Habana (CENPALAB),
las cuales fueron adaptadas durante siete días a las
condiciones de laboratorio con libre acceso al agua y
la comida. Las experiencias se realizaron de acuerdo
con los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio
vigentes en la República de Cuba y los procedimientos
del Centro de Productos Naturales (CPN).
Administración y dosificación
El policosanol fue suministrado por las Plantas de
Productos Naturales del Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC) (Ciudad Habana, Cuba) y se
utilizó tras corroborar sus especificaciones de calidad.
La monocrotalina (MCT) se disolvió en HCl 0,5 mol/L
y el pH se ajustó a 7,4 con NaOH 0,5 Mol/L . La MCT se
administró como dosis única por vía s.c.
Para su administración, el policosanol se suspendió
en un vehículo tween 20/agua (2 %) y se administró por
vía oral mediante entubación gástrica [5 mL/(kg/d)]. Los
tratamientos (policosanol o vehículo) comenzaron el día
de la inyección con MCT y se administraron por 28 d .
Tratamiento y diseño experimental
Las ratas se distribuyeron en cuatro grupos: un control negativo tratado vía s.c. con disolución salina y por
vía oral con el vehículo tween 20/agua y tres inyectados
con dosis únicas de MCT (60 mg/kg s.c.), uno tratado
por vía oral con el vehículo (control positivo) y dos con
policosanol (20 y 200 mg/kg).
Supervivencia. Se cuantificó el porcentaje de muertes en todo el estudio.
Peso corporal. El peso corporal se determinó al principio y al final del tratamiento. Transcurridos los 28 d., las
ratas se sacrificaron en atmósfera de éter, desangradas
y se extrajeron su corazón y sus pulmones.
Peso del pulmón completo. El pulmón se extrajo y
se pesó en balanza analítica Mettler Toledo y después se
calculó la relación peso pulmonar/peso corporal.
Hipertrofia ventricular. El corazón se tomó para
determinar la relación entre el peso del ventrículo derecho respecto al peso del ventrículo izquierdo más el
tabique. [VD/(VI + T)] como índice de hipertrofia ventricular derecha.
Estudio histológico
La fijación se realizó utilizando formaldehido 4 %
en disolución estabilizada. La inclusión y coloración
con hematoxilina y eosina fue realizada según los procedimientos comunes. Las láminas fueron analizadas a
ciegas sin conocer a qué grupo pertenecían. La observación microscópica se realizó en un microscopio Olympus
BH2 a 100 X.
Morfometría. En cada rata se examinaron de 45 a
55 arterias intraacinares y se categorizaron como mus-
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cularizadas (si tenían capas completas de músculo liso
en la media), parcialmente muscularizadas (si la capa
muscular no era completa) y no musculares (con apenas
músculo liso), según Rabinovitch y cols.32
DISCUSIÓN
La HTAP es una enfermedad fatal que afecta frecuentemente a la población adulta. Los cambios patológicos de
la HTAP involucran un incremento en la resistencia de
los vasos precapilares dado por un mayor tono vasomotor
y una proliferación anormal de las células vasculares endoteliales y musculares lisas, lo que genera oclusión del
lumen de las pequeñas arterias pulmonares. Esto da lugar
a la hipertrofia e insuficiencia ventricular derecha.1-4
El presente estudio demuestra que el tratamiento oral
con policosanol (20 y 200 mg/kg) durante 28 d no protegió
del daño pulmonar y sistémico inducido por la MCT.
La inyección de una dosis única de MCT (60 mg/kg.)
por vía s.c. a ratas produjo un daño pulmonar marcado,
dado por el incremento significativo en el peso del pulmón y la relación peso pulmón/peso corporal, así como
una reducción significativa del peso corporal y una
marcada hipertrofia ventricular derecha. Además, la
MCT causó la muerte en tres de los 12 animales controles
positivos. La magnitud del daño observado reultós similar a la reportada por otros autores,12 lo cual corrobora la
validez del modelo experimental.
