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Publicación Previa al
VIII Congreso Nacional de Acuicultura
(Santander, mayo 2001)
Estudio preliminar de interacciones
genéticas y virulencia en una coinfección
interserotípica del virus de la Necrosis
Pancreática Infecciosa
Rodriguez, S.; Roddom, O.; Guaita, L. y Pérez-Prieto, S.
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), c/ Velazquez 144, 28006 Madrid (España)
Introducción
El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es un aquabirnavirus que
ha sido aislado en diferentes especies de peces teleosteos tanto en el medio
ambiente natural como en entornos de piscicultura (Souter et al. 1986, 1992 ;
Rivas et al. 1993; Shankar and Yamamoto 1994). Es el agente causal de una
enfermedad propia de salmónidos en especial de trucha arco iris
(Onchorhynchus mikiss) cultivada y es responsable de importantes pérdidas
económicas en aquellos países dedicados a la acuicultura continental. En España
es el virus de mayor prevalencia (Ledó et al.1990; Rodríguez et al.1994). Este
virus posee una gran variabilidad existiendo múltiples cepas que difieren en
virulencia y en su capacidad de producir respuesta inmune (Wolf 1988).
Actualmente se acepta la clasificación en 10 serotipos (Hill and Way 1995) y se
sabe poco de los perfiles moleculares asociados a factores de virulencia.
El IPNV es muy simple y extraordinariamente estable y posee al menos 4
proteínas codificadas por dos segmentos de RNA, A y B, de doble cadena. El
segmento B codifica la proteína VP1, la RNA polimerasa del virus. El fragmento
A del RNA codifica tres proteínas que se producen como una poliproteína
precursora que se escinde para proporcionar la proteína mayoritaria de la cápsida
(VP2), una proteína no estructural (NS) y la proteína estructural más interna
(VP3) (Duncan y Dobos,,1986; Duncan et al 1991).
La presencia simultánea de serotipos de virus distintos podrían ocasionar como
en otros virus coinfecciones en las que coexistan poblaciones víricas mixtas o se
produzcan reapareamientos interserotípicos del RNA bisegmentado, que puede
resultar en aumento o pérdida de virulencia. Pese a su interés, no han sido
abordados este tipo de estudios en virus de importancia para la acuicultura.
En este trabajo hemos iniciado el estudio de las posibles interacciones genéticas
que se establecen entre los dos serotipos IPNV Sp y Ab y la virulencia de estas
co-infecciones virales en trucha arco-iris.
En una primera aproximación experimental, se crearon infecciones mixtas in
vitro entre los virus IPN Sp y Ab. Para determinar el tipo de interacción,
interferencia o reordenación de segmentos genómicos (reassortment), que se
establecen entre los dos serotipos se están estudiando: 1) la capacidad de
inhibición de un virus por el otro in vitro. 2) Las características del genoma viral.
3) La virulencia en trucha arco-iris.
Material y métodos
Cultivos celulares:
Se han utilizado células BF-2 (células de pedúnculo de carpa) procedentes
de la American Type Culture Collection (ATCC- CCL-91) cultivadas en
monocapa a 25ºC en medio L15 (Gibco) suplementado con suero fetal
(10%), glutamina y aminoácidos no esenciales (1%).
Virus:
Se utilizaron los virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN) serotipo
Sp (ATCC VR-1318) y serotipo Ab (ATCC VR-1319) y diversos aislados
españoles de ambos serotipos.
Peces:
Poblaciones de trucha arco-iris de tres meses procedentes de instalaciones
con historial sanitario libre de IPNV. Los animales se mantuvieron en
acuario de 350 l con temperatura controlada (Living stream System,
Toledo, Ohio) y se transfirieron a acuarios de 40 l, en un sistema múltiple
de temperatura regulada durante los experimentos de infección.
Los métodos utilizados en este trabajo fueron:
1. Determinación del título infectivo por dosis infectiva 50% en cultivos
celulares (TCID50) adaptado de Reed and Muench (1938).
2. Indice de Neutralización, (IN), determinado por el ensayo de reducción del
título infectivo con sueros policlonales anti-IPN Sp y Ab.
