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CURSO SUPERIOR DE POSTGRADO EN
CANCER HEREDO FAMILIAR
MODULO 3:
Técnicas de detección de alteraciones moleculares-génicas en
tumores ginecológicos: Síndrome de Lynch
Bioq. Florencia C. Cardoso
(fcardoso@cemic.edu.ar)
El Síndrome de Lynch es un síndrome autosómico dominante causado por
mutaciones germinales en los genes que codifican para las proteínas reparadoras
del ADN (genes MMR): MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 o mutaciones en el gen EPCAM
que no es un gen perteneciente a la familia de los genes reparadores de ADN pero
por su localización inactiva el gen MSH2.
Incidencia: 1: 400-500
3-5% del total de cáncer colorrectal
(CCR)
2% del total de cáncer de
endometrio
Tumores asociados a Síndrome de Lynch
Fuente: NCCN Guidelines Version 1.2015
DIAGNÓSTICO
1- Selección del caso índice adecuado de acuerdo a la historia personal y/o
familiar:
Criterios establecidos por las guías NCCN versión 1.2015:
• Cumplir con los criterios de Bethesda o Amsterdam
• Diagnóstico de cáncer de endometrio <50 años
• Mutación familiar conocida asociada a Síndrome de Lynch
• Presentar un riego ≥5% de ser portador de una mutación de acuerdo a los
modelos de predicción: MMRpro, PREMM o MMRpredict
2- Estudios de laboratorio:
• Evaluación del tejido tumoral
1- Inestabilidad de microsatelites (MSI)
2- Inmunohistoquímica (IHQ) de las proteínas
reparadoras del ADN
MLH1/MSH2/MSH6/PMS2
3- Análisis de metilación de MLH1
4- Testeo de mutaciones en el gen BRAF
• Estudio de mutaciones germinales en los genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 y
EPCAM (secuenciación completa y/o grandes rearreglos)
ESTUDIO DEL TUMOR
CONSIDERACIONES GENERALES IHQ Y MSI:
Ambas técnicas son de screening y deben ser realizadas en tejido tumoral de colon o
endometrio para que sea informativas
>90% de los tumores asociados a Síndrome de Lynch tiene alta inestabilidad de MSI y/o
ausencia de la expresión de una de las proteínas reparadoras
Tejido utilizado:
Colorrectal
1- Carcinoma
2- Pólipo adenomatoso con alto grado de
displasia
3- Pólipo adenomatoso con bajo grado de
displasia
Tumor de endometrio
Se desconoce hasta el momento la eficacia del estudio de otro tipo de tumores asociados a
Síndrome de Lynch
1- INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ)
Se utiliza un anticuerpo especifico que marca el antígeno, en este caso las proteínas que
forman parte de complejo MMR y se compara la expresión en tejido tumoral y tejido normal.
Se revela entonces la presencia o ausencia de las proteínas expresadas por lo genes
reparadores de ADN.
