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DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS HIDROLÍTICOS PARA LA
PRODUCCIÓN DE JARABES DE GLUCOSA A PARTIR DE ALMIDÓN DE YUCA
M. I. Ruiz*, D.R. Molina*,† R.G Torrres * & C.I. Sanchez **
Escuela de Química *, Escuela de Bacteriología y laboratorio clínico **, Universidad Industrial
de Santander, Cra 27 Calle 9, Bucaramanga, Colombia
†
E-mail de correspondencia: dmolina@uis.edu.co
Resumen: Se evaluaron a nivel de laboratorio los parámetros de la hidrólisis enzimática del
almidón, para la producción de jarabes de glucosa. Se compararon las enzimas de Novozymes y
Genecor International. Se evaluaron la α-amilasa del Bacillus licheniformis (Liquozyme® SC
DS, de Novozymes), en un rango de pH 5.7-6.0, de temperatura 82-86°C, dosificación de enzima
% (p/p) 0.013-0.025; igualmente, la glucoamilasa del Aspergillus niger (Spirizyme® Fuel, de
Novozymes), en un rango de pH 3.5-5.5, de temperatura 32-70°C, dosificación de enzima %
(p/p) 0.04-0.06; y finalmente la mezcla enzimática fúngica α-amilasa del Aspergillus kawachi y
glucoamilasa del Aspergillus niger (STARGEN™ 001, de Genecor International), en un rango de
pH 3.0-4.5, temperatura de fermentación de 20-40°C, dosificación de enzima 1.0-2.5 kg/MT de
grano seco. Se utilizaron los métodos analíticos del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS), glucosa
oxidasa y Bradford, para medir y determinar los valores de equivalentes de dextrosa (ED) y
actividad enzimática, concentración de glucosa y concentración de proteína, respectivamente. Se
encontró que las mejores condiciones de hidrólisis enzimática de almidón de yuca fueron: αamilasa (Liquozyme® SC DS) a pH 5.0, temperatura de 80°C, dosificación de enzima % (p/p)
0.0280; con glucoamilasa (Spirizyme® Fuel) pH 4.5, temperatura 70°C, dosificación de enzima
% (p/p) 0.0631; y finalmente la mezcla enzimática α-amilasa y glucoamilasa (STARGEN™ 001)
pH 4.5, temperatura de 46 °C, dosificación de enzima 0.023% (p/p).
Palabras claves: Almidón de yuca, Hidrólisis enzimática de almidón, Alfa-amilasa,
Glucoamilasa, Yuca
Abstract: Enzymatic hydrolysis of starch for producing glucose syrups were evaluated at
laboratory scale. Enzymes provided from Novozymes and Genecor International were compared.
Alpha-amylase from Bacillus licheniformis (Liquozyme® SC DS from Novozymes), in a range
of pH 5.7 - 6.0, temperature 82-86 ° C, enzyme dosage % (w/w) 0.013-0.025; and also
glucoamylase of the Aspergillus niger (Spirizyme® Fuel of Novozymes), in a range of pH of 3.55.5 , temperature 32-70 ° C, enzyme dosage % (w/w) 0.04-0.06; and finally the enzyme mixture
of fungal α-amylase and Aspergillus Kawachi glucoamylase of Aspergillus niger (STARGEN™
001 of International Genecor), in a range of 3.0-4.5 pH, fermentation temperature of 20-40 ° C,
enzyme dosage of 1.0-2.5 kg / MT of dry grain were evaluated. The 3.5-dinitrosalicylic acid
(DNS), glucose oxidase and Bradford analytical methods were used to measure and determine
dextrose equivalent (ED) and enzyme activity, glucose concentration and protein concentration,
respectively. It was found that the best conditions for the enzymatic hydrolysis of cassava starch
were: α-amylase (Liquozyme® SC DS) at pH 5.0, temperature at 80 °C, enzyme dosage of
0.0280 % (w/w); and with glucoamylase (Spirizyme® Fuel) at pH 4.5, temperature at 70 ° C,
enzyme dosage 0.0631 % (w/w); and finally enzymatic mixture of α-amylasee and glucoamylase
(STARGEN™ 001) at pH 4.5, temperature 46 ° C, and enzyme dosage of 0.023% (w/w).
Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009
Keywords: Cassava starch , Starch, Enzymatic starch hydrolysis; alpha-amylase, glucoamylase,
Cassava
1. INTRODUCCIÓN
La amenaza mundial del agotamiento de los recursos energéticos no renovables, el aumento de
los requerimientos energéticos y el constante incremento de los gases contaminantes a la
atmósfera, han llevado a la búsqueda de nuevas fuentes de energía de fácil acceso, seguras y
efectivas [1].
La hidrólisis enzimática del almidón, consiste de tres etapas: gelatinización, licuefacción y
sacarificación, que requieren ser optimizadas para las diferentes materias primas. La
gelatinización, es requerida para aumentar la accesibilidad al sustrato.
Posterior a la gelificación del almidón, la licuefacción es lleva a cabo con la enzima α-amilasa,
que hidroliza enlaces α-(1-4) fragmentando las cadenas de almidón produciendo dextrinas,
maltosa, maltotriosa y maltopentosas, con equivalentes de dextrosa (ED) menores a 30, lo que
permite la reducción rápida de la viscosidad de la solución [2][3]. Para evitar la retrogradación
(agregación y parcial cristalización de las moléculas) sufrida por las geles de almidones al bajar
la temperatura, se utilizan para la hidrólisis amilasas termofílicas, las cuales pueden ser derivadas
de enzimas mesofílicas por modificaciones químicas o mutagénesis de α-amilasas termofílicas
naturales[3].
Enzimas de bacterias termorresistentes como Bacillus licheniformis o B. amyloliquefaciens, son
ideales para la etapa de licuefacción que son realizadas a altas temperaturas (80-110°C). La
sacarificación se lleva a cabo a menores temperaturas (60-70ºC) y se utilizan enzimas como la
glucoamilasa (amiloglucosidasas) obtenidas de Aspergillus niger o de Rhizopus sp., las cuales
hidrolizan los enlaces α-(1-4) y α-(1-6) de los fragmentos de almidón obteniéndose como
productos jarabes de maltosa o jarabes de D-glucosa con ED alrededor de 40 y 96,
respectivamente [1][2][4][5].
Por ser solubles, estas enzimas son a menudo inhibidas por sustratos o productos de reacción, por
lo que la identificación y la optimización de las variables que afectan positiva o negativamente
la actividad enzimática mejora la viabilidad de estos procesos biotecnológicos. Las condiciones
que pueden afectar los sitios activos de la enzima utilizada son: temperatura, pH, tiempo de
reacción, concentración enzimática, viscosidad, velocidad de agitación, concentración de
productos hidrolizados, concentración de iones Ca+2, debido a que algunas enzimas resultan ser
calcio dependientes para su activación. [3][6][7].
El reciente desarrollo enzimático ha provisto el procesamiento de almidones de técnica y
economía. [2] Baks et al.(2008) [8], compararon rendimientos de producción de glucosa al tratar
a altas temperaturas y presiones con la misma enzima almidón en la etapa de gelatinización.
Encontraron un alto nivel de dextrosa al tratar el almidón a altas temperaturas más que a altas
presiones, aunque no tanto como en la hidrólisis del almidón nativo (sin gelatinizar). Estos
resultados se deberían a la diferencia estructural del almidón. [9].
Teniendo en cuenta que el almidón en su estado nativo es insoluble en agua, y resistente a las
reacciones químicas y enzimáticas, es conveniente realizar previamente procesos hidrotémicos de
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gelatinización. [10]. Sin embargo, el alto consumo energético de este proceso genera un aumento
del costo de producción. [11]
Este trabajo tuvo por objeto la búsqueda de las mejores condiciones para la obtención de jarabes
de azúcares fermentables por medios enzimáticos a partir del almidón de la yuca, utilizando
enzimas nativas y comerciales no específicas para esta materia prima.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Obtención de la materia prima
El almidón se obtuvo de la planta productora de harina de yuca de la Ganadería Manzanarez y
Cia Ltda., con una humedad de 7.8%. Las enzimas fueron donadas por los distribuidores
especializados Novozymes y Merquiand Ltda. (Genecor S.A).
2.2 Pre-tratamiento del almidón de yuca
El almidón de yuca fue pre-tratado térmicamente, [9] disolviendo el almidón en una solución
buffer de acetato de sodio 0.016M a escala de laboratorio, a un pH inicial de 4.0, y calentando a
66°C [12] (temperatura de gelatinización) en un baño de agua por 30 minutos.
