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ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL
MANUAL DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
Y DE LAS VACUNAS
PARA LOS ANIMALES TERRESTRES
(mamíferos, aves y abejas)
Volumen I
2004
Este Manual de animales terrestres ha sido editado por
la Comisión de Estándares Biológicos de la OIE y
adoptado por el Comité Internacional de la OIE
Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres
Quinta Edición, 2004 (Primera edición en español)
Manual of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements for Biological Products:
Volumen I, 1989; Volumen II, 1990; Volumen III, 1991.
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines:
Segunda Edición, 1992
Tercera Edición, 1996
Cuarta Edición, 2000
ISBN 92-9044-632-3
©
Copyright
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2004
12, rue de Prony, 75017 Paris, FRANCE
Telephone: 33-(0)1 44 15 18 88
Fax: 33-(0)1 42 67 09 87
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Todas las publicaciones de la OIE (Organización mundial de sanidad animal) están protegidas por un Copyright
internacional. Extractos pueden copiarse, reproducirse, adaptarse o publicarse en publicaciones periódicas,
documentos, libros o medios electrónicos, y en cualquier otro medio destinado al público, con intención
informativa, didáctica o comercial, siempre y cuando se obtenga previamente una autorización escrita por parte
de la OIE.
Las designaciones y nombres utilizados y la presentación de los datos que figuran en esta publicación no
constituyen de ningún modo el reflejo de cualquier opinión por parte de la OIE sobre el estatuto legal de los
países, territorios, ciudades o zonas ni de sus autoridades, fronteras o limitaciones territoriales.
PRÓLOGO
El propósito de este Manual de animales terrestres es facilitar el comercio internacional de
animales y productos animales, así como contribuir a la mejora de los servicios de salud animal en
todo el mundo. Mediante la descripción de los métodos de laboratorio para el diagnóstico de
enfermedades y los requisitos para la producción y control de productos biológicos (principalmente
vacunas), ambos consensuados internacionalmente, se pone de manifiesto lo que constituye el
objetivo del Manual: la armonización de los elementos fundamentales de la prevención, vigilancia
y control de las enfermedades animales.
Este ambicioso objetivo ha requerido la cooperación de especialistas en salud animal de muchos
países. La OIE, Organización Mundial de Sanidad Animal, es, a todas luces, una de las
organizaciones más indicadas para acometer la mencionada tarea a nivel global. Las principales
actividades de la organización, que fue fundada en 1924 y en 2004 cuenta con 166 estados
miembros, son las siguientes:
1.
Asegurar la transparencia de la situación global relativa a la zoonosis y las enfermedades
animales.
2.
Recabar, analizar y difundir información científico-veterinaria.
3.
Ofrecer conocimiento experto y promover la solidaridad internacional para el control de las
enfermedades animales.
4.
Dentro de su mandato, sujeto al Acuerdo SPS con la OMC, salvaguardar el comercio
internacional mediante la publicación de estándares sanitarios para el comercio
internacional de animales y productos animales.
5.
Mejorar el marco legal y los recursos de los Servicios Nacionales de Veterinaria.
6.
Garantizar mejor la seguridad de los alimentos de origen animal y mejorar el bienestar
animal mediante procedimientos científicos.
El Manual de animales terrestres, que trata de las enfermedades infecciosas y parasitarias de los
mamíferos, aves y abejas, se publicó por primera vez en 1989. En cada nueva edición del Manual
se han ampliado y actualizado los contenidos del mismo. Esta quinta edición incluye capítulos
adicionales sobre infecciones zoonósicas, reflejando así la implicación creciente de la OIE en los
temas de salud pública. Como complemento al Código de sanidad animal, el Manual de animales
terrestres fija los estándares del laboratorio para todas las enfermedades de las listas A y B de la
OIE así como para otras varias enfermedades de importancia global. El Manual se ha venido
adoptando ampliamente como un texto de referencia de importancia crucial para los laboratorios
de veterinaria de todo el mundo. Las enfermedades de animales acuáticos se tratan por separado
en el Manual de animales acuáticos.
El Comité Internacional de la OIE asignó a la Comisión de Estándares Biológicos de la
Organización la tarea de encargar los capítulos y compilar el Manual de animales terrestres. Los
originales se solicitaron a expertos en cada una de las enfermedades o en otros temas incluidos
en el Manual. Después de su examen inicial por el Editor Técnico Consultor, los capítulos se
enviaron a los revisores científicos y a expertos de los laboratorios de referencia de la OIE.
También se enviaron a los países miembros, recabando su revisión y comentarios. Los
comentarios recibidos fueron examinados por la Comisión de Estándares Biológicos y el Editor
Técnico Consultor, quienes, en muchos casos, se los hicieron llegar a los autores para las
aclaraciones pertinentes, antes de dar forma definitiva a los capítulos. El texto final fue aprobado
por el Comité Internacional de la OIE.
Ante el incremento del volumen de contenidos del Manual de animales terrestres, ha sido
necesario publicar esta quinta edición en dos volúmenes. Es nuestro sincero deseo que este
Manual resulte de la mayor utilidad para los responsables de diagnóstico veterinario y para los
fabricantes de vacunas de todos los Países Miembros de la OIE.
Doctor Bernard Vallat
Director General de la OIE
Profesor Steven Edwards
Presidente de la Comisión de Estándares
Biológicos de la OIE
Enero 2004
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
iii
AGRADECIMIENTOS
Estoy sumamente agradecido a las muchas personas que han contribuido con su esfuerzo a la
preparación del presente Manual de animales terrestres. De forma especial, me gustaría expresar
mi agradecimiento a:
El Dr. B. Vallat, Director General de la OIE desde 2001 hasta el presente, por propiciar y
apoyar el proyecto de preparación de la nueva edición del Manual de animales terrestres,
Los Miembros de la Comisión de Estándares de la OIE, Prof. M. Truszczynski, Prof. S.
Edwards, Dr. B. Schmitt y Dr. A. Golovko, y los observadores en la reunión de la Comisión
de Estándares Biológicos, Dr. A. Diallo y Dr. P. Wright, quienes se responsabilizaron de
encargar los capítulos y, junto con el Editor Técnico Consultor, editar las contribuciones
hasta completar esta edición del Manual,
Los colaboradores relacionados en las páginas xxiv-xxxv, que aportaron su inestimable
tiempo y conocimiento experto en la redacción de los capítulos,
Los revisores y expertos de los laboratorios de referencia de la OIE, quienes dedicaron su
tiempo y conocimiento experto al examen de los capítulos,
Los países miembros de la OIE que aportaron comentarios sobre los borradores de los
capítulos que previamente se les había enviado. Esos comentarios resultaron esenciales
para hacer del Manual un texto internacionalmente aceptable,
Ms Sara Linnane, quien, como Editor Científico, organizó este complejo proyecto y
contribuyó de forma importante a mejorar la calidad del texto,
Los Doctores G.A. Cullen y J.E. Pearson, Editores Técnicos Consultores del Manual de
animales terrestres, que contribuyeron en gran medida a la edición y armonización de los
contenidos aportando la información requerida para subsanar cualquier laguna informativa,
Los miembros del Departamento Científico y Técnico de la OIE y del Departamento de
Publicaciones por su apoyo.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang
Presidente del Comité Internacional de la OIE
Enero 2004
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
v
AGRADECIMIENTOS POR LA EDICIÓN ESPAÑOLA
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todos los que han posibilitado la primera edición en español
del Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres y a todos los que con su
trabajo han colaborado en la traducción al español, muy especialmente a:
El Dr. Vallat, por impulsar este Proyecto tan necesario para los veterinarios y técnicos y especialistas de
países de habla española.
Los gobiernos del Reino de España y de la República de Argentina, y en concreto al Ministerio de
Agricultura, Pesca y Alimentación (España) y al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASA, Argentina), por sus contribución económica a este Proyecto.
Los miembros del “Comité Director para los proyectos de l´OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal)
de traducción del Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines al idioma español y Base
terminológica multilíngüe para el ámbito de la Sanidad Animal y ciencias afines”, los Doctores Angot
(Francia), Cabello Navarro (España), Acerbi (Argentina), Cruz de Urbina (Colombia), Serrano (Cuba), por
su colaboración y apoyo.
Los miembros del Grupo ad Hoc correspondiente, Profesores Doctores Rodríguez Ferri, Zepeda Seín,
Gimeno, León Vizcaíno, Cuello Gijón y Sánchez Vizcaíno por su participación activa en las correcciones
científicas y técnicas de los textos en español, así como por sus aportaciones, comentarios y críticas, que
han resultado fundamentales para la calidad de la traducción.
El Profesor Dr. Schudel, Jefe del Servicio Científico y Técnico de la OIE, que ha coordinado de forma
impecable las relaciones entre nuestra organización y el Comité Director y el Grupo ad Hoc.
El Profesor Dr. Gutiérrez Díez, miembro del Grupo ad Hoc, que ha llevado a cabo la coordinación
lingüística y traductológica de la versión española de este Manual y a su equipo de traductores.
El Profesor Dr. Crespo León, Secretario del Comité Director y del Grupo ad Hoc, que fue el coordinador
científico y técnico de este Proyecto.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang
Presidente del Comité Internacional de la OIE
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
vii
CONTENIDOS
VOLUMEN I
Introducción: cómo usar el Manual de animales terrestres......................................
Lista de pruebas para el comercio internacional......................................................
Abreviaturas más comunes usadas en el Manual de animales terrestres
Glosario terminológico..............................................................................................
Colaboradores..........................................................................................................
xi
xiii
xvii
xix
xxiv
PARTE I
INFORMACIÓN GENERAL
SECCCIÓN I.1.
CAPÍTULOS INTRODUCTORIOS
Capítulo I.1.1.
Capítulo I.1.2.
Capítulo I.1.3.
Métodos de muestreo...............................................................................................
Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias...............................
Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades
infecciosas………………………………………………………………………………….
21
Capítulo I.1.4.
Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena de la
polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas………......
32
Capítulo I.1.5.
Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales
biológico…………………………………………………………………………………….
Capítulo I.1.6.
Capítulo I.1.7.
Capítulo I.1.8.
Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología……………...
Principios de producción de vacunas veterinarias....................................................
La Biotecnología en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y el
desarrollo de vacunas……………………………………………………….…………….
3
14
40
49
62
75
Capítulo I.1.9.
El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional de los
productos biológicos de uso veterinario………………………………………………...
99
Capítulo I.1.10.
Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a
antimicrobianos……………………………………………………………………………....
112
PARTE 2
LISTADO DE ENFERMEDADES DE LA OIE
SECCCIÓN 2.1.
ENFERMEDADES DE LA LISTA A
Capítulo 2.1.1.
Capítulo 2.1.2.
Capítulo 2.1.3.
Capítulo 2.1.4.
Capítulo 2.1.5.
Capítulo 2.1.6.
Capítulo 2.1.7.
Capítulo 2.1.8.
Capítulo 2.1.9.
Capítulo 2.1.10.
Capítulo 2.1.11.
Capítulo 2.1.12.
Capítulo 2.1.13.
Capítulo 2.1.14.
Capítulo 2.1.15.
Fiebre aftosa.............................................................................................................
Estomatitis vesicular.................................................................................................
Enfermedad vesicular porcina..................................................................................
Peste bovina.............................................................................................................
Peste de los pequeños rumiantes............................................................................
Pleuroneumonía bovina contagiosa..........................................................................
Dermatosis nodular contagiosa ……………………………………………………........
Fiebre del Valle del Rift…………………………………………………………………...
Lengua azúl..............................................................................................................
Viruela ovina y viruela caprina..................................................................................
Peste equina africana...............................................................................................
Peste porcina africana..............................................................................................
Peste porcina clásica (cólera del cerdo)...................................................................
Gripe aviar muy virulenta..........................................................................................
Enfermedad de Newcastle........................................................................................
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
123
142
150
156
167
178
191
202
213
230
241
254
266
281
293
ix
Contenido
SECCIÓN 2.2.
ENFERMEDADES DE ESPECIES MÚLTIPLES- LISTA B
Capítulo 2.2.1.
Capítulo 2.2.2.
Capítulo 2.2.3.
Capítulo 2.2.4.
Capítulo 2.2.5.
Capítulo 2.2.6.
Capítulo 2.2.7.
Capítulo 2.2.8.
Carbunco..................................................................................................................
Enfermedad de Aujeszky..........................................................................................
Equinococosis/Hidatidosis........................................................................................
Leptospirosis.............................................................................................................
Rabia.........................................................................................................................
Paratuberculosis (enfermedad de Johne) ................................................................
Cowdriosis................................................................................................................
Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia hominivorax) y del Viejo Mundo
(Chrysomya bezziana)………………………………………………………………….....
Capítulo 2.2.9.
Capítulo 2.2.10.
Capítulo 2.2.11.
Triquinelosis..............................................................................................................
Fiebre Q ...................................................................................................................
Leishmaniosis...........................................................................................................
SECCIÓN 2.3.
ENFERMEDADES BOVINAS- LISTA B
Capítulo 2.3.1.
Capítulo 2.3.2.
Capítulo 2.3.3.
Capítulo 2.3.4.
Capítulo 2.3.5.
Capítulo 2.3.6.
Capítulo 2.3.7.
Capítulo 2.3.8.
Capítulo 2.3.9.
Capítulo 2.3.10.
Capítulo 2.3.11.
Capítulo 2.3.12.
Capítulo 2.3.13.
Capítulo 2.3.14.
Capítulo 2.3.15.
Brucelosis bovina......................................................................................................
Campilobacteriosis genital bovina............................................................................
Tuberculosis bovina..................................................................................................
Leucosis bovina enzoótica........................................................................................
Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis pustular infecciosa.........................
Tricomonosis.............................................................................................................
Anaplasmosis bovina................................................................................................
Babesiosis bovina.....................................................................................................
Cisticercosis bovina* (ver capítulo 2.10.1)................................................................
Dermatofilosis...........................................................................................................
Teileriosis..................................................................................................................
Septicemia hemorrágica...........................................................................................
Encefalopatía espongiforme bovina..........................................................................
Fiebre catarral maligna.............................................................................................
Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé.tsé)………………………………......
x
307
320
334
343
356
377
391
402
413
421
433
445
477
489
503
514
526
534
548
560
561
564
580
593
615
626
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
INTRODUCCIÓN
(Sobre la utilización del
Manual de animales terrestres)
•
Estructura del Manual de animales terrestres y sistema de numeración
La Parte I, al comienzo del Manual, contiene diez capítulos introductorios sobre diversos temas
generales de interés para los responsables de diagnóstico de los laboratorios de veterinaria. Cada
uno de los capítulos es una introducción al tema enunciado, y todos ellos contienen información
básica no estandarizada.
El cuerpo principal del Manual de animales terrestres (Parte 2) contiene los estándares para las
pruebas de diagnóstico y las vacunas para las enfermedades listadas en el Código sanitario de
animales terrestres de la OIE. Estas aparecen en el mismo orden y con el mismo sistema de
numeración que se utiliza en el Código Sanitario a fin de facilitar las referencias cruzadas entre los
dos libros. La Lista A contiene las enfermedades transmisibles que pueden propagarse
rápidamente, y con graves consecuencias, a través de las fronteras entre países. Son
enfermedades de consecuencias especialmente graves por su incidencia en la salud pública y sus
repercusiones socio-económicas. En la Lista B aparecen las enfermedades transmisibles de
consecuencias igualmente graves para la salud pública y el ámbito socio-económico, aunque
restringidas a ciertos países; tienen un impacto en el comercio internacional de animales y de
productos animales. La lista B se subdivide según la especie animal hospedadora.
Las cuatro primeras enfermedades de la Sección 2.10 se incluyen en algunas secciones de la
Lista B, que se refieren a especies individuales; pero en estos capítulos se tratan varias especies,
ofreciendo así una visión más amplia. En la Sección 2.10 se incluyen algunas otras enfermedades
que también son importantes para el comercio, y a las que no se les asigna un capítulo específico
en el Código sanitario de animales terrestres.
Los colaboradores de los distintos capítulos aparecen relacionados en las páginas xxiv–xxxviii,
pero la responsabilidad última en relación con los contenidos del Manual de animales terrestres
recae en el Comité Internacional de la OIE.
Al final del Volumen II se ofrece un índice alfabético de enfermedades.
• Formato de los capítulos
Cada capítulo se inicia con un resumen del contenido, a fin de proporcionar a los oficiales
veterinarios y a otros lectores una información sucinta sobre las pruebas y las vacunas disponibles
para el tratamiento de la enfermedad. A continuación del resumen, se ofrece el texto completo,
con información detallada para los operarios del laboratorio. En la Parte A de cada capítulo, se
ofrece una introducción general sobre la enfermedad; en la Parte B, se incluye el diagnóstico de la
enfermedad en el laboratorio; y en la Parte C (en los casos en que sea pertinente), se tratan los
requisitos para las vacunas y los productos biológicos para el diagnóstico in vivo. La información
sobre la producción y control de las vacunas o los materiales de diagnóstico se ofrecen a modo de
ejemplo: no siempre es necesario ajustarse a esa información, sobre todo en los casos en que
existan razones científicamente fundamentadas para la utilización de enfoques alternativos. Al
final de cada capítulo, se incluyen las referencias bibliográficas como fuente de información
adicional.
• Explicación de las pruebas descritas y del cuadro de las páginas xiii–xvi
En el cuadro de las páginas xiii–xvi aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas
en dos categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas son las pruebas
que se exigen en el Código sanitario de animales terrestres para ser aplicadas a los animales
antes de su transporte internacional. En el Manual de animales terrestres, tales pruebas aparecen
en tipo azul. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xi
Introducción
de las listas A y B. Las pruebas alternativas son aquellas que conviene aplicar para el diagnóstico
de la enfermedad en un ámbito geográfico local, y que también se pueden utilizar de cara a la
importación/exportación de animales previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, a menudo
se describen otras pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o
que están todavía en proceso de desarrollo.
• Lista de laboratorios de referencia de la OIE
En la Parte 3 del presente Manual de animales terrestres se ofrece una lista de laboratorios de
referencia de la OIE. Dichos laboratorios han sido designados por la OIE como centros de
excelencia por su conocimiento experto en campos específicos. Tienen capacidad para asesorar a
otros laboratorios sobre cuestiones de metodología. En ocasiones pueden obtenerse de estos
laboratorios de excelencia cepas estándar de microorganismos o reactivos de referencia (por
ejemplo, antisueros o antígenos).
La lista de laboratorios de referencia será actualizada cada año por el Comité Internacional de la
OIE. Existe una lista actualizada en la página Web de la propia OIE.
*
* *
xii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
LISTA DE PRUEBAS PARA EL COMERCIO
INTERNACIONAL
En el cuadro inferior aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas según dos
categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas se exigen en el Código
sanitario de animales terrestres de la OIE para el transporte internacional de animales y de
productos animales, y se consideran como las más adecuadas para determinar el estado de salud
de los animales. Tales pruebas aparecen impresas en letra azul en el Manual de animales
terrestres. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades de
las listas A y B. Las pruebas alternativas son las adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad
en un ámbito geográfico local, y también se pueden utilizar de cara a la importación/exportación
de animales, previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, se describen a menudo otras
pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o que están todavía en
proceso de desarrollo.
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
2.1.1.
Fiebre aftosa
2.1.2.
Estomatitis vesicular
2.1.3.
Enfermedad vesicular porcina
2.1.4.
Peste bovina
2.1.5.
Peste de los pequeños rumiantes
2.1.6.
Pleuroneumonía bovina contagiosa
2.1.7.
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
ELISA*, NV
FC
FC, ELISA, NV
–
NV
ELISA
ELISA
NV
NV
ELISA
FC, ELISA
–
Dermatosis nodular contagiosa
–
VN
2.1.8.
Fiebre del Valle del Rift
–
HI, ELISA, PRN
2.1.9.
Lengua azul
Id. agente, IGDA,
ELISA, PCR
NV
2.1.10.
Viruela ovina y viruela caprina
–
NV
2.1.11.
Peste equina africana
FC, ELISA
NV
2.1.12.
Peste porcina africana
ELISA
IFI
2.1.13.
Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
NPLA, FAVN, ELISA
–
2.1.14.
Gripe aviar muy virulenta
–
IGDA, HI
2.1.15.
Enfermedad de Newcastle
–
HI
2.2.1.
Carbunco
–
–
2.2.2.
Enfermedad de Aujeszky
ELISA, NV
–
2.2.3.
Equinococosis/Hidatidosis
–
–
2.2.4.
Leptospirosis
–
MAT
2.2.5.
Rabia
NV
ELISA
2.2.6.
Paratuberculosis (enfermedad de Johne
–
DTH, ELISA
2.2.7.
Cowdriosis
–
ELISA, IFI
2.2.8.
Larva perforada del Nuevo Mundo
(Cochliomyia hominivorax y del Viejo
Mundo (Chrysomya bezziana)
–
Id. agente
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xiii
Lista de pruebas para el comercio internacional
•
Hay que consultar los capítulos del Manual de animales terrestres para comprobar el método prescrito
Capítulo Nº
2.2.9.
Triquinelosis
2.2.10.
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
Id. agente
ELISA
Fiebre Q
–
CF
2.2.11.
Leishmaniosis
–
Id. agente
2.3.1.
Brucelosis bovina
–
2.3.2.
Campilobacteriosis genital bovina
BBAT, FC,
ELISA, FPA
Id. agente
2.3.3.
Tuberculosis bovina
2.3.4.
Leucosis bovina enzoótica
2.3.5.
2.3.6.
Rinotraqueitis bovina infecciosa
/vulvovaginitis pustular infecciosa
Tricomonosis
2.3.7.
Prueba de la
tuberculina
IGDA, ELISA
–
–
PCR
NV, ELISA, Id. agente
(sólo semen)
Id. agente
Agg. moco
Anaplasmosis bovina
–
FC, Agg. card
2.3.8.
Babesiosis bovina
–
ELISA, IFI
2.3.9.
Cisticercosis bovina
–
Id. agente
2.3.10.
Dermatofilosis
–
–
2.3.11.
Teileriosis
Id. agente, IFI
–
2.3.12.
Septicemia hemorrágica
–
Id. agente
2.3.13.
Encefalopatía espongiforme bovina
–
–
2.3.14.
Fiebre catarral maligna
–
NV, IFI, PCR
2.3.15.
Tripanosomosis (transmitida por la
mosca tsé-tsé)
Epididimitis ovina (Brucella ovis)
–
IFI
FC
ELISA
BBAT, FC
Prueba de la brucelina
–
–
IGDA, ELISA
–
FC
–
2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.
2.4.4/5.
xiv
Nombre de la enfermedad
Brucelosis caprina y ovina
(no debida Brucella ovis)
Agalaxia contagiosa
Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
–
2.4.6.
Pleuroneumonía caprina contagiosa
2.4.7.
–
FC
2.4.8.
Aborto enzoótico de las ovejas
(Clamidiosis ovina)
Prurigo lumbar
–
–
2.4.9.
Adenomatosis pulmonar ovina
–
–
2.4.10.
Enfermedad de Nairobi
–
–
2.4.11.
Salmonelosis (S. Abortus ovis)
–
Id. agente
2.5.1.
Metritis equina contagiosa
Id. agente
–
2.5.2.
Durina
FC
IFI, ELISA
2.5.3.
–
HI, FC, PRN
2.5.4.
Encefalomielitis equina (del Este y del
Oeste)
Anemia infecciosa equina
IGDA
ELISA
2.5.5.
Gripe equina
–
HI
2.5.6.
Piroplasmosis equina
ELISA, IFI
FC
2.5.7.
Rinoneumonitis equina
–
NV
2.5.8.
Muermo
Prueba de la maleína,
FC
–
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Lista de pruebas para el comercio internacional
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
2.5.10.
Arteritis vírica equina
NV, Id. agente (en
muestras de semen)
–
2.5.11.
Sarna equina
–
Id. agente
2.5.12.
Encefalomielitis equina venezolana
–
HI, FC, PRN
2.5.13.
Linfangitis epizoótica
–
–
2.5.14.
Encefalitis japonesa
–
–
2.5.15.
Tripamosomosis (Trypansoma evansi)
–
–
2.6.1.
Rinitis atrófica porcina
–
–
2.6.2.
Brucelosis porcina
ELISA
BBAT, FPA
2.6.3.
Encefalomielitis por enterovirus
(anteriormente enfermedades de
Teschen/Talfan)
Gastroenteriris transmisible
–
NV
–
NV, ELISA
Síndrome reproductivo y respiratorio
porcino
Cisticercosis porcina
–
ELISA, IFI, IPMA
–
Id. agente
Bursitis infecciosa (Enfermedad de
Gumboro )
Enfermedad de Marek
–
IGDA, ELISA
–
IGDA
–
Agg., HI
2.7.4.
Micoplasmosis aviar
(Mycoplasma gallisepticum)
Clamidiosis aviar
–
–
2.7.5.
Pulorosis y taifosis aviar
–
Agg., Id. agente
2.7.6.
Bronquitis infecciosa aviar
–
NV, HI, ELISA
2.7.7.
Laringotraqueitis infecciosa aviar
–
IGDA, NV, ELISA
2.7.8.
Tuberculosis aviar
–
Prueba de la
tuberculina,
Id. agente
2.7.9.
Hepatitis vírica del pato
–
–
2.7.10.
Enteritis vírica del pato
–
–
2.7.11.
Cólera aviar (pasteulerosis aviar)
–
–
2.7.12.
Viruela aviar
–
–
2.8.1.
Mixomatosis
–
IGDA, FC, IFI
2.8.2.
Tularemia
–
Id. agente
2.8.3.
Enfermedad hemorrágica del conejo
–
HI
2.9.1.
Acariosis de las abejas
–
–
2.9.2.
Loque americana
–
–
2.9.3.
Loque europea
–
–
2.9.4.
Nosemosis de las abejas
–
–
2.9.5.
Varroosis
–
–
2.9.6.
Infestación de las abejas melíferas por
Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T.
koenigerum)
–
–
2.10.1.
Cisticercosis
2.6.4.
2.6.5.
2.6.6.
2.7.1.
2.7.2.
2.7.3.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Id. agente
xv
Lista de pruebas para el comercio internacional
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
2.10.2.
Enfermedades bunyavirales de
animales (excluyendo la Fiebre del
Valle del Rift)
–
–
2.10.3.
Salmonelosis
–
Id. agente
2.10.4.
Sarna
–
Id. agente
2.10.5.
Enfermedad de la frontera
Id. agente
–
2.10.6.
Diarrea vírica bovina
Id. agente
–
2.10.7.
Encefalitis del Oeste del Nilo
–
–
2.10.8.
Campylobacter jejuni and C. Coli
–
–
2.10.9.
Criptosporidiosis
–
–
2.10.10.
Enfermedades víricas de Hendra y de
Nipah
–
–
2.10.11.
Gripe porcina
–
–
2.10.12.
Toxoplasmosis
–
–
2.10.13.
Escherichia coli Verocitotoxigénica
–
–
2.10.14.
Listeria monocytogenes
–
–
Nota: Las pruebas prescritas por el Código sanitario de animales terrestres a efectos de comercialización
internacional se han impreso en letra azul en el Manual de animales terrestres.
Abreviaturas
Id. agente
Identificación del agente
HI
Inhibición de la hemaglutinación
Agg.
Prueba de aglutinación
IFI
Inmunofluorescencia indirecta
IGDA
Inmunodifusión en gel de agar
IPMA
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
BBAT
Prueba con antígeno tamponado de Brucella
MAT
Prueba de aglutinación microscópica
FC
(Prueba de) fijación del complemento
NPLA
Prueba de neutralización acoplada a la
peroxidasa
DTH
Hipersensibilidad retardada
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
ELISA
Prueba de enzimoinmunoensayo
PRN
Neutralización por reducción de calvas
FAVN
Neutralización vírica con anticuerpo
fluorescente
NV
Neutralización vírica
FPA
Prueba de polarización de la fluorescencia
–
Prueba por designar
xvi
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL MANUAL DE
ANIMALES TERRESTRES
ABTS
ATCC1
BBAT
BFK
BGPS
BHK
BLP
BPAT
BSA
BSF
CAM
CEF
CFU
CIEP
CK
CPLM
CSY
DEAE
DEPC
DICT50
DMEM
DMSO
DTH
ECP
EGTA
EID
ELISA
EMTM
EYL
FAT
FAVN
FBS
FC
FITC
FLK
FPA
g
GIT
HA
ácido 2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfónico
Colección americana de cultivos tipo
Prueba con antígeno tamponado de
Brucella
(Células de ) riñón fetal bovino
Medio con extracto de carne-glucosapeptona y suero
Línea celular de riñón de hamster
neonato
Lactosa y peptona tamponada
Prueba con antígeno tamponado en
placa
Albúmina de suero bovino
Factores del suero bovino
Membrana corioalantoidea
Fibroblasto de embrión de pollo
Unidad formadora de colonia
Contrainmunoelectroforesis
Células de riñón de ternero
Medio con cisteína-peptona-infusión de
hígado y maltosa
Medio con caseína-sacarosa y levadura
(con agar)
Dietilaminoetil
Dietil pirocarbonato
Dosis infectiva del 50% en cultivo celular
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
Dimetil sulfóxido
Hipersensibilidad retardada
Efecto citopático
Ácido etilén glicol tetra-acético
Dosis infecciosa en huevo
Prueba de enzimoinmunoensayo
Medio de Tobie modificado por Evans
Solución salina equilibrada de Earle con
lactalbúmina y levadura
Prueba de anticuerpo fluorescente
Neutralización vírica con anticuerpo
fluorescente
Suero bovino fetal
(Prueba de) fijación del complemento
Isotiocianato de fluoresceína
(Células de) riñón de cordero fetal
Prueba de polarización de la
fluorescencia
Fuerza centrífuga relativa
Prueba de inhibición del crecimiento
Hemaglutinación
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
HAD
HBSS
HEP
HEPES
HI
HRPO
IB
ICFTU
ICPI
ID50
IFI
IGDA
IHA
IPMA
IVPI
LA
LD
LEP
MAb
MAT
MCS
MDT
MEM
MHC
MSV
NI
NV
OGP
OPD
OPG
PAGE
PAP
PAS
PBS
PCR
PD
PFU
PHA
PPD
PPLO
PRN
Hemadsorción
Solución salina equilibrada de Hanks
Alto número de pases en huevo (virus)
Ácido N-2-hidroxietilpiperazina, N-2etanosulfónico (tampón)
Inhibición de la hemaglutinación
Peroxidasa de rábano
Prueba de inmunodetección
Unidad internacional de la prueba de
fijación de complemento
Índice de patogenicidad intracerebral
Dosis infecciosa media
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Inmunodifusión en gel de agar
Hemaglutinación indirecta
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
Índice de patogenicidad intravenosa
Aglutinación con látex
Dosis letal
Bajo número de pases en huevo (virus)
Anticuerpo monoclonal
Prueba de aglutinación microscópica
Stock de células iniciales
Tiempo letal medio
Medio mínimo esencial
Complejo mayor de histocompatibilidad
Virus inicial de siembra
Índice de neutralización
Neutralización viral
1-octil-beta-D-glucopiranósido (tampón)
Ortofenildiamina (tampón)
Solución conservante con oxalasa-fenol
y glicerina
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Peroxidasa–antiperoxidasa
(procedimiento de tinción)
Reacción de Schiff con ácido periódico
Solución salina tamponada con fosfato
Reacción en cadena de la polimerasa
Dosis protectora
Unidad formadora de calvas o halos
Prueba de hemaglutinación pasiva
Derivado de proteína purificada
Organismos semejantes a los causantes
de pleuroneumonía
Neutralización por reducción de calvas
xvii
Abreviaturas utilizadas en el Manual de animales terrestres
PSG
Solución salina tamponada con fosfato
más glucosa
RBC
Eritrocito
RFLP
Polimorfismo de fragmentos de
restricción
RK
Riñón de conejo
RPM
Revoluciones por minuto
RSA
Aglutinación sérica rápida
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa
con transcripción inversa
SAT
Prueba de aglutinación sérica
SDS
Dodecil sulfato sódico
SNC
SPF
SPG
SRBC
TMB
TSI
UI
VB
VBS
Vero
Sistema nervioso central
Libre de patógeno específico
Sacarosa, fosfato y ácido glutámico
Eritrocito de oveja
Tetrametil benzidina
Medio de hierro y triple azúcar
Unidades internacionales
Tampón veronal
Solución salina tamponada con veronal
Células de riñón de mono verde african
ABREVIATURAS DE LOS NOMBRES DE ENFERMEDADES
AEC
AIE
APO
AVE
BI
BIA
CA
DNC
DVB
EA
EEB
EEE
EEO
EEV
EHC
EM
EV
EVP
EVP
FA
FCM
FVR
GAMV
1
Artritis/encefalitis caprina
Anemia infecciosa equina
Adenomatosis pulmonar ovina
Arteritis vírica equina
Bursitis infecciosa
Bronquitis infecciosa aviar
Clamidiosis aviar
Dermatosis nodular contagiosa
Diarrea vírica bovina
Enfermedad de la frontera
Encefalopatía espongiforme bovina
Encefalomielitis equina del este
Encelalomielitis equina del oeste
Encefalomielitis equina venezolana
Enfermedad hemorrágica del conejo
Enfermedad de Marek
Estomatitis vesícular
Enfermedad vesicular porcina
Enteritis vírica del pato
Fiebre aftosa
Fiebre catarral maligna
Fiebre del Valle del Rift
Gripe aviar muy virulenta
GET
HVP
LA
LBE
LPNM
LPVM
LTI
MV
NPO
PBC
PEA
PNCC
PPA
PPC
PPR
RBI/VPI
RE
SH
SRRP
Gastroenteritis transmisible
Hepatitis vírica del pato
Lengua azul
Leucosis bovina enzoótica
Larva perforada del nuevo mundo
Larva perforada del viejo mundo
Laringotraqueitis infecciosa aviar
Maedi-visna
Neumonía progresiva ovina de las
Ovejas
Pleuroneumonía bovina contagiosa
Peste equina africana
Pleuroneumonía caprina contagiosa
porcino
Peste porcina africana
Peste porcina clásica
Peste de los pequeños rumiantes
Rinotraqueitis bovina infecciosa/
Vulvovaginitis pustular infecciosa
Rinoneumonitis equina
Septicemia hemorrágica
Síndrome reproductivo y respiratorio
Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de
América.
xviii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Las definiciones dadas a continuación se han seleccionado con el criterio restrictivo de incluir
solamente las que pueden ser de utilidad para los usuarios del Manual de animales terrestres.
•
Absorbancia/densidad óptica
Absorbancia y densidad óptica son términos utilizados para indicar la fuerza de la reacción. Se utiliza un
espectrofotómetro para medir la cantidad de luz de la longitud de onda específica absorbida por una muestra, y
la absorbancia es proporcional a la cantidad de material analizado que está presente.
•
Animal de referencia
Cualquier animal cuyo estatus infeccioso pueda definirse de forma inequívoca; puede incluir animales enfermos,
infectados, vacunados, inmunizados o animales sin ninguno de los rasgos anteriores.
•
Armonización
Calibración de métodos de prueba idénticos o similares frente a reactivos internacionales estándar y expresión
de los resultados cuantitativos o semi-cuantitativos de la prueba, que han sido normalizados frente a estándares
de trabajo incorporados en cada realización de la prueba.
•
Característica de la realización
Propiedad del método de prueba; puede incluir la sensibilidad y especificidad analíticas, la exactitud, la
precisión, y/o la sensibilidad y especificidad diagnósticas.
•
Célula maestra (línea, stock, inóculo)
Conjunto de alícuotas de células de un determinado número de pases, que se utilizan en la preparación o
prueba de un producto biológico, se distribuye dentro de recipientes en una operación individual, se procesa
conjuntamente y se almacena de forma que queda garantizada la uniformidad y la estabilidad, y se evita la
contaminación.
•
Células primarias
Grupo de células originales derivadas de tejido normal incluyendo el décimo subcultivo.
•
Centrifugación
En todo el texto del Manual, el promedio de centrifugación se expresa como la fuerza centrífuga relativa,
simbolizada por ‘g’. La fórmula es:
(rpm ‰ 0,10472)2
‰ radio (cm) = g
980
donde rpm es la velocidad del rotor en revoluciones por minuto, y donde radio (cm) es el radio del brazo del rotor
hasta la parte baja del tubo, en centímetros.
Puede ser necesario calcular el rpm necesario para alcanzar un valor dado de g, con un rotor específico. La
fórmula es:
rpm =
«g ‰ 980 /radio (cm)
0,10472
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xix
Glosario de términos
•
Comparación entre laboratorios (Ensayo en anillo)
Cualquier evaluación de la realización de una prueba y/o de la competencia de un laboratorio para ensayar
muestras determinadas, llevada a cabo por dos o más laboratorios; un laboratorio puede actuar como referencia
en la definición de los atributos de las muestras a ensayar.
•
Control del proceso
Los procedimientos de prueba llevados a cabo durante la fabricación de un producto biológico para garantizar
que el producto cumple con las normas de calidad acordados.
•
Controles internos
Todas las actividades tendentes a garantizar la calidad dentro de un laboratorio y que están directamente
relacionadas con el control, la validación, y el mantenimiento de las condiciones de realización y suficiencia
técnica de la prueba.
•
Diluciones
Cuando se dan diluciones para preparar reactivos líquidos, éstas se expresan como, por ejemplo, 1 en 4 partes
o una cuarta parte (1/4), lo que significa que una parte se añade a cuatro partes, es decir, un 20% de la solución
A en B.
•
•
v/v = volumen a volumen (dos líquidos)
•
w/v = peso a volumen (sólido añadido a líquido).
Diluciones utilizadas en las pruebas de neutralización vírica
Hay dos formas convencionales de expresar la dilución utilizada en las pruebas de neutralización vírica (NV). En
Europa es costumbre expresar la dilución antes de la adición del antígeno, pero en Estados Unidos y en otros
lugares, es común expresar las diluciones después de la adición del antígeno.
Estas convenciones alternativas se expresan en el presente Manual como “dilución inicial” o “dilución final”,
respectivamente.
•
Eficacia
Capacidad específica que tiene un producto biológico para producir el resultado esperado, cuando aquél se
utiliza bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.
•
Ensayo
Sinónimo de prueba o método de prueba, como enzimoinmunoensayo o prueba de fijación de complemento.
•
Especificidad (analítica)
Grado en el que los materiales analizados distintos al material problema reaccionan en una prueba; cuanto más
alto sea el nivel de reacciones cruzadas, más baja será la especificidad analítica.
•
Especificidad (diagnóstica)
Proporción de animales de referencia no infectados que se sabe que presentan un resultado negativo en la
prueba; se considera que los animales infectados que presentan un resultado positivo tienen resultados
positivos falsos.
•
Especificidad (relativa)
Proporción de animales de referencia, definidos como negativos mediante un método de prueba o una
combinación de métodos, que también dan resultado negativo en el ensayo que se compara.
•
Espécimen
Material sometido a prueba.
•
Esterilidad
Ausencia de microorganismos contaminantes viables, que se establecerá mediante pruebas autorizadas y
adecuadas.
xx
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Glosario de términos
•
Exactitud
Nivel de concordancia entre el valor obtenido en la prueba y el valor esperado para un estándar de referencia
de actividad o título conocido.
•
Incidencia
Estimación del número de nuevas infecciones en una población susceptible durante un período de tiempo
determinado; no debe confundirse con la prevalencia.
•
Inóculo de producción
Un organismo en un determinado número de pases, que se utiliza, sin propagación adicional, para iniciar la
preparación de un lote de producción.
•
Inóculo de trabajo
Organismo con un número de pases comprendido entre el inóculo original y el inóculo de producción.
•
Inóculo original (agente, cepa)
Conjunto de alícuotas de un organismo de un determinado número de pases, del que se derivan todos los otros
pases del inóculo, que se obtienen de un lote individual, se distribuyen en recipientes en una operación
individual, se procesan conjuntamente y se almacenan de forma que queden aseguradas la uniformidad y la
estabilidad y se eviten la contaminación.
•
Laboratorio de referencia
Laboratorio de reconocido nivel de capacitación científica y diagnóstica en que concierne a una determinada
enfermedad animal y/o a la metodología de pruebas; incluye la capacidad para describir y evaluar los reactivos y
muestras de referencia.
•
Libre de patógenos específicos (SPF)
Animales de los que se ha demostrado, mediante el uso de pruebas adecuadas, que están libres de
microorganismos patógenos específicos; también se refiere a los huevos provenientes de aves SPF.
•
Línea celular
Línea de células transformada y estable que tiene una alta capacidad de multiplicación in vitro.
•
Lote
Todas las vacunas u otros reactivos, tales como antígeno o antisueros, derivados del mismo lote homogéneo e
identificados mediante un solo número de código.
•
Método de la prueba
Procedimiento técnico específico para la detección del material a analizar (sinónimo de ensayo).
•
Muestra
Material obtenido de un espécimen y utilizado en las pruebas.
•
Potencia
La potencia relativa de un producto biológico puesta de manifiesto por los métodos de prueba apropiados.
(Inicialmente, la potencia se mide utilizando una prueba de eficacia en animales. Más tarde aquella puede
correlacionarse con pruebas de contenido antigénico, o respuesta a anticuerpos, para pruebas rutinarias de
potencia de lotes.
•
Precisión
Grado de dispersión de los resultados para una muestra ensayada repetidamente.
•
Prevalencia
Estimación de la proporción de animales infectados dentro de una población en un momento dado. No debe
confundirse con la incidencia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxi
Glosario de términos
•
Producto final(lote)
Todos los recipientes finales sellados, que se han llenado a partir de un mismo lote homogéneo de vacunas en
una sesión de trabajo, liofilizados conjuntamente en una operación continua (si es pertinente), sellados en una
sesión de trabajo e identificados con un número de código único.
•
Prueba de suficiencia
Medición de la competencia del laboratorio mediante la comparación entre laboratorios; esta definición implica
que los laboratorios participantes utilizan los mismos métodos de prueba, los mismos reactivos y controles y que
los resultados se expresan cualitativamente.
•
Pruebas
•
Pruebas alternativas
Métodos de prueba que aparecen en el Manual de Animales Terrestres, que se consideran adecuados
para el diagnóstico de las enfermedades en un ámbito local y que también pueden utilizarse para la
importación y exportación reguladas por convenios bilaterales.
•
Pruebas confirmativas
Métodos de prueba de alta especificidad diagnóstica que se utilizan para confirmar resultados,
generalmente resultados positivos, derivados de otros métodos de prueba.
•
Pruebas de criba
Pruebas de alta sensibilidad diagnóstica adecuadas para aplicación a gran escala.
•
Pruebas prescritas
Los métodos de prueba exigidos por el Código de Sanidad Animal de la OIE para el transporte
internacional de animales y productos animales, y que se consideran óptimos para determinar el estado
sanitario de los animales.
•
Pruebas de equivalencia
Determinación de ciertas características de realización de la prueba, propias de métodos de prueba nuevos y/o
diferentes, mediante la comparación con un método de prueba estándar llevada a cabo por varios laboratorios.
En esta definición está implícito que los laboratorios participantes utilizan sus propios métodos de prueba, sus
reactivos y controles, y que los resultados se expresan de forma cualitativa.
•
Punto de corte/umbral
Valor resultante de una prueba seleccionado para distinguir entre resultados positivos y negativos, y que puede
incluir zonas indeterminadas o sospechosas.
•
Pureza
Calidad de un producto biológico preparado hasta su forma final y:
a)
Relativamente libre de microorganismos y material (orgánico e inorgánico) extraños, lo que vendrá avalado
por métodos de prueba adecuados al producto; y
b)
Libre de microorganismos y material extraños que podrían afectar de forma adversa a la inocuidad, la
potencia o la eficacia del producto.
•
Reacción cruzada
Actividad detectable en un método de prueba, atribuible a un material a analizar procedente de, o producido por
otro organismo que da como resultado una reacción positiva falsa; los ensayos de este tipo tienen una
especificidad analítica baja.
•
Reactivos estándar
•
Reactivos estándar internacionales
Reactivos estándar por medio de los cuales se contrastan los demás reactivos y pruebas; preparados y
distribuidos por un Laboratorio Internacional de Referencia, para ser remitidos a los Laboratorios
Nacionales.
xxii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Glosario de términos
•
Reactivos estándar nacionales
Los reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar internacionales; son
preparados y distribuidos por los laboratorios de referencia nacionales para ser remitidos a las redes de
laboratorios nacionales.
•
Estándares de trabajo (reactivos)
Reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar nacionales; se
incluyen en las pruebas de diagnóstico rutinarias como control y/o para normalización de los resultados de
la prueba.
•
Repetibilidad
Nivel de acuerdo entre las réplicas de una muestra, tanto dentro una aplicación como entre varias aplicaciones
del mismo método de prueba en un mismo laboratorio.
•
Reproducibilidad
La capacidad que una prueba tiene de proporcionar resultados consistentes cuando se aplica a las alícuotas de
la misma muestra en diferentes laboratorios.
•
Seguridad
Ausencia de propiedades causantes de reacciones locales indebidas o sistémicas, cuando se utilizan como
recomendadas o sugeridas por el fabricante, y sin riesgo conocido para los animales próximos, los humanos o el
medio ambiente.
•
Sensibilidad (analítica)
La cantidad más pequeña del material de prueba que se puede detectar; el material de prueba puede consistir
en anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos u organismos vivos.
•
Sensibilidad (diagnóstica)
Proporción de animales de referencia infectados que se sabe que dan resultado positivo en la prueba; se
considera que los animales infectados que presentan un resultado negativo tienen resultados negativos falsos.
•
Sensibilidad (relativa)
Proporción de animales de referencia, definida como positiva por un método o por una combinación de métodos
de prueba, que también presentan un resultado positivo en el ensayo que se compara.
•
Temperatura ambiente
El término “temperatura ambiente” se refiere a la temperatura de un entorno de trabajo confortable. No se
pueden fijar límites precisos para este término, pero las cifras de referencia son 18–25°C. Cuando en una
prueba se especifica la temperatura ambiente, ésta debería lograrse con aire acondicionado, si es preciso; de lo
contrario, los parámetros de la prueba pueden verse afectados.
•
Valor predictivo (negativo)
Proporción de animales con resultado negativo en una prueba sin estar realmente infectados; el valor predictivo
está influido por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia de la infección.
•
Valor predictivo (positivo)
Proporción de animales que están realmente infectados y presentan un resultado positivo en una prueba; el
valor de predicción está influenciado por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia
de la infección
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxiii
COLABORADORES
L IS T A DE C O L A BO RA DO RE S Y DIRE C C IO NE S P RO F E S IO NA L E S
Los capítulos del Manual de animales terrestres han sido confeccionados mediante invitación
expresa de la OIE a sus respectivos autores. Siguiendo el procedimiento estándar de esta
organización, los capítulos se distribuyen entre sus países miembros y entre expertos en la
enfermedad correspondiente a fin de recabar sus comentarios. A continuación, la Comisión de
Estándares Biológicos y el Editor Consultor de la OIE proceden a incorporar al texto las
modificaciones propuestas. Una vez completado el proceso de revisión del texto y finalizada su
redacción, el Manual de animales terrestres se presentó al Comité Internacional de la OIE durante
su Sesión General Anual para su aprobación antes de publicarse. De esta forma, el Manual se ha
convertido en un texto estándar de la OIE como fruto del consenso internacional. Por esta razón,
los nombres de los colaboradores no aparecen en la cabecera del correspondiente capítulo sino
que se ofrecen en un listado global. La Comisión de Estándares Biológicos valora enormemente el
trabajo de los siguientes colaboradores:
I.1.1. Métodos de muestreo
Dr J.E. Pearson
4016 Phoenix St., Ames, Iowa 50014, USA.
I.1.2. Gestión de calidad en los laboratorios de
pruebas veterinarias
Dr A. Wiegers
USDA, APHIS, VS, Center for Veterinary
Biologics, Policy, Evaluation, and Licensing,
Biotechnology, Immunology, and Diagnostics, 510
South 17th Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010,
USA.
I.1.3. Principios de validación para las pruebas de
diagnóstico de enfermedades infecciosas
Dr R. Jacobson (retired)
Formerly Diagnostic Laboratory, College of
Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca,
New York 14850-5786, USA.
I.1.4. Validación y control de calidad de los métodos
de la reacción en cadena de la polimerasa
utilizados para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas
Dr S. Belak & Dr P. Thorén
Department of Virology, National Veterinary
Institute, Ulls väg 2B, SE-751 89 Uppsala,
Sweden
I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de
contaminación en materiales biológicos
Dr L. Elsken
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Suite 104, 510 South 17th Street, Ames, Iowa
50010, USA.
I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios
veterinarios de microbiología
Dr M. Best
Office of Laboratory Security, Centre for
Emergency Preparedness and Response, Health
Canada, Ottawa, Ontario K1A 0K9, Canada.
I.1.7. Principios de producción de vacunas
veterinarias
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
xxiv
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
I.1.8. La Biotecnología en el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas y el desarrollo de
vacunas
Dr J. Gorham
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Microbiology and Pathology,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-7030, USA.
Dr D. Knowles & Dr H. Li
Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-6630, USA.
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
I.1.9. El papel de los organismos oficiales en la
regulación internacional de los productos
biológicos de uso veterinario
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de
recherches avicoles et porcines, Zoopôle des
Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
Dr O. Itoh
National Veterinary Assay Laboratory, JMAFF,
1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511,
Japan.
I.1.10. Métodos de laboratorio para ensayos de
sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos
Dr D. White
Centre for Veterinary Medicine, Food and Drug
Administration, Office of Research, HFV-530,
8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708,
USA.
2.1.1. Fiebre aftosa
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr P.V. Barnett & Dr D.K.J. Mackay
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.2. Estomatitis vesicular
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Dr B. Schmitt
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
xxv
Colaboradores
2.1.3. Enfermedad vesicular porcina
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr D.K.J. Mackay
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.4. Peste bovina
Dr W.P. Taylor
8 South Terrace, Littlehampton, West Sussex
BN17 5NZ, UK.
Dr P. Roeder
Animal Health Service, Animal Production and
Health Division, FAO, Vialle delle Terme di
Caracalla, 00100 Rome, Italy.
2.1.5. Peste de los pequeños rumiantes
Dr A. Diallo
FAO/IAEA Centre for ELISA and Molecular
Techniques in Animal Disease Diagnosis,
International Atomic Energy Agency
Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400
Vienna, Austria.
2.1.6. Pleuroneumonía bovina contagiosa
Dr F. Thiaucourt
CIRAD-EMVT, Campus international de
Baillarguet, Montferriez-sur-Lez, B.P. 5035, 34032
Montpellier Cedex 1, France.
2.1.7. Dermatosis nodular contagiosa
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
2.1.8. Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.1.9. Lengua azul
Dr B. Eaton
Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
2.1.10. Viruela ovina y viruela caprina
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
xxvi
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.1.11. Peste equina africana
Prof. J.M. Sánchez-Vizcaíno
Catedrático del Área de Sanidad Animal,
Universidad Complutense, Facultad de
Veterinaria, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040
Madrid, Spain.
2.1.12. Peste porcina africana
Dr P.J. Wilkinson (retired)
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
2.1.13. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr T. Drew
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.1.14. Gripe aviar muy virulenta
2.1.15. Enfermedad de Newcastle
Dr D.J. Alexander
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.2.1. Carbunco
Dr P.R. Coker
Biological Safety Officer, Office of University
Research Compliance, Oklahoma State
University, Stillwater, Oklahoma 74078, USA.
2.2.2. Enfermedad de Aujeszky
Prof. B. Toma & Prof. N. Haddad
Ecole nationale vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du
Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de
recherches avicoles et porcines, Zoopôle des
Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
2.2.3. Equinococosis/Hidatisodis
Prof. P.S. Craig
Division of Biological Sciences, School of
Environment & Life Sciences, University of
Salford, Salford M5 4WT, UK.
2.2.4. Leptospirosis
Prof. C.A. Bolin
Diagnostic Center for Population & Animal Health,
College of Veterinary Medicine, A3 Veterinary
Medical Center, Michigan State University, East
Lansing, Michigan 48824, USA.
2.2.5. Rabia
Dr F. Cliquet & Dr J. Barrat
AFSSA Nancy, Domaine de Pixérécourt, BP 9,
F-54220 Malzeville, France.
2.2.6. Paratuberculosis (enfermedad de Johne)
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire d’Études et de
Recherches en Pathologie Animale et Zoonoses,
22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxvii
Colaboradores
Dr E. Camus
CIRAD-EMVT, Campus International de
Baillarguet – TA/30B, 34398 Montpellier Cedex 5,
France.
2.2.7. Cowdriosis
Dr D. Martinez
CIRAD-EMVT, Domaine de Duclos, Prise d’Eau,
97170 Petit-Bourg, Guadeloupe.
Prof. F. Jongejan
Department of Parasitology & Tropical Veterinary
Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht
University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht,
The Netherlands
AND
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.2.8. Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia
hominivorax) y del Viejo Mundo (Chrysomya
bezziana)
Dr M.J.R. Hall
Department of Entomology, The Natural History
Museum, Cromwell Road, London SW7 5BD, UK.
2.2.9. Triquinelosis
Dr H.R. Gamble
Director, Fellowships Office, National Research
Council, 500 Fifth Street NW, Washington DC
20001, USA.
2.2.10. Fiebre Q
Dr E. Rousset, Dr P. Russo, Dr M. Pépin,
& M.F. Aubert
AFSSA Sophia Antipolis, Laboratoire d’Études et
de Recherches sure les Petits Ruminants et les
Abeilles, Les Templiers, 105 route des Chappes,
BP 111, 06902 Sophia Antipolis Cedex, France.
2.2.11. Leishmaniosis
Dr L. Gradoni & Dr M. Gramiccia
Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio
di Parassitologia, Viale Regina Elena 299,
I-00161 Rome, Italy.
2.3.1. Brucelosis bovina
Dr K. Nielsen
Canadian Food Inspection Agency, Animal
Diseases Research Institute, P.O. Box 11300,
Station H, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
Dr D.R. Ewalt
Mycobacteria and Brucella Section, Diagnostic
Bacteriology Laboratory, National Veterinary
Services Laboratories, 1800 Dayton Road, Ames,
Iowa 50010, USA.
Y la importante contribución del Grupo Ad hoc de la
OIE en Brucelosis:
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA Alfort, Unité Zoonoses Bactériennes, Lab.
OIE/FAO de référence pour la brucellose, 22 rue
Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr A.P. MacMillan
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Dr Peter Wright
Canadian Food Inspection Agency, National
Centre for Foreign Animal Disease, 1015
Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4,
Canada
2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina
xxviii
Dr J.A. Wagenaar & M.A.P. Van Bergen, BSc
Animal Sciences Group, P.O. Box 65, 8200 AB
Lelystad, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.3.3. Tuberculosis bovina
Dr N.M.A. Palmer
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.3.4. Leucosis bovina enzoótica
Dr L. Renström
National Veterinary Institute, Department of
Virology, SE-751 89 Uppsala, Sweden.
2.3.5. Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis
pustular infecciosa
Prof. J.T. van Oirschot
Animal Sciences Group - Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB, Lelystad, The Netherlands.
2.3.6. Tricomonosis
Prof. M. Taylor
Veterinary Surveillance Unit, Central Science
Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, UK.
Dr A.A. Gajadhar & Dr S. Parker
Canadian Food Inspection Agency, Saskatoon
Laboratory, 116 Veterinary Road, Saskatoon,
Saskatchewan S7N 2R3, Canada.
2.3.7. Anaplasmosis bovina
Prof. T.F. McElwain
Washington State University, Animal Disease
Diagnostic Laboratory, 155 Bustad Hall, Pullman,
Washington 99164-7034, USA.
2.3.8. Babesiosis bovina
Dr R.E. Bock
Queensland Department of Primary Industries,
Animal and Plant Health Service, Tick Fever
Research Centre, 280 Grindle Road, Wacol,
Queensland 4076, Australia.
Dr W.K. Jorgensen & Mr J.B. Molloy
Queensland Department of Primary Industries,
Agency for Food & Fibre Sciences, 665 Fairfield
Rd, Yeerongpilly, Queensland 4105, Australia.
2.3.9. Cisticercosis bovina (ver capítulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.3.10. Dermatofilosis
Prof. D.H. Lloyd
Dept of Veterinary Clinical Sciences, Royal
Veterinary College, Hawkshead Lane, North
Mymms, Hatfield, Hertfordshire AL9 7TA, UK.
2.3.11. Teileriosis
Prof. E. Pipano
Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew
University of Jerusalem, P.O. Box 12 Rehovot,
Israel.
Dr S. Morzaria
FAO Regional Office for Asia and the Pacific,
39 Phra Athit Road, Bangkok 10200, Thailand.
Dr P. Spooner
International Livestock Research Institute,
Naivasha Road, Nairobi 00100, Kenya.
Dr V. Shkap
Division of Parasitology, Kimron Veterinary
Institute, P.O. Box 12, Beit Dagan, 50250 Israel.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxix
Colaboradores
2.3.12 Septicemia hemorrágica
Dr S. Chandrasekaran
Veterinary Research Institute, 59 Jalan Suntan
Azlan Shah, P.O. Box 369, 31400 Ipoh, Perak,
Malaysia.
Dr K. Townsend
Diagnostic Bacteriology Laboratory, Veterinary
Pathology and Anatomy, School of Veterinary
Science, The University of Queensland, Brisbane
QLD 4072, Australia.
2.3.13. Encefalopatía espongiforme bovina
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey, Dr M.M. Simmons,
Mr M. Stack, Mr G.A.H. Wells & Prof. J.W.
Wilesmith
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.3.14. Fiebre catarral maligna
Dr H.W. Reid
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.3.15. Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé
tsé)
Dr J. Schlater
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
Dr P. Van Den Bossche
Veterinary Department, Institute of Tropical
Medicine, Nationalestraat 155, 2000 Antwerpen
Belgium
AND
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Post Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa
2.4.1. Epididimitis ovina (Brucella ovis)
2.4.2. Brucelosis caprina y ovina (excluyendo la
infección por Brucella ovis)
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA, Unité Zoonoses Bactériennes, OIE
Reference Laboratory/FAO Collaborating Centre
for Brucellosis, BP 67, F-94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
Dr J.M. Blasco
Dpt Sanidad Animal, Servicio de Investigacion
Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza,
Spain.
2.4.3. Agalaxia contagiosa
Dr R. Nicholas
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.4.4/5. Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
Dr D. Knowles & Dr L.M. Herrmann
Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-6630, USA.
2.4.6. Pleuroneumonía caprina contagiosa
Dr F.R Rurangirwa
Department of Veterinary Microbiology and
Pathology, Washington State University, Pullman,
Washington 99164-7040, USA.
Dr J.H. Kinyili
Kenya Veterinary Vaccines Production Institute,
P.O. Box 53260, Nairobi, Kenya.
2.4.7. Aborto enzoótico de las ovejas (Clamidiosis
ovina)
xxx
Prof. I.D. Aitken & and Dr D. Longbottom
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park
Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, UK.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.4.8. Prurigo lumbar
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey Dr M.M. Simmons,
Mr M. Stack & Mr G.A.H. Wells
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.4.9. Adenomatosis pulmonar ovina
Dr J.M. Sharp
VLA, Pentlands Science Park, Bush Loan,
Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.4.10. Enfermedad de Nairobi (ver capítulo 2.10.2.)
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.4.11. Salmonelosis (S. abortus ovis)
(ver capítulo 2.10.3.)
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Prof. M. Truszczynski
National Veterinary Research Institute,
57 Partyzantow St., 24-100 Pulawy, Poland.
2.5.1. Metritis equina contagiosa
Dr N. Chanter
Intervet UK Ltd, Walton Manor, Walton, Milton
Keynes MK7 7AJ, UK.
2.5.2. Durina
Dr J.B. Katz
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste)
2.5.4. Anemia infecciosa equina
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.5. Gripe equina
Dr J. Daly
Animal Health Trust, Lanwades Park, Kentford,
Newmarket, Suffolk CB8 7UU, UK.
2.5.6. Piroplasmosis equina
Dr D.T. de Waal
University College Dublin, Faculty of Veterinary
Medicine, Department of Veterinary Microbiology
& Parasitology, Belfield, Dublin 4, Ireland.
2.5.7. Rinoneumonitis equina
Dr G.P. Allen
Department of Veterinary Science,
College of Agriculture, University of Kentucky, 108
M.H. Gluck Equine Research Center, Lexington,
Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.8. Muermo
Dr N.K. Bookova,
All-Russian State Centre for Quality and
Standardisation of Veterinary Drugs and Feeds,
Ministry of Agriculture of the Russian Federation,
5, Zvenigorodskoye shosse, 123022 Moscow,
RUSSIA.
2.5.10. Arteritis vírica equina
Dr P.J. Timoney
University of Kentucky, Department of Veterinary
Science, 108 Gluck Equine Research Center,
Lexington, Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.12. Encefalomielitis equina venezolana
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.13. Linfangitis epizoótica
Dr J.A.W. Coetzer
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Private Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxi
Colaboradores
2.5.14. Encefalitis japonesa
Dr I. Takashima
Laboratory of Public Health, Department of
Environmental Veterinary Sciences,
Graduate School of Veterinary Medicine,
Hokkaido University, Sapporo 060-0818, Japan.
2.5.15. Tripanosomosis (Trypanosoma evansi)
Dr A.G. Luckins
Centre for Tropical Veterinary Medicine, Easter
Bush Veterinary Centre, Roslin, Midlothian,
Scotland EH25 9RG, UK.
2.6.1. Rinitis atrófica porcina
Dr K. Register
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.2. Brucelosis porcina
Dr Steve Olsen,
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.3. Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente
enfermedades de Teschen/Talfan)
Dr V. Mádr
Hudcova 66, 62100 Brno, Czech Republic.
2.6.4. Gastroenteritis transmisible
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr L.J. Saif
The Ohio State Universtiy, Ohio Agricultural
Research and Development Center, Food Animal
Health Research Program, 1680 Madison
Avenue, Wooster, Ohio 44691-4096, USA.
2.6.5. Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
Dr L.R. Ludemann
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
Dr R. Magar
Agence canadienne d’inspection des aliments,
Laboratoire d’hygiène vétérinaire et alimentaire,
3400 Casavant ouest, Saint-Hyacinthe, Québec
J2S 8E3, Canada.
2.6.6. Cisticercosis porcina (ver capítulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.7.1. Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro)
Dr N. Eterradossi
AFSSA Ploufragan, Unité de virologie,
immunologie et parasitologie aviaires et
cunicoles, BP 53, 22440 Ploufragan, France
2.7.2. Enfermedad de Marek
Dr J.M. Sharma
Veterinary PathoBiology, College of Veterinary
Medicine, University of Minnesota, St Paul,
Minnesota 55127, USA.
2.7.3. Micoplasmosis aviar
(Mycoplasma gallisepticum)
Dr S.H. Kleven
University of Georgia, College of Veterinary
Medicine, Department of Avian Medicine, Athens,
Georgia 30602-4875, USA.
Dr F.T.W. Jordan & Dr J.M. Bradbury
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Veterinary Field Station, Leahurst,
Neston, South Wirral CH64 7TE, UK.
2.7.4. Clamidiosis aviar
xxxii
Dr A.A. Andersen
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
P.O. Box 70, Ames, Iowa 50010, USA.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.7.5. Pulorosis y tifosis aviar
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.7.6. Bronquitis infecciosa aviar
Dr R. Gough (retired) & Dr D.J. Alexander
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.7.7. Laringotraqueitis infecciosa aviar
Dr R.C. Jones
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Jordan Building, Veterinary Field
Station, ‘Leahurst’, Neston, South Wirral
CH64 7TE, UK.
2.7.8. Tuberculosis aviar
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire central de recherches
vétérinaires, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703
Maisons-Alfort Cedex, France.
2.7.9. Hepatitis vírica del pato
2.7.10. Enteritis vírica del pato
Dr P.R. Woolcock
California Animal Health and Food Safety
Laboratory System – Fresno Branch, School of
Veterinary Medicine, University of California,
Davis, 2789 South Orange Avenue, Fresno,
California 93725, USA.
2.7.11. Cólera aviar (Pasteurelosis aviar)
Dr R. Kunkle,
National Animal Disease Center, P.O. Box 70,
Ames, Iowa 50010, USA.
2.7.12. Viruela aviar
Dr D.N. Tripathy
University of Illinois at Urbana-Champaign,
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Pathbiology, 2001 South Lincoln
Avenue, Urbana, Illinois 61802, USA.
2.8.1. Mixomatosis
Prof. J. Chantal (retired) & Prof. S. Bertagnoli
École Nationale Vétérinaire, 23 Chemin de
Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France.
2.8.2. Tularemia
Dr T. Mörner
Department of Wildlife, The National Veterinary
Institute, 751 89 Uppsala, Sweden
Dr G. Sandström
Department of Clinical Immunology, Infectious
Diseases, Umeå University and National Defence
Research Establishment, SE-901 82 Umeå,
Sweden.
2.8.3. Enfermedad hemorrágica del conejo
Dr A. Lavazza & Dr L. Capucci
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della
Lombardia e dell’Emilia Romagna, Via Bianchi
7/9, 25124 Brescia, Italy.
2.9.1. Acariosis de las abejas
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.2. Loque americana
Prof. D.C. de Graaf
Laboratory of Zoophysiology, University of Gent,
K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium.
2.9.3. Loque europea
Dr B.V. Ball
Plant and Invertebrate Ecology Division,
Rothamstead Research, Harpenden,
Hertfordshire AL5 2JQ, UK.
2.9.4. Nosemosis de las abejas
Dr A. de Ruijter
Research Centre for Insect Pollination and
Beekeeping, Ambrosiusweg 1, 5081 NV
Hilvarenbeek, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxiii
Colaboradores
2.9.5. Varroosis
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.6. Infestación de las abejas melíferas por
Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T. koenigerum)
Dr D. Sammataro
Carl Hayden Honey Bee Research Center,
2000 East Allen Road, Tucson, Arizona 857191596, USA.
2.10.1. Cisticercosis
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.10.2. Enfermedades bunyavirales de animales
excluyendo la Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.10.3. Salmonelosis
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.4. Sarna
Dr P. Bates
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.5. Enfermedad de la frontera
Dr P.F. Nettleton
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.10.6. Diarrea vírica bovina
Dr T. Drew
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.7. Encefalitis del Oeste del Nilo
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
United States of America.
2.10.8. Campylobacterosis
Dr Diane Newell
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Dr W.F. Jacobs-Reitsma & Dr J.A. Wagenaar
Animal Sciences Group, Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB Lelystad, The Netherlands.
2.10.9. Criptosporidiosis
Prof. H. Smith
Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill
General Hospital, Glasgow G21 3UW, UK.
2.10.10. Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
Dr B.T. Eaton & Dr P. Daniels
Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
Dr M. Narasiman
Veterinary Research Institute, 59, Jalan Sultan
Azlan Shah, 31400 Ipoh, Perak, Malaysia.
2.10.11. Gripe porcina
Dr S.L. Swenson
National Veterinary Services Laboratories, P.O.
Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.
Dr P.L. Foley
Center for Veterinary Biologics, 510 S. 17th St.,
Suite 104, Ames, IA 50010 USA
2.10.12. Toxoplasmosis
xxxiv
Dr D. Buxton & Dr S.W. Maley
Moredun Research Institute, Pentlands Science
Park, Bush Loan, by Edinburgh EH26 0PZ,
Scotland, UK.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.10.13. Escherichia coli Verocitotoxigénica
Dr F.A. Clifton-Hadley
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.14. Listeria monocytogenes
Dr Jose Lopez
Canadian Food Inspection Agency,
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxv
C O MIT É D IRE C T O R P A RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L
DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S F O R T E RRE S T RIA L A NIMA L S Y
E L A BO RA C IÓ N DE UNA B A S E T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE
L A S A NIDA D A NIMA L .