3. Inmunofluorescencia indirecta por citometria de flujo utilizando antisueros
específicos como primer anticuerpo, y conjugados comerciales de
fluoresceína (Rodríguez et al. 1991)
4. Técnica de transcriptasa inversa (RT) y reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
El RNA total se extrajo de células infectadas siguiendo el método del tiocianato
de guanidina descrito por Chomczynski and Sacchi (1987). Para la síntesis de
cDNA se utilizó el protocolo proporcionado por la casa comercial (First strand
synthesis kit for RT-PCR, Amersham) La amplificación de cDNA se realizó
según el kit comercial GeneAmp PCR (Perkin-Elmer). Las reacciones se
sometieron a ciclos de amplificación en un termociclador modelo 480 (Perkin
Elmer Cetus). Los fragmentos de DNA amplificados se analizaron en geles de
agarosa teñidos con bromuro de etidio. Los cebadores se seleccionaron a partir
de las secuencias de nucleótidos publicadas de los genes que codifican la
proteína VP2 del virus IPN (Havarstein et al.,1991). Los oligonucleótidos
seleccionados fueron sintetizados por El Servicio de Química de Proteínas del
Centro de Investigaciones.
Establecimiento de coinfecciones "in vitro":
Se prepararon los virus de referencia IPNV Sp y Ab y sus mezclas diluidos en
medio sin suero, de forma que se obtuvieran los inóculos con las siguientes dosis
infectivas:
Sp, 1x 105 TCID50/ml
Ab, 1x 105 TCID50/ml
Sp:Ab (1:1), 1x 105 TCID50/ml de ambos virus
Sp:Ab (1:10), 1x105 TCID50/ml de Sp 1x106 TCID50/ml de Ab
Sp:Ab (1:100) 1x105 TCID50/ml de Sp y 1x 107 TCID50/ml de Ab.
Los inóculos se titularon, se neutralizaron y se calcularon los índices de
neutralización (IN) y de inespecificidad de los antisueros respecto al
serotipo. Paralelamente se infectaron monocapas de células BF-2 (frascos
de 25 cm2, Falcon) y se inició una serie de tres pases sucesivos de la
coinfección Sp: Ab y sus controles de virus de referencia en infección
simple. Cada pase fue recogido cuando los efectos citopáticos (CPE)
fueron máximos y los virus se titularon, se identificaron por
seroneutralización y por RT-PCR y se calcularon los IN respectivos.
Establecimiento de coinfecciones "in vivo":
La virulencia de los virus se determinó mediante las curvas de mortalidad
en infecciones simples (controles de IPNV Sp y Ab) y mixtas, y la
mortalidad acumulativa durante 35 días, en grupos de alevines de trucha
arco-íris. Los animales se infectaron por inmersión con 5 x 105 TCID50/ml
de virus (IPN Sp, Ab y Sp-Ab) en un volumen de 500 ml de agua aireada
por difusores. Después de 4 horas de infección, los peces se colocaron en
acuarios de 40 litros de agua declorada con temperatura controlada a 14°C
durante el tiempo del experimento (35 días). Diariamente se retiraron los
animales muertos, se procesaron para el aislamiento viral en vísceras
según los protocolos de Amos (1985) y se identificaron los virus aislados
por seroneutralización y RT-PCR . A los animales supervivientes se les
extrajeron leucocitos del riñón anterior y se cuantificaron los antígenos
virales por inmunofluorescencia indirecta por citometria de flujo y RTPCR.
Resultados y discusión
Para determinar el tipo de interacción, interferencia o reordenación de segmentos
genómicos (reassortment), que se establecen entre los virus IPN Sp y Ab se
crearon infecciones mixtas in vitro a diferentes proporciones 1:1; 1:10 y 1:100 .
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Títulos infectivos e índices de neutralización de coinfecciones de IPNV SP y AB en pases sucesivos.
Mezcla de serotipos.
Pase cero
Titulo Infectivo (log TCID50/ml)
Virus
Virus sin neutralizar
Indice de Neutralización
Virus Neutralizado con
Anti Sp Anti Ab
Sp
Ab
IPN Sp 1/1000
8
0
7
8
1
IPN Ab 1/1000
8
7
2
1
6
Sp:Ab (1:1)
8
2
2
6
6
Sp:Ab (1:10)
8
0
2
6
6
Sp:Ab (1:100)
8
2
2
6
6
Pase 1
Titulo Infectivo (log TCID50/ml)
Indice de Neutralización
Virus
Virus sin neutralizar
Virus Neutralizado con
Anti Sp Anti Ab
Sp
Ab
IPN Sp 1/1000
7
1
4
6
3
IPN Ab 1/1000
8
7
1
1
7
Sp:Ab (1:1)
8
2
2
6
6
Sp:Ab (1:10)
8
4
2
4
6
Sp:Ab (1:100)
8
6
4
2
6
Pase 2
Titulo Infectivo (log TCID50/ml)
Virus
Virus sin neutralizar
Indice de Neutralización
Virus Neutralizado con
Anti Sp Anti Ab
Sp
Ab
IPN Sp 1/1000
7
1
4
6
3
IPN Ab 1/1000
8
7
1
1
7
Sp:Ab (1:1)
8
5
3
3
5
Sp:Ab (1:10)
8
0
5
8
3
Sp:Ab (1:100)
8
8
7
0
1
Pase 3
Titulo Infectivo (log TCID50/ml)
Virus
Virus sin neutralizar
Indice de Neutralización
Virus Neutralizado con
Anti Sp Anti Ab
Sp
Ab
IPN Sp 1/1000
7
1
4
6
3
IPN Ab 1/1000
8
7
0
1
8
Sp:Ab (1:1)
8
8
7
0
1
Sp:Ab (1:10)
8
8
7
0
1
Sp:Ab (1:100)
8
8
7
0
0
En el pase cero (son los inóculos originales), el índice de neutralización muestra
las relaciones antigénicas de afinidad serotípica: a mayor IN, mayor relación de
serotipo. Las reacciones cruzadas inespecíficas son de un logaritmo (IN 1) para
el Sp respecto al Ab y 2 logaritmos (IN 2) la viceversa. En el pase 1 se
mantienen niveles infectivos altos de los virus Sp y Ab en infección simple, y en
la coinfección 1:1 se mantienen igualados los niveles infectivos de ambos
serotipos, tal como aparecían en el inóculo original (tabla I,pase 0). El IPNV Sp
disminuye a medida que se aumenta la dosis infectiva del serotipo Ab en el
inóculo coinfectado.
