Download técnica no invasiva para el estudio del cultivo y la diferenciación

TÉCNICA NO INVASIVA PARA EL ESTUDIO DEL CULTIVO Y LA
DIFERENCIACIÓN CELULAR MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE
PARÁMETROS MORFOMÉTRICOS EN IMÁGENES DIGITALES
Marcela Delannoy1,2, Sébastien Hupont3, Alicia Fontana1, Miguel Oliveros1,
Dominique Dumas3, Jacques Magdalou4, Bibiana Riquelme1,2
1 Área Física, FCByF (UNR) - Rosario, Argentina
2 Grupo de Óptica Aplicada a la Biología, IFIR (CONICET-UNR) – Rosario, Argentina
3 UMR7561 PPIA - FR3209 CNRS, PTIBC IBISA – Nancy, Francia
Suipacha 531, Rosario.marceladelannoy@hotmail.com
El objetivo de este trabajo es validar una técnica de procesamiento de imágenes para
proporcionar información cuantitativa relativa a cambios en el metabolismo, la
proliferación y la morfología de las células madres, basada en QWLSI (4-Wave Lateral
Shearing Interferometry - interferometría de ondas quadri-corte lateral) combinada con un
microscopio convencional de transmisión de luz blanca. La principal ventaja de esta técnica
es que se pueden examinar las células vivas en su estado natural, monitoreando la variación
en cambios de fase locales dentro de las células durante las etapas tempranas de
diferenciación. Para el análisis de las imágenes se utilizó el programa de circulación libre
ImageJ, con el cual se pudieron evaluar características representativas en la evolución de las
células, tales como dimensiones, relación entre área y perímetro, relación entre área real y
área convexa, relación entre los ejes mayor y menor, etc. En este proyecto, consideramos
que el uso de QWLSI combinado con un microscopio convencional de transmisión de luz
blanca por lo general utilizados para la inspección de cultivo celular (de rutina). No hay
necesidad de alineación óptica y es insensible a las vibraciones y adecuado con cualquier
tipo de iluminación (halógeno, lámpara, láser, LED).
Palabras clave: células madres, diferenciación celular, imágenes digitales, contraste de fase.
INTRODUCCIÓN
Las técnicas frecuentemente utilizadas por la
ingeniería de tejidos para monitorear el cultivo y
la diferenciación celular están limitadas en
aplicación debido a la naturaleza destructiva de
los mecanismos involucrados. Recientemente se
han utilizado diversas técnicas en forma
combinada, como la microscopia de imagen de
tiempo de vida de fluorescencia (FLIM), la
generación de segundo armónico (SHG), la
espectroscopía anti-Stockes Raman coherente y
la excitación de fluorescencia bifotónica
(TPEF), que permiten el monitoreo no invasivo
de la diferenciación de células madres humanas.
Sin embargo, en microscopía óptica 3D, la
variación espacial del índice de refracción de la
muestra produce cambios en la trayectoria de la
luz, que resulta en imágenes aberrantes con
distorsiones geométricas, degradan la resolución
y reducen la relación señal-ruido. Estos efectos
son particularmente importantes cuando se
analizan muestras biológicas gruesas y
particularmente graves para imágenes de células
in vivo. Para mejorar la calidad de las imágenes
se han desarrollado varios métodos que reducen
la contribución del fondo de la luz difundida por
el material que rodea el plano de interés (Boas,
2010). En nuestro trabajo, para mejorar la
calidad de la imagen disminuyendo las
contribuciones de fondo de la luz difusa, se
empleo la técnica óptica de contraste de fase.
Para ello se procedió a validar una técnica de
procesamiento de imágenes que proporciona
información cuantitativa relativa a cambios en
el metabolismo, la proliferación y la morfología
de las células madres, basada en QWLSI
(Quadri-Wave Lateral Shearing Interferometry)
combinada con un microscopio convencional de
transmisión de luz blanca (trabajo realizado en
el Lab. de Imágenes de Nancy, Francia). La
principal ventaja de esta técnica es que permite
examinar las células vivas en su estado natural,
monitoreando la variación en los cambios de
fase locales dentro de las mismas durante las
etapas tempranas de diferenciación.