Presidente
Vicepresidente
Excmo. Sr. D. Bernard Vallat
Ilmo. Sr. D. Jean-Luc Angot
Director General
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: b.vallat@oie.int
Jefe del Servicio Administrativo y Financiero
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: l-l.angot@oie.int
Vocales
Ilmo. Sr. D. Arnaldo Cabello Navarro
Dra. Dña. Luz Alba Cruz de Urbina
Subgerente de Prevención y Control
Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Calle 37 nº 8-43 PISO 4 Y 5.
Apartado Aéreo 7984 y 1511123
El Dorado
Santa Fe de Bogotá. Colombia.
Tfno: (57-1) 32 o 3654
Fax: (57-1) 232 4695
Correo electrónico: savinal@elsitio.net.co
Subdirector General de Sanidad Animal.
Dirección General de Ganadería.
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.
Corazón de María nº 8
28002 Madrid.
Tfno: 34 91 3 47 83 24
Fax: 34 91 3 47 82 99
Correo electrónico: acabello@mapya.es
Dr. D. Rodolfo César Acerbi
Dr. D. Emerio F. Serrano Ramírez
Coordinador Relaciones Internacionales e
Institucionales
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria SENASA
Avda. Paseo Colón. 367 – 5º p.cont.
1063 Buenos Aires.
Republica Argentina
Tfno: 00 (54) 11 4331-6041/9 INT. 1323
Fax: 00 (54) 11 4334-4738
Correo electrónico: relint@inea.com.ar
Director General del Instituto de
Medicina Veterinaria.
Ministerio de Agricultura.
Calle 12 nº 355, entre 17 y 17ª
El Vedado.
Zona Postal 10400
Ciudad de la Habana. Cuba.
Tfno: (53-7) 83 06 6 15
Fax: (53-7) 830 35 37
Correo electrónico: dnimv@infoued.sld.cv
Secretario
Coordinador de la OIE
Profesor Dr. D. Fernando Crespo León
Profesor Dr. D. Alejandro Schudel.
Experto de la OIE
Organización Mundial de Sanidad Animal
y de la Unión Europea
Investigador del Departamento de
Ganadería y Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigación y Desarrollo Agrario
y Alimentario. (IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
España.
Tfno: 00 34 968 36 67 99
Fax: 00 34 968 36 67 92
Correo electrónico: fernando.crespo@carm.es
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Jefe del Servicio Científico y Técnico
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: a.schudel@oie.int
xxxvi
Colaboradores
C O O RDINA C IÓ N
C IE NT ÍF IC O - T É C NIC A
DE L A TRA DUC C IÓ N
Profesor Dr. D. Fernando Crespo León
Experto de la OIE
Organización Mundial de Sanidad Animal
y de la Unión Europea
Investigador del Departamento de Ganadería y
Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigación y Desarrollo Agrario
y Alimentario.(IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
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C O O RDINA C IÓ N
L INGÜÍS T IC A Y
TRA DUC TO L Ó GIC A
Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción
e Interpretación de la Universidad de Murcia
Dpto. de Filología Inglesa
C/ Santo Cristo nº 1. 30071. Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrónico: fgut@um.es
G RUPO A D HO C PA RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L
DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S Y E L A BO RA C IÓ N DE L A B A S E
T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE L A S A NIDA D A NIMA L .
Profesor Dr. D. Elías Fernando Rodríguez Ferri
Catedrático de Microbiología e Inmunología de la
Facultad de Veterinaria
Departamento de Sanidad Animal
Universidad de León
Campus de Vagazana. 24071 León. España
Tfno: 00 34 987 29 12 97
Fax: 00 34 987 29 11 94
Correo electrónico: dsaerf@isidoro.unileon.es
Profesor Dr. D. Luis León Vizcaíno
Catedrático de Patología Infecciosa de la
Facultad de Veterinaria
Universidad de Murcia, España.
Departamento de Sanidad Animal
Campus de Espinardo. 30100 Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 47 32
Fax: 00 34 968 36 41 47
Correo electrónico: lleonvi@um.es
Profesor Dr. D. Emilio J. Gimeno
Coordinator of OIE Representation for the
Americas (RR/AA)
Cerviño 3101
1425 Buenos Aires. República de Argentina
Tfno: (54-11) 48 03 48 77
Fax: (54-11) 48 03 36 88
Correo electrónico: rr.americas@oie.int
Profesor Dr. D. José Joaquín Cerón Madrigal
Profesor Titular del Departamento de Medicina y
Cirugía Animal
Facultad de Veterinaria
Universidad de Murcia
Campus de Espinardo. 30100 Murcia. España
Tfno: 968 36 47 22
Fax: 968 36 41 47
Correo electrónico: jjceron@um.es
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción e
Interpretación de la Universidad de Murcia.
Dpto. de Filología Inglesa. C/ Santo Cristo nº 1.
30071. Murcia, España.
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrónico: fgut@um.es
Profesor Dr. Pascual Cantos Gómez
Profesor Titular de Filología Inglesa.
Departamento de Filología Inglesa
Universidad de Murcia
Campus La Merced. C/ Santo Cristo nº 1.
30071. Murcia España.
Tfno: 00 34 968 36 43 65
Fax: 00 34 968 36 31 85
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Profesor Dr. D. Alejandro Schudel
Jefe del Servicio Científico y Técnico
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
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Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción e
Interpretación de la Universidad de Murcia.
Dpto. de Filología Inglesa. C/ Santo Cristo nº 1
30071. Murcia, España.
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Colaboradores
T RA DUC TO RE S
Profesor Dr. D. Mariano Gacto Fernández
Catedrático de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, España
Fax. 00 34 968 36 39 63
Tfno: 00 34 968 36 71 32
Correo electrónico: maga@um.es
Profesora Dra. Dña. Purificación Sánchez
Hernández
Profesora Titular de Filología Inglesa
Universidad de Murcia
Profesora del Máster de Traducción e
Interpretación
Dpto. Filología Inglesa, C/ Santo Cristo, 1.30071-Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 48 67
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrónico: purisan@um.es
Profesora Dra. Dña. Jerónima Vicente Soler
Profesora Titular de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética,
Campus de Espinardo, 30071-Murcia,
España
Tfno: 00 34 968 43 03 29
Fax: 00 34 968 36 39 63
Correo electrónico: jerovic@um.es
Profesor Dr. D. José Cansado Vizoso
Dña. Elena Cuadrado Caparrós
Licenciada en Biología y Máster en
Traducción e Interpretación
Tfno: 00 34 968 21 55 24
Correo electrónico: islaplana@telefónica.net
Dña. Ruth Elena Pérez
Licenciada en Filología Inglesa y Máster en
Traducción e Interpretación
C/ Olor Palme, 1, 7º B.- 30009-Murcia, España
Tfno: 00 34 968 29 45 93
Correo electrónico: rutelena@ono.com
Profesor Titular de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, España
Fax: 968-363963
Tfno: 00 34 968 36 49 53
Correo electrónico: jcansado@um.es
*
* *
xxxviii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
PARTE I
INFORMACIÓN GENERAL
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1
SECCIÓN I.1.
CAPÍTULOS INTRODUCTORIOS
CAPÍTULO I.1.1.
MÉTODOS DE MUESTREO
INTRODUCCIÓN
El punto de partida para la investigación de una enfermedad animal en el laboratorio es la toma de
muestras. Este primer capítulo introductorio trata algunos de los principios generales relativos a la
toma, envío y almacenamiento de muestras. Cada uno de los capítulos sobre enfermedades de
este Manual proporciona información específica sobre la toma de muestras para esa enfermedad
concreta. Las muestras pueden tomarse de los animales o de su entorno con diferentes fines, tales
como el diagnóstico de enfermedades, vigilancia de enfermedades, certificado sanitario o
seguimiento de la respuesta a un tratamiento o a la vacunación. Para proporcionar resultados
estadísticos válidos, las muestras recogidas deberán ser idóneas para el fin que se persigue y
adecuadas en cuanto al número y cantidad. Los laboratorios de diagnóstico solicitan la entrega de
muestras adecuadas que lleguen al laboratorio en buenas condiciones. Para el diagnóstico de una
enfermedad, los tejidos muestreados deberán ser representativos de la enfermedad investigada y
de las lesiones observadas. Las muestras deben tomarse cuidadosamente con el fin de evitar
cualquier lesión o estrés excesivo para el animal o cualquier peligro para el operador. Las
muestras deben tomarse de forma aséptica y se debe tener cuidado para evitar la contaminación
cruzada.
Las muestras deben embalarse, etiquetarse y enviarse al laboratorio por el procedimiento más
rápido posible, controlando convenientemente la temperatura. Se deben seguir los requisitos
específicos para el embalaje y expedición de especímenes para diagnóstico y sustancias
infecciosas. También es necesario que el expedidor reciba instrucción sobre los procedimientos de
expedición. Cuando se vaya a enviar material a un laboratorio de otro país, se consultará
previamente con dicho laboratorio para asegurarse de que está dispuesto a recibir el material y a
obtener la correspondiente licencia de importación. Todas las muestras deberán acompañarse de
una carta o formulario de envío en el que se indique el nombre y la dirección del remitente, el
origen del material, el historial pertinente, identificación del animal y espécimen correspondiente y
las pruebas solicitadas.
A. RECOGIDA DE MUESTRAS
Antes de tomar las muestras, debe tenerse en cuenta el fin para el que se solicitan. Dicho fin determinará el tipo
y número de muestras necesarias para obtener resultados válidos. Cuando las muestras se tomen de animales
vivos, se llevará cuidado para evitar heridas o sufrimiento al animal o cualquier peligro para el operador y sus
ayudantes. Puede ser necesario el uso de sujeción mecánica, de anestésicos o de tranquilizantes. Siempre que
se maneje material biológico de animales vivos o muertos, debe tenerse en cuenta el riesgo de contraer una
enfermedad zoonósica y, por lo tanto, deben tomarse precauciones para evitar la infección humana (véase
también el Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios de microbiología veterinaria). Los exámenes
post-mortem deben realizarse bajo las más estrictas condiciones de asepsia posibles. Hay que procurar evitar la
contaminación ambiental o el riesgo de propagar la enfermedad a través de insectos o fomites. Debe organizarse
la forma apropiada y segura de deshacerse de animales y tejidos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
3
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
Se requieren bastante habilidad y cuidado para decidir qué muestras son apropiadas para enviar al laboratorio.
Las muestras recogidas deben ser representativas de la enfermedad que se está investigando y de las lesiones
observadas. Con frecuencia, se requiere un combinado de muestras de sangre para pruebas serológicas y de
tejidos procedentes de animales muertos o sacrificados selectivamente para cultivos microbiológicos. Más
adelante, dentro de este capítulo, se describen recomendaciones para el transporte.
Los capítulos sobre enfermedades contenidos en este Manual proporcionan una guía sobre las muestras que
deben tomarse, y, por lo tanto, no repetiremos aquí esa información. Además, las autoridades nacionales e
internacionales han elaborado los procedimientos para la recogida de muestras y su envío (2, 4, 8, 11, 12). Estas
publicaciones ofrecen recomendaciones detalladas de muestras concretas que hay que tomar de diferentes
especies, y sobre una amplia variedad de enfermedades de cuya existencia se sospecha. También proporcionan
información sobre los procedimientos post-mortem, listados de medios apropiados e instrucciones sobre el envío
de muestras. Se debería contactar con el laboratorio que vaya a realizar las pruebas para dilucidar cualquier
cuestión relacionada con el tipo de muestreo a realizar.
1.
Toma de muestras de animales vivos
a)
Sangre
Las muestras de sangre pueden tomarse para análisis hematológico, para cultivos y/o para el examen
directo de bacterias, virus o protozoos, en cuyo caso es normal el uso de anticoagulantes, como el etilén
diamino tetra-acético (EDTA) o heparina. También se pueden tomar para pruebas serológicas, en cuyo
caso se necesita una muestra coagulada. El plasma sanguíneo también se usa para algunos
procedimientos. Las muestras de sangre se toman mediante venepuntura, de la forma más limpia posible.
En la mayoría de los grandes mamíferos, se utiliza la vena yugular o una vena caudal, pero también se
pueden utilizar venas braquiales y mamarias. En las aves, generalmente se utiliza una vena del ala (vena
braquial). En los animales pequeños de laboratorio, las venas auricular o retroorbital pueden ser útiles para
obtener muestras de sangre, pudiéndose obtener ésta también por punzamiento del corazón. La sangre se
puede extraer con una jeringa y aguja o con una aguja y un tubo de vacío (no es fácil con venas delicadas,
pero es cómodo con venas gruesas). Se pueden obtener cómodamente pequeñas cantidades de sangre
mediante punción con una aguja triangular de punta sólida. Lo ideal sería rasurar (o desplumar) la piel del
lugar de la punción, frotarla con alcohol etílico al 70% y dejarla secar.
Cuando las muestras se recogen con anticoagulante, es preciso mezclarlas por completo mediante
agitación suave inmediatamente después de su recogida. Es preciso mezclar bien las muestras tomadas
con anticoagulantes y/o antibióticos tan pronto como se tomen éstas. También puede ser necesario hacer
un frotis sanguíneo en un portaobjetos; se pueden preparar semiextensiones y extensiones de sangre. Para
las muestras de suero, la sangre debe dejarse a temperatura ambiente, pero protegida del calor o frío
excesivos, durante 1-2 horas, hasta que el coágulo empiece a retraerse. Entonces, se recoge el coágulo
con una varilla estéril, girándola, y se colocan los frascos en el frigorífico a 4° C. La muestra se puede
centrifugar a 1000 g durante 10-15 minutos después de unas horas o al día siguiente, y el suero se puede
decantar o quitar con una pipeta. Con los sueros que van a utilizarse para pruebas de neutralización de
virus, deben evitarse los conservantes químicos, tales como el ácido bórico o el tiomersal (mertiolato). A
menudo, será necesario tomar muestras de suero pareadas para determinar los títulos de los anticuerpos
con intervalos de 14 días. Un método alternativo para el transporte de sangre, que se va a usar en pruebas
de sensibilidad a anticuerpos, es la colocación de una gota de sangre sobre papel de filtro; la sangre se
seca a temperatura ambiente y la muestra puede entonces remitirse sin necesidad de refrigeración.
b)
Heces
Se deben utilizar al menos 10 g de heces recién evacuadas, enviándolas con o sin medio de transporte. Las
heces para análisis parasitológico deben llenar por completo el recipiente y enviarse con refrigeración para
impedir la eclosión de los huevos de los parásitos, y deben llegar al laboratorio antes de transcurridas 24
horas. Deben utilizarse botellas con tapón de rosca o bolsas de plástico para el transporte. Debe evitarse el
uso de tubos con tapón de goma, pues el gas que se genera puede expulsar el tapón del tubo destruyendo
así la integridad de la muestra y contaminando otras muestras del mismo paquete. Un método alternativo y
a menudo preferible consiste en tomar muestras del recto (o cloaca), procurando arrastrar la superficie
mucosa. Los hisopos deben estar visiblemente cubiertos de materia fecal; sin embargo las muestras
recogidas con hisopos no suelen ser adecuadas para el análisis parasitológico. Se debe tener cuidado al
tomar muestras de animales pequeños y delicados o de aves, para no herirlos; se deberían utilizar los
hisopos pequeños que se encuentran en el mercado. Los hisopos deben colocarse en un medio de
transporte. Las heces se deben almacenar y transportar a 4°C.
c)
4
Piel
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
Las muestras se tomarán de las lesiones mismas, en el caso de enfermedades que producen erupciones
vesiculares: se tomarán 2 g del tejido epitelial afectado de la forma más aséptica posible, y se depositarán
en 5 ml de medio de transporte de virus con glicerina tamponada con fosfato o caldo de triptosa tamponada
con Tris, a pH 7,6. Además, las muestras de fluido vesicular deben tomarse por aspiración con una jeringa,
en donde haya vesículas intactas, y depositarse en un tubo estéril independiente. Las muestras de pelo o
lana son útiles en los caso de infección por ácaros de superficie, piojos y hongos. Para la detección del
antígeno vírico, cuando se sospecha la presencia de la enfermedad de Marek, pueden obtenerse piojos
“excavadores” mediante raspado profundo con el borde de un escalpelo, y, en el caso de las aves, pueden
tomarse las puntas de las alas.
d)
Tracto genital y semen
Las muestras pueden tomarse mediante lavado vaginal y prepucial o utilizando hisopos adecuados. El
cérvix y la uretra se muestrean por raspado. Las mejores muestras de semen se obtienen mediante una
vagina artificial o por extrusión y estimulación artificial del pene. La muestra debe contener una fracción rica
en esperma y debe evitarse la contaminación, mediante el lavado con una solución antiséptica. A menudo
se requieren medios y condiciones de transporte.
e)
Ojos
La muestra de la conjuntiva puede tomarse separando el párpado y arrastrando suavemente por la
superficie. A continuación, el hisopo debe colocarse en un medio de transporte. Los raspados también se
pueden depositar sobre portaobjetos. En este caso, las asas de los hisopos de mango de metal son útiles
para asegurarse de que se retiran suficientes células para el estudio microscópico. Sólo en raras ocasiones
son útiles las secreciones mucopurulentas nasales y lacrimales.
f)
Exudados nasales (saliva, lágrimas)
Las muestras también se pueden tomar con hisopos de dracón, algodón o gasa, preferiblemente con
mangos de alambre, ya que la madera no es flexible y se puede partir. Puede resultar útil humedecer el
hisopo con medio de cultivo antes de tomar la muestra. Es conveniente dejar el hisopo en contacto con las
secreciones durante 1 minuto, colocarlo después en un medio de transporte, y enviarlo al laboratorio sin
demora, a 4°C. Se deberían utilizar hisopos nasofaríngeos con protección duradera para recoger muestras
en algunos casos sospechosos de infección vírica.
g)
Leche
Las muestras de leche deben tomarse después de limpiar y secar el pezón, evitando el uso de antisépticos.
Debe desecharse el primer chorro de leche y llenar un tubo con el chorro o chorros siguientes. Para algunas
pruebas, puede tomarse la muestra de leche de un tanque de almacenamiento. La leche para pruebas
serológicas no se debe congelar, calentar o agitar de forma enérgica. Puede añadirse conservante a las
muestras de leche recogidas para pruebas serológicas si se va a tardar en enviarlas al laboratorio. Si es
preciso se puede congelar la leche destinada a análisis bacteriológico.
2.
Toma de muestras en los exámenes post-mortem
Al realizar el examen post-mortem, se pueden tomar muestras de tejidos de diferentes órganos. En la mayoría de
los libros de texto de patología, se detallan los procedimientos para la realización de exámenes post - mortem y
para la toma de muestras. Se ha publicado una guía sobre los procedimientos de necropsia (10). Las técnicas
post- mortem se recogen también en algunas de las directrices nacionales (2, 4, 8). En este apartado se ofrece
un resumen de estos procedimientos.
Se debe instruir al personal veterinario sobre los procedimientos que deben seguirse en un examen post-mortem
de los animales con los que trabajan. El equipo necesario para realizar este trabajo dependerá del tamaño y de
la especie del animal y se requerirán un cuchillo, una sierra, un hacha y también bisturí, fórceps y tijeras,
incluidas unas con punta curva en una de sus hojas para abrir los intestinos. Debe disponerse de un abundante
número de recipientes adecuados a la naturaleza de la muestra, así como de etiquetas y formularios de informe.
Los recipientes deben etiquetarse perfectamente con la fecha y la identificación del tejido y del animal antes de
comenzar la necropsia. Pueden necesitarse medios especiales para el transporte de las muestras desde el lugar
en el que se toma la muestra. El operador debería llevar vestimenta protectora (traje de protección lavable y
guantes y botas de goma). Además, si se están investigando posibles enfermedades zoonósicas, el examen
post-mortem debería realizarse en una cabina de seguridad biológica; si esto no es posible, se debería llevar una
mascarilla y protección para los ojos. Es normal separar la cabeza del animal, si se sospecha de la rabia o de
encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs).
Los tejidos se recogen para realizar cultivos microbiológicos, diagnósticos de parásitos, análisis bioquímicos,
estudios histopatológicos y/o inmunopatológicos, y para la detección de proteínas o ácidos nucleicos del
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
5
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
genoma. La persona que realice el examen post-mortem debe poseer conocimientos de anatomía y patología
suficientes para seleccionar los órganos correctos y las lesiones más favorables para el muestreo. Cada trozo de
tejido se debe colocar en una bolsa de plástico independiente perfectamente rotulada o en un bote con tapa de
rosca. Se debe utilizar instrumental esterilizado para la recogida de especímenes destinados a cultivo
microbiológico, y hay que tener un cuidado especial de no contaminar los tejidos con contenido intestinal. No
deben utilizarse desinfectantes sobre o cerca de los tejidos que vayan a servir de muestra para cultivo
bacteriológico o para aislamientos víricos.
Los tejidos se pueden enviar secos al laboratorio o en medio de transporte de bacterias o de virus, dependiendo
de las pruebas que se soliciten. Tras la recogida, las muestras para examen microbiológico deben refrigerarse
hasta su envío. Las muestras se deben congelar si aquél no se hace en 48 horas; sin embargo el
almacenamiento prolongado a –20ºC puede resultar perjudicial para el aislamiento de virus. Para los estudios
histopatológicos, se cortarán bloques de tejido que no excedan de 0,5 cm de grosor y 1–2 cm2 y se colocarán en
formalina al 4–10 % en tampón neutro, que debería ser, al menos, diez veces el volumen de la muestra de tejido.
Cuando se sospeche de ciertas enfermedades, se necesitan trozos más grandes de cerebro; el cerebro se
secciona haciendo un corte sagital: la mitad se envía fresco, en hielo, y la otra en formalina al 10% tamponada.
En el caso de la “tembladera” (scrapie), de la encefalopatía espongiforme bovina y otras EETs, los detalles sobre
recolección de muestras se ofrecen en los capítulos correspondientes del presente Manual. Almacene y embale
los tejidos fijados con formalina separados de los tejidos frescos, la sangre y los frotis. Hay que asegurarse de
que los tejidos fijados con formalina no estén congelados. Una vez fijados, se les puede quitar la formalina y
enviarlos al laboratorio, siempre que se mantengan húmedos y estén protegidos (por ejemplo, envolviendo los
tejidos en toallas de papel empapadas con formalina y en botes con tapón a rosca herméticamente cerrados).
3.
Toma de muestras medioambientales y de alimentos
Las muestras se pueden tomar para controlar la higiene o como parte de la investigación de enfermedades. Las
muestras del medio ambiente se pueden tomar del estiércol o de la cama de los animales y de heces excretadas
u orina. Las muestras pueden tomarse de la superficie de los conductos de ventilación, de comederos y de
desagües. Este tipo de muestreo es particularmente importante en criaderos, centros de inseminación artificial y
mataderos, en los que hay equipamiento especializado. Las muestras también se pueden tomar del forraje de los
comederos o de los contenedores de almacenamiento. La toma de muestras de agua se puede hacer de
comederos, de bebederos, de tanques de alimentación o de alimentos naturales o manufacturados.
4.
Abejas
Las abejas adultas, estén muertas o moribundas, se pueden recoger en las cercanías de las colonias. A las vivas
se las mata por congelación. Las muestras de crías se toman quitando un trozo de panal de cría que presente
anormalidades. Se envuelve en papel y se coloca en una caja para transportarla al laboratorio.
B. TAMAÑO DE LA MUESTRA
Cuando se investiga un caso de una enfermedad clínica, las muestras recogidas deben ser representativas de la
enfermedad que se está investigando y de las lesiones observadas. Cuando se desarrolla un programa de
vigilancia y seguimiento de la salud animal, se deben utilizar algunos métodos estadísticos de muestreo
generales. Estos métodos de muestreo son necesarios para realizar los estudios científicos especificados en el
Código Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE (9). Es posible calcular el número de animales de una
manada de un tamaño determinado que se deben muestrear, para que la detección de la infección, que se
asume que está presente en un determinado porcentaje de animales, alcance una probabilidad del 95% (10). Las
formulas siguientes pueden proporcionar datos numéricos aproximados, pero un programa de muestreo
específico para el programa de vigilancia planificada debería basarse en fórmulas completas que están
disponibles en las referencias (1, 3, 11) o utilizando un programa (FreeCalc) disponible en Internet
(http://www.ausvet.com.au/content.php?page=res_software#freecalc).
La siguiente fórmula podría utilizarse para calcular el tamaño de la muestra n para detectar al menos un caso de
infección, con una prueba que tiene una sensibilidad y especificidad del 100%, donde D es el nivel de
significación y 1–D es el nivel de confianza, y p es la prevalencia en la población. Si una enfermedad se
presentara en el 5% de una manada de 500 animales, sería necesario muestrear 59 animales, para que la
confianza de encontrar al menos un caso positivo sea del 95%, suponiendo que la sensibilidad y la especificidad
de la prueba fueran del 100%. Puesto que la mayoría de las pruebas diagnósticas no tienen la especificidad y la
sensibilidad del 100%, el número de muestras recogidas debe ajustarse a la sensibilidad y especificidad de la
prueba que se utilice (véase también Capítulo I.1.3. Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de
enfermedades infecciosas).
6
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
ln (D)
n=
ln (1–p)
En el ejemplo anterior D = 0,5, 1–D = 95%, p = 0,05 y n = 59
Si la sensibilidad (Se) es menor del 100%, la fórmula anterior se debería modificar de la siguiente forma:
ln (D)
n=
ln (1–p.Se)
En el ejemplo anterior con D = 0,05, p = 0,05, especificidad (Sp) = 1 y Se = 0,95, sería necesario muestrear un
mínimo de n = 62 animales en vez de 59 para tener una probabilidad de 0,95 de encontrar al menos un animal
positivo. El aumento en el tamaño de la muestra desde 59 a 62 se debe a la disminución de la sensibilidad de la
prueba desde 1 a 0,95. La gráfica de abajo indica el tamaño de muestra mínimo que se requiere para encontrar
al menos un positivo para varias combinaciones de sensibilidad y prevalencia para D = 0,05 y Sp = 1.
Si se sabe que la prueba tiene una especificidad menor de 1, los resultados positivos se deberán confirmar
mediante una prueba con una especificidad más alta. Si la prevalencia es muy baja y la prueba utilizada tiene
una especificidad menor de 1, es muy posible que un resultado positivo de la prueba sea un falso positivo.
Figura 1. Tamaño de muestra mínimo requerido para la confianza del 95% de encontrar la infección para
distintas combinaciones de sensibilidad y prevalencia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
7
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
C. INFORMACIÓN QUE HA DE ENVIARSE CON LAS MUESTRAS
Es fundamental que las muestras individuales se identifiquen perfectamente mediante métodos adecuados. Los
instrumentos de marcado deben poder resistir las condiciones de uso; por ejemplo, mojarse o congelarse. El
lápiz tiene tendencia a borrarse de los contenedores, y las etiquetas, pegadas al plástico, se desprenden cuando
se almacenan a –70°C. La información y el historial del caso siempre deberían acompañar a las muestras al
laboratorio y deberían colocarse en un sobre de plástico, por fuera del embalaje de transporte. Se sugiere que se
sigan los siguientes puntos. Es aconsejable contactar con el laboratorio receptor para determinar si tiene un
formulario de envío que quisiera que le remitieran con las muestras o si necesita otra información.
i)
Nombre y dirección del propietario/titular donde se dio la enfermedad, con los números de teléfono y fax.
ii)
Nombre, dirección postal, correo electrónico, números de teléfono y fax del remitente.
iii)
Enfermedades de cuya existencia se sospecha y pruebas solicitadas.
iv)
Especie, raza, sexo, edad e identidad del animal muestreado.
v)
Fecha de toma de las muestras y envío.
vi)
Lista de las muestras remitidas y medios de transporte utilizados.
vii)
Debería incluirse un historial completo para el laboratorio, que contemplara los siguientes elementos:
a)
Una lista y descripción de los animales examinados y de los hallazgos del examen post-mortem.
b)
El tiempo que han permanecido los animales enfermos en la granja; si son recién llegados y de dónde
procedían.
c)
La fecha de los primeros casos y de los posteriores, o de los animales muertos, con los números de
referencia de los envíos anteriores.
d)
Una descripción de la extensión de la infección en la manada o rebaño.
e)
El número de animales muertos y de los que presenten signos clínicos, y edad, sexo y raza.
f)
Los signos clínicos y su duración, incluidos el estado de la boca, ojos y patas, y los datos de
producción de leche y huevos.
g)
Tipo y normas para la cría, incluidos el tipo de alimento disponible, y posible contacto con venenos o
plantas venenosas.
h)
Cualquier medicación administrada a los animales y cuándo se les administró.
i)
Cualquier vacuna administrada y cuándo se administró.
j)
Otras observaciones sobre la enfermedad y manejo de los animales.
D. EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
1.
Autorización de envío de especímenes
Se debe contactar con el laboratorio que va a recibir las muestras, para asegurarse de que está capacitado para
realizar las pruebas solicitadas y para consultar si hay requisitos especiales de embalaje o expedición. Cuando el
material se envíe a otro país es imprescindible ponerse en contacto con el laboratorio receptor. Normalmente se
necesitará una licencia de importación especial para cualquier material biológico, que debe obtenerse con
anticipación. La licencia debe colocarse en un sobre en el exterior del paquete.
2.
Transporte de especímenes
Los especímenes deben enviarse al laboratorio por el procedimiento más rápido disponible. Si las muestras
pueden llegar al laboratorio antes de 48 horas, se deben enviar refrigeradas. Si se utiliza hielo seco, se deben
seguir normas adicionales de empaquetado. Las sustancias infecciosas, que pueden incluir especímenes de
diagnóstico, no se pueden enviar como equipaje facturado ni como equipaje de mano, y se deben enviar como
cargamento.
8
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
3.
Embalaje
El remitente debe asegurarse de que los especímenes se embalan de tal forma que lleguen al laboratorio en
buenas condiciones y que no hay fugas durante el transporte. El Reglamento sobre Mercancías Peligrosas
(DGR) de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA) tiene requisitos explícitos sobre el embalaje y
expedición de especímenes para diagnóstico en todos los medios comerciales de transporte aéreo. En muchos
países se exigen requisitos similares para los envíos terrestres y por servicio postal. Los requisitos para el
transporte aéreo se especifican de forma detallada en las publicaciones de la IATA, que son actualizadas cada
año. Se espera que el remitente conozca y siga los procedimientos esbozados en el Reglamento para
Mercancías Peligrosas (DGR). A continuación se ofrece un resumen del Reglamento vigente en el momento en
que este Manual se envió a la imprenta, y que deberían seguirse para cualquier envío. También anticipamos que
a partir del 1 de enero de 2005 tendrán efecto algunos cambios importantes en las citadas normas. Si hay
cambios significativos en las DGR, colocaremos una versión revisada de este capítulo en la red, en el sitio Web
www.oie.int . Los remitentes deberán consultar siempre la última versión de las DGR de la IATA antes de
proceder al envío de especímenes de diagnóstico. Además, tres de las directrices nacionales ofrecen
instrucciones explícitas para el embalaje y envío de especímenes de diagnóstico, estando tales directrices
basadas en los requisitos de la IATA (2, 4, 8).
Las DGR esboza los procedimientos para el envío de sustancias infecciosas, incluidos los especímenes de
diagnóstico. Las DGR define las sustancias sospechosas como sustancias de las que se sabe o se sospecha
que contienen patógenos. Los patógenos se definen como microorganismos (incluidas bacterias, virus,
rickettsias, parásitos y hongos) o microorganismos recombinantes (híbridos o mutantes) de los que se sabe o se
tiene una sospecha razonable de que causan enfermedades en los humanos o los animales.
La IATA (5, 6) menciona como exento del Reglamento sobre Mercancías Peligrosas el siguiente supuesto:
Las sustancias que no contienen sustancias infecciosas o las sustancias que no es probable que causen
enfermedades en humanos o animales no están sujetas a estas Regulaciones salvo que se ajusten a criterios
por los que se las pueda incluir en otra clase.
También hay excepciones para algunos productos biológicos, y el remitente debe consultar el Reglamento de la
IATA ya que algunos de esos productos no están exentos. A continuación ofrecemos la definición de productos
biológicos que aparece en las DGR:
Los productos biológicos provienen de organismos vivos. Estos se fabrican y distribuyen de acuerdo con los
requisitos exigidos por las correspondientes autoridades gubernativas de ámbito nacional; estos productos están
sometidos a requisitos para obtener licencias y se utilizan para la prevención, tratamiento o diagnóstico de
enfermedades humanas o animales, o para el desarrollo, experimentación e investigación relacionados con los
propósitos antes mencionados. Entre esos productos se incluyen productos acabados o no acabados como las
vacunas y los materiales de diagnóstico.
Las DGR especifica que las sustancias infecciosas (incluidos los especímenes que puedan contener patógenos
que afectan a los humanos o los animales) se designan como N2814, NU2900 o UN3373.
Las muestras enviadas para fines diagnósticos deberían designarse como UN 2814 o UN 2900 si contienen
material proveniente de humanos o animales afectados por cualquier enfermedad contagiosa para las que
normalmente no existe tratamiento efectivo ni medidas preventivas1. Las sustancias infecciosas que se ajusten a
esta definición y afecten a los humanos, incluidos los agentes zoonósicos, se designan como UN 2814. Las que
sólo afectan a los animales se designan como UN 2900.
Las sustancias infecciosas enviadas con fines diagnósticos, y que no se ajustan a los criterios por los que se las
designaría como UN2814, o, UN 2009, son asignadas a la clase UN 3373 y designadas como “Especímenes de
Diagnóstico”.
Las DGR de la IATA contiene una lista indicativa de los patógenos que se deben asignar a UN 2814, o, UN
2900 (Cuadros 1 y 2). Los patógenos incluidos en estas listas no se pueden asignar a UN 3373 (5, 6).
1
La definición propuesta para la versión de la DGR en el 2005 es: “Sustancia infecciosa que se transporta de tal forma
que, en caso de exposición a la misma, es capaz de provocar invalidez permanente, peligro para la vida o enfermedad
letal en humanos y animales.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
9
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
Cuadro 1. Sustancias infecciosas que afectan a los humanos y que deben denominarse UN 2814.
Bacilo del ántrax (sólo cultivos)
Virus de la Encefalitis japonesa (sólo cultivos)
Brucella abortus (sólo cultivos)
Virus de Junin
Brucella melitensis (sólo cultivos)
Virus de la Enfermedad de la Selva de Kyasanur
Brucella suis (sólo cultivos)
Virus de Lassa
Burkholderia mallei – Pseudomonas mallei –
Muermo (sólo cultivos)
Virus Machupo
Burkholderia pseudomallei –
Pseudomonas pseudomallei (sólo cultivos)
Virus de Marburg
Chlamydia psittaci – cepas aviares (sólo cultivos)
Mycobacterium tuberculosis (sólo cultivos)
Clostridium botulinum (sólo cultivos)
Virus de la Viruela del mono
Coccidioides immitis (sólo cultivos)
Virus de Nipah
Coxiella burnetii (sólo cultivos)
Virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk
Virus de la Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo
Virus de la Polio (sólo cultivos)
Virus del Dengue (sólo cultivos)
Virus de la Rabia
Virus de la Encefalitis equina del Este (sólo cultivos)
Rickettsia prowazekii (sólo cultivos)
Escherichia coli, verotoxigénico (sólo cultivos)
Rickettsia rickettsii (sólo cultivos)
Virus del Ébola
Virus de la Fiebre del Valle del Rift
Virus Flexal
Virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano (sólo
cultivos)
Francisella tularensis (sólo cultivos)
Virus de la Sabia
Virus Guanarito
Virus de la Disentería Shigella tipo 1 (sólo cultivos)
Virus Hantaan
Virus de la Encefalitis rusa estival (sólo cultivos)
Hantavirus causante del Síndrome pulmonar por
Hantavirus
Virus de la Viruela
Virus de Hendra
Virus de la Encefalitis equina venezolana
Virus de la Hepatitis B (sólo cultivos)
Virus del Oeste del Nilo (sólo cultivos)
Virus del Herpes B (sólo cultivos)
Virus de la Fiebre amarilla (sólo cultivos)
Virus de la Inmunodeficiencia humana (sólo cultivos)
Yersinia pestis (sólo cultivos)
Virus de la Gripe aviar muy virulenta (sólo cultivos)
Cuadro 2. Ejemplos indicativos de patógenos animales prohibidos que deben enviarse como sustancias
infecciosas que afectan a los animales (UN 2900).
Virus de la Peste equina africana
Mycoplasma mycoides – Pleuroneumonía contagiosa bovina
Virus de la Peste porcina africana
Virus de la Peste de los pequeños rumiantes
Virus de la Enfermedad de Newcastle
Virus de la Peste bovina
Virus de la Lengua azul
Virus de la Viruela ovina
Virus del Cólera porcino
Virus de la Viruela caprina
Virus de la Fiebre aftosa
Virus de la Enfermedad vesicular porcina
Virus de Dermatosis nodular contagiosa
Virus de la Estomatitis vesicular
Cualquier agente infeccioso que pueda producir una enfermedad en humanos o animales que se
haya incrementado en cultivo así como los patógenos nuevos o emergentes deben asignarse a UN2814 o UN
2900, He aquí la definición de incremento en cultivo ofrecida por la IATA:
Los cultivos (stocks de laboratorio) son el resultado de un proceso por el que los patógenos se multiplican o
propagan para generar grandes concentraciones, de lo que se deriva un gran riesgo de infección cuando se da
una exposición a los mismos. Esta definición se refiere a los cultivos preparados con la intención de generar
patógenos y no incluye los cultivos producidos con fines clínicos y de diagnóstico.
10
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
En el siguiente diagrama de producción se ofrece una clasificación resumida de muestras de diagnóstico.
Puede
Puedela
lasustancia
sustanciacontener
contenermicroorganismos?
microorganismos?
No
No
Sí
Sí
Es
Espoco
pocoprobable
probableque
quela
la sustancia
sustancia
cause
cause una
una enfermedad
enfermedadhumana
humana oo
animal?
animal?
No
No
Sí
Sí
Está
Está exenta
exentade
delas
las Regulaciones
Regulaciones de
de Mercancías
Mercancías
Peligrosas-.
Envíar
en
paquete
a
prueba
Peligrosas-. Envíar en paquete a pruebade
depérdidas.
pérdidas.
La
Lasustancia
sustanciapuede
puede tener
tenerpatógenos
patógenosque
quepueden
pueden
causar
causarenfermedades
enfermedades graves
gravesde
de tipo
tipohumano
humanooo
animal
muy
contagiosas
que
no
pueden
curarse
animal muy contagiosas que no pueden curarseoo
prevenirse
prevenirse con
con rapidez,
rapidez,oo los
lospatógenos
patógenoslistados
listadosen
en
el
el Cuadro
Cuadro 11ooCuadro
Cuadro 22??
No
No
La
Lasustancia
sustanciaes
esun
uncultivo
cultivo
(exceptuados
(exceptuadoslos
los cultivos
cultivos
producidos
producidospara
parafines
finesclínicos
clínicosoo
de
dediagnóstico)?
diagnóstico)?
Sí
Sí
Sí
Sí
No
No
La
Lasustancia
sustanciase
se transporta
transportapara
para
fines
finesde
dediagnóstico?
diagnóstico?
No
No
Sí
Sí
Consígnese
Consígnese como
como espécimen
espécimen
de
de diagnóstico
diagnóstico (UN
(UN 3373)
3373)
Consígnese
Consígnese como
como sustancia
sustancia
infecciosa
infecciosa (UN
(UN 2814
2814 or
or UN
UN 2900)
2900)
El embalaje de sustancias y especímenes infecciosos procedentes de enfermedades animales graves, Un
2814, o, UN 2900, se trata de forma resumida en la instrucción de embalaje 602; La Declaración de Mercancía
Peligrosa por parte del remitente debe cumplimentarse y entregarse junto con las muestras. También existe el
requisito de que el remitente reciba entrenamiento sobre procedimientos de embalaje aprobados por la
IATA para los embarques de UN 2814 y UN 2900. Debido a la complejidad de estas directrices, se le recomienda
al remitente que consulte el Reglamento de la IATA par obtener más información sobre los embarques de UN
2814 y UN 2900.
El otro grupo, UN 3373, cubre los “Especímenes de Diagnóstico”. Esta categoría entraña un riesgo menor, y los
paquetes que contienen tales especímenes deben llevar la etiqueta “Especímenes de Diagnóstico”; no es
necesario hacer una declaración de mercancías peligrosas. La instrucción de embalaje 650 de la IATA
proporciona las directrices para embalar sustancias infecciosas clasificadas como NU3373, ofreciéndose a
continuación un resumen de las instrucciones de embalaje mencionadas. No obstante, debe seguirse el
procedimiento completo, tal como se explica en el Reglamento de Mercancías Peligrosas más recientes de la
IATA (5, 6).
i)
Los especímenes para diagnóstico (UN 3373) deben disponerse en embalajes de buena calidad, que deben
ser suficientemente fuertes para resistir los golpes y el peso que tienen que soportar durante el transporte.
Los embalajes se deben hacer y cerrar de forma que se evite cualquier fuga de contenido que pudiera
producirse en condiciones normales de transporte.
ii)
El espécimen deberá colocarse en un recipiente o recipientes primarios, ya sean botellas de cristal, tubos o
contenedores de plástico.
iii)
El recipiente o recipientes primarios se envolverán en material absorbente adecuado para absorber todo el
fluido de los mismos.
iv)
Si se utilizan varios recipientes primarios éstos deberán envolverse individualmente o por separado para
impedir el contacto entre ellos.
v)
El recipiente o recipientes primarios y el material absorbente se colocarán dentro de un recipiente
secundario.
vi)
Los recipientes primario y secundario que se utilizan para los líquidos deben ser a prueba de fugas, y deben
resistir, sin fuga, una presión diferencial interna no inferior a 95 kPa entre –40°C y 55°C.
vii)
El recipiente o recipientes primarios para los sólidos deben ser a prueba de fugas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
11
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
viii) El recipiente o recipientes primarios no deben contener más de 500 ml de especímenes líquidos, ni más de
500 g de sólidos. El embalaje exterior no debe exceder los 4 litros o 4 kilos para especímenes líquidos o
sólidos, respectivamente.
ix)
Debe incluirse una lista detallada del contenido entre el embalaje secundario y el exterior.
x)
Si el envío se realiza a temperatura ambiente o superior, el recipiente primario tiene que tener un medio que
asegure su estanqueidad, tal como un cierre hermético, un cierre sellable por calor o un tapón con reborde.
Si se usan tapones a rosca, deben reforzarse con cinta adhesiva.
xi)
Las bolsas refrigerantes o el hielo seco deben colocarse fuera del recipiente secundario. Si se usa hielo
seco debe haber un soporte interno que mantenga el recipiente secundario en la posición original, una vez
que el hielo seco se haya derretido. El embalaje exterior debe permitir la liberación de dióxido de carbono.
Cuando se utiliza nitrógeno líquido, hay requisitos adicionales que se describen en el DGR.
xii)
Los recipientes primario y secundario se pondrán dentro de un embalaje de transporte con material de
amortiguamiento.
xiii) El embalaje debe resistir una prueba de caída desde 1,2 metros. Existen requisitos adicionales de
resistencia de embalajes usados para los especímenes NU2900 y NU2814.
xiv) El paquete se etiquetará como “Especímenes para Diagnóstico”. En la casilla de “Naturaleza y Cantidad de
Mercancías” de la guía de carga aérea constará “ESPECÍMENES PARA DIAGNÓSTICO EMBALADOS
CONFORME A LA INSTRUCCIÓN DE EMBALAJE 650 DE LA IATA”.
4.
Documentos de embarque
Todos los documentos de embarque, incluidos la licencia de importación y el formulario de envío deben ponerse
en un sobre pegado en la parte exterior del embalaje de transporte. Los formularios y las etiquetas de mercancía
peligrosas requeridas se cumplimentarán tal como se explica en el DGR y se ponen también en la parte exterior
del embalaje.
E. CONSERVACIÓN DE MUESTRAS EN ALMACENAMIENTOS PROLONGADOS
Puede resultar muy útil establecer una colección de muestras para futuros estudios. La colección puede incluir
cultivos para la comparación con futuros aislados, muestras de tejido o de suero que pueden utilizarse para
validación de nuevas pruebas, y una colección de tejidos fijados o bloques de parafina para futuros exámenes
histológicos. Posiblemente la colección más útil es el almacenamiento de muestras de suero. Estas muestras
pueden resultar útiles si se lleva a cabo una investigación retrospectiva para comparar el estado actual de la
enfermedad con el de otras veces anteriores.
Œ
Bancos de suero
Las muestras de suero pueden proporcionar información sobre los animales de los que se han tomado. Se
pueden analizar diversos constituyentes de éstas, tales como inmunoglobulinas, elementos traza, toxinas,
hormonas y enzimas. Si el número de muestras de suero recogido al azar de la población es suficiente, se
pueden hacer comparaciones sobre la influencia del sexo, edad, raza y localización geográfica. Los resultados
de esta comparación permiten identificar grupos de alto riesgo, se pueden establecer prioridades de vacunación
y establecer patrones e índices de enfermedades (5).
Un banco de suero es una colección catalogada de sueros que se almacenan para conservar sus propiedades
inmunológicas y otras bioquímicas. Las condiciones de catalogación y almacenamiento son fundamentales para
que un banco de suero sea eficaz. Cada uno de los sueros se deberá documentar e identificar perfectamente.
Las bases de datos deberían contener toda la información pertinente sobre el origen de la muestra y los
resultados obtenidos de las pruebas. También se pueden incluir datos adicionales que pueden ser de interés,
tales como las condiciones climáticas y la productividad del animal. Es fundamental la exactitud de los datos y
estos deben obtenerse cuando se toman las muestras de sangre. El primer dato fundamental es la identificación
completa del animal. La cantidad de detalles registrados dependerá de la pericia del operador, siendo más
importante la exactitud que la cantidad de información. Debería evitarse la mezcla de sueros, pues, aunque
reduce la cantidad de documentación y el espacio de almacenamiento, también reduce enormemente la utilidad
del material. La recogida de muestras de sangre debe hacerse de la forma más aséptica posible, y la esterilidad
debe mantenerse durante la separación del suero y otras manipulaciones. El catálogo del banco de suero debe
organizarse bien, y mantenerse en una base de datos computarizada, con una adecuada copia de seguridad. Se
ha sugerido y descrito con detalle una metodología (7).
Los sueros se pueden almacenar para un uso periódico o se pueden mantener almacenados a largo plazo para
objetivos históricos, estas dos funciones deberán mantenerse separadas. Las condiciones de almacenamiento
de los sueros deberán minimizar la pérdida de propiedades inmunológicas y de otras propiedades bioquímicas.
12
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.1. — Métodos de muestreo
Hay tres métodos de almacenamiento: ultracongelación, almacenamiento en seco sobre discos de papel a
temperatura ambiente y liofilización (congelación-desecación). Deberá mantenerse una temperatura central por
debajo de –60°C para el almacenamiento de sueros a largo plazo mediante ultracongelación. Cuanto más baja
sea la temperatura mejor, pero resulta más caro de mantener. El nitrógeno en fase líquida se encuentra a –
196°C, el nitrógeno en fase de gas se encuentra a –100°C y un congelador de temperatura ultrabaja se
mantendrá a –90°C. Algunos bancos de suero se han mantenido a –20°C, pero el suero puede deteriorarse y no
ser apropiado para la detección de algunas propiedades, especialmente, si se almacena durante largos períodos
de tiempo a esta temperatura. Los ultracongeladores deberían tener un sistema de aviso si la temperatura sube,
debido a avería mecánica o a un fallo de energía. Es imprescindible un generador de emergencia junto con un
espacio alternativo para el almacenamiento en frío por si hay que transferir los contenidos del congelador. El
almacenamiento en disco de papel es un método simple y barato, pero sólo permite almacenar una pequeña
cantidad de suero, y el suero eluído sólo es apropiado para un número limitado de pruebas. Los discos deberán
mantenerse en un lugar fresco y seco. Puede que proporcionen resultados satisfactorios durante 5 años. En
general, se considera la liofilización como el mejor método para almacenamiento de sueros a largo plazo. Si se
optimizan las condiciones de ultracongelación, se reducirá la pérdida de características séricas. Para la
liofilización se precisa un equipo caro y, además, hay que invertir mucho tiempo. Los viales liofilizados deben
mantenerse a 4°C.
REFERENCIAS
1.
CAMERON A.R. & BALDOCK F.C. (1998). A new probability formula for surveys to substantiate freedom from
disease. Prev. Vet. Med., 34, 1–17.
2.
CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY, LABORATORY DIRECTORATE: ANIMAL HEALTH (2002). Manual of Common
Procedures. Section: Specimen Collection and Submission; Specimen Packaging; Specimen Transportation.
Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada, 61 pp.
3.
CANNON R.M. & ROE R.T. (1982). Livestock Disease Surveys – A Field Manual for Veterinarians. Department
of Primacy Industry, Water and Environment, Australia, 15 pp.
4.
COOK R., BARTON M., GLEESON L. & MAIN C. (1996). AUSVETPLAN Management Manual: Laboratory
Preparedness. Animal Health Australia, Canberra, 56 pp. http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm.
5.
INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2004). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition.
International Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1,
Canada, 801 pp.
6.
INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Infectious Agents and Diagnostic Specimens Shipping
th
Guidelines, 4 Edition. IATA, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 208
pp.
7.
MOORHOUSE P.D. & HUGH-JONES M.E. (1981). Serum banks. Vet. Bull., 51, 277–290.
8.
NATIONAL VETERINARY SERVICES LABORATORIES (2003). Procedures for Collection and Submission of
Specimens. National Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa, USA. www.aphis.usda.gov/vs/nvsl.
9.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2003). Terrestrial Animal Health Code. Office International des
Epizooties, Paris, France. www.oie.int.
10. STRAFUSS A.C. (1988). Necropsy: Procedures and Basic Diagnostic Methods for Practicing Veterinarians.
Charles C. Thomas, Springfield, IL, USA, 244 pp.
11. VETERINARY LABORATORIES AGENCY (1998). Submission of Samples to VI Centres. Veterinary Laboratories
Agency, New Haw, Addleston, Surrey, United Kingdom, 36 pp.
12. WORLD HEALTH ORGANIZATION/FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (WHO/FAO)
(1994). Basic Procedures for Veterinary Laboratories in Developing Countries, Pini A., Parodi P.,
Demeneghi D., Belemu U., Kabilika H. & Ghirotti M., eds. WHO/FAO Collaborating Centre, Viale Regina
Elena 299, 00161 Rome, Italy, 142 pp.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
13
CAPÍTULO I.1.2.
GESTIÓN DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS
DE PRUEBAS VETERINARIAS
RESUMEN
Es esencial para el diagnóstico, la vigilancia y la comercialización que los resultados del laboratorio
sean válidos. Dichos resultados deben alcanzarse mediante el uso de buenas prácticas de manejo,
métodos de prueba y calibración válidos, técnicas apropiadas, control y garantía de calidad, todo
ello dentro de un sistema de calidad. Estos temas comprenden un área compleja de suma
importancia en la conducción e interpretación de las pruebas. Podemos denominar a este asunto
“gestión de calidad del laboratorio”, e incluye elementos administrativos, operativos y técnicos. Un
programa de gestión de calidad debe permitir al laboratorio demostrar que opera con un sistema
de calidad viable, que es técnicamente competente, y es capaz de generar resultados
técnicamente válidos. Además, un laboratorio debe llevar a cabo un programa de gestión de
calidad que sea apropiado para su territorio, sus clientes, sus necesidades y objetivos, y que
pueda demostrar su eficacia en la consecución de los objetivos de calidad. La necesidad y los
requisitos de los programas de gestión de calidad de los laboratorios, también están determinados
por la necesidad de una aceptación recíproca de los resultados de las pruebas realizadas para el
comercio internacional y por la aceptación de los estándares internacionales tales como la Norma
1
Internacional 17025 de la ISO/IEC (4) para la acreditación del laboratorio. La OIE ha publicado
normas detalladas sobre este tema (7). No es nuestro propósito recordar en este capítulo los
requisitos de los mencionados documentos de la ISO o de la OIE. Más bien se presenta un
esquema de los asuntos y consideraciones importantes que un laboratorio debe acometer en el
diseño y el mantenimiento de su programa de gestión de calidad.
CONSIDERACIONES CLAVE PARA EL DISEÑO Y MANTENIMIENTO DE UN
PROGRAMA DE GESTIÓN DE CALIDAD DEL LABORATORIO.
Con el fin de asegurar que el programa de gestión de calidad sea apropiado, debe elaborarse cuidadosamente el
diseño. En las siguientes siete secciones de este capítulo, se presenta un esquema de las principales categorías
a tener en cuenta, y de los asuntos y actividades clave dentro de cada una de dichas categorías.
1.
El trabajo, las responsabilidades y los objetivos del laboratorio
Son muchos los factores que influyen en los elementos necesarios y los requisitos de un programa de gestión de
calidad. Dichos factores son:
i)
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
vii)
1
14
El tipo de prueba realizada.
El uso de los resultados de la prueba.
La repercusión de un resultado cuestionable o erróneo.
El nivel de tolerancia de riesgo y de responsabilidad.
Las necesidades del cliente (por ejemplo, sensibilidad y especificidad de los métodos de prueba, costes y
tiempo para la devolución).
El papel del laboratorio en el trabajo legal o en los programas reguladores.
El papel del laboratorio en la asistencia, confirmación y/o supervisión del trabajo de otros laboratorios, y
Organización Internacional para la Estandarización/Comisión Internacional Electroquímica.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.2.
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
viii) Los objetivos comerciales del laboratorio, incluyendo la necesidad de algún reconocimiento y/o acreditación
por parte de terceros.
2.
Estándares, directrices y referencias
Se recomienda que el laboratorio seleccione estándares y directrices acreditadas y fiables para ayudar en el
diseño del programa de gestión de calidad. El estándar de la OIE sobre este tema, constituye una directriz útil
(7). Para los laboratorios que deseen acreditarse, es esencial la utilización de la norma 17025 ISO/IEC (4) o del
estándar de la OIE (7). Puede obtenerse información adicional sobre los estándares en los organismos de
estándares nacionales de cada país, en el Laboratorio Internacional para la Cooperación de la Acreditación
(ILAC) y en los organismos de acreditación (por ejemplo, la Asociación Internacional de Autoridades de Pruebas
[NATA], en Australia; la Asociación Americana de Acreditación de Laboratorio [A2LA], en EE.UU; el Servicio de
Acreditación del Reino Unido [UKAS] y en el Consejo de Estándares de Canadá [SCC]). Algunas organizaciones
internacionales y técnicas, tales como la AOAC Internacional (la antigua Asociación de Químicos Analistas
Oficiales) y la ISO, publican referencias, directrices y/o estándares útiles que completan los requisitos generales
de la norma 17025 de la ISO/IEC. La Norma Internacional 9001 de la ISO (5), que es un norma general para los
sistemas de gestión de calidad y una de las muchas normas incluidas en el grupo denominado comúnmente “Las
series 9000 de la ISO”, no se utiliza para la acreditación, puesto que el cumplimiento de los requisitos, no implica
ni garantiza necesariamente la competencia técnica. (Véase sección 3 abajo). Aunque un laboratorio puede
llevar a cabo un sistema de gestión de calidad que cumpla con los requisitos del la norma ISO 9001, el registro o
la certificación se utilizan para indicar conformidad con la norma. La norma 17025 de la ISO/IEC incluye una
comparación, mediante cuadros con cláusulas numeradas, entre dicha norma, la norma ISO 9001 (de 1994) y la
norma ISO 9002 de 1994. Estos dos últimos documentos han sido reemplazados por la versión 2000 (de 9001)
(5).
3.
Acreditación
Si el laboratorio ha determinado que necesita un reconocimiento formal de su programa de gestión de calidad,
entonces será necesaria la verificación por parte de terceros de su conformidad con el estándar o estándares
seleccionados. El ILAC ha publicado los requisitos y las directrices específicas, para los laboratorios y los
organismos de acreditación. Los términos acreditación, “un procedimiento por medio del cual un organismo
autorizado reconoce formalmente que una persona u organismo es competente para llevar a cabo tareas
específicas” (2), y la acreditación del laboratorio, “el reconocimiento formal de la competencia de un laboratorio
para llevar a cabo pruebas específicas o tipos específicos de pruebas” (2), son propios de los requisitos del ILAC
y del uso de la Norma 17025 de la ISO/EC y del estándar de la OIE como base para la acreditación. Por
competencia se entiende algo significativo: quiere decir mucho más que tener y seguir procedimientos
documentados. Tener competencia también significa que el laboratorio:
i)
Tiene validez técnica, métodos de prueba validados, procedimientos y especificaciones que estén
documentados de acuerdo con los requisitos de las normas y/o directrices seguidas.
ii)
Tiene personal cualificado y adecuado, capaz de entender el componente científico que subyace bajo los
procedimientos.
iii)
Tiene el equipo correcto y adecuado.
iv)
Tiene instalaciones adecuadas y control medioambiental.
v)
Tiene los procedimientos y especificaciones que garantizan unos resultados precisos y fiables.
vi)
Puede prever las necesidades y problemas técnicos.
vii)
Puede solucionar y prevenir los problemas técnicos que puedan surgir.
viii) Puede controlar y calcular de forma precisa la incertidumbre en los resultados de las pruebas; y
ix)
Puede demostrar competencia en la aplicación de los métodos de prueba utilizados.
4.
Selección de un organismo de acreditación
Para que una acreditación pueda propiciar la aceptación de los resultados de una prueba de laboratorio con fines
comerciales, dicha acreditación debe ser reconocida por la comunidad internacional. Por lo tanto, el organismo
de acreditación debe ser reconocido como competente para acreditar laboratorios. Los programas para el
reconocimiento de los organismos de acreditación están basados, dentro del esquema del ILAC, en los requisitos
del Estándar Internacional 17011 de la ISO/EC (3). Se puede obtener información sobre organismos de
acreditación reconocidos, de las organizaciones que los reconoce, tales como la Cooperación Nacional para la
Acreditación de Laboratorios (NACLA), la Cooperación Asia-Pacífico para la Acreditación de Laboratorios
(APLAC), la Cooperación Interamericana para la Acreditación (IAAC), y la Cooperación Europea para la
Acreditación (EA).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
15
Capítulo I.1.2.
5.
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
Determinación del ámbito del programa de gestión de calidad y/o de la acreditación del
laboratorio
El programa de gestión de calidad debería cubrir preferentemente las áreas de actividad que afectan a cualquier
prueba realizada en el laboratorio. Sin embargo, y a efectos de acreditación, el laboratorio debería determinar el
rango de pruebas que se van a incluir en la acreditación. Los factores que pueden afectar el ámbito de
acreditación elegido por un laboratorio son:
i)
La disponibilidad y coste del personal necesario, de las instalaciones y del equipo.
ii)
El coste del control medioambiental para evitar una contaminación cruzada.
iii)
La fecha límite para la acreditación.
iv)
El impacto de los resultados de las pruebas.
v)
El número de pruebas realizadas.
vi)
Si las pruebas efectuadas son rutinarias o no rutinarias.
vii)
Si alguna parte de la prueba se subcontrata para su realización en otro lugar.
viii) La garantía de calidad necesaria para los materiales, los reactivos y el medio.
ix)
La disponibilidad de estándares de referencia (por ejemplo, los reactivos estandarizados, muestras de
control de calidad interno, los cultivos de referencia).
x)
La disponibilidad de pruebas de competencia.
xi)
La disponibilidad de estándares y/o métodos de prueba plenamente validados, procedentes de fuentes
fiables.
xii)
La evaluación y validación de los métodos de prueba que se van a utilizar.
xiii) La complejidad técnica del (los) método (s).
Los organismos de acreditación también acreditan a los proveedores y operadores de programas de pruebas de
competencia, y pueden exigir el uso de un proveedor acreditado, con el fin de entregar al laboratorio un
certificado de acreditación.
6.
Métodos de Prueba
La norma 17025 de la ISO/IEC exige el uso de métodos apropiados y señala los requisitos para la selección,
desarrollo y validación. El documento de la OIE también proporciona los requisitos para la selección y la
validación.
En los capítulos sobre enfermedades específicas, el presente Manual ofrece recomendaciones sobre la selección
de métodos de prueba realizados con fines comerciales y de diagnóstico. Además se suministra un listado de
pruebas para el comercio internacional. Tal como se indica en la introducción de este listado, las pruebas
prescritas que aparecen en la lista son las exigidas por el Código sanitario de animales terrestres de la OIE. Se
considera que estas pruebas tienen la validación adecuada para proporcionar resultados fiables al decidir qué
animales son aptos para el transporte internacional. También se ofrece una lista de pruebas alternativas
apropiadas para el diagnóstico de enfermedades de ámbito local, pero que pueden haber tenido una validación
limitada. Generalmente se trata de pruebas serológicas.
En la profesión veterinaria, otros métodos estandarizados (métodos publicados en los estándares
internacionales, regionales o nacionales) o plenamente validados (métodos que han sido sometidos a un estudio
colaborativo y han sido publicados o emitidos por un organismo técnico con autoridad, tal como el Internacional
de la AOAC), pueden no estar disponibles aunque su uso fuera preferible. Muchos laboratorios veterinarios
desarrollan o modifican los métodos, y muchos de dichos laboratorios tienen programas de prueba que utilizan
métodos no estándares o una combinación de métodos estándar y no estándar. A fin de garantizar resultados
válidos en los laboratorios veterinarios, incluso cuando se utilizan métodos estandarizados, por lo general debe
realizarse una evaluación, una optimización y/o una validación internas.
16
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.2.
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
Los clientes y el personal del laboratorio deben tener muy claro cuál es el resultado que se espera de una
prueba. Muchos laboratorios de pruebas veterinarias, tendrán, por tanto la necesidad de demostrar su
competencia en el desarrollo, adaptación y validación de los métodos de prueba.
En el capítulo I.1.3 del presente Manual se proporciona asesoramiento detallado y específico sobre la selección,
optimización, estandarización y validación de las pruebas.
En los siguientes apartados se tratan los temas relacionados con la metodología de la prueba, temas que son de
sumo interés para el personal implicado en una gestión de calidad de un laboratorio.
a)
Selección del método de la prueba
Los resultados válidos comienzan con la selección de un método de prueba apropiado para los temas de
diagnóstico de que se trate. Las consideraciones para la selección del método de prueba son:
i)
Aceptación internacional.
ii)
Aceptación científica.
iii)
Vigencia del método.
iv)
Características de ejecución (por ejemplo, sensibilidad y especificidad analítica y de diagnóstico, tasa
de aislamiento, precisión (repetibilidad, reproducibilidad, replicabilidad, precisión e incertidumbre).
v)
Comportamiento en las especies y en la población pertinente.
vi)
Recursos y tiempo disponibles para la realización, adaptación y/o evaluación.
vii)
Tiempo de realización y de devolución.
viii) Tipo de muestra (por ejemplo, suero, tejido) y la calidad o estado en que se espera que aquella llegue
al laboratorio.
ix)
Sustancia a analizar (por ejemplo, anticuerpo, antígeno).
x)
Recursos y tecnología del laboratorio.
xi)
Naturaleza del uso que se le pretende dar al método (por ejemplo, exportación, importación, vigilancia,
protección, confirmación, utilización con un animal solo o con la manada).
xii)
Expectativas del cliente.
xiii) Factores de seguridad.
xiv) Número de pruebas a realizar.
xv)
Coste de la prueba por muestra.
xvi) Existencia de estándares de referencia, incluyendo los materiales de referencia; y
xvi) Disponibilidad de planes sobre para pruebas de competencia.
b)
Optimización y estandarización del método de prueba
Una vez seleccionado el método debe ponerse en marcha en el laboratorio. Tanto si el método se ha
desarrollado localmente como si ha sido importado de una fuente externa, se requiere una optimización
adicional. La Optimización consiste en una serie de experimentos seguida de un análisis posterior de los
datos. La optimización establece las especificaciones esenciales y los estándares de ejecución para el
proceso de la prueba y para su utilización a la hora de monitorizar la correcta ejecución de la prueba. La
optimización debe garantizar que el método se somete al correspondiente control estadístico. La
optimización también debe determinar:
i)
Las especificaciones esenciales para el equipamiento y el instrumental.
ii)
Las especificaciones esenciales para los reactivos (por ejemplo, químicos o biológicos).
iii)
Las especificaciones esenciales para los estándares de referencia, materiales de referencia y
controles internos.
iv)
La robustez (si es aplicable).
v)
Los puntos críticos de control esenciales y los rangos, características o comportamiento aceptables en
los puntos de control esenciales, utilizando procedimientos aceptables desde el punto de vista
estadístico.
vi)
Las actividades de control de calidad necesarias para monitorizar los puntos de control esenciales.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
17
Capítulo I.1.2.
vii)
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
El tipo, número, alcance, frecuencia y/o disposición de los controles de ejecución de la prueba que
sean necesarios.
viii) Los requisitos para controlar el comportamiento de la aceptación o rechazo no subjetivos de los
resultados de la prueba.
c)
ix)
Los elementos de un método de prueba fijado y documentado, para ser usado por el personal del
laboratorio; y
x)
El nivel de competencia técnica que deben reunir aquellas personas que realizan y/o interpretan la
prueba.
Validación del método de la prueba
La validación sirve además para evaluar la prueba según su adecuación a un determinado uso. La
validación establece las características aplicables al método de la prueba, tales como el grado de
sensibilidad, especificidad y aislamiento, y los parámetros de diagnóstico tales como corte positivo/negativo,
y título de interés o significación. La validación debe hacerse utilizando un procedimiento optimizado,
documentado y fijado. Dependiendo de los factores logísticos y de riesgo, la validación puede incluir
cualquier número de actividades y cantidad de datos, con el posterior análisis de los datos mediante el uso
de estadísticas apropiadas. La validación de pruebas se trata en el capítulo I.1.3., titulado Principios de
validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas, y en el capítulo I.1.4, titulado
Validación y control de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Las actividades de validación podrían incluir:
i)
Estudios de campo y/o epidemiológicos.
ii)
Comparación con otros métodos, preferiblemente con métodos estándar.
iii)
Comparación con estándares de referencia (si están disponibles).
iv)
Estudios en colaboración con otros laboratorios, utilizando el mismo método documentado e incluido el
intercambio de muestras, con preferencia, aquellas cuya composición o dosificación no estén
explicitadas. Es preferible que dichos estudios sean dirigidos por un laboratorio cualificado, que
organice dichos estudios y evalúe los resultados proporcionados por todos los participantes.
v)
Reproducción de los datos a partir de un método estándar aceptado o de una publicación acreditada.
vi)
Estudios experimentales de comprobación; y
vii)
Análisis de los datos de control de calidad internos.
La norma 17025 de la ISO/IEC reconoce que “La Validación es siempre un equilibrio entre los costes, los
riesgos y las posibilidades técnicas”. También admite que hay muchos casos en los que aspectos tales
como la exactitud y la precisión, sólo pueden darse de forma simplificada.
d)
Incertidumbre
Los laboratorios deben ser capaces de evaluar la incertidumbre suscitada por los métodos de prueba
aplicados en el laboratorio. Esto incluye los métodos usados por el laboratorio para calibrar el equipo (3).
Los requisitos de la norma 17025 de la ISO/IEC relacionados con este asunto, se mencionan en las
secciones 5.1.2, 5.4.4k, 5.4.6.2, 5.4.6.3 y 5.10.3.1c de dicho documento.