En el pase 2 los IN de los serotipos Ab y Sp en la coinfección indican que ambos
están presentes, en mayor cantidad el Ab (IN 5) que el Sp (IN 3). Pero en el pase
3, no es posible reconocer ninguno de los serotipos de la coinfección. Los virus
control en infección simple mantienen sus IN respectivos, pero las coinfecciones
Ab:Sp, aunque rinden títulos infectivos altos (1x108 TCID 50/ml), presentan
valores de 1 o 0 como IN, lo que indica que los antisueros no reconocen al virus.
Estos resultados sugieren que tras 3 pases sucesivos en coinfección, la
recombinación de hebras de RNA entre los dos serotipos podría dar lugar a
poblaciones de virus mixtas con alteraciones en la proteína VP2 o a la formación
de quimeras. Esta hipótesis queda reforzada por los resultados obtenidos con la
RT-PCR. En la figura 1 se observa que es posible detectar los productos
esperados en los virus de referencia (infecciones simples) y en el pase 1 de la
coinfección Sp: Ab, pero a partir del segundo pase no se detectan los productos
esperados en la coinfección, ni, por PCR directa o anidada, lo que podría indicar
una alteración en las zonas genómicas correspondientes a los cebadores externos
e internos diseñados para la VP2.
Figura 1: RT-PCR de IPNV Sp y Ab y de coinfecciones Sp:Ab
en pase 1
Líneas:
(1) Control
(2) IPN Sp
(3) IPNV Ab
(4) Sp:Ab (1:1)
(5) Sp:Ab (1:10)
(6) Sp:Ab (1:100)
Experimentos "in vivo":
Para estudiar la cinética de la coinfección de serotipos "in vivo" y su virulencia,
se realizaron experimentos similares a los descritos in vitro, en alevines de
trucha arco iris.
Previamente se reactivaron las cepas de los serotipos Ab y Sp mediante pases en
trucha y se determinó la edad óptima para la infección.
Los resultados (figura 2) indican que las mortalidades acumulativas a los 33 días
PI son similares en los virus control en infección simple, tanto del serotipo Sp
(60%) como del Ab (65%) y se producen entre los días 13 y 33 PI. En la
coinfección Sp:Ab, el comienzo de mortalidad es mas temprano, a los 11días PI
y va aumentando hasta los 17 días PI, alcanzando un 70% (figura 3). En el pase
2 se mantiene en los mismos días la aparición y evolución de mortalidad, que se
reduce hasta un 50%.. Por el contrario en el pase 3 se recupera la franja de
mortalidad mas prolongada, entre los 11 y 33 días PI, con un 60% de mortalidad
acumulativa final, similar a las de los virus en coinfección simple.
Figura 2: Mortalidad Acumulativa de truchas inoculadas con virus IPN Sp, Ab y coinfecciones Sp:Ab
Los resultados de la identificación de virus aislados en los peces muertos
procesados de los distintas muestras y la identificación de serotipos basada en
sus IN, se resume en la Tabla 2.
Los resultados se expresan como log del índice de Neutralización (IN) calculado
según la fórmula: log IN= log (Titulo de virus sin neutralizar (TV) - Título de
virus tratado con el antisuero (TN)).
Tabla 2: Indices de neutralización de los virus aislados de tejido de peces inoculados con IPNV.