Las células madre mesenquimales (MSC)
humanas (Pittenger et al., 1999) están presentes
en el estroma de la médula ósea, constituyendo
una población totalmente diferente de las
células madre hematopoyéticas, (Wagers et al.,
2002) y su papel es contribuir a la regeneración
de los tejidos mesenquimáticos (hueso,
cartílago, músculo, ligamento, tendón, tejido
adiposo y estroma) (Weissman et al., 2001). Se
han aislado y cultivado MSC humanas (Jiang et
al., 2002) y lo que es mejor, se ha logrado su
diferenciación controlada hasta células con
rasgos típicos de osteocitos, condrocitos o
adipocitos, respectivamente (Grant et al., 2002)
(figura 1).
Médula ósea
humana (P0)
Luego de 14 días, las
células adherentes
(MSC) se recuperan
por tripsinización
Expansión celular
5 x 104 células mononucleares
(MNC)/cm² en medio α-MEM
a 37°C
Se sembraron 500 células/placa en
placas de 60 cm². Se registraron
imágenes por microscopia de fase
Figura 1: Esquema de la formación de células madres a partir de médula ósea humana
MATERIALES Y MÉTODO
Las células madre mesenquimales (MSC) son
células estromales no hematopoyéticas que
representan de 0.001 a 0.01% de las células
nucleadas de la médula ósea del adulto. Se las
puede seleccionar por adherencia al plástico y
son capaces de generar colonias discretas in
vitro (colony-forming unit-fibroblast o CFU-F).
Se las identifica por su perfil fenotípico y por su
capacidad de diferenciarse en células del tejido
conectivo (adipocitos, osteocitos, condrocitos).
La amplificación in vitro o su potencial
replicativo varía en función de diferentes
parámetros, como la densidad de siembra, el
tiempo de cultivo y la presión de oxígeno.
Para el análisis automático de las imágenes
digitales obtenidas se utilizó el programa de
circulación libre ImageJ, con el cual, luego de la
IMAGEN ORIGINAL
SELECCIÓN
DE UMBRAL
RESALTE
DE CONTRASTE
REGIONES DE INTERÉS
estandarización de las condiciones límites
óptimas en la escala de grises, se pudieron
determinar
en
forma
automática
las
características morfométricas representativas en
la evolución de las células, tales como sus
dimensiones, relación área/perímetro, relación
entre área real y área convexa, relación entre los
ejes mayor y menor, etc. El análisis de los
resultados obtenidos permite establecer cuales
son los parámetros morfométricos vinculados a
la evolución temporal de las distintas células
madre analizadas. Se tomaron como parámetros
más representativos para seguir la evolución del
crecimiento de las células madres: dimensiones,
área/perímetro, área real/área convexa; eje
mayor / eje menor.
IMAGEN CONTRASTADA
ANÁLISIS
DE REGIONES
APLICACIÓN
DE FILTROS
REGIONES ANALIZADAS
Figura 2: Procesamiento y análisis de las imágenes con el programa ImageJ.
IMAGEN FILTRADA
IMAGEN Y REGIONES ANALIZADAS
(1)
(2)
(3)
(4)
Figura 3 Imágenes correspondientes a distintas etapas de la evolución de un cultivo de MSC
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El procedimiento de análisis de las imágenes
consistió en mejorar la imagen original
resaltando el contraste y aplicando filtros para
destacar las células, seleccionar las regiones de
interés, aquellas correspondientes a las células,
y determinar los parámetros de cada una de las
regiones seleccionadas. Como parámetros más
representativos se tomaron:
• Área: Es el área de la superficie
seleccionada,
expresada
en
pixeles
cuadrados.
• Perim (perímetro): Es la longitud del
contorno de la superficie seleccionada.
• Major: Es la longitud del eje mayor de la
elipse que mejor se ajusta a la superficie
seleccionada.
• Minor: Es la longitud del eje menor de la
elipse que mejor se ajusta a la superficie
seleccionada.
• Circ. (circularidad): es una medida de
cuánto se acerca la superficie seleccionada
a un círculo. Un valor de 1 indica un círculo
perfecto.