La determinación de la incertidumbre de una medición (MU), no es nueva en metrología. Sin embargo, la
aplicación de los principios de la MU en los laboratorios de ciencias biológicas, es nueva. La mayor parte de
los trabajos realizados hasta la fecha están relacionados con ámbitos de ensayos distintos al de las
ciencias biológicas, y la mayor parte de las aportaciones son de tipo teórico. Sin embargo, a medida que la
acreditación ha ido cobrando importancia, se han ido desarrollando aplicaciones en otras áreas. Es
importante tener en cuenta que la MU no implica duda acerca de la validez del resultado de una prueba o
de una medición, ni es equivalente a un error, ya que puede aplicarse a todos los resultados de las pruebas
derivados de un procedimiento particular. La MU puede considerarse como una expresión cuantitativa de
fiabilidad y se expresa comúnmente con un número después del signo +/- (es decir, el valor real cae dentro
del rango establecido, ya que el MU se expresa como un rango). La desviación estándar y el intervalo de
confianza son ejemplos de la expresión de la MU. Un ejemplo del uso de la desviación estándar para
expresar duda, lo constituyen los límites permitidos en los controles de realización de una prueba en un
enzimoinmunoensayo, comúnmente expresado como +/- n SD.
18
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.2.
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
Aunque la determinación y expresión de la MU no han sido estandarizadas para los laboratorios de pruebas
veterinarias, existen algunas directrices bien fundadas.
En el laboratorio debe estimarse el MU para cada método que haya de ser acreditado. Puede estimarse
mediante una serie de pruebas realizadas sobre muestras control. La MU puede también estimarse
utilizando características manejadas en publicaciones (6), pero antes el laboratorio debe demostrar una
actuación aceptable al aplicar el método. Las agencias gubernamentales pueden fijar metas para los
valores de la MU para los métodos oficiales, (por ejemplo: Health Canadá). Organizaciones técnicas de
prestigio (como la AOAC Internacional, ISO, NATA, A2LA, SCC, UKAS, Eurachem y la Cooperación para la
Trazabilidad Internacional en Química Analítica [CTAC]), imparten cursos y ofrecen directrices sobre MU
para los laboratorios que solicitan la acreditación. Codex Alimentarius, que especifica los estándares para
las pruebas con alimentos, ha asumido el principio de que no es necesario que un laboratorio obtenga una
estimación adicional de la MU, si dicho laboratorio cumple con los principios de Codex relativos a la calidad:
es decir, que el laboratorio está acreditado por la norma 17025 de ISO/IEC y usa métodos validados ( por
ejemplo, que conozca parámetros aplicables tales como sensibilidad y especificidad, así como el intervalo
de confianza en torno a dichos parámetros), y que participe en los Programas de Pruebas de Competencia,
y en los estudios en colaboración, y utilice procedimientos de control de calidad internos que sean
apropiados.
El “uso de procedimientos adecuados de control de calidad, de carácter interno”, implica que el laboratorio
debe utilizar procedimientos de control de calidad para identificar las principales fuentes de incertidumbre.
No es preciso tratar cada componente por separado. Los componentes pueden estimarse mediante
experimentos de laboratorio (estimaciones de Tipo A) o a partir de otras fuentes (materiales de referencia,
certificaciones de calibración, etc.) (estimaciones de Tipo B). Un procedimiento tradicional de muestra
control, llevado a cabo muchas veces por todos los analistas, normalmente identifica todas las fuentes
principales de duda, con la posible excepción de la preparación de la muestra. Puede utilizarse la variación
de las muestras control como una estimación de aquellas fuentes combinadas de duda.
La norma 17025 de ISO/IEC exige que el laboratorio identifique todas las fuentes importantes de
incertidumbre, y que obtenga estimaciones fiables de MU. Puede darse el caso de que los laboratorios
deseen establecer especificaciones aceptables, criterios y/o intervalos en los puntos críticos de control para
cada componente. Donde proceda, los laboratorios pueden implementar el control adecuado de calidad en
los puntos críticos asociados con cada fuente o intentar reducir el tamaño de un componente. Entre las
fuentes de incertidumbre, están el muestreo, las condiciones de almacenamiento, los efectos de la muestra,
la extracción y recuperación la calidad del reactivo, la pureza del material de referencia, las manipulaciones
volumétricas, las condiciones ambientales, la contaminación, los efectos del equipamiento, el sesgo del
operador o analista, y otros defectos desconocidos o debidos al azar. Es de esperar que el laboratorio se
ocupe de cualquier error que se haya producido de forma sistemática. (Véase también la Sección 6.b.,
puntos i-vii). Los errores sistemáticos (por sesgo) deben corregirse con cambios metodológicos, ajuste
matemático, anotación de cualquier sesgo en el documento de informe. Si se produce un ajuste del
procedimiento, puede ser necesaria o no una re-evaluación de la incertidumbre. Si se produce un ajuste
para corregir el sesgo, se estará introduciendo una nueva fuente de incertidumbre (la incertidumbre de la
corrección). Esta debe añadirse a la MU de la estimación.
Las tres formas principales de estimación de la MU son:
1. La aproximación por componentes (aproximación de abajo hacia arriba o “bottom-up”), en la que se
identifican todas las fuentes de incertidumbre, se hacen estimaciones razonables para cada
componente, se desarrolla un modelo matemático que relaciona entre sí a los componentes y se
combinan las variaciones utilizando reglas para la propagación del error (1).
2. La aproximación en que se utilizan muestras control (aproximación de arriba hacia abajo o “top-down”),
en la que se utilizan mediciones de material control estable para estimar la variación combinada de
muchos componentes. Debe añadirse la variación procedente de fuentes adicionales.
3. La aproximación que tiene en cuenta las características del método, en la que se utilizan como
incertidumbres combinadas los datos de actuación de un estudio colectivo válido (se pueden añadir
otras fuentes de incertidumbre). Los laboratorios deben cumplir con los criterios definidos para el
tratamiento del sesgo y la repetibilidad a fin de que las estimaciones de MU sean válidas. Estas
deberían ser mayores que las obtenidas por los laboratorios competentes mediante la utilización de sus
propias muestras control o mediante le modelo de componentes.
e)
Aplicación y uso del método de la prueba
Los analistas deben demostrar su competencia en el uso del método de la prueba, según se va realizando
ésta, antes de elaborar el informe con los resultados.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
19
Capítulo I.1.2.
— Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
El laboratorio debe garantizar, mediante la gestión de proyectos adecuados y documentados, el registro de
datos, el manejo de datos y los procedimientos de archivado, que puede recrear de nuevo, si es necesario,
todos los aspectos relacionados con la selección, el desarrollo, la optimización, la estandarización, la
validación, la realización y el uso de la prueba. Ello incluye las actividades de control y garantía de calidad.
7.
Plan Estratégico
Es esencial que haya un perfeccionamiento continuo. Se recomienda que el laboratorio esté informado y al día
en torno a cualquier obstáculo que se presente relacionado con los estándares y los métodos utilizados, con el
fin de demostrar la competencia del laboratorio y establecer y mantener la validez técnica. Los métodos para
llevar esto a cabo son:
i)
Asistencia a conferencias.
ii)
Participación en organizaciones locales e internacionales.
iii)
Participación en la redacción de estándares nacionales e internacionales (por ejemplo, participación en las
comisiones del ILAC y de ISO).
iv)
Consulta de publicaciones.
v)
Visitas a otros laboratorios.
vi)
Participación en programas de colaboración (por ejemplo, con el Instituto Interamericano de Cooperación
para la Agricultura).
vii)
Intercambio de procedimientos, métodos, reactivos, muestras, personal e ideas; y
viii) Siempre que sea posible, acreditación por medio de terceros de que dicho laboratorio está reconocido
como competente para emitir acreditaciones.
REFERENCIAS
1.
AMERICAN NATIONAL STANDARDS INSTITUTE (1997). ANSI/NCSL Z540-2-1997, US Guide to the Expression of
Uncertainty in Measurement, First Edition. American National Standards Institute, 1819 L Street, NW,
Washington, DC 20036, USA.
2.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17000 (2005) . Conformity Assessment – General Vocabulary.
International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case
Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
3.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17011 (2003) . General Requirements for Bodies Providing Assessment
and Accreditation of Conformity Assessment Bodies– General Requirements for Operation and Recognition.
International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case
Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
4.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17025 (1999). General Requirements for the Competence of Testing and
Calibration Laboratories. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue
de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
5.
ISO INTERNATIONAL STANDARD 9001 (2000). Quality management systems – Requirements. International
Organization for Standardization (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH 1211, Geneva 20, Switzerland.
6.
ISO DTS 21748 (draft). Guide to the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in
measurement uncertainty estimation. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central
Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
7.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2000). Standard for Management and Technical Requirements for
Laboratories Conducting Tests for Infectious Animal Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for
Veterinary Laboratories: Infectious Diseases (2002). Office International des Epizooties (OIE), 12 rue de
Prony, 75017 Paris, France, 1–31.
2
3
*
* *
2
3
20
ISO/IEC International Standard 17000 replaces ISO/IEC GUIDE 2 (1996). Standardisation and Related Activities – General
Vocabulary.
ISO/IEC International Standard 17011 replaces ISO/IEC Guide 58 (1993). Calibration and Testing Laboratory
Accreditation Systems – General Requirements for Operation and Recognition.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO I.1.3.
PRINCIPIOS DE VALIDACIÓN PARA LAS
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIÓN
La validación consiste en la evaluación de un proceso a fin de determinar su idoneidad para un
uso particular. Una ensayo validado produce resultados que identifican la presencia de un
compuesto concreto (por ejemplo, un anticuerpo) y permite la posibilidad de formular predicciones
sobre el estado de los sujetos analizados. Las pruebas realizadas sobre individuos o sobre
poblaciones tienen varios propósitos, tales como ayudar a documentar la ausencia de una
determinada enfermedad en un país o región, evitar su propagación a través del comercio,
erradicar una infección de una zona, confirmar el diagnóstico de los casos clínicos, estimar la
prevalencia de una infección para facilitar análisis de riesgo, identificar los animales infectados
con vistas a desarrollar medidas de control, y clasificar los animales según su salud o estado de
inmunización ECP la vacunación. Es posible validar una única prueba para uno o varios
propósitos mejorando algunas características de su realización en cada caso (por ejemplo,
elevando el nivel de sensibilidad del diagnóstico - hasta el 99,99%- y disminuyendo a la vez su
especificidad para un ensayo general, o inversamente, estableciendo una alta especificidad
asociada a un bajo nivel de sensibilidad en una prueba confirmativa).
Si consideramos las variables que pueden afectar a la realización de un ensayo, podremos
apreciar más claramente los criterios que deben tenerse en cuenta para su validación. Estas
variables pueden agruparse en tres categorías: (a) la muestra - que refleja las interacciones
hospedador/organismo que influye en la composición y concentración del componente a analizar
en la muestra de suero; (b) el sistema de ensayo - que incluye factores físicos, químicos,
biológicos y técnicos que afectan a la capacidad de la prueba para detectar en la muestra un
componente específico; y (c) el resultado de la prueba - es decir, la capacidad del sistema de
ensayo para predecir de forma precisa el estado del individuo o de la población en relación con el
componente en cuestión.
Los factores que influyen en la concentración y en la composición de un componente de la
muestra de suero dependen en gran medida del hospedador y son factores naturales (como la
edad, sexo, raza, estado nutritivo, embarazo, respuesta inmunológica), o bien factores adquiridos
(como la adquisición pasiva de anticuerpos, la inmunidad activa obtenida por vacunación o
infección). Otros factores que no dependen del hospedador, como la contaminación o el deterioro
de la muestra, también pueden afectar al componente a analizar en dicha muestra.
Los principios de validación que se consideran en este capítulo se refieren fundamentalmente a
métodos para detectar anticuerpos en sueros. No obstante, estos mismos principios se pueden
aplicar a la valoración de pruebas para otros componentes en sueros o tejidos. El capítulo I.1.4.,
que trata de la validación y el control de calidad de métodos de la reacción en cadena de la
polimerasa usados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, aplica los principios
generales descritos aquí a un método directo de detección de agentes infecciosos, mediante
ensayos de diagnóstico molecular.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
21
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
Los factores que interfieren en la precisión analítica del sistema de ensayo incluyen la
instrumentación, el error técnico, la elección de los reactivos (tanto desde el punto de vista
químico como biológico), la calibración, ajuste y límites de validez de los controles, los recipientes
de las reacciones, la calidad del agua, el pH y la fuerza iónica de los tampones y diluyentes, las
temperaturas de incubación y su duración, así como los errores que se introducen por detección
de compuestos estrechamente relacionados, del tipo de anticuerpos con reacción cruzada,
factores reumatoides, o anticuerpos heterófilos.
Los factores que influyen en la capacidad del resultado de una prueba para predecir de forma
1
precisa la infección o el nivel de un componente analizado en el hospedador son la sensibilidad
del diagnóstico, la especificidad del mismo, y la prevalencia de la enfermedad en la población
objeto de la prueba. La sensibilidad y la especificidad diagnóstica derivan de resultados de
pruebas con muestras obtenidas de animales de referencia previamente seleccionados. Los
métodos empleados para seleccionar estos animales son importantes para la precisión de las
estimaciones (5). El grado en que dichos animales representen todas las variables ambientales y
del hospedador en la población examinada tiene una influencia fundamental en la adecuada
interpretación de los resultados. Por ejemplo, los clínicos experimentados saben que un ensayo
validado para un tipo de ganado del norte de Europa puede que no sea adecuado para suministrar
resultados válidos cuando se aplica a poblaciones de ganado de África.
La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el
estado de un animal o población con respecto a una infección es la consideración más importante
para la validación de un ensayo. Esta capacidad no sólo depende de un ensayo preciso y muy
fiable, y de estimaciones cuidadosamente obtenidas acerca de la sensibilidad y la especificidad de
diagnóstico, sino que también está muy influenciada por la prevalencia de la infección en la
población sometida a análisis o por la probabilidad de que un animal esté infectado según criterios
clínicos. Sin una estimación real de la prevalencia de la enfermedad en esa población o de la
probabilidad de infección en un animal aislado, la interpretación del resultado positivo o negativo
de una prueba puede resultar dudosa.
Por supuesto, antes de considerar validado un ensayo se deben tener en cuenta muchas
variables (15,13). Sin embargo, no hay consenso sobre si el concepto de validación de un ensayo
es un proceso temporalmente limitado, en el que solamente se optimizan y estandarizan aquellos
factores inherentes al ensayo, o bien si supone una validación continuada del ensayo por todo el
tiempo en el que el ensayo puede ser usado. De acuerdo con lo descrito, el término "ensayo
validado" puede llevar a varias interpretaciones entre los técnicos de laboratorio y los veterinarios
clínicos. Por consiguiente, se ofrece una definición funcional de la validación de un ensayo como
marco para las directrices esbozadas a continuación. En teoría, todos las pruebas diagnósticas
deberían ser completamente validadas para uno o varios fines, pero en la práctica a veces existen
limitaciones para una completa validación.
1
22
A lo largo de este capítulo, los términos “positivo” y “negativo” se emplean con relación a los resultados de pruebas y
nunca para designar el estado de infección o el nivel de anticuerpo/antígeno en el hospedador. Cuando se hace
referencia a “infección” o “compuesto a analizar” se supone la existencia de algun modo de exposición a un agente
infeccioso que puede ser detectado de modo directo (como antígeno) o indirecto (como anticuerpo) por una prueba de
ensayo.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
A. DEFINICIÓN DE LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO
Un ensayo validado proporciona de modo repetitivo unos resultados mediante un test que identifican a los
animales como positivos o negativos para un componente o proceso determinado (por ejemplo un anticuerpo,
un antígeno, o la induración cutánea localizada en el sitio de prueba) y, por deducción, permite predecir de
2
modo preciso el estado de infección de animales con un grado predeterminado de fiabilidad estadística . Este
capítulo se centrará en los principios que fundamentan el desarrollo y el mantenimiento de una prueba validada.
Se incluyen también algunas indicaciones acerca de los estadios iniciales del desarrollo del ensayo porque
constituyen parte del proceso mismo de validación. La capacidad del resultado final del test en cuanto a
proporcionar fiabilidad diagnóstica está influenciada de un modo notable por el modo en que se lleva a cabo
este proceso inicial.
Debe hacerse hincapié en que un ensayo, cuando se aplica a poblaciones, minimizará la clasificación de
animales como falsos positivos o falsos negativos solamente en la medida en que su validez esté garantizada
en todas las fases del proceso de validación del ensayo. Esto supone que un método de prueba bien diseñado y
documentado, así como unos reactivos adecuados, en combinación con técnicos bien preparados,
proporcionarán un ensayo estable de laboratorio. También implica el empleo minucioso de un riguroso diseño
experimental y de herramientas epidemiológicas y estadísticas. Estos son elementos requeridos para eliminar
sesgo, errores aleatorios y falsas suposiciones acerca de la población de animales sobre la que se formulan las
estimaciones del ensayo (5). Además, se supone que el ensayo se adapta bien al propósito que se persigue
(por ejemplo, es probable que un ensayo confirmativo suministre muchos resultados del tipo falsos positivos si
se usa como una prueba general de detección). Finalmente, esto también supone que, en la práctica, el ensayo
se aplica dentro del contexto de un programa riguroso de control de calidad.
La definición funcional de validación de un ensayo que se emplea en este capítulo generaliza un proceso que
conlleva diferentes aspectos en función de la intención o el fin para el cual se desarrolla. Dejando a un lado el
tipo concreto de ensayo, sin la existencia de rigor científico en el proceso validativo, el ensayo no cumplirá las
expectativas. No obstante, existen muchas técnicas tradicionales con un uso muy extendido que no han sido
sometidas a un proceso de validación completo.
B. ESTADIOS DE LA VALIDACIÓN DE UN ENSAYO
El desarrollo y la validación de un ensayo es un proceso secuencial que consta de al menos de cinco fases: 1)
Determinación de la viabilidad del método para un uso específico; 2) Elección, optimización y estandarización de
los reactivos, técnicas y métodos; 3) Determinación de las características de funcionamiento del ensayo; 4)
Evaluación continuada del funcionamiento; y 5) Mantenimiento y refuerzo de los criterios de validación durante
el uso rutinario del ensayo (Figura 1). Aunque algunos científicos pueden cuestionar la relevancia de la cuarta y
quinta fase, tales estadios se incluyen aquí porque un ensayo solo se considera válido cuando los resultados de
las pruebas son válidos, es decir, si están dentro de límites estadísticamente definidos y proporcionan
deducciones precisas. En la práctica, hay muchas técnicas tradicionales de amplio uso que no se han sometido
al proceso de validación formal expuesto. Se deberían hacer esfuerzos para validar formalmente las
características de funcionamiento de estos ensayos, mediante el uso de datos históricos o bien a través de un
estudio prospectivo. Esto daría crédito a la creencia de que tales ensayos son útiles para lo que se pretende. En
dichos casos se puede comenzar el proceso en los estadios 4 y 5, reuniendo un conjunto de datos de validación
para ensayos que carezcan de la información necesaria correspondiente a las fases 1-3.
Es muy importante no detenerse después de los dos primeros estadios de validación de un ensayo -ya que eso
no constituye un ensayo validado para uso diagnóstico. Aunque la mejora del protocolo y de los reactivos son
factores importantes, el factor más crítico es probablemente la selección de las poblaciones de referencia.
Cuando se revisa la literatura no resulta raro encontrar un amplio espectro de valoraciones sobre la sensibilidad
diagnóstica y la especificidad diagnóstica para un mismo ensayo básico. Aunque parte de la variación se puede
atribuir a los reactivos escogidos, es probable que la variación en las valoraciones de la sensibilidad y de la
especificidad se deba a una selección sesgada de los sueros sobre los que se "valida" la prueba. Este estadio
en la validación de un ensayo necesita más atención de la que ha recibido con anterioridad. Esto es
2
Según esta definición, la sensibilidad y especificidad diagnósticas son características de la realización de una prueba
para una población estudiada. Ambas características determinan –en conjunción con la prevalencia de la enfermedad en
la población- la probabilidad de que un resultado concreto de una prueba refleje el verdadero estado del animal. Puede
aceptarse como validada una prueba si se dispone de estimaciones fiables de la sensibilidad y la especificidad
diagnósticas para la población estudiada. Esto no implica la exigencia de unos determinados valores-umbral de esos dos
parámetros. En aplicaciones prácticas, unos valores de sensibilidad o especificidad bajos o problemas de diagnóstico
debidos a una prevalencia baja de la enfermedad se compensan con el diseño de muestreo o combinando muchas
pruebas de diagnóstico ya sea en paralelo, ya sea secuenciadas. La selección de las pruebas, el proceso de muestreo,
la combinación de múltiples pruebas en un determinado régimen de ensayo y la regla de interpretación de resultados
hacen posible una definición del proceso de diagnóstico.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
23
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
particularmente cierto ante la atmósfera actual de acuerdos de comercio internacional y todas sus implicaciones
respecto al movimiento de animales y sus productos derivados.
Seleccionar método
FASE 1
Viabilidad
Seleccionar sueros estándar
Seleccionar sueros control
Estudios de
viabilida
FASE 2
Desarrollo
y
estandarización
FASE 3
Caracterización
operativa del ensayo
Problemas que requieren
reconsideración
Sueros de animales
infectados y no
infectados
Optimizar y
estandarizar
reactivos y
protocolos
Sensibilidad analítica
Ensayar
muestras de
animales de
referencia
Normalizar
datos
Especificidad analítica
Valoraciones iniciales de repetitividad
Estándares de suero
conocidos
Establecer
cortes
FASE 4
Comprobación de la
realización y validez
del ensayo
Resultados
normalizados de
pruebas de
rutina
Categorizar
los resultados
en Pos/Neg
Controlar precisión y
exactitud
FASE 5
Mantenimiento y
mejora de criterios de
validación
Cambio de reactivos estandarizados por
comparación con reactivos en uso
Calcular
precisión y
exactitud
Calcular especificidad
y sensibilidad
diagnóstica
Determinar la prevalencia
en la población
Calcular VPr+ y VPr- para una
interpretación válida de resultados
Extensión de la validación a otras
poblaciones probando sueros de
animales de referencia
representativos de dichas
Fig. 1. Fases consecutivas del proceso de validación de un ensayo
En este capítulo usaremos un ensayo indirecto basado en la unión de una enzima a un inmunoadsorbente
(técnica ELISA) para la detección de anticuerpos a fin de ilustrar los principios de validación de un ensayo. Es
un formato de prueba que puede resultar difícil de validar debido a la amplificación de la señal tanto de los
componentes específicos como de los inespecíficos (2). Esta metodología sirve para destacar los problemas a
los que hay que enfrentarse en cualquier proceso de validación. Los mismos principios básicos se usan en la
validación de otros formatos de ensayo simples o complejos. El Capítulo I.1.4., sobre validación y control de
calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa que se usan para el diagnóstico de
enfermedades infecciosas, describe los principios para validar técnicas de amplificación de genes.
Por limitaciones de espacio, este capítulo introductorio proporciona únicamente directrices básicas en los
principios relacionados con la validación de un ensayo. Su presentación deriva de un tratamiento más detallados
del tema (8).
1ª FASE. ESTUDIOS DE VIABILIDAD
En el ejemplo de las técnicas ELISA, los estudios de viabilidad constituyen la primera fase para validar un nuevo
ensayo. Se llevan a cabo para determinar si los reactivos y el protocolo que han sido seleccionados tienen la
capacidad de distinguir entre un intervalo de concentraciones de anticuerpo frente a un agente infeccioso a la
vez que proporcionan una mínima actividad inespecífica de fondo. Los estudios de viabilidad también
suministran estimaciones iniciales de reproducibilidad, y de sensibilidad y especificidad analíticas.
24
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
1.
Muestras control
Resulta útil seleccionar cuatro o cinco muestras (suero en nuestro caso) que difieran en cuanto al nivel de
anticuerpos contra el agente infeccioso en cuestión. Además, se requiere una muestra que no contenga
anticuerpos. Estas muestras se usarán para optimizar los reactivos y el protocolo del ensayo durante los
estudios de viabilidad, y más tarde como muestras control. En teoría, las muestras deberían representar tanto a
animales que se consideran infectados como aquellos no infectados dentro de la población que finalmente va a
ser objeto del ensayo validado. Por otra parte, las muestras deben haber dado los resultados esperados en uno
o más ensayos serológicos además de aquél en el que se está validando. Con preferencia, las muestras deben
proceder de animales individuales, aunque también pueden derivar de la acumulación de muestras de varios
animales. Una práctica que resulta adecuada es preparar un gran volumen de cada muestra (por ejemplo, 10
ml) y dividirlo en alicuotas de 0,1 ml para almacenamiento a -20ºC o por debajo de esta temperatura. Luego, una
alícuota de cada muestra se descongela, se utiliza para los experimentos y después se desecha. Si resulta poco
práctico descartar la alícuota, se puede mantener la misma a -4ºC para experimentos sucesivos hasta alrededor
de 2 semanas, aunque en estas circunstancias existe la posibilidad de que la muestra se deteriore. A
continuación, se descongela otra alícuota para ulterior investigación. Este método proporciona una misma
fuente de suero con idéntico número de ciclos de congelación-descongelación para todos los experimentos (la
congelación y descongelación repetida del suero puede desnaturalizar los anticuerpos, de modo que debería
evitarse). También, la variación se reduce cuando el investigador usa la misma fuente de suero para todos los
experimentos en vez de cambiar entre varios sueros. Este enfoque tiene la ventaja añadida de generar una serie
de datos válidos para muestras que se manejan repetidamente. Después de que se completan las fases
iniciales de validación de un ensayo, una o más muestras se pueden convertir además en controles de suero
que son la base para la expresión de los datos y la evaluación de la reproducibilidad tanto dentro de un ensayo
como entre diferentes ensayos. Pueden también servir como estándar de referencia si su actividad ha sido
predeterminada; esos estándares normalizados proporcionan la seguridad de que la realización de los ensayos
produce datos precisos (13).
Es muy deseable incluir los sueros internacionales estandarizados de la OIE u otros sueros estandarizados, si
puede disponerse de ellos. Su uso proporcionaría una adecuada armonización entre el ensayo en desarrollo y
cualquier otro método normalizado que use normalmente sueros de tipo estándar internacional (12).
2.
Selección del método para lograr resultados normalizados
La normalización ajusta los resultados directos del test para todas las muestras con relación a los valores de los
controles incluidos en cada desarrollo del ensayo (no confundir esto con una transformación de datos para
lograr una distribución normal de Gauss). El método de normalización y expresión de los datos debería
determinarse, preferiblemente, antes del final de los estudios de viabilidad. Las comparaciones de resultados
día a día y entre laboratorios son más precisos cuando se usan datos normalizados. Por ejemplo, en los
sistemas ELISA, los valores directos de densidad óptica (absorbancia) son medidas absolutas influenciadas por
las temperaturas ambientales, los parámetros de comprobación y la instrumentación fotométrica. Para tener en
cuenta esta variabilidad, los resultados se expresan en función de la reactividad de una o más muestras control
de los sueros que se incluyen en cada desarrollo del ensayo. En el método indirecto de la técnica ELISA, la
normalización de los datos se logra expresando los valores de absorbancia en una de varias formas posibles
(13). Un método simple y útil es expresar todos los valores de absorbancia como porcentaje de un control único
de suero altamente positivo que se incluye en cada placa. Este método resulta adecuado para la mayoría de las
aplicaciones. El procedimiento de normalización puede resultar más riguroso si se calculan los resultados a
partir de una curva estándar generada por varios controles de suero. Esto requiere un algoritmo más sofisticado,
tal como un ajuste de regresión lineal o un análisis de tipo log-logit. Este método es más preciso porque no
descansa solamente en una muestra control altamente positiva para la normalización de datos, sino que usa
varios controles de suero, ajustados a valores esperables, para obtener una curva estándar desde la que puede
extrapolarse el valor de la muestra. Este método también permite la exclusión de un valor control que puede
caer fuera de los límites de confianza esperados.
Para ensayos de punto final por titulación de la muestra, como la neutralización vírica por suero, cada ensayo
realizado se acepta o se rechaza en función de si los valores control caen dentro de límites predeterminados. Ya
que los valores de la muestra no se ajustan normalmente a un valor control, los datos no resultan normalizados
en estricta definición del término.
Sea cual sea el método usado para la normalización de los datos, es esencial incluir controles adicionales para
cada reactivo que pueda introducir variabilidad y que pueda limitar por tanto los intentos de lograr un ensayo
validado. Los valores normalizados para tales controles tienen que caer dentro de límites predeterminados
(dentro de un múltiplo apropiado de la desviación estándar de la media de muchas reacciones de cada control).
Los límites escogidos deberían reflejar una tasa tolerable de rechazo de ensayo y un riesgo aceptable de que
algunas muestras de test puedan estar mal clasificadas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
2ª FASE. DESARROLLO Y ESTANDARIZACION DEL ENSAYO
Una vez establecida la viabilidad del método, el paso siguiente es proceder al desarrollo del ensayo y la
estandarización de los reactivos y los protocolos seleccionados.
1.
Selección de las concentraciones óptimas de reactivo y parámetros de protocolo
Las concentraciones o diluciones óptimas del antígeno fijado a la placa, del suero, del conjugado
enzima/anticuerpo y de la solución de sustrato se determinan mediante valoraciones de tipo "tablero de ajedrez"
enfrentando cada uno de los reactivos contra todos los demás, confirmándose después la elección mas
apropiada de los recipientes de reacción (generalmente por evaluación de dos o tres tipos de microplacas, con
características de fijación diferentes, para minimizar la actividad de fondo y conseguir la máxima diferencia en
actividad entre muestras negativas y positivas altas). Experimentos adicionales determinan las variables
temporales, químicas y físicas óptimas del protocolo, incluyendo las temperaturas y duración de la incubación; el
tipo, pH, y la molaridad del disolvente y de los tampones de lavado y bloqueantes; así como el equipamiento
usado en cada fase del ensayo (como por ejemplo las pipetas y los sistemas de lavado que proporcionan una
mejor reproducibilidad).
La optimización de los reactivos y del protocolo conlleva una comprobación de la exactitud mediante la
inclusión, en cada realización de la prueba, de uno o mas estándares de suero con un nivel conocido de
actividad debida a la sustancia a analizar. Un ensayo optimizado que proporcione los mismos resultados de
forma repetitiva para un estándar de suero y para los controles puede ser considerado como una prueba
estandarizada.
2.
Reproducibilidad- estimaciones preliminares
Las evidencias preliminares de reproducibilidad (concordancia entre los duplicados dentro de un mismo ensayo
y entre distintas realizaciones de la prueba) resultan necesarias para garantizar el posterior desarrollo del
ensayo a validar. Esto se lleva a cabo evaluando los resultados de réplicas de todas las muestras en cada placa
(variación intraplaca), y analizando la variación interplaca usando las mismas muestras en placas diferentes
dentro de un mismo ensayo o entre diferentes realizaciones del mismo. En las técnicas ELISA, en esta fase de
validación se usan normalmente los valores basales de absorbancia porque es dudoso que los resultados del
suero de control altamente positivo, que podrían usarse para calcular valores normalizados, sean reproducibles
en las realizaciones iniciales del ensayo. Además aún no se han determinado los correspondientes valores de
los controles. Para obtener estimaciones preliminares de reproducibilidad suele ser suficiente realizar tres o
cuatro réplicas de cada muestra y llevar a cabo el ensayo en al menos cinco placas en cinco ocasiones
diferentes. En esta fase del desarrollo del ensayo, coeficientes de variación (desviación estandar de las
réplicas/media de las mismas) inferiores al 20% en los valores de absorbancia indican una reproducibilidad
adecuada. Sin embargo, si se pone de manifiesto una excesiva variación (mayor del 30%) en la mayor parte de
las muestras en una misma o diferentes realizaciones de la prueba, deberían hacerse más estudios preliminares
para determinar si es posible estabilizar el ensayo o si se debería abandonar el tipo de test. Esto resulta
particularmente importante ya que un ensayo intrínsecamente variable tiene una alta probabilidad de no resistir
las exigencias de las pruebas diarias con muestras procedentes de la población animal a estudiar.
3.
Determinación de la sensibilidad y la especificidad analítica
La sensibilidad analítica de un ensayo es la cantidad más pequeña de la sustancia en cuestión que puede
detectar, y la especificidad analítica es el grado en que el ensayo no muestra reacción cruzada con otras
sustancias. Estos parámetros son diferentes de la sensibilidad y especificidad diagnóstica que se definen mas
adelante. La sensibilidad analítica puede ser determinada mediante diluciones a punto final, lo que revela la
dilución del suero en la que el anticuerpo ya no puede detectarse. La especificidad analítica se determina
usando un conjunto de sueros procedentes de animales que han experimentado infecciones relacionadas y que
pueden estimular la formación de anticuerpos con reacción cruzada. Por ejemplo, si el ensayo no detecta
anticuerpo a diluciones límite de suero con la misma eficacia que otros ensayos, o si se producen reacciones
cruzadas con sueros procedentes de animales con otras infecciones relacionadas, se necesitará recalibrar o
sustituir los reactivos o, alternativamente, debería abandonarse el ensayo. No obstante, una prueba con baja
especificidad puede ser válida para uso como “prueba tamiz” en situaciones donde se requiere analizar un gran
número de muestras, con tal de que su sensibilidad sea alta, y donde exista una “prueba confirmativa” que tenga
elevada especificidad.
3ª FASE. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DEL ENSAYO
Si los estudios iniciales de desarrollo y estandarización indican que el ensayo es factible y potencialmente
aplicable a las condiciones de campo, el paso siguiente es establecer las características operativas del ensayo.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
1.
Sensibilidad y especificidad diagnóstica
a)
Principios y definiciones
Los valores de sensibilidad y especificidad diagnóstica constituyen los parámetros más importantes que se
establecen durante la validación de un ensayo. Constituyen la base para el cálculo de otros parámetros a
partir de los cuales se realizan deducciones sobre los resultados. Por consiguiente, es muy importante que
las estimaciones sobre la sensibilidad y la especificidad diagnóstica sean tan exactas como sea posible.
En teoría, estos valores derivan del ensayo de una serie de muestras procedentes de animales de
referencia cuya historia es conocida, así como su estado de infección/enfermedad, y que son además
animales representativos de la región o país donde se pretende usar la prueba. La sensibilidad diagnóstica
es la proporción de los animales de referencia infectados que dan respuesta positiva en el ensayo; los
animales infectados que dan respuesta negativa se consideran como resultados falsos negativos. La
especificidad diagnóstica es la proporción de animales de referencia no infectados que dan respuesta
negativa a la prueba; aquellos animales no infectados que dan resultados positivos se consideran como
falsos positivos.
Para establecer la sensibilidad y la especificidad diagnóstica, tanto el número como el origen de los
animales de referencia son aspectos clave cuando se intenta una validación adecuada del ensayo para su
uso con la población de animales a la que va dirigida. Resulta posible calcular el número de muestras de
referencia derivadas de animales cuyo estado es conocido en cuanto a infección, que es necesario para
determinar la sensibilidad y la especificidad diagnóstica dentro de ciertos límites estadísticos definidos. Las
fórmulas y cuadros para determinar el número de muestras requeridas se presentan en otra parte (5,8). Sin
embargo, el número de muestras de referencia obtenidas de estas fórmulas y cuadros puede resultar
inadecuado para un ensayo bien validado debido al gran número de variables que deben tenerse en
cuenta a nivel poblacional al establecer los sueros de referencia. Tales limitaciones y una exposición de los
criterios de selección para sueros estándar se desarrollan con detalle en otra parte (4, 6). Debido a las
muchas variables a tener en cuenta, es conveniente incluir al menos 300 muestras de referencia de
animales infectados y unas 1000 de animales no infectados para obtener estimaciones iniciales sobre la
sensibilidad y la especificidad, respectivamente. La obtención de un número tan grande de muestras de
animales de referencia puede ser difícil o incluso imposible. A veces, iniciar el proceso con menos
animales, y continuar luego la estimación de la sensibilidad y la especificidad a medida que es posible
disponer de mas animales de referencia, es el único modo, en la práctica, de obtener las estimaciones
iniciales (ver más adelante, Fase 5).
b)
Estándares de comparación para el nuevo ensayo
En serología, el “estándar de comparación” es el resultado de un método o combinación de métodos con el
que se compara el nuevo ensayo. Aunque se usa normalmente el término “estándar de oro” para describir
cualquier standard de comparación, debería limitarse el término a métodos que clasifiquen los animales
como infectados o no infectados de modo inequívoco. Algunos métodos de aislamiento tienen problemas
propios de reproducibilidad y sensibilidad. Los métodos con estándar de oro incluyen el aislamiento del
agente causal o criterios histopatológicos patognomónicos. Como establecer un estándar de oro es
imposible, a menudo son necesarios estándares relativos de comparación; éstos se basan en resultados
de otros ensayos serológicos y en animales vacunados o infectados experimentalmente. Los cálculos de
sensibilidad y especificidad diagnóstica son más fiables cuando descansan en un estándar de oro para
comparación. Cuando solo se dispone de estándares relativos de comparación, las estimaciones de estos
parámetros en el nuevo ensayo pueden verse afectadas debido al error previo de estos valores en el
estándar relativo, que se acumula en el nuevo ensayo. Si no se dispone de un estándar para la
comparación, se pueden establecer la sensibilidad y la especificidad diagnóstica (3, 7).
c)
Precisión, repetición, reproducibilidad, y exactitud
En un ensayo, la repetición y reproducibilidad son indicaciones de precisión. La precisión es una medida
de la dispersión de los resultados en una muestra repetidamente ensayada; un ensayo preciso muestra
solo una pequeña dispersión. La repetición en un ensayo diagnóstico consta de dos elementos: el nivel de
concordancia entre las réplicas de cada muestra (normalmente dos o tres) dentro del desarrollo de un
ensayo, y el nivel de concordancia para los valores normalizados de cada muestra control entre diferentes
series de ensayos. La reproducibilidad es el grado de coincidencia de resultados para las mismas
muestras ensayadas en laboratorios diferentes. La exactitud es el nivel de concordancia entre el valor del
ensayo y el valor esperado para la sustancia en cuestión en una muestra estándar de actividad conocida
(título o concentración). Un sistema de ensayo puede ser preciso, pero no exacto, si los resultados de la
prueba no concuerdan con los valores esperados para un estándar.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
Se pueden obtener estimaciones fiables de repetitividad y exactitud, tanto dentro de una misma ejecución
del ensayo como entre distintas realizaciones del mismo, mediante el uso de los resultados normalizados
obtenidos de las muchas pruebas del nuevo ensayo que se requirió hacer para evaluar los sueros de los
animales de referencia (se obtienen resultados menos fiables a partir de datos preliminares sobre valores
directos de absorbancia). Al menos 10 ejecuciones del ensayo, y con preferencia 20, permitirán una
estimación inicial razonable de estos parámetros. Los métodos para evaluar estos parámetros se han
descrito con detalle (8).
La exactitud se puede determinar incluyendo uno o más estándares (muestras de título o concentración
conocida, etc.) en cada ejecución del ensayo. Los estándares pueden ser sueros control siempre que la
cantidad de la sustancia a analizar (es decir, su titulo o concentración) se haya determinado previamente
en cada uno de ellos mediante comparación con estándares primarios o secundarios de referencia (13) y
que los sueros control no se usen en el proceso de normalización de datos.
La reproducibilidad de los ensayos se determina en laboratorios distintos utilizando un ensayo idéntico (en
cuanto a protocolo, reactivos y controles) sobre un grupo de al menos 10 muestras, preferiblemente por
duplicado hasta un total de 20 muestras. Es preciso que estas muestras representen el intervalo completo
de las concentraciones esperadas de la sustancia analizada en las muestras de la población. El grado en
que se desvían los resultados colectivos de cada muestra respecto a los valores esperados es una medida
de la reproducibilidad del ensayo. El grado de concordancia entre los datos de los laboratorios constituye
una base adicional sobre la que establecer si las características de realización del ensayo son las
adecuadas para que un ensayo pueda considerarse validado.
2.
Selección del nivel de corte (umbral de positividad y negatividad)
Para llevar a cabo valoraciones de sensibilidad y especificidad diagnóstica, los resultados de las pruebas tienen
primero que reducirse a la categoría de positivo o negativo. Esto implica considerar un punto de corte (umbral o
límite de decisión) en la escala continua de resultados de la prueba. Aunque se han descrito muchos métodos a
este respecto, los tres ejemplos que siguen a continuación ilustrarán los diferentes enfoques, junto a sus
ventajas y limitaciones. El primer método establece un corte basado en la distribución de frecuencias de los
resultados con animales de referencia infectados y no infectados (8). Este corte se puede establecer por
inspección visual de la distribución de frecuencias, por análisis de las características de tipo receptor-operador
(6, 14), o por una selección que favorezca la sensibilidad o la especificidad, dependiendo del uso que se
pretenda con el ensayo determinado (11). Un segundo enfoque consiste en establecer el corte basados solo en
animales de referencia no infectados; esto permite una estimación de la especificidad diagnóstica pero no de la
sensibilidad diagnóstica. El tercer método proporciona un “corte intrínseco” basado en resultados de sueros
tomados al azar dentro de la población estudiada sin conocerse de antemano el estado de infección de los
animales (4). Aunque por este método no se obtienen estimaciones de la sensibilidad y especificidad, éstas se
pueden determinar a partir de datos confirmativos acumulados.
Si existe una superposición considerable en las distribuciones de los valores de las pruebas con animales
infectados y no infectados, resulta difícil seleccionar un punto de corte que permita clasificar adecuadamente
estos animales con relación a su estado infectivo. Entonces, en lugar de un único corte, se pueden seleccionar
dos cortes que definan una sensibilidad diagnóstica elevada (por ejemplo, con inclusión del 99% de los valores
de animales infectados) y una especificidad elevada (con 99% de los valores de los animales no infectados).
Los valores que se encuentren entre estos percentiles deberían clasificarse como sospechosos o equívocos y
podrían requerir otra prueba de ensayo confirmativo o para detectar la existencia de seroconversión.
3.
Cálculo de la sensibilidad y la especificidad diagnóstica
La selección de cortes o umbrales permite clasificar los resultados de una prueba como positivos o negativos.
La determinación de la sensibilidad y la especificidad se facilita asociando los datos positivos y negativos con el
estado conocido de la infección de cada animal mediante un cuadro de dos por dos (Cuadro 1). Una vez
establecido el corte, los resultados de las pruebas de los sueros estándares se pueden clasificar como
verdaderos positivos (VP) o verdaderos negativos (VN) si están de acuerdo con los estándares de oro (u otros
estándares de comparación). Alternativamente, se pueden clasificar como falsos positivos (FP) o falsos
negativos (FN) si no concuerdan con el estándar. La sensibilidad diagnóstica se calcula como VP/(VP+FN),
mientras que la especificidad diagnóstica se expresa como VN/(VN+FP); los resultados de ambas
determinaciones se suelen indicar como porcentajes (Cuadro 1).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
Cuadro 1. Cálculo de la sensibilidad diagnóstica y de la especificidad diagnóstica con ayuda de cuadro de 2 x 2
que asocia el estado de infección con resultados de la prueba en 2000 animales de referencia.
Animales de referencia con estado infectivo conocido
Infectados (n = 600)
Positiva
No infectados (n = 1400)
570
46
Resultado
TP
FP
de la prueba
FN
TN
Negativa
30
1354
Sensibilidad diagnóstica
TP
TP + FN
4.
=
570
= 95.0%
600
Especificidad diagnóstica
TN
TN + FP
=
1354
= 96.7%
1400
Armonización de los ensayos
Cuando para la determinación de un componente existe ya un método estándar internacional (12), es posible
comparar dicho método con el que se está desarrollando. Este proceso requiere el uso de los mismos controles
de suero y de estándares en ambos ensayos. Si se dispone de sueros internacionalmente estandarizados se
deberían incluir al menos tres de ellos (uno negativo, otro con baja positividad, y otro con alta positividad) en el
estudio comparativo de los ensayos. Esto podría conducir a un nuevo ensayo considerado como un método
estándar internacional y a sueros de estándar internacional (12). La armonización de los dos ensayos sería
entonces posible.
4ª FASE. COMPROBACIÓN DE LA VALIDEZ DE LA REALIZACIÓN DEL ENSAYO
1.
Interpretación de los resultados — factores que influyen en la validez del ensayo
Los resultados de una prueba sólo son útiles si las deducciones que permiten alcanzar son correctas. Un error
muy común consiste en suponer que un ensayo con un 99% de sensibilidad y un 99% de especificidad originará
aproximadamente un solo falso positivo y un falso negativo en los resultados de cada 100 ensayos con animales
de una determinada población. Tal ensayo puede ser preciso y exacto pero puede, sin embargo, producir
resultados que no permitan predecir adecuadamente el estado de infección. Por ejemplo, si la prevalencia de
una enfermedad en una población analizada por el ensayo es solo de 1 entre 1.000 animales, y la tasa de falsos
positivos en la prueba es de 1 por cada 100 animales (especificidad diagnóstica 99%), entonces en cada 1.000
pruebas sobre esa población habrá 10 falsos positivos y solo uno será verdadero positivo. Por tanto, tan solo
aproximadamente el 9% de los resultados positivos de la prueba permitirá predecir de manera exacta el estado
del animal en cuanto a infección; los resultados de la prueba clasificarán erróneamente al animal el 91% de las
veces. Esta situación ejemplifica que la capacidad de los resultados de una prueba positiva o negativa para
definir el estado de infección depende de la prevalencia de la infección en la población estudiada (9). Por
supuesto, la prevalencia probablemente se habrá determinado a su vez mediante el uso de una prueba
serológica con el error de clasificación de resultados que la misma conlleva.
La determinación de la prevalencia en la población resulta necesaria para calcular los valores predictivos
positivos (VPr+) o negativos (VPr-) del ensayo. Cuando los valores de la prueba se indican sin disponer de datos
acerca de la especificidad o la sensibilidad, no es posible inferir predicciones sobre el estado infectivo a partir de
los resultados (6). Por consiguiente, es muy conveniente disponer de una especie de interpretación adicional,
acompañando los resultados con un pequeño cuadro que indique VPr+ y VPr- en un intervalo de prevalencias
posibles en la población. Sin dicha información, los resultados de los ensayos de la prueba pueden carecer de lo
requerido para clasificar con exactitud el estado de infección de los animales y, por tanto, no reflejarán un
ensayo completamente validado.
FASE 5ª. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN
Un ensayo validado necesita un constante seguimiento y un mantenimiento para conservar tal designación. Una
vez que el ensayo se ha puesto ya en uso rutinario, hay que realizar un control interno de calidad comprobando
repetidamente el ensayo en cuanto a repetitividad y exactitud (1).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.3. — Principios de validación para las pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas
La reproducibilidad entre laboratorios debería comprobarse al menos dos veces por año. Es deseable formar
parte de un consorcio de laboratorios interesados en evaluar los resultados. En un futuro próximo, una buena
práctica de laboratorio que incluya la aplicación de un programa para asegurar la calidad total será un requisito
esencial para aquellos que intenten un reconocimiento nacional o internacional (véase Capítulo I.1.2).
El examen de aptitud es una forma de control externo de calidad para una determinada prueba. Normalmente,
esto se lleva a cabo por un laboratorio de referencia que distribuye lotes de muestras, recibe resultados de los
laboratorios, analiza los datos, y devuelve los informes a los laboratorios implicados. Si los resultados de un
determinado laboratorio están dentro de límites aceptables y muestran evidencias de exactitud y
reproducibilidad, el laboratorio puede disponer de un certificado emitido por agencias gubernamentales o
laboratorios de referencia que lo acreditan como laboratorio oficial para dicha prueba (10). Las muestras de
suero para el examen de aptitud deberían contener una representación completa de la concentración de la
sustancia a analizar en los animales de una población bajo estudio. Si las muestras representaran solo sueros
altamente positivos o débilmente positivos (con ninguna muestra próxima al nivel de corte del ensayo), el
ejercicio solo pondría en evidencia la reproducibilidad en los extremos de concentración de la sustancia
analizada, pero no aclararía si los resultados de pruebas rutinarias en la población clasifican de modo
conveniente el estado de infección de los animales.
Debido al extraordinario número de variables que inciden en la realización de las pruebas serodiagnósticas, es
conveniente ampliar el número de sueros estándar correspondientes a animales con reconocida infección
debido a que el error en las estimaciones de sensibilidad y especificidad se reduce cuando aumenta el tamaño
de las muestras. Además, cuando se pretende transferir el ensayo a una región geográfica completamente
distinta, es esencial efectuar una nueva validación del ensayo para el nuevo uso, ajustándolo a sueros de
poblaciones de animales que residan en las condiciones locales. Lo mismo cabe decir a la hora de establecer
la sensibilidad y especificidad diagnósticas para subpoblaciones (ej., grupos de edad, vacunado/no vacunado,
etc.).
Cuando una muestra de suero control está a punto de agotarse, resulta necesario preparar y probar
repetidamente otro suero de repuesto antes de que se acabe. La nueva muestra de control se incluye en 10-20
realizaciones del ensayo antes del agotamiento del control original para establecer su relación proporcional con
el que se está acabando. Si la muestra en vías de desaparición era un control positivo en técnicas ELISA, donde
el valor normalizado se expresa como porcentaje del control positivo, la diferencia proporcional de actividad en
el ensayo ELISA entre el suero original y el de recambio debe ser convertido en un factor de normalización para
mantener el mismo nivel de corte, y por tanto la misma sensibilidad y especificidad diagnóstica en el ensayo.
Cuando hay que reemplazar otros reactivos, como el antígeno para captura de los anticuerpos, esto debería
llevarse a cabo siguiendo los mismos criterios que con los reactivos originales y deberían probarse en al menos
cinco desarrollos del ensayo utilizando una serie de muestras de suero diseñadas para tal propósito. Siempre
que sea posible, es importante cambiar cada vez solamente un reactivo para evitar el problema de tener que
evaluar simultáneamente mas de una variable.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
31
CAPÍTULO I.1.4.
VALIDACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD
DE LOS MÉTODOS DE LA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO
DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico de enfermedades infecciosas se realiza mediante la detección directa e indirecta de
los agentes infecciosos. Mediante los métodos directos se detectan las partículas de los agentes
infecciosos y/o sus componentes, tales como los ácidos nucleicos, proteínas estructurales y no
estructurales, enzimas, etc. Los métodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos
por las infecciones.
Los métodos más comunes de detección directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la
microscopía electrónica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoquímica, el enzimoinmunoensayo
(ELISA), la hibridación de ácidos nucleicos (NAH) y la amplificación de ácidos nucleicos, tal como
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También se denominan métodos de diagnóstico
molecular, puesto que los ensayos de NAH y PCR tienen como objetivo las moléculas de ácidos
nucleicos.
Los métodos indirectos más comunes de detección del agente infeccioso son las pruebas
serológicas tales como: la neutralización vírica, la detección de anticuerpos mediante ELISA y las
pruebas de inhibición de la hemoaglutinación. En general, los laboratorios de diagnóstico aplican
simultáneamente los dos métodos para garantizar un diagnóstico seguro.
Hasta la fecha, los principios de validación de la OIE se han desarrollado para los métodos de
detección indirecta, esto es, para la prueba ELISA de anticuerpos. El objetivo de este capítulo es
ampliar las normas a un método directo de detección de un agente infeccioso, es decir, adaptar los
principios de validación a los ensayos de PCR.
Las experiencias de la última década indican que las técnicas de PCR finalmente sustituirán a
muchos de los métodos directos clásicos de detección de agentes infecciosos. Está claro que la
PCR está reemplazando el aislamiento de virus o cultivo de bacterias para la detección de agentes
que son difíciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en
cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los virus que se replican; ii) los
cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para
completar el diagnóstico; y iv) una pericia especial, que se está perdiendo o disminuyendo hoy en
muchos laboratorios. Aunque los ensayos de PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en
día, son herramientas relativamente baratas, seguras y fáciles de utilizar en los laboratorios de
diagnóstico (2, 7). Generalmente, la sensibilidad y especificidad de la PCR es mayor que los
procedimientos ELISA de aislamiento y captura.
32
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
A. MÉTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNÓSTICOS
MOLECULARES RUTINARIOS
1.
Principios de la técnica de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reacción de amplificación
basada en enzimas. El término “reacción en cadena” se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo específico
de ADN o de ácidos nucleicos diana (nucleótidos), en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La
región que hay que amplificar está definida por dos (o más) secuencias de nucleótidos cortos denominados sitios
de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucleótidos cortos que son
complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una
polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana
uniendo los nucleótidos libres a los cebadores. Repitiendo el régimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40
veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene es suficiente para operaciones posteriores, tales como
detección, clonación y secuenciación. La sensibilidad de diagnóstico de la PCR es muy alta, porque se producen
varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reacción puede ser también muy alta,
ya que está determinada por las secuencias específicas de nucleótidos de la diana seleccionada, así como por el
diseño del cebador. Los cebadores pueden diseñarse para detectar secuencias específicas de nucleótidos en los
genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden diseñarse para ser complementarios de las
secuencias muy comunes que se dan en la naturaleza. Estos cebadores no específicos, llamados cebadores
universales, son capaces de aglutinar una gama más amplia de ADN y pueden utilizarse para detectar miembros
dentro de una familia o género del agente infeccioso.
a)
Amplificación del ADN
Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificación se realiza directamente, con o sin
purificación previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extraído y purificado del material
que se va a utilizar en la prueba, dará como resultado un aumento en la sensibilidad analítica y diagnóstica.
b)
Amplificación del ARN (PCR de trascripción inversa)
Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen ácido ribonucleico (RNA) que no se puede
amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificación por PCR se necesita un ADN diana
monocatenario, y éste no está disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adición
de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la trascriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a
ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de
PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripción inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reacción
de trascripción inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere después a un tubo
nuevo para la reacción de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con
actividad trascriptasa inversa y tampones específicos en los cuales las polimerasas RT y ADN están
activas. Ambas permiten una reacción RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin
manipulación adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayoría de los casos será
necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripción inversa. Sin embargo, en algunos casos, es
suficiente con hervir la muestra antes de la RT-PCR (p. ej. muestras de materias fecales en PBS).
c)
Detección del amplímero por PCR
El producto PCR o amplímero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El más común incluye la
detección no específica del producto de la PCR, basada en una medida amplímera utilizando electroforesis
en gel de agarosa y tiñendo el ADN con un tinte no específico, como el bromuro de etilo, o el
reconocimiento específico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por
Southern blot seguido de hibridación con sondas de oligonucleótidos complementarias de la secuencia
diana. Las sondas de hibridación pueden ser, enzima, marcado como quimiluminiscente o radionucleótido
para permitir la detección de la secuencia diana específica.
Más abajo se dan algunos ejemplos de métodos de PCR utilizados actualmente.
2.
PCR convencional
En la “PCR convencional” (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucleótidos para amplificar
una parte pequeña del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analítica es relativamente alta con un
número mínimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analítica también es bastante
alta. La sensibilidad y especificidad analíticas se pueden mejorar mediante la aplicación de la PCR anidada
(véase más adelante el punto 3). La especificidad se puede mejorar posteriormente utilizando el método
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
33
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
Southern blot de transferencia a papel y comprobando los productos de la PCR con una sonda marcada, pero
esto lleva mucho tiempo y no es una práctica común hoy día en los laboratorios de diagnóstico.
3.
PCR anidada
En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificación con cuatro cebadores, denominados
cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y
especificidad analíticas superiores si se comparan con las pruebas de PCR convencionales. La sensibilidad
analítica es típicamente <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la especificidad analítica también
aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucleótidos tienen que unirse específicamente a las dianas
seleccionadas para producir una reacción positiva (2).
4.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real es una amplificación en la que los productos de la PCR son detectados directamente
durante los ciclos de amplificación utilizando sondas marcadas con fluorescencia. Diversos métodos en tiempo
real, tales como los ensayos que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan o Molecular Beacon, se han
convertido en herramientas muy populares para la detección de agentes infecciosos. La PCR en tiempo real se
ha utilizado para la detección de bacterias, virus o parásitos de una amplia variedad de especies animales (2, 6,
8). Estos nuevos ensayos tienen varias ventajas comparados con los métodos “clásicos” de la PCR convencional
o anidada. Sólo se utiliza un par de cebadores, presentando, a menudo, una sensibilidad próxima o igual a la
PCR anidada tradicional, pero con un riesgo mucho más bajo de contaminación. La fluorescencia, que indica la
presencia del producto amplificado, se mide a través de la tapa o del lado del tubo de reacción, de forma que no
es necesario el manejo posterior de los productos de la PCR. Estos procedimientos llevan considerablemente
menos tiempo si se compara con la detección tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa,
seguidos de la tinción con bromuro de etidio, con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminación. El
empleo de la modalidad de placa de microtitulación de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite
que el procedimiento sea automático y apropiado para pruebas a gran escala (5). El diagnóstico se puede
automatizar posteriormente utilizando robots para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparación
con los métodos clásicos, una ventaja adicional de la técnica de la PCR en tiempo real es que es posible realizar
ensayos cuantitativos (6).
5.
PCR múltiple
Se denominan pruebas de PCR múltiple a las reacciones de PCR que utilizan cebadores múltiples dirigidos a
diferentes dianas en un único ensayo. En la PCR múltiple se pueden detectar y diferenciar de forma simultánea
varios agentes infecciosos en un único tubo de reacción individual. Los diferentes PCR diana amplificados en
una prueba estándar de PCR se identifican basándose en el tamaño del producto de la PCR. El empleo de los
métodos de la PCR anidada “clásica” para la construcción de un ensayo múltiple resulta complicado debido a la
necesidad de dianas de diferentes tamaños, así como de cebadores que puedan “competir” entre sí en la misma
mezcla reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el
concepto de la PCR en tiempo real (pares de cebadores únicos) proporciona excelentes posibilidades para la
construcción de sistemas múltiples muy sensibles (2, 4) basados en un tamaño más uniforme de la diana, en
unas condiciones de amplificación uniformes y en la detección por separado de las dianas utilizando sondas de
hibridación específicas marcadas con fluoróforos diferentes.
B. VALIDACIÓN DE LOS ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Cuando se realizan análisis diagnósticos de material clínico es importante producir datos de buena calidad. Para
esto, hay que cumplir algunos criterios clave. Es necesario establecer los sistemas de garantía de calidad (GC) y
de control de calidad (CC), esto es, un juego de protocolos de calidad, incluyendo el empleo de muestras control,
que aseguren que el sistema está funcionando adecuadamente y confirme la calidad de los datos. En muchos
laboratorios de todo el mundo ya se han establecido los sistemas GC y CC y hay personal entrenado y
competente. La validación de ensayos es otro factor fundamental para garantizar que los resultados de las
pruebas reflejan el estado real de las muestras (3).
Para predecir la eficacia de un ensayo diagnóstico, es necesario utilizar una metodología de validación con el fin
de documentar los resultados analíticos que se esperan del ensayo en cuestión. La validación es la evaluación
de un ensayo diagnóstico con el fin de determinar su idoneidad para una utilización concreta. Los principios
generales de validación de ensayos se pueden encontrar en el Capítulo I.1.3. Principios de validación para las
pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas. El presente capítulo extiende estos principios de validación
a los ensayos de diagnóstico molecular. Consúltese el Capítulo I.1.3. para la explicación de los términos y las
definiciones.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
C. MEDIDAS DE LA VALIDEZ
Las características operativas (o parámetros del ensayo) proporcionan información sobre la eficacia de un
método bajo condiciones específicas. En el Capítulo I.1.3. se presentan algunas características operativas, y en
este capítulo se ofrecen algunas otras que son importantes para los métodos de la PCR.
D. ETAPAS DE LA VALIDACIÓN DE ENSAYOS
En el Capítulo I.1.3. se describen con detalle las cinco etapas de la validación de ensayos. En el presente
capítulo, se exponen brevemente estas etapas, con especial énfasis en los ensayos de diagnóstico molecular.
1ª ETAPA. ESTUDIOS DE VIABILIDAD
El estudio de viabilidad constituye la etapa preliminar en la validación de un nuevo ensayo. El objetivo es
determinar si en un ensayo se puede detectar o no un rango de concentraciones testigo sin actividad de fondo.
Se eligen, al menos, diez muestras (por ejemplo, agentes infecciosos producidos en el laboratorio en cultivo
celular o bacteriano), que comprendan desde niveles bajos hasta niveles altos del agente infeccioso. También
hay que incluir, al menos, diez muestras que no contengan el testigo. Normalmente, es difícil separar esta etapa
de la segunda, ya que es necesaria una optimización preliminar antes de que se puedan realizar estudios
posteriores. Los ensayos que parecen prometedores se someten a un desarrollo posterior en la 2ª etapa.
Obsérvese que, a veces, se puede mejorar considerablemente un ensayo mediante esquemas de optimización
adecuados, y de esta forma la exclusión de ensayos no óptimos se hará con cautela.
La selección de la diana y el diseño del cebador son críticas, y debería tenerse en cuenta la naturaleza del
agente infeccioso, su estructura genómica y la diversidad de secuencias genéticas que existen entre diferentes
cepas o aislados, y la utilización que se pretende dar a la prueba (por ejemplo prueba de control, tipificación de
cepas, etc.).
El resultado obtenido por la PCR puede verse influido por el funcionamiento del equipo del laboratorio y en
particular por el termociclador, que, por tanto, se debería supervisar de forma continua como parte del programa
QA. Es crucial la calibración de la temperatura correcta y, para los instrumentos de la PCR en tiempo real, deben
calibrarse de forma regular los sistemas ópticos, de acuerdo con los protocolos QA de laboratorio. Los ensayos
desarrollados y validados mediante la utilización de equipo clave, como la extracción robótica o un termociclador
fabricado por un fabricante específico, deben ser revalidados o tener datos de equivalencia generados antes de
su utilización en plataformas de equipamiento alternativas.
2ª ETAPA. DESARROLLO Y ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO
1.
Selección de las concentraciones óptimas de los reactivos, los parámetros de los
protocolos y el equipo
La toma, preparación y transporte de muestras (véase Capítulo I.1.1.) y los métodos de extracción de ácidos
nucleicos (véase Capítulo I.1.8.) son todos parámetros esenciales en la realización de un ensayo y deberían
optimizarse para el diagnóstico de enfermedades. Incluso los métodos adecuados varían dependiendo del tipo
de muestra y organismo. En general, el suero sanguíneo, el tejido del cuerpo y las muestras de frotis son
muestras adecuadas para la extracción fácil de ácidos nucleicos objeto de estudio, mientras que las muestras de
heces y semen son más difíciles de manejar. La extracción del ARN difiere de la del ADN, y el ARN es más
proclive a la degradación. Tanto los métodos comerciales (robóticos, columnas de giro, extracciones por
procedimientos magnéticos, etc.) como los métodos químicos estándar se utilizan para la extracción del ADN o
del ARN. Es fundamental establecer el método más reproducible y eficaz de extracción antes de llevar a cabo
una validación posterior del ensayo. Si se cambia el método de extracción, deben generarse unos datos de
equivalencia o se debe repetir el procedimiento completo de validación.
Todo el equipo utilizado en el proceso debe mantenerse correctamente. Los aparatos que requieren calibración
(bloques de calentamiento, refrigeradores, congeladores, termocicladores, pipetas, etc.) deben calibrarse según
los protocolos de calidad del laboratorio.
Cuando se realicen los ensayos “clásicos” de PCR o en tiempo real, es necesario optimizar todos los parámetros,
los protocolos y los reactivos. Un ensayo estandarizado es un método que produce constantemente el mismo
resultado para una muestra dada cuando se repite varias veces y cuando se lleva a cabo por diferentes analistas
en diferentes laboratorios.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
35
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
2.
Repetitividad — estimaciones preliminares
En esta etapa debe conseguirse una concordancia entre las réplicas en la realización del ensayo y entre las
distintas realizaciones del mismo. Esto proporciona información importante sobre el ensayo antes de que se lleve
a cabo una validación posterior. Si se encuentra una excesiva variabilidad, habrá que corregirla antes de
continuar con el proceso de validación.
3.
Determinación de los parámetros esenciales de control
Durante la optimización del ensayo de la PCR, también se puede estimar la capacidad del método de no verse
afectado por pequeños cambios en los parámetros principales. Es preciso documentar las variaciones
intencionadas durante la realización del ensayo a fin de caracterizar los parámetros esenciales del mismo. Los
ejemplos de tales parámetros son: tiempos de incubación y temperaturas, concentración de tampones,
cebadores, MgCl2, etc., pH, cantidades de otros componentes añadidos (por ejemplo dNTP, suero bovino,
albúmina, etc.). La caracterización de dichos parámetros de control es crucial para la identificación de los puntos
esenciales que deben controlarse correctamente en el ensayo.
4.
Sensibilidad y especificidad analíticas
La sensibilidad analítica (o límite de detección) se define como la cantidad más pequeña de agente detectado por
el ensayo, y puede representarse como el número de copias del genoma, de dosis infecciosas, de unidades que
integran la colonia, de unidades que forman la placa, etc. del agente que puede detectarse y distinguirse a partir
de un resultado cero. Para determinar la sensibilidad analítica se utiliza una dilución de punto final hasta que el
ensayo ya no pueda detectar el blanco en estudio en más del 5% de las réplicas (2 desviaciones estándar). Los
fragmentos clonados de los productos de la PCR en estudio se pueden usar como muestras estándar, bien como
ADN o para dianas de ARN, siendo éste trascrito in vitro a ADN.
La especificidad analítica se define como la capacidad de un ensayo para distinguir el agente objeto de estudio
de otros agentes infecciosos. La capacidad se determina analizando los patógenos genéticamente relacionados
entre sí y el material clínico obtenido de los animales portadores de enfermedades que pueden imitar a (o
confundirse con) aquellas para las que se ha diseñado la prueba.
5.
Rango
Las técnicas analíticas deben optimizarse en la fase lineal de la curva de respuesta. El rango de un ensayo se
define como el intervalo existente entre la concentración máxima y mínima de un agente infeccioso en una
muestra en la que el agente puede detectarse de forma fiable.
3ª ETAPA. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS
OPERATIVAS DEL ENSAYO
1.
Sensibilidad y especificidad diagnósticas
La sensibilidad diagnóstica (proporción de animales de referencia que se sabe que están infectados, que dan
respuesta positiva en el ensayo) y la especificidad (proporción de animales de referencia que se sabe que no
están infectados, que dan respuesta negativa en el ensayo) son los parámetros más importantes obtenidos
durante la validación de un ensayo. Constituyen la base para el cálculo de otros parámetros y son, por lo tanto,
cruciales para el conjunto del proceso de validación. Se puede calcular el número de muestras de referencia que
se requiere para determinar las estimaciones y el error admisible de la sensibilidad y de la especificidad
diagnósticas. Para hacer esto, debe utilizarse una predicción razonable de la sensibilidad y de la especificidad
diagnósticas. Normalmente, la confianza de la estimación se establece en el 95%. Sin embargo, ninguna fórmula
puede tener en cuenta los numerosos factores del hospedador/organismo que pueden afectar al resultado de la
prueba. En el Capítulo I.1.3. se explica, a grandes rasgos, el número de muestras requeridas para determinar las
estimaciones de la sensibilidad y de la especificidad diagnósticas. En la práctica esto es difícil de conseguir con
los métodos moleculares especialmente en lo referente a muestras positivas en el caso de una enfermedad que
no es endémica o no está extendida. Generalmente, el ensayo se pone en práctica en la fase final, quizás en
paralelo con la Norma de oro de que se ensaye un número suficiente de animales. A medida que se avanza en la
utilización de la prueba, los datos adicionales recogidos ayudarán a reducir el error de las estimaciones. El
estado de los animales que se sabe que están infectados y el de los que no lo están, debería establecerse
mediante comparaciones con otros ensayos. No es adecuado el empleo de muestras adicionadas en la PCR, ya
que éstas podrían no ser representativas de muestras infectadas de forma natural, y de esta forma podría
ponerse potencialmente en riesgo todo el proceso de validación.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
2.