• Expresión normal: se encuentra expresión de las 4 proteínas sintetizadas por los genes
MMR
• Ausencia de expresión: alguna/s de las proteínas evaluadas en el tejido esta ausente ya sea
por la presencia de una mutación patogénica germinal o una alteración somática que silencia
la expresión del gen (ej: metilación MLH1 )
Limitaciones IHQ:
Material y operador dependiente: poca cantidad de tejido, tipo de fijación y toma
de muestra y cuestiones propias de la técnica pueden alterar al resultado
Es posible que algunas mutaciones no resulten en ausencia de detección de la
proteína
Las proteínas reparadoras del ADN funcionan como dímeros y son inestables
cuando no forman estos complejos
2- INESTABILIDAD DE MICROSATELITES (MSI)
Microsatélites: son secuencias repetitivas en el DNA (ej: AAAAA o CGCGCG) susceptibles
de adquirir errores cuando el sistema de reparación de encuentra dañado
Panel de microsatélites recomendado por el NCI:
Mononucleotidos: BAT25, BAT26
Dinucleotidos: D2S123, D5S346, D17S250
D17S250 ESTABLE
Tejido normal:
SANGRE
Tejido tumoral
D17S250 INESTABLE
Resultados posibles:
•Alta inestabilidad: ≥2 microsatelites inestables
•Baja inestabilidad: 1 microsatelite inestables
•Estable: ninguno de los microsatelites son inestables
Ventajas:
Se requiere menos tejido que para IHQ
Limitaciones:
Calidad de la muestra
10-15% de CCR esporádico exhiben MSI
Una pequeña proporción de los tumores asociados a Lynch no presentan MSI (MSH6)
Pueden existir discordancias entre los resultados de IHQ y MSI:
IHQ normal + alta MSI: ej: anticuerpo utilizado en la IHQ
IHQ con ausencia de proteína + estabilidad de MSI: ej: tipo de tejido utilizado
3- METILACIÓN MLH1
10-15% de los tumores con ausencia de MLH1 en la IHQ y estabilidad de
microsatélites se debe a la metilación somática del promotor de MLH1 que
silencia la expresión del gen
No descartar el diagnóstico de Síndrome de Lynch en individuos con CCR en edad
temprana, fuerte historia familiar u otros factores de riego
4- TESTEO MUTACIÓN V600E EN EL GEN BRAF
Las mutaciones patogénicas en el gen BRAF se encuentran asociadas
principalmente a cáncer esporádico y son muy raras en el Síndrome de Lynch.
ESTUDIO DE MUTACIONES
GERMINALES
Que genes estudiamos en Síndrome de Lynch?
Genes MMR: MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2
Gen no MMR: EPCAM (formalmente conocido como TACSTD1)
Hay reportes de casos con mutaciones en otro genes involucrados en el proceso de
reparación del DNA (ej: MLH3, MSH3, PMS1, etc) pero dado que la significancia
clínica y el posible rol de la función de estos genes es aún desconocida y se
desconoce cual puede ser la utilidad clínica de esta información no se incluyen en el
testeo de mutaciones germinales.
ALGORITMO DE TRABAJO
Firma del consentimiento
•Beneficios, riesgos y limitaciones
•Resultados posibles e interpretación
•Confidencialidad
Toma de muestra
Sangre Periférica/Hisopado bucal
Extracción de ADN genómico
Procesamiento del ADN
Secuenciación completa de/los gen/es
Estudio de grandes rearreglos
(MLPA)
1- SECUENCIACIÓN COMPLETA
Secuenciación por Next Generation Sequencing
•A partir de un pool de primers diseñados y validados para amplificar los exones
y bordes exón-intrón se obtienen amplicones que cubren un 100% de la
secuencia codificante de los genes MLH1/MSH2/MSH6 y MUTYH y 98% para el
gen PMS2
•Corroboración manual de la lectura de todos los fragmentos. Las escasas
regiones no cubiertas por la metodología de NGS son cubiertas por
secuenciación por SANGER
•Secuenciación de las regiones amplificadas mediante NGS
•Búsqueda de las variantes en las bases de datos de referencia para determinar
su significancia clínica
•Confirmación por secuenciación SANGER en caso de encontrarse una mutación
con implicancia clínica (técnica gold standard)
Beneficios NGS:
Las regiones estudiadas son leídas con gran profundidad
Mayor costo-beneficio asociado a la evaluación de regiones grandes o mayor
número de genes
Resultados en menor tiempo
Limitaciones NGS:
No es efectiva en regiones repetitivas de los genes y nomenclatura de las
mutaciones producto de deleciones o inserciones
Sanger es la técnica gold standard para la confirmación de mutaciones deletéreas
2- MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
PASOS
Día 1:
• Desnaturalización DNA
• Reacción de Hibridación: se utilizan
2 sondas que hibridan adyacentes
una a la otra en la secuencia blanco
Día 2:
•Reacción de Ligación
•Reacción de PCR: es llevada a cabo
con un par de primers universales
•Corrida electroforética y análisis de
fragmentos
Características de la técnica:
• cuantificación relativa
• sensible a la experiencia del operador, concentración y calidad del DNA a analizar
y contaminantes e inhibidores de la PCR en la muestra
Ejemplo: deleción exón 7 de MSH2
Los grandes rearreglos son una mutación más, por ello cuando por secuenciación
se tiene un resultado de secuencia normal se debe completar el estudio con el
análisis de grandes rearreglos
GENES QUE SE PUEDEN EVALUAR POR MLPA:
MSH2: 20-40% de las mutaciones patogénicas
MSH6: 7% de las mutaciones patogénicas
MLH1: 5% de las mutaciones patogénicas
EPCAM: 100% de las mutaciones patogénicas
Consideraciones para el gen PMS2:
Debido a la alta homología de PMS2 y los pseudogenes, el testeo e
interpretación de los resultados es muy difícil. Se debe tener en cuenta la
experiencia del laboratorio para la correcta interpretación e informe de
mutaciones patogénicas en este gen.
Hasta el momento no contamos con una técnica especifica para la detección de
grandes rearreglos.
CORRELACIÓN GENO-FENOTIPO
CCR: se ha observado un mayor riesgo a desarrollo en pacientes portadores de
mutaciones en los genes MLH1/MSH2 que en pacientes portadores de mutaciones
en MSH6/PMS2. En este ultimo caso la edad de aparición es mas avanzada.
Mutaciones en MSH2: asociadas a mayor riesgo de cáncer extracolónico, con
excepción del cáncer de endometrio.
Mutaciones en MSH6: asociadas a tumores con baja MSI y mayor riesgo a cáncer
de endometrio
Mutaciones en PMS2: asociadas a un menor riesgo general al desarrollo de
tumores asociados a Sindrome de Lynch
Deleciones del gen EPCAM: dado que esta mutación resulta en un silenciamiento
de MSH2 se lo relaciona principalmente con un riesgo aumentado a CCR. El riesgo
a tumores extracolónicos dependen de la extensión de la deleción en la región 3`
de EPCAM.
INFORMES
Deben ser detallados e incluir todos los cambios encontrados en la muestra con
la correcta denominación, interpretación y significancia clínica.
Puede incluir:
•Análisis in silico (SIFT, Polyphen, Align): herramientas bioinformáticas que
ayudan a predecir el efecto biológico de la sustitución de aminoácidos en una
proteína y colaboran en el análisis de las variantes de significado clínico incierto
(VUS)
•Citas bibliográfica de estudio funcionales in vivo, ex vivo y estudios
epidemiológicos
•Reportes y experiencia previa de co-ocurrencia con mutación patogénica o
estado de homocigosis
Análisis completo de los genes MMR (SECUENCIACIÓN COMPLETA Y MLPA)
•Mutaciones patogénicas reportadas
•Mutaciones patogénicas noveles
•Polimorfismos
•Variantes de significado clínico incierto (VUS)
Diagnóstico genético de Cáncer de Síndrome de Lynch
Prevención
Detección
Precoz
Seguimiento
Tratamiento
personalizado
Asesoramiento
familiar
Cualquiera que porte una mutación patogénica, tanto padre como madre, tiene la
probabilidad de 1 de 2 de transmitirla a sus hijos (o sea cada hijo tiene 50% de
probabilidades de heredar la mutación). En estos casos el estudio se limita a la mutación
familiar previamente identificada. El estudio genético de Sindrome de Lynch no se
recomienda en pacientes <18 años.
Es infrecuente la presencia de mutaciones de novo en estos genes
CONCLUSIONES:
Técnicas de detección de alteraciones moleculares-génicas en tumores
ginecológicos: Síndrome de Lynch
SCREENING: se realizan en tejido tumoral
no definen el diagnóstico de Síndrome de Lynch
TECNICAS
DIAGNOSTICAS: estudian la presencia de mutaciones germinales
en los genes MMR mediante secuenciación completa y MLPA
RESULTADO
POSITIVO
Se detectó la mutación asociada a
Síndrome de Lynch
NEGATIVO
No se puede descartar la presencia de una
mutación en otro sitio o gen/es no evaluados
en el ensayo (revisar antecedentes
personales y familiares, caso índice
inadecuado, etc.)
Fuente: NCCN Guidelines Version 1.2015
Muchas gracias por su atención