•
•
•
•
•
•
•
•
Feret (diámetro de Feret): Es la mayor
distancia entre dos puntos cualesquiera del
contorno de la superficie seleccionada,
conocido también como calibre máximo.
Feret X: Es la longitud de la proyección de
la superficie seleccionada sobre el eje X.
Feret Y: Es la longitud de la proyección de
la superficie seleccionada sobre el eje
Y.Feret
Angle: Es el ángulo entre el eje X y el
segmento de recta determinado por el
diámetro de Feret.
Feret Min: Es la menor distancia entre dos
puntos cualesquiera del contorno de la
superficie seleccionada, conocido también
como calibre mínimo.
AR (aspect ratio): Es la relación entre las
longitudes de los ejes de la elipse, mayor y
menor, que mejor se ajusta a la superficie
seleccionada.
Red. (redondez): Es el inverso de AR..
Solid.: Es la relación entre el área de la
superficie seleccionada y el área de la
superficie convexa que encierra a la
superficie seleccionada.
En la figura 2 se ha esquematizado el
procesamiento y análisis de las imágenes
utilizando el programa ImageJ.
En la tabla I se muestran los resultados de los
distintos parámetros obtenidos por el proceso
anteriormente mencionado aplicado a las
imágenes de la figura 3.
Tabla I. Valores obtenidos para las imágenes de la figura 2
Area
Per
Maj
Min
Ang
Circ
Feret
Area
Feret
Feret
Feret
Feret
%
X
Y
Ang
Min
AR
Red.
Solid
1
546
177
57,28
12,42
107
0,256
73,33
99,90
153
141
117
18,30
5,039
0,249
0,678
2
633
143
50,85
16,50
74
0,402
57,66
99,99
191
173
82
20,54
3,387
0,370
0,761
3
424
93
31,97
15,80
105
0,605
35,27
99,93
202
150
103
17,82
2,070
0,526
0,858
4
349
91
30,68
13,11
130
0,500
34,35
99,83
171
120
134
15,72
2,405
0,463
0,799
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
El análisis de los resultados obtenidos permite
establecer
cuales son
los parámetros
morfométricos vinculados a la evolución
temporal de las distintas células madre
analizadas., estos son: Major, Minor, AR, Red,
Solid.
Estas experiencias contribuyen a un mejor
entendimiento de la dinámica de las células
madre para su posterior aplicación médica.
Se presenta una técnica no invasiva, sencilla y
eficaz para la caracterización del cultivo de las
células madre mesenquimales que permitirá
obtener parámetros cuantitativos de la
morfología y orientación de las células en
distintos estadios de la diferenciación celular a
fin de mejorar la calidad de las mismas para su
utilización en Ingeniería tisular.
El uso que más ha llamado la atención sería el
empleo de células diferenciadas a partir de
células madre embrionarias para terapias
celulares o incluso reparación de tejidos
dañados.
Estos experimentos contribuyen a un mejor
entendimiento de la dinámica de las células
madres, ayudando al avance de diversas
aplicaciones médicas.
Boas G, (2010), Cell Cultures in 3-D Optical
techniques contribute to advances in tissue
engineering.. Bio Photonics 17: 18-20.
Grant MB, May WS, Caballero S, Brown GA,
Guthrie SM, Mames RN et al. (2002), Adult
hematopoietic stem cells provide functional
hemangioblast activity during retinal
neovascularization. Nat Med 8:607-612.
Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M,
Reyes M, Verfaillie CM. (2002),
Multipotent progenitor cells can be isolated
from postnatal murine bone marrow, muscle,
and brain. Exp Hematol 30: 896-904.
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal
RK, Douglas R, Mosca JD et al. (1999),
.Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science 284: 143147.
Wagers AJ, Sherwood RI, Christensen JL,
Weissman IL. (2002). Little evidence for
developmental
plasticity
of
adult
hematopoietic stem cells. Science; 297:
2256-2259.
Weissman IL, Anderson DJ, Gage F. (2001),
Stem and progenitor cells: origins,
phenotypes, lineage commitments, and
transdifferentiations. Annu Rev Cell Dev
Biol; 17: 387-403.