Repetitividad y reproducibilidad
La repetitividad y reproducibilidad son dos parámetros importantes de la precisión de un ensayo. La repetitividad
se mide como el grado de concordancia entre réplicas ensayadas en diferentes realizaciones. La reproducibilidad
se determina utilizando un ensayo idéntico (protocolo, reactivos y controles) en diferentes laboratorios.
Hoy en día, tal como se indica en el Capítulo I.1.3, es poco frecuente realizar en su totalidad la 3ª etapa
recomendada por la OIE en los laboratorios de diagnóstico veterinarios llevando a cabo ensayos de la PCR.
Tradicionalmente, muchos laboratorios han utilizado pruebas de elaboración propia, probablemente por razones
prácticas. Los métodos estandarizados y validados deben seguirse allí donde se hayan publicado. Tienen que
llevarse a cabo los procesos de validación entre laboratorios, incluso si son costosos y requieren una labor
intensa. Este trabajo propiciará la realización de los ensayos estandarizados, permitiendo la actividad diagnóstica
armonizada en diferentes países.
4ª ETAPA. SEGUIMIENTO DE LA VALIDEZ DE LA OPERATIVIDAD DEL ENSAYO
La estimación de la prevalencia de un virus en la población es necesaria para calcular el valor predictivo de los
resultados positivos (VP+) o negativos (VP–) de la prueba. Esto se aplica por igual a los métodos de ensayos
moleculares y a otros métodos tales como el enzimoinmunoensayo (ELISA).
Se insta a los Laboratorios de Referencia a determinar los valores de la sensibilidad y especificidad diagnósticas
de la forma más precisa posible, ya que éstas son muy importantes para valorar la eficacia real de un ensayo
cuando se usa en el campo. También es importante estimar los valores predictivos (VP+ o VP–) en las
circunstancias locales. Durante la validación inicial y el empleo de un ensayo nuevo, se recomienda la
investigación de los resultados negativos y positivos falsos. Por ejemplo, las reacciones positivas falsas basadas
en ensayos moleculares pueden ser evaluadas por análisis de secuencia del ADN amplificado, para ayudar en la
corrección de errores debidos a la fijación de dianas o cebadores no específicos, a la falta de rigor del ensayo,
etc.
5ª ETAPA. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIÓN
Cuando el ensayo se utiliza como una prueba rutinaria, es importante mantener el CC interno. El ensayo tiene
que ser supervisado continuamente con relación a la repetitividad y exactitud. La OIE recomienda que la
reproducibilidad entre laboratorios (pruebas del anillo) se compruebe, al menos, dos veces al año (9).
Si el ensayo se va a aplicar en otra región geográfica y/o población, podría ser necesario hacer una revalidación
o documentar la equivalencia bajo las nuevas condiciones. La revalidación también puede ser necesaria si la
prueba se aplica a una matriz de muestra distinta, por ejemplo, validación en sangre y utilización en otros tejidos
o validación para tejidos de cabezas de ganado y utilización en otras especies. Esto es especialmente cierto para
los ensayos de la PCR ya que es muy común que las mutaciones puntuales ocurran en muchos agentes
infecciosos (esto es, virus de ARN). Las mutaciones, que se pueden dar dentro de los emplazamientos del
cebador o la sonda pueden afectar a la eficacia de un ensayo y, de ser así, los criterios de actuación
establecidos ya no son válidos. También es recomendable confirmar de forma regular la secuencia diana de las
regiones genómicas seleccionadas para los aislados nacionales o regionales de los agentes infecciosos. Esto es
especialmente cierto para los emplazamientos de los cebadores si se quiere garantizar que los mismos
permanezcan estables con el fin de que no se cuestione la validez de la prueba. Puede ser necesaria la
repetición de la validación y la solidez cuando la prueba se transfiere de un laboratorio de desarrollo al campo,
dado que las condiciones pueden ser menos óptimas y el personal estar menos preparado.
1.
Precauciones y controles
Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnóstico rutinario, se
deberían tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la técnica de PCR para la detección
de agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos o negativos falsos. Estos, junto con controles
internos (miméticos) garantizan la evaluación segura de los resultados.
a)
Precauciones para evitar resultados positivos falsos
Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una reacción positiva), pueden surgir de
bien de temas relacionados con el laboratorio, tales como contaminación cruzada, o factores relacionados
con la prueba, por ejemplo una realización del ensayo o de la optimización ineficaces. Los restos de
productos de las muestras positivas o, más comúnmente, de la contaminación cruzada por los productos de
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Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
la PCR provenientes de experimentos anteriores constituyen una posible fuente de error, y se han aplicado
varias técnicas y herramientas para evitar los resultados falso positivos de la PCR. Las muestras y los
reactivos se deben manejar en campanas de aire de flujo laminar, que regularmente se descontaminan
regularmente utilizando luz UV y lejía. La construcción y utilización de soportes de tubos y abridores
especiales ayuda a evitar resultados positivos falsos de la PCR. Además, se deberían aplicar prácticas de
laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas básicas (extracción del ADN, preparación y mezcla del
cebador, preparación de la muestra, electroforesis por gel agarosa de la ampliación de productos, etc.). en
áreas o habitaciones del laboratorio separadas (1,2). Se deben utilizar diferentes juegos de pipetas en cada
una de las etapas. Se recomienda el empleo de un desplazamiento positivo y de filtros. También se
recomienda que diferentes personas lleven a cabo las distintas etapas, que están restringidas a las
respectivas áreas del laboratorio. Se deben tomar precauciones para evitar la introducción de material
amplificado de laboratorios potencialmente contaminados dentro de las áreas “limpias” del laboratorio
mediante las restricciones en los movimientos de las muestras, documentos, equipo, personas o cualquier
otra forma de contaminación potencial. El movimiento en la dirección contraria debería ocurrir sólo después
de la descontaminación, la ducha y el cambio de ropa. Además, es preferible diluir las muestras con una
cantidad desconocida pero que se supone grande, de agente o ácido nucleico diana antes de la
introducción del material en las áreas “limpias” del laboratorio.
También es muy importante incluir controles negativos, por ejemplo, muestras que sean tan parecidas a las
muestras de prueba como sea posible, pero sin la diana. A los laboratorios que han tenido problemas con la
contaminación cruzada, se les recomienda al menos un control negativo por cada cinco muestras de
diagnóstico. Ambas muestras control positivas y negativas se deberían intercalar de forma rutinaria con
muestras de diagnóstico a fin de evaluar la realización de la prueba de PCR.
b)
Controles de los procesos (miméticos) para evitar resultados negativos falsos
Los resultados negativos falsos (muestras que contienen el agente objetivo pero probadas como negativas)
se deben en su mayor parte a los efectos inhibidores y/o a los errores de pipeteo. Por tanto, los controles
internos se utilizan como indicadores de la eficacia de la prueba de PCR. Los controles internos de la PCR
pueden incluir ADN extraño añadido a la muestra o ADN que se da en la muestra de forma natural. El ADN
extraño añadido a la muestra puede incluir miméticos de ADN o de ARN. Los miméticos de ADN,
oligonucleótidos manufacturados, tienen las mismas secuencias de unión a los cebadores que las de la
PCR diana, pero flanquean un fragmento de ADN heterólogo de un tamaño diferente. Las secuencias de
nucleótidos idénticas de unión al cebador permiten la amplificación simultánea del molde y del mimético en
el mismo tubo con una competición mínima. Las diferencias de tamaño proporcionan una discriminación
fácil por medio del análisis de Southern blot. El ARN blindado, un concepto idéntico a los miméticos de
ADN, utiliza un fragmento de ARN control envuelto en proteínas protectoras de bacteriófago para proteger o
estabilizar el ARN para los ensayos de control o la estandarización de las pruebas RT-PCR.
En los ensayos de la PCR en tiempo real, también es posible emplear controles internos, un gen vigilante
que se da forma natural, un fragmento seleccionado del genoma del animal hospedador como el actina
beta, GAPDH o el ARN ribosómico. Mediante la inclusión de dicho control intrínseco, con un fluoróforo
indicador específicamente coloreado, es posible comprobar la calidad de la muestra y confirmar la eficacia
de la PCR cuando se detectan simultáneamente el agente en estudio y los ADN intrínsecos (8).
Los controles internos aumentan la fiabilidad del diagnóstico de PCR (1,2) Se debe tener precaución al
diseñar y validar los controles internos. Es necesario realizar muchas pruebas para garantizar que la
amplificación por PCR del control interno añadido no compite con la PCR de diagnóstico y por tanto
disminuye la sensibilidad analítica. Los controles internos se emplean en concentraciones ligeramente por
debajo del límite de detección de la PCR de diagnóstico para garantizar la realización de la prueba.
También debería tenerse en cuenta que los controles internos tienen una desventaja similar a las pruebas
descartadas y no son representativos del ácido nucleico diana y pueden proporcionar resultados negativos
falsos.
2.
Preparación de estándares
Los laboratorios de referencia deben proporcionar muestras estándares representativas de un agente infeccioso
dado. Dichas muestras pueden ser agentes infecciosos cultivados, especimenes clínicos, etc., que se distribuyen
de manera que el agente infeccioso se conserve bien. De esta forma, las muestras se distribuyen congeladas en
disolventes orgánicos (por ejemplo, trizol) o de otras formas adecuadas. Las muestras también se pueden enviar
como ácidos nucleicos (congelados, secados por congelación o en etanol). Para los detalles específicos, véanse
los capítulos individuales sobre enfermedades. Los laboratorios de referencia deberían proporcionar los
miméticos apropiados.
38
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.4. — Validación y control de calidad de los métodos de la reacción en cadena
de la polimerasa utilizados en el diagnóstico de enfermedades infecciosas
REFERENCIAS
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diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, 159–164.
2.
BELAK S. & THOREN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases. Expert Rev. Mol. Diagn., 1, 434–444.
3.
BURKHARDT H.J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38,
87–91.
4.
ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J., & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application
in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, 559–570.
5.
JUNGKIND D. (2001). Automation of laboratory testing for infectious diseases using the polymerase chain
reaction – our past, our present, our future. J. Clin. Virol., 20, 1–6.
6.
HEID C.A., STEVENS J., LIVAK K.J. & W ILLIAMS P.M. (1996). Real-time quantitative PCR. Genome Res., 6, 986–
994.
7.
LOUIE M., LOUIE L. & SIMOR A.E. (2000). The role of DNA amplification technology in the diagnosis of
infectious diseases. CMAJ., 163, 301–309.
8.
MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30, 1292–
1305.
9.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality
Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, 53–63.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Validación y control de calidad de los métodos de la
reacción en cadena de la polimerasa utilizados en la medicina veterinaria (ver Cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
39
CAPÍTULO I.1.5.
PRUEBAS PARA ESTERILIDAD Y
AUSENCIA DE CONTAMINACIÓN EN
MATERIALES BIOLÓGICOS
INTRODUCCIÓN
La esterilidad se define como la ausencia de organismos vivos. Se logra por calentamiento, por
filtración, mediante tratamiento con óxido de etileno o por radiaciones ionizantes, y realizando
asépticamente cualquier proceso posterior. La ausencia de contaminación se define como la falta de
seres vivos concretos. Esto se puede obtener seleccionando los materiales a partir de fuentes que
carezcan de los organismos concretos y realizando asépticamente cualquier proceso posterior. Solo
con un control adecuado de los materiales primarios empleados y de los procesos que se siguen, así
como del almacenamiento, se puede conseguir una adecuada seguridad de esterilidad y de
ausencia de contaminación. Se requiere la realización de pruebas sobre el producto para comprobar
que se ha logrado este control.
A. PROCEDIMIENTOS GENERALES
1.
Los materiales originales deben obtenerse de fuentes que estén libres de contaminación y que sean
manejadas de tal modo que se reduzca la contaminación y la posibilidad de que cualquier contaminante se
multiplique.
2.
Los materiales que puedan esterilizarse sin que sus propiedades biológicas resulten excesivamente
afectadas deben esterilizarse mediante un método efectivo para tales materiales concretos. El método debe
reducir el nivel de contaminación hasta que ésta sea indetectable, según determine una prueba de
esterilidad adecuada (Véase párrafo B.3 más adelante).
3.
Si se emplea un procedimiento de esterilización, deberá ser validado para demostrar su conveniencia y ser
controlado de modo adecuado para demostrar que ha funcionado correctamente en cada ocasión.
4
Los materiales que no se han esterilizado y aquellos sometidos a manipulación tras la esterilización han de
ser manejados asépticamente.
5
El ambiente en que se realiza cualquier manipulación aséptica ha de mantenerse en un estado de limpieza
protegido de fuentes externas de contaminación, y debe estar controlado para reducir al mínimo la
contaminación interna.
B. VACUNAS CON VIRUS VIVOS PARA ADMINISTRACIÓN POR INYECCIÓN
1.
Los materiales de origen animal deben ser (a) esterilizados, o (b) obtenidos de animales sanos que, en la
medida de lo posible, deberían de estar libres de patógenos que puedan transmitirse de la especie de
origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie en contacto con ellas, o (c) el material
debe estar exento de tales patógenos.
2.
Los virus del inóculo inicial y los de cualquier línea celular continua empleada para el crecimiento de los
virus deben estar libres de bacterias, hongos, micoplasmas, virus no relacionados y otros patógenos que
puedan transmitirse de la especie de origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie
en contacto con ellas.
3.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba de esterilidad similar a la de métodos publicados (1-3, 5).
40
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
4.
Cada lote de vacuna debe superar pruebas adecuadas para demostrar que la vacuna está exenta de virus
contaminados. (Tales pruebas incluyen ensayos en cultivos celulares que sean sensibles a los virus de la
especie a vacunar, pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario, pruebas en animales).
5.
Algunos países exigen que cada lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas. Se han
publicado métodos adecuados para tal prueba (1-3, 5).
6.
Puede ser necesaria la realización de pruebas para determinar la ausencia de algunas bacterias
específicas, por ejemplo Salmonella pullorum, Mycobacterium tuberculosis y M. paratuberculosis, Brucella
spp. y Leptospira spp.
C. VACUNAS CON VIRUS VIVOS PARA ADMINISTRACIÓN CON AGUA DE
BEBIDA, PULVERIZACIÓN, O ESCARIFICACIÓN CUTÁNEA
1.
Resultan aplicables los párrafos B.1., 2., 4., 5., y 6.
2.
Puede estar permitido un número limitado de bacterias no patógenas y hongos contaminantes (ver Sección
J.2.5. más adelante).
D. VACUNAS CON VIRUS INACTIVADOS
1.
Resultan aplicables los párrafos B.2. y 3.
E. VACUNAS CON BACTERIAS VIVAS
1.
Resulta aplicable el párrafo B.1.
2.
Los inóculos bacterianos iniciales deben estar libres de otras bacterias así como de hongos y micoplasmas.
3.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba de pureza mediante el uso de medios sólidos e ignorando el
crecimiento de la bacteria de la vacuna.
4.
Algunos países exigen que cada lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas. Se han
publicado métodos adecuados para tal prueba ( ref. 5, y para micoplasmas aviares ref. 2).
F. VACUNAS CON BACTERIAS INACTIVADAS
1.
Resultan aplicables los párrafos B.1., B.3., y E.
2
Cada lote de vacuna debe superar una prueba para demostrar la inactivación de la bacteria contenida en la
vacuna. Si resulta apropiado, puede utilizarse a este respecto la prueba de esterilidad.
G. SUEROS PARA ADMINISTRACIÓN A ANIMALES
1.
Resulta aplicable el párrafo B.1.
2.
Si se usa un virus o una bacteria para la producción de los sueros, resultan aplicables los párrafos B.2. o
E.2. según corresponda.
3.
Cada lote de suero debe superar una prueba de esterilidad que cumpla lo descrito en la ref. 5. Se han
publicado métodos de ensayo adecuados (1-3).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
41
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
4.
Cada lote de suero debe superar pruebas apropiadas que demuestren que el suero está exento de virus
contaminados. (Tales pruebas incluyen ensayos en cultivos celulares que sean sensibles a los virus de la
especie tratada, pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario, pruebas en animales).
5.
Algunos países exigen que cada lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas. Se han
publicado métodos adecuados para tal prueba ( ref. 5, y para micoplasmas aviares ref. 2).
H. AGENTES DIAGNÓSTICOS PARA ADMINISTRACIÓN A ANIMALES
1.
Resultan aplicables los párrafos B.1. y 3.
2.
Si se utiliza un virus en la producción del agente diagnóstico, son aplicables los párrafos B.2. y D.2.; si se
usa una bacteria resultan aplicables los párrafos E.2. y F.2.
I. EMBRIONES, ÓVULOS, Y SEMEN
En relación con el uso de embriones, óvulos y semen, se deben tomar precauciones especiales (4).
J. EJEMPLOS DE PROCEDIMIENTOS
1.
Procedimientos generales
Los materiales utilizados en la producción de productos biológicos deben ser esterilizados y/o probados antes de
su uso para asegurar la ausencia de contaminantes. También deben ensayarse muestras del producto biológico
final para la detección de bacterias, hongos o micoplasmas contaminantes.
Los ensayos que aquí se describen para bacterias, hongos, micoplasmas y virus proceden de diversas fuentes y
se indican como ejemplo de métodos que pueden emplearse con seguridad.
2.
Detección de bacterias y hongos
Estos ensayos describen los materiales y métodos que se usan para detectar bacterias y hongos por la técnica
de filtración por membrana o mediante la inoculación directa en medios de cultivo líquido en el caso de
materiales que no son adecuados para filtración a través de membrana.
2.1. Procedimiento general para estimación de bacterias y hongos viables
Las pruebas normalizadas para la detección de bacterias y hongos indeseables en materiales de partida,
lotes de inóculo o en el producto final son: la prueba de filtración por membrana o la prueba de esterilidad
por inoculación directa.
En la técnica de filtración por membrana, se usa un filtro con un tamaño de poro nominal no superior a 0,45
µm y un diámetro de al menos 47 mm. Si el material es acuoso o débilmente lipídico se deben usar filtros
de nitrato de celulosa; si el material tiene un elevado contenido alcohólico, lipídico o con adyuvantes
lipídicos se deben usar filtros de acetato de celulosa. El filtro se humedece con 20-25 ml de Diluyente A o B
inmediatamente antes de verter el contenido del recipiente o recipientes que se vayan a ensayar.
Diluyente A - para productos o materiales acuosos: Disolver 1 g de hidrolizado péptico de tejido animal en
agua hasta completar un litro, filtrar o centrifugar para clarificar, ajustar el pH a 7.1+ 0,2, distribuir en
recipientes en alícuotas de 100 ml, y esterilizar por vapor.
Diluyente B - para materiales o productos lipídicos: Añadir 1 ml de polisorbato 80 a 1 litro de Diluyente A,
ajustar el pH a 7.1+ 0,2, distribuir en recipientes en alícuotas de 100 ml, y esterilizar por vapor.
Si la muestra biológica ensayada tiene propiedades antimicrobianas, la membrana se lava tres veces con
aproximadamente 100 ml del diluyente apropiado (A o B) después de la aplicación de la muestra. A
continuación la membrana se transfiere entera a los medios de cultivo, cortada asépticamente en partes
42
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
iguales y colocadas en los medios, o bien los medios se transfieren a la membrana en el aparato de
filtración. Cuando la muestra contenga mertiolato como conservante, se usa medio de tioglicolato líquido
(FTM) y la membrana se incuba tanto a 30-35ºC como a 20-25ºC. Si la muestra ensayada contiene un
agente biológico muerto sin mertiolato como conservante, se usa el medio FTM a 30-35ºC y medio de soja
y caseína hidrolizada (SCDM) a 20-25ºC. Cuando se trata de una muestra biológica a ensayar que
contenga virus vivos, se utiliza el medio SCDM para incubación a ambas temperaturas.
Si se elige la inoculación directa a los medios de cultivo, se emplea una pipeta estéril o una jeringa con
aguja para transferir asépticamente el material biológico de modo directo a los medios líquidos. En caso de
que la muestra ensayada tenga propiedades antimicrobianas, se debe determinar la proporción del inóculo
respecto al volumen del medio de cultivo antes del comienzo de la prueba. Para determinar el volumen
correcto de medio a fin de invalidar la actividad antimicrobiana, se usan 100 unidades formadoras de
colonias (CFU) de los microorganismos control indicados en el Cuadro 1. Si la muestra analizada contiene
mertiolato como conservante, se emplea medio FTM en recipientes de ensayo que se incuban tanto a 3035ºC como a 20-25ºC. Después de un tiempo de incubación adecuado (ver Sección J.2.2.), el crecimiento
debería ser claramente visible. Si la muestra ensayada contiene un agente biológico muerto sin mertiolato,
o una bacteria viva, se usa medio FTM a 30-35ºC y medio SCDMa 20-25ºC. Si se trata de una muestra con
virus vivos, se usa medio SCDM a ambas temperaturas de incubación. Si la vacuna con bacterias
inactivadas contiene clostridios, o algún componente de los clostridios, es preferible usar medio FTM
suplementado con 0.5% de extracto de carne (FTMB) en lugar de FTM. También puede ser aconsejable la
utilización de FTM y SCDM en todas las pruebas.
Cuadro 1. Algunas cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo1 con sus medios respectivos y
condiciones de incubación
Incubación
Medio
Microorganismo de referencia
Temperatura (°C)
Condiciones
FTM
FTM
Bacillus subtilis ATCC # 6633
30–35
Aeróbicas
Candida krusei ATCC # 6258
20–25
Aeróbicas
SCDM
Bacillus subtilis ATCC # 6633
30–35
Aeróbicas
SCDM
Candida kursei ATCC # 6258
20–25
Aeróbicas
FTMB
Clostridium sporogenes ATCC # 11437
30–35
Anaeróbicas
FTMB
Staphylococcus aureus ATCC #6538
30–35
Aeróbicas
Tanto para pruebas de esterilidad mediante filtración por membrana como por inoculación directa, todos los
medios se incuban por al menos 14 días. A intervalos durante la incubación, y tras los 14 días de
incubación, se examinan los recipientes de ensayo para evidencia de crecimiento microbiano. El
crecimiento microbiano debería confirmarse mediante subcultivo y tinción de Gram.
2.2. Inducción del crecimiento y pruebas de interferencia
La esterilidad de los medios de cultivo debe ser confirmada incubando recipientes representativos a las
temperaturas adecuadas por el tiempo especificado para cada prueba.
Cada vez que se realiza una prueba debe validarse para cada producto objeto de prueba y para cada
partida o lote de medios de cultivo la capacidad de un medio de cultivo para mantener el crecimiento en
presencia y en ausencia del producto, componentes del producto, células, inóculos, y otros materiales
ensayados.
Para ensayar la capacidad de mantener el crecimiento en ausencia del material a prueba, los medios de
cultivo deberían inocularse con 10-100 organismos control viables de las cepas sugeridas por la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que se indican en el Cuadro 1 e incubados de acuerdo con las
condiciones especificadas.
Para ensayar la capacidad de los medios de cultivo de mantener el crecimiento en presencia del material a
prueba, los recipientes deben ser inoculados simultáneamente con el material de prueba (ver Sección
J.2.3.) y con 10-100 organismos control viables. El número de recipientes a usar debería ser al menos la
mitad de los usados para ensayar el producto o los componentes del producto. Los medios son
1
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
43
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
satisfactorios si en 7 días existe clara evidencia de crecimiento de los organismos control en todos los
recipientes con medio inoculado. En el caso de que se aprecie crecimiento, debería identificarse el
organismo para confirmar que se trata del organismo originalmente añadido al medio. La prueba de
esterilidad no se considera válida si alguno de los medios muestra una respuesta inadecuada al
crecimiento, o si el organismo detectado no es el organismo usado para inocular el material.
2.3. Número de muestras de prueba
El número de artículos en cada lote determina el número de recipientes que deberían ser sometidos a
prueba de esterilidad. Si el tamaño del lote no es superior a 100, debería ensayarse el 10% o cuatro
recipientes, cualquiera que sea mayor. Si el lote contiene entre 100 y 500 recipientes, deberían probarse
diez. Si el lote tiene más de 500 contenedores, entonces el 2% o 20 contenedores, cualquiera que sea el
menor, deberían ser sometidos a ensayo. La cantidad de inóculo para la prueba de esterilidad está en
función de la cantidad de muestra biológica presente en cada recipiente. Si la cantidad es menor de 1 ml,
todo el contenido se divide para cada medio. Si la cantidad es de 1 a 4 ml, se usa entonces la mitad del
contenido para cada medio. Si se encuentra entre 4 y 20 ml, se utiliza un inóculo de 2 ml para cada medio.
Cuando la cantidad en cada recipiente es de entre 20 y 100 ml, entonces se usa el 10% del contenido por
medio. Finalmente, si la cantidad por recipiente supera los 100 ml, se usa para inocular cada medio el 10%
o 50 ml, cualquiera que sea mayor.
2.4. Interpretación de los resultados de la prueba de esterilidad
Si existe crecimiento en cualquier medio pero puede demostrarse por controles que fueron defectuosos los
medios o la técnica empleada, entonces el primer ensayo se considera no válido y debe repetirse. Si en una
primer ensayo se detecta crecimiento microbiano en cualquiera de los recipientes del ensayo y no hay
evidencias que lo invaliden, se debe proceder a una segunda prueba. En tal caso, el número mínimo de
recipientes con muestra biológica, recipientes de ensayo y filtros de membrana es el doble del número
usado en la primera prueba. Cuando no se detecta crecimiento en el primer ensayo ni en su repetición, la
muestra satisface los requisitos de la prueba y se considera adecuada en cuanto a esterilidad. Si se detecta
crecimiento microbiano en cualquiera de los recipientes del ensayo repetido, la muestra biológica se
considera no satisfactoria en cuanto a esterilidad. Sin embargo, cuando se demuestre mediante controles
que los medios o la técnica fueron incorrectos en la repetición, debe procederse a una nueva repetición.
2.5. Procedimiento general para determinar la presencia de bacterias y hongos en vacunas con virus
vivos producidas en huevos y administradas por agua de bebida, pulverización o escarificación
cutánea.
Cada lote de recipientes con muestra biológica final debe tener una contaminación media no superior a una
colonia de bacterias u hongos por dosis de vacuna recomendada en aves, o diez colonias por dosis en
otros animales (ver la anterior Sección J.2.3. para determinar el numero de muestras a ensayar). De cada
muestra de recipiente se inoculan dos placas Petri con vacuna equivalente a diez dosis si la vacuna es
recomendable para aves, o a una dosis si es recomendable para otros animales. A cada placa se añaden
20 ml de medio sólido de infusión de cerebro y corazón que contiene 0.007 IU (unidades internacionales) de
penicilinasa por ml. Una placa se debe incubar a 30-35ºC durante 7 días y la otra a 20-25ºC durante
14 días. El recuento del número de colonias se realiza al final de cada período de incubación. En cada
condición de incubación se debe realizar una determinación promedio de colonias en todas las placas que
representen un lote. Si en la prueba inicial la media del número de colonias en cada condición de
incubación supera a una colonia por dosis de vacuna recomendada para aves, o a diez colonias por dosis
de vacuna recomendada para otros animales, se debe proceder a repetir la prueba para eliminar la
posibilidad de fallos en la técnica, usando el doble de recipientes no abiertos de la muestra biológica final.
Si en la prueba final la media del número de colonias por cada lote en cada condición de incubación supera
una colonia por dosis en el caso de vacuna aviar, o diez colonias por dosis en caso de vacuna apropiada
para otros animales, el lote de vacuna debe ser considerado como no satisfactorio.
2.6. Procedimiento general para determinar la pureza de inóculos de bacterias y de productos
biológicos con bacterias vivas
Cada inóculo de bacterias o cada lote de material con bacterias vivas debe ser ensayado en cuanto a
pureza por inoculación en medio SCDM, que se incuba a 20-25ªC por 14 días, y en medio FTM, que se
incuba a 30-35ºC por 14 días (ver la anterior Sección J.2.3. para determinar el número de muestras a
ensayar y la cantidad de inóculo usado). Se utiliza una pipeta estéril o una jeringa con aguja para transferir
directamente de modo aséptico la cantidad de muestra a los dos tipos de cultivo. La relación mínima de
inóculo a medio de cultivo es de 1/15.
44
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
Si el inóculo o el crecimiento de la vacuna bacteriana vuelve turbio el medio de tal modo que no es posible
determinar la ausencia de crecimiento microbiano atípico, se debe proceder a hacer subcultivos a partir de
los tubos turbios desde el día 3 al día 11. El subcultivo de hace transfiriendo 0,1-1,0 ml a medios
diferenciales líquidos y sólidos e incubando durante el resto del período de 14 días. También se debería
realizar un examen microscópico mediante la tinción de Gram.
Si no se detecta crecimiento microbiano atípico en ninguno de los recipientes de ensayo cuando se
compara con un control positivo incluido en la prueba, el lote de muestra biológica puede considerarse
satisfactorio en cuanto a pureza. Si se detecta crecimiento atípico pero se puede demostrar mediante
control que los medios o la técnica fueron defectuosos, entonces se debe repetir la primera prueba. Si se
detecta crecimiento atípico pero no existe evidencia que permita invalidar la prueba, se puede llevar a cabo
una repetición. En esta repetición se usa un número doble de recipientes con muestra biológica y de
recipientes para prueba respecto al primer ensayo. Si en dicha repetición no se detecta crecimiento atípico,
la muestra se considera satisfactoria en cuanto a pureza. Si en cualquiera de los recipientes de prueba se
encuentra crecimiento atípico, la muestra se considera inadecuada en cuanto a pureza. Sin embargo,
cuando en la repetición pueda demostrarse mediante controles que los medios o la técnica fueron
defectuosos, la repetición debería a su vez repetirse.
3.
Detección de contaminación por Mycoplasma
3.1. Procedimiento general para la detección de contaminación por Mycoplasma
Cada lote de vacuna con virus vivos, cada lote de inóculo vírico original (MSV), cada lote de células
primarias y originales en stock (MCS), y todos los ingredientes de origen animal que no hayan sido
esterilizados al vapor deben ser sometidos a pruebas para determinar la ausencia de micoplasmas.
Deberían utilizarse medios sólidos y líquidos, tales como el medio para micoplasmas de Frey, capaces de
mantener el crecimiento de pequeñas cantidades de organismos de referencia, entre los que se incluyen
Acholeplasma laidlawii (ATCC nº 23206), Mycoplasma arginini (ATCC nº 23838), M. hyorhinis (ATCC nº
17981), and M. orale (ATCC nº 23714). En el caso de materiales para aves también sería conveniente usar
como organismo de referencia M. synoviae (ATCC nº 25204). En teoría, se debería incluir en los ensayos
de los medios algún aislamiento reciente de micoplasma con bajo número de pases en resiembra,
identificado mediante comparación con las cepas de referencia. Las propiedades nutritivas del medio sólido
deberían de ser tales que cuando se inoculan aproximadamente 200 CFUs (unidades formadoras de
colonias) por placa, no aparezcan menos de 100 CFU para cada organismo de referencia. Cuando se
inoculan aproximadamente 20 CFUs de cada organismo en los medios líquidos, debe originarse un
apropiado cambio de color. La capacidad de los medios de cultivo para mantener el crecimiento en
presencia de los productos debe validarse para cada producto objeto de prueba y para cada nuevo grupo o
lote de medios de cultivo.
Debe someterse a prueba una muestra de cada lote de vacuna, MSV, etc. Inocular cuatro placas de medio
sólido con 0,25 ml de la muestra a ensayar e inocular, por otra parte, 100 ml de medio líquido con 10 ml de
la muestra. Incubar durante 28 días dos placas a 35-37ºC en condiciones aeróbicas (una atmósfera de aire
conteniendo 5-10% de CO2 y una humedad adecuada) y otras dos en condiciones anaeróbicas (una
atmósfera de nitrógeno conteniendo 5-10% de CO2 y una humedad adecuada). En el día 3 o 4 tras la
inoculación, subcultivar 0.25 ml del medio líquido por resiembra en dos placas de medio sólido. Incubar a
35-37ºC una placa en condiciones aeróbicas y otra en condiciones anaeróbicas hasta el día 28 de la
prueba. Repetir el proceso de subcultivo por resiembra en los días 6, 7 u 8, y de nuevo en los días 13 ó
14. Observar diariamente el medio líquido, y, si ocurre cualquier cambio de color, se procede a subcultivar
inmediatamente.
3.2. Interpretación de los resultados de la prueba para Mycoplasma
Al final del período de incubación (día 28), se examinan microscópicamente todos los medios sólidos
inoculados para comprobar la presencia de colonias de micoplasmas. La muestra ensayada supera la
prueba si se ha dado un crecimiento de colonias de micoplasmas en los controles positivos, y si no se ha
dado crecimiento en ninguno de los medios sólidos inoculados con el material de prueba. Si se rompiera o
contaminara accidentalmente con bacterias u hongos más de una placa en cualquier fase de la prueba, la
prueba se consideraría no válida y debería repetirse. Si aparecen colonias de micoplasmas en cualquiera
de las placas con medio sólido, debería repetirse una vez la prueba para confirmar la contaminación por
micoplasmas. En esta nueva prueba se puede usar el doble de volumen (0,5 ml) de material biológico
objeto de la prueba. Si en alguna placa de esta repetición se detectan colonias de micoplasma, la muestra
de la prueba debe considerarse como no satisfactoria debido a la contaminación por micoplasmas. Algunos
micoplasmas no pueden cultivarse, en cuyo caso los lotes de MSV y MCS tienen que ensayarse utilizando
una línea celular indicadora (células Vero), o los métodos de tinción de ADN o basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
45
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
4.
Detección de contaminación por Salmonella
Cada lote de material biológico con virus vivos producidos en huevos debe de carecer de contaminación por
Salmonella. Se deben probar cinco muestras de cada lote; 5 ml de muestra o la mitad del contenido de un
recipiente, cualquiera que sea menor, se inoculan en 100 ml de caldo de triptosa y caldo de tetrationato. Estos
medios líquidos inoculados se incuban a 35-37ºC durante 18-24 horas. A partir de estos caldos se debe
resembrar en los medios sólidos MacConkey y Salmonella-Shigella, se incuba por 18-24 horas y se examina. Si
no se advierte el típico crecimiento de Salmonella, las placas deben incubarse 18-24 horas adicionales y
examinarse de nuevo. Si entonces se observan colonias típicas de Salmonella, se debe proceder a un subcultivo
en un medio diferencial adecuado para realizar una identificación positiva. Si se encuentra Salmonella, el lote de
muestra biológica no es satisfactorio.
5.
Detección de virus en muestras biológicas
Los materiales biológicos que son susceptibles de contaminación vírica y que no pueden ser esterilizados antes
de su uso, como el caso de algunos ingredientes de origen animal (por ejemplo, suero), las células de cultivo
primario, las líneas celulares, o los stocks de virus para inoculación, deben ser ensayados antes de su
correspondiente uso. Existen pruebas descritas para detectar virus contaminantes mediante efectos citopáticos,
la hemoadsorción, la hemoaglutinación, técnicas con anticuerpos fluorescentes u otros métodos adecuados,
como por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el enzimoinmunoensayo (técnicas ELISA).
Las células se ensayan de la siguiente manera. El día inicial, las células primarias o congeladas que se van a
ensayar se siembran en frascos de 75 cm2 (o en contenedores similares); 7 días después, se preparan a partir
de él al menos dos frascos de 75 cm2. En el día 14, un frasco se utiliza para pruebas celulares de citopatología,
hemadsorción, y tinción con anticuerpos fluorescentes (los procedimientos se describen más adelante). El otro
frasco se resiembra por segunda vez, y el día 21 se somete a tres ciclos de congelación y descongelación.
Después del tercer ciclo de congelación y descongelación, las células se centrifugan a 2.000 g por 10 minutos, y
el sobrenadante se usa para inocular células adecuadas que sean sensibles a virus, es decir, células
susceptibles a virus que puedan estar presentes en la especie animal de la que proceden las células, células
susceptibles a virus que puedan presentarse en los animales a los que el uso del material está dirigido y células
susceptibles a los pestivirus. Estas células son luego resembradas dos veces a intervalos de 7 días, y analizadas
en cuanto a citopatología, hemadsorción, y tinción con anticuerpos fluorescentes.
Los componentes de origen animal se prueban tanto en células de riñón de mono verde africano (células Vero)
como en líneas celulares o células primarias de la misma especie que el componente sometido a prueba. Se
emplean frascos de 72 cm2, y las células se inoculan en 25 ml de medio con 3.75 ml del material ensayado o con
15% de dicho material, cualquiera que sea el menor. Las células se resiembran dos veces a intervalos de 7 días
y se analizan en cuanto a citopatología, hemadsorción y tinción con anticuerpos fluorescentes. Deben observarse
las células, para averiguar si hay efecto citopático, cada 2 o 3 días y antes de cada subcultivo a lo largo del
período de incubación.
Los lotes de inóculos víricos originales (MSV) se prueban sobre células Vero, líneas celulares o células primarias
de la especie para la que está diseñado el producto, y sobre líneas celulares o células primarias de la especie en
la que se prepara el producto (si es diferente de la especie a la que se dirige el mismo).
Para cada tipo celular utilizado en la prueba, se descongela o reconstituye 1 ml del MSV ensayado y se
neutraliza mediante adición de 1 ml de anticuerpo monoespecífico. El suero debe carecer de anticuerpos frente a
cualquiera de los contaminantes que se pretende evidenciar en la prueba. Siempre resulta necesario un mínimo
de al menos dos tipos celulares, de modo que se requiere un mínimo de 2 ml de MSV y 2 ml de antisuero. Se
permite que el antisuero neutralice el MSV a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, de esta
mezcla de MSV/antisuero, se inoculan 2 ml en frascos de 75 cm2 conteniendo las células adecuadas. Si se
conoce que el MSV presenta un título alto o que es un agente difícil de neutralizar, o cuando se sabe que el
suero bloqueante presenta un título bajo, se puede añadir antisuero bloqueante al medio de crecimiento a una
concentración final de 1-5%. Se deben resembrar las células al menos dos veces en un período de 14 días, y el
cultivo final se examina para citopatología, hemadsorción y tinción con anticuerpos fluorescentes.
Para detectar la citopatología causada por virus contaminantes, se usa normalmente el procedimiento de tinción
de May-Grünwald-Giemsa. Las monocapas se suelen preparar en portaobjetos para cultivos de tejidos de dos
cámaras y se incuban por 7 días. Se extraen los pocillos de plástico de los portas dejando la junta de goma unida
al porta. Los portaobjetos se enjuagan con la solución tampón de fosfato salino de Dulbecco (PBS) ligeramente
calentada, se fijan en alcohol y se colocan en un dispositivo de tinción. A continuación, los portas se tiñen
durante 15 minutos a temperatura ambiente con colorante May-Grünwald diluido 1/5 con metanol absoluto. El
colorante May-Grünwald se elimina mediante inversión de los portas. Luego los portas se tiñen durante
20 minutos con colorante Giemsa diluido 1/15 con agua desionizada. El colorante Giemsa se elimina por
inversión de los portas y lavado de los mismos con agua desionizada por 10-20 segundos. Los portas se secan
46
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
al aire, y se aplica aceite de parafina y un cubreobjetos. La tinción de May-Grünwald-Giemsa tiñe de modo
diferente las nucleoproteínas con ADN o ARN. Las nucleoproteínas con ADN se colorean de rojo-púrpura,
mientras que las nucleoproteínas con ARN se colorean de azul. Las monocapas se examinan con un
microscopio convencional para ver la presencia de cuerpos de inclusión, un número anormal de células gigantes,
u otra citopatología atribuible a un virus contaminante. Las monocapas inoculadas se comparan con monocapas
no inoculadas. Si se detecta citopatología específica debida a un virus contaminante, el material ensayado
debería considerarse como no satisfactorio.
La prueba para detectar virus contaminantes que producen hemadsorción en las células infectadas se lleva a
cabo normalmente en monocapas de segunda resiembra de cultivos celulares inoculados con el material
probado y en cultivos celulares no inoculados. Las monocapas se disponen, por lo general, en frascos de plástico
de 25 cm2. La sangre de cobaya, de pollo o de cualquier otro origen que se usa en este ensayo se mezcla con
un volumen igual de solución de Alsever. La sangre puede conservarse hasta 7 días a 4ºC si se lava varias
veces con solución de Alsever antes del almacenarse en un volumen igual de dicha solución. Inmediatamente
antes de su uso, los eritrocitos guardados se lavan de nuevo añadiendo 5 ml de sangre en solución de Alsever a
45 ml de PBS libre de calcio y magnesio y se centrifuga a 500 g durante 10 minutos en un tubo de centrífuga de
50 ml. Se elimina el sobrenadante resultante mediante succión y los eritrocitos se suspenden en PBS y se
vuelven a centrifugar. Este proceso de lavado se repite al menos dos veces hasta que el sobrenadante resulte
claro. Los eritrocitos de cada especie se combinan añadiendo 0.1 ml de cada tipo de células sanguíneas
empaquetadas a 100 ml de PBS. Los eritrocitos de las diferentes especies pueden mantenerse separados o
combinados, según se desee. A cada frasco se añade 5 ml de la suspensión de eritrocitos y se incuban los
frascos a 4ºC durante 30 minutos. Las monocapas se lavan dos veces con PBS y se examinan para
hemadsorción. Si no se observa hemadsorción, se añaden 5 ml de la suspensión de eritrocitos a cada frasco, se
incuban de nuevo a 20-25ºC por 30 minutos, se lavan como antes, y se vuelven a examinar para hemadsorción.
Si se desea, se pueden usar frascos distintos para cada temperatura. Las monocapas se examinan para
presencia de hemadsorción tanto de manera aproximada (usando un transiluminador encendido) como
microscópicamente. Es importante comparar las monocapas no inoculadas con las monocapas de la prueba para
detectar la existencia de hemadsorción no específica que puede ocurrir con algunos tipos celulares. El uso de
PBS libre de calcio y magnesio y de eritrocitos frescos debería evitar, en gran medida, la existencia de
hemadsorción no específica. Si se detecta hemadsorción específica atribuible a un virus contaminante, el
material ensayado debería ser considerado no satisfactorio.
Las pruebas para detectar virus contaminantes con anticuerpos fluorescentes usan por lo general monocapas de
segunda resiembra de cultivos celulares inoculados con el material ensayado y cultivos celulares no inoculados.
Las monocapas se disponen normalmente en portaobjetos de cultivos celulares con ocho cámaras. Para cada
conjugado antivírico se prepara un porta como control positivo (formado por ocho monocapas) inoculando cada
monocapa con aproximadamente 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo del tejido) del virus apropiado.
Se tiñen tres grupos de monocapas con cada conjugado antivírico. Estos son, Grupo 1 - la segunda resiembra de
los cultivos celulares inoculados con el material que está siendo ensayado; Grupo 2 - la segunda resiembra de
los cultivos celulares no inoculados; y Grupo 3 - la segunda resiembra de los cultivos celulares no inoculados
(para producción de cultivos celulares como control positivo). A la hora de teñir, se eliminan los pocillos de
plástico de los portas, dejando la junta de goma unida al porta. Los portas se lavan con PBS de Dulbecco, se
fijan a 4ºC con acetona por al menos 10 minutos, y se secan. Sobre cada pocillo de un porta de los Grupos 1,2, y
sobre el porta correspondiente al control positivo del Grupo 3, se deposita aproximadamente 0.1 ml de cada
conjugado. Los portas se incuban luego a 37ºC en una cámara con humedad por 30 minutos, se lavan una vez
con PBS de Dulbecco, y se colocan en un contenedor con PBS de Dulbecco durante 10 minutos. Los portas se
lavan cuidadosamente con agua desionizada y se secan. Se examinan todos los portas en cuanto a
fluorescencia atribuible a cada virus específico. Se comparan los tres portas de cada grupo con el mismo
conjugado. Si el porta que contiene las células inoculadas con el material ensayado muestra alguna evidencia de
fluorescencia vírica específica, el MSV se considerará como no satisfactorio.
•
Agradecimiento
Algunas partes de este capítulo tienen su origen o están basadas en el capítulo sobre Pruebas para esterilidad y
ausencia de contaminación en materiales biológicos de la edición anterior del Manual de animales terrestres.
REFERENCIAS
1.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2003). Animals and Animal Products, Title 9, Parts 1-199. The Office of the
Federal Register, National Archives and Records Adminsitration. US Government Printing Office,
Washington DC, USA.
2.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Cuarta Edición. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France. ISBN 92-871-4587-3.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.5. — Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos
3.
EUROPEAN UNION (1999). The Rules Governing Medicinal Products in the European Union. Eudralex, Vols 49. Office Publications of the European Communities, Luxembourg.
4.
HARE W.C.D. (1985). Diseases transmissible by semen and embryo transfer techniques. OIE Technical
Seris No. 4. OIE, Paris, France. ISBN 92-9044-164-1.
5.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) (1998). WHO Expert Committee on Biological Standardization. World
Health Organization, Geneva, Switzerland. ISBN 92-4-120878-3.
LECTURAS ADICIONALES
Para más detalles sobre métodos y medios de cultivo, pueden consultarse los siguientes libros así como los
catálogos comerciales correspondientes.
A.
BARROW G.I. & FELTHAM R.K.A., eds. (1993). Cowan and Steel´s Manual for the Identification of Medical
Bacteria, Tercera Edición. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
B.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2003) Subchapter E. Viruses, serums, toxins, and analogous products;
organisms and vectors. En: Code of Federal Regulation, Animals and Animal Products, Title 9, Parts 101124. The Office of the Federal Register, National Archives and Records Adminsitration. US Government
Printing Office, Washington DC, USA. 501-676.
C.
COLLINS C.H., LYNE P.M. & GRANGE J.M., eds. (1995). Collins and Lyne´s Microbiological Methods, Séptima
Edición. Butterworth Heinemann, Oxford, UK.
D.
MURRAY P.R., ed. (2003). Manual od Clinical Microbiology, Octava Edición. American Society for
Microbiology Press, Washington DC, USA.
*
* *
48
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO I.1.6.
SEGURIDAD HUMANA EN LOS LABORATORIOS
VETERINARIOS DE MICROBIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
El tipo de trabajo de laboratorio que se describe en este Manual debería realizarse en condiciones
de mínimo riesgo para la salud del personal. Esto supone una cuidadosa consideración de los
riesgos relacionados con cada procedimiento particular y la toma de las medidas adecuadas para
minimizar la posibilidad de enfermedad en humanos. Tal asunto es un tema complejo que solo
puede ser tratado de forma somera en un capítulo introductorio. Este capítulo se refiere casi
exclusivamente a los riesgos de los agentes infecciosos, pero también deben evitarse en el
laboratorio de microbiología las lesiones físicas y químicas. Las probabilidades de infección se
reducen mediante buenas técnicas de laboratorio y equipamientos seguros, que ayudan a
controlar los patógenos. Es importante destacar que el control de los patógenos cumple dos
objetivos. Uno es evitar la enfermedad en humanos, y el otro evitar la enfermedad en los
animales. Con frecuencia, se usan los mismos métodos de control para evitar la adquisición de
infecciones en humanos en el laboratorio y para impedir la diseminación de patógenos que
podrían causar un brote de enfermedad en los animales. Pese a que los métodos, técnicas e
instalaciones que se necesitan pueden ser las mismas, la lista de patógenos y su ordenación en
cuanto a niveles de riesgo puede diferir en función de si el objetivo fundamental es controlar una
enfermedad en humanos o en animales.
Los laboratorios nacionales e internacionales de referencia existentes tienen una experiencia
considerable en la práctica del trabajo seguro y en el suministro de instalaciones apropiadas.
Cuando se establezcan laboratorios nuevos, resultaría prudente pedir consejo a las autoridades
competentes en los institutos ya establecidos. Es importante cumplir con las normas legislativas.
A. DETERMINACIÓN DE RIESGOS DE LOS PATÓGENOS
En primer lugar, es necesario determinar el riesgo de un patógeno, de modo que pueda asignarse a un grupo de
riesgo. El trabajo con dicho patógeno puede relacionarse luego con una categoría de contención apropiada.
Para determinar el riesgo que plantea un patógeno particular para el hombre es necesario conocer si la
infección con dicho organismo puede provocar la muerte, una enfermedad, o molestias a la gente que lo
manipula, y además si es susceptible de fácil diseminación de modo que pueda causar enfermedad a la
población en general. (Existen aspectos adicionales que hay que considerar respecto a la contención de los
patógenos animales y a la prevención de la extensión de sus infecciones, lo que constituye un tema separado,
aunque relacionado. Puede encontrarse información al respecto en el Código Sanitario de Animales Terrestres
de la OIE, capítulo 1.4.6, que por comodidad se reproduce al final de este capítulo como Apéndice 1). Para
determinar el riesgo hay que saber aspectos epidemiológicos del organismo y también propiedades suyas tales
como infectividad para los humanos, estabilidad en el medio, capacidad de infectar por diferentes rutas, y su
sensibilidad a tratamientos específicos o profilaxis (1, 2, 5, 6). Es relativamente sencillo disponer de esta
información cuando se trabaja con un patógeno conocido, pero el problema es mucho mas complicado cuando
un laboratorio de diagnóstico recibe material clínico que puede estar infectado con diversos patógenos
desconocidos, algunos de los cuales pueden ser extremadamente peligrosos para la salud humana. Algunos de
los aspectos a tener en cuenta cuando se evalúa el riesgo son:
1.
Existencia conocida de infección humana por el organismo, o por organismos relacionados con
características similares, cualquier historia que lo relacione con una infección adquirida en laboratorio,
dosis infectiva y gravedad de la enfermedad; producción de toxinas o sustancias alergénicas.
2.
El volumen del cultivo que se maneja y la concentración del organismo que esta probablemente presente.
(Algunos procedimientos como la producción de antígenos o vacunas, que requieren grandes cantidades
de organismos, tienen normalmente mas riesgo que las técnicas que intentan el aislamiento del
organismo).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
49
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
3.
El origen de la muestra, ya que, por ejemplo, muestras procedentes de animales salvajes es probable que
contengan patógenos humanos del tipo de los no encontrados normalmente.
4.
La historia del aislamiento que se está procesando. Los patógenos en aislamiento primario o durante los
pases iniciales en cultivo son a menudo más peligrosos que los patógenos con un nivel de pases en cultivo
mas elevado. En algunos casos, en cambio, la patogenicidad puede aumentar por pases o subcultivos en
diferentes medios nutritivos.
5.
La posibilidad de formación de aerosoles debe ser tenida especialmente en cuenta cuando se manejan
muestras líquidas o, por ejemplo, durante fases de trituración, homogenización o centrifugación.
6.
La amenaza que el organismo pueda representar en animales de consumo o de compañía o para la vida
salvaje, independientemente de la que represente para el personal del laboratorio. Se necesitan
precauciones adicionales para el manejo y el almacenamiento de agentes transmisores de enfermedades
animales que provengan del extranjero.
7.
El estado físico de los empleados. Por ejemplo, en el caso de embarazo, inmunodeficiencia o alergia,
pueden requerirse precauciones especiales. En ocasiones, se tienen que excluir algunos individuos de
algunos tipos particulares de trabajo que puedan resultar especialmente peligrosos para ellos.
8.
Se puede producir un elevado nivel de riesgo cuando algunos agentes, como Brucella o Mycobacterium, se
inoculan en animales. A fin de evaluar tal inoculación, debería valorarse el riesgo que entraña y tener en
cuenta los siguientes factores:
a) La especie hospedadora en contraposición a la especie inoculada.
b) La cepa/tratamiento y la concentración del inóculo.
c) La ruta de la inoculación.
d) El tipo de alojamiento de los animales.
e) Tipos de recolección de muestras.
B. AGRUPACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
Las consideraciones anteriormente expuestas se han tenido en cuenta por varias autoridades nacionales para
agrupar los microorganismos en cuatro grupos de riesgo (2,3) que representan una clasificación en función del
peligro creciente para la salud humana. Esta clasificación no considera que haya gente particularmente
susceptible, debido, por ejemplo, a una enfermedad previa, a un sistema inmune deprimido o a un embarazo.
Los cuatro grupos pueden resumirse del siguiente modo:
Grupo 1- Organismos que no es probable que ocasionen enfermedad en humanos.
Grupo 2- Organismos que pueden causar enfermedad pero que son incapaces de dispersarse por la comunidad
y frente a los cuales se dispone de tratamientos eficaces y profilaxis.
Grupo 3- Organismos que originan enfermedad grave en humanos y que pueden extenderse por la comunidad
pero frente a los cuales hay tratamientos eficaces y profilaxis.
Grupo 4- Organismos que causan enfermedad grave en humanos y que pueden suponer un alto riesgo por su
extensión por la comunidad, frente a los cuales no existe ni tratamiento adecuado ni profilaxis.
A los agentes productores de enfermedades animales que están bajo el control de las autoridades veterinarias
se aplican principios adicionales, siendo necesario evitar su difusión entre los animales domésticos o salvajes.
Estos aspectos se tratan en el Código Sanitario de Animales Terrestres de la OIE; el capítulo 1.4.6 del Código
trata de los grupos de contención y se presenta como apéndice del presente capítulo. Estas Normas de la OIE
son similares a las publicadas por la Unión Europea para la contención en laboratorio de los agentes que
afectan a los animales.
Los microorganismos infecciosos que pueden encontrarse en el trabajo de laboratorio se han incluido por las
autoridades de los diversos países en los Grupos de Riesgo del 1 al 4 (2, 4). Algunos ejemplos de los
patógenos peligrosos que pueden detectarse en los laboratorios veterinarios se indican en la Cuadro 1. La
encefalopatía espongiforme bovina ha sido situada por la Unión Europea en el grupo 3. Además, algunos
agentes muy peligrosos del grupo 4, como Hendra y Nipah, se han aislado de muestras para su utilización en
diagnóstico en laboratorios veterinarios.
50
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
Cuadro 1. Ejemplos de algunos microorganismos de los Grupos de Riesgo 2 y 3 capaces de causar enfermedades
humanas y que pueden encontrarse en un laboratorio veterinario
Grupo 2
Virus: Virus de influenza tipos A, B y C; virus de la enfermedad de Newcastle; virus Orf (parapoxvirus).
Bacterias: Alcaligenes spp.; Arizona spp.; Campylobacter spp.; Chlamydia psittaci (no aviar);Clostridium tetani;
Clostridium botulinum; Corynebacterium spp.; Erysipelothrix rhusiopathiae;Eschericihia coli; Haemophilus spp.;
Leptospira spp.; Listeria monocytogenes; Moraxella spp.;Mycobacterium avium; Pasteurella spp.; Proteus spp.;
Pseudomonas spp.; Salmonella spp.;
Hongos: Aspergillus fumigatus; Microsporum spp.; Trichophyton spp.
Grupo 3
Virus: Virus de la rabia; virus de la encefalomielitis equina (tipo Este, tipo Oeste, tipo Venezolano); virus de la
encefalitis japonesa B; virus de la encefalitis ovina.
Bacterias: Bacillus anthracis; Burkholderia mallei (Pseudomonas mallei); Brucella spp.; Chlamydia psittaci (solo
cepas aviares); Coxiella burnetti; Mycobacterium bovis.
C. REQUISITOS PARA TRABAJAR CON AGENTES INFECCIOSOS
A. Patógenos conocidos
Después de determinar el nivel de riesgo de un trabajo determinado, es posible decidir luego el “nivel de
contención” adecuado que se precisa para minimizar el riesgo de enfermedad en humanos. El nivel de
contención queda definido por la combinación de las instalaciones físicas y las prácticas de trabajo utilizadas.
Los organismos de los cuatro grupos de riesgo indicados anteriormente se pueden colocar en niveles de
contención apropiados para un trabajo seguro (ver más adelante). Con frecuencia, los laboratorios nombran un
oficial de seguridad responsable de asegurar que los microorganismos se manipulan en el nivel adecuado de
contención. Deben poseer la suficiente experiencia y edad como para supervisar y aconsejar todo lo relativo a
asuntos de seguridad. En grandes organizaciones que incluyan una red de laboratorios es adecuado nombrar
un oficial de seguridad central para coordinar los asuntos de seguridad de una manera corporativa, lo que es
luego aplicado en los laboratorios de cada sitio por los oficiales de seguridad locales. Los métodos de trabajo
para un procedimiento o estación de trabajo particular deben ser escritos y estar fácilmente disponibles. El
personal debe estar bien entrenado y enterado por completo de cualquier riesgo para la salud asociado con su
trabajo, así como de los procedimientos para informar de cualquier incidente o accidente. También se debería
suministrar al personal una tarjeta médica con indicación de los patógenos a los que puede estar expuesto. En
algunos casos, el personal puede ser vacunado de modo especial para suministrarle protección adicional, por
ejemplo, si trabaja con el virus de la rabia; esto también debería indicarse en la tarjeta médica. Tal información
resulta útil en la práctica médica en caso de que se presente una enfermedad. Se recomiendan los exámenes
médicos periódicos de los empleados y la realización de pruebas en aquellos que trabajan con organismos que
causan enfermedades graves en humanos, tales como brucelosis y tuberculosis.
Existe mucha información sobre contención de patógenos y se pueden construir sofisticados aparatos y edificios
enteros para controlar los organismos más peligrosos según requieran las directrices, estándares y regulaciones
de cada país. Las necesidades dependen de la contención requerida, desde el nivel más básico al más alto.
Requisitos esenciales de todos los trabajos. Las necesidades esenciales de cualquier trabajo con agentes
infecciosos, por muy inocuos que puedan ser, son las siguientes:
1.
El laboratorio debe ser fácil de limpiar, con superficies impermeables al agua y resistentes a agentes
químicos. Deben tener una pila de lavado de manos y una ducha de emergencia, incluyendo también un
lavador de ojos en cada laboratorio para los peligros de tipo químico y de otro tipo presentes.
2.
El acceso de personal al laboratorio debe ser restringido.
3.
En el laboratorio se debe de llevar puesta ropa adecuada de protección, incluyendo guantes, máscaras (o
mejor, respiradores) y gafas protectoras apropiadas, que debe uno quitarse cuando abandona el
laboratorio.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
51
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
4.
La puerta del laboratorio debe cerrarse cuando hay trabajo en curso y debe existir ventilación por
extracción del aire de la habitación. (Cuando se usan cabinas de bioseguridad se debe tener cuidado en
equilibrar los sistemas de ventilación).
5.
No se pueden guardar ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio.
6.
No se debe fumar o aplicarse cosméticos en el laboratorio.
7.
No se debe pipetear con la boca.
8.
Debe tenerse cuidado en reducir la producción de aerosoles.
9.
Deberían implementarse planes de respuesta de emergencia para el caso de derramamiento de materiales
de peligro biológico. Entre los elementos de ese plan deben figurar desinfectantes efectivos para limpiar
los vertidos, descarte y descontaminación de la ropa de protección contaminada, lavado de manos y
limpieza y desinfección de las mesas de trabajo.
10. El material de vidrio usado y cualquier otro material de laboratorio debe ser guardado con seguridad antes
de su desinfección. Los materiales de desecho deben transportarse sin vertido en contenedores fuertes. La
basura debe ser esterilizada en autoclave, incinerada o convertida en material seguro antes de su
evacuación. El material reutilizable debe ser descontaminado por medios adecuados.
11. Nunca se eliminará material infeccioso por las pilas de laboratorio ni ningún otro tipo de escape similar.
12. Cualquier incidente o accidente debe ser registrado y comunicado al Oficial de Seguridad.
En el nivel de contención de patógenos del Grupo 2 (ver Apéndice 1), además de los puntos indicados
anteriormente, se deben de utilizar cabinas microbiológicas de seguridad que pueden ser usadas con modo de
apertura frontal (cabinas de Clase I). También se pueden usar cabinas de clase II cuando exista la posibilidad
de que se generen aerosoles o cuando se manejen grandes cantidades de cultivo o exista una necesidad real
de proteger el producto biológico (ver sección D). Es necesaria la colocación de señales en las puertas de
entrada para indicar el peligro existente y el nombre y número de teléfono de las personas responsables.
Deberían colocarse dentro del laboratorio indicaciones de emergencia para advertir al personal sobre los
procedimientos a seguir en caso de vertidos del patógeno o cuando exista la necesidad de evacuar el
laboratorio debido a un fuego o a otra emergencia.
En el nivel de contención de patógenos del Grupo 3 (ver Apéndice 1), es aconsejable que el laboratorio esté
situado de modo aislado y restringir la entrada a personal con cualificación de nivel 3. Se necesita una
adecuada señalización en todas las puertas de entrada, indicando los peligros presentes y el nombre y número
de teléfono de la persona o personas responsables. Dentro del laboratorio deben colocarse indicaciones de
emergencia señalando al personal los procedimientos a seguir en caso de vertidos del patógeno o ante la
necesidad de evacuar el laboratorio por fuego. El nivel 3 de contención de la OIE rebasa las directrices de
bioseguridad 3 (BSL-3) delineadas por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos
(DHHS) (15) y del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (14).
Además de las exigencias anteriores, el laboratorio debe estar bajo presión negativa y los diferenciales de
presión deben vigilarse; debe desarrollarse un procedimiento que de la alarma en caso de un problema. Se
necesita un sistema de ventilación que extraiga el aire del laboratorio mediante un filtro de aire particulado de
alta eficacia (filtros HEPA). Los filtros HEPA deben ser revisados regularmente (usualmente anualmente); esto
incluye los filtros HEPA en los gabinetes de bioseguridad y en los ductos de salida de las habitaciones y equipo.
El laboratorio debe poder ser cerrado por completo para fumigación y contener una entrada con bloqueo de aire.
Existe la necesidad de tratar los líquidos efluentes en función del patógeno. Deben estar disponibles cabinas de
clase I, II o III (13). El laboratorio debería estar bajo presión negativa respecto a zonas circundantes donde se
realiza trabajo menos peligroso. Además, puede ser necesario que el personal se duche a la salida del
laboratorio y que dicho personal vista ropa especial de laboratorio que se deja en el mismo cuando se abandona
el edificio.
Nota. Debido a la relación entre la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) y la nueva variante de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, el agente productor de la BSE y otros agentes relacionados se
clasifican en el Grupo 3 de riesgo. Por tanto, los veterinarios y trabajadores de laboratorio que lleven a cabo
necropsias de animales sospechosos de BSE o que manejen tejidos procedentes de tales animales deben
realizar su trabajo bajo condiciones estrictas de contención adecuada, a veces con las limitaciones impuestas
por la naturaleza del trabajo y los resultados de la valoración del riesgo local. Resulta importante que se vista
ropa adecuada y que se siga un código práctico estricto para evitar contacto con el patógeno. Los laboratorios
que realizan trabajos con BSE deben cumplir las normativas nacionales sobre biocontención y bioseguridad.
52
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
En el nivel de contención de patógenos del Grupo 4 (ver Apéndice 1), se exigen las precauciones más
estrictas, incluyendo un sistema de acceso al edificio a través de compartimentos estancos y el mantenimiento
del edificio bajo presión negativa. El aire que penetra en el laboratorio debe ser filtrado a través de un filtro
HEPA sencillo, y el aire extraído a través de un filtro HEPA doble. Todo el trabajo realizado con material infectivo
debe hacerse en cabinas de tipo II o III conjuntamente con el uso de trajes personales de trabajo de presión
positiva. Todas las aguas residuales del laboratorio, los efluentes normales y los de salida del autoclave, deben
tratarse por medios adecuados para asegurar la destrucción de todo material infeccioso antes de que alcance el
sistema público de alcantarillado. El personal debe tomar una ducha y cambiarse de ropa antes de salir del
edificio. También son aplicables otras precauciones descritas para el Grupo 3. En la actualidad, el uso de trajes
de una pieza con presión positiva es una norma internacionalmente aceptada para lograr una contención de
nivel 4.
Las directrices de la OIE para el nivel de contención de los patógenos del Grupo 4 son, en general, iguales a las
directrices Ag. para el nivel 3 de bioseguridad de USDA (14). La diferencia entre una y otra es que en la
segunda se especifica que el laboratorio debe ser hermético y debe superar una prueba de diferencial de
presión para asegurarse de que no sobrepasa la cantidad máxima de escape prescrita.
B.
Muestras para diagnóstico
Los centros de diagnóstico veterinario reciben muestras que son enviadas porque se sospecha la presencia de
una variedad de enfermedades. La naturaleza infecciosa de las muestras es normalmente desconocida, pero
potencialmente presentan agentes biológicos que pueden ocasionar enfermedad en el hombre y los animales.
Se requiere seguir prácticas y procedimientos que disminuyan al mínimo el riesgo de la exposición ocupacional
de los trabajadores a tales patógenos. A menos que se sospeche que contienen un patógeno que requiera un
nivel de contención más elevado, es recomendable que el procesamiento inicial de todas las muestras
desconocidas se realice como si el material contuviera un patógeno del Grupo 2. Los aspectos más importantes
son aquellos que evitan la exposición percutánea y la de las membranas mucosas. Las cabinas de seguridad
biológica deben usarse en todas las manipulaciones que puedan generar aerosoles. Las de clase I y II son
adecuadas, en función de la necesidad de protección de las muestras de contaminación. Además, no se debe
realizar el pipeteo con la boca, se debe llevar puesta ropa protectora y, en algunos casos, protección respiratoria
y para los ojos, dependiendo del nivel previsto de exposición. Aunque las etapas iniciales del diagnóstico se
pueden realizar en el nivel 2, toda vez que se aísle un organismo del Grupo 3 (o que se sospeche su presencia),
el trabajo ulterior se debe llevar a cabo en el régimen superior de contención.
D. CABINAS DE SEGURIDAD MICROBIOLÓGICA
Se utilizan para los diferentes niveles de contención, según se describe en la anterior sección C.A. Son de tres
tipos:
Clase I: cabinas de apertura frontal diseñadas de modo especial para suministrar protección al operador y sin
proteger el producto.
Clase II: cabinas de apertura frontal, a veces llamadas cabinas de flujo laminar recirculante. Están destinadas
fundamentalmente a dar protección al producto, pero también protegen al operador.
Clase III: cabinas cerradas, con acceso frontal mediante guantes, que proporcionan el mayor grado de
contención mediante separación completa del trabajador y del trabajo realizado. Algunas cabinas tienen
extraíble la parte frontal con los guantes y se conocen como cabinas de clase III/I, es decir, se pueden utilizar de
ambos modos.
Se han publicado descripciones de cabinas de seguridad y de prácticas operativas de seguridad (8, 10, 16).
E. ALMACENAMIENTO DE PATÓGENOS
El almacenamiento de patógenos vivos requiere contención y seguridad adecuadas para evitar los riesgos
derivados de fugas por el uso no autorizado de material. El equipamiento en que se mantienen debe ser
marcado como corresponde, indicando la naturaleza del patógeno (es decir, su grupo) y la persona o personas
responsables de tal equipamiento. Debe mantenerse un completo inventario, actualizado y disponible, acerca de
los patógenos almacenados. Se debe tener un cuidado particular cuando se abran los viales de vidrio de
patógenos liofilizados, ya que se fragmentan con frecuencia. Igualmente hay que tener cuidado cuando se
trabaja con nitrógeno líquido.
Muchas de las explicaciones dadas arriba no son solo de aplicación para la seguridad humana sino que también
son aplicables para evitar la extensión de la infección a los animales. En un laboratorio veterinario, el eliminar
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
riesgos de escape de patógenos hacia animales salvajes o domésticos de la comunidad es una importante
responsabilidad. Debe mantenerse una estrecha comunicación con las autoridades veterinarias. Para trabajar
con algunos microorganismos, se requiere disponer de licencias especiales.
F. RIESGOS QUÍMICOS Y FÍSICOS
El trabajo de laboratorio incluye muchas manipulaciones que son potencialmente peligrosas, como el manejo de
material de vidrio, el uso de agujas y otros instrumentos cortantes. Deben de existir dispositivos especiales para
desechar adecuadamente las agujas y otro instrumental cortante.
