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Curso Posgrado: PEDECIBA/BIOLOGIA
Coordinador: Susana González
Metilación del ADN asociado
a efectos ambientales.
Análisis por Real Time-PCR
Alicia Postiglioni
Junio, 2009
OBJETIVOS:
• Diferenciar la herencia mendeliana de la
no-mendeliana.
• Explicar la epigenética (ADN metilado)
• Explicar la discriminación di-alélica de los
genes improntados.
• Explicar la conversión del ADN por la
metodología del bisulfito. (BSP, MSP)
• Cuantificar por Real Time/PCR.
Expresión de génica:
• 1) expresión primaria del gen (dominancia
y recesividad) (transcripción).
Fenotipo= Genotipo + Ambiente
Expresión de génica:
• 2) expresión de algunos alelos del gen por
influencia ambiental (pos-transcripción).
(modificaciones químicas del ADN)
Fenotipo= Genotipo + Ambiente
.
.
.
.
.
.
Epigenética:
mecanismos que influyen en la
expresión génica sin modificar las secuencias de ADN,
transmitiéndose por mitosis o meiosis.
• Genética (hardware). Lento
• Epigenética (software). Rápido
Un organismo responde al medio
ambiente sin cambiar su ADN.
EPIGENÉTICA
EPIGENETICA
Dos alelos; uno silencioso, otro activo, indican cambios
epigenéticos de la expresión génica.
Alelo 1: condensación de los
nucleosomas (deacetilación
y metilación).
Alelo 2: descondensación
nucleosómica (acetilación y
desmetilación)
Callipyge
A
G
DLK1 y PEG11
vía paterna
GTL2; antiPEG11; MLG8
vía materna
+M/CLPGP
= Callipyge
+M/+P; CLPGM/CLPGP; CLPGM/+P = Normal
(M=materno; P=paterno)
Translocación Robertsoniana
rob(1;29)
IGF2 (gen improntado)
Poll
COL6A1
COL6 A2
COL8A1
COL8A2
METILACIÓN DEL ADN
INSERCIÓN DE GRUPO METILO
(CH3) EN CITOCINAS DE
DINUCLEÓTIDOS CpG
SUPRIME EXPRESIÓN GÉNICA
Sellado gamético
• Se imprime en la gametogénesis
• Se mantiene en la fecundación
• Se pierde de la línea germinativa en las
primeras fases del desarrollo embrionario
• Se vuelve a imprimir durante la maduración de
los gametos si la progenie es del mismo sexo.
• Materno: maduración de ovocitos
• Paterno: línea germinativa antes de la meiosis.
Hemicigosis funcional
• Uno de los dos alelos se heredan sellados
( no se expresa) La hemicigosis funcional
es un sello (impronta) colocado en los
óvulos o espermatozoides maduros
durante la gametogénesis.
• Epigenética: siendo heredable no
presenta cambios en la secuencia de
ADN.
Genome imprinting (impronta
genética)
• Gen IGF2 (receptor de crecimiento) en bovinos.
•
•
•
La impronta o silenciamiento del gen proviene por vía materna.
El gen se expresa por vía paterna.
El gen está ubicado en el extremo próximo terminal del cromosoma
BTA29.
• Metodología:
•
RT-PCR, en muestras obtenidas de hígado, pulmón, cerebro, corión,
•
•
•
alantoides, determinan que la expresión diferencial proviene del
alelo paterno, en todas las muestras.
Conceptos
El gen se expresa por vía paterna;
El gen está improntado por vía materna.
MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit
• Conversión de citocinas no metiladas en uracilo,
en muestras de ADNgenómico, plásmido, ADN
digeridos con endonucleasas. Las citocinas
metiladas no cambian.
GggcaagtCG
NaHSO3
- c se convierte en u pero se
detecta como t por la PCR.
-
• GggtaagtCG
C metiladas no cambian
CITOCINAS NO METILADAS
DEAMINACIÓN
citocina
uracilo
CITOCINAS METILADAS
Pasos Bisulfito/MSP:
1- Desnaturalizar el ADN
2- Tratarlo con NaHSO3 (kit Epitech bisulfito)
3- Amplificar por PCR el ADN convertido
Condiciones de la PCR:
Utilizar primers específicos para el alelo metilado y el no
metilado.
4- Correr en geles de poliacrilamida no-desnaturalizados
(secuenciación: con o sin clonación).
Pasos MSP:
1- Desnaturalizar el ADN
2- Tratarlo con NaHSO3
3- Amplificar por PCR el ADN template.
Condiciones de la PCR:
Utilizar primers específicos para el alelo metilado y el no
metilado.
4- Correr en geles de poliacrilamida no-desnaturalizados.
Variaciones:
Digestión de productos de PCR con enzimas de
restricción.
Características:
• El Bisulfito de Sodio convierte los residuos de
citocina de una cadena simple de ADN, en residuos
de uracilo, no activando a la 5-metilcitocina.
• El ADN convertido se amplifica con primers
específicos (U) (U-T) (citocinas no metiladas) y
primers específicos para citocinas metiladas (M) (CG).
• Se detecta por secuenciación ( con o sin clonación),
MSP, HTM/PCR, microarrays, Pirosecuenciación.
Polimorfismos generados por el bisulfito
Azul: citocinas no metiladas que se convierten en uracilo por la reacción
del bisulfito.
Rojo: citocinas resistentes a la 5-metilcitocina
Methylation specific PCR (MSP)
Primers que hibridizan con secuencias metiladas (contienen 5-metilcitocina y son resistentes a la
conversión con bisulfito).
HRM
Se realiza con ADN de doble cadena dentro de
un amplicón.
La T aumenta entre 55-95ºC. Llega un momento
en que la doble hebra se separa
Se utiliza SYBR Green porque se intercala
en la doble cadena de ADN Si no hay doble
cadena la fluorescencia es débil.
Nivel de fluorescencia VS nivel de temperatura
Doble cadena
Cadena simple
Análisis de metilación del ADN
HRM monitorea el proceso a altas temperaturas.
ADN no metilado
ADN metilado
Tratamiento con bisulfito convierte las C no metiladas en U. Este ADN no metilado
tendrá una baja T, a diferencia de los metilados. HRM determina la proporción de
Metilación, al permitir comparar en una curva donde se tienen ambas M y U.
CUANTIFICACIÓN
CUANTIFICACIÓN