Download Producción y purificación de la proteína recombinante HN

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN Y DE LA SALUD ANIMAL
Producción y purificación de la proteína
recombinante HN del Rubulavirus porcino como
candidata para un inmunógeno en cerdos
Rocío Lara-Romero, Sandra Cuevas-Romero, José Luis
Cerriteño-Sánchez, Humberto Ramírez-Mendoza, Susana Mendoza.
16,201,625
Población de
cerdos 2013
(SIAP)
En 1980
Zona de mayor producción
porcina en los estados de:
•
•
•
•
Guanajuato
Michoacán
Querétaro
Jalisco
5,696,373
cerdos
Primeros brotes en 1980 en la ciudad de La Piedad Michoacán.
Enfermedad endémica en el centro de la República Mexicana.
Signos clínicos dependientes de la edad.
Perdidas económicas relacionadas con problemas reproductivos y
mortalidad en lechones.
Capacidad de establecer infecciones persistentes in vivo e in
vitro.
Stephano et al., 1981; Stephano et al, 1988; Linné et al, 1992; Rima et al, 1995; RamírezMendoza et al, 1997; Escobar-López et al, 2011; Hernández et al, 2004; Rivera-Benítez, 2013
Virus RNA
Cadena sencilla sentido
negativo
15180 pares de bases





Longitud total
aminoácidos.
de
1862
bases
y
576
Glicoproteína transmembranal con capacidad
hemoaglutinante y neuroaminidasa.
Peso molecular en SDS-Page de 66 KDa.
Proteína inmunodominante del Rubulavirus
porcino.
Variabilidad
del
gen
neuraminidasa (HN).
hemoaglutinina-
Moreno-López et al., 1986; Sundqvist et al., 1990, 1992; Ramírez-Mendoza et al, 1997 ; Zenteno-Cuevas et al., 1998;
Paniagua-Buelnas, 2000 ; Santos-Lopez et al., 2004; Wang et al., 2007; Sanchez-Betancourt et al, 2008.
General:
Producir y purificar la proteína recombinante HN del
Rubulavirus porcino para su posible uso como
inmunógeno en cerdos
Particulares:
• Identificar las colonias de E. coli KRX que expresen el vector pDual®GC donde
se encuentra clonado el gen HN del PorPV
• Identificar la forma de expresión de la proteína HN en E. coli KRX
• Transformar la cepa de E. coli BL-21 con el vector de expresión pDual®GC que
contenga el gen HN clonado y compara su expresión y producción de proteína
con la cepa E. coli KRX
• Estandarizar el proceso de purificación mediante columna de afinidad para la
proteína recombinante HN
• Detectar la proteína recombinante HN del PorPV mediante western-blot
La enfermedad de ojo azul en cerdos solo se ha reportado en México y
es endémica en la región central de nuestro país. Hasta el 2002 fue
considerada la cuarta enfermedad mas importante en la industria
porcícola, debido a las graves perdidas económicas que produce. Por lo
tanto es importante la prevención y control de la enfermedad, siendo
el uso de vacunas una herramienta muy importante para lograrlo. Es
por esto que la proteína HN del Rubulavirus porcino, al ser
inmunodominante, podría ser una buena alternativa para el control
de la enfermedad.
2000 pb
1500 pb
1000 pb
Gel de agarosa al 0.8%. Amplificación mediante PCR del
gen HN del PorPV de cinco colonias de E. coli KRX
Western-blot revelado mediante quimioluminiscencia.
Control negativo. Placa de agar
LB-kanamicina (células
competentes de E. coli BL21 sin
transformar
Transformación. Placa de agar
LB-kanamicina (células
competentes de E. coli
BL21+pDualGC-HN
Sin exp
KRX-HN
Exp. 8 hrs
Exp 16 hrs
Western-blot revelado mediante quimioluminiscencia
BL21-HN
Sin exp
Exp 16 hrs
Western-blot revelado mediante quimioluminiscencia
Repetición
KRK (µg/µl)
BL21 (µg/µl)
1
0.2528
0.7618
2
0.2489
0.5430
3
0.0657
0.4087
Media
0.1891
0.5711
Se realizó estadística descriptiva utilizando la prueba de t de student para
diferencia de medias de BL21 y KRX con un valor de confianza de 0.05. El
valor p obtenido fue de 0.02212, lo que nos indica que la cantidad de
cuerpos de inclusión producida por la cepa de E. coli BL21 fue mayor que
la de KRX.
M
70
Kda
CI
NP
L
1
2
3
4
5
6
66 Kda
Gel de poliacrilamida al 12% teñido con azul de Coomassie. M: Marcador
de peso molecular. CI: cuerpos de inclusión. NP: fracción de proteínas no
pegadas a la columna. L: fracción de lavados de la columna. 1-6:
elusiones realizadas a la columna de purificación.
CI
NP
L
1
2
3
Western-blot revelado por quimioluminiscencia. CI: cuerpos de
inclusión. NP: Fracción no pegada a la columna. L: fracción de
lavados de la columna. 1-3: elusiones de la columna
66 Kda
6
5
4
3
2
1
L
NP
CI
Western-blot revelado utilizando sustrato para fosfatasa alcalina.
CI: cuerpos de inclusión. NP: fracción no pegada a la columna. L:
fracción de lavados. 1-6: elusiónes de la columna de purificación
70
Kda
•
Se lograron detectar las colonias de E. coli KRX que
contenían el gen HN de la cepa LPMV en el vector de
expresión pDualGC mediante la amplificación de
2000 pb por PCR punto final.
•
La sobre expresión de la proteína recombinante HN
del PorPV mediante la inducción con IPTG produce la
formación de cuerpos de inclusión E. coli KRX.
•
Se logró transformar la cepa E. coli BL-21, a partir de DNA de KRX.
•
La cepa de E. coli BL-21 produjo una mayor cantidad de cuerpos de inclusión,
en comparación con KRX.
•
Se logró estandarizar un proceso de purificación para recuperar la
proteína HN recombinante del PorPV
Mediante western-blot se logro la detección de la proteína
recombiannte utilizando como anticuerpos primarios anti
c-myc y suero de cerdo infectado con PAC3 al peso
esperado de 66Kda