El personal de laboratorio corre el riesgo de sufrir quemaduras por sólidos o líquidos calientes. Los autoclaves
deben de estar equipados con mecanismos de seguridad para evitar su apertura accidental cuando funcionan a
presión y sometidos a servicios de mantenimiento y pruebas regulares. Deben suministrarse guantes de
protección frente al calor. El frío extremo puede suponer también un riesgo, por ejemplo cuando se trabaja con
nitrógeno líquido; las salpicaduras sobre la piel no protegida pueden ser muy peligrosas. Se deben de utilizar
guantes que permitan aislamiento del frío y que sean resistentes al agua para evitar la penetración del nitrógeno
líquido. Se debe también llevar máscara para la cara y botas cuando se trabaja con nitrógeno líquido.
La radiación es un riesgo serio para la salud que puede estar presente debido al uso de aparatos de rayos X, o
al empleo de emisores de rayos gamma u otras fuentes. Tales equipos deben estar sometidos a mantenimiento
y a pruebas periódicas. Todo uso de material radioactivo ha de ser meticulosamente anotado. Todo el personal
debe disponer de un dispositivo de control de radiación y pasar controles sanitarios anuales. Deben tenerse en
cuenta las regulaciones locales y nacionales al respecto (10).
En los laboratorios veterinarios se emplea una amplia gama de compuestos químicos, muchos de los cuales
pueden ser tóxicos o mutagénicos, y algunos incluso carcinogénicos. Debería recordarse que es la dosis la que
determina el peligro (por ejemplo, en cantidades suficientes, incluso una sustancia “inocua” puede llegar a ser
tóxica). Los vapores son especialmente peligrosos, y algunas sustancias se pueden absorber por penetración a
través de la piel intacta. Siempre deben tomarse suficientes precauciones para proteger a trabajadoras
embarazadas. Debe disponerse de una lista de sustancias químicas peligrosas y de un archivo de sustancias a
las que puede estar expuesto el personal del laboratorio. Esto constituye en la actualidad normativa legal en
muchos países. Las sustancias químicas deben guardarse en contenedores apropiados y a la temperatura
debida. Aquellas que sean muy inflamables deben mantenerse en armarios a prueba de fuego. Debe llevarse un
inventario de compras y de uso del material químico peligroso que indique cuánto se ha usado, cuándo, por
quién, y con qué fines. La eliminación de sustancias químicas está regulada oficialmente.
Se puede obtener más información sobre precauciones de seguridad frente a agentes físicos y químicos en la
literatura sobre el tema (10, 11).
G. INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE ANIMALES
El trabajo con patógenos en animales de laboratorio tiene riesgos especiales (ver Apéndice 1). Los habitáculos
para los animales deben estar construidos teniendo en cuenta los estándares y niveles de contención
apropiados, como en el caso de los propios laboratorios. La contención en estos habitáculos es muy importante
porque pueden generarse en ellos una gran cantidad de agentes infecciosos. Consideraciones similares son
también de aplicación en cuanto al entrenamiento del personal, ropa de protección e inventario de
procedimientos de trabajo. Debe tomarse especial cuidado en evitar daños al personal, por ejemplo a través de
mordeduras o coces por parte de los animales. Cualquier incidente de ese tipo debe ser documentado y las
heridas curadas adecuadamente. Deben existir equipos de incineración o eliminación de cadáveres y sistemas
que hagan posible una cuidadosa limpieza y desinfección de los habitáculos animales. Estos recintos deberían
suministrar al animal no solamente un ambiente adecuado sino que deberían construirse y ventilarse de tal
modo que se asegure una determinada comodidad para el personal que los atiende. Este es un tema muy
amplio que solo puede tratarse aquí de forma breve (4, 7). Recientemente se ha publicado un libro excelente
sobre salud y seguridad en el equipamiento de laboratorios animales (17).
H. DISPOSITIVOS DE EMERGENCIA
En las proximidades de toda estación de trabajo debe existir un equipo de primeros auxilios; pero debe
guardarse un lugar que no pueda ser contaminado por el trabajo de laboratorio (p. Ej. en una cámara de aire o
en una antesala). Este equipo debe estar en relación con el tipo de trabajo, y tiene que ser mantenido limpio y
sujeto a un adecuado mantenimiento. Debe estar dispuesto y disponible para usos inmediatos de emergencia y
contener vendas, ropas y medicinas usuales. Parte del personal debería recibir entrenamiento en
54
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
procedimientos de seguridad y primeros auxilios por parte de autoridades reconocidas y estar en posesión de un
certificado válido que evidencie su competencia. Sus nombres y localización deben ser conocidos por todos y
figurar en los tablones de anuncios. Todo el personal de plantilla debe ser consciente de la importancia de la
seguridad. Deben considerarse procedimientos apropiados y equipos para tratar casos de vertidos y
descontaminaciones. Además, debe mantenerse un registro de todos los accidentes.
Deben existir por escrito procedimientos a seguir en caso de emergencia debida al fallo de los sistemas de aire,
por ejemplo, en cabinas de bioseguridad o habitaciones de biocontención que pueden originar una pérdida de
contención.
Muchos laboratorios disponen en plantilla de un comité de seguridad para desarrollar la comprensión del
concepto de seguridad por parte del personal y para comentar temas relacionados con la dirección. Los
directores son responsables de la seguridad en cada una de sus áreas de competencia, y no deberían permitir
que asuntos tales como la rapidez o los costes del trabajo primaran sobre la seguridad de los trabajadores.
Por si fuera necesario, debería existir un procedimiento de emergencia para disponer de asistencia médica así
como de hospitalización cuando ello se requiriese. Las alarmas de fuego deben estar en funcionamiento, y
sometidas a pruebas con regularidad. Cada unidad debería nombrar a un bombero para dirigir ejercicios
periódicos con el fin de hacer conocer al personal qué hacer y donde reunirse en caso de un incendio. El
bombero es el responsable de comprobar que todas las personas abandonan el edificio. La existencia de
normas para el caso de existir otros desastres naturales, como huracanes y terremotos, es también pertinente
cuando representen un riesgo. Todas estas directrices deben ser indicadas por escrito y revisadas
periódicamente.
I. TRANSPORTE DE MATERIAL INFECCIOSO
Se debe tomar una precaución especial en la preparación y embalaje de muestras diagnósticas que se van a
transportar, para asegurarse de que no hay roturas de los recipientes ni derrames de contenido que pudieran
suponer un riesgo para los trabajadores de correos, transportistas o personal del laboratorio que lleva a cabo la
recepción (ver Capítulo I.1.1. Métodos de muestreo). Deben seguirse las normas locales, nacionales e
internacionales sobre el transporte de materiales peligrosos y sobre la importación de patógenos.
J. CONCLUSIONES
Una de las prioridades más importantes del laboratorio es disponer de altas cualificaciones de seguridad que
aseguren unas condiciones sanas de trabajo a toda la plantilla del personal. Esto solo puede lograrse después
de un cuidadoso estudio de los principios que conlleva y mediante su aplicación práctica en los edificios,
equipos, procedimientos operativos e higiene. El entrenamiento de todo el personal del laboratorio es una
cuestión clave, y ninguna persona debería estar autorizada a trabajar hasta haberlo completado de forma
documentada. Existe una literatura muy amplia sobre todos y cada uno de los aspectos de este tema, y se
recomienda su ulterior lectura (6, 9, 13, 14, 15).
REFERENCIAS
1.
ACHA P.N. & SZYFRES B. (1987). Zoonoses and Communicable Diseases Common to Man and Animals,
Second Edition. Pan American Health Organisation, Scientific Publication No. 503. PAHO, Washington DC,
USA.
2.
ADVISORY COMMITTEE ON DANGEROUS PATHOGENS (1995). Categorisation of Biological Agents According to
Hazard and Categories of Containment, Fourth Edition. Health and Safety Executive Books, P.O. Box 1999,
Sudbury, Suffolk, CO10 6FS, UK. ISBN 0-7176-1038-1.
3.
BARBEITO M.S., ABRAHAM G., BEST M., CAIRNS P., LANGEVIN P., STERRITT W.G., BARR D., MEULEPAS W.,
SANCHEZ-VIZCAINO J.M., SARAZA M., REQUENA E., COLLADO M., MANI P., BREEZE R., BRUNNER H., MEBUS C.A.,
MORGAN R.L., RUSK S., SIEGFRIED L.M. & THOMPSON L.H. (1995). Recommended biocontainment features for
research and diagnostic facilities where animal pathogens are used. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 14,
873887.
4.
BELL J.C., PALMER S.R. & PAYNE J.M. (1988). The Zoonoses. Edward Arnold, London, UK.
5.
BERAN G.W. & STEELE J.H. (eds) (1994). Handbook of Zoonoses, Second Edition. Section A. (Bacterial,
Rickettsial, Chlamydial and Mycotic Zoonoses) and Section B (Viral Zoonoses), CRC Press, USA.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
55
Capítulo I.1.6. — Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología
6.
CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY (1996). Containment Standards for Veterinary Facilities, Best M., ed.
Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Ontario, Canada.
7.
COLLINS C.H. (1990). Health hazards in microbiology. In: Handbook of Laboratory Health and Safety
Measures, Pal S.B., ed. Kluwer Academic Publications, Dordrecht, The Netherlands, 159188.
8.
INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY (IAEA) (1994). International Basic Safety Standards for Protection
against Ionizing Radiation and for the Safety of Radiation Sources, Interim Edition. Safety Series No. 115-I.
IAEA, Vienna, Austria.
9.
OFFICE OF BIOSAFETY, LABORATORY CENTRE FOR DISEASE CONTROL, HEALTH AND W ELFARE CANADA (1996).
Laboratory Biosafety Guidelines, Second Edition. Ministry of Supply and Services Canada, Cat. No. MR 212/1996.
10. RAYBURN S.R. (1990). The Foundations of Laboratory Safety (a Guide for the Biomedical Laboratory).
Springer-Verlag, New York, USA.
11. SEWELL D.L. (1995). Laboratory associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Rev., 8, 389405.
12. US DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTRES FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION AND
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (1999). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth
Edition. Catalogue number 017-040-00547-4. United States Government Printing Office, Washington DC,
USA.
13. U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, PUBLIC HEALTH SERVICE, CENTERS FOR DISEASE CONTROL
AND PREVENTION, AND NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (2000). Primary Containment for Biohazards: Selection,
Installation and Use of Biological Safety Cabinets, Second Edition. United States Government Printing
Office, Washington DC, USA.
14. W OOD M. & SMITH M.W. (EDS) (1999). Health and Safety in Laboratory Animal Facilities. Royal Society of
Medicine Press, London, UK, pp. 249.
15. US DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTRES FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION AND
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (1999). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth
Edition. Catalogue number 017-040-00547-4. United States Government Printing Office, Washington DC,
USA.
16. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and
Prevention, and National Institutes of Health (2000). Primary Containment for Biohazards: Selection,
Installation and Use of Biological Safety Cabinets, Second Edition. United States Government Printing
Office, Washington DC, USA.
17. W OOD M. & SMITH M.W. (EDS) (1999). Health and Safety in Laboratory Animal Facilities. Royal Society of
Medicine Press, London, UK, pp. 249.
56
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
APÉNDICE I.1.6.1
TRANSPORTE INTERNACIONAL Y CONTENCIÓN
DE AGENTES PATÓGENOS DE ORIGEN ANIMAL
EN EL LABORATORIO1
A. OBJETIVO
Prevenir la introducción y propagación de enfermedades animales causadas por agentes patógenos.
B. INTRODUCCIÓN
1.
La introducción de una enfermedad infecciosa, de un agente patógeno de origen animal o de una cepa
nueva de agente patógeno de origen animal en un país libre de ellos hasta entonces puede tener
consecuencias muy graves, en la medida en que puede perjudicar en mayor o menor grado la salud
animal, la salud pública, la economía agropecuaria y el comercio. Para evitar que el comercio internacional
de animales vivos y productos de origen animal sea causa de esa introducción, los países deberán prever
una serie de medidas que impongan, por ejemplo, las pruebas veterinarias y la cuarentena antes de la
importación.
2.
No obstante, existe también el riesgo de que una enfermedad aparezca como consecuencia de la
liberación accidental de agentes patógenos por laboratorios que los utilizan con distintos fines, como por
ejemplo la investigación, el establecimiento de diagnósticos o la elaboración de vacunas. Esos agentes
patógenos pueden existir ya en el país o haber sido importados voluntaria o involuntariamente. Por
consiguiente, es imprescindible disponer de medidas para evitar su liberación accidental. Las medidas
pueden aplicarse en las fronteras nacionales, mediante la prohibición o el control de las importaciones de
determinados agentes patógenos o de sus portadores (véase el Artículo 1.4.6.7.), o en el territorio
nacional, mediante la especificación de las condiciones que deben respetar los laboratorios para
manipularlos. En la práctica se combinarán probablemente los controles internos y externos, en función del
riesgo que suponga para la salud animal el agente patógeno considerado.
C. PROPÓSITO
1.
Hacer recomendaciones sobre la contención en laboratorios de agentes patógenos de origen animal en
función del riesgo que suponen para la salud animal y la economía agropecuaria de un país, sobre todo
cuando la enfermedad que causan no es enzoótica.
2.
Hacer recomendaciones sobre las condiciones de importación de agentes patógenos de origen animal.
3.
Si los agentes patógenos de origen animal suponen también un riesgo para la salud pública, las
recomendaciones relativas a su contención en los laboratorios se hallarán en el Manual Terrestre y en los
demás documentos pertinentes publicados.
D. CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES PATÓGENOS DE ORIGEN ANIMAL
1.
1
Los agentes patógenos de origen animal serán clasificados por categorías, en función del riesgo que
suponen para la salud animal, si son introducidos en un país o liberados accidentalmente por un
laboratorio. Al proceder a la clasificación de los agentes patógenos en cuatro categorías, según el grado
de contención que requieren, se tendrán en cuenta los siguientes factores: patogenicidad del agente
considerado, riesgos biológicos que representa, capacidad de propagación, aspectos económicos y
disponibilidad de tratamientos profilácticos y terapéuticos.
Este Apéndice está tomado del Capítulo 1.4.6 del Código internacional de sanidad animal de la OIE, 2001.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
57
Apéndice I.1.6.1.— Transporte internacional y contención de agentes patógenos
de origen animal en el laboratorio
2.
Algunos agentes patógenos necesitan ser transmitidos por determinados vectores o terminar sus fases de
desarrollo en huéspedes intermediarios antes de infectar a los animales y provocar una enfermedad. En
los países en que esos vectores o esos huéspedes intermediarios no existen o en que las condiciones
climáticas o ambientales no propician su supervivencia, esos agentes patógenos suponen menor riesgo
para la salud animal que en los países en que esos vectores o esos huéspedes intermediarios viven
naturalmente o pueden sobrevivir.
3.
Al proceder a la clasificación de los agentes patógenos de origen animal en grupos particulares se tendrán
en cuenta los siguientes criterios:
a)
Agentes patógenos de origen animal del grupo 1
Organismos que causan enfermedades enzoóticas pero no están sujetos a control oficial.
b)
Agentes patógenos de origen animal del grupo 2
Organismos que causan enfermedades exóticas o enzoóticas, sujetos a control oficial y con escasa
posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
c)
i)
Su transmisión no depende de vectores ni de huéspedes intermediarios.
ii)
Su transmisión entre animales de especies distintas es muy limitada, incluso inexistente.
iii)
Su capacidad de propagación geográfica en caso de liberación accidental por un laboratorio es
limitada.
iv)
Su transmisión directa entre animales es relativamente limitada.
v)
La necesidad de aislar los animales enfermos o infectados es mínima.
vi)
Las consecuencias económicas y/o clínicas de la enfermedad son limitadas.
Agentes patógenos de origen animal del grupo 3
Organismos que causan enfermedades exóticas o enzoóticas, sujetos a control oficial y con
moderada posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
d)
i)
Su transmisión puede depender de vectores o de huéspedes intermediarios.
ii)
Su transmisión entre animales de especies distintas puede producirse fácilmente.
iii)
Su capacidad de propagación geográfica en caso de liberación accidental por un laboratorio es
moderada.
iv)
Su transmisión directa entre animales es relativamente fácil.
v)
El aislamiento reglamentario de los animales enfermos, infectados o que han estado en
contacto con animales afectados es imperativo.
vi)
Las consecuencias económicas y/o clínicas de la enfermedad son graves.
vii)
Los tratamientos profilácticos y/o terapéuticos son escasos o tienen efectos limitados.
Agentes patógenos de origen animal del grupo 4
Organismos que causan enfermedades exóticas o enzoóticas, sujetos a control oficial y con alta
posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
58
i)
Su transmisión puede depender de vectores o de huéspedes intermediarios.
ii)
Su transmisión entre animales de especies distintas puede producirse muy fácilmente.
iii)
Su capacidad de propagación geográfica en caso de liberación accidental por un laboratorio es
total.
iv)
Su transmisión directa entre animales se produce muy fácilmente.
v)
El aislamiento reglamentario de los animales enfermos, infectados o que han estado en
contacto con animales afectados es imperativo.
vi)
El control reglamentario de los movimientos de animales en un vasto perímetro es imperativo.
vii)
Las consecuencias económicas y/o clínicas de la enfermedad son sumamente graves.
viii)
No existe ningún tratamiento profiláctico y/o terapéutico satisfactorio.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Apéndice I.1.6.1.— Transporte internacional y contención de agentes patógenos
de origen animal en el laboratorio
E. NIVELES DE CONTENCIÓN
1.
El principal objetivo de la contención es evitar que un agente patógeno se escape de un laboratorio y se
propague a la población animal del país. Algunos agentes patógenos de origen animal pueden infectar a
las personas y, en ese caso, la protección de la salud pública puede exigir una contención superior a la
que se considera suficiente para proteger la salud de los animales.
2.
El nivel de contención física y los procedimientos y prácticas de seguridad biológica dependerán del grupo
en que haya sido clasificado el agente patógeno y los requisitos deberán ser los apropiados para el tipo de
organismo considerado (bacteria, virus, hongo o parásito, por ejemplo). Para los agentes patógenos del
grupo 1 se necesitará el nivel de contención más bajo y para los del grupo 4 el más alto. En el Cuadro 1 se
indican los requisitos de contención para los grupos 2, 3 y 4.
3.
Algunos artrópodos pueden ser agentes patógenos o vectores de agentes patógenos. Si son vectores de
un agente patógeno que se utiliza en el laboratorio se respetará el nivel de contención que requiere dicho
agente patógeno y se respetarán, además, las condiciones de contención que se aplican a los artrópodos.
Cuadro 1.Recomendaciones relativas a las condiciones que deben respetar los laboratorios
para los distintos grupos de contención
Grupo de contención
Condiciones aplicables a los laboratorio
2
3
4
1. Alejamiento de cualquier peligro de incendio
notorio
Sí
Sí
Sí
2. Separación entre el lugar de trabajo y las demás
actividades
Sí
Sí
Sí
3. Acceso limitado del personal
Sí
Sí
Sí
4. Protección contra incursiones de roedores e
insectos
Sí
Sí
Sí
Sí, bajo vigilancia
Sí, bajo vigilancia
Sí
Sí
Simple a la salida
Simple a la entrada,
doble a la salida
8. Sistema mecánico de entrada de aire con
dispositivo antiavería
Sí
Sí
9. Posibilidad de cierre hermético en caso de
fumigaciones
Sí
Sí
Accesible
Sí
Sí, en el sitio
11. Campana extractora de seguridad de clase 1/2/3
Sí
Sí
Sí
12. Acceso directo al autoclave
Sí
Sí, con puertas
dobles
Sí, con puertas
dobles
13. Conservación de agentes patógenos en el
laboratorio
Sí
Sí
Sí
Preferible
Sí
A) Localización y organización del laboratorio
5. Esterilización de los efluentes líquidos
6. Aislamiento por esclusa de aire. Ventilación
interna continua
7. Filtración de la entrada y salida de aire con filtros
HEPA o similares
10. Incinerador de cadáveres y desechos
B) Instalaciones del laboratorio
14. Depósito con contenedor doble (aguas residuales)
15. Ropa de protección prohibida fuera del laboratorio
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Sí
Sí
Sí
59
Apéndice I.1.6.1.— Transporte internacional y contención de agentes patógenos
de origen animal en el laboratorio
Cuadro 1. Recomendaciones relativas a las condiciones que deben respetar los laboratorios para los distintos
grupos de contención (cont.)
Grupo de contención
Condiciones aplicables a los laboratorio
2
3
4
Sí
16. Ducha obligatoria antes de salir del laboratorio
17. Designación de un responsable de la contención
Sí
Sí
Sí
18. Formación del personal en la observancia de las
reglas
Sí
Sí
Sí
19. Fijación de carteles relativos a la zona de
contención
Sí
Sí
Sí
20. Posibilidad de cerrar el laboratorio con llave
Sí
Sí
Sí
21. Entrada exclusiva del personal autorizado
Sí
Sí
Sí
22. A la entrada, cambio de toda la ropa de calle por
ropa limpia
Sí
Sí
23. A la salida, cambio de toda la ropa de laboratorio,
ducha y entrada al sector limpio
Sí
C) Reglamento del laboratorio
24. Ducha obligatoria de las personas antes de entrar
en el sector limpio
Sí
Sí
Sí
Sí
26. Notificación de las condiciones de embalaje de las
muestras antes de su envío al laboratorio
Sí
Sí
Sí
27. Apertura de los paquetes por personal
experimentado
Sí
Sí
Sí
28. Traslado de agentes patógenos de un laboratorio
autorizado a otro previa autorización únicamente
Sí
Sí
Sí
29. Manual de procedimientos normalizados de
manejo que cubra todos los aspectos
Sí
Sí
Sí
25. Declaración de todos los accidentes
D) Manipulación de muestras
F. POSESIÓN Y MANIPULACIÓN DE AGENTES PATÓGENOS
1.
60
Un laboratorio sólo estará autorizado a poseer y a manipular agentes patógenos de origen animal que
pertenezcan a los grupos 3 ó 4 si puede demostrar a la autoridad competente que está dotado de las
instalaciones de contención apropiadas para dichos grupos. No obstante, según las circunstancias
particulares de cada país, la autoridad competente podrá decidir que la posesión y la manipulación de
determinados agentes patógenos del grupo 2 también deben ser objeto de control. La autoridad
inspeccionará en primer lugar las instalaciones, para cerciorarse de su conformidad, y otorgará después
una licencia que especifique todas las condiciones pertinentes. Una de ellas será que el laboratorio lleve
un registro en debida forma e informe a la autoridad en caso de que sospeche que el material utilizado
contiene un agente patógeno que no está cubierto por la licencia. La autoridad visitará periódicamente el
laboratorio para asegurarse de que respeta las condiciones de la licencia, pero velará por que el personal
que efectúe la visita no tenga ningún contacto con animales susceptibles a los agentes patógenos
manipulados por el laboratorio durante un período determinado después de haber visitado el laboratorio,
período cuya duración dependerá del tipo de agente patógeno.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Apéndice I.1.6.1.— Transporte internacional y contención de agentes patógenos
de origen animal en el laboratorio
2.
Las licencias especificarán:
a)
las condiciones de transporte del agente patógeno y de eliminación de su embalaje;
b)
el nombre de la persona responsable del trabajo;
c)
si se va a utilizar el agente patógeno in vivo (y en ese caso, si en animales de laboratorio o en otros
animales) y/o solamente in vitro;
d)
las condiciones de eliminación del agente patógeno y de los animales utilizados para la
experimentación, una vez concluido el trabajo;
e)
las restricciones en materia de contactos del personal del laboratorio con animales susceptibles a los
agentes patógenos utilizados;
f)
las condiciones de traslado de agentes patógenos a otros laboratorios;
g)
las condiciones particulares relativas al nivel de contención apropiado y a los procedimientos y
prácticas de seguridad biológica.
G. IMPORTACIÓN DE AGENTES PATÓGENOS DE ORIGEN ANIMAL
1.
La importación de agentes patógenos de origen animal, de material patológico o de organismos portadores
de agentes patógenos estará supeditada a la concesión de una licencia de importación por la autoridad
competente. La licencia de importación especificará las condiciones pertinentes según el riesgo que
suponga el agente patógeno y, en caso de transporte aéreo, las normas pertinentes de la Asociación
Internacional de Transporte Aéreo en materia de embalaje y de transporte de sustancias peligrosas. La
licencia de importación de un agente patógeno de los grupos 2, 3 ó 4 se concederá únicamente a un
laboratorio autorizado expresamente a manipular ese agente patógeno, como se indica en el
Artículo 1.4.6.6.
2.
Al examinar las solicitudes de importación de material patológico, las autoridades tendrán en cuenta el tipo
de material, el animal del que proviene, la susceptibilidad de dicho animal a distintas enfermedades y la
situación zoosanitaria del país de origen. Podrá ser útil exigir un tratamiento del producto antes de la
importación para reducir al mínimo el riesgo de introducir inadvertidamente un agente patógeno.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
61
CAPÍTULO I.1.7.
PRINCIPIOS DE PRODUCCIÓN DE
VACUNAS VETERINARIAS
RESUMEN
La administración fiable de vacunas puras, inocuas, potentes y eficaces es imprescindible para el
mantenimiento de la salud animal y el funcionamiento satisfactorio de los programas de salud
animal. La inmunización de animales con vacunas de gran calidad es el principal medio de control
de muchas enfermedades animales. En otros casos, las vacunas se emplean conjuntamente con el
control nacional de enfermedades o los programas de erradicación.
Se pretende que los requisitos y procedimientos que se describen en este capítulo sean de
carácter general y consistentes con los estándares publicados de los que se dispone normalmente
como guía en la producción de vacunas veterinarias. El planteamiento para garantizar la calidad,
inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas veterinarias puede variar de un país a otro
dependiendo de las necesidades locales. Sin embargo, son imprescindibles estándares y controles
de producción adecuados para asegurar la disponibilidad de productos uniformes de gran calidad
para el uso en programas de salud animal.
Como la patogénesis y la epidemiología de cada enfermedad varía, el papel y la eficacia de la
vacunación como medio de control varía también de una enfermedad a otra. Algunas vacunas
pueden ser de gran eficacia, induciendo una inmunidad que no sólo previene los síntomas de la
enfermedad, sino también la infección y la replicación del agente causante de la enfermedad. Otras
vacunas pueden prevenir la enfermedad clínica, pero no la infección y/o el estado de desarrollo del
portador. En otros casos, la inmunización puede resultar completamente ineficaz o sólo reducir la
severidad de la enfermedad. De esta forma, la decisión de recomendar la vacunación como parte
de la estrategia de control de las enfermedades animales, requiere un conocimiento profundo de
las características del agente infeccioso y de su epidemiología, así como de las características y
posibilidades de las diferentes vacunas disponibles. Además, hay una preocupación pública
creciente por las implicaciones de la producción y uso de vacunas veterinarias para el bienestar
animal. En cualquier caso, si se utilizan vacunas, un rendimiento satisfactorio requiere que éstas
se fabriquen de forma que se garantice un producto uniforme y constante de gran calidad.
NOMENCLATURA
La nomenclatura para los productos biológicos veterinarios varía de un país a otro. Por ejemplo, en EE.UU el
término “vacuna” se utiliza para productos que contienen virus vivos o inactivados o protozoos, bacterias vivas o
ácidos nucleicos. Dependiendo del tipo de antígeno que contienen, los productos con bacterias muertas y otros
microorganismos se identifican como bacterinas, extractos bacterianos, subunidades, toxoides bacterianos o
toxoides. Por ejemplo, a los productos que contienen componentes antigénicos o inmunizantes de
microorganismos se les puede llamar “subunidades” o “extractos bacterianos”, y a los obtenidos a partir de la
inactivación de toxinas se les llama “toxoides”. En la Unión Europea (UE), los productos médicos veterinarios se
definen como “productos administrados a animales para producir inmunidad activa o pasiva o para diagnosticar
el estado de inmunidad; véase Directiva 90/677/CEE. Sin embargo, en este capítulo el término “vacuna” incluirá
todos los productos diseñados para estimular la inmunización activa de animales contra enfermedades, con
independencia del tipo de microorganismo o toxina microbiana que contengan o de los que éstos puedan
derivarse. Este uso es más coherente con la nomenclatura internacional. En esta revisión no se utilizará “vacuna”
con referencia a productos biológicos recomendados para la inmunización pasiva, inmunoestimulación,
tratamiento de alergias o diagnóstico.
62
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
TIPOS O FORMAS DE VACUNAS
Las vacunas se pueden preparar como productos vivos o inactivados (muertos). Algunas vacunas vivas se
preparan a partir de los aislados de campo de baja virulencia, atenuados, de un agente causante de una
enfermedad, que cuando se administran por vía no natural o bajo otras condiciones, en las que la exposición a
los microorganismos inmuniza en vez de causar la enfermedad, se ha descubierto que son inocuos y eficaces.
Otras vacunas vivas se preparan de los aislados de los agentes causantes de enfermedades que han sido
modificados mediante el pase por animales de laboratorio, medios de cultivo, cultivos celulares o embriones
aviares, para seleccionar un aislado de virulencia reducida. El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante
(ADNr ha proporcionado algunas oportunidades únicas para la producción de vacunas. En la actualidad, las
vacunas vivas modificadas se pueden producir de forma específica mediante la eliminación de los genes
relacionados con la virulencia en un microorganismo. Otras vacunas se producen por la introducción de genes
que codifican antígenos inmunizantes específicos, en un microorganismo vector no virulento, a partir de un
microorganismo causante de una enfermedad. Se están desarrollando vacunas mediadas por ácido nucleico que
contienen ADN plasmídico. Normalmente, el ácido nucleico se encuentra en forma de plásmido y codifica
antígenos inmunizantes a partir de microorganismos que causan enfermedades.
Los productos inactivados pueden contener: 1) Cultivos de microorganismos que han sido inactivados por
medios químicos u otros medios; 2) Toxinas inactivadas; o 3) Subunidades (partes antigénicas de
microorganismos) que se han extraído de cultivos o que se han producido mediante procedimientos de ADNr.
Tanto las vacunas vivas como las inactivadas se pueden formular con adyuvantes diseñados para aumentar su
eficacia. Los adyuvantes típicos son emulsiones de aceite en agua (simples o dobles), hechas con aceite mineral
o vegetal y un agente emulsionante. También se utilizan otros adyuvantes como el gel de hidróxido de aluminio.
GARANTÍA DE CALIDAD
La producción uniforme de vacunas de gran calidad, inocuas, potentes y eficaces requiere procedimientos de
garantía de calidad para asegurar la uniformidad y consistencia del proceso de producción. Puesto que los
procesos de producción de vacunas proporcionan una gran oportunidad para la variabilidad, se debe tener
cuidado en controlar ésta en la medida de lo posible, utilizando, preferiblemente, procedimientos validados, y
proteger el producto de la contaminación a lo largo de todas las etapas de producción.
Deben garantizarse la calidad, inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas mediante la consistencia durante el
proceso de producción. En cada etapa debe desarrollarse la calidad constante del producto (uniformidad entre
lotes). El análisis del producto final se utiliza como comprobación para verificar que los controles en los
procedimientos de producción se han mantenido intactos, y que el producto fabricado reúne la especificación
previamente acordada con la autoridad otorgante de la licencia.
Las autoridades reguladoras de los diferentes países han desarrollado planteamientos diferentes para asegurar
la calidad de las vacunas. Aunque parecidos en su objetivo final, estos sistemas pueden variar en la importancia
que se da al control del proceso de producción (estándares de proceso) en comparación con el control mediante
el análisis del producto final (estándares de eficacia). Los procedimientos de control seleccionados deben ser los
que mejor se ajusten a las condiciones bajo las que se estén produciendo las vacunas y deben, en la medida de
lo posible, cumplir con las prácticas correctas de fabricación.
Los estándares y procedimientos de control establecidos para un producto determinan el riesgo o la posibilidad
de producir y poner en el mercado un producto inútil, contaminado, peligroso o nocivo. El grado de riesgo
aceptable puede depender de los beneficios que se obtengan teniendo un producto disponible que evite las
muertes por enfermedad. De esta forma, los estándares pueden variar, de forma justificada, de un país a otro, o
de un producto a otro, dependiendo de las condiciones de sanidad animal a nivel local. Sin embargo, las
autoridades controladoras deben esforzarse por establecer estándares y procedimientos de control que
garanticen un producto acabado de la mejor calidad, inocuidad, potencia y eficacia posibles.
El sistema de garantía de calidad óptimo deberá abordar por igual los procedimientos de producción y el análisis
del producto final. Un sistema de seguridad absolutamente eficaz que no tenga el riesgo de elaborar un producto
insatisfactorio, sería, probablemente, demasiado caro con relación al coste de producción y al control. Las
autoridades reguladoras y los fabricantes de vacunas deben seleccionar los procedimientos de control que
puedan garantizar un nivel bajo de riesgo aceptable con relación a ese peligro. Tales procedimientos, sin
embargo, no deben ser tan onerosos que impidan el desarrollo y la disponibilidad de los productos necesarios
para proporcionar un cuidado médico preventivo a un coste que sea aceptable para el consumidor.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
INSTALACIONES DE PRODUCCIÓN
Las instalaciones que se usan para la producción de vacunas deberán estar diseñadas para proteger la pureza
del producto durante todo el proceso de producción y la salud del personal. Se deben construir de forma que:
1) puedan limpiarse fácil y totalmente; 2) proporcionen una separación adecuada de las cuartos de elaboración;
3) tengan ventilación adecuada; 4) tengan abundante agua limpia fría y caliente, y un drenaje y fontanería
eficientes; y 5) vestidores y otras instalaciones para el personal, a las que se acceda sin pasar por las zonas de
elaboración del producto biológico. Las instalaciones deben ser adecuadas para facilitar todas las funciones de
producción, tales como el almacenamiento de los inóculos maestros, los ingredientes y otros materiales de
producción; la preparación de los medios de cultivo y los cultivos celulares; la preparación del material de vidrio y
de producción; la inoculación; la incubación; la recolección de los cultivos; el almacenamiento de los materiales
en proceso; la inactivación; la centrifugación; la adición del adyuvante y la formulación del producto; el envasado,
la desecación, el sellado de recipientes, el etiquetado y el almacenamiento del producto final; la comprobación
del control de calidad de los materiales en proceso y del producto final; e investigación y desarrollo.
Por lo general, se requieren zonas separadas para actividades diferentes. Todas las habitaciones y los sistemas
de manipulación de aire deben construirse de forma que se evite la contaminación cruzada por otros productos y
por las personas o el equipo. Los microorganismos virulentos o peligrosos se deben preparar y almacenar en
habitaciones separadas del resto del establecimiento. En concreto, los organismos en estudio deben estar
completamente separados de las cepas de las vacunas. Todo el equipo que entre en contacto con el producto
debe esterilizarse mediante procedimientos validados.
Las instalaciones de producción tienen que diseñarse de tal forma que se evite la contaminación del medio
ambiente. Cualquier material utilizado durante la producción tiene que ser convertido en material seguro antes de
salir de la instalación. Si se propagan microorganismos muy contagiosos, la salida del aire debe ser tratada para
impedir la fuga de los agentes infecciosos. El personal debe seguir los protocolos de seguridad tales como la
ducha, y evitar ponerse en contacto con animales sensibles después de abandonar las instalaciones de
producción.
Aunque la calidad y el diseño de las instalaciones de producción pueden variar significativamente, deben cumplir
siempre con los estándares que se consideran apropiados para las vacunas que se van a producir. Por ejemplo,
los requisitos con respecto a las instalaciones para la producción de vacunas de embriones de pollo
administradas por vía oral, intranasal o intraocular pueden no ser tan exigentes como aquéllos que se estipulan
para la producción de vacunas de cultivos celulares administradas de forma subcutánea o intramuscular.
PLAN DE LAS INSTALACIONES
Para cada vacuna producida en una instalación debe haber un plan de producción detallado que describa donde
tendrá lugar cada etapa del proceso de producción. Este plan debe documentarse en un procedimiento operativo
estándar detallado (POE) o por un plano general (plano de planta) y la leyenda del plano. Cada habitación del
establecimiento debe identificarse de forma individualizada, y deben especificarse, para cada una, todas las
funciones realizadas y los microorganismos implicados También deben documentarse los procedimientos de
desinfección, de comprobación del equipo y otros procedimientos usados en el funcionamiento de las
instalaciones para evitar la contaminación o los errores durante la producción. Este plan debe actualizarse
cuando se añadan nuevos productos a la instalación, o cuando se realicen cambios o mejoras en los
procedimientos.
DOCUMENTACIÓN DEL PROCESO DE FABRICACIÓN
También debe prepararse un perfil de producción detallado, una serie de procedimientos operativos estándares,
y otros documentos que describan el protocolo para la producción y el control de cada producto fabricado en un
establecimiento. Los criterios y estándares para los materiales de origen deben estar documentados de forma
clara y precisa. La documentación debe también abordar asuntos tales como el historial del origen, aislamiento y
pases (subcultivos) de cada cepa; los métodos para la identificación y determinación de la virulencia y la pureza;
el medio o el sistema de cultivo celular usado para los cultivos de siembra y de producción, incluyendo los
métodos utilizados para demostrar que los medios están libres de contaminación; el origen de los ingredientes de
procedencia animal; los métodos de esterilización de medios; las condiciones de almacenamiento de líneas
celulares y de cultivos de siembra; el tamaño y los tipos de recipientes utilizados para el crecimiento de los
cultivos; los métodos para la preparación de cultivos de siembra e inoculación de cultivos de producción; el
tiempo y las condiciones de incubación; las observaciones durante el crecimiento; los criterios y las
especificaciones para la recolección exitosa del material; y las técnicas de recolección. También debe de haber
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
documentación sobre las medidas tomadas por la empresa con objeto de minimizar el riesgo de contaminación
de ingredientes de origen animal por encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE; prión), y sobre los
procedimientos para garantizar que el suero bovino está libre de pestivirus. Asimismo, la documentación debe
incluir: una descripción de todas las pruebas realizadas para evaluar la pureza y la calidad del producto a lo largo
del proceso de proceso de producción; cada etapa de la formulación del producto final; las pruebas utilizadas
para la evaluación de la calidad, inocuidad, potencia, y otros requisitos de cada lote de producto acabado; las
especificaciones para el acabado, incluyendo el empaquetamiento y etiquetado con las indicaciones completas y
las recomendaciones de uso, y la fecha de caducidad establecida para el producto.
Las directrices para la preparación de dichos documentos con respecto a las vacunas veterinarias son
publicadas por las autoridades controladoras competentes. Esta documentación tiene por finalidad definir el
producto y establecer sus especificaciones y estándares. Dicha documentación deberá servir, junto con los
planos generales y las leyendas de los planos (plan de producción y los POE), de método uniforme y constante
de elaboración del producto que deberá seguirse en la preparación de cada lote.
MANTENIMIENTO DE REGISTROS
El productor debe establecer un sistema de mantenimiento de registros detallado capaz de rastrear la ejecución
de las sucesivas etapas de la preparación de cada producto biológico. Los registros deberán indicar la fecha en
la que se han dado cada uno de los pasos cruciales, el nombre de la persona que llevó a cabo la tarea, la
identidad y cantidad de los ingredientes añadidos o retirados en cada etapa, y cualquier ganancia o pérdida de
cantidad durante el curso de la preparación. Se deben mantener registros de todas las pruebas realizadas a cada
lote. Todos los registros relacionados con un lote de producto deberán guardarse al menos durante dos años,
después de la fecha de caducidad de la etiqueta. Además, deberá mantenerse un registro de todas las etiquetas
utilizadas en todos los productos, con cada etiqueta identificada en cuanto al nombre, número de producto,
número de licencia del producto, tamaño del paquete, y número de identificación de la etiqueta. Se debe dar
cuenta de todas las etiquetas impresas. Se deben guardar registros relacionados con los procedimientos de
esterilización y pasteurización. Normalmente, estos se llevan a cabo por medio de dispositivos automáticos de
registro. El fabricante debe también conservar registros completos de todos los animales del establecimiento,
incluyendo datos sobre la salud del animal antes de su utilización en cualquier prueba, los resultados de las
pruebas realizadas, el tratamiento administrado, mantenimiento, necropsia y eliminación.
INÓCULO MAESTRO
Para cada microorganismo utilizado en la fabricación de un producto, debe establecerse un inóculo maestro que
sirva de fuente de siembra para la inoculación de todos los cultivos de producción. Los cultivos de trabajo y los
de producción se pueden preparar a partir del inóculo maestro haciendo subcultivos; los cultivos de producción
finales no deben tener más de cinco pases (a veces diez) a partir del inóculo maestro. En cada caso, se debe
determinar y diseñar el número de pases según los datos. La utilización de un inóculo maestro y la limitación del
número de pases del microorganismo que se usa de siembra en la forma indicada, ayuda a mantener la
uniformidad y la consistencia en la producción. Se debe mantener un registro del inóculo maestro. El inóculo
maestro debe componerse de un único lote homogéneo de inóculo que se ha mezclado y envasado en
recipientes como un solo lote. El inóculo maestro se debe congelar o desecar y almacenar a bajas temperaturas
tales como –40°C o –70°C, o bajo otras condiciones que se consideren óptimas para el mantenimiento de la
viabilidad. Cada inóculo maestro se deberá analizar para garantizar su identidad, inocuidad y eficacia. También
se debe determinar la pureza mediante el correspondiente análisis para garantizar que está libre de bacterias,
hongos, micoplasma y virus extraños.
BANCO DE CÉLULAS MAESTRO
Cuando se utilicen cultivos celulares para preparar un producto, debe establecerse un banco de células maestro
(MCS) para cada tipo de célula que se utilice. Debe mantenerse un registro del origen del banco de células
maestro. En el Perfil de Producción o en el POE, se deben determinar y especificar, para cada producto, los
números más altos y bajos de pases de células. Algunas autoridades controladoras no permiten más de 20 a
40 subcultivos. Cada MCS debe caracterizarse para garantizar su identidad, y su estabilidad genética debe
demostrarse al hacer subcultivos a partir del pase más alto y más bajo utilizado para la producción. La pureza de
los MCS debe establecerse mediante análisis para asegurar que está libre de bacterias, hongos, micoplasma y
virus extraños.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
Œ
Células primarias
Se definen como un conjunto de células originales obtenidas de tejido normal, que incluye hasta el décimo
subcultivo, utilizadas en la producción de biológicos. En el caso de productos para uso avícola, estas células se
obtienen, normalmente, a partir de huevos de pollo embrionados libres de patógenos, que tienen su origen en
una parvada sin vacunar, sujeta a control microbiológico minucioso. Otras células primarias se derivan de tejidos
normales de animales sanos y se analizan con relación a la contaminación por una variedad de organismos tan
amplia como sea pertinente, incluyendo bacterias, hongos, micoplasmas, y agentes citopáticos y/o
hemoadsorbentes y otros virus extraños. Algunas autoridades controladoras sólo permiten el uso de células
primarias en casos excepcionales.
Œ
Huevos embrionados
Los huevos se utilizan con frecuencia en la producción de biológicos. En casi todos los casos, deben derivarse
de parvadas de pollos libres de patógenos específicos, que hayan sido controladas de forma exhaustiva con
relación a agentes infecciosos y que no hayan sido vacunadas. La vía de inoculación del huevo y la elección del
material del huevo que se va a recolectar dependen del organismo concreto que esté siendo propagado.
INGREDIENTES
Las especificaciones y el origen de todos los ingredientes de los productos deben estar definidos en el perfil de
producción, en el POE, y en otros documentos apropiados. El perfil de producción debe ser aprobado por una
agencia nacional expendedora de licencias. Todos los ingredientes de origen animal que no están sujetos a
esterilización se deben analizar para garantizar que están libres de bacterias, hongos, micoplasma y virus
extraños. Se debe conocer el país de origen. La empresa adoptará medidas para minimizar el riesgo de
contaminación de ingredientes de origen animal por TSE (prión). Algunas autoridades controladoras
desaconsejan el uso de conservantes o (más importante) el uso de antibióticos como medio de controlar la
contaminación accidental durante la producción, y prefieren el uso de técnicas asépticas estrictas para asegurar
la pureza. Sin embargo, a veces, permiten el uso de conservantes en recipientes multidosis para proteger el
producto durante el uso. Normalmente, estas autoridades controladoras limitan cualquier adición de antibióticos
al líquido del cultivo celular y a otros medios, a los inóculos de huevos, y al material recogido de piel o
posiblemente de otros tejidos, durante la elaboración del producto. Normalmente, permiten el uso de no más de
tres antibióticos en el mismo producto. Algunas autoridades controladoras también prohíben el uso de penicilina
o estreptomicina en vacunas administradas mediante aerosol o de forma parenteral. Si los antibióticos utilizados
no están recomendados para el uso en las especies a las que se destinan, deberá demostrarse que aquéllos no
tienen efectos dañinos en los animales vacunados y que no tienen repercusión en la contaminación de alimentos
derivados de los animales vacunados.
PRUEBAS DE EFICACIA
La eficacia de las vacunas veterinarias deberá demostrarse mediante estudios estadísticos válidos de la
vacunación en prueba en el animal hospedador utilizando los animales más jóvenes a los que ha de
recomendarse el producto. En cada especie animal, los datos deben apoyar la eficacia de la vacuna en cada
régimen de vacunación que se describe en la etiqueta de recomendación del producto, incluyendo los estudios
sobre el comienzo de la protección cuando en la etiqueta del producto se haga referencia a dicho comienzo y a la
duración de la inmunidad. Las pruebas se realizarán bajo condiciones controladas, comenzando, siempre que
sea posible, con animales seronegativos. En lugares en los que se disponga de las pruebas de potencia
validadas, pueden ser innecesarios los estudios de la vacunación que se prueba en las especies a las que va
destinada, si se dispone de los resultados de predicción de las pruebas serológicas. En la medida de lo posible,
debe fomentarse la aplicación de procedimientos para reemplazar, reducir y refinar los ensayos con animales (la
regla de las tres R).
Los estudios de eficacia deben realizarse con el producto final de la vacuna, elaborada a partir del inóculo
maestro con el número de pases más alto permitido en el perfil de producción, o en otra documentación del
proceso de fabricación. En dicha documentación, se habrá especificado la cantidad mínima de antígeno por
dosis que debe haber en el producto final durante todo el tiempo de validez autorizado. El nivel de antígeno por
dosis en la vacuna ensayada para averiguar su eficacia, debe estar en esta cantidad mínima o por debajo. El
método de estudio exacto y los criterios para determinar la protección varían con el agente inmunizante y deben
estandarizarse siempre que sea posible.
Los estudios de la eficacia de campo se pueden utilizar para determinar la eficacia cuando no sean posibles los
estudios significativos de la vacunación en prueba. Sin embargo, normalmente, es más difícil obtener datos
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
estadísticos significativos para demostrar la eficacia bajo las condiciones de campo. Los protocolos para los
estudios de campo son más complejos, y se debe poner cuidado en establecer los controles adecuados con el fin
de garantizar la validez de los datos. Incluso cuando se diseñan adecuadamente, los estudios de la eficacia de
campo pueden no resultar concluyentes debido a condiciones externas incontrolables. Algunos problemas
implican: niveles de desafío variables una incidencia baja de la enfermedad en controles sin vacunar y la
exposición a otros microorganismos causantes de una enfermedad similar. Por lo tanto, para establecer la
eficacia de algunos productos, pueden necesitarse los datos de la eficacia de los estudios de campo y de los del
laboratorio.
PRUEBAS DE INTERFERENCIA
Para los productos con más de dos componentes antigénicos, las pruebas deben confirmar que no hay
interferencia entre los componentes individuales, es decir, que un componente no cause una disminución en la
respuesta inmunológica protectora de otro componente. La comprobación de la interferencia debe realizarse para
cada combinación de productos antes de su aprobación.
Se puede producir también una pérdida de potencia cuando el agente residual de la inactivación de un producto
líquido muerto, utilizado como diluyente para una fracción viva disecada, reduce la viabilidad de los organismos
vivos debido a la actividad viricida y bactericida. Cada lote de vacuna muerta líquida que vaya a utilizarse como
diluyente para vacunas vivas debe, por lo tanto, comprobarse para su actividad viricida y bactericida antes de su
puesta en el mercado.
También hay que prestar atención a la posible interferencia entre dos vacunas diferentes del mismo fabricante,
que se recomienda que sean suministradas al mismo animal en un período de dos semanas.
PRUEBAS SOBRE EL INCREMENTO DE LA VIRULENCIA
Con las vacunas vivas existe la preocupación de que el organismo pueda ser excretado por el hospedador y
transmitirse a animales en contacto, causando enfermedades, si aquél conserva una virulencia residual o revierte
a la virulencia. Por lo tanto, todas las vacunas vivas se deben examinar para la reversión a la virulencia mediante
estudios de pases. Los organismos vacunales se propagan in vivo por inoculación de un grupo de animales
diana con el inóculo maestro, utilizando normalmente la vía natural de infección para ese organismo. El
organismo vacunal se recupera de los tejidos o excreciones y se utiliza directamente para inocular un nuevo
grupo de animales, y así sucesivamente. Después de no menos de cinco pases (más si se trata de productos
avícolas), el aislado debe caracterizarse completamente utilizando los mismos procedimientos que para
caracterizar el inóculo maestro. El organismo vacunal debe conservar un nivel aceptable de atenuación tras la
propagación de esta forma.
EVALUACIÓN DEL RIESGO PARA EL MEDIO AMBIENTE
Debe estimarse la capacidad de cada vacuna viva para abandonar el hospedador, para propagarse, para entrar
en contacto con animales diana y los que no lo son, y para persistir en el medio ambiente, con el fin de facilitar
información para evaluar el riesgo de la vacuna para el medio ambiente.
En algunos casos esto se puede hacer junto con los ensayos de reversión a la virulencia.
CONSISTENCIA EN LA PRODUCCIÓN
Antes de la aprobación de comercialización de cualquier producto nuevo, cada establecimiento deberá producir
en sus instalaciones tres lotes de producto completo para evaluar la consistencia en la producción. Estos lotes
deberán prepararse según los procedimientos descritos en el perfil de producción y en los planos generales y
leyendas, en los procedimientos operativos estándares y en otra documentación del proceso de fabricación. El
tamaño de cada uno de los tres lotes debe ser, al menos, un tercio del tamaño medio del lote que se producirá
una vez que el producto esté en producción.
El fabricante debe comprobar cada uno de estos tres lotes en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia, como se
estipula en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de fabricación. Se pueden utilizar los
requisitos normalizados aplicables y los procedimientos de ensayo, por ejemplo, los descritos en el CFR (Código
federal de regulaciones) Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la Farmacopea
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
europea, o como se describe en este Manual. Antes de la aprobación de la fabricación del producto en las
instalaciones y de la aprobación para su comercialización, los tres lotes deben mostrar resultados satisfactorios
en los ensayos. Todos los lotes sucesivos deben dar resultados satisfactorios al comprobarse de la misma forma
antes de la aprobación para su comercialización.
PRUEBAS DE POTENCIA
Las pruebas de potencia, exigidas para cada lote antes de su aprobación, se diseñan para que guarden relación
con los estudios de eficacia de la vacunación ensayada en el animal hospedador. Para los productos víricos o
bacterianos inactivados, las pruebas de potencia se pueden realizar en el laboratorio o en animales
hospedadores, o por métodos cuantitativos in vitro. Normalmente, la potencia de las vacunas vivas se estima
mediante recuentos bacterianos o titulación de virus.
Cuando se ensaya una vacuna bacteriana viva para su aprobación, el recuento de bacterias debe ser bastante
mayor que el recuento que se demuestra que es realmente protector en la prueba de inmunogenicidad (eficacia)
del inóculo maestro, con el fin de garantizar que, en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el
recuento será, al menos, igual al manejado en la prueba de inmunogenicidad. Cuando se prueba una vacuna
vírica viva para su aprobación, la titulación del virus tiene que ser, como norma general, bastante mayor que la
que se demuestra que es protectora en la prueba de inmunogenicidad del inóculo maestro para garantizar que,
en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el título será, al menos, igual al manejado en la prueba de
inmunogenicidad. Algunas autoridades controladoras especifican que se hagan recuentos bacterianos o víricoses
más altos que los referidos anteriormente. Es evidente que el título adecuado para la aprobación depende, en
primer lugar, de la potencia requerida y, en segundo lugar, de la velocidad de desaparición de las bacterias o los
virus en la vacuna, como se indica mediante las pruebas de estabilidad.
Los requisitos estándares han sido desarrollados y publicados por las autoridades competentes con relación a
las pruebas de potencia de diversas vacunas. Estas pruebas se pueden encontrar en el CFR Título 9 parte 113,
en la Farmacopea europea y en este Manual.
PRUEBAS DE ESTABILIDAD
Para establecer la validez de la fecha de caducidad que aparece en el paquete del producto, son necesarios los
estudios de estabilidad (basados en una prueba aceptable de potencia). Para estimar la estabilidad con el fin de
establecer una fecha provisional de caducidad, un producto nuevo se puede someter a pruebas de estabilidad
aceleradas, por ejemplo, incubándolo a 37°C durante 1 semana por cada año de validez. Dichas estimaciones
deben confirmarse en tres lotes diferentes al menos, mediante pruebas de potencia periódicas en tiempo real,
durante el período de tiempo indicado por la fecha de caducidad, y entre 3 y 6 meses después. Para los
productos que contengan organismos viables, las pruebas deberán hacerse en la fecha de aprobación de
comercialización y en la fecha de caducidad aproximada, hasta que se fije un valor estadísticamente válido. Para
los productos con organismos no viables, cada lote que se presente para su autorización se probará en la fecha
de aprobación de comercialización, y en/después de la fecha de caducidad exigida. Algunas autoridades también
solicitan una prueba intermedia. Si al final del período fechado (período de validez), se prueba el producto y se
encuentra que aún está por encima de la calidad de aprobación, se puede considerar la ampliación del período
de validez indicado, mediante la solicitud a la autoridad controladora. El análisis de la estabilidad, también
proporciona la oportunidad para probar la humedad residual y otros parámetros importantes, tales como la
estabilidad de las emulsiones adyuvantes.
PRUEBAS DE INOCUIDAD
La inocuidad intrínseca de una vacuna deberá demostrarse al comienzo de la etapa de desarrollo. Se deben
evaluar las vacunas vivas mediante pruebas de incremento de la virulencia y mediante la valoración del riesgo
medioambiental, tal como se ha dicho más arriba. Deben evaluarse las vacunas obtenidas mediante
biotecnología, tal como se argumentó a propósito de la clasificación de esas vacunas y la puesta en circulación
de vacunas vivas ADNr, a las que nos referimos más adelante. Los estudios de seguridad incluirán la inocuidad
de una dosis única, de una sobredosis, y de dosis únicas repetidas. Las pruebas de inocuidad para la aprobación
de un lote se describen en el CFR Título 9 parte 113, en la Farmacopea europea, en este Manual y en otros
sitios. Los procedimientos estándares se aplican a las pruebas de inocuidad con ratones, cobayas, gatos, perros,
caballos, cerdos y ovejas. Los productos pueden requerir más de un tipo de pruebas de inocuidad. La prueba de
inocuidad exigida para un producto avícola se describe en los requisitos estándares o en el perfil de producción
específico para dicho producto. Por regla general, se necesitan estudios de sobredosis para todas las vacunas:
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
‰10 para vacunas vivas y ‰2 para las inactivadas (si esto no es factible, puede obtenerse confirmación de la
inocuidad a partir de los datos de las pruebas de potencia).
Para los productos víricoses inactivados, en los que se utilizan animales hospedadores para las pruebas de
potencia, la inocuidad se puede determinar mediante la inspección diaria de las vacunaciones durante el período
previo de estudio de las pruebas de potencia. De los estudios de reversión a la virulencia en productos vivos
modificados (analizados anteriormente) y de las pruebas de inocuidad de campo (analizados más adelante), se
obtienen pruebas adicionales de la inocuidad de los productos, pero dichas pruebas no son necesarias para cada
lote.
PRUEBAS DE PUREZA
La pureza se determina mediante el análisis de una variedad de contaminantes. Las pruebas para detectar los
contaminantes se realizan en los inóculos maestros, en las células primarias, en los bancos de MCS, en los
ingredientes de origen animal si no se someten a esterilización (por ejemplo, suero fetal bovino, albúmina bovina
o tripsina), y en cada lote del producto final antes de su aprobación.
En el CFR Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la Farmacopea europea o en
este Manual se han publicado los procedimientos de las pruebas de pureza para la detección de virus, bacterias,
micoplasma y hongos extraños, incluyendo, por ejemplo, la Salmonella, la Brucella, los agentes clamidiales, los
virus hemoaglutinantes, la leucosis linfoide aviar, los patógenos detectados mediante una prueba de inoculación
en embriones de pollo, la coriomeningitis linfocítica, los agentes citopáticos y hemoadsorbentes, y los patógenos
detectados por el enzimoinmunoensayo, la reacción en cadena de la polimerasa o la técnica del anticuerpo
fluorescente. Debería prestarse mucha atención, acompañando la documentación pertinente, a los
procedimientos utilizados para asegurarse de que el suero fetal bovino y otros ingredientes de origen bovino
están libres de pestivirus. Las pruebas que se van a utilizar para asegurar la pureza varían según la naturaleza
del producto y deben especificarse en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de
fabricación. Puesto que no se han desarrollado pruebas para la detección de la encefalopatía espongiforme
bovina en ingredientes de origen animal, los fabricantes de vacunas deberían documentar en el perfil de
producción o SOPs las medidas tomadas para minimizar el riesgo de dicha contaminación en ingredientes de
origen animal, tales como: verificación de que todos los ingredientes de origen animal del establecimiento de
producción provienen de países que están libres de la encefalopatía espongiforme bovina.
OTRAS PRUEBAS
Dependiendo de la forma en la que se fabrique la vacuna, se puede sugerir la realización de ciertas pruebas que
deberán especificarse como pertinentes en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de
fabricación. Estas pruebas pueden relacionarse con el nivel de humedad que hay en los productos desecados, el
nivel residual de inactivación de los productos muertos, la inactivación completa de los productos muertos, el pH,
el nivel de conservantes y antibióticos permitido, la estabilidad física de los adyuvantes, la retención del vacío en
los productos desecados y un examen físico general de la vacuna final. Las pruebas para estos objetivos se
pueden también encontrar en el CFR Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la
Farmacopea europea o en este Manual.
MUESTREO
Las muestras deben seleccionarse de cada lote del producto. El seleccionador elegirá envases finales
representativos de cada lote y los almacenará a la temperatura de almacenamiento recomendada en la etiqueta.
El fabricante guardará estas muestras de reserva a la temperatura de almacenamiento recomendada durante
6 meses después de la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta, de forma que estén disponibles para
facilitar la evaluación de la causa de cualquier problema de campo que se presente por el uso de la vacuna. Las
muestras deberían guardarse en una zona de almacenaje segura.
ETIQUETADO
Los estándares para el etiquetado de los productos variarán de un país a otro; sin embargo, las indicaciones de
la etiqueta y todas las afirmaciones que se hacen en ésta deberán estar respaldadas por datos relevantes que
hayan sido revisados y aprobados por las autoridades competentes. Se recomienda que todas las etiquetas para
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
las vacunas veterinarias contengan la siguiente información, aunque en el caso de los envases muy pequeños,
sus etiquetas remitan a la etiqueta del envase o a un prospecto adjunto para la información menos importante:
1.
Denominación exacta del producto, con letras visibles y con igual énfasis en cada letra.
2.
Nombre y dirección del fabricante (y también del importador en el caso de los productos importados).
3.
Temperatura de almacenamiento recomendada.
4.
Una declaración de que el producto es “para uso exclusivo veterinario (o animal)”. Instrucciones de uso
completas, incluyendo todas las advertencias requeridas.
5.
En el caso de los animales destinadas a la alimentación, una declaración indicando que los animales no
deberán ser vacunados dentro de un número específico de días antes del sacrificio. Esto dependerá de
las vacunas (por ejemplo, el tipo de adyuvante) y no se requiere para todos los productos.
6.
Fecha de caducidad.
7.
Número de lote por el que se identifica el producto en el registro de fabricación del productor.
8.
Número de autorización del producto. En algunos países se sustituye por el número de licencia del
establecimiento o del fabricante.
9.
Cantidad recuperable y número de dosis.
10.
Declaración de que el contenido total de un vial multidosis se usará cuando se abra éste por primera vez
(o con un tiempo de almacenamiento temporal adecuado para ciertos productos, cuando esté respaldado
por los datos) y que las porciones no utilizadas deberán eliminarse de forma adecuada.
11.
Una advertencia de seguridad para el operador, si se considera oportuno, en el caso, por ejemplo, de una
autoinyección accidental con la emulsión de aceite de las vacunas.
12.
Cuando se añade un antibiótico a una vacuna durante el proceso de producción, en el cartón o embalaje
utilizados debe figurar la expresión “Contiene (nombre del antibiótico) como conservante” u otra similar. Si
no se utiliza cartón, esa información debe aparecer en la etiqueta del recipiente final.
Las etiquetas pueden incluir también otras declaraciones objetivas que no sean falsas o engañosas. También
deben indicar, siempre que sea procedente, las restricciones especiales con relación al empleo o manejo del
producto.
También se facilitará información similar en una hoja de datos del producto que se proporciona como un
prospecto. Ésta contendrá también muchos más detalles sobre el método de empleo y las posibles reacciones
adversas.
PRUEBAS DE CAMPO (INOCUIDAD Y EFICACIA)
Todos los productos biológicos veterinarios administrados a animales deberán probarse en cuanto a su inocuidad
y a su eficacia en el campo, si es posible, utilizando las buenas prácticas clínicas antes de su autorización para
uso general. Los estudios de campo están diseñados para demostrar la eficacia en las condiciones de trabajo, y
para detectar reacciones inesperadas, incluida la mortalidad, que pueden no haberse observado durante el
desarrollo del producto. En las condiciones de campo, hay muchas variables incontroladas que hacen difícil
obtener buenos datos de eficacia, pero la demostración de inocuidad es más fiable. Las pruebas se deben hacer
en el organismo hospedador y en diferentes zonas geográficas, utilizando grandes cantidades de animales
susceptibles. Los animales en estudio deben representar todas las edades y prácticas de cría para los que está
indicado el producto. Deben incluirse controles sin vacunar. Se deben analizar uno o más lotes de producción.
Se debe desarrollar un protocolo que indique los métodos de observación y de registro.
INSPECCIÓN DE LAS INSTALACIONES DE PRODUCCIÓN
Los establecimientos que están autorizados para producir biológicos veterinarios deben estar sometidos a
inspecciones minuciosas de todo el local por parte de las autoridades competentes nacionales que garanticen la
conformidad con el perfil de producción y los planos generales y las leyendas, los POE u otra documentación del
proceso de fabricación. Estas inspecciones pueden incluir asuntos como las cualificaciones del personal; el
mantenimiento de un registro; las condiciones de salubridad general y estándares de laboratorio; las actividades
de investigación sobre los productos que se están desarrollando; los procedimientos de producción; el
funcionamiento de los esterilizadores, pasteurizadores, incubadores y refrigeradores; el envasado; la desecación;
y los procedimientos de acabado; el cuidado y control de los animales; los procedimientos de análisis; la
distribución y la comercialización; y la destrucción del producto. Es deseable que tengan prácticas correctas de
70
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
fabricación (para la fabricación) y prácticas correctas de laboratorio (para el análisis de la garantía de calidad).
(Véase el Capítulo I.1.2 para las directrices).
Los inspectores prepararán un informe detallado documentando los hallazgos de la inspección y planteando las
medidas que el establecimiento debe tomar para mejorar los procesos de producción. El establecimiento debe
recibir una copia del informe. Se deberá realizar una inspección complementaria cuando sea necesario, con el fin
de determinar si se han tomado las medidas apropiadas para corregir las deficiencias. Se necesita una
evaluación continuada para garantizar que las instalaciones de producción continúan operativas de una forma
aceptable. Las inspecciones periódicas también fomentan las mejoras continuas en los procedimientos de
producción y las instalaciones son coherentes con los avances de la tecnología.
CONTROL PREVIO A LA COMERCIALIZACIÓN
Antes de la aprobación, el fabricante debe comprobar cada lote en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia así
como realizar otra serie de pruebas para ese producto, detalladas en el perfil de producción de la compañía o en
otra documentación del proceso de producción. En los países que tienen programas nacionales reguladores, que
incluyen comprobar los análisis del producto final, muestras de cada lote deben remitirse para su análisis en los
laboratorios gubernamentales por parte de las autoridades competentes. Si se obtienen resultados no
satisfactorios en las pruebas realizadas bien por el fabricante o por las autoridades competentes, el lote no debe
aprobarse. En tales casos, se debe dar prioridad para la comprobación de los análisis de los sucesivos lotes del
producto por las autoridades competentes.
ACTUALIZACIÓN DEL PERFIL DE PRODUCCIÓN
Antes de cambiar los procedimientos de producción, debe cambiarse el correspondiente perfil de producción u
otra documentación del proceso de producción. Los establecimientos deberán tener procedimientos internos de
revisión para evaluar todos los cambios en la producción antes de que se inicien tales cambios. Los cambios
deberán ser también revisados y aprobados por las autoridades competentes antes de su ejecución. En los
casos en los que se altere una etapa significativa de la producción, las revisiones pueden requerir datos
adicionales que respalden la pureza, inocuidad, potencia, y/o eficacia del producto. En los países con programas
reguladores que incluyen la comprobación de los análisis del producto final en los laboratorios nacionales, las
revisiones deberán implicar el análisis del nuevo producto por parte de las autoridades competentes.
SEGUIMIENTO DE LA EFICACIA
Debe pedirse a los fabricantes que mantengan un sistema de notificación de reacciones adversas y un
mecanismo eficaz para la pronta retirada del producto, que se someterá a la auditoria. En muchos países el
fabricante debe notificar inmediatamente todas las reacciones adversas a la autoridad reguladora, junto con la
medida correctiva tomada. Una alternativa utilizada en muchos países es que si en algún momento surgen
indicaciones o interrogantes sobre la pureza, inocuidad, potencia o eficacia del producto, o parece que puede
haber algún problema relativo a la preparación, ensayo o distribución del producto, el fabricante debe comunicar
de inmediato a la autoridad reguladora tales circunstancias y las medidas que se han tomado.
Después de la aprobación de comercialización de un producto, las autoridades competentes deben hacer un
seguimiento de la eficacia bajo las condiciones de campo. Las quejas del consumidor pueden servir como fuente
de información; sin embargo, dicha información tiene que ser investigada para determinar si las observaciones
de las que se informa se relacionan con el uso del producto. Se debe informar a los usuarios de las vacunas
veterinarias de los procedimientos adecuados para hacer las reclamaciones. Las autoridades competentes
deben informar al fabricante del producto de todas las reclamaciones recibidas. Deben confirmar también si han
recibido otras reclamaciones relacionadas con dicho producto y, de ser así, si el fabricante ha tomado las
mediadas oportunas. Si es necesario, los laboratorios de control pueden analizar muestras del lote del producto
implicado.
Cuando la investigación esté completa, debe prepararse un informe final y debe enviarse un resumen de los
hallazgos al reclamante y al fabricante. Cuando se determine que un producto está causando graves problemas,
deben tomarse medidas urgentes para retirar el producto del mercado y notificarlo a las autoridades de sanidad
animal.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
71
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
CUMPLIMIENTO
Los programas nacionales establecidos para garantizar la calidad, la inocuidad, la potencia y la eficacia de las
vacunas veterinarias deben tener la autoridad legal suficiente para garantizar el cumplimiento de las condiciones
de registro del producto y otros requisitos del programa. El objetivo debe ser conseguir un cumplimiento
voluntario de los requisitos reguladores establecidos. Sin embargo, cuando aquéllos se incumplen, las
autoridades competentes deben tener la autoridad legal suficiente para proteger la salud animal. Puede resultar
inestimable para este propósito el que haya una autoridad para la retención, incautación y expropiación de los
productos que se consideren inútiles, contaminados, peligrosos o dañinos. Al amparo de dicha autoridad, el
producto puede ser retenido por un tiempo, y si durante el mismo no se logra el cumplimiento de los requisitos,
las autoridades competentes pueden solicitar un mandato judicial o un auto de incautación y expropiación.