2.3 Hidrólisis enzimática del almidón de yuca.
2.3.1 Licuefacción del almidón de yuca
Se utilizó la α-amilasa, (Liquozyme® SC DS de Novozymes) para la obtención de las dextrinas
del almidón de yuca. En todas las etapas incluyendo la descrita, se estudiaron variables como
relación de la concentración enzima/sustrato, el pH, la temperatura, y concentración de sustrato.
Para medir su grado de conversión del almidón a dextrinas [13] (Figura 1), se determinaron los
azúcares reductores, los cuales se reportaron en términos de actividad enzimática y de
equivalentes de dextrosa (ED), de los productos, por el método colorimétrico del ácido 3,5dinitrosalisilico (DNS) [14], usando un espectrofotómetro UV visible Genesys 20, por espacio de
30 minutos a diferentes intervalos de tiempo.
Figura 1. Hidrólisis enzimática del almidón, tomado de Ochoa et al. [13]
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2.3.2 Sacarificación
Se utilizó la glucoamilasa, (Spirizyme® Fuel de Novozymes), para producción de jarabes de
glucosa a partir de las dextrinas (Figura 1) obtenidas en el paso anterior, teniendo en cuenta las
variables: temperatura, pH y relación de la concentración enzima/sustrato. [13]
Por último, se determinó la eficiencia en el proceso de conversión de las dextrinas a glucosa en
unidades de mg/ml, por medio del método colorimétrico de la glucosa-oxidasa. [15] Durante el
proceso total de la hidrólisis se mantuvo la agitación a 390 rpm desde el pre-tratamiento térmico.
2.4 Licuefacción y sacarificación simultaneas
Para este proceso, se trabajó con el almidón nativo (sin gelatinizar), disuelto en agua destilada,
con la adición de la mezcla enzimática α-amilasa y glucoamilasa (STARGEN™ 001), para la cual
se estudiaron las mismas variables, con los mismos métodos que el punto 2.3. El monitoreo se
realizó por espacio de 180 minutos en intervalos de 30 minutos, manteniendo la agitación de 390
rpm y 37°C en un baño de agua.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Hidrólisis enzimática del almidón de yuca.
3.1.1 Efecto de la relación enzima / sustrato en la hidrólisis enzimática
En el estudio de las variables, se comenzó con la búsqueda de la mejor relación enzima/sustrato,
para la medición del proceso. Después de que se probó con varias relaciones como se muestra en
Figura 2A, se concluyo que la que permitió la mejor velocidad de reacción y por ende la mejor
condición de trabajo fué: 0.0280% (p/p) para la enzima de Novozymes, encargada de la
licuefacción.
A
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B
C
Figura 2. Equivalentes de dextrosa como función de la relación enzima/sustrato en la hidrólisis
enzimática, A. Licuefacción. B. Sacarificación. (pre-gelatinizado, Buffer acetato de sodio 0.016M
pH= 4.0, [sustrato] = 10% (p/p) y 66°C). C. Licuefacción-sacarificación simultaneas (Agua
destilada a pH= 4.0, [sustrato] = 10% (p/p) y 37°C).
De 0.0631 % (p/p), (Figura 2B) para el proceso de sacarificación, bajo las condiciones
mencionadas y de 0.023 % p/p, (Figura 2C) para la mezcla enzimática de Genecor S.A,
relaciones que son menores comparadas con los datos reportados por Castaño y col. (2008) [16] y
las fichas técnicas [17][18][19].
3.1.2 Efecto de la temperatura
Los valores de temperatura que fueron usados en la experimentación oscilaron entre los 30 y
86°C dependiendo del rango recomendado por las fichas técnicas de las enzimas [17][18][19]. El
pH inicial de trabajo se mantuvo en 4.0 (Figura 3), mostrando el marcado y significativo efecto
de la temperatura de reacción de 80°C para Liquozyme® SC DS, de 70 °C para Spirizyme® Fuel
(amilasa y glucoamilasa de Novozymes) y de 47°C para la mezcla enzimática STARGEN™ 001,
sobre la reactividad enzimática (constante catalítica).
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A
B
C
Figura 3. Actividad enzimática como función de la temperatura en la hidrólisis enzimática, A.
Licuefacción. B. Sacarificación. (pregelatinizado, Buffer acetato de sodio 0.016M pH= 4.0,
[sustrato] = 10% (p/p) y 0.0280% (p/p) para A y 0.0631% (p/p) para B) C. Licuefacciónsacarificación simultaneas (Agua destilada a pH= 4.0, [sustrato] = 10% (p/p), 0.023% p/p).