Contrario a lo esperado, el tratamiento durante 28 d
por vía oral con policosanol a dosis de 20 y 200 mg/kg
no produjo protección sobre ninguno de los indicadores
evaluados en este modelo.
El estudio microscópico confirmó los resultados
anteriores. La inyección con MCT produjo una severa
hipertrofia de la capa media muscular de las arterias, lo
cual corrobora la validez del modelo experimental. El
tratamiento con policosanol a 200 mg/kg no modificó
este indicador.
Ha sido reportado que las estatinas, substancias inhibidoras de la HMG-CoA reductasa, protegen de manera
efectiva en este modelo de daño pulmonar.9 Este mecanismo de acción no solo está involucrado en la inhibición de
la síntesis del colesterol, típica de este tipo de fármacos,
sino también, en la reducción de la síntesis posterior de
isoprenoides, lo cuales son esenciales para la prenilación
de proteínas. Las proteínas preniladas desempeñan un
importante papel en la regulación del crecimiento celular,
secreción celular y transducción de señales. Así, las estatinas afectan muchos procesos celulares involucrados en
la inflamación mediante la inhibición de la prenilación
de proteínas,16 y es el mecanismo por el cual ejercen sus
efectos protectores sobre el daño pulmonar.
Análisis estadístico
Las comparaciones entre grupos de las variables
continuas se realizaron con la prueba de la U de Mann
Whitney. Las comparaciones entre grupos de las variables categóricas [supervivencia(%)] se realizaron con la
prueba de la Probabilidad Exacta de Fisher. Todos los
análisis se realizaron utilizando el paquete comercial
Statistic para Windows (Release 4.2, Stat Soft, Inc USA).
A priori se fijó un nivel de significación α = 0,05.
RESULTADOS
Como se observa, la MCT redujo significativamente
el peso corporal del grupo control positivo con relación
al grupo control negativo (ratas que no recibieron MCT),
efecto que no fue prevenido por el tratamiento con policosanol (Tabla 1).
La MCT produjo daño pulmonar medido como el
peso neto del pulmón y la relación peso pulmonar/peso
corporal, así como el indicador de hipertrofia ventricular
derecha. También aumentó significativamente el peso
absoluto y relativo del pulmón y el índice VD/(VI+T) con
respecto al control negativo, sin que el tratamiento con
policosanol modificara estos daños (Tabla 2).
En relación con los índices de supervivencia durante el estudio, en ninguna de las comparaciones
realizadas se observó un efecto significativo. Si bien
en el grupo control negativo no ocurrieron muertes
(100 % de sobrevivencia), los grupos control positivo
y policosanol muestran un 75 y un 83 % de supervivencia, respectivamente (Tabla 3).
Mientras en el grupo control negativo no se detectaron alteraciones histológicas, el análisis morfométrico
demostró una severa hipertrofia de la capa media muscular de las arterias del acino pulmonar y en las arterias
peribronquiales en el grupo tratado con MTC. Además, se
constató un aumento significativo de la muscularización
de las arterias pulmonares distales y peribronquiales y
una reducción de las arterias sin muscularización de su
capa media al compararse con el grupo control negativo.
El grupo tratado con policosanol (200 mg/kg) no mostró diferencias significativas con el control positivo (Tabla 4).
Tabla 1. Efectos del policosanol sobre la reducción del peso corporal inducida por MCT
en ratas.
Peso corporal
(g)
Tratamiento
Inicial
Final (28 d)
Cambio
(%)
Control – (vehículo)
207,1 ± 6,6
359,5 ± 8,6
73,5
Control (+) (vehículo + MCT)
205,6 ± 6,3
297,8 ± 16,9**
44,8
Policosanol 20 mg/kg + MCT
205,6 ± 5,9
309,6 ± 11,4 ns
50,5
Policosanol 200 mg/kg + MCT
206,3 ± 4,8
289,9 ± 11,1 ns
40,5
MCT Monocrotalina. ** p < 0,01 Comparación contra el grupo control (–). Ns No
significativo, comparación contra el grupo control (+). Prueba de la U de Mann Whitney.
21
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Tabla 2. Efectos del policosanol sobre el daño pulmonar y la hipertrofia ventricular derecha inducidas por la inyección
S.C de MCT en ratas.
Peso del pulmón
(g)
Tratamiento
Control – (vehículo)
1,31 ± 0,05
Control (+) (vehículo + MCT)
2,23 ± 0,10**
Peso pulmón/peso corporal
[VD/(VI + T)]
3,6 ± 0,16
0,24 ± 0,007
7,92 ± 1,14***
0,57 ± 0,01***
Policosanol 20 mg/kg + MCT
2,4 ± 0,13 ns
7,7 ± 0,32 ns
0,58 ± 0,03 ns
Policosanol 200 mg/kg + MCT
2,13 ± 0,17 ns
7,54 ± 0,77 ns
0,62 ± 0,02 ns
MCT Monocrotalina. ** p < 0,01 comparación contra el grupo control (–). ns No significativo comparación
contra el grupo control (+). Prueba de la U de Mann Whitney.
Tabla 3. Efectos del policosanol sobre la supervivencia en ratas con
daño pulmonar inducido por MCT.
Tratamiento
Control – (vehículo)
Sobrevivientes/Total
(%)
8/8 (100 %)
Control (+) (vehículo + MCT)
9/12 (75 %)
Policosanol 20 mg/kg + MCT
10/12 (83 %) ns
Policosanol 200 mg/kg + MCT
10/12 (83 %) ns
MCT Monocrotalina. ns No significativo comparación contra el
grupo control (+).
Tabla 4. Efectos del policosanol sobre la proliferación muscular arterial inducida por MCT en ratas.
Tratamiento
Control – (vehículo)
No muscularizadas (n)
39,3 ± 0,6
Parcialmente (n)
6,0 ± 0,46
Control (+) (vehículo + MCT)
4,6 ± 0,41
Policosanol 20 mg/kg + MCT
5,0 ± 0,5 ns
+++
10,0 ± 0,46
Muscularizadas (n)
04,0 ± 0,26
+++
35,8 ± 0,44+++
9,3 ± 0,41 ns
35,0 ± 0,37 ns
MCT Monocrotalina. +++ p < 0,000 1 comparación contra el grupo control (-). ns No significativo comparación
contra el grupo control (+). Prueba de la U de Mann Whitney.
22
El policosanol también actúa sobre la enzima HMGCoA reductasa, pero a diferencia de las estatinas, lo hace
por un mecanismo de modulación indirecta,28 el cual
involucra la activación de la AMPkinasa.29
Estudios comparativos del policosanol con algunas
estatinas (lovastatina, simvastatina, pravastatina) han
mostrado una eficacia similar para reducir las concentraciones séricas de colesterol total y LDL-C, mientras
se ha observado mayor eficacia del policosanol para
elevar las de HDL-C en pacientes con hipercolesterolemia tipo II.33-35
Aunque no se tiene una explicación plausible para
la carencia de efectos protectores del policosanol sobre
este modelo de daño pulmonar, las diferencias en el
mecanismo de acción sobre la HMG-CoA reductasa,
siendo de modo directo con las estatinas e indirecto
con el policosanol, pudieran estar relacionados con los
resultados aquí observados.
Por otra parte, estudios previos de farmacocinética
demostraron que el octacosanol, principal componente
del policosanol, se distribuye en todos los órganos siendo
el pulmón uno de los tejidos a donde menos llega.36 Por
este motivo, no se puede descartar que la carencia de
protección del policosanol en este modelo de daño pulmonar sea debido a causas de tipo farmacocinéticas.
No obstante, para descartar completamente estos
efectos, deberán realizarse estudios que evalúen dosis
superiores de policosanol.
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