También tendrá que haber una autoridad que pueda retirar o suspender la licencia del establecimiento y/o la
licencia del producto y que pueda obtener un requerimiento judicial para detener la venta del producto. También
pueden ser necesarias las multas administrativas o el enjuiciamiento penal en caso de incumplimientos graves y
deliberados.
AUTORIZACIÓN DE PRODUCTOS OBTENIDOS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA
Los recientes avances en biotecnología han hecho posible el desarrollo y la comercialización de nuevos
productos biológicos con propiedades antigénicas y diagnósticas. Muchos de tales productos han sido
autorizados y aprobados, y muchos están siendo elaborados. Los productos de la tecnología del ADN
recombinante no se diferencian básicamente de los productos convencionales. Por lo tanto, las leyes y
regulaciones existentes son aplicables en su totalidad a estos nuevos productos.
CLASIFICACIÓN DE LAS VACUNAS OBTENIDAS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA
Cada autoridad competente con capacidad para regular organismos y productos obtenidos por las técnicas
recombinantes debe garantizar que la salud pública y el medio ambiente están protegidos de cualquier efecto
potencialmente perjudicial. Con el propósito de evaluar las solicitudes de licencia, las vacunas veterinarias
obtenidas mediante la tecnología de ADNr pueden dividirse en tres grandes categorías. La división se basa en
las propiedades biológicas de los productos y en los problemas de seguridad que presentan.
La Categoría I está formada por los productos no viables o muertos que no representan un riesgo para el medio
ambiente y no presentan problemas de seguridad nuevos o inusuales. Dichos productos incluyen
microorganismos inactivados, ya sean completos o como subunidades, creados mediante la utilización de
técnicas de ADNr.
Los productos de la Categoría II contienen microorganismos vivos modificados mediante la inserción o
eliminación de uno o más genes. Los genes añadidos pueden codificar antígenos marcadores, enzimas u otros
subproductos bioquímicos. Los genes eliminados pueden codificar la virulencia, la oncogenicidad, los
marcadores antigénicos, las enzimas u otros subproductos bioquímicos. La solicitud de autorización debe incluir
una caracterización de los segmentos de ADN añadidos o eliminados, así como una caracterización fenotípica
del organismo alterado. Las modificaciones genéticas no deben repercutir en un aumento de la virulencia,
patogenicidad o supervivencia del organismo alterado en comparación con la forma de tipo silvestre. Es
importante que la modificación genética no produzca el deterioro de las características de inocuidad del
organismo.
Los productos de la Categoría III hacen uso de vectores vivos para transportar genes foráneos, obtenidos por
tecnología recombinante, que codifican antígenos inmunizantes. Los vectores vivos pueden llevar uno o más
genes foráneos que se ha demostrado que son eficaces para la inmunización de animales hospedadores diana.
El uso de vacunas de ADN que contienen genes foráneos, obtenidos por técnicas recombinantes, que codifican
agentes inmunizantes (vacunas de ADN plasmídico) constituye un nuevo enfoque para el desarrollo de vacunas.
La clasificación adecuada de este tipo de producto de ADNr se establecerá conforme se determinen las
propiedades biológicas y sus características inocuas. Estas nuevas vacunas pueden tener aplicación en una
variedad de situaciones mucho más amplia que los productos convencionales. Las directrices para el desarrollo,
producción, caracterización, y control de estos nuevos productos todavía son preliminares y están sujetas a
cambio a medida que se adquieren nuevos datos y conocimientos. La información relacionada con las ideas
actuales sobre las directrices reguladoras para las vacunas de ADN plasmídico se pueden encontrar en Internet
en las siguientes direcciones: http://www.fda.gov/cber/points.htm; http://www.cba.unige.it/VL/bio-info.html;
http://www.orcbs.msu.edu/biological/biolsaf.htm; http://www.pestlaw.com/index.html.
72
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
AUTORIZACIÓN DE PRODUCTOS DE ADNr VIVOS
La producción de vacunas de ADNr y de ADN plasmídico vivas (Categorías II y III) para pruebas de campo o
para la distribución general como un producto aprobado o autorizado puede tener un efecto importante en la
calidad del medio ambiente humano. Antes de que se autorice la producción, los fabricantes de la vacuna deben
realizar una evaluación de riesgos para valorar el impacto sobre el medio ambiente humano. En EE.UU., por
ejemplo, se ha adoptado un procedimiento que podría utilizarse como un sistema modelo en otros países. La
Unión Europea ha adoptado un sistema similar. El procedimiento en cuestión se realiza de la siguiente forma:
La evaluación de riesgos que se lleve a cabo debe contener la siguiente información: el objetivo y la necesidad
de la acción propuesta, las alternativas consideradas, una lista de las agencias gubernamentales, las
organizaciones y personas consultadas, y las consecuencias para el medio ambiente afectado y para el medio
ambiente potencial. Deben incluirse los siguientes temas: las características del organismo vacunal, los riesgos
para la salud humana, los riesgos para la salud de los animales diana y de los que no lo son, la persistencia en el
medio ambiente y el aumento de la virulencia.
Si la evaluación de los riesgos por parte de las autoridades competentes demostrase que la referida liberación al
medio ambiente de la vacuna recombinante destinada a ensayos de campo o a su distribución general, no tiene
un impacto significativo sobre el medio ambiente, deberá publicarse un anuncio y distribuirse al público dando a
conocer esto y que la evaluación de riesgos y los hallazgos están a disposición del público para su revisión y
comentario. Si no se reciben comentarios de peso que refuten los hallazgos, las autoridades competentes
pueden autorizar las pruebas de campo o conceder la licencia o la aprobación para su distribución general.
La preparación de una evaluación de riesgos y los hallazgos hechos a partir de la misma pueden incluir también
la organización de una o más reuniones públicas, si una acción propuesta tiene trascendencia ecológica o
pública. Tales reuniones deben comunicarse a través de un anuncio público. Se invitará a las personas
interesadas junto con el fabricante del producto y el personal del gobierno para que hagan propuestas. Las
transcripciones de dichas reuniones deben formar parte del archivo público.
Si en el desarrollo de una evaluación de riesgos, las autoridades competentes concluyen que la acción propuesta
puede tener un efecto importante en el medio ambiente humano, debe prepararse una Declaración de Impacto
Ambiental, DIA (Environmental Impact Statement, EIS). Dicha Declaración ofrece un debate detallado e imparcial
de los impactos medioambientales significativos e informa a las personas que toman decisiones y al público de
las alternativas razonables que evitarían o minimizarían los impactos adversos. (Los documentos
medioambientales se consideran en el CFR Título 40 parte 1508). Véanse también las Directivas 90/219/CEE y
90/220/CEE de la Unión Europea.
LECTURAS ADICIONALES
Los siguientes textos sugeridos contienen directrices sobre distintos aspectos de la producción de vacunas.
A.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1999) The Rules Governing Medicinal Products in the
European Union. Eudralex. Volumes IV–IX. Office Publications of the European Communities, 1999,
Luxembourg. See also EU Directives: 90/219/EEC 90/220/EEC and 92/18/EEC.
B.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Fourth Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France.
C.
ESPESETH D.A. (1993). Licensing Veterinary Biologics in the United States. The First Steps Towards an
International Harmonization of Veterinary Biologicals; and Free circulation of vaccines within the EEC.
Dev. Biol. Stand., 79, 17–25.
D.
ESPESETH D.A. & GOODMAN J.B. (1993). Chapter 13. In: Licensing and Regulation in the USA. Vaccines for
Veterinary Application. Butterworth Heinemann, London, UK, 321–342.
E.
GAY C.G. & ROTH H.J. (1994). Confirming the safety characteristics of recombinant vectors used in
veterinary medicine: a regulatory perspective. Recombinant vectors in vaccine development. Dev. Biol.
Stand., 82, 93–105.
F.
ROTH H.J. & GAY C.G. (1996). Specific safety requirements for products derived from biotechnology. In:
Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elseviers Science
Publishers B.V. Amsterdam, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
73
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
G.
PASTORET P.P., BLANCOU J., VANNIER P. & VERSCHUEREN C.,
Science, Amsterdam, The Netherlands.
H.
UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (2000). Code of Federal Regulations, Title 9, Parts 1–
199. US Government Printing Office, Washington DC, USA.
I.
USDA-APHIS -VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Categories of Inspection
for Licensed Veterinary Biologics Establishments. Veterinary Services Memorandum No. 800.91. Center
th
for Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
J.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Veterinary Biological
Product Samples. Veterinary Services Memorandum No. 800.59. Center for Veterinary Biologics, 510 S.
th
17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
K.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Guidelines for Submission
of Materials in Support of Licensure. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.84. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
L.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Veterinary Biologics
General Licensing Considerations No. 800.200, Efficacy Studies. USDA-APHIS-Veterinary Biologics, 4700
River Road, Riverdale, Maryland 20737, USA.
M.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Veterinary Biologics
General Licensing Considerations No. 800.201, Back Passage Studies. Center for Veterinary Biologics,
th
510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
N.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES (1964–1994). Standard Assay Methods, Series 100–900. National
Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa 50010, USA.
O.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1984). Basic License
Requirements for Applicants. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.50. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA
P.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1988). Guidelines for the
Preparation and Review of Labeling Materials. Veterinary Services Memorandum No. 800.54. Center for
th
Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
EDS
(1997). Veterinary Vaccinology. Elsevier
1
*
* *
1
74
United States Department of Agriculture (USDA), Animal and Plant Health Inspection Services (APHIS). USDA-APHISCENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS HOME PAGE: http://www.aphis.usda.gov/vs/cvb/index.html
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO I.1.7.
PRINCIPIOS DE PRODUCCIÓN DE
VACUNAS VETERINARIAS
RESUMEN
La administración fiable de vacunas puras, inocuas, potentes y eficaces es imprescindible para el
mantenimiento de la salud animal y el funcionamiento satisfactorio de los programas de salud
animal. La inmunización de animales con vacunas de gran calidad es el principal medio de control
de muchas enfermedades animales. En otros casos, las vacunas se emplean conjuntamente con el
control nacional de enfermedades o los programas de erradicación.
Se pretende que los requisitos y procedimientos que se describen en este capítulo sean de
carácter general y consistentes con los estándares publicados de los que se dispone normalmente
como guía en la producción de vacunas veterinarias. El planteamiento para garantizar la calidad,
inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas veterinarias puede variar de un país a otro
dependiendo de las necesidades locales. Sin embargo, son imprescindibles estándares y controles
de producción adecuados para asegurar la disponibilidad de productos uniformes de gran calidad
para el uso en programas de salud animal.
Como la patogénesis y la epidemiología de cada enfermedad varía, el papel y la eficacia de la
vacunación como medio de control varía también de una enfermedad a otra. Algunas vacunas
pueden ser de gran eficacia, induciendo una inmunidad que no sólo previene los síntomas de la
enfermedad, sino también la infección y la replicación del agente causante de la enfermedad. Otras
vacunas pueden prevenir la enfermedad clínica, pero no la infección y/o el estado de desarrollo del
portador. En otros casos, la inmunización puede resultar completamente ineficaz o sólo reducir la
severidad de la enfermedad. De esta forma, la decisión de recomendar la vacunación como parte
de la estrategia de control de las enfermedades animales, requiere un conocimiento profundo de
las características del agente infeccioso y de su epidemiología, así como de las características y
posibilidades de las diferentes vacunas disponibles. Además, hay una preocupación pública
creciente por las implicaciones de la producción y uso de vacunas veterinarias para el bienestar
animal. En cualquier caso, si se utilizan vacunas, un rendimiento satisfactorio requiere que éstas
se fabriquen de forma que se garantice un producto uniforme y constante de gran calidad.
NOMENCLATURA
La nomenclatura para los productos biológicos veterinarios varía de un país a otro. Por ejemplo, en EE.UU el
término “vacuna” se utiliza para productos que contienen virus vivos o inactivados o protozoos, bacterias vivas o
ácidos nucleicos. Dependiendo del tipo de antígeno que contienen, los productos con bacterias muertas y otros
microorganismos se identifican como bacterinas, extractos bacterianos, subunidades, toxoides bacterianos o
toxoides. Por ejemplo, a los productos que contienen componentes antigénicos o inmunizantes de
microorganismos se les puede llamar “subunidades” o “extractos bacterianos”, y a los obtenidos a partir de la
inactivación de toxinas se les llama “toxoides”. En la Unión Europea (UE), los productos médicos veterinarios se
definen como “productos administrados a animales para producir inmunidad activa o pasiva o para diagnosticar
el estado de inmunidad; véase Directiva 90/677/CEE. Sin embargo, en este capítulo el término “vacuna” incluirá
todos los productos diseñados para estimular la inmunización activa de animales contra enfermedades, con
independencia del tipo de microorganismo o toxina microbiana que contengan o de los que éstos puedan
derivarse. Este uso es más coherente con la nomenclatura internacional. En esta revisión no se utilizará “vacuna”
con referencia a productos biológicos recomendados para la inmunización pasiva, inmunoestimulación,
tratamiento de alergias o diagnóstico.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
TIPOS O FORMAS DE VACUNAS
Las vacunas se pueden preparar como productos vivos o inactivados (muertos). Algunas vacunas vivas se
preparan a partir de los aislados de campo de baja virulencia, atenuados, de un agente causante de una
enfermedad, que cuando se administran por vía no natural o bajo otras condiciones, en las que la exposición a
los microorganismos inmuniza en vez de causar la enfermedad, se ha descubierto que son inocuos y eficaces.
Otras vacunas vivas se preparan de los aislados de los agentes causantes de enfermedades que han sido
modificados mediante el pase por animales de laboratorio, medios de cultivo, cultivos celulares o embriones
aviares, para seleccionar un aislado de virulencia reducida. El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante
(ADNr ha proporcionado algunas oportunidades únicas para la producción de vacunas. En la actualidad, las
vacunas vivas modificadas se pueden producir de forma específica mediante la eliminación de los genes
relacionados con la virulencia en un microorganismo. Otras vacunas se producen por la introducción de genes
que codifican antígenos inmunizantes específicos, en un microorganismo vector no virulento, a partir de un
microorganismo causante de una enfermedad. Se están desarrollando vacunas mediadas por ácido nucleico que
contienen ADN plasmídico. Normalmente, el ácido nucleico se encuentra en forma de plásmido y codifica
antígenos inmunizantes a partir de microorganismos que causan enfermedades.
Los productos inactivados pueden contener: 1) Cultivos de microorganismos que han sido inactivados por
medios químicos u otros medios; 2) Toxinas inactivadas; o 3) Subunidades (partes antigénicas de
microorganismos) que se han extraído de cultivos o que se han producido mediante procedimientos de ADNr.
Tanto las vacunas vivas como las inactivadas se pueden formular con adyuvantes diseñados para aumentar su
eficacia. Los adyuvantes típicos son emulsiones de aceite en agua (simples o dobles), hechas con aceite mineral
o vegetal y un agente emulsionante. También se utilizan otros adyuvantes como el gel de hidróxido de aluminio.
GARANTÍA DE CALIDAD
La producción uniforme de vacunas de gran calidad, inocuas, potentes y eficaces requiere procedimientos de
garantía de calidad para asegurar la uniformidad y consistencia del proceso de producción. Puesto que los
procesos de producción de vacunas proporcionan una gran oportunidad para la variabilidad, se debe tener
cuidado en controlar ésta en la medida de lo posible, utilizando, preferiblemente, procedimientos validados, y
proteger el producto de la contaminación a lo largo de todas las etapas de producción.
Deben garantizarse la calidad, inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas mediante la consistencia durante el
proceso de producción. En cada etapa debe desarrollarse la calidad constante del producto (uniformidad entre
lotes). El análisis del producto final se utiliza como comprobación para verificar que los controles en los
procedimientos de producción se han mantenido intactos, y que el producto fabricado reúne la especificación
previamente acordada con la autoridad otorgante de la licencia.
Las autoridades reguladoras de los diferentes países han desarrollado planteamientos diferentes para asegurar
la calidad de las vacunas. Aunque parecidos en su objetivo final, estos sistemas pueden variar en la importancia
que se da al control del proceso de producción (estándares de proceso) en comparación con el control mediante
el análisis del producto final (estándares de eficacia). Los procedimientos de control seleccionados deben ser los
que mejor se ajusten a las condiciones bajo las que se estén produciendo las vacunas y deben, en la medida de
lo posible, cumplir con las prácticas correctas de fabricación.
Los estándares y procedimientos de control establecidos para un producto determinan el riesgo o la posibilidad
de producir y poner en el mercado un producto inútil, contaminado, peligroso o nocivo. El grado de riesgo
aceptable puede depender de los beneficios que se obtengan teniendo un producto disponible que evite las
muertes por enfermedad. De esta forma, los estándares pueden variar, de forma justificada, de un país a otro, o
de un producto a otro, dependiendo de las condiciones de sanidad animal a nivel local. Sin embargo, las
autoridades controladoras deben esforzarse por establecer estándares y procedimientos de control que
garanticen un producto acabado de la mejor calidad, inocuidad, potencia y eficacia posibles.
El sistema de garantía de calidad óptimo deberá abordar por igual los procedimientos de producción y el análisis
del producto final. Un sistema de seguridad absolutamente eficaz que no tenga el riesgo de elaborar un producto
insatisfactorio, sería, probablemente, demasiado caro con relación al coste de producción y al control. Las
autoridades reguladoras y los fabricantes de vacunas deben seleccionar los procedimientos de control que
puedan garantizar un nivel bajo de riesgo aceptable con relación a ese peligro. Tales procedimientos, sin
embargo, no deben ser tan onerosos que impidan el desarrollo y la disponibilidad de los productos necesarios
para proporcionar un cuidado médico preventivo a un coste que sea aceptable para el consumidor.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
INSTALACIONES DE PRODUCCIÓN
Las instalaciones que se usan para la producción de vacunas deberán estar diseñadas para proteger la pureza
del producto durante todo el proceso de producción y la salud del personal. Se deben construir de forma que:
1) puedan limpiarse fácil y totalmente; 2) proporcionen una separación adecuada de las cuartos de elaboración;
3) tengan ventilación adecuada; 4) tengan abundante agua limpia fría y caliente, y un drenaje y fontanería
eficientes; y 5) vestidores y otras instalaciones para el personal, a las que se acceda sin pasar por las zonas de
elaboración del producto biológico. Las instalaciones deben ser adecuadas para facilitar todas las funciones de
producción, tales como el almacenamiento de los inóculos maestros, los ingredientes y otros materiales de
producción; la preparación de los medios de cultivo y los cultivos celulares; la preparación del material de vidrio y
de producción; la inoculación; la incubación; la recolección de los cultivos; el almacenamiento de los materiales
en proceso; la inactivación; la centrifugación; la adición del adyuvante y la formulación del producto; el envasado,
la desecación, el sellado de recipientes, el etiquetado y el almacenamiento del producto final; la comprobación
del control de calidad de los materiales en proceso y del producto final; e investigación y desarrollo.
Por lo general, se requieren zonas separadas para actividades diferentes. Todas las habitaciones y los sistemas
de manipulación de aire deben construirse de forma que se evite la contaminación cruzada por otros productos y
por las personas o el equipo. Los microorganismos virulentos o peligrosos se deben preparar y almacenar en
habitaciones separadas del resto del establecimiento. En concreto, los organismos en estudio deben estar
completamente separados de las cepas de las vacunas. Todo el equipo que entre en contacto con el producto
debe esterilizarse mediante procedimientos validados.
Las instalaciones de producción tienen que diseñarse de tal forma que se evite la contaminación del medio
ambiente. Cualquier material utilizado durante la producción tiene que ser convertido en material seguro antes de
salir de la instalación. Si se propagan microorganismos muy contagiosos, la salida del aire debe ser tratada para
impedir la fuga de los agentes infecciosos. El personal debe seguir los protocolos de seguridad tales como la
ducha, y evitar ponerse en contacto con animales sensibles después de abandonar las instalaciones de
producción.
Aunque la calidad y el diseño de las instalaciones de producción pueden variar significativamente, deben cumplir
siempre con los estándares que se consideran apropiados para las vacunas que se van a producir. Por ejemplo,
los requisitos con respecto a las instalaciones para la producción de vacunas de embriones de pollo
administradas por vía oral, intranasal o intraocular pueden no ser tan exigentes como aquéllos que se estipulan
para la producción de vacunas de cultivos celulares administradas de forma subcutánea o intramuscular.
PLAN DE LAS INSTALACIONES
Para cada vacuna producida en una instalación debe haber un plan de producción detallado que describa donde
tendrá lugar cada etapa del proceso de producción. Este plan debe documentarse en un procedimiento operativo
estándar detallado (POE) o por un plano general (plano de planta) y la leyenda del plano. Cada habitación del
establecimiento debe identificarse de forma individualizada, y deben especificarse, para cada una, todas las
funciones realizadas y los microorganismos implicados También deben documentarse los procedimientos de
desinfección, de comprobación del equipo y otros procedimientos usados en el funcionamiento de las
instalaciones para evitar la contaminación o los errores durante la producción. Este plan debe actualizarse
cuando se añadan nuevos productos a la instalación, o cuando se realicen cambios o mejoras en los
procedimientos.
DOCUMENTACIÓN DEL PROCESO DE FABRICACIÓN
También debe prepararse un perfil de producción detallado, una serie de procedimientos operativos estándares,
y otros documentos que describan el protocolo para la producción y el control de cada producto fabricado en un
establecimiento. Los criterios y estándares para los materiales de origen deben estar documentados de forma
clara y precisa. La documentación debe también abordar asuntos tales como el historial del origen, aislamiento y
pases (subcultivos) de cada cepa; los métodos para la identificación y determinación de la virulencia y la pureza;
el medio o el sistema de cultivo celular usado para los cultivos de siembra y de producción, incluyendo los
métodos utilizados para demostrar que los medios están libres de contaminación; el origen de los ingredientes de
procedencia animal; los métodos de esterilización de medios; las condiciones de almacenamiento de líneas
celulares y de cultivos de siembra; el tamaño y los tipos de recipientes utilizados para el crecimiento de los
cultivos; los métodos para la preparación de cultivos de siembra e inoculación de cultivos de producción; el
tiempo y las condiciones de incubación; las observaciones durante el crecimiento; los criterios y las
especificaciones para la recolección exitosa del material; y las técnicas de recolección. También debe de haber
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
documentación sobre las medidas tomadas por la empresa con objeto de minimizar el riesgo de contaminación
de ingredientes de origen animal por encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE; prión), y sobre los
procedimientos para garantizar que el suero bovino está libre de pestivirus. Asimismo, la documentación debe
incluir: una descripción de todas las pruebas realizadas para evaluar la pureza y la calidad del producto a lo largo
del proceso de proceso de producción; cada etapa de la formulación del producto final; las pruebas utilizadas
para la evaluación de la calidad, inocuidad, potencia, y otros requisitos de cada lote de producto acabado; las
especificaciones para el acabado, incluyendo el empaquetamiento y etiquetado con las indicaciones completas y
las recomendaciones de uso, y la fecha de caducidad establecida para el producto.
Las directrices para la preparación de dichos documentos con respecto a las vacunas veterinarias son
publicadas por las autoridades controladoras competentes. Esta documentación tiene por finalidad definir el
producto y establecer sus especificaciones y estándares. Dicha documentación deberá servir, junto con los
planos generales y las leyendas de los planos (plan de producción y los POE), de método uniforme y constante
de elaboración del producto que deberá seguirse en la preparación de cada lote.
MANTENIMIENTO DE REGISTROS
El productor debe establecer un sistema de mantenimiento de registros detallado capaz de rastrear la ejecución
de las sucesivas etapas de la preparación de cada producto biológico. Los registros deberán indicar la fecha en
la que se han dado cada uno de los pasos cruciales, el nombre de la persona que llevó a cabo la tarea, la
identidad y cantidad de los ingredientes añadidos o retirados en cada etapa, y cualquier ganancia o pérdida de
cantidad durante el curso de la preparación. Se deben mantener registros de todas las pruebas realizadas a cada
lote. Todos los registros relacionados con un lote de producto deberán guardarse al menos durante dos años,
después de la fecha de caducidad de la etiqueta. Además, deberá mantenerse un registro de todas las etiquetas
utilizadas en todos los productos, con cada etiqueta identificada en cuanto al nombre, número de producto,
número de licencia del producto, tamaño del paquete, y número de identificación de la etiqueta. Se debe dar
cuenta de todas las etiquetas impresas. Se deben guardar registros relacionados con los procedimientos de
esterilización y pasteurización. Normalmente, estos se llevan a cabo por medio de dispositivos automáticos de
registro. El fabricante debe también conservar registros completos de todos los animales del establecimiento,
incluyendo datos sobre la salud del animal antes de su utilización en cualquier prueba, los resultados de las
pruebas realizadas, el tratamiento administrado, mantenimiento, necropsia y eliminación.
INÓCULO MAESTRO
Para cada microorganismo utilizado en la fabricación de un producto, debe establecerse un inóculo maestro que
sirva de fuente de siembra para la inoculación de todos los cultivos de producción. Los cultivos de trabajo y los
de producción se pueden preparar a partir del inóculo maestro haciendo subcultivos; los cultivos de producción
finales no deben tener más de cinco pases (a veces diez) a partir del inóculo maestro. En cada caso, se debe
determinar y diseñar el número de pases según los datos. La utilización de un inóculo maestro y la limitación del
número de pases del microorganismo que se usa de siembra en la forma indicada, ayuda a mantener la
uniformidad y la consistencia en la producción. Se debe mantener un registro del inóculo maestro. El inóculo
maestro debe componerse de un único lote homogéneo de inóculo que se ha mezclado y envasado en
recipientes como un solo lote. El inóculo maestro se debe congelar o desecar y almacenar a bajas temperaturas
tales como –40°C o –70°C, o bajo otras condiciones que se consideren óptimas para el mantenimiento de la
viabilidad. Cada inóculo maestro se deberá analizar para garantizar su identidad, inocuidad y eficacia. También
se debe determinar la pureza mediante el correspondiente análisis para garantizar que está libre de bacterias,
hongos, micoplasma y virus extraños.
BANCO DE CÉLULAS MAESTRO
Cuando se utilicen cultivos celulares para preparar un producto, debe establecerse un banco de células maestro
(MCS) para cada tipo de célula que se utilice. Debe mantenerse un registro del origen del banco de células
maestro. En el Perfil de Producción o en el POE, se deben determinar y especificar, para cada producto, los
números más altos y bajos de pases de células. Algunas autoridades controladoras no permiten más de 20 a
40 subcultivos. Cada MCS debe caracterizarse para garantizar su identidad, y su estabilidad genética debe
demostrarse al hacer subcultivos a partir del pase más alto y más bajo utilizado para la producción. La pureza de
los MCS debe establecerse mediante análisis para asegurar que está libre de bacterias, hongos, micoplasma y
virus extraños.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
65
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
Œ
Células primarias
Se definen como un conjunto de células originales obtenidas de tejido normal, que incluye hasta el décimo
subcultivo, utilizadas en la producción de biológicos. En el caso de productos para uso avícola, estas células se
obtienen, normalmente, a partir de huevos de pollo embrionados libres de patógenos, que tienen su origen en
una parvada sin vacunar, sujeta a control microbiológico minucioso. Otras células primarias se derivan de tejidos
normales de animales sanos y se analizan con relación a la contaminación por una variedad de organismos tan
amplia como sea pertinente, incluyendo bacterias, hongos, micoplasmas, y agentes citopáticos y/o
hemoadsorbentes y otros virus extraños. Algunas autoridades controladoras sólo permiten el uso de células
primarias en casos excepcionales.
Œ
Huevos embrionados
Los huevos se utilizan con frecuencia en la producción de biológicos. En casi todos los casos, deben derivarse
de parvadas de pollos libres de patógenos específicos, que hayan sido controladas de forma exhaustiva con
relación a agentes infecciosos y que no hayan sido vacunadas. La vía de inoculación del huevo y la elección del
material del huevo que se va a recolectar dependen del organismo concreto que esté siendo propagado.
INGREDIENTES
Las especificaciones y el origen de todos los ingredientes de los productos deben estar definidos en el perfil de
producción, en el POE, y en otros documentos apropiados. El perfil de producción debe ser aprobado por una
agencia nacional expendedora de licencias. Todos los ingredientes de origen animal que no están sujetos a
esterilización se deben analizar para garantizar que están libres de bacterias, hongos, micoplasma y virus
extraños. Se debe conocer el país de origen. La empresa adoptará medidas para minimizar el riesgo de
contaminación de ingredientes de origen animal por TSE (prión). Algunas autoridades controladoras
desaconsejan el uso de conservantes o (más importante) el uso de antibióticos como medio de controlar la
contaminación accidental durante la producción, y prefieren el uso de técnicas asépticas estrictas para asegurar
la pureza. Sin embargo, a veces, permiten el uso de conservantes en recipientes multidosis para proteger el
producto durante el uso. Normalmente, estas autoridades controladoras limitan cualquier adición de antibióticos
al líquido del cultivo celular y a otros medios, a los inóculos de huevos, y al material recogido de piel o
posiblemente de otros tejidos, durante la elaboración del producto. Normalmente, permiten el uso de no más de
tres antibióticos en el mismo producto. Algunas autoridades controladoras también prohíben el uso de penicilina
o estreptomicina en vacunas administradas mediante aerosol o de forma parenteral. Si los antibióticos utilizados
no están recomendados para el uso en las especies a las que se destinan, deberá demostrarse que aquéllos no
tienen efectos dañinos en los animales vacunados y que no tienen repercusión en la contaminación de alimentos
derivados de los animales vacunados.
PRUEBAS DE EFICACIA
La eficacia de las vacunas veterinarias deberá demostrarse mediante estudios estadísticos válidos de la
vacunación en prueba en el animal hospedador utilizando los animales más jóvenes a los que ha de
recomendarse el producto. En cada especie animal, los datos deben apoyar la eficacia de la vacuna en cada
régimen de vacunación que se describe en la etiqueta de recomendación del producto, incluyendo los estudios
sobre el comienzo de la protección cuando en la etiqueta del producto se haga referencia a dicho comienzo y a la
duración de la inmunidad. Las pruebas se realizarán bajo condiciones controladas, comenzando, siempre que
sea posible, con animales seronegativos. En lugares en los que se disponga de las pruebas de potencia
validadas, pueden ser innecesarios los estudios de la vacunación que se prueba en las especies a las que va
destinada, si se dispone de los resultados de predicción de las pruebas serológicas. En la medida de lo posible,
debe fomentarse la aplicación de procedimientos para reemplazar, reducir y refinar los ensayos con animales (la
regla de las tres R).
Los estudios de eficacia deben realizarse con el producto final de la vacuna, elaborada a partir del inóculo
maestro con el número de pases más alto permitido en el perfil de producción, o en otra documentación del
proceso de fabricación. En dicha documentación, se habrá especificado la cantidad mínima de antígeno por
dosis que debe haber en el producto final durante todo el tiempo de validez autorizado. El nivel de antígeno por
dosis en la vacuna ensayada para averiguar su eficacia, debe estar en esta cantidad mínima o por debajo. El
método de estudio exacto y los criterios para determinar la protección varían con el agente inmunizante y deben
estandarizarse siempre que sea posible.
Los estudios de la eficacia de campo se pueden utilizar para determinar la eficacia cuando no sean posibles los
estudios significativos de la vacunación en prueba. Sin embargo, normalmente, es más difícil obtener datos
66
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
estadísticos significativos para demostrar la eficacia bajo las condiciones de campo. Los protocolos para los
estudios de campo son más complejos, y se debe poner cuidado en establecer los controles adecuados con el fin
de garantizar la validez de los datos. Incluso cuando se diseñan adecuadamente, los estudios de la eficacia de
campo pueden no resultar concluyentes debido a condiciones externas incontrolables. Algunos problemas
implican: niveles de desafío variables una incidencia baja de la enfermedad en controles sin vacunar y la
exposición a otros microorganismos causantes de una enfermedad similar. Por lo tanto, para establecer la
eficacia de algunos productos, pueden necesitarse los datos de la eficacia de los estudios de campo y de los del
laboratorio.
PRUEBAS DE INTERFERENCIA
Para los productos con más de dos componentes antigénicos, las pruebas deben confirmar que no hay
interferencia entre los componentes individuales, es decir, que un componente no cause una disminución en la
respuesta inmunológica protectora de otro componente. La comprobación de la interferencia debe realizarse para
cada combinación de productos antes de su aprobación.
Se puede producir también una pérdida de potencia cuando el agente residual de la inactivación de un producto
líquido muerto, utilizado como diluyente para una fracción viva disecada, reduce la viabilidad de los organismos
vivos debido a la actividad viricida y bactericida. Cada lote de vacuna muerta líquida que vaya a utilizarse como
diluyente para vacunas vivas debe, por lo tanto, comprobarse para su actividad viricida y bactericida antes de su
puesta en el mercado.
También hay que prestar atención a la posible interferencia entre dos vacunas diferentes del mismo fabricante,
que se recomienda que sean suministradas al mismo animal en un período de dos semanas.
PRUEBAS SOBRE EL INCREMENTO DE LA VIRULENCIA
Con las vacunas vivas existe la preocupación de que el organismo pueda ser excretado por el hospedador y
transmitirse a animales en contacto, causando enfermedades, si aquél conserva una virulencia residual o revierte
a la virulencia. Por lo tanto, todas las vacunas vivas se deben examinar para la reversión a la virulencia mediante
estudios de pases. Los organismos vacunales se propagan in vivo por inoculación de un grupo de animales
diana con el inóculo maestro, utilizando normalmente la vía natural de infección para ese organismo. El
organismo vacunal se recupera de los tejidos o excreciones y se utiliza directamente para inocular un nuevo
grupo de animales, y así sucesivamente. Después de no menos de cinco pases (más si se trata de productos
avícolas), el aislado debe caracterizarse completamente utilizando los mismos procedimientos que para
caracterizar el inóculo maestro. El organismo vacunal debe conservar un nivel aceptable de atenuación tras la
propagación de esta forma.
EVALUACIÓN DEL RIESGO PARA EL MEDIO AMBIENTE
Debe estimarse la capacidad de cada vacuna viva para abandonar el hospedador, para propagarse, para entrar
en contacto con animales diana y los que no lo son, y para persistir en el medio ambiente, con el fin de facilitar
información para evaluar el riesgo de la vacuna para el medio ambiente.
En algunos casos esto se puede hacer junto con los ensayos de reversión a la virulencia.
CONSISTENCIA EN LA PRODUCCIÓN
Antes de la aprobación de comercialización de cualquier producto nuevo, cada establecimiento deberá producir
en sus instalaciones tres lotes de producto completo para evaluar la consistencia en la producción. Estos lotes
deberán prepararse según los procedimientos descritos en el perfil de producción y en los planos generales y
leyendas, en los procedimientos operativos estándares y en otra documentación del proceso de fabricación. El
tamaño de cada uno de los tres lotes debe ser, al menos, un tercio del tamaño medio del lote que se producirá
una vez que el producto esté en producción.
El fabricante debe comprobar cada uno de estos tres lotes en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia, como se
estipula en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de fabricación. Se pueden utilizar los
requisitos normalizados aplicables y los procedimientos de ensayo, por ejemplo, los descritos en el CFR (Código
federal de regulaciones) Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la Farmacopea
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
europea, o como se describe en este Manual. Antes de la aprobación de la fabricación del producto en las
instalaciones y de la aprobación para su comercialización, los tres lotes deben mostrar resultados satisfactorios
en los ensayos. Todos los lotes sucesivos deben dar resultados satisfactorios al comprobarse de la misma forma
antes de la aprobación para su comercialización.
PRUEBAS DE POTENCIA
Las pruebas de potencia, exigidas para cada lote antes de su aprobación, se diseñan para que guarden relación
con los estudios de eficacia de la vacunación ensayada en el animal hospedador. Para los productos víricos o
bacterianos inactivados, las pruebas de potencia se pueden realizar en el laboratorio o en animales
hospedadores, o por métodos cuantitativos in vitro. Normalmente, la potencia de las vacunas vivas se estima
mediante recuentos bacterianos o titulación de virus.
Cuando se ensaya una vacuna bacteriana viva para su aprobación, el recuento de bacterias debe ser bastante
mayor que el recuento que se demuestra que es realmente protector en la prueba de inmunogenicidad (eficacia)
del inóculo maestro, con el fin de garantizar que, en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el
recuento será, al menos, igual al manejado en la prueba de inmunogenicidad. Cuando se prueba una vacuna
vírica viva para su aprobación, la titulación del virus tiene que ser, como norma general, bastante mayor que la
que se demuestra que es protectora en la prueba de inmunogenicidad del inóculo maestro para garantizar que,
en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el título será, al menos, igual al manejado en la prueba de
inmunogenicidad. Algunas autoridades controladoras especifican que se hagan recuentos bacterianos o víricoses
más altos que los referidos anteriormente. Es evidente que el título adecuado para la aprobación depende, en
primer lugar, de la potencia requerida y, en segundo lugar, de la velocidad de desaparición de las bacterias o los
virus en la vacuna, como se indica mediante las pruebas de estabilidad.
Los requisitos estándares han sido desarrollados y publicados por las autoridades competentes con relación a
las pruebas de potencia de diversas vacunas. Estas pruebas se pueden encontrar en el CFR Título 9 parte 113,
en la Farmacopea europea y en este Manual.
PRUEBAS DE ESTABILIDAD
Para establecer la validez de la fecha de caducidad que aparece en el paquete del producto, son necesarios los
estudios de estabilidad (basados en una prueba aceptable de potencia). Para estimar la estabilidad con el fin de
establecer una fecha provisional de caducidad, un producto nuevo se puede someter a pruebas de estabilidad
aceleradas, por ejemplo, incubándolo a 37°C durante 1 semana por cada año de validez. Dichas estimaciones
deben confirmarse en tres lotes diferentes al menos, mediante pruebas de potencia periódicas en tiempo real,
durante el período de tiempo indicado por la fecha de caducidad, y entre 3 y 6 meses después. Para los
productos que contengan organismos viables, las pruebas deberán hacerse en la fecha de aprobación de
comercialización y en la fecha de caducidad aproximada, hasta que se fije un valor estadísticamente válido. Para
los productos con organismos no viables, cada lote que se presente para su autorización se probará en la fecha
de aprobación de comercialización, y en/después de la fecha de caducidad exigida. Algunas autoridades también
solicitan una prueba intermedia. Si al final del período fechado (período de validez), se prueba el producto y se
encuentra que aún está por encima de la calidad de aprobación, se puede considerar la ampliación del período
de validez indicado, mediante la solicitud a la autoridad controladora. El análisis de la estabilidad, también
proporciona la oportunidad para probar la humedad residual y otros parámetros importantes, tales como la
estabilidad de las emulsiones adyuvantes.
PRUEBAS DE INOCUIDAD
La inocuidad intrínseca de una vacuna deberá demostrarse al comienzo de la etapa de desarrollo. Se deben
evaluar las vacunas vivas mediante pruebas de incremento de la virulencia y mediante la valoración del riesgo
medioambiental, tal como se ha dicho más arriba. Deben evaluarse las vacunas obtenidas mediante
biotecnología, tal como se argumentó a propósito de la clasificación de esas vacunas y la puesta en circulación
de vacunas vivas ADNr, a las que nos referimos más adelante. Los estudios de seguridad incluirán la inocuidad
de una dosis única, de una sobredosis, y de dosis únicas repetidas. Las pruebas de inocuidad para la aprobación
de un lote se describen en el CFR Título 9 parte 113, en la Farmacopea europea, en este Manual y en otros
sitios. Los procedimientos estándares se aplican a las pruebas de inocuidad con ratones, cobayas, gatos, perros,
caballos, cerdos y ovejas. Los productos pueden requerir más de un tipo de pruebas de inocuidad. La prueba de
inocuidad exigida para un producto avícola se describe en los requisitos estándares o en el perfil de producción
específico para dicho producto. Por regla general, se necesitan estudios de sobredosis para todas las vacunas:
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
‰10 para vacunas vivas y ‰2 para las inactivadas (si esto no es factible, puede obtenerse confirmación de la
inocuidad a partir de los datos de las pruebas de potencia).
Para los productos víricoses inactivados, en los que se utilizan animales hospedadores para las pruebas de
potencia, la inocuidad se puede determinar mediante la inspección diaria de las vacunaciones durante el período
previo de estudio de las pruebas de potencia. De los estudios de reversión a la virulencia en productos vivos
modificados (analizados anteriormente) y de las pruebas de inocuidad de campo (analizados más adelante), se
obtienen pruebas adicionales de la inocuidad de los productos, pero dichas pruebas no son necesarias para cada
lote.
PRUEBAS DE PUREZA
La pureza se determina mediante el análisis de una variedad de contaminantes. Las pruebas para detectar los
contaminantes se realizan en los inóculos maestros, en las células primarias, en los bancos de MCS, en los
ingredientes de origen animal si no se someten a esterilización (por ejemplo, suero fetal bovino, albúmina bovina
o tripsina), y en cada lote del producto final antes de su aprobación.
En el CFR Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la Farmacopea europea o en
este Manual se han publicado los procedimientos de las pruebas de pureza para la detección de virus, bacterias,
micoplasma y hongos extraños, incluyendo, por ejemplo, la Salmonella, la Brucella, los agentes clamidiales, los
virus hemoaglutinantes, la leucosis linfoide aviar, los patógenos detectados mediante una prueba de inoculación
en embriones de pollo, la coriomeningitis linfocítica, los agentes citopáticos y hemoadsorbentes, y los patógenos
detectados por el enzimoinmunoensayo, la reacción en cadena de la polimerasa o la técnica del anticuerpo
fluorescente. Debería prestarse mucha atención, acompañando la documentación pertinente, a los
procedimientos utilizados para asegurarse de que el suero fetal bovino y otros ingredientes de origen bovino
están libres de pestivirus. Las pruebas que se van a utilizar para asegurar la pureza varían según la naturaleza
del producto y deben especificarse en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de
fabricación. Puesto que no se han desarrollado pruebas para la detección de la encefalopatía espongiforme
bovina en ingredientes de origen animal, los fabricantes de vacunas deberían documentar en el perfil de
producción o SOPs las medidas tomadas para minimizar el riesgo de dicha contaminación en ingredientes de
origen animal, tales como: verificación de que todos los ingredientes de origen animal del establecimiento de
producción provienen de países que están libres de la encefalopatía espongiforme bovina.
OTRAS PRUEBAS
Dependiendo de la forma en la que se fabrique la vacuna, se puede sugerir la realización de ciertas pruebas que
deberán especificarse como pertinentes en el perfil de producción o en otra documentación del proceso de
fabricación. Estas pruebas pueden relacionarse con el nivel de humedad que hay en los productos desecados, el
nivel residual de inactivación de los productos muertos, la inactivación completa de los productos muertos, el pH,
el nivel de conservantes y antibióticos permitido, la estabilidad física de los adyuvantes, la retención del vacío en
los productos desecados y un examen físico general de la vacuna final. Las pruebas para estos objetivos se
pueden también encontrar en el CFR Título 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unión Europea, en la
Farmacopea europea o en este Manual.
MUESTREO
Las muestras deben seleccionarse de cada lote del producto. El seleccionador elegirá envases finales
representativos de cada lote y los almacenará a la temperatura de almacenamiento recomendada en la etiqueta.
El fabricante guardará estas muestras de reserva a la temperatura de almacenamiento recomendada durante
6 meses después de la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta, de forma que estén disponibles para
facilitar la evaluación de la causa de cualquier problema de campo que se presente por el uso de la vacuna. Las
muestras deberían guardarse en una zona de almacenaje segura.
ETIQUETADO
Los estándares para el etiquetado de los productos variarán de un país a otro; sin embargo, las indicaciones de
la etiqueta y todas las afirmaciones que se hacen en ésta deberán estar respaldadas por datos relevantes que
hayan sido revisados y aprobados por las autoridades competentes. Se recomienda que todas las etiquetas para
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
69
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
las vacunas veterinarias contengan la siguiente información, aunque en el caso de los envases muy pequeños,
sus etiquetas remitan a la etiqueta del envase o a un prospecto adjunto para la información menos importante:
1.
Denominación exacta del producto, con letras visibles y con igual énfasis en cada letra.
2.
Nombre y dirección del fabricante (y también del importador en el caso de los productos importados).
3.
Temperatura de almacenamiento recomendada.
4.
Una declaración de que el producto es “para uso exclusivo veterinario (o animal)”. Instrucciones de uso
completas, incluyendo todas las advertencias requeridas.
5.
En el caso de los animales destinadas a la alimentación, una declaración indicando que los animales no
deberán ser vacunados dentro de un número específico de días antes del sacrificio. Esto dependerá de
las vacunas (por ejemplo, el tipo de adyuvante) y no se requiere para todos los productos.
6.
Fecha de caducidad.
7.
Número de lote por el que se identifica el producto en el registro de fabricación del productor.
8.
Número de autorización del producto. En algunos países se sustituye por el número de licencia del
establecimiento o del fabricante.
9.
Cantidad recuperable y número de dosis.
10.
Declaración de que el contenido total de un vial multidosis se usará cuando se abra éste por primera vez
(o con un tiempo de almacenamiento temporal adecuado para ciertos productos, cuando esté respaldado
por los datos) y que las porciones no utilizadas deberán eliminarse de forma adecuada.
11.
Una advertencia de seguridad para el operador, si se considera oportuno, en el caso, por ejemplo, de una
autoinyección accidental con la emulsión de aceite de las vacunas.
12.
Cuando se añade un antibiótico a una vacuna durante el proceso de producción, en el cartón o embalaje
utilizados debe figurar la expresión “Contiene (nombre del antibiótico) como conservante” u otra similar. Si
no se utiliza cartón, esa información debe aparecer en la etiqueta del recipiente final.
Las etiquetas pueden incluir también otras declaraciones objetivas que no sean falsas o engañosas. También
deben indicar, siempre que sea procedente, las restricciones especiales con relación al empleo o manejo del
producto.
También se facilitará información similar en una hoja de datos del producto que se proporciona como un
prospecto. Ésta contendrá también muchos más detalles sobre el método de empleo y las posibles reacciones
adversas.
PRUEBAS DE CAMPO (INOCUIDAD Y EFICACIA)
Todos los productos biológicos veterinarios administrados a animales deberán probarse en cuanto a su inocuidad
y a su eficacia en el campo, si es posible, utilizando las buenas prácticas clínicas antes de su autorización para
uso general. Los estudios de campo están diseñados para demostrar la eficacia en las condiciones de trabajo, y
para detectar reacciones inesperadas, incluida la mortalidad, que pueden no haberse observado durante el
desarrollo del producto. En las condiciones de campo, hay muchas variables incontroladas que hacen difícil
obtener buenos datos de eficacia, pero la demostración de inocuidad es más fiable. Las pruebas se deben hacer
en el organismo hospedador y en diferentes zonas geográficas, utilizando grandes cantidades de animales
susceptibles. Los animales en estudio deben representar todas las edades y prácticas de cría para los que está
indicado el producto. Deben incluirse controles sin vacunar. Se deben analizar uno o más lotes de producción.
Se debe desarrollar un protocolo que indique los métodos de observación y de registro.
INSPECCIÓN DE LAS INSTALACIONES DE PRODUCCIÓN
Los establecimientos que están autorizados para producir biológicos veterinarios deben estar sometidos a
inspecciones minuciosas de todo el local por parte de las autoridades competentes nacionales que garanticen la
conformidad con el perfil de producción y los planos generales y las leyendas, los POE u otra documentación del
proceso de fabricación. Estas inspecciones pueden incluir asuntos como las cualificaciones del personal; el
mantenimiento de un registro; las condiciones de salubridad general y estándares de laboratorio; las actividades
de investigación sobre los productos que se están desarrollando; los procedimientos de producción; el
funcionamiento de los esterilizadores, pasteurizadores, incubadores y refrigeradores; el envasado; la desecación;
y los procedimientos de acabado; el cuidado y control de los animales; los procedimientos de análisis; la
distribución y la comercialización; y la destrucción del producto. Es deseable que tengan prácticas correctas de
70
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
fabricación (para la fabricación) y prácticas correctas de laboratorio (para el análisis de la garantía de calidad).
(Véase el Capítulo I.1.2 para las directrices).
Los inspectores prepararán un informe detallado documentando los hallazgos de la inspección y planteando las
medidas que el establecimiento debe tomar para mejorar los procesos de producción. El establecimiento debe
recibir una copia del informe. Se deberá realizar una inspección complementaria cuando sea necesario, con el fin
de determinar si se han tomado las medidas apropiadas para corregir las deficiencias. Se necesita una
evaluación continuada para garantizar que las instalaciones de producción continúan operativas de una forma
aceptable. Las inspecciones periódicas también fomentan las mejoras continuas en los procedimientos de
producción y las instalaciones son coherentes con los avances de la tecnología.
CONTROL PREVIO A LA COMERCIALIZACIÓN
Antes de la aprobación, el fabricante debe comprobar cada lote en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia así
como realizar otra serie de pruebas para ese producto, detalladas en el perfil de producción de la compañía o en
otra documentación del proceso de producción. En los países que tienen programas nacionales reguladores, que
incluyen comprobar los análisis del producto final, muestras de cada lote deben remitirse para su análisis en los
laboratorios gubernamentales por parte de las autoridades competentes. Si se obtienen resultados no
satisfactorios en las pruebas realizadas bien por el fabricante o por las autoridades competentes, el lote no debe
aprobarse. En tales casos, se debe dar prioridad para la comprobación de los análisis de los sucesivos lotes del
producto por las autoridades competentes.
ACTUALIZACIÓN DEL PERFIL DE PRODUCCIÓN
Antes de cambiar los procedimientos de producción, debe cambiarse el correspondiente perfil de producción u
otra documentación del proceso de producción. Los establecimientos deberán tener procedimientos internos de
revisión para evaluar todos los cambios en la producción antes de que se inicien tales cambios. Los cambios
deberán ser también revisados y aprobados por las autoridades competentes antes de su ejecución. En los
casos en los que se altere una etapa significativa de la producción, las revisiones pueden requerir datos
adicionales que respalden la pureza, inocuidad, potencia, y/o eficacia del producto. En los países con programas
reguladores que incluyen la comprobación de los análisis del producto final en los laboratorios nacionales, las
revisiones deberán implicar el análisis del nuevo producto por parte de las autoridades competentes.
SEGUIMIENTO DE LA EFICACIA
Debe pedirse a los fabricantes que mantengan un sistema de notificación de reacciones adversas y un
mecanismo eficaz para la pronta retirada del producto, que se someterá a la auditoria. En muchos países el
fabricante debe notificar inmediatamente todas las reacciones adversas a la autoridad reguladora, junto con la
medida correctiva tomada. Una alternativa utilizada en muchos países es que si en algún momento surgen
indicaciones o interrogantes sobre la pureza, inocuidad, potencia o eficacia del producto, o parece que puede
haber algún problema relativo a la preparación, ensayo o distribución del producto, el fabricante debe comunicar
de inmediato a la autoridad reguladora tales circunstancias y las medidas que se han tomado.
Después de la aprobación de comercialización de un producto, las autoridades competentes deben hacer un
seguimiento de la eficacia bajo las condiciones de campo. Las quejas del consumidor pueden servir como fuente
de información; sin embargo, dicha información tiene que ser investigada para determinar si las observaciones
de las que se informa se relacionan con el uso del producto. Se debe informar a los usuarios de las vacunas
veterinarias de los procedimientos adecuados para hacer las reclamaciones. Las autoridades competentes
deben informar al fabricante del producto de todas las reclamaciones recibidas. Deben confirmar también si han
recibido otras reclamaciones relacionadas con dicho producto y, de ser así, si el fabricante ha tomado las
mediadas oportunas. Si es necesario, los laboratorios de control pueden analizar muestras del lote del producto
implicado.
Cuando la investigación esté completa, debe prepararse un informe final y debe enviarse un resumen de los
hallazgos al reclamante y al fabricante. Cuando se determine que un producto está causando graves problemas,
deben tomarse medidas urgentes para retirar el producto del mercado y notificarlo a las autoridades de sanidad
animal.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
CUMPLIMIENTO
Los programas nacionales establecidos para garantizar la calidad, la inocuidad, la potencia y la eficacia de las
vacunas veterinarias deben tener la autoridad legal suficiente para garantizar el cumplimiento de las condiciones
de registro del producto y otros requisitos del programa. El objetivo debe ser conseguir un cumplimiento
voluntario de los requisitos reguladores establecidos. Sin embargo, cuando aquéllos se incumplen, las
autoridades competentes deben tener la autoridad legal suficiente para proteger la salud animal. Puede resultar
inestimable para este propósito el que haya una autoridad para la retención, incautación y expropiación de los
productos que se consideren inútiles, contaminados, peligrosos o dañinos. Al amparo de dicha autoridad, el
producto puede ser retenido por un tiempo, y si durante el mismo no se logra el cumplimiento de los requisitos,
las autoridades competentes pueden solicitar un mandato judicial o un auto de incautación y expropiación.
También tendrá que haber una autoridad que pueda retirar o suspender la licencia del establecimiento y/o la
licencia del producto y que pueda obtener un requerimiento judicial para detener la venta del producto. También
pueden ser necesarias las multas administrativas o el enjuiciamiento penal en caso de incumplimientos graves y
deliberados.
AUTORIZACIÓN DE PRODUCTOS OBTENIDOS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA
Los recientes avances en biotecnología han hecho posible el desarrollo y la comercialización de nuevos
productos biológicos con propiedades antigénicas y diagnósticas. Muchos de tales productos han sido
autorizados y aprobados, y muchos están siendo elaborados. Los productos de la tecnología del ADN
recombinante no se diferencian básicamente de los productos convencionales. Por lo tanto, las leyes y
regulaciones existentes son aplicables en su totalidad a estos nuevos productos.
CLASIFICACIÓN DE LAS VACUNAS OBTENIDAS MEDIANTE BIOTECNOLOGÍA
Cada autoridad competente con capacidad para regular organismos y productos obtenidos por las técnicas
recombinantes debe garantizar que la salud pública y el medio ambiente están protegidos de cualquier efecto
potencialmente perjudicial. Con el propósito de evaluar las solicitudes de licencia, las vacunas veterinarias
obtenidas mediante la tecnología de ADNr pueden dividirse en tres grandes categorías. La división se basa en
las propiedades biológicas de los productos y en los problemas de seguridad que presentan.
La Categoría I está formada por los productos no viables o muertos que no representan un riesgo para el medio
ambiente y no presentan problemas de seguridad nuevos o inusuales. Dichos productos incluyen
microorganismos inactivados, ya sean completos o como subunidades, creados mediante la utilización de
técnicas de ADNr.
Los productos de la Categoría II contienen microorganismos vivos modificados mediante la inserción o
eliminación de uno o más genes. Los genes añadidos pueden codificar antígenos marcadores, enzimas u otros
subproductos bioquímicos. Los genes eliminados pueden codificar la virulencia, la oncogenicidad, los
marcadores antigénicos, las enzimas u otros subproductos bioquímicos. La solicitud de autorización debe incluir
una caracterización de los segmentos de ADN añadidos o eliminados, así como una caracterización fenotípica
del organismo alterado. Las modificaciones genéticas no deben repercutir en un aumento de la virulencia,
patogenicidad o supervivencia del organismo alterado en comparación con la forma de tipo silvestre. Es
importante que la modificación genética no produzca el deterioro de las características de inocuidad del
organismo.
Los productos de la Categoría III hacen uso de vectores vivos para transportar genes foráneos, obtenidos por
tecnología recombinante, que codifican antígenos inmunizantes. Los vectores vivos pueden llevar uno o más
genes foráneos que se ha demostrado que son eficaces para la inmunización de animales hospedadores diana.
El uso de vacunas de ADN que contienen genes foráneos, obtenidos por técnicas recombinantes, que codifican
agentes inmunizantes (vacunas de ADN plasmídico) constituye un nuevo enfoque para el desarrollo de vacunas.
La clasificación adecuada de este tipo de producto de ADNr se establecerá conforme se determinen las
propiedades biológicas y sus características inocuas. Estas nuevas vacunas pueden tener aplicación en una
variedad de situaciones mucho más amplia que los productos convencionales. Las directrices para el desarrollo,
producción, caracterización, y control de estos nuevos productos todavía son preliminares y están sujetas a
cambio a medida que se adquieren nuevos datos y conocimientos. La información relacionada con las ideas
actuales sobre las directrices reguladoras para las vacunas de ADN plasmídico se pueden encontrar en Internet
en las siguientes direcciones: http://www.fda.gov/cber/points.htm; http://www.cba.unige.it/VL/bio-info.html;
http://www.orcbs.msu.edu/biological/biolsaf.htm; http://www.pestlaw.com/index.html.
72
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
AUTORIZACIÓN DE PRODUCTOS DE ADNr VIVOS
La producción de vacunas de ADNr y de ADN plasmídico vivas (Categorías II y III) para pruebas de campo o
para la distribución general como un producto aprobado o autorizado puede tener un efecto importante en la
calidad del medio ambiente humano. Antes de que se autorice la producción, los fabricantes de la vacuna deben
realizar una evaluación de riesgos para valorar el impacto sobre el medio ambiente humano. En EE.UU., por
ejemplo, se ha adoptado un procedimiento que podría utilizarse como un sistema modelo en otros países. La
Unión Europea ha adoptado un sistema similar. El procedimiento en cuestión se realiza de la siguiente forma:
La evaluación de riesgos que se lleve a cabo debe contener la siguiente información: el objetivo y la necesidad
de la acción propuesta, las alternativas consideradas, una lista de las agencias gubernamentales, las
organizaciones y personas consultadas, y las consecuencias para el medio ambiente afectado y para el medio
ambiente potencial. Deben incluirse los siguientes temas: las características del organismo vacunal, los riesgos
para la salud humana, los riesgos para la salud de los animales diana y de los que no lo son, la persistencia en el
medio ambiente y el aumento de la virulencia.
Si la evaluación de los riesgos por parte de las autoridades competentes demostrase que la referida liberación al
medio ambiente de la vacuna recombinante destinada a ensayos de campo o a su distribución general, no tiene
un impacto significativo sobre el medio ambiente, deberá publicarse un anuncio y distribuirse al público dando a
conocer esto y que la evaluación de riesgos y los hallazgos están a disposición del público para su revisión y
comentario. Si no se reciben comentarios de peso que refuten los hallazgos, las autoridades competentes
pueden autorizar las pruebas de campo o conceder la licencia o la aprobación para su distribución general.
La preparación de una evaluación de riesgos y los hallazgos hechos a partir de la misma pueden incluir también
la organización de una o más reuniones públicas, si una acción propuesta tiene trascendencia ecológica o
pública. Tales reuniones deben comunicarse a través de un anuncio público. Se invitará a las personas
interesadas junto con el fabricante del producto y el personal del gobierno para que hagan propuestas. Las
transcripciones de dichas reuniones deben formar parte del archivo público.
Si en el desarrollo de una evaluación de riesgos, las autoridades competentes concluyen que la acción propuesta
puede tener un efecto importante en el medio ambiente humano, debe prepararse una Declaración de Impacto
Ambiental, DIA (Environmental Impact Statement, EIS). Dicha Declaración ofrece un debate detallado e imparcial
de los impactos medioambientales significativos e informa a las personas que toman decisiones y al público de
las alternativas razonables que evitarían o minimizarían los impactos adversos. (Los documentos
medioambientales se consideran en el CFR Título 40 parte 1508). Véanse también las Directivas 90/219/CEE y
90/220/CEE de la Unión Europea.
LECTURAS ADICIONALES
Los siguientes textos sugeridos contienen directrices sobre distintos aspectos de la producción de vacunas.
A.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1999) The Rules Governing Medicinal Products in the
European Union. Eudralex. Volumes IV–IX. Office Publications of the European Communities, 1999,
Luxembourg. See also EU Directives: 90/219/EEC 90/220/EEC and 92/18/EEC.
B.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Fourth Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France.
C.
ESPESETH D.A. (1993). Licensing Veterinary Biologics in the United States. The First Steps Towards an
International Harmonization of Veterinary Biologicals; and Free circulation of vaccines within the EEC.
Dev. Biol. Stand., 79, 17–25.
D.
ESPESETH D.A. & GOODMAN J.B. (1993). Chapter 13. In: Licensing and Regulation in the USA. Vaccines for
Veterinary Application. Butterworth Heinemann, London, UK, 321–342.
E.
GAY C.G. & ROTH H.J. (1994). Confirming the safety characteristics of recombinant vectors used in
veterinary medicine: a regulatory perspective. Recombinant vectors in vaccine development. Dev. Biol.
Stand., 82, 93–105.
F.
ROTH H.J. & GAY C.G. (1996). Specific safety requirements for products derived from biotechnology. In:
Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elseviers Science
Publishers B.V. Amsterdam, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
73
Capítulo I.1.7. — Principios de producción de vacunas veterinarias
G.
PASTORET P.P., BLANCOU J., VANNIER P. & VERSCHUEREN C.,
Science, Amsterdam, The Netherlands.
H.
UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (2000). Code of Federal Regulations, Title 9, Parts 1–
199. US Government Printing Office, Washington DC, USA.
I.
USDA-APHIS -VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Categories of Inspection
for Licensed Veterinary Biologics Establishments. Veterinary Services Memorandum No. 800.91. Center
th
for Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
J.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Veterinary Biological
Product Samples. Veterinary Services Memorandum No. 800.59. Center for Veterinary Biologics, 510 S.
th
17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
K.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Guidelines for Submission
of Materials in Support of Licensure. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.84. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
L.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Veterinary Biologics
General Licensing Considerations No. 800.200, Efficacy Studies. USDA-APHIS-Veterinary Biologics, 4700
River Road, Riverdale, Maryland 20737, USA.
M.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Veterinary Biologics
General Licensing Considerations No. 800.201, Back Passage Studies. Center for Veterinary Biologics,
th
510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
N.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES (1964–1994). Standard Assay Methods, Series 100–900. National
Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa 50010, USA.
O.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1984). Basic License
Requirements for Applicants. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.50. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA
P.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1988). Guidelines for the
Preparation and Review of Labeling Materials. Veterinary Services Memorandum No. 800.54. Center for
th
Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
EDS
(1997). Veterinary Vaccinology. Elsevier
1
*
* *
1
74
United States Department of Agriculture (USDA), Animal and Plant Health Inspection Services (APHIS). USDA-APHISCENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS HOME PAGE: http://www.aphis.usda.gov/vs/cvb/index.html
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO I.1.9.
EL PAPEL DE LOS ORGANISMOS OFICIALES
EN LA REGULACIÓN INTERNACIONAL
DE LOS PRODUCTOS BIOLÓGICOS
DE USO VETERINARIO
RESUMEN
El control oficial de los productos biológicos de uso veterinario está encomendado a varios
organismos nacionales y regionales que garantizan, de formas diferentes, la calidad, la inocuidad y
la eficacia de los productos La armonización internacional de las normas relativas a los productos
biológicos no comenzó hasta bastante después de la normativa relativa a los productos químicos.
Los primeros productos biológicos de uso veterinario no se fabricaron ni se distribuyeron hasta
finales del siglo XIX. Dichos productos se elaboraban de forma poco sofisticada y se distribuían sin
más control que el de los propios fabricantes. Mas tarde, cada fabricante desarrolló sus propios
estándares. En Europa, ya en 1895, el Estado controlaba los estándares de ciertos productos de
diagnóstico (por ejemplo, la maleína y la tuberculina) y los de las vacunas. Poco a poco se fueron
desarrollando las condiciones para la armonización internacional, comenzando con la pruebas para
la comparación de productos, proporcionadas por diferentes laboratorios europeos. Hasta la
segunda mitad del siglo XX, no se establecieron leyes de ámbito nacional para la regulación de los
productos biológicos de uso veterinario. En ellas se exigía la aplicación de técnicas muy precisas
antes de la concesión de licencias para los productos biológicos de uso veterinario. A dichas leyes
les siguieron notables esfuerzos para la armonización de esas normas nacionales, primero a nivel
regional, particularmente en Europa y América, y luego a nivel global, especialmente por parte de
la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), con la publicación en 1989 de la primera edición del
Manual de Normas para las Pruebas de Diagnóstico y las Vacunas por parte de la OIE.
La armonización a nivel mundial de estándares para los productos biológicos de uso veterinario
será de gran ayuda para los veterinarios oficiales jefes, que deben seguir las instrucciones dadas
en el Código Zoosanitario Internacional de la OIE, instrucciones que son aplicables a todos los
productos biológicos utilizados en el comercio internacional. También será de ayuda para los
productores de vacunas que han expresado el deseo de una armonización de las normas de
registro a nivel mundial, con el fin de simplificar y facilitar la comercialización de sus productos.
Evidentemente, eso también interesa a los agricultores y consumidores, quienes se beneficiarán
del hecho de que la inocuidad y eficacia de los productos por ellos utilizados se garanticen de
forma uniforme al más alto nivel.
En las diferentes secciones de este capítulo se revisarán y compararán las normativas de las
regiones del mundo que han realizado mayores progresos en este campo, y se describirán los
intentos actuales para la armonización de estas normativas a escala internacional.
Nota: En este capítulo el término "productos biológicos de uso veterinario", incluirá las vacunas y
antisueros para uso animal, y las preparaciones “in vivo” para diagnósticos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
99
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
A. NORMATIVA PARA LOS PRODUCTOS BIOLÓGICOS DE USO VETERINARIO.
SITUACIÓN ACTUAL
1.
En Japón
1.1. Introducción
Los productos medicinales de uso exclusivo en animales, incluidos los productos biológicos de uso veterinario,
están bajo la jurisdicción del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. La garantía de calidad, eficacia y
inocuidad está estipulada en la Ley de Asuntos Farmacéuticos (1). Desde 1972 se han ido desarrollando los
procedimientos para el registro de dichos productos, con el objeto de racionalizar los procedimientos de
supervisión y facilitar la obtención de su autorización. Dichos procedimientos están estipulados en la Ley de
Asuntos Farmacéuticos y otras normativas afines. En consecuencia, se ha conseguido un procedimiento de
supervisión simple y rápida, poniendo énfasis en garantizar la calidad, inocuidad y eficacia de tales productos. La
Comisión para la Seguridad Alimentaria se estableció dentro de la Oficina del Gabinete del Gobierno de Japón
en julio de 2003. Tratándose de inspecciones, reinspecciones y reevaluaciones para la aprobación, todas las
vacunas de uso veterinario, excepto los productos destinados a perros y gatos, deben cumplir con lo exigido en
la Ley Básica de Seguridad Alimentaria de la Comisión de Seguridad Alimentaria.
1.2. Normas que regulan la autorización y garantizan la calidad de los productos biológicos de uso
veterinario
a)
Solicitud de autorización y licencia
Quienes deseen fabricar o importar productos biológicos de uso veterinario deben cumplimentar una
solicitud usando el formato indicado para cada producto y obtener la aprobación del Ministerio de
Agricultura, Bosques y Pesca. La solicitud se deberá presentar acompañada de los documentos
relacionados en la misma, tales como los relativos a estudios clínicos. De entre estos últimos, los estudios
sobre seguridad y los estudios clínicos en los que se usan las especies objeto de estudio, se deben llevar a
cabo de conformidad con la "Buena Práctica de Laboratorio" (Good Laboratory Practice, GLP) y con la
"Buena Práctica Clínica" (Good Clinical Practice, GCP).