Sin dejar de lado la actividad termofílica de algunas de estas enzimas, al aumentar la
temperatura, la actividad enzimática disminuye de manera más rápida, por lo cual los procesos
de licuefacción no son muy largos, al igual que por encima de su temperatura óptima de reacción,
pueden sufrir desnaturalización irreversible e inactivación (Figuras 3A y 3C) [20].
3.1.3 Efecto del pH
El efecto del pH en la acción enzimática es causada por la ionización reversible tanto del sustrato,
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como de los residuos aminoacídicos de la enzima, manifestándose en el cambio de la actividad
enzimática, la estabilidad o en el equilibrio de la reacción [5].
Se estudió el efecto del pH en la actividad enzimática sobre la hidrólisis del almidón de la yuca,
probando con valores de pH de 0.5 por encima y por debajo de los reportados en las fichas
técnicas [17][18][19]. (Figura 4). Se fijaron como pH de trabajo los valores en los que las
enzimas adquieren el estado de ionización que le brinda mayor actividad enzima [20]. Se trabajó
con valores de pH 5, 4.5 y 4.5 para; la licuefacción, sacarificación y licuefacción-sacarificación
simultáneas, respectivamente. Estos valores son muy similares a los valores de trabajo
encontradas en otros estudios para las mismas enzimas. [16][11].
A
B
C
Figura 4. Actividad enzimática como función de la temperatura en la hidrólisis enzimática, A.
Licuefacción. B. Sacarificación. (pregelatinizado, Buffer acetato de sodio 0.016M, [sustrato] =
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10% (p/p), 66°C y 0.0280% (p/p) para A y 0.0631% (p/p) para B) C. Licuefacción-sacarificación
simultaneas (Agua destilada, [sustrato] = 10% (p/p), 0.023% (p/p) y 37°C).
3.1.4 Efecto de la concentración del sustrato
Finalmente, al estudiar el efecto de la concentración del sustrato en la actividad enzimática, como
se muestra en la Figura 5, y manteniendo constante la cantidad de enzima adicionada, se observa
la disminución la actividad de la enzima en el mismo tiempo de reacción. Esto pudo deberse a
una posible limitación difusional durante el proceso de hidrólisis [7], provocado por un aumento
de la viscosidad, tal y como se ha reportado en estudios donde se trabaja a altas concentraciones
de almidón [8].
A
B
Figura 5. Actividad enzimática como función de la concentración de sustrato en la hidrólisis
enzimática, A. Licuefacción (pregelatinizado, Buffer acetato de sodio 0.016M pH= 4.0, 66°C y
0.0280% (p/p)) B. Licuefacción-sacarificación simultaneas (Agua destilada a pH= 4.0, 0.023%
(p/p) y 37°C).
Por lo anterior, se escogió trabajar con las enzimas de Novozymes en una concentración máxima
de 20% (p/v), y para la enzima de Genecor del 25% (p/v).
Se mantuvo la agitación a 390 rpm desde el pre-tratamiento térmico durante el proceso total de la
hidrólisis de almidón. Dicha agitación no es tan alta para que pueda afectar la actividad
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enzimática provocada por las fuerzas generadas en el fluido [20], ni tan baja que no permita la
transferencia de sustratos y transporte entre las fases[7].
4. CONCLUSIONES
Se concluyó experimentalmente que las mejores condiciones de reacción para estas enzimas,
utilizando almidón de yuca como sustrato son: α-amilasa (Liquozyme® SC DS) a pH 5.0,
temperatura de 80°C, dosificación de enzima 0.0280 %(p/p); con glucoamilasa (Spirizyme®
Fuel) a pH 4.5, temperatura de 70°C, dosificación de enzima 0.0631 % (p/p) y finalmente para la
mezcla enzimática α-amilasa y glucoamilasa (STARGEN™ 001) pH 4.5, temperatura de 46 °C,
dosificación de enzima 0.023% (p/p).
5. REFERENCIAS
[1] Sánchez Ó. J & Cardona C. A. (2005).“Producción biotecnológica de alcohol carburante I:
obtención a partir de diferentes materias primas”. INCI. [online]. vol.30, no.11 [citado 9 Agosto
2008 y 17 Agosto de 2009], p.671-678. Disponíble en World Wide Web:
<http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S037818442005001100005&lng=pt&nrm=iso>. ISSN 0378-1844.