Titulo Infectivo log TCID50/ml*
Virus sin neutralizar
Virus Neutralizado con
Anti Sp IN
Anti Ab IN
IPN Sp
8
1
7
7
1
IPN Ab
8
6
2
6
2
1:1 Pase 1
6
2
4
5
1
1:1 Pase 2
6
1
5
5
1
1:1 Pase 3
8
2
6
6
2
* Los títulos indicados son los valores promedio de tres muestras de cada grupo.
De acuerdo con estos valores y desde el punto de vista antigénico, todos los
virus recuperados en los experimentos "in vivo" pertenecen al serotipo Sp.
Esta aparente contradicción con los resultados obtenidos "in vitro" podría
explicarse porque la infección en un organismo vivo implica numerosos órganos
y es posible que se seleccione el serotipo de IPNV más virulento, o que presenta
un ciclo replicativo mas eficaz. Existe además la posibilidad de que el
"reassortment" pueda ser mayor en un sistema artificial como es un cultivo de
células de línea.
Por otra parte no se ha estudiado si existen diferencias de tropismo orgánico a
nivel de serotipo en Birnavirus.
En cuanto a los supervivientes a la infección, la presencia de virus en los
animales sin sintomatología clínica a los 35 días PI se determinó por
cuantifiación de antígenos virales en leucocitos del riñón anterior procesados por
citometría de flujo. Los resultados (Figura 3) indican que el número de células
que expresan antígenos virales es muy pequeño en general (entre el 0.5 y el
9.8%) salvo en el caso del pase 2 de la coinfección, que alcanza un 29.5%. Este
bajo nivel de virus se corrobora por los resultados obtenidos con el ensayo de
PCR en el que los resultados fueron negativos tanto con RT-PCR como con
nested_PCR.
Figura 3: Leucocitos de trucha arco iris supervivientes a una infección por virus IPN Sp,
Ab y coinfecciones Sp:Ab en pases 1,2 y 3
Los datos aquí presentados son insuficientes para sacar conclusiones pero la
persistencia o no de los serotipos en coinfección en animales portadores, merece
ser investigada con mayor detalle.
Los virus son capaces de inhibir no sólo la síntesis de macromoléculas celulares,
sino también la replicación de virus homólogos o heterólogos en coinfección. La
habilidad de un virus para inhibir el crecimiento de otro se denomina
interferencia viral y ha sido descrita en numerosos géneros de virus de
mamíferos desde la década de los 70, pero no se conocen bien los mecanismos
moleculares concretos que median en la inhibición.
En peces Teleósteos, apenas se ha iniciado este tipo de estudios. Hay
descripciones de coinfecciones entre el virus de la necrosis pancreática
infecciosa (IPNV) y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) en
Salmónidos (LaPatra et al 1993; Rodriguez et al 1995) en las que están
implicados virus de familias distintas, y en ellas se produce interferencia de un
virus sobre el otro, a niveles tan altos que incluso uno de los virus desaparece.
En trabajos previos, nuestro grupo ha planteado el primer estudio molecular
sobre la interferencia de estos virus en coinfección (Alonso et al 1999a y b).
Otras descripciones sobre coinfecciones señalan interferencia entre reovirus y
herpesvirus del pez gato (Chinchar et al. 1998)y en trucha arco-iris, se ha
descrito resistencia a rhabdovirus, mediada por un reovirus (LaPatra et al 1995)
o por el birnavirus IPNV (deKinkelin et al 1992).
En el caso que aquí describimos, el estudio de ciclo de replicación de la muestra
IPNV Sp-Ab coinfectada en comparación con los ciclos de los virus implicados,
no indica la existencia de interferencia en una primera fase, pudiendo detectarse
ambos serotipos en al menos dos pases sucesivos de la coinfección in vitro. La
seroneutralización con anticuerpos policlonales proporciona unos datos
aproximativos pero no permite identificaciones exactas debido a las reacciones
cruzadas entre antisueros, Por ello hemos diseñado un sistema comparativo de
RT-PCR para amplificar 3 zonas genómicas correspondientes al segmento A del
genoma, a fragmentos de genes de la proteínas VP2, VP2-NS y N-VP3, siendo
esto último el que ofrece mayor grado de variabilidad en las cepas españolas del
serotipo Ab. Mediante este sistema y la definición de los perfiles electroforéticos
resultantes del corte de productos de PCR con enzimas de restricción, estamos
analizando (datos no mostrados) las muestras de los experimentos de la
coinfección in vitro e in vivo, para definir perfiles de serotipo y comparar los
resultados obtenidos por perfiles antigénicos y genéticos.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Comunidad de Madrid la subvención del proyecto
07B/22/98, cuyos fondos permitieron este trabajo.
Bibliografía
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Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 13 (especial VIII Congreso Nacional de Acuicultura), mayo 2001