La licencia para fabricar, o para importar y vender productos biológicos de uso veterinario, la expide el
Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca a cada solicitante y debe renovarse cada 5 años. La
conformidad con la "Buena Práctica de Fabricación" (Good Manufacturing Practice, GMP) se considera
como una de las condiciones necesarias para obtener la licencia de fabricación.
b)
Pruebas a nivel nacional
Después de recibir una licencia, cada lote de productos biológicos de uso veterinario debe ser examinado
por el Laboratorio Nacional de Pruebas Veterinarias, de acuerdo con los procedimientos del Estándar de
Pruebas para Productos Biológicos de Uso Veterinario (3, 9). Cada producto destinado a la
comercialización ha de llevar en el contenedor o embalaje un sello oficial de identificación en forma de
precinto.
c)
Nuevo examen y nueva evaluación
A los productos biológicos de uso veterinario recién autorizados, se les realiza un nuevo control. Por lo
general, después de la autorización inicial de la vacuna, se realiza un estudio de campo del medicamento
por un período de 6 años. Durante ese período se evalúan de nuevo la eficacia y la seguridad del producto.
La evaluación se realiza sobre los productos disponibles en el mercado que hayan sido autorizados por
orden del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. Debe seguirse ese procedimiento cuando se
sospeche que un producto biológico de uso veterinario no cumple con los últimos estándares vigentes.
d)
Requisitos mínimos que deben reunir los productos biológicos de uso veterinario
Los controles proporcionan información sobre la consistencia del proceso de fabricación y la calidad del
producto: métodos de fabricación, propiedades de las cepas utilizadas en la fabricación, métodos de control
de calidad, métodos de almacenamiento y fechas de caducidad, de acuerdo con los estándares
100
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.9.
— El Papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
establecidos en los "Requisitos Mínimos Exigidos para los Productos Biológicos de Uso Veterinario" (2). No
se puede fabricar, importar ni comercializar ningún producto que no cumpla con esos estándares.
e)
Casos en los que se deniega la autorización
Cuando la calidad del producto que se somete a aprobación no es satisfactoria o sus efectos negativos
destacan sobre los previstos en las indicaciones, se considera que el producto es de poco valor y, por lo
tanto, no se autoriza.
f)
Cancelación de autorizaciones
A la hora de conceder la autorización para fabricar o importar un producto, se examinan cuidadosamente la
calidad, inocuidad y eficacia del mismo de acuerdo con las últimas tecnologías disponibles. No obstante, si
los avances científicos realizados desde la concesión de la autorización indicasen que podría existir un
riesgo para la salud asociado a la utilización del producto, se realizarán un nuevo examen y evaluación y
podrá emitirse una orden de cancelación de la autorización.
1.3. Procedimiento para autorizar la fabricación (o importación)
Los criterios más importantes a tener en cuenta cuando se quiere fabricar o importar un producto, como, por
ejemplo, una vacuna de uso veterinario, son la calidad, la seguridad y la eficacia del producto. No es necesaria
una licencia para cada una de las instalaciones. Basta con una autorización para cada producto, incluso si el
fabricante va a fabricar (o importar) en más de una instalación. También es posible solicitar, de forma simultánea,
la aprobación de la calidad de un producto y la licencia para su fabricación.
Cuando un fabricante (o importador o distribuidor), fabrica (o importa) productos biológicos de uso veterinario,
debe presentar en un documento oficial la solicitud de autorización para fabricar (o importar) dichos
medicamentos a la persona encargada de medicamento veterinarios en el Departamento de Industria Cárnica de
cada Prefectura. Si la documentación es correcta, la solicitud para fabricar (o importar), junto con los documentos
que la acompañan, se envía para su revisión a la Oficina del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. En ese
momento puede realizarse una consulta o audiencia, si se considera necesario. A continuación se estudia la
solicitud en el Consejo Central de Asuntos Farmacéuticos, y si no se encuentra ningún problema, se envía al
solicitante una notificación de aprobación para fabricar (o importar) el producto veterinario.
2.
En la Unión Europea
2.1. Introducción
La legislación farmacéutica de la Unión Europea (UE), que ha ido evolucionando a lo largo de 30 años, trata de
los medicamentos de uso humano y de uso animal. La armonización de los requisitos en el área de
medicamentos de uso veterinario se inició en 1981 con la adopción de las Directivas 81/851/EEC y 81/852/EEC,
en las que se fijan requisitos comunes para la autorización de fabricación y comercialización basada en la
evaluación de la calidad, la seguridad y la eficacia del producto. Estas directrices, así como la legislación
posterior sobre productos farmacéuticos de uso veterinario y humano, se consolidaron en la Directriz 2001/82/EC
y 2001/83/EC reguladoras, respectivamente, de los productos de uso veterinario y humano. En 1994 se
publicaron una serie de directrices detalladas bajo el título "Normas que regulan los medicamentos en la Unión
Europea" (7). Estas directrices se han actualizado y describen en detalle las bases legales para la obtención de
autorizaciones de comercialización, así como la forma de compilación y evaluación de los expedientes. Estas
normas sirven como publicaciones de referencia de gran utilidad para cualquier autoridad que vaya a instaurar un
sistema de autorización de productos biológicos de uso veterinario. Las normas fueron formalmente adoptadas y
aplicadas específicamente a los productos biológicos de uso veterinario a partir de 1993. Se tomaron muchas
medidas adicionales para avanzar en la armonización de los procedimientos y criterios de evaluación de
medicamentos de uso veterinario, tales como los requisitos marco y las pautas interpretativas para su
experimentación, los principios y las directrices de la "Buena Práctica Médica" (GMP), y el procedimiento
utilizado por la Comunidad para la evaluación de productos de alta tecnología. Sin embargo, la concesión de
autorizaciones seguía siendo prerrogativa de los diferentes estados. Como consecuencia, aunque las solicitudes
se evaluaban en base a esos criterios y procedimientos de armonización, y, en algunos casos, de forma
simultánea por las autoridades de los estados miembros, había discrepancias en las decisiones tomadas por
dichos estados en torno a un mismo producto. Debido a lo anterior, en 1990 la Comisión propuso un nuevo
sistema para la comercialización de medicamentos, que fue adoptada por el Consejo de Ministros en 1993 y
entró en vigor el 1 de enero de 1995.
Una de las primeras consecuencias fue la creación en Londres (Reino Unido), de la Agencia Europea de
Evaluación de Medicamentos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
101
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
2.2. El papel de la Agencia Europea de Evaluación de Medicamentos (EMEA)
En 1995 entró en vigor un nuevo sistema para la autorización de medicamentos. Después de 10 años de
cooperación entre las autoridades de registro nacionales, a nivel de la Unión Europea, y después de 4 años de
negociaciones, el Consejo de la Unión Europea adoptó en junio de 1993 tres directrices y una regulación, que
juntas constituyen la base legal del sistema. (5)
La EMEA fue fundada por Regulación del Consejo 2309/93/EEC del 22 de julio de 1993. (OJ No. L214,
24.8.1993), y Londres, en el Reino Unido, fue elegida como su sede por decisión de los Jefes de Estado y de
Gobierno el 29 de Octubre de 1993. Esta agencia formula opiniones y además del personal administrativo y de la
junta directiva, está compuesta por dos comités científicos, el Comité para la Propiedad de los Productos
Medicinales (CPMP), encargado de los medicamentos para los humanos y el Comité para los Productos
Medicinales de Uso Veterinario (CVMP), que se encarga de los medicamentos y otros productos de uso animal.
El CVPM es el responsable de la evaluación de las solicitudes para la comercialización de productos derivados
de la biotecnología, de los intensificadores de productividad, de las nuevas sustancias químicas y de otros
productos nuevos de carácter innovador. Además, el CVPM ofrece recomendaciones relacionadas con los
Límites Máximos de Residuos (MRLs) para las sustancias utilizadas en la producción de alimentos para
animales. Para apoyar estas actividades, el CVMP cuenta con un grupo de 400 expertos puestos a disposición
de la agencia por los estados miembros de la Unión Europea. Estos expertos pueden participar en cualquiera de
los grupos de trabajo del CVMP. Entre los grupos de trabajo, el Grupo de Trabajo para las Sustancias
Inmunológicas (CVMP/IWP), tiene un doble mandato: asistir al CVMP, si es necesario, examinando, en nombre
del Coordinador de Asesoramiento Científico del CVMP, en parte o en todo, cualquier consulta sobre
asesoramiento científico hecha por una compañía durante el desarrollo de una nueva vacuna, y asesorando al
CVMP en asuntos de política más general tales como la elaboración y revisión de las directrices relativas a los
productos inmunológicos. Las directrices generales para las pruebas de los medicamentos de uso veterinario
están contenidas en "Las Reglas que Regulan los Medicamentos en la Unión Europea", cuya última publicación
por la Unión Europea data de 1999 (7). Las directrices nuevas y las revisiones de las directrices antiguas ya no
se publican en documento impreso, pudiéndose acceder a ellas en la página Web de EMEA, www.emea.eu.int
y/o la página Web de DG Enterprise www.pharmacos.org.
2.3. Procedimientos Europeos actuales para autorizar la comercialización
A partir de 1995, empezaron a estar disponibles, a través de la Unión Europea, dos nuevos tipos de
procedimiento de registro de medicamentos de uso humano y de uso animal: el procedimiento centralizado y el
procedimiento descentralizado (12).
a)
El procedimiento centralizado
Este procedimiento se aplica a productos de alta tecnología definidos en el Anexo a la Regulación del
Consejo 2309/93. Es obligatorio para algunos productos ("Parte A”: ciertos productos biotecnológicos y
promotores de crecimiento nuevos), y opcional para otros ("Parte B": otros productos innovadores). La
valoración está coordinada por uno de los miembros del CVMP, conocido como el "Ponente", bajo contrato
con la EMEA. Las exigencias y los criterios relativos a los datos son los mismos que se utilizan en los
procedimientos nacionales. Por consiguiente, la autorización la emite la Comisión, y es válida en todos los
estados miembros de la comunidad. Sin embargo en el caso de vacunas veterinarias, uno o más de los
estados miembros pueden prohibir el uso de la vacuna, bien sea debido a la ausencia de infección en su
territorio, o bien porque se ha implantado un programa de erradicación en su territorio, tal como lo certifican
las autoridades competentes.
b)
El procedimiento descentralizado
Las solicitudes para la autorización de un producto pueden aún resolverse en un único estado miembro (el
"Estado Miembro de Referencia"), por medio de un procedimiento nacional. Se aplican las mismas "Normas
que Regulan los Medicamentos en la Unión Europea”). Siguiendo la aprobación del Estado Miembro de
Referencia, las solicitudes pueden dirigirse, si se desea, a otros estados miembros "Interesados" para que
sean concedidas autorizaciones idénticas en base al reconocimiento recíproco. Si otro estado miembro
considera, de manera fundada, que el producto que se va a autorizar constituye un “riesgo para los
animales, la salud pública o el medio ambiente”, dicho estado miembro puede remitir el expediente a la
EMEA para un arbitraje. La Comisión emite una decisión vinculante basada en la opinión del CVMP.
102
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.9.
— El Papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
2.4. Autorización para la fabricación y control de la salida de productos al mercado
De acuerdo con la Directiva 81/85/EEC, también se necesita autorización para la fabricación de medicamentos
de uso veterinario, incluidos los inmunológicos. Esta directiva determina inspecciones regulares y estipula que la
fabricación debe ser supervisada por una "persona cualificada", que certifique que cada partida se ajusta a las
especificaciones aprobadas para ese producto. Para la puesta en práctica de estos requisitos, la Comisión
adoptó la Directiva 91/412/EEC relacionada con el principio y las directrices de la GMP, y publicó una guía
detallada sobre la GMP desarrollada por un grupo de inspectores farmacéuticos de los estados miembros.
Se exige a los fabricantes tener a su disposición una persona cualificada que certifique que cada partida de un
producto ha sido fabricada y controlada de acuerdo con las condiciones exigidas para su comercialización. Este
es un requisito básico de la legislación farmacéutica. En el caso de partidas importadas desde terceros países,
cada partida tiene que someterse, en el primer estado miembro que ha realizado la importación hacia el interior
de la Unión Europea, a un análisis completo de calidad y cantidad de por lo menos los ingredientes activos, bajo
la supervisión de una persona cualificada. Solo cuando dicho análisis se ha llevado a cabo, puede una partida
circular dentro de la Unión Europea sin control posterior. En el caso especial de medicamentos inmunológicos
para uso veterinario, se puede introducir una nueva medida. La Directiva 90/677/E{68} permite a todos aquellos
estados miembros que lo consideren necesario solicitar que muestras de la mayor parte de las partidas
fabricadas y/o de los productos terminados sean sometidos a examen por el laboratorio de control antes de que
dicha partida sea colocada en el mercado. Esta salida oficial de la partida al mercado, no exime de la necesidad
de un control de los lotes por parte de una persona cualificada. Excepto en circunstancias especialmente
justificadas, la comercialización de un producto llevada a cabo por un laboratorio nacional de control, debe ser
reconocida por los otros estados miembros, sin necesidad de repetir dicho proceso. Se ha acordado un
procedimiento administrativo de intercambio de información entre las autoridades competentes, para asegurar
que este procedimiento funcione sin problemas. Aunque no todos los estados miembros exigen la salida al
mercado de una forma oficial de los productos inmunológicos para uso veterinario, todos aceptan su implicación
en este plan de intercambio de información. Están actualmente en curso (año 2000) discusiones para establecer
un sistema armonizado de salida de los productos al mercado en todos los estados miembros de la Unión
Europea. Después de la revisión de la legislación europea sobre medicamentos (revisión de 2001), la Comisión
Europea ha realizado propuestas para introducir enmiendas en dicha legislación y esas propuestas están siendo
estudiadas por el Consejo y el Parlamento Europeos siguiendo el Procedimiento de Co-decisión.
2.5. El Papel de la Farmacopea Europea
En los últimos 30 años se han realizado profundos cambios en la organización y regulación de los medicamentos
en los países europeos. Hace 30 años, cada país tenía sus propias regulaciones, y entre ellos los países
europeos tenían dos tercios de las farmacopeas del mundo. La Convención de la Farmacopea Europea ha sido
firmada ahora por 24 socios: 23 países1 a los que acaba de unirse la Comisión de las Comunidades Europeas;
aunado a esto 10 países europeos y no europeos2 y la Organización Mundial de la Salud (OMS) tienen categoría
de observadores. Se mantienen estrechas relaciones con las autoridades que regulan las licencias en el Área
Económica Europea, donde la integración se desarrolla a través del contacto con el EMEA y la implementación
de directrices comunes y pautas sobre los medicamentos para los humanos y los animales. En 1990 la
Farmacopea Europea junto con la de Japón y la de EE.UU., cofundaron el Grupo de Discusión Farmacopeica
(GDF); este grupo está trabajando asiduamente para la armonización a nivel mundial y participa en la
Conferencia Internacional sobre Armonización de los Requisitos Técnicos para el Programa de Registro de
Medicamentos de Uso Humano. Recientemente, mediante un programa paralelo de medicamentos veterinarios,
la Cooperación Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Medicamentos
Veterinarios (VICH), ha prestado atención a la Armonización de los requisitos para ciertos tipos de prueba
aplicados a agentes extraños (véase sección C.4. más abajo).La Farmacopea Europea define los estándares
mínimos aceptables para los productos que se han de aprobar en la Unión Europea, ya que el cumplimiento de
los monográficos es un requisito obligatorio según la Directriz 2001/82/EC. Esto exige que los productos cumplan
con el monográfico específico pertinente, en los lugares en que éste exista, o con un monográfico general allí
donde no exista uno específico.
La Farmacopea Europea también incluye un departamento llamado "Departamento Europeo para la Calidad de
los Medicamentos" (EDQM). Este departamento crea, mantiene y distribuye los reactivos estándares
internacionales mencionados en las monografías de la Farmacopea Europea. Hasta la fecha hay pocos
1
2
Austria, Bélgica, Chipre, Croacia, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania, Grecia, Islandia, Irlanda, Italia, Luxemburgo,
Holanda, Noruega, Portugal, Eslovenia, España, Suiza. Suecia, Turquía, El Reino Unido y la antigua República Yugoslava
de Macedonia; los estados miembros deben aplicar los estándares de la farmacopea europea.
Albania, Australia, Bulgaria, Canadá, Hungría, la República Checa, la República Popular China, Lituania, Eslovaquia y
Polonia; los estados observadores no tienen que aplicar los estándares de la farmacopea europea, aunque algunos de
ellos aplican dichos estándares de forma voluntaria.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
103
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
estándares para productos biológicos de uso veterinario, pero hay indicios de que el EDQM pretende ser cada
vez más activo en esta área, y puede adelantarse que varios más estarán disponibles en un futuro próximo.
3.
En los Estados Unidos
3.1. Introducción
En EE.UU. los productos biológicos de uso veterinario se definen de forma igual a los virus, sueros, toxinas
(excluyendo las sustancias que son parcialmente tóxicas para los microorganismos, por ejemplo los antibióticos),
o productos análogos en cualquier fase de producción, embarque, distribución o venta, que se pretenda usar en
el tratamiento (prevención, diagnóstico, gestión o cura) de enfermedades de animales y que actúan
fundamentalmente por estimulación directa, complementación, mejora o modulación del sistema inmunológico o
respuesta inmunológica. El término “productos biológicos” incluye, pero no se limita a, vacunas, bacterias,
alérgenos, anticuerpos, antitoxinas, toxoides, inmunoestimulantes, ciertas citoquinas, componentes antigénicos o
inmunizantes de organismos vivos, y componentes de diagnóstico de origen natural o sintético o que derivan de
la síntesis o alteración de varias sustancias o componentes de sustancias tales como microorganismos, genes o
secuencias genéticas, carbohidratos, proteínas, antígenos, alérgenos o anticuerpos.
3.2. Bases Legales
La ley de 1913 sobre Virus, Sueros y Toxinas (Ley VST), modificada por la 21 U.S.C., Secciones 151 a la 159,
proporciona la autoridad legal para la regulación de los productos inmunológicos y biológicos de uso animal en
EE.UU. El programa regulador que implementa los requisitos de la Ley VST lo administra el Centro para
Productos Biológicos de Uso Veterinario (CVB), y el Servicio de Inspección de Salud Animal y de las Plantas
(APHIS) del Departamento de Agricultura de EE.UU. Las regulaciones administrativas debidamente promulgadas
y con efecto de ley, se publican en el Título 9 del Código de Regulaciones Federales, Partes 101 a 118 (6).
Además, el APHIS ha ofrecido asesoramiento sobre noticias del CVB, Memoranda sobre Servicios Veterinarios,
Consideraciones Generales Relacionadas con la Autorización de Productos Biológicos de Uso Veterinario y el
Manual de Programas de Productos Biológicos de Uso Veterinario.
La ley VST exige que los productos por ella regulados y que se incorporen a los canales de comercialización no
sean de poco valor, contaminantes, dañinos o peligrosos. El plan regulador que implementa esos estándares
exigen a los fabricantes de esos productos que soliciten las correspondientes licencias antes de la
comercialización, y obligan a los solicitantes a asumir responsabilidades indiciarias al exigirles que demuestren,
mediante la entrega de cierta información relativa a los datos de la investigación y los resultados de las pruebas,
que sus productos son "puros, seguros, potentes y eficaces". El programa de APHIS para productos
inmunológicos y biológicos de uso animal regula la fabricación de los productos y de su salida al mercado a
través de un sistema de autorización, inspección, verificación y vigilancia post-comercialización, que asegura que
los estándares reguladores y legales se cumplen.
3.3. Licencia e Inspección Inicial
Cualquier persona o empresa que solicita fabricar en EE.UU. productos inmunológicos o biológicos de uso
animal debe obtener del APHIS una licencia para fabricar en una determinada instalación (Licencia para la
instalación), y una licencia para cada uno de los productos que va a fabricar (Licencia del producto). Los
requisitos exigidos para esas licencias se aplican tanto si el producto se va a lanzar en el mercado de EE.UU.
como si se va a exportar al extranjero. Normalmente, el solicitante pedirá de forma simultánea la licencia para la
instalación y la licencia para el primer producto. Una vez haya obtenido las licencias para la instalación el
producto, la empresa que solicita fabricar y comercializar nuevos productos, tendrá que solicitar solamente
licencias para productos adicionales. Una persona o empresa ubicada en el extranjero que solicite comercializar
sus productos en EE.UU., también debe pedir autorización para la comercialización. No obstante, para la
importación de un producto, tan solo se necesita un “permiso” en lugar de una “licencia”.
Para obtener una licencia de instalación, el solicitante deberá someter a aprobación el proyecto (o sea, el plano
arquitectónico del arquitecto) y los planos de las instalaciones con los correspondientes rótulos o anotaciones. El
APHIS revisa esos planos y rótulos para asegurar que la instalación funcionará de acuerdo con la "Buena
Práctica Médica" (GMP). Si el solicitante realiza posteriormente cambios físicos u operacionales en la instalación,
deberá someter a revisión, de forma inmediata, los correspondientes planos y rótulos modificados.
Para obtener una licencia del producto, el solicitante debe establecer la pureza e identidad de todas las semillas
madre y de todas las células madre que se van a usar en la fabricación del producto, y debe someter a
aprobación un esquema detallado de la producción El esquema de producción incluye no sólo los detalles
relacionados con el método de fabricación del producto, sino también una descripción de los procedimientos para
la recogida y presentación de muestras y el lanzamiento de lotes de productos. El solicitante también deberá
suministrar las referencias profesionales y técnicas del personal de la compañía, e identificar a una persona
104
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.9.
— El Papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
cualificada (denominada "enlace gubernamental" por las regulaciones de EE.UU), quien actúa como contacto
oficial con el CVB durante el proceso de obtención de la licencia, y es el responsable de presentar los informes
de las pruebas de la empresa y de la salida al mercado del producto. Al solicitante se le exige que presente datos
de las pruebas que demuestren que el producto fabricado de acuerdo con el plan pertinente es puro, seguro,
potente y eficaz. El solicitante debe presentar a los Laboratorios del CVB muestras de tres lotes consecutivos del
producto, a fin de que puedan confirmarse los resultados de las pruebas del producto realizadas por el
solicitante.
Finalmente, antes de la concesión de las licencias para la instalación y el producto, las instalaciones del
solicitante se someten a una inspección exhaustiva por parte de los inspectores del APHIS. La inspección
asegura que la instalación funciona de acuerdo con la "Buena Práctica Médica" (GMP) mediante la confirmación
de que el establecimiento está construido según los planos y las leyendas; que la línea de producción está
establecida y funciona de acuerdo con el plan de producción aprobado y que los archivos relativos a cada fase
de la producción se guardan y actualizan de forma adecuada. La inspección también confirma que el solicitante
sigue la "Buena Práctica de Laboratorio" (GLP); que el programa relativo a la comprobación del proceso y del
producto final se desarrolla y documenta de forma apropiada; que el muestreo se realiza de forma conveniente y
que se aplican los procedimientos adecuados para determinar y documentar la salida del producto al mercado.
3.4. Inspección después de la concesión de la licencia
Una vez se le han expedido a la empresa las licencias para la instalación y para el producto, el APHIS, realizará
inspecciones rigurosas de seguimiento a las instalaciones de forma rutinaria, para verificar que el titular de la
licencia sigue operando de acuerdo con las normas del programa y según lo estipulado en la licencia. Las
inspecciones que se realizan después de la obtención de la licencia se llevan a cabo sin previo aviso, y
normalmente dentro de los 12-18 meses siguientes a la última inspección. Si el titular de la licencia propone
algún cambio significativo en la instalación o en el método de producción de un producto autorizado, el APHIS se
reserva el derecho a realizar una inspección especial antes de aprobar los cambios.
3.5. Verificación
Cada titular de una licencia es responsable de verificar de forma exhaustiva todos sus procesos de producción y
cada serie (o lote) de cada producto antes de la salida al mercado. El tipo y la cantidad de pruebas requeridas
dependen de cada producto concreto, pero, en cualquier caso, son fijadas y aprobadas por la autoridad
reguladora antes de concederse la licencia del producto. Una persona cualificada empleada por el titular de la
licencia ("enlace gubernamental") se responsabiliza de la selección de las muestras que van a ser verificadas, de
la monitorización del programa de verificación del titular de la licencia y de la certificación de los resultados de la
prueba ante la autoridad reguladora.
Al mismo tiempo que la empresa selecciona sus muestras para la verificación en la propia empresa, también
selecciona las muestras que van a ser presentadas a los laboratorios del CVB. Utilizando un programa para una
selección al azar, el CVB, selecciona un porcentaje de las muestras que se han sometido a pruebas de
confirmación a fin de verificar la adecuación y suficiencia de las pruebas realizadas por el fabricante. La
verificación se realiza para cada serie antes de la autorización de comercialización. Por medio de una regulación,
el CVB está obligado a poner a prueba sus muestras seleccionadas dentro de los 14 días siguientes al recibo de
las mismas; normalmente, las muestras se ponen a prueba antes del límite de los 14 días, de tal forma que, de
hecho, la comprobación de la producción por parte de la empresa y el Programa de Prueba de Competencia del
CVB se llevan a cabo al mismo tiempo.
Cuando la empresa recibe los resultados de sus propias pruebas, el enlace gubernamental presenta esos
resultados a la autoridad reguladora junto con un impreso de lanzamiento de un lote, iniciándose el proceso de
lanzamiento. Si la partida no ha sido seleccionada como parte del Programa de la Prueba de Competencia, o si
ésta ha sido elegida, pero las pruebas del CVB confirman los resultados de las pruebas de la compañía, el
impreso de lanzamiento es refrendado por la autoridad reguladora completando el proceso de lanzamiento. Si las
pruebas de la empresa o las pruebas de competencia indican que la partida puede ser insatisfactoria, dicha
partida no podrá lanzarse.
Si el titular de la licencia hace una propuesta para modificar su instalación o su funcionamiento en forma tal que
ello pudiese afectar de algún modo la pureza, la inocuidad, la potencia o la eficacia del producto, la autoridad
reguladora requerirá al titular de la licencia para que proporcione datos que demuestren la pureza, la inocuidad,
la potencia y la eficacia del producto, y para que entregue a los laboratorios del CVB muestras del producto para
las pruebas confirmatorias.
3.6. Vigilancia después de la salida al mercado
El CVB mantiene un programa de vigilancia para la post-comercialización con el que monitoriza el
comportamiento de los productos en el mercado. Con este programa, el CVB normalmente tiene conocimiento de
algunos problemas relativos a la calidad del producto a través de los informes o quejas de los consumidores,
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
105
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
aunque las regulaciones del programa también obligan al titular de la licencia a informar al CVB de cualquier
problema que llame su atención relacionado con la pureza, inocuidad, y potencia del producto. El CVB tiene
autoridad legal para intervenir en aquellos puntos del mercado donde se presenten problemas serios en relación
con la pureza, inocuidad, potencia y eficacia del producto.
B. COMPARACIÓN DE LAS REGULACIONES DE LA UNIÓN EUROPEA CON LAS DE
LOS ESTADOS UNIDOS
Aunque la Agencia Reguladora supervisa la producción de los productos biológicos de uso veterinario, estos
deben cumplir con ciertos criterios básicos. Estos criterios son:
Œ
Inocuidad: el producto debe ser seguro en las especies-objetivo y, si son vivas, en las especies expuestas a
organismos excretados.
Œ
Eficacia: el producto debe ser efectivo de acuerdo con las propiedades declaradas en la etiqueta.
Œ
Calidad: incluye la pureza, la potencia y la consistencia.
Œ
Pureza: el producto debe estar libre de agentes contaminantes.
Œ
Potencia: cada lote de productos debe formularse y testarse para asegurar la eficacia y reproducibilidad de
la actividad tal como se demuestra en los datos del registro.
Aunque, de forma global, las agencias y regulaciones difieren, todas se esfuerzan por garantizar al consumidor
final que los productos ofrecidos cumplen con esos estándares básicos.
La Unión Europea usa un sistema completo que consiste en una combinación de la GMP, incluyendo procesos y
especificaciones de los materiales validadas, junto con los métodos de producción que garantizan la calidad del
producto final. Los procesos internos y las comprobaciones de los lotes constituyen una garantía adicional de la
calidad de los productos médicos de uso veterinario. En los procesos y en las pruebas de los lotes. Las pruebas
de inocuidad son realizadas siguiendo la “Buena Práctica de Laboratorio”, y las pruebas de eficacia se realizan
siguiendo la “Buena Práctica de Controles” (GCP). Los EE.UU. definen lo que constituye procesos de fabricación
aceptables en el plan de producción y en la descripción detallada de la instalación (planos y rótulos de los
planos), y se apoyan en la inspección y en las pruebas confirmatorias para conseguir el mismo objetivo. Aunque
diferentes, ambos sistemas están diseñados para conseguir que sólo los productos biológicos puros, seguros,
potentes y efectivos sean puestos a la venta.
En la Unión Europea, además de los datos proporcionados por el solicitante, se deben incluir informes de
expertos en el dossier de solicitud de autorización para la comercialización. Cada sección importante del
expediente, incluyendo la analítica, y las relativas la seguridad y la eficacia, debe ser revisada por un experto
independiente. La valoración del experto se incluye en el archivo de autorización de comercialización. El sistema
de revisión por una tercera parte, no existe en el sistema de registro de EE.UU.
Existen diferencias entre los procedimientos utilizados en la Unión Europea y los utilizados en EE.UU. Debería
establecerse, en la medida de lo posible, la armonización de esos dos sistemas, para el reconocimiento de la
equivalencia en las pruebas y procedimientos que se llevan a cabo al evaluar una vacuna, y garantizar la calidad,
inocuidad y eficacia del producto. Se han firmado acuerdos bilaterales de reconocimiento recíproco (MRAs)
relacionados con los productos biológicos de uso veterinario entre la Unión Europea y Australia y entre la Unión
Europea y Nueva Zelanda. La puesta en práctica de dichos acuerdos está en período transición. Parece que va a
tardar más tiempo en lograrse acuerdos de reconocimiento recíproco entre la Unión Europea y los EE.UU. en
relación con los productos biológicos de uso veterinario.
C. EL PAPEL DE LAS ORGANIZACIONES INTERNACIONALES
La mayoría de las naciones tienen un conjunto de leyes oficiales que regulan la venta y el uso de productos
biológicos de uso veterinario. Casi todas estas leyes estipulan "unos requisitos mínimos" de calidad, inocuidad y
eficacia de los productos biológicos de uso veterinario (especialmente vacunas), que han de ser probados en
laboratorios independientes, generalmente bajo supervisión estatal. Estas leyes y pruebas pueden variar de un
país a otro, y ello supone costes y restricciones para los fabricantes, usuarios y comprobadores.
106
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.9.
— El Papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
Muchas de las vacunas descritas en este Manual se producen y/o utilizan en países donde los regímenes de
autorización y comprobación no son tan estrictos como los descritos en este capítulo. No obstante, conviene ser
consciente de las regulaciones que se aplican en las distintas regiones y, por consiguiente, de las pruebas y la
inspección de productos biológicos de uso veterinario que se pueden haber realizado en dichas regiones.
La idea de armonizar estas pruebas para simplificar y reducir costes a nivel regional, e incluso a nivel mundial, no
es nueva, y se ha avanzado mucho en los últimos 20 años. El propósito de esta sección es revisar la situación
actual mediante la descripción del papel de las organizaciones internacionales en la regulación de las vacunas
de uso veterinario.
En esta sección el término "organización internacional" se refiere a aquellas organizaciones relacionadas con la
salud animal a escala mundial (OIE, FAO y OMS).
1.
El papel de la Oficina Internacional de Epizootias
La OIE se fundó en París en 1924 como la organización mundial encargada de la sanidad animal y en el año
2002 contaba con 162 Países Miembros. Los tres principales objetivos de la OIE son: proporcionar información
sobre la sanidad animal a escala mundial, promover la coordinación internacional de la investigación y el control
de ciertas enfermedades animales, y armonizar y regular, a nivel internacional, la importación y exportación de
animales y productos animales.
Dentro de la OIE hay cuatro Comisiones Especializadas: la Comisión Zoosanitaria Internacional que se ocupa del
Código Internacional de Sanidad Animal , la Comisión de Normas, La Comisión de la Enfermedad de la Fiebre
Aftosa y de Otras Epizootías, y La Comisión para las Enfermedades de los Animales Acuáticos (incluidas las
enfermedades de los moluscos y los crustáceos). Además hay un Grupo de Trabajo se ocupa de las
enfermedades de la fauna salvaje.
Entre estas Comisiones Especializadas, la más estrechamente relacionada con la estandarización es la
Comisión de Normas. Esta Comisión establece las normas para los métodos de diagnóstico (incluidas las
preparaciones para diagnóstico) y para las vacunas. Sus términos de referencia reflejan la obligación que la
Comisión tiene de participar en la estandarización de los productos biológicos, incluidas las vacunas que usan
con fines profilácticos. La Comisión de Normas es responsable de la preparación del Manual de Normas para las
Pruebas de Diagnóstico y las Vacunas de la OIE (11) y la organización de los laboratorios de referencia para
muchas de las enfermedades contenidas en las Listas A y B de la OIE.
Sin embargo, sólo se logrará la estandarización completa de las pruebas con vacunas cuando se hayan
diseñado las normas pertinentes. Se espera alcanzar el objetivo de la estandarización y la amplia disponibilidad
de estándares a través de la participación de los laboratorios de referencia de la OIE. Entre las funciones y
responsabilidades de los expertos de los casi 150 laboratorios de referencia de la OIE, están la provisión de un
centro de excelencia en una actividad designada, la estandarización de métodos, la preparación, el
almacenamiento y la distribución de antisuero estándar, antígenos y otros reactivos
Entre los 10 Centros Colaboradores de la OIE, tres pueden estar involucrados, en un momento dado, en el
control y/o armonización del control de las vacunas: tal es el caso del Centro Colaborador para los Productos
Medicinales de Uso Veterinario, de Fougères (Francia), el Centro Colaborador para la prueba de
enzimoinmunoensayo (ELISA, enzime-linked inmunoadsorbent assay) y para las Técnicas Moleculares en el
Diagnóstico de Enfermedades Animales, de Viena (Austria), y el Centro Colaborador para el Diagnóstico de
Enfermedades Animales y Evaluación de Vacunas, de Ames (EE.UU.).
En 1994, después de los debates de la Consulta Técnica Internacional sobre el Registro de Drogas para Uso
Veterinario (ITCVDR), la OIE estableció un grupo Ad hoc sobre La Armonización de los Medicamentos de Uso
Veterinario, lo que constituyó el primer paso hacia la creación de la Cooperación Internacional sobre la
Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos de Uso Veterinario (VICH) (Véase
Sección C.4 abajo)
2.
El papel de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación
La FAO establecida en 1945, es responsable del desarrollo de la agricultura y de la producción de alimentos. La
División de Salud y Producción Animal ('AGA'), dentro del Departamento de Agricultura, se encarga del
desarrollo del ganado, e incluye el Servicio de Sanidad Animal ('AGAH'), cuya principal función es la prestar
asistencia a los Países Miembros en el control de las enfermedades animales, con el propósito de aumentar la
producción de ganado como un componente integral del desarrollo general, en las áreas social, económica y
agrícola .La participación de la FAO en las pruebas de productos biológicos de uso veterinario se lleva a cabo
principalmente a través de su sistema de asistencia técnica a los Países Miembros con el fin de establecer e
incluso ejecutar de forma independiente, controles de las vacunas y de otros productos biológicos. Un ejemplo de
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
107
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
la asistencia de la FAO a la Unión Africana, (UA) es la creación de un sistema para que el Centro Panafricano de
Vacunas de Uso Veterinario (PANVAC), realice pruebas con vacunas de uso veterinario, a escala continental,
especialmente las utilizadas contra la peste bovina y la pleuroneumonía contagiosa bovina; la FAO encarga, a
petición de los Países Miembros, iniciativas bien para garantizar la calidad de las vacunas y otros productos
biológicos o para las consultas a expertos sobre este asunto, o para la publicación de manuales sobre el control
de la producción y de la calidad de las vacunas. Es más, se pueden solicitar a dos servicios auxiliares, como son
el Codex Alimentarius 'y a la División de Técnicas Nucleares para la Alimentación y la Agricultura', que
intervengan en los asuntos relacionados con estos productos. El segundo de dichos servicios opera
conjuntamente con la FAO y la Agencia Internacional de Energía Atómica (IAEA) con base en Viena (Austria), y
tiene una Sección de Sanidad y Producción Animal que presta asistencia a los servicios veterinarios e institutos
de investigación de los países en vías de desarrollo para el establecimiento de las técnicas RIA (Prueba de
Inmunidad Radiológica) y ELISA. Relacionado con esta actividad existe un plan de garantía de calidad por el que
a los laboratorios que han recibido equipos ELISA de la FAO o de la IAEA se les exige monitorizar de forma
rutinaria los controles de calidad interna y probar periódicamente (una o dos veces al año) un lote de muestras
desconocidas, y enviar los resultados a la IAEA. El objetivo global es proporcionar a todos los interesados la
garantía de que los resultados que se generan mediante el uso de los equipos estandarizados y validados
internacionalmente, son fiables y correctos.
3.
El papel de la Organización Mundial de la Salud
Actualmente la OMS no está directamente involucrada en la elaboración de preparados de referencia
internacionales (por ejemplo antígenos o anticuerpos) para uso meramente veterinario, pero ha desarrollado y
conserva aún en el Instituto Nacional para el Control de Estándares Biológicos, en Potter`s Bar (Reino Unido),
algunos materiales relacionados con las enfermedades estrictamente veterinarias (por ejemplo, vacuna activa
para la enfermedad de Newcastle, y suero contra la fiebre porcina). La OMS quiere mantener su papel en esta
área en los casos en que los preparados veterinarios de referencia documentos guía tienen una relevancia
directa para la salud humana. (8, 10, 15, 16). Esto involucra a los agentes zoonósicos, o potencialmente
zoonósicos y a otros agentes infecciosos de origen animal que son contaminantes potenciales de los productos
biológicos, bien se trate de vacunas producidas en cultivos de células u órganos para xenotransplante. En la
reunión del Comité de Expertos para la Estandarización Biológica que tuvo lugar en octubre de 1998, se llevó a
cabo una revisión de los estándares internacionales entonces vigentes y de los preparados de referencia para los
medicamentos de uso veterinario, y se sugirió una lista de candidatos para ser descontinuados, reemplazados o
revisados (8). Sin embargo, el Comité de Expertos decidió postergar la toma de decisión referente a la
preparación de las referencias veterinarias, al estar pendiente, por parte de la OMS y de sus socios en el campo
de la veterinaria, una evaluación de la necesidad de estos diversos productos biológicos. Además se ha de
evaluar el interés actual por ciertos preparados, especialmente las vacunas veterinarias, contra zoonosis
familiares (por ejemplo, ántrax y brucelosis), adoptadas y/o revisadas en los años 60 y 70.
El formato de la lista de Requisitos para las Sustancias Biológicas, publicado como Apéndice en cada informe del
Comité de Expertos para la Estandarización Biológica, fue revisado en 1998 y debería facilitar la recuperación de
información y lograr el objetivo de una mayor transparencia.
4.
El papel de la VICH
4.1 Los términos de referencia
Los objetivos de la Cooperación Internacional para la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro
de los Productos de Uso Veterinario (VICH) son:
Œ
Propiciar un forum para un diálogo constructivo entre las autoridades reguladoras y la industria de
productos medicinales de uso veterinario, sobre las diferencias reales y las percibidas en relación a los
requisitos técnicos para el registro de los productos en la Unión Europea, Japón y EE.UU., con la esperanza
de que este proceso pueda servir como catalizador para una armonización internacional más amplia.
Œ
Identificar áreas en que las modificaciones en los requisitos técnicos o la mayor aceptación recíproca de los
procedimientos de investigación y desarrollo, pueda conducir a una utilización más económica de las
recursos humanos y materiales sin que peligre la seguridad.
Œ
Hacer recomendaciones sobre modos prácticos de alcanzar la armonización de los requisitos técnicos que
afectan el registro de productos veterinarios e implementar dichas recomendaciones en las tres regiones.
Una vez adoptadas, las recomendaciones de la VICH deberían sustituir a los correspondientes requisitos
regionales. Estas recomendaciones deberían centrarse en los requisitos científicos esenciales necesarios
para tratar un tema, eliminando los requisitos innecesarios o redundantes.
108
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.9.
— El Papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
Œ
La VICH debería conducirse de forma transparente y rentable brindando una oportunidad para los
comentarios públicos que puedan hacerse sobre recomendaciones durante la elaboración de éstas. La
VICH se centra en la armonización de los requisitos de registro para los productos medicinales de uso
veterinario, en la Unión Europea, EE.UU. y Japón.
A los países no involucrados en la VICH, se les mantiene informados de sus progresos a través de la OIE. Se
toman en consideración los productos biológicos, pero sin dar alas, por el momento, a los promotores de una
expansión adicional.
4.2. El Comité Directivo
Para la existencia de la VICH, es fundamental el Comité Directivo, que está autorizado para dirigir el proceso de
armonización. El Comité Directivo consta de dos delegados de cada una de las autoridades reguladoras y de las
asociaciones industriales en las tres regiones. Australia y Nueva Zelanda (juntas) y Canadá tienen estatus de
observadoras, con un delegado que representa a las autoridades gubernativas y otro que representa a las
asociaciones industriales. Se ha autorizado una categoría adicional de partes interesadas, y a los encuentros del
Comité Directivo asisten delegados del Comité de las Américas para la Armonización del Registro y Control de
Medicamentos Veterinarios (CAMEVET) y de la Asociación de Compañías de Productos Veterinarios (AVBC).
4.3. Los Grupos de Trabajo
Con el fin de conseguir la armonización en torno a los temas seleccionados, el Comité Directivo de la VICH
nombra grupos de trabajo para preparar las recomendaciones. Normalmente, cada grupo de trabajo está
integrado por seis expertos -cada uno de ellos representando a un miembro de pleno derecho de la VICH.
Pueden nombrarse por el Comité Directivo, expertos adicionales de los países observadores - o incluso de otros
países - si se considera apropiado.
El Comité Directivo nombra un director para cada tema. Dicho director es responsable de iniciar el grupo de
trabajo dirigiendo el trabajo del grupo. Normalmente, el director preside el grupo de trabajo y es responsable de
la entrega del borrador de directrices armonizadas al Comité Directivo.
El Comité Directivo ha creado grupos de trabajo específicos para ocuparse de la armonización de pruebas
usadas para el control de las vacunas de uso veterinario. Este es el grupo de trabajo encargado de supervisar la
calidad de los productos biológicos.
4.4. La VICH y el papel de las federaciones industriales
La IFAH3, la "industria motor" en el proceso de la VICH, es la responsable de la secretaria completa de la VICH.
Esto conlleva la preparación de los documentos para las reuniones de los miembros de la VICH, la puesta en
venta de las publicaciones, la distribución de los documentos de los grupos de trabajo y la publicación de las
recomendaciones adoptadas por el Comité Directivo. El IFAH también coordina los emplazamientos de las tres
federaciones industriales de ámbito regional. El AHI4 , la FEDESA5 y la JVPA6, tienen la responsabilidad de
garantizar que la opinión de sus respectivas regiones está debidamente representada. Esas organizaciones
envían expertos industriales a cada grupo de trabajo, para que actúen como enlace con las autoridades
regionales y se responsabilicen de la organización de las conferencias locales para discutir y dar publicidad a las
recomendaciones de la VICH.
CONCLUSIÓN
En este momento, existe una clara intención de alcanzar una gran armonización internacional para la regulación
de los requisitos exigidos para los productos biológicos de uso veterinario (14). Se ha progresado a través de las
organizaciones internacionales para permitir una competencia justa en el mercado de los productos veterinarios.
Sin embargo los esfuerzos hechos en el pasado por organizaciones internacionales no han dado como resultado
un nivel suficiente de armonización que facilite el mercado internacional. Dichos esfuerzos han servido de base
para los gestiones actuales Las autoridades nacionales reconocen la ventaja de una armonización y están ahora
dedicadas a la consecución de dicho objetivo.
3
4
5
6
Federación Internacional para la Sanidad Animal (Internacional Federation for Animal Health)
Instituto para la Sanidad Animal (Animal Health Institute, EE.UU.)
Federación Europea para la Sanidad Animal (Fédération Européenne de la Santé Animale)
Asociación Japonesa de Farmacología Veterinaria (Japanese Veterinary Pharmaceutical Association)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
109
Capítulo I.1.9.
— El papel de los organismos oficiales en la regulación internacional
de los productos biológicos de uso veterinario
Los esfuerzos de las organizaciones internacionales han hecho posible el objetivo de la armonización y como
consecuencia la creación de una organización y de un proceso que caminan hacia ese objetivo. El éxito en
alcanzar dicho objetivo dependerá de la buena voluntad de las autoridades participantes de trabajar juntos y
aceptar los compromisos que serán necesarios para resolver las dificultades de los asuntos científicos y políticos.
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CAPÍTULO I.1.10.
MÉTODOS DE LABORATORIO
PARA ENSAYOS DE SENSIBILIDAD DE BACTERIAS
FRENTE A ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCION
La amplia propagación de bacterias patógenas con resistencia múltiple a los antibióticos ha sido
reconocida como un importante problema global para la sanidad animal y humana por la OIE y la
Organización Mundial de la Salud. La aparición de resistencias a antimicrobianos en diversas
bacterias patógenas ha convertido a las pruebas de sensibilidad frente a estas sustancias en algo
esencial cuando se emplean antimicrobianos con fines terapeúticos. La resistencia de un patógeno
frente a un antimicrobiano determinado permite predecir que el tratamiento no resultará eficaz,
mientras que la sensibilidad del patógeno al mismo constituye una excelente base para elegir el
tratamiento antibacteriano adecuado. Por tanto, el ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos
es un importante componente de cualquier programa eficaz de tratamiento. Además, en el caso de
bacterias patógenas aisladas, las pruebas de sensibilidad inciden en las directrices generales que
deben seguirse a nivel mundial para un uso prudente de los antimicrobianos en la producción
animal, y los veterinarios deberían tener en cuenta estos datos (1).
Las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos son también la base del control epidemiológico de
las bacterias patógenas para el hombre y los animales. Tal control suministra un punto de partida
para elegir adecuadamente un tratamiento empírico (primera línea de terapia) y para detectar la
aparición y/o la diseminación de cepas bacterianas resistentes así como los determinantes de la
resistencia en diferentes especies de bacterias. La estandarización y homologación de las diversas
metodologías de ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos, utilizadas en el control
epidemiológico de la resistencia a compuestos antimicrobianos, constituyen un factor clave si se
pretende comparar datos entre los diferentes programas nacionales e internacionales de
seguimiento de los paises miembros de la OIE. Resulta esencial que los métodos de ensayo de
sensibilidad a antimicrobianos generen resultados reproducibles en laboratorios de uso diario y que
los datos puedan ser comparables con los resultados obtenidos por un método patrón de
referencia conocido como la “norma de oro”. En ausencia de métodos estandarizados o de
procedimientos de referencia, los resultados de sensibilidad obtenidos en laboratorios diferentes no
pueden compararse con fiabilidad.
Este Capítulo contiene directrices metodológicas para las pruebas de sensibilidad frente a antimicrobianos e
incluye procedimientos para estandarizar y normalizar la interpretación de los resultados de dichas pruebas.
1.
Requerimientos de las pruebas
Para lograr la estandarización de los métodos de determinación de la sensibilidad a antimicrobianos y la
comparación de sus resultados, hay que tener en cuenta los siguientes principios:
i)
Son cuestiones esenciales el uso de métodos estandarizados y la homologación de los datos sobre
sensibilidad (incluyendo los criterios de interpretación).
ii)
Tanto los métodos estandarizados como unos criterios similares de interpretación deberían ser aceptados y
usados por todos los laboratorios implicados.
iii)
Todos los métodos de determinación de sensibilidad a antimicrobianos deberían dar lugar a resultados
reproducibles.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
iv)
Todos los datos han de poder describirse en términos cuantitativos
v)
Resulta esencial establecer una red de laboratorios designados a nivel nacional o regional para coordinar
las metodologías, interpretaciones y controles de calidad de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
vi)
Los laboratorios de Microbiología deberían llevar a cabo su trabajo dentro de un sistema interno de
aseguramiento de la calidad.
vii)
Los laboratorios deberían estar acreditados, siempre que sea posible, y participar en programas externos
de mejora.
viii) La existencia de cepas bacterianas específicas para referencia y control de calidad resulta necesaria a fin
de determinar el nivel de control de calidad, la seguridad y la mejora de las pruebas dentro de un mismo
laboratorio, y entre varios laboratorios.
2.
Metodología de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Deben tenerse en cuenta las siguientes exigencias:
i)
Las bacterias sometidas a ensayo deben aislarse en cultivo puro a partir de las muestras enviadas.
ii)
El procedimiento para el aislamiento de cada bacteria en particular debe estar estandarizado, de modo que
las bacterias analizadas puedan ser identificadas de forma correcta y lógica hasta el nivel de género y/o
especie.
iii)
Cuando sea posible, las bacterias aisladas deben ser guardadas para ulteriores análisis (mediante
liofilización o conservación en frío entre -70 y -80ºC).
A su vez, se requiere la estandarización de los siguientes factores que influencian los ensayos de sensibilidad
frente a antimicrobianos:
i)
Una vez que se ha aislado la bacteria en cultivo puro, el inóculo debe normalizarse para obtener resultados
precisos de sensibilidad.
ii)
La composición de los medios sólidos y líquidos utilizados (en cuanto a pH, catione timidina o timina, o el
uso de medios de cultivo suplementados).
iii)
El contenido de la sustancia antimicrobiana en la forma utilizada de suministro (en disco, tira o tableta).
iv)
La composición de los solventes y diluyentes empleados en la preparación de las soluciones stock de
antimicrobianos.
v)
Las condiciones de crecimiento e incubación (tiempo, temperatura, tipo de atmósfera, por ejemplo
presencia de CO2).
vi)
Concentración del agar como agente solidificante.
vii)
Los criterios posteriores de interpretación.
Por estos motivos, se debe destacar la especial importancia de los procedimientos normalizados y de los
métodos estandarizados, ya que sólo puede lograrse una reproducibilidad adecuada mediante el uso de una
metodología modelada.
3.
Selección de la metodología para determinar la sensibilidad al antimicrobiano
La selección de una metodología apropiada para determinar la sensibilidad frente a los antimicrobianos debe
estar basada en los siguientes principios:
i)
Facilidad de realización
ii)
Flexibilidad
iii)
Adaptación a sistemas automatizados o semiautomatizados
iv)
Coste
v)
Reproducibilidad
vi)
Fiabilidad
vii)
Exactitud
viii) Preferencias nacionales e internacionales.
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Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
4.
Métodos de ensayo
Los tres métodos que se citan a continuación son los únicos que suministran resultados significativamente
reproducibles:
i)
Difusión en disco
ii)
Dilución en medio líquido
iii)
Dilución en medio sólido con agar
a)
Método de difusión en disco
La difusión en disco hace referencia a la difusión que experimenta un agente antimicrobiano a una
determinada concentración a partir de discos, tiras o tabletas, que se depositan en un medio de cultivo
sólido que ha sido sembrado con un inóculo bacteriano estandarizado. El método de difusión en disco se
basa en la determinación de una zona de inhibición del crecimiento que es proporcional a la sensibilidad de
la bacteria frente al antimicrobiano presente en el disco.
La difusión de un antimicrobiano en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia
antimicrobiana. Cuando su concentración llega a ser tan diluida que no logra inhibir el crecimiento de la
bacteria ensayada, termina la zona de inhibición. Teóricamente, el borde de esta zona de inhibición se
corresponde con la concentración mínima inhibitoria (MIC) para esa combinación concreta de bacteria y
antimicrobiano. En otras palabras, la zona de inhibición se correlaciona de modo inversamente proporcional
con el valor de la MIC para la bacteria ensayada. En general, cuanto mayor es la zona de inhibición, menor
es la concentración de antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento de los microorganismos.
No obstante, esto depende también de la concentración del antibiótico en el disco y de su capacidad de
difusión.
Hay que advertir que las pruebas de difusión en disco basadas solamente en la presencia o ausencia de
una zona de inhibición, sin considerar su tamaño, no son aceptables como ensayos para la sensibilidad a
antimicrobianos desde el punto de vista metodológico.
•
Consideraciones sobre el uso de la técnica de difusión en disco
La difusión en disco es fácil de realizar, reproducible, y no requiere disponer de una infraestructura cara.
Sus principales ventajas son:
i)
Bajo coste
ii)
Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando ello se requiere.
La medición manual de las zonas de inhibición puede llevar excesivo tiempo. Sin embargo, existen
dispositivos automáticos que permiten leer las zonas y que pueden integrarse en sistemas de
procesamiento de datos y de informes de laboratorio. Se puede colocar hasta un máximo de 12 discos por
cada placa de cultivo de 150 mm de diámetro y un máximo de 5 discos por placa de 100 mm.
Independientemente del número de discos depositados sobre la superficie del medio solidificado con agar,
éstos deben de estar distribuidos de forma uniforme de modo que no estén a una distancia menor de
24 mm, desde el centro de un disco al centro de otro.
b)
Métodos de dilución en medio líquido y en medio sólido
La finalidad de estos métodos es determinar la concentración más baja del antimicrobiano ensayado que es
capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria analizada (MIC, concentración mínima inhibitoria, que
normalmente se expresa en microgramos/mililitro o miligramos/litro). Sin embargo, la MIC no siempre
representa un valor absoluto. La "verdadera" MIC es un punto que se encuentra entre la concentración más
baja del ensayo que inhibe el crecimiento de la bacteria y la siguiente concentración más baja del ensayo.
El rango de los antimicrobianos debería:
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i)
Abarcar tanto los criterios de interpretación (sensibilidad, valor intermedio y resistencia) como los
organismos de referencia para el control de calidad.
ii)
Tener en consideración las concentraciones de antimicrobiano que se pueden alcanzar in vivo para
una combinación específica de antibiótico y bacteria.
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Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
Los métodos para determinar la sensibilidad a antimicrobianos que se basan en diluciones parecen ser mas
reproducibles y fáciles de cuantificar que los basados en difusión. Sin embargo, los antibióticos se ensayan
normalmente mediante diluciones en serie reduciendo la concentración a la mitad, lo que puede originar
datos inexactos en cuanto a la MIC.
Cualquier laboratorio que pretenda usar un método de dilución y utilizar sus propios reactivos y diluciones
de antibióticos debería tener la capacidad de obtener, preparar y mantener un stock de soluciones de
antimicrobianos de pureza adecuada y generar diluciones de trabajo de modo regular. Por consiguiente, es
importante que tales laboratorios usen organismos de control garantizado (ver más adelante) para asegurar
la precisión y estandarización en sus procedimientos.
•
Dilución en caldos de cultivo.
La dilución en medio líquido es una técnica en la que se prueba una suspensión normalizada de bacterias
frente a varias concentraciones de un agente antimicrobiano (normalmente mediante diluciones seriadas
que reducen la concentración a la mitad) en un medio líquido estandarizado. El método se puede realizar
tanto en tubos con un contenido mínimo de 2 ml (macrodilución) como en volúmenes más pequeños,
utilizando placas de microtitulación (microdilución). Existen comercialmente en el mercado varios tipos de
placas de microtitulación que contienen antibióticos prediluidos dentro de los pocillos de las placas. El uso
de lotes idénticos de estas placas de microtitulación ayuda a eliminar errores potenciales que pueden surgir
durante la preparación y dilución de los antimicrobianos. Dicho uso, junto a un protocolo normalizado,
incluyendo cepas de referencia con control de calidad, puede facilitar la homologación si se dispone de
suficientes recursos financieros.
Debido a que en la actualidad la mayor parte de las pruebas para antimicrobianos mediante microdilución
en medio líquido se preparan comercialmente, estas pruebas pueden considerarse menos flexibles que las
basadas en dilución en medio sólido o en difusión en disco en cuanto a su capacidad para admitir cambios
necesarios derivados del programa de control y seguimiento.
Como la compra de la infraestuctura necesaria y el conjunto de antimicrobianos puede resultar costosa,
esta metodología no se suele elegir en laboratorios con presupuestos limitados.
•
Dilución en medio sólido
La dilución en medio sólido implica la incorporación de un agente antimicrobiano a concentraciones
progresivamente crecientes en un medio solidificado con agar y la aplicación de un inóculo bacteriano
definido a la superficie de la placa que contiene el agar. A menudo, los resultados derivados de estos
ensayos se consideran como los estándares de oro en la determinación del valor MIC para una
determinada combinación bacteria/antimicrobiano en una prueba concreta.
Las ventajas de los métodos de dilución en medio sólido son:
i)
Un mayor control en la pureza de la bacteria ensayada.
ii)
La capacidad de ensayar simultáneamente varias bacterias en una misma placa de medio con agar.
iii)
La mejora potencial en cuanto a la determinación de valores MIC por extensión del rango de
concentraciones del antimicrobiano.
iv)
Posibilidad de semi-automatizar el procedimiento mediante la utilización de un replicador del inóculo.
Existen en el mercado unos replicadores de los inóculos que pueden transferir entre 32 y 36 inóculos
bacterianos diferentes a cada una de las placas con medio sólido.
Los métodos de dilución en medio sólido tienen algunos inconvenientes, por ejemplo:
i)
Son muy laboriosos y requieren importantes recursos económicos y técnicos.
ii)
Una vez que se preparan deben usarse en el término de una semana.
iii)
Los puntos finales no son siempre fáciles de determinar ni resulta fácil verificar la pureza del inóculo.
La dilución en medio sólido se recomienda a menudo como un ensayo estandarizado para medir la
sensibilidad a antimicrobianos de organismos difíciles de cultivar, como es el caso de especies de
Helicobacter y Campylobacter. Sin embargo, al menos en la práctica veterinaria, la microdilución en medio
líquido también funciona muy bien con organismos como Haemophilus, Campylobacter y Brachyspira, entre
otros.
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Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
c)
Otras pruebas para determinar la sensibilidad a bacterias y la resistencia a antimicrobianos
específicos
Las concentraciones mínimas inhibitorias de antimicrobianos para bacterias se pueden obtener, además,
mediante tiras de gradientes disponibles en el mercado que permiten la difusión de una concentración
preformada de antibiótico. Sin embargo, el uso de tiras de gradientes puede ser muy caro y originar
discrepancias en cuanto a MIC cuando sus resultados se comparan con los obtenidos mediante dilución en
medio sólido (2).
Cualquiera que sea el método usado, los procedimientos deberían estandarizarse para lograr resultados
exactos y reproducibles. Cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad a antimicrobianos se necesita
probar también los microorganismos de referencia con control de calidad para asegurarse de la exactitud de
los datos.
La elección apropiada en cuanto al sistema para determinar la sensibilidad dependerá, en último término de
las propiedades de crecimiento de la bacteria en cuestión. En circunstancias especiales, pueden resultar
adecuados nuevos métodos para la detección de fenotipos de resistencia particulares. Por ejemplo,
pruebas basadas en cefalosporinas cromogénicas (como nitrocefin) o pruebas equivalentes, pueden revelar
resultados rápidos y fiables sobre determinación de beta-lactamasas en algunas bacterias.
De modo similar, puede detectarse un amplio espectro de actividad beta-lactamasa en algunas bacterias
mediante métodos estándar de sensibilidad por difusión en disco utilizando cefalosporinas específicas
(cefotaxima y ceftazidima) en combinación con un inhibidor de beta-lactamasas (como el ácido clavulánico),
y midiendo las zonas de inhibición resultantes. Además, la resistencia al cloranfenicol atribuible a la
producción de cloranfenicol-acetil transferasa se puede detectar en algunas bacterias mediante pruebas
rápidas en un tubo o en papel de filtro en cuestión de 1-2 horas (4).
5.
Puntos críticos de sensibilidad y criterios de zona de inhibición
El objetivo de una prueba de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos es predecir el modo en que un patógenos
bacteriano va a responder al agente antimicrobiano in vivo. Independientemente de si se usan métodos de
difusión o de dilución, los resultados de estas pruebas in vitro clasifican las bacterias respecto a la acción de un
antimicrobiano particular como resistentes, sensibles o con efecto intermedio.
Los puntos críticos de sensibilidad a antimicrobianos los establecen organizaciones nacionales, sociedades
profesionales o agencias reguladoras. Deberían consultarse los documentos pertinentes. No obstante, pueden
existir notables diferencias entre diferentes países en relación con un mismo agente antimicrobiano.
Como se ha indicado previamente, los resultados de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos deberían
expresarse cuantitativamente:
i)
como distribución de concentraciones mínimas inhibitorias en miligramos por litro.
ii)
como diámetros de zonas de inhibición en milímetros.
Los dos siguientes factores son importantes para interpretar si una bacteria es sensible o resistente a un agente
antimicrobiano:
i)
El desarrollo y establecimiento de intervalos de control de calidad, usando siempre que sea posible pruebas
de difusión y pruebas de dilución para microorganismos de control de calidad.
Esto resulta esencial para validar el método específico de sensibilidad a antimicrobianos que se use. Las
series de control de calidad para los microorganismos control deberían establecerse antes de determinar
los puntos críticos de sensibilidad o resistencia.
ii)
La determinación de criterios de interpretación apropiados.
Esto implica la generación de tres distintos tipos de datos:
Œ
distribución poblacional de valores MIC para organismos relevantes
Œ
parámetros farmacocinéticos del agente antimicrobiano
Œ
resultados de ensayos clínicos y experiencia
La interpretación de los datos incluye la creación de un diagrama de puntos a partir de la distribución de la
población bacteriana (aislamientos bacterianos representativos), representando la zona de inhibición frente al
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Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
valor MIC para cada bacteria patógena. La selección de puntos críticos se basará en múltiples factores,
incluyendo el análisis de la línea de regresión que correlaciones los valores MIC y los diámetros zonales de
inhibición, distribución de poblaciones bacterianas, límites de error, farmacocinética y, finalmente, la verificación
clínica.
El desarrollo del concepto de "puntos críticos microbiológicos", que se basa en las distribuciones poblacionales
de la especie bacteriana concreta comprobada, puede ser mas adecuado para algunos programas de control. En
este caso los aislamientos de bacterias que se desvían de la población sensible normal se deberían considerar
resistentes, y los cambios de sensibilidad en una combinacion específica antimicrobiano/bacteria podrían ser
objeto de seguimiento (5).
6.
Directrices para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Se dispone actualmente de varias directrices a nivel mundial para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y
para los correspondientes criterios de interpretación de las pruebas. Entre otras, se incluyen las directrices y
referencias publicadas por:
Comité Nacional para Estándares de Laboratorios Clínicos (NCCLS)
Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC)
Comité de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiología (CASFM)
Instituto Alemán de Normativas (DIN)
Sociedad Japonesa de Quimioterapia (JSC)
Werkgroep richtlijnen gevoeligheidsbepalingen (Sistema WRG, Países Bajos)
Hasta ahora, solo el NCCLS ha desarrollado protocolos para ensayos de sensibilidad de bacterias aisladas de
animales y ha determinado criterios interpretativos (4). Sin embargo, existen protocolos y directrices disponibles
de varias organizaciones y sociedades profesionales sobre pruebas de sensibilidad para especies bacterianas
afines que causan infecciones en humanos. Es posible que se puedan adoptar tales directrices para las pruebas
de sensibilidad de bacterias aisladas de animales pero cada país debe evaluar sus propias directrices y pautas
de estandarización. Además, están progresando determinados esfuerzos encaminados a homologar a escala
internacional los puntos críticos de sensibilidad. Estos esfuerzos inciden principalmente en la adopción de los
estándares y directrices del NCCLS, que contempla la existencia de laboratorios con métodos normalizados y
valores de control de calidad que permiten establecer comparaciones sobre las pruebas de sensibilidad a
antimicrobianos y sobre los datos generados. Para los países miembros de la OIE que no tienen métodos de
determinación de sensibilidad estandarizados, la adopción de las indicaciones y los estándares del NCCLS
debería ser un paso inicial apropiado.
Como primer paso hacia una comparación de datos de seguimiento y control, se anima a los países miembros a
diseñar un programa homologado y estandarizado (6). Los datos procedentes de países que usan otros diseños
metodológicos y de estudio pueden no ser directamente comparables (3,6). A pesar de esto, los datos
acumulados a lo largo del tiempo en un determinado país pueden servir al menos para permitir la detección de
apariciones de resistencia microbiana o tendencias en la prevalencia de resistencias en dicho país. No obstante,
si se presentan juntos los resultados que se han obtenido con diferentes métodos, debe demostrarse que es
posible la comparación de los resultados y que se puede alcanzar un consenso interpretativo.
Nótese que esto podrá llevarse a cabo más fácilmente utilizando métodos de determinación de la sensibilidad a
antimicrobianos que sean exactos y fiables, acoplados a un seguimiento operativo de los ensayos, y con el
empleo por los laboratorios participantes de cepas bacterianas con control de calidad definido.
7.
Comparación de resultados
Para determinar la comparación de resultados que se originan en diferentes sistemas de vigilancia, los
resultados deben ser cuantitativos y deben incluir información sobre los métodos, organismos de control de
calidad e intervalos de concentración de antimicrobianos empleados, así como los criterios de interpretación
usados.
8.
Control de calidad y seguridad de calidad
Los laboratorios que realizan determinaciones de sensibilidad a antimicrobianos deberían establecer sistemas
adecuados para lograr tanto control de calidad como seguridad de calidad.
Deben verificarse los siguientes componentes:
i)
precisión del procedimiento de ensayo
ii)
exactitud del procedimiento de ensayo
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Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
iii)
personal del laboratorio.
iv)
funcionamiento de los reactivos apropiados
También deberían respetarse las siguientes exigencias:
i)
Estricto cumplimiento de las técnicas estandarizadas junto a un control de calidad de los medios y reactivos.
ii)
Mantener registro de:
Œ
los números de lote de todos los materiales y reactivos adecuados
Œ
las fechas de caducidad de todos los materiales y reactivos
iii)
También debería comprobarse que las bacterias de referencia tienen el adecuado control de calidad vi)
para asegurar la estandarización, independientemente del método utilizado para determinación de
sensibilidad.
iv)
Las cepas bacterianas de referencia tendrían que ser catalogadas y caracterizadas por fenotipos estables y
definidos en cuanto a sensibilidad a los antimicrobianos.
v)
Los laboratorios implicados en los ensayos deberían utilizar las cepas de referencia apropiadas con control
de calidad.
vi)
Las cepas de referencia deben mantenerse en cultivos stock de los que se puedan derivar subcultivos de
trabajo y deben proceder de colecciones de cultivo nacionales o internacionales. Las cepas bacterianas de
referencia deben mantenerse en laboratorios centrales o regionales designados al efecto.
vii)
El mejor método para analizar en su conjunto las realizaciones de cada laboratorio es ensayar las cepas
bacterianas con control de calidad cada día que se lleven a cabo pruebas de sensibilidad.
Como esto no siempre resulta fácil o económico, la frecuencia de tales ensayos de control de calidad puede
reducirse si el laboratorio demuestra que los procedimientos seguidos para determinar la sensibilidad son
reproducibles. Si aparecen errores con los controles de calidad, el laboratorio tiene la responsabilidad de
determinar las causas y repetir las pruebas. En caso de que no pueda determinar el origen de los errores,
los ensayos de control de calidad deberían reiniciarse diariamente.
viii) Cada vez que se inicie el empleo de un nuevo lote de medio de cultivo o de placas, y de forma periódica, se
debería probar el comportamiento de las cepas de control de calidad en paralelo con las cepas bacterianas
a estudiar.
ix)
Se debe tener en cuenta la adopción de medidas adecuadas de bioseguridad cuando se reciban o se
envíen las cepas de referencia de control de calidad entre los laboratorios participantes. El empleo de tales
cepas permitirá la comparación de los datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos (fase de seguimiento).