[2] Plácido M. G. R, Rodrigues do Canto L, & Amante E. R. (2005). ”Cassava And Corn
Starch In Maltodextrin Production”. Quim. Nova, Vol. 28, No. 4, 596-600.
[3] Leveque E, Janecek S, Haye B & Belarbi A. (2000). “Termophilic archaeal amylolytic
enzymes”. Review. Enzyme and Microbial Technology 26, 3-14.
[4] Morales S, Alvarez H & Sanchez C. (2008). “Dynamic models for the production of glucose
syrups from cassava starch.” Short communication. Food and bioproducts processing 86, 25 – 30
[5] Nagodawithana T & Reed G. (1993). “Enzymes In Food Processing” Third edition.
Diego New York Boston Academic press, Inc. Harcourt Brace & company. pag 122
San
[6] Ozbek B & Yuceer S. (2001). “α-Amylase inactivation during wheat starch hydrolysis
process”. Process Biochemistry 37, 87–95
[7] Kilic A. D & O¨Zbek B. (2005). “α-Amylase inactivation during rice starch hydrolysis”.
Process Biochemistry. 40, 1367–1379
[8] Baks T, Kappenb F. H. J, Janssen A. E. M & Boom R. M. (2008). “Towards an optimal
process for gelatinisation and hydrolysis of highly concentrated starch–water mixtures with
alpha-amylase from B. licheniformis”, Journal of Cereal Science. 47, 214–225
[9] Baks T, Bruins M. E, Matser A. M, Janssen A. E. M & Boom R. M. (2008). “Effect of
Gelatinization and Hydrolysis Conditions on the Selectivity of Starch Hydrolysis with αAmylase from Bacillus licheniformis”. J. Agric. Food Chem. 56, 488–495
Universidad del Quindío - 9, 10 y 11 de septiembre– Armenia, Colombia
9
Memorias del IV Simposio de Química Aplicada – SIQUIA 2009
[10] Morales S. Y & Sanchez P. I. A. (2004). “Diseño conceptual y comparación técnica de los
procesos de hidrólisis ácida y enzimática para la producción de glucosa a partir de almidón de
yuca”. Tesis de pregrado en Ingeniería Química. Universidad Industrial de Santander,
Bucaramanga, Colombia.
[11] Shariffaa Y.N, Karima A.A, Fazilaha A & Zaidulb I.S.M.. (2009). “Enzymatic hydrolysis of
granular native and mildly heat-treated tapioca and sweet potato starches at sub gelatinization
temperature”. Food Hydrocolloids. 23,434- 440
[12] Sandoval A A P, Farhat I & Fernández Q. A. (2007). “Comportamiento reológico de
harinas y almidones de yuca (manihot esculenta crantz) durante un proceso de extrusión”. Vitae,
Revista De La Facultad De Química Farmacéutica. Volumen 14 número 1, año 2007.
Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. págs. 6-15
[13] Ochoa S, Yoo A, Repke Jens-Uwe, Wozny G, & Yan D. R (2007). “Modeling and
Parameter Identification of the Simultaneous Saccharification Fermentation Process for Ethanol
Production” Biotechnol. Prog. 23, 1454−1462
[14] Whistler. Roy L. Smith, Robert J, Be Miller, James N. Y Wolfrom, M.L. (1964). Methods
in Carbohydrate Chemistry, Starch.1994. volumen IV. Academic Press. New York Pagina 67
[15] FICHA de aplicación del producto. Biosystems
[16] Castaño P H. I & Mejía G .C. E, “producción de etanol a partir de almidón de yuca
utilizando la estrategia de proceso sacarificación- fermentación simultáneas (SSF)”. (2008).
Vitae, Revista de la facultad de química farmacéutica. Volumen 15 número 2, págs. 251-258,
Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
[17] FICHA
Novozymes
de datos del producto LIQUOZYME® SC DS y FICHA de aplicación.
[18] FICHA de datos del producto SPIRIZYME® FUEL y FICHA de aplicación. Novozymes
[19] FICHA de datos del producto STARGEN™ 001 y FICHA de aplicación. Genecor
[20] Illanes F. A. (1994) “Biotecnología de enzimas”. Ediciones universitarias de la universidad
católica de Valparaíso. Chile. Monografía No 35
6. AGRADECIMIENTOS
Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia por su apoyo económico para el
desarrollo de esta investigación (Proyecto No 2007D3321-639). A las casas comerciales
Novozymes y Genecor International, por la donación de las enzimas.
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