Download PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN γ EN Escherichia coli

IX CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
PRODUCCIÓN DE INTERFERÓN γ EN Escherichia coli
Victor E. Balderas Hernández, Ana Paulina Barba de la Rosa y Antonio de León Rodríguez,
Depto. de Biología Molecular, IPICyT, Camino a la Presa San José 2055, Col. Lomas 4ª secc. CP78216, San Luis
Potosí, SLP. Tel. 01(444)8342000 Ext. 2057, Fax 01(444)8342010. E-mail: aleonr@ipicyt.edu.mx
Palabras clave: Péptido señal, gen sintético, proteína terapéuticas.
Introducción. El Interferón γ humano (hIFN- γ) es una
glucoproteína de 2 subunidades de ~18-22 kDa que tiene
múltiples efectos biológicos, con influencia directa en el
sistema inmune, es objeto de amplia investigación en su
estructura, función y potencial terapéutico. Requiriéndose
grandes cantidades de proteína pura, que solo pueden
obtenerse mediante tecnología de DNA recombinante. Entre
los posibles huéspedes, Escherichia coli se ha convertido en
el hospedero de elección (en términos de valor económico)
para la producción de ésta y otras proteínas recombinantes.
Los avances recientes en la optimización de genes,
estabilización de mRNA, co-expresión de chaperonas,
péptidos señales de fusión y plegamiento en el espacio
periplásmico han permitido obtener productos bioactivos y
de forma soluble (1).
Este trabajo describe la evaluación de los efectos de
optimización del gen, fusión del péptido señal SP1 (2) y
optimización de las condiciones de operación para la
producción de la proteína recombinante rhIFN- γ en E. coli
BL21-SI.
Metodología. El gen sintético optimizado del rhIFN-γ
fusionado al péptido señal SP1 se clonó en el vector pET12a
(Novagen) en los sitios Nde I y Bam HI, para su expresión en
E. coli BL21-SI. Se utilizó NaCl 0.3 M como inductor y las
condiciones iniciales de acuerdo a Donahue y Bebee (1999)
(3). Se evaluaron diferentes condiciones de expresión,
variando la densidad óptica (OD620[0.6, 0.9 y 1.5]),
temperatura (28, 32 y 37ºC) y medio de cultivo (LBON y
medio mineral). Se cuantificó biomasa y cantidad de
proteína por métodos espectrofotométricos. El patrón de
proteínas se analizó por electroforesis en gel de SDS-PAGE
para la posterior inmunodetección del rhIFN-γ por Western
Blot.
Resultados y discusión. El alineamiento de la secuencia del
gen sintético rhIFN-γ con la secuencia nativa mostró un 74%
de homología. Las diferencias se debieron a la optimización
del gen sintético para su mejor expresión en E. coli. En la
Fig.1. se muestra un esquema del vector de expresión. De las
transformantes de E. coli BL21SI/pET12aSP1IFN-γ. Se
seleccionaron 7 clonas para su expresión en matraz
utilizando medio LBON. Se pudo observar la presencia de la
proteína recombinante en su forma procesada (18 kDa) y sin
procesar (21kDa), siendo la clona 4 (Fig.2) la que mayor
proteína procesada generó, y que se utilizará para los
posteriores estudios de expresión. El análisis del efecto de
las condiciones de expresión, dió como resultado que la
concentración más alta de rhIFN-γ, fue de 6.3 mg/L, y se
obtuvo a una OD620=0.9, a 32ºC en medio mineral.
Fig. 1. Construcción del plásmido pET12a SP1 IFN-γ.
Fig. 2. Inmunodetección del IFN- en 7 clonas analizadas por
Western Blot.
Conclusiones. La optimización del gen rhIFN-γ permitió su
expresión en E. coli evitando así problemas por el uso de
codones. Al procesarse adecuadamente el péptido señal SP1
de fusión permitió obtener proteína madura con secuencia
N-terminal correcta (sin f-Met). El estudio de las
condiciones de operación llevó a un incremento en la
concentración del rhIFN-γ. El sistema E .coli BL21-SI
pET12a se presenta como un sistema de expresión eficiente
y costeable económicamente para la producción de proteínas
recombinantes.
Agradecimiento. Se agradece el apoyo de la IBQ Luz Ma.
Teresita Paz. El financiamiento CONACYT-39639 y
FOMIX FMSLP-2002-4100. V. Balderas agradece la beca
172102 al CONACYT.
Bibliografía.
1.- Choi, J y Lee, S. (2004). Secretory and extracellular production
of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol
Biotechnol. 64: 625-635.
2.- Bergès, H, Liauzun, E, y Fayet, O. (1995). Combined effects of
the signal sequence and the major chaperone proteins on the export
of human cytokines in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol.
62(1): 55–60.
3.- Donahue, R y Bebee R. (1999). BL21-SI ™ Competent Cells for
Protein Expression in E. coli. Focus. 21(2): 49-51.