9.
Pruebas externas de capacitación
Para asegurar que los datos de sensibilidad que se describen son de hecho correctos, los países miembros de la
OIE deberían llevar a cabo pruebas de capacitación externas (es decir, desarrolladas por una tercera parte).
Estas pruebas de habilitación pueden desarrollarse a nivel nacional. Se invita a que los laboratorios de países
miembros participen en comparaciones internacionales entre diferentes laboratorios. A este respecto, deberían
tenerse en cuenta todas las especies bacterianas importantes.
Cada país debería designar o establecer laboratorios nacionales responsables de:
i)
verificar los programas de seguridad sobre la calidad de los laboratorios que participan en el control y
seguimiento de las resistencias frente a los antimicrobianos
ii)
suministrar a dichos laboratorios un lote de cepas de referencia.
iii)
Crear una base de datos centralizada, disponible en Internet (p. ej. EARSS) que contenga los diferentes
perfiles de resistencia para cada especie bacteriana.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo I.1.10. — Métodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias
frente a antimicrobianos
REFERENCIAS
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ANTHONY F., ACAR J., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELLFALL E.J., VOSE D.,
VAN VUUREN M. & W HITE D.G. (2001). Antimicrobial resistance: responsible and prudent use of antimicrobial
agents in veterinary medicine. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 829–839.
2.
BROWN D.F. & BROWN L. (1991). Evaluation of the E-test, a novel method of quantifying antimicrobial activity.
J. Antimicrob. Chemother., 26, 185–190.
3.
LEEGARD T.M., CAUGANT D.A., FROHOLM L.O. & HOIB, E.A. (2000). Apparent differences in antimicrobial
susceptibility as a consequence of national guidelines. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 6, 290–293.
4.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M31-A2.
Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from
Animals, Approved Standard, Second Edition. document M31-A2. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite
1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 80 pp.
5.
RINGERTZ S., OLSSON-LILJEQUIST B., KAHLMETER G. & KRONVALL G. (1997). Antimicrobial susceptibility testing
in Sweden II. Species-related zone diameter breakpoints to avoid interpretive errors and guard against
unrecognised evolution of resistance. Scand. J. Infect. Dis. (Suppl.), 105, 8–12.
6.
THRELFALL E.J., FISHER I.S.T., WARD L., TSCHAPE H. & GERNER-SMIDT P. (1999). Harmonization of antibiotic
susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the
European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist., 5, 195–199.
7.
WHITE D.G., ACAR J., ANTHONY F., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELFALL
J.E., VOSE D., VAN VUUREN M., W EGENER H., & COSTARRICA L. (2001). Standardisation and harmonisation of
laboratory methodologies for the detection and quantification of antimicrobial resistance. Rev. sci. tech. Off.
int. Epiz., 20, 849–858.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos (ver Cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
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PARTE 2
ENFERMEDADES DE LA LISTA A
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SECCIÓN 2.1.
ENFERMEDADES DE LA LISTA A
CAPÍTULO 2.1.1.
FIEBRE AFTOSA
RESUMEN
La fiebre aftosa (FA) o glosopeda es la enfermedad más contagiosa de los mamíferos y posee un
gran potencial para causar graves pérdidas económicas en animales ungulados de pezuña
hendida. Existen siete serotipos del virus de la FA, que son O, A, C, SAT1,SAT2, SAT3 y Asia1. La
infección con un serotipo no confiere protección frente a otro. Clínicamente, la FA no se puede
diferenciar de otras enfermedades vesiculares, como la enfermedad vesicular porcina, estomatitis
vesicular y el exantema vesicular. El diagnóstico de laboratorio en los casos de sospecha de FA es
por tanto un asunto de urgencia.
Los casos típicos de FA se caracterizan por la aparición de vesículas en las patas, la mucosa bucal
y, en el caso de las hembras, en las mamas. Los síntomas clínicos varían desde ligeros a graves y
pueden ocasionar muerte, en especial en animales jóvenes. En algunas especies, la infección
puede ser subclínica, como en el búfalo africano (Syncerus caffer). El mejor tejido para el
diagnóstico es el epitelio de vesículas intactas o recién rotas o del líquido vesicular. Cuando esto
no es posible, una fuente alternativa de virus son las muestras de sangre y/o de líquido esofágicofaríngeo tomadas con sonda en los rumiantes o por frotis de garganta en el caso de los cerdos. En
casos de muerte se puede enviar tejido del miocardio o sangre pero, si están presentes las
vesículas, éstas son preferibles.
Es importante que el transporte de muestras de casos sospechosos sea seguro y adaptado a
normas internacionales. Sólo deben enviarse a laboratorios autorizados.
El diagnóstico de la FA requiere el aislamiento del virus o la demostración del antígeno vírico de la
FA o el ácido nucleico en las muestras de tejidos o fluidos. También puede utilizarse para
diagnóstico la detección de anticuerpos humorales específicos. El uso del serodiagnóstico está
incrementándose con las nuevas pruebas desarrolladas con proteínas no estructurales (NSP) que
permiten la detección de infecciones pasadas o presentes, independientemente del estado de
vacunación.
Identificación del agente: Para un diagnóstico positivo, es suficiente con la demostración del
antígeno vírico de la FA. Debido a la naturaleza tan contagiosa y a la importancia económica de la
FA, el diagnóstico de laboratorio y la identificación del serotipo del virus deben realizarse en un
laboratorio con seguridad para el trabajo con virus.
El uso de la fijación del complemento (FC) se ha reemplazado en muchos laboratorios por el
enzimoinmunoensayo (ELISA), ya que este último es más específico y sensible y no se ve
afectado por factores pro- y anti-complementarios. Si la muestra es inadecuada o el resultado de la
prueba no es concluyente, será necesario cultivar el virus en cultivos celulares o en ratones
lactantes de 2-7 días. Con preferencia, los cultivos deberían de ser cultivos primarios de tiroides
bovino, aunque se pueden utilizar células de riñón de cerdo, cordero o ternero, o líneas celulares
de sensibilidad comparable. Cuando en los cultivos aparece un efecto citopático (ECP), se pueden
utilizar los sobrenadantes en pruebas FC o ELISA. Se pueden realizar pruebas similares con
suspensiones homogenizadas de tejido derivado de músculo esquelético diseccionado de
cualquier ratón que muera. En ausencia de ECP o de ratones muertos, se debe efectuar otro pase
con un intervalo de 48 horas, congelando y descongelando las células, antes de considerar que la
muestra es negativa.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
Las pruebas de reconocimiento de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa,
se están utilizando mucho como métodos de diagnóstico rápidos y sensibles. A veces el examen
por microscopía electrónica es útil para diferenciar la FA de enfermedades causadas por otros
virus.
Pruebas serológicas: Para un diagnóstico positivo, es suficiente la demostración de anticuerpos
específicos contra proteínas estructurales en animales no vacunados que presenten una
manifestación vesicular. Esto resulta particularmente útil en casos benignos o cuando no se puede
tomar tejido epitelial. Las pruebas para anticuerpos contra algunas NSPs del virus de la FA
proporcionan evidencia de infecciones previas o actuales del hospedador, independientemente del
estado de vacunación. A diferencia de las proteínas estructurales, las NSPs no son específicas de
serotipo y, en consecuencia, la detección de estos anticuerpos no está restringida a un serotipo
particular.
Las pruebas de neutralización del virus (NV) y los ELISAs para anticuerpos contra proteínas
estructurales se emplean como pruebas serológicas específicas de serotipo. Las pruebas NV
dependen de los cultivos de tejidos y por tanto son más propensas a variabilidad de resultados que
las pruebas ELISA; son también más lentas y más fáciles de contaminar. Las técnicas ELISA para
anticuerpos, presentan la ventaja de la rapidez y de no ser dependientes de los cultivos celulares.
La prueba ELISA se puede llevar a cabo con antígenos inactivados, lo que requiere, por tanto,
menos servicios restrictivos de biocontención.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Existen varios tipos de vacunas
disponibles comercialmente con virus inactivados de composición variada. Por lo general, se
infecta con el virus una suspensión o una monocapa de cultivo celular y la preparación que resulta
se clarifica, se inactiva con etilenimina y se prepara con adyuvante. Muchas vacunas contra la FA
son polivalentes con el fin de proporcionar protección contra los diferentes serotipos que es
probable encontrar en determinadas condiciones de campo.
La vacuna terminada debe carecer de virus vivos residuales. Esto se comprueba mediante una
combinación de pruebas in vitro sobre la preparación de virus inactivados y de pruebas in vivo
sobre la vacuna final. También se realizan pruebas de desafío en el ganado vacunado para
establecer la PD50 (dosis protectora del 50%), aunque una prueba serológica se considera
satisfactoria si el productor de la vacuna ha establecido una correlación estadísticamente
significativa entre la protección y la respuesta de anticuerpos específicos.
Los servicios de producción de la vacuna contra la FA deben cumplir también los requisitos de la
OIE para patógenos del Grupo 4 de Contención.
Los reactivos para diagnóstico y de referencia se pueden obtener de los Laboratorios de
Referencia de la OIE para la FA, y del Laboratorio de Referencia Mundial para la FA de la FAO
(Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura)1. El laboratorio de
Pirbright (ver pie de página) posee doble condición, como Laboratorio de Referencia Mundial y
como Laboratorio de Referencia de la OIE para FA.
A. INTRODUCCIÓN
La fiebre aftosa o glosopeda (FA) está causada por un virus del género Aftovirus, de la familia Picornaviridae.
Existen siete serotipos de virus FA, que son el O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 y Asia1, que infectan animales de
pezuña hendida. La infección con un serotipo determinado no confiere inmunidad contra otro. Dentro de los
serotipos, se pueden identificar muchos subtipos mediante pruebas bioquímicas e inmunológicas.
Los virus de la FA se mantienen en África en el ganado vacuno y en el búfalo africano (Syncerus caffer). La
información disponible indica que aunque se pueden infectar otras especies domésticas y salvajes, éstas son
incapaces de mantener la infección más allá de unos cuantos meses en ausencia de ganado vacuno o del búfalo
africano. En otras partes del mundo, el ganado vacuno es el principal reservorio, aunque, a veces, los virus
implicados parecen haberse adaptado específicamente a cerdos domésticos, ovejas y cabras. Es probable que
estos virus adaptados sean capaces de modificar su adaptación e infectar otras especies bajo condiciones
adecuadas. Sin embargo, la cepa Cathay del virus de la FA adaptada a los cerdos no parece infectar a los
1
124
FAO World Reference Laboratory for FMD, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United
Kingdom.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
grandes rumiantes, bien natural o experimentalmente. Hasta ahora, fuera de África, la fauna salvaje no parece
ser capaz de mantener el virus de la FA. La evidencia indica que la infección de ciervos en el pasado derivó de
contactos, directos o indirectos, con animales domésticos infectados.
De las especies domesticas, el ganado vacuno, porcino, ovino, caprino y los búfalos resultan susceptibles a la FA
(21). Además, pueden infectarse muchas especies salvajes de pezuña hendida, como los ciervos, antílopes y
cerdos salvajes aunque, con la excepción del búfalo africano, no está claro su papel en la epidemiología de la FA
en las especies domésticas. Se han aislado de cerdos salvajes y de ciervos cepas de virus de la FA que infectan
al ganado bovino. Para el diagnóstico de la FA en especies salvajes se pueden aplicar procedimientos similares
a los descritos para los animales de granja.
La infección de animales susceptibles con el virus de la FA conduce a la aparición de vesículas en las patas,
dentro y alrededor de la cavidad oral, y en las glándulas mamarias de las hembras. También se pueden
presentar vesículas en otros lugares, como en el interior de los ollares nasales y en los puntos de presión de los
miembros -especialmente en cerdos. La gravedad de los síntomas clínicos varía con la cepa de virus, la dosis de
exposición, la edad y raza del animal, la especie hospedadora y su grado de inmunidad (32). Los síntomas
pueden variar desde una infección benigna y desapercibida hasta una grave. En algunos casos puede originar la
muerte. La mortalidad por miocarditis multifocal es más común en animales jóvenes: también puede presentarse
miositis en otros lugares. Ocasionalmente, también pueden producir la muerte de los animales adultos.
Cuando se presenta una historia de muertes repentinas en ganado joven de pezuña hendida, un examen de los
animales adultos revela a menudo la presencia de lesiones vesiculares, en caso de que se trate de FA. La
presencia de vesículas en los casos graves es variable.
En animales con enfermedad vesicular, es suficiente para establecer un diagnóstico la detección del virus de la
FA en muestras de líquido vesicular, tejido epitelial, leche o sangre. También se puede establecer el diagnóstico
por aislamiento del virus de la sangre, el corazón u otros órganos en casos fatales. En una alta proporción de
estos casos macroscópicamente se puede observar la presencia de miocarditis.
El virus de la FA se puede multiplicar y excretar del tracto respiratorio de los animales. La excreción aérea del
virus tiene lugar durante la fase aguda de la infección. Los virus pueden presentarse en todas las secreciones y
excreciones de los animales con infección aguda, incluyendo el aire expirado. Generalmente, la transmisión tiene
lugar por contacto entre animales infectados y susceptibles o, más raramente, por exposición de animales
susceptibles a las secreciones y excreciones de animales con infección aguda. Después de la recuperación del
estado agudo de la infección, los virus infecciosos desaparecen de todas las secreciones y excreciones con
excepción, en el caso de los rumiantes, de las de origen esofágico-faríngeo (OP). Los animales en los que el
virus persiste en las OP durante más de 28 días después de la infección se denominan portadores. Los cerdos
no son portadores. Alguna evidencia circunstancial indica que, en raras ocasiones, los portadores son capaces
de transmitir la infección a animales susceptibles con los que están en contacto estrecho: el mecanismo
implicado resulta desconocido. Normalmente el estado de portador en el ganado bovino no persiste más allá de
6 meses, aunque en una pequeña proporción puede durar hasta 3 años. En búfalos africanos, a título individual,
se ha visto que el virus persiste durante al menos 5 años, pero probablemente no es un fenómeno que dure toda
la vida. Dentro de una manada de búfalos, el virus se puede mantener durante 24 años o más. No existe
información sobre la duración del estado de portador en otro búfalo doméstico, el búfalo de los pantanos del este
de Asia. Por lo general, el búfalo doméstico, las ovejas y las cabras no portan el virus de la FA durante más de
unos pocos meses.
Debido a la naturaleza contagiosa y a la importancia económica de la FA, el diagnóstico de laboratorio y la
identificación del serotipo del virus deben realizarse en un laboratorio de seguridad biológica para virus. Este
servicio debe cumplir los requisitos del Grupo 4 de Contención de patógenos indicado en el Apéndice I.1.6.1. del
Capítulo I.1.6. de este Manual. Los países sin acceso a tal laboratorio especializado nacional o regional de estas
características deben enviar las muestras a un Laboratorio de Referencia de la OIE para FA. Las instalaciones
de producción de vacunas también deben cumplir los requisitos para el Grupo 4 de Contención de patógenos.
Los reactivos estándar y para el diagnóstico se pueden obtener como preparados comerciales o como artículos
individuales proporcionados por el Laboratorio de Referencia Mundial de la FAO para FA. El uso de antígenos
inactivados en el enzimoinmunoensayo (ELISA), como controles en las pruebas de detección de antígeno o para
reaccionar con sueros de ensayo en las pruebas ELISA bloqueantes en fase líquida o competitivas en fase
sólida, reduce el riesgo de enfermedad existente con el uso de virus vivos. Los reactivos se suministran
liofilizados o en glicerol y son estables a 4ºC y a –20ºC, respectivamente, durante muchos años. La Agencia
2
Internacional de la Energía Atómica ha editado un manual que incluye una prueba recomendada y protocolos
para el control de calidad.
2
International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
125
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Para el diagnóstico, las muestras mejores son el tejido epitelial o el líquido vesicular. Idealmente, se debe
recoger por lo menos 1 g de tejido epitelial de vesículas sin romper o recién rotas. Para evitar daños al personal
que recoge las muestras, así como por el cuidado a los animales, se recomienda sedar a los animales antes de
obtener las muestras.
Las muestras de epitelio se deben colocar en un medio para transporte compuesto de cantidades iguales de
glicerol y tampón fosfato 0,04 M, pH 7.2-7.6, preferiblemente con antibióticos (penicilina [1.000 Unidades
Internacionales (UI)], sulfato de neomicina [100 UI], sulfato de polimixina B [50 UI], micostatin [100 UI]). Si no se
dispone de tampón fosfato 0,04 M, se puede utilizar medio de cultivo de tejidos o solución salina tamponada
(PBS), pero es importante que el pH final de la mezcla glicerol/tampón esté en el intervalo de pH 7.2-7.6. Las
muestras deben mantenerse refrigeradas o en hielo hasta su llegada al laboratorio.
Cuando no se puede disponer de tejido epitelial de rumiantes, por ejemplo, en casos avanzados o de
convalecencia, o cuando se sospecha la infección en ausencia de síntomas clínicos, se pueden tomar muestras
de líquido OP por medio de una sonda (esputos) (o en cerdos, por frotis de garganta3) para su envío a un
laboratorio para el aislamiento de virus.
Antes de recoger las muestras OP del ganado o de grandes rumiantes (como búfalos), se deben añadir, a un
recipiente de unos 5 ml de capacidad y con capacidad de resistir la congelación por dióxido de carbono (nieve
carbónica) o por nitrógeno líquido, 2 ml de líquido de transporte (formado por tampón fosfato 0,08 M que
contenga 0,01% de seroalbúmina bovina, 0,002% de rojo fenol, antibióticos [1.000 unidades/ml de penicilina, 100
unidades/ml de micostatin, 100 unidades/ml de neomicina y 50 unidades/ml de polimixina], ajustado a pH 7,2).
Después de recoger el líquido OP mediante sonda, el contenido se vierte en una botella transparente de boca
ancha de unos 20 ml de capacidad. Se examina el líquido, que debería contener algún material celular visible. Se
toman 2 ml y se añaden a 2 ml del líquido de transporte, asegurándose que se transfiere material celular; la
mezcla se agita suavemente y debe tener un pH final próximo a pH 7,6. Las muestras contaminadas con material
del rumen pueden ser inadecuadas para cultivo y las que contienen sangre tampoco son por completo
satisfactorias. Se puede repetir el muestreo después de lavar la boca y la garganta del animal con agua o PBS.
Las muestras OP de pequeños rumiantes se recogen poniendo 2 ml del líquido de transporte en una botella de
boca ancha de unos 20 ml de capacidad y lavando, después de la toma, la sonda y la copa de recogida con
este líquido de transporte para descargar la muestra OP. Esto se transfiere luego a un recipiente de cerca de 5
ml de capacidad para el transporte. El pequeño recipiente debe tener la capacidad de resistir la congelación por
dióxido de carbono (nieve carbónica) o por nitrógeno líquido (27).
Las muestras de líquido OP se deben refrigerar o congelar inmediatamente después de tomadas. Si el transporte
no dura más que unas pocas horas, se deben congelar con nieve carbónica o con nitrógeno líquido. Antes de
congelar, los recipientes se deben cerrar cuidadosamente con tapones herméticos o con silicona. Esto es
particularmente importante cuando se utiliza nieve carbónica, pues la introducción de CO2 en la muestra OP
hace que descienda el pH, inactivando cualquier virus de la FA que pudiera estar presente en la muestra. No
deberían utilizarse recipientes de cristal por existir el riesgo de que exploten al descongelarse si penetra
nitrógeno líquido. Las muestras deben llegar al laboratorio en estado congelado.
Se deben tomar precauciones especiales cuando se envíe material perecedero sospechoso de FA tanto dentro
de un país como entre diversos países. Las Regulaciones sobre Materiales Peligrosos (DGR) de la Asociación
Internacional del Transporte Aéreo (IATA) especifican los requisitos de embalaje y envío de muestras
diagnósticas por todos los medios comerciales de transporte. Éstos se resumen en el Capítulo I. 1. 1. Métodos
de muestreo.
1.
Identificación del agente
a)
Aislamiento de los virus
La muestra de epitelio se extrae de la mezcla PBS/glicerol, se transfiere sobre papel absorbente para
reducir el contenido en glicerol, que es tóxico para los cultivos celulares, y se pesa. Se debe preparar una
suspensión homogenizando la muestra en arena estéril y un mortero con mano estéril con un pequeño
volumen de medio de cultivo de tejidos y antibióticos. Se añade luego más medio hasta un volumen final
cinco veces superior al de la muestra epitelial añadida, obteniéndose una suspensión al 20%. Ésta se
3
126
El cerdo debe mantenerse de modo adecuado, preferiblemente en posición decúbito supino en una caja de madera y con
el cuello extendido. Manteniendo una torunda de algodón con un instrumento apropiado, por ejemplo con unas pinzas
hemostáticas, se empuja la torunda hacia la parte posterior de la boca dentro de la faringe.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
clarifica en una centrífuga de sobremesa a 2.000 x g durante 10 minutos. Una vez clarificadas, las
suspensiones de las muestras sospechosas de contener virus de la FA se inoculan en cultivos celulares o
en ratones lactantes. Los sistemas de cultivos celulares sensibles incluyen células primarias de tiroides
bovino, y células primarias de riñón de cerdo, ternero o cordero. Se pueden utilizar líneas celulares
establecidas, como la BHK-21 (de riñón de hámster lactante) o la IB-RS-2, pero son menos sensibles que
las células primarias para detectar niveles bajos de infectividad (10). Los cultivos celulares deben
examinarse para efecto citopático (ECP) durante 48 horas. Si no se detecta ECP las células se deben
congelar y descongelar, y utilizar para inocular cultivos frescos, que se examinan para ECP durante otras
48 horas. La alternativa a los cultivos celulares son los ratones lactantes, que deben tener 2-7 días de edad
y proceder de cepas de razas seleccionadas. Algunos virus de campo necesitan varios pases antes de
adaptarse a ratones (38).
b)
Métodos inmunológicos
•
Enzimoinmunoensayo
En el Laboratorio de Referencia Mundial para la FA de la FAO (ver pie de página 1), el mejor procedimiento
para la detección del antígeno vírico de la FA y para la identificación de los serotipos víricos es el ELISA
(20, 36). Se trata de una prueba indirecta de tipo "sandwich" en la que las diferentes filas de las placas
multipocillo están recubiertas con antisuero de conejo a cada uno de los siete serotipos del virus de la FA.
Estos son los sueros de "captura". A cada una de las filas se añaden suspensiones de las muestras de
ensayo, incluyendo los controles apropiados. Después se añade antisuero de cobaya a cada uno de los
serotipos del virus de la FA, y a continuación suero anti-cobaya de conejo conjugado con un enzima. Entre
cada paso se lava cuidadosamente para eliminar los reactivos no fijados. Una reacción coloreada después
de la adición del substrato del enzima indica una reacción positiva; también se puede identificar el serotipo
del virus de la FA. Los valores próximos a 0,1 deben confirmarse por repetición o por amplificación del
antígeno por pases en cultivo celular y prueba del sobrenadante después de que se haya desarrollado
ECP. Más adelante se presenta un protocolo adecuado.
Dependiendo de la especie y del origen geográfico de la muestra puede ser apropiado probar
simultáneamente para el virus de la enfermedad vesicular porcina (SVD) y el virus de la estomatitis
vesicular (VS). En teoría, en todas las condiciones de manifestaciones vesiculares se debería hacer un
diagnóstico diferencial completo.
Como anticuerpo de captura, se utiliza antisuero de conejo contra el antígeno 146S de cada uno de los
siete serotipos del virus de la FA (más el virus de la SVD, si fuera necesario), a una concentración óptima
predeterminada y en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6.
Los antígenos control se preparan de cepas seleccionadas de cada uno de los siete serotipos del virus de
la FA (más el virus de la SVD si fuera necesario), que se cultivan en monocapas de células BHK-21 (células
IB-RS-2 para el virus de la SVD). Se utilizan los sobrenadantes sin purificar y se pretitulan en placas ELISA.
La dilución final que se escoge es la que corresponde a una absorbancia en la parte superior de la región
lineal de la curva de titulación (densidad óptica aproximada 0,2), de modo que las diluciones a 1/5 de los
antígenos control que se utilizan en la prueba den dos lecturas adicionales de densidad óptica más baja de
las que se pueda tener referencia en la curva de titulación. Como diluyente se usa PBS con 0,05% de
Tween 20 y rojo fenol como indicador (PBST).
Como anticuerpo de detección se utilizan antisueros de cobaya preparados por inoculación de cobayas con
antígeno 146S de uno de los siete serotipos del virus de la FA (más el virus de la SVD si fuera necesario) y
prebloqueados con suero bovino normal (NBS). Se preparan concentraciones óptimas predeterminadas en
PBS con 0,05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo desnatada (PBSTM).
Se utiliza inmunoglobulina de conejo (o de oveja) anti-cobaya conjugada con peroxidasa de rábano y
prebloqueda con NBS, a una concentración óptima predeterminada en PBSTM. Como alternativa a los
antisueros de cobaya o conejo, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales (MAbs) adecuados unidos a
las placas ELISA como anticuerpos de captura o conjugados con peroxidasa como anticuerpos de
detección.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Las placas ELISA se recubren con sueros antivíricos de conejo (50 µl/pocillo) en tampón
carbonato/bicarbonato, pH 9,6. Las filas A hasta H reciben, respectivamente, antisueros contra los
serotipos O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia1 y virus SVD (opcional).
ii)
Se dejan toda la noche a 4ºC en posición estática o en un agitador a 100-120 revoluciones por minuto
en un incubador a 37ºC durante 1 hora.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
127
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
iii)
Preparar la suspensión de la muestra de ensayo (con la suspensión de la muestra original al 20% o
con los sobrenadantes clarificados y sin diluir de los cultivos celulares).
iv)
Lavar cinco veces las placas ELISA con PBS.
v)
En cada placa, cargar los pocillos de las columnas 4, 8 y 12 con 50 µl de PBS. Además, añadir 50 µl
de PBST a los pocillos 2 y 3 de las filas A hasta H de la placa 1. Al pocillo 1 de la fila A de la placa 1
se añaden 50 µl de antígeno control de tipo O, y al pocillo 2 de la fila A se añaden 12.5 µl de antígeno
control de tipo O. Se mezcla el antígeno y el diluyente en el pocillo 2 y se transfieren 12,5 µl del pocillo
2 al pocillo 3 de la fila A. Mezclar y eliminar 12,5 µl del pocillo 3 (esto da diluciones seriadas de 1/5 del
antígeno O). Repetir del mismo modo con el antígeno A, añadiendo 50 µl de antígeno de tipo A al
pocillo 1 de la fila B, y 12,5 µl de antígeno de tipo A al pocillo 2, y luego mezclar y transferir 12.5 µl al
pocillo 3 (como antes para el antígeno O), y continuar el mismo proceso para los tipos C, SAT1, SAT2,
SAT3, Asia1 y SVD (si es necesario). Sólo se requiere cambiar las puntas de las micropipetas entre
antígenos. El resto de la placa se puede rellenar con muestra(s) de ensayo. Añadir 50 µl de la muestra
uno a los pocillos 5, 6 y 7 de las filas A hasta H. La segunda muestra se coloca de modo similar en las
columnas 9, 10 y 11 de las filas A hasta H.
Si se ensayan más de dos muestras al mismo tiempo, las otras placas ELISA se deben de utilizar
como sigue:
Depositar 50 µl de PBST en los pocillos (en las filas A hasta H) de las columnas 4, 8 y 12 (columnas
de control de tampón). Adviértase que en estas placas no se necesitan los antígenos control. Las
muestras de ensayo se pueden añadir en volúmenes de 50 µl en las columnas A hasta H a las
columnas 1, 2, 3; 5, 6, 7; 9, 10, 11, respectivamente.
vi)
Cubrir con las tapas y colocar en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.
vii)
Lavar las placas por inundación con PBS -lavar tres veces como antes y vaciar el líquido residual.
Secar las placas con papel secante.
viii) Pasar 50 µl de cada dilución de suero de cobaya a cada pocillo de la placa en el orden apropiado, es
decir, las filas A hasta H, reciben respectivamente antisueros contra los serotipos O, A, C, SAT1,
SAT2, SAT3, Asia1 y contra el virus de VSD (opcional).
ix)
Cubrir con las tapas y colocar en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.
x)
Lavar de nuevo las placas tres veces y añadir a cada pocillo 50 µl de inmunoglobulina de conejo anticobaya conjugada con peroxidasa de rábano. Las placas se incuban a 37ºC durante 1 hora en un
agitador orbital.
xi)
Lavar de nuevo las placas tres veces y añadir a cada pocillo 50 µl de solución de substrato con 0,05%
de H2O2 más ortofenilén diamina o un cromógeno alternativo adecuado.
xii)
La reacción se detiene a los 15 minutos añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 1,25 M. Las placas se leen
a 492 nm en un espectrofotómetro acoplado a un ordenador.
•
Prueba de fijación de complemento
La técnica ELISA es preferible a la prueba de fijación de complemento (FC) porque es más sensible y no se
ve afectada por factores pro- y anti-complementarios. No obstante, si se carece de los reactivos para
ELISA, se puede utilizar la prueba FC del siguiente modo:
Se diluyen en tampón veronal (VBD) los antisueros contra cada uno de los siete tipos de virus de FA, en
diluciones de 1.5 veces, desde una dilución inicial 1/16 para dejar 25 µl de las diluciones sucesivas de
antisuero en pocillos con fondo redondeado de una placa de microtitulación. Se añade a éstos 50 µl de 3
unidades de complemento y a continuación 25 µl de suspensión de la(s) muestra(s) de ensayo. El sistema
se incuba a 37ºC durante 1 hora antes de añadir 25 µl de eritrocitos de oveja (SRBC) estandarizados al
1.4% en VBD y sensibilizados con 5 unidades de anti-SRBC de conejo. Los reactivos se incuban a 37ºC
durante otros 30 minutos y después se centrifugan las placas y se leen. Se incluyen controles adecuados
para las suspensiones de ensayo, antisueros, células y complemento. Los títulos de FC se expresan como
el inverso de la dilución del suero que produce un 50% de hemolisis. Un título FC >36 se considera una
reacción positiva. Valores de 24 en el título deben confirmarse volviendo a probar el antígeno amplificado
por pases en cultivo de tejidos.
128
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
c)
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
Se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los fragmentos del genoma
del virus de la FA en materiales para diagnóstico (2, 8). Se han diseñado cebadores específicos para
distinguir cada uno de los siete serotipos. Para investigar la presencia del ARN del virus de la FA en
muestras de tejidos se han desarrollado técnicas de hibridación in situ (44). Estas técnicas solo se utilizan
en laboratorios especializados.
La epidemiología molecular de la FA se basa en la comparación de las diferencias genéticas entre los virus
aislados. Se han publicado dendogramas que muestran la relación genética entre las cepas vacunales y
naturales de los siete serotipos respecto a secuencias derivadas del gen 1D. La amplificación del ARN del
virus de la FA por PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es la opción preferida actualmente para generar
los datos de secuencias que permiten realizar estas comparaciones. El Laboratorio Mundial de Referencia
(WRL) y otros laboratorios han desarrollado técnicas para realizar estos estudios, y actualmente se
mantiene una base de datos con más de 3000 secuencias.
El método recomendado es el siguiente:
i)
Extraer el ARN del virus directamente de suspensiones epiteliales, o de pases bajos en cultivo celular.
ii)
Realizar una RT-PCR del gen VP1 completo (o, si sólo una parte del gen VP1, el extremo 3´del gen es
más útil)
iii)
Determinar la secuencia nucleotídica del producto de la PCR (o, por lo menos, 170 nucleótidos
[preferiblemente 420 para los tipos SAT] en el extremo 3´del gen).
Se puede disponer de un protocolo completo con secuencias cebadoras, previa solicitud del WRL, o se
puede bajar de la siguiente dirección en la World Wide Web:
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphtovitus/fmd.htm
2.
Pruebas serológicas
La infección por el virus de la FA se puede diagnosticar por la detección de una respuesta de anticuerpos
específicos. Las pruebas generalmente utilizadas son la neutralización del virus (NV) y el ELISA (24, 25,
41). Éstas son también las pruebas ordenadas para el comercio de ganado. La prueba NV es específica de
serotipo, requiere disponer de servicios de cultivos celulares y tarda 2-3 días en proporcionar resultados. La
prueba ELISA es un ensayo de tipo bloqueante o competitivo que utiliza anticuerpos poli o monoclonales
específicos de serotipo. Por consiguiente, es específica de serotipo, sensible y cuantitativa, y tiene la
ventaja de que es más rápida de realizar, es menos variable y no depende del uso de sistemas de cultivos
celulares. Por cualquiera de las dos pruebas se puede esperar una proporción baja de sueros de título bajo
con reacciones positivas falsas. Una combinación de análisis por ELISA y la confirmación de los positivos
por la prueba de NV reduce los resultados falsos positivos. La OIE ha coordinado la producción de sueros
de referencia para estandarizar las pruebas serológicas de la FA; están disponibles en el WRL.
La detección de anticuerpos contra las proteínas no estructurales (NSPs) del virus de la FA se ha utilizado
para identificar infecciones pasadas o actuales con algunos de los siete serotipos del virus,
independientemente de que el animal haya sido también vacunado. Esto se ha realizado de modo
convencional, midiendo el anticuerpo contra el antígeno vírico asociado a la infección (VIAA; la proteína de
la ARN polimerasa vírica 3D) por medio de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (31). Aunque es
relativamente insensible, la prueba es barata, fácil de llevar a cabo y utilizada ampliamente en Sudamérica
para detectar la actividad vírica en una población durante las campañas de erradicación de la FA. La
prueba VIAA está actualmente superada por pruebas que miden anticuerpos frente a NSPs del virus de la
FA producidas por técnicas recombinantes en una variedad de sistemas de expresión in vitro. En general,
se considera que los indicadores más fiables de infección son los anticuerpos contra las poliproteínas 3AB
o 3ABC (11, 30, 39). En animales seropositivos para anticuerpos contra 3AB o 3ABC, los anticuerpos contra
una o más de las otras NSPs, incluyendo la proteína L, 2C, 3A, 3B o 3D, sirven de confirmación adicional
de la infección (9, 30, 39). La prueba se puede utilizar para detectar la infección por el virus de la FA en
poblaciones vacunadas y no vacunadas. Sin embargo, la pureza de la vacuna es una consideración
importante ya que la presencia de trazas de NSPs en algunas preparaciones de vacunas puede originar
reacciones positivas falsas en animales que han sido vacunados repetidamente. A la inversa, hay evidencia
experimental de que unos pocos animales, vacunados y después probados en desafío con virus vivos y con
infección persistente, pueden pasar sin ser detectados en algunas pruebas anti-NSP, originando resultados
negativos falsos (28). Por tanto, las pruebas NSP pueden utilizarse a nivel poblacional, pero no a nivel de
animal individual, para detectar la circulación del virus de la FA en poblaciones vacunadas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
a)
Neutralización de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional)
La microprueba cuantitativa NV para anticuerpo contra la FA se realiza con células IB-RS-2, BHK-21 o con
células de riñón de cordero o cerdo, en placas de microtitulación para cultivo de tejidos con pocillos de
fondo plano.
Los virus se cultivan en monocapas celulares y se guardan a -20ºC después de añadir glicerol al 50%. (El
virus es estable en estas condiciones por lo menos durante 1 año). Antes de la prueba, los sueros de
ensayo se inactivan a 56ºC durante 30 minutos. El suero control estándar es suero de convaleciente de 21
días (normalmente de cerdo). Un medio adecuado es el medio completo de Earle/LYH (solución salina
equilibrada de Hank con hidrolizado de levadura y lactoalbúmina) más antibióticos.
La prueba utiliza volúmenes idénticos de 50 µl.
•
Procedimiento de la prueba:
i)
Comenzando con la dilución 1/4, se diluyen los sueros en soluciones dobles seriadas por la placa,
utilizando al menos dos filas de pocillos por suero, preferiblemente cuatro filas, y un volumen de 50 µl.
ii)
Se añade virus previamente titulado; cada 50 µl de suspensión vírica debe contener aproximadamente
100 DICT50 (dosis infectiva 50% cultivo de tejidos) dentro de un margen aceptable (por ejemplo, 35350 DICT50).
iii)
Los controles incluyen un antisuero estándar de título conocido, un suero negativo, un control de
células, un control de medio y una titulación vírica empleada para calcular el título real del virus
utilizado en la prueba.
iv)
Incubar a 37ºC durante 1 hora con las placas cubiertas.
v)
Se prepara una suspensión celular de 106 células/ml en medio que contenga 10% de suero bovino
(negativo para el anticuerpo específico) para el crecimiento celular. A cada pocillo se añaden 50 µl de
la suspensión celular.
vi)
Las placas se cierran a presión con las tapas y se incuban a 37ºC durante 2-3 días. Alternativamente,
se cubren con las tapas flojas y se incuban a 37ºC durante 2-3 días en una atmósfera de 3-5% de
dióxido de carbono.
vii)
Después de 48 horas se pueden realizar lecturas microscópicas. Finalmente las placas se fijan y se
tiñen, por lo general, al tercer día. La fijación se hace con 10% formol en solución salina durante
30 minutos. Para la tinción las placas se sumergen en 0,05% de azul de metileno con 10% de
formalina durante 30 minutos. Una alternativa de fijación y tinción consiste en utilizar una solución de
azul negro de naftaleno (0,4% [p/v] de azul negro de naftaleno, 8% [p/v] de ácido cítrico en solución
salina) (23). Las placas se lavan con agua del grifo.
viii) Los pocillos positivos (allí donde el virus se ha neutralizado y las células permanecen intactas)
contienen capas celulares teñidas de azul; los pocillos negativos (donde el virus no ha sido
neutralizado) están vacías. Los títulos se expresan como la dilución final del suero presente en la
mezcla suero/virus al punto final del 50%, como en el método de Kärber. La prueba se
considera válida cuando la cantidad de virus utilizada por pocillo está comprendida en el intervalo
log10 1.5-2.5 DICT50, y el suero positivo estándar está dentro de un margen equivalente a dos veces
su título esperado.
ix)
b)
La interpretación de las pruebas puede variar entre laboratorios respecto al punto final tomado. Los
laboratorios deben establecer sus propios criterios con referencia a reactivos estándar que pueden
obtenerse del WRL de la FAO para FA (ver nota a pie de página 1). En el WRL, un título de 1/45 o
más de la dilución final del suero en la mezcla suero/virus se considera positivo. Títulos de 1/16 a 1/32
se consideran dudosos, y se necesitan más muestras de suero para prueba. El animal se considera
positivo, si la segunda muestra presenta un título de 1/16 o superior. Un título de 1/8 o inferior se
considera negativo.
Enzimoinmunoensayo competitivo en fase sólida (prueba prescrita para el comercio internacional)
Como anticuerpo de captación, se utiliza antisuero de conejo contra el antígeno 146S de uno de los
4
siete tipos de virus de la FA a una concentración óptima predeterminada en tampón carbonato/bicarbonato,
pH 9.6.
4
130
Se realiza una titulación del tipo en tablero de ajedrez del antisuero captador de conejo, del antisuero de cobaya y del
antisuero anti-cobaya. Antes de utilizar el ELISA de captación de antígeno o el ELISA de bloqueo en fase líquida, se titula
cada uno de estos reactivos, uno frente al otro, manteniendo el tercero a una concentración constante. De este modo, se
pueden determinar las diluciones óptimas (para color positivo y para bajo color de fondo). Estas dilucione
predeterminadas" se pueden utilizar después para todas las pruebas que en el futuro utilicen estos lotes particulares de
reactivos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
Los antígenos se preparan inactivando virus procedentes de cultivos celulares con etilenimina, utilizando los
procedimientos descritos para la producción de vacunas. La dilución final escogida es la que, después de
añadir un volumen idéntico de diluyente, proporciona una absorbancia en la parte superior de la región
lineal de la curva de titulación (densidad óptica aproximada de 1,5). Como diluyente se utiliza PBS que
contiene 0,05% de Tween 20 y rojo de fenol como indicador (PBST).
Como anticuerpos de detección, se utilizan antisueros de cobaya, preparados mediante inoculación de
cobayas con el antígeno 146S de uno de los siete serotipos y prebloqueado con suero normal de bovino.
Las concentraciones óptimas predeterminadas se preparan en PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 5%
de leche desnatada en polvo (PBSTM).
La inmunoglobulina anti-cobaya de conejo (o de oveja) se emplea a una concentración óptima
predeterminada en PBSTM conjugada con peroxidasa de rábano y prebloqueada con NBS.
Los sueros de ensayo se diluyen en PBST.
Los estudios realizados en colaboración han indicado que el ELISA competitivo en fase sólida es más
específico que el ELISA de bloqueo en fase líquida, pero de sensibilidad similar (29).
•
Procedimiento de la prueba
i)
Las placas ELISA se recubren con 50 µl/pocillo de anticuerpo de conejo contra el antígeno vírico de la
FA diluido en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6, y se deja toda la noche a 4ºC en una cámara
húmeda.
ii)
Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.
iii)
A continuación se añaden, a cada pocillo de la placa de ELISA, 50 µl del antígeno del virus de la FA
diluido en tampón de bloqueo. (Tampón de bloqueo: 0,05% [p/v] de Tween 20, 10% [v/v] de suero
bovino normal, 5% [v/v] de suero de conejo normal). Las placas se tapan y se colocan en un agitador
orbital a 37ºC durante 1 hora, con agitación continua.
iv)
Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden a cada pocillo 40 µl de tampón de bloqueo y 10 µl
de suero de ensayo (o de suero control), lo que proporciona una dilución inicial de suero de 1/5.
v)
Inmediatamente se añaden 50 µl de antisuero de cobaya contra el virus de la FA diluido en tampón de
bloqueo, obteniendo una dilución final del suero de 1/10.
vi)
Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.
vii)
Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden 50 µl de Ig anti-cobaya conjugada, diluida en
tampón de bloqueo. Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37ºC durante 1 hora.
viii) Después de lavar cinco veces con PBS, se añaden a cada pocillo 50 µl de solución de substrato que
contiene 0,05% de H2O2 más ortofenilén diamina o un cromógeno alternativo adecuado.
c)
ix)
La reacción se para a los 10 minutos añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 2 M. Las placas se leen en un
espectrofotómetro acoplado a un ordenador.
x)
Controles: Se utilizan dos pocillos por cada placa para los controles de conjugado (sin suero de
cobaya), cuatro pocillos para sueros positivos fuertes y débiles, dos pocillos para sueros negativos y
cuatro pocillos para competición nula (sin suero de ensayo).
xi)
Interpretación de los resultados: Para cada pocillo se calcula un porcentaje de inhibición, visualmente
o mediante un programa adecuado de ordenador (100 – [densidad óptica de cada valor de ensayo o
control/densidad óptica media del resultado de competición nula] x 100) que represente la competición
entre el suero de ensayo y el antisuero de cobaya contra el virus de la FA en la placa de ELISA.
Inhibiciones superiores al 60% son positivas (35).
Enzimoinmunoensayo de bloqueo en fase líquida
Los antígenos se preparan a partir de cepas seleccionadas de virus de la FA cultivados en monocapas de
células BHK-21. Se utilizan los sobrenadantes sin purificar y se pretitulan con diluciones seriadas dobles,
pero sin suero. La dilución final elegida es la que, después de añadir el mismo volumen de diluyente (ver a
continuación), proporciona una absorbancia en la parte superior de la región lineal de la curva de titulación
(Densidad óptica aproximada de 1,5). Como diluyente se emplea PBS con 0,05% de Tween 20 y rojo de
fenol como indicador (PBST). Los otros reactivos utilizados en la prueba son los mismos que para ELISA de
bloqueo en fase sólida.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
131
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
•
Procedimiento de la prueba
i)
Las placas ELISA se recubren con 50 µl/pocillo de antisuero de conejo contra el antígeno 146S que se
va a ensayar y se dejan toda la noche en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
ii)
Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.
iii)
En placas multipocillo con fondo en U (placas portadoras) se preparan por duplicado 50 µl de
diluciones seriadas dobles de cada suero de ensayo, comenzando con ¼. A cada pocillo, se añaden
50 µl de una dosis constante de antígeno vírico homólogo al antisuero de conejo utilizado para recubrir
las placas, y las mezclas se dejan toda la noche a 4ºC, o se incuban a 37ºC durante 1 hora. La adición
del antígeno aumenta la dilución inicial del suero a 1/8.
iv)
A continuación se transfieren 50 µl de las mezclas suero/antígeno de las placas portadoras a las
placas ELISA recubiertas con suero de conejo y se incuban las placas a 37ºC durante 1 hora en un
agitador orbital.
v)
Después de lavar, se añaden a cada pocillo 50 µl de antisuero de cobaya homólogo al antígeno
utilizado en el paso previo (iv). A continuación, las placas se incuban a 37ºC durante 1 hora en un
agitador orbital.
vi)
Se lavan las placas y se añaden a cada pocillo 50 µl de inmunoglobulina de conejo anti-cobaya,
conjugada con peroxidasa de rábano. Se incuban las placas a 37ºC durante 1 hora en un agitador
orbital.
vii)
Las placas se lavan de nuevo tres veces y se añaden a cada pocillo 50 µl de la solución de substrato
que contiene 0,5% de H2O2 más ortofenilén diamina o un cromógeno alternativo adecuado.
viii) La reacción se para a los 15 minutos mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 1 M. Las placas
se leen en un espectrofotómetro acoplado a un ordenador.
d)
ix)
Controles: En cada placa se incluye un mínimo de cuatro pocillos para cada uno de los sueros bovinos
de referencia (muy positivo, débilmente positivo y negativo) a una dilución final de 1/32 junto con un
número equivalente de pocillos para control de antígeno, que contengan sólo antígeno en diluyente sin
suero. Para pruebas de titulación a punto final, en cada prueba se debe incluir por duplicado, por lo
menos en una placa, una serie de diluciones dobles de sueros bovinos de referencia positivos y
negativos.
x)
Interpretación de los resultados: Los títulos de anticuerpo se expresan como el 50% del título a punto
final, es decir, la dilución a la que la reacción de los sueros ensayados origina una densidad óptica
igual al 50% de inhibición de la densidad óptica media de la reacción en los pocillos control (antígeno)
(Kärber). La mediana se calcula como la media de dos valores medios de la reacción en los pocillos
control, eliminando del cálculo los valores más altos y los más bajos (alternativamente, se puede
utilizar el valor medio después de ajustar unos límites adecuados de tolerancia al control para
variaciones entre los pocillos). Los títulos superiores a 1/40 se consideran positivos. Los títulos
próximos a 1/40 se deben volver a probar utilizando la prueba NV.
Pruebas de anticuerpo contra proteínas no estructurales
Los anticuerpos contra las NSPs expresadas en virus recombinantes de la FA se pueden medir por ELISA o
inmunotransferencia. En varios laboratorios se ha comprobado que varios métodos ELISA indirectos son
sensibles, específicos y fiables. Estos enzimoinmunoensayos utilizan antígenos purificados que se
adsorben directamente en microplacas o emplean anticuerpos policlonales o monoclonales para capturar
antígenos específicos de preparaciones semi-purificadas (9, 11, 30). También se ha desarrollado un ELISA
competitivo (39). Más adelante se describen con detalle ejemplos de una técnica de ELISA y de una
inmunotransferencia.
Como se ha indicado con anterioridad, la prueba IGDA para detectar anticuerpos contra la VIAA (proteína
de la ARN polimerasa vírica 3D) se ha utilizado mucho en Sudamérica (31). Actualmente se ha substituido
en gran medida por pruebas de tipo ELISA o de inmunotransferencia.
132
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
• Enzimoinmunoensayo indirecto
•
Preparación de antígenos recombinantes (ver Sección B.2.d. Prueba de enzimoinmunotransferencia,
más adelante)
•
Procedimiento de la prueba
i)
Las microplacas se recubren durante toda la noche a 4ºC con 1 µg/ml del antígeno de fusión 3ABC en
tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6 (100 µl por pocillo). El antígeno 3ABC se expresa y purifica
como se indica para las pruebas EITB (33).
ii)
Se lavan las placas seis veces con PBS, pH 7,2, que contiene 0,05% de Tween 20 (PBST).
iii)
Se añaden los sueros de ensayo (100 µl por pocillo) a una dilución 1/20 en tampón de bloqueo que
consiste en PBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leche en polvo desnatada, 10% de suero de caballo y
0,1% de lisado de Escherichia coli. Cada placa incluye un juego de controles positivos, fuertes y
débiles, y de controles negativos, calibrados frente a los Sueros Internacionales Estándar descritos
más abajo.
iv)
Se incuban las placas durante 30 minutos a 37ºC y se lavan seis veces con PBST.
v)
Se añaden 100 µl por pocillo de IgG de conejo contra la especie, conjugada con peroxidasa de rábano
y diluida de modo óptimo en tampón de bloqueo. Se incuban las placas durante 30 minutos a 37ºC.
vi)
Después de seis lavados, cada pocillo recibe 100 µl de 3´3´, 5´5´-tetrametilbenzidina más 0,004% (p/v)
de H2O2 en tampón fosfato/citrato, pH 5.5.
vii)
La reacción se para a los 15 minutos de incubación a temperatura ambiente añadiendo 100 µl de
ácido sulfúrico 0,5 M. La absorbancia se lee a 450 nm y a 620 nm para corrección de fondo.
viii) Interpretación de los resultados: Los resultados se expresan como porcentaje relativo de positividad
respecto al control positivo fuerte [(densidad óptica del pocillo de ensayo o control/densidad óptica del
control positivo fuerte) x 100]. Los valores de corte, con y sin zonas de sospecha, se determinan por
los laboratorios individuales en función de la finalidad de la prueba y de la población objeto del
análisis.
•
Sueros Internacionales Estándares
Se están desarrollando en la actualidad sueros internacionales estándares sobre la base del método
descrito arriba. Se trata de tres estándares: un positivo fuerte, un positivo débil y otro negativo, obtenidos de
acuerdo con las Normas de la OIE (34). Estos sueros serán los materiales de referencia para calibrar otros
métodos de prueba y otros reactivos y como prototipos para la producción de estándares nacionales y de
trabajo. El estándar positivo fuerte representará el nivel superior de detección de anticuerpo. El estándar
positivo débil representará el nivel inferior de detección o la sensibilidad analítica del método de la prueba.
Es importante advertir que la dilución de estándar positivo débil debe elegirse de tal modo que sea
inequívocamente positiva en todos los ensayos. El estándar negativo, utilizado para preparar diluciones de
los estándares positivos, actuará como control de la línea basal o de fondo para los estándares positivos.
•
Prueba de enzimoinmunotransferencia (EITB)
La prueba EITB se ha empleado mucho en Sudamérica para el control y determinación de riesgos
asociados con el desplazamiento de animales. Actualmente, el procedimiento consiste en un análisis inicial
utilizando un ELISA indirecto para anticuerpos contra 3ABC, seguido por una prueba confirmativa EITB, si
las muestras dan resultados positivos o sospechosos. En particular, se recomienda esta combinación de
pruebas cuando el control implica un gran número de muestras. Se dispone de más información en el
Laboratorio de Referencia de la OIE de Brasil (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).
•
Preparación de las tiras de ensayo con los antígenos recombinantes
i)
Las cinco NSPs del virus de la FA sometidas a ingeniería genética, 3A, 3B, 2C, 3D, y 3ABC, se
expresan en E. coli C600 por termo-inducción. El polipéptido 3D se expresa en su forma completa
(33), mientras que el resto de las proteínas se obtiene como productos de fusión con la porción Nterminal del gen de la polimerasa del MS-2 (40).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
133
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
ii)
La polimerasa expresada se purifica en fosfocelulosa, y después por columnas de Sefarosa poli-U.
Las proteínas de fusión 3A, 3B, 2C y 3ABC se purifican por extracción secuencial de los extractos
bacterianos con concentraciones crecientes de urea. La fracción 7M, que contiene las proteínas de
fusión, se purifica por una SDS-PAGE preparativa al 10% (dodecil sulfato sódico-electroforesis en gel
de poliacrilamida). La banda de proteínas de fusión se separa del gel y se electroeluye (33).
iii)
Mediante SDS-PAGE al 12.5%, se separa una mezcla que contenga 20 ng/ml de cada uno de los
polipéptidos recombinantes purificados y se transfieren electroforéticamente a nitrocelulosa (33).
•
Procedimiento de la prueba
i)
Debe determinarse la cantidad necesaria de tiras de muestra considerando que, por cada lámina de
nitrocelulosa que define un gel de transferencia, se debe probar un suero positivo, otro positivo débil,
otro de corte, y un control de suero negativo. En general, de un gel deben derivar 24 tiras de
nitrocelulosa, cada una de 3 mm de ancho.
ii)
A cada pocillo se añaden 0,8 ml de tampón de saturación (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl;
0,2% Tween 20; 5% de leche desnatada en polvo y 0,05% de lisado bacteriano de E.coli). Las tiras
con antígeno se bloquean colocando las placas en un agitador durante 30 minutos a temperatura
ambiente (20-22ºC).
iii)
Se añade a los sitios adecuados una dilución 1/200 de los sueros de ensayo y de cada uno de los
controles. Las tiras deben estar sumergidas por completo, mirando hacia arriba y mantenidas en esa
posición durante todo el proceso.
iv)
Se incuban las tiras durante 60 minutos en un agitador a temperatura ambiente.
v)
Se elimina el líquido de las bandejas y cada tira de ensayo se lava tres veces con solución de lavado
(50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl y 0,2% Tween 20) con agitación durante 5 minutos.
vi)
Se añade a cada pocillo de la prueba la solución de suero de conejo anti-bovino conjugado con
fosfatasa alcalina, y las tiras se incuban con agitación durante 60 minutos a temperatura ambiente.
vii)
Se elimina el líquido de las bandejas y cada tira se lava tres veces con solución de lavado como
anteriormente.
viii) En tampón de substrato (100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; y 100 mM Tris-HCl, pH 9.3) se prepara la
solución de substrato (0,015% fosfato de bromocloroindol/0,03% de nitroazul tetrazolio) y se añade a
cada pocillo de ensayo.
ix)
Las tiras se incuban colocando la bandeja de la prueba en un agitador orbital hasta que el control de
corte muestre claramente cinco bandas distintas. Las tiras se lavan abundantemente con agua
desionizada y se dejan secar al aire.
x)
Interpretación de los resultados: La prueba EITB se puede escanear con un densitómetro pero se
considera que la lectura visual, aunque es más subjetiva, también resulta adecuada. Se presentan
controles individuales de los sueros que exhiben un color mínimo pero repetitivo para cada uno de los
cuatro antígenos. Una muestra de ensayo se considera positiva si los antígenos 3ABC, 3A, 3B y 3D
(+2C) muestran densidades de color iguales o mayores que las de sus controles adecuados. Una
muestra se considera negativa si dos o más antígenos muestran densidades inferiores a las de sus
sueros control. Las muestras que no encajan con estos modelos se consideran indeterminadas.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Normalmente, el control de la FA es una responsabilidad nacional y, en muchos países, la vacuna solo puede
utilizarse con autorización.
Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter
general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Para producir vacunas contra la FA se deben emplear virus virulentos de la FA; por tanto, las instalaciones de
producción de la vacuna contra la FA deben funcionar bajo normas y prácticas apropiadas de bioseguridad. Las
instalaciones deben cumplir los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 4 como se indica en el
Apéndice I.1.6.1 del Capítulo I.1.6 de este Manual.
134
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
La vacunación contra la FA se utiliza de forma rutinaria en muchos países donde la enfermedad es endémica. En
contraste, varios países que están libres de la enfermedad no han vacunado nunca su ganado y cuando se han
presentado brotes prefieren utilizar controles estrictos del desplazamiento y el sacrificio de los animales
infectados y los que han estado en contacto con ellos. No obstante, muchos países libres de la enfermedad
mantienen la opción de vacunar y disponen de sus propias reservas estratégicas de preparaciones concentradas
de virus inactivados. Tales reservas de antígeno suponen la posibilidad de suministrar vacunas a corto plazo en
el caso de una "emergencia" (17).
Las vacunas contra la FA son preparaciones del virus químicamente inactivado derivado de cultivos celulares,
que han sido mezcladas con un adyuvante adecuado. En el caso de vacunas destinadas a utilización en cerdos,
se prefieren los adyuvantes oleosos.
Debido a la existencia de varios serotipos del virus, muchas vacunas contra la FA son multivalentes, y es común
la práctica de preparar vacunas con dos o más cepas diferentes de virus. En las áreas donde la enfermedad se
mantiene en búfalos de vida libre, se necesita incluir más de un virus por serotipo para asegurar una cobertura
antigénica amplia contra los virus predominantes.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
En teoría, la selección de los virus del inóculo debería basarse en su facilidad de crecimiento en cultivo
celular, en la tasa de virus, en la estabilidad y en un amplio espectro antigénico (37). Las cepas de
producción se deben caracterizar y distribuir por laboratorios oficiales de control y deben seleccionarse de
acuerdo con la importancia epidemiológica de cada variante.
b)
Método de cultivo
Muchos productores de vacunas contra la FA utilizan cepas vacunales que proceden de aislamientos
locales naturales y, para las procedentes de cultivo celular, de su adaptación a crecer en células en
suspensión o en monocapas, por pases seriados. Para eliminar el riesgo de cualquier virus contaminante
que contenga lípidos en estos aislamientos naturales, se recomienda un tratamiento con un solvente
orgánico antes de la adaptación, o durante ella. Es aconsejable mantener bajo el número de pases en
cultivo celular, pues existen pruebas de que, durante estos procesos, el virus puede presentar una "deriva"
antigénica.
c)
Validación como una vacuna
Los virus del inóculo deben estar caracterizados antigénicamente y se debe demostrar que están libres de
todos los agentes extraños declarados por la autoridad competente para establecer la homología con el
virus original aislado, así como su pureza y eficacia contra las cepas circulantes frente a las que se dirigen.
A menudo, esto supone varios métodos, pero, para establecer su adecuación a las cepas naturales, se
suele utilizar la prueba NV. Los virus de siembra se pueden guardar a -20ºC con glicerina o a temperatura
inferior sin glicerina (por ejemplo, a -70ºC). Los virus del inóculo de trabajo se pueden amplificar por uno o
varios pases del inóculo original y utilizarlos para infectar el cultivo celular final a una proporción aproximada
de 1 PFU (unidades formadoras de placas o calvas) por cada 100 células.
2.
Método de producción
En general, el virus de la FA se produce a gran escala en sistemas celulares en suspensión bajo condiciones
asépticas. Es esencial que todas las tuberías y contenedores estén cuidadosamente esterilizados para asegurar
que en el sistema no existen áreas que contengan microorganismos. Además de las condiciones generales de
esterilidad, es importante destacar que el virus es vulnerable al ataque por enzimas proteolíticas, como las
producidas por microorganismos (13). También resulta crítico el control del pH y de la temperatura debido a la
labilidad del virus a estos factores (12). La temperatura óptima para el crecimiento celular y vírico, y para la
desnaturalización, que suele ser de alrededor de 37ºC y 26ºC, respectivamente, debe controlarse con precisión.
Durante otras fases de la producción, la temperatura debe reducirse a 4-6ºC. Los virus deben mantenerse a un
pH cercano a 7,6 y nunca por debajo de 7,0.
Se utiliza una cepa adecuada de virus para infectar una suspensión de una línea celular transformada, como la
BHK. Tales cultivos deben estar libres de microorganismos contaminantes. Resulta común mantener los stocks
de células BHK en nitrógeno líquido y darles un pase cuando sea necesario. Después de el pase, se extienden
en medio nutritivo en un volumen y a una densidad celular apropiados para sembrar el cultivo principal. Como
6
una aproximación indicativa, se siembra el cultivo principal para dar una densidad inicial de 0,2-0,5 x 10
6
células/ml, y se deja multiplicar hasta 2-3 x 10 células/ml antes de infectarlo con el virus.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
135
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
Cuando el virus alcanza su título máximo, lo cual se determina por infectividad, FC y otras pruebas, el cultivo se
clarifica y se filtra, a menudo con centrifugación. A continuación, el virus se inactiva añadiendo etilenimina (EI),
normalmente en forma de etilenimina binaria (BEI). Esto se prepara disolviendo, a una concentración de 0,1 M,
hidrobromuro de 2-bromoetilamina en una solución de hidróxido sódico 0,2 N, e incubando a 37ºC durante 1 hora
(4, 5). El BEI formado se añade luego a una suspensión de virus mantenida a 26ºC, a una concentración final de
3 mM. Normalmente, la inactivación se prolonga durante 24 horas, seguida de una segunda dosis de BEI durante
otras 24 horas. Después de la inactivación, cualquier BRI residual en el producto se puede neutralizar añadiendo
una suspensión de tiosulfato a una concentración final de 2%. Para disminuir la probabilidad de que en la
segunda aplicación no entren en contacto virus vivos con la BEI, es importante transferir inmediatamente el
contenido de los recipientes a un segundo recipiente estéril, donde se deja que la inactivación continúe hasta 48
horas.
El virus inactivado se puede concentrar por ultrafiltración, precipitación con polietilenglicol o adsorción con óxido
de polietileno (1, 43). Si es necesario, estos antígenos concentrados se pueden mantener a -70ºC o a
temperaturas más bajas durante muchos años, y, cuando se requiera, convertirlos en vacunas mediante dilución
en un tampón adecuado y adición de adyuvantes (15).
Normalmente, las vacunas convencionales contra la FA se presentan en una de dos formas. La utilizada más
corrientemente en el ganado vacuno se prepara adsorbiendo el virus en gel de hidróxido de aluminio, que es uno
de los adyuvantes de la preparación final de la vacuna. Otros componentes del producto final incluyen
antiespumante, rojo de fenol (si está permitido en el país que necesita la vacuna), hidrolizado de lactalbúmina,
caldo de triptosa con fosfato, antibióticos, aminoácidos, vitaminas y sales tamponadas. También se incorpora un
segundo adyuvante, la saponina, derivada del árbol sudamericano Quillaja saponaria mollina, y también
mertiolato/cloroformo como conservante.
Una fórmula alternativa utiliza como adyuvantes aceites minerales, como Marcol y Drakeol. Estas preparaciones
tienen varias ventajas sobre la vacuna estándar con hidróxido de aluminio/saponina, sobre todo su eficacia en los
cerdos. Se utilizan mucho en Sudamérica para vacunar ganado bovino debido a una mayor duración de la
inmunidad obtenida. El aceite mineral se pre-mezcla, por lo general, con un agente emulsionante, como el
monooleato de manosa, antes de añadir un volumen igual de fase acuosa de la vacuna, y emulsionar mediante
un dispersador coloidal, o un emulsificador mecánico continuo o de flujo ultrasónico. Se pueden producir
emulsiones dobles más complejas (agua/aceite/agua) emulsionando de nuevo en una fase acuosa que contenga
una pequeña cantidad de Tween 80 (26).
La introducción de adyuvantes con aceites alternativos "listos para usar" ha supuesto un avance significativo en
los últimos años. Los aceites con ésteres del ácido octadecenoico y 2,5 anhidro-d-manitol, por ejemplo, forman
fácilmente emulsiones dobles o mezcladas (agua/aceite/agua) que son estables y de baja viscosidad sin que se
necesite un equipo emulsionantes sofisticado (6, 17).
3.
Control interno
En general, los títulos de virus alcanzan niveles óptimos a las 24 horas de la infección de los cultivos celulares. El
tiempo escogido para recoger el cultivo se puede basar en ciertas pruebas; por ejemplo, la muerte celular. La
concentración de virus se puede determinar por pruebas de infectividad, gradiente de densidad de sacarosa (14)
o técnicas serológicas. Es preferible utilizar un método que mida masa antigénica, como el análisis en gradiente
de densidad de sacarosa, junto con uno que mida infectividad, ya que las dos propiedades no coinciden
necesariamente y los diferentes métodos pueden complementarse.
Durante la inactivación del virus se deben tomar muestras a intervalos de tiempo regulares para controlar la
velocidad y linealidad del proceso de inactivación. Los títulos de virus en las muestras se determinan por
inoculación de cultivos celulares que sean muy susceptibles al virus de la FA, por ejemplo, células BHK o de
tiroides bovino. Dichos cultivos permiten la prueba de muestras estadísticamente significativas en condiciones
reproducibles. Los valores lg10 de la infectividad de las muestras se representan en función del tiempo, y el
proceso de inactivación no se considera correcto a menos que la última parte de la pendiente de la línea sea
4
recta y que la extrapolación indique que hay menos de una partícula infecciosa por cada 10 litros de preparación
al final del período de inactivación.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Tanto la masa total de antígeno inactivado, como los adyuvantes, los tampones de dilución, y el producto
final deben someterse a pruebas de esterilidad. Esto se puede realizar directamente con los componentes
de la vacuna y con el producto final, pero el método preferido es recoger cualquier microorganismo
contaminante por filtración en membrana del material a examinar y detectarlo por incubación de la
136
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
membrana en medios de cultivo. Este procedimiento permite la eliminación de conservantes y otras
substancias que puedan inhibir la detección de los microorganismos. En la Farmacopea Europea 1997 se
describen normas sobre técnicas y medios de cultivo que permiten la detección de una amplio espectro de
microorganismos (ref. 19; consultar también el Capítulo I.1.5).
b)
Inocuidad
A efectos de demostrar la ausencia de virus infecciosos, después de la inactivación se debería probar una
muestra de cada lote de antígeno inactivado, que represente por lo menos 200 dosis, por inoculación de
monocapas celulares que sean sensibles, si es posible del mismo origen que las utilizadas para la
producción del antígeno. Para hacer esto puede preferirse concentrar el antígeno, en cuyo caso se debe
demostrar que el concentrado no interfiere con la sensibilidad o la estimación de la prueba. Las monocapas
celulares se examinan diariamente durante tres días, después de lo cual el medio gastado se transfiere a
monocapas frescas y las originales se rellenan con medio nuevo. Empleando este método, se pueden
amplificar trazas de virus vivo mediante pases y detección del ECP observado. Normalmente, se emplean
dos o tres pases de la preparación original del virus. Una variante de este método es congelar y
descongelar la monocapa para liberar el virus intracelular, que puede detectarse por pases sucesivos.
c)
Potencia
La potencia se examina solamente en el producto final (ver Sección C.5.b.). Se puede utilizar la carga de
antígeno como indicador de la potencia, si se ha establecido previamente una correlación al respecto.
d)
Duración de la inmunidad
Para establecer un nivel satisfactorio de inmunidad, lo normal es proceder a una primera fase de dos
inoculaciones, separadas 2-4 semanas entre sí, seguida por una revacunación cada 4-12 meses. La
frecuencia de revacunación dependerá de la situación epidemiológica y del tipo y calidad de la vacuna
utilizada. Cuando el acceso a los animales resulta difícil, es preferible emplear vacunas con adyuvantes con
aceite a los 4 meses y al año de edad, y después revacunar cada año.
En terneros nacidos de vacas vacunadas, se debe retrasar la primera vacunación lo máximo posible para
permitir que descienda el nivel de anticuerpos maternos, pero no más allá de los 4 meses, tiempo al que se
espera que una elevada proporción responda eficazmente a la vacunación. En terneros nacidos de vacas
no vacunadas, la primera vacuna puede administrarse a la primera semana de edad (3).
e)
Estabilidad
La caducidad de las vacunas convencionales contra la FA suele ser de 1-2 años a 4ºC pero son sensibles a
la temperatura y no deberían congelarse ni mantenerse por encima de 4ºC.
f)
Conservantes
Los conservantes más utilizados son cloroformo y mertiolato. Este último se utiliza a una concentración final
de 1/30.000 (p/v).
g)
Precauciones (riesgos)
Las vacunas actuales contra la FA son inocuas y no presentan riesgo tóxico para el usuario. Se debe tener
cuidado para evitar la autoinyección de vacunas con adyuvantes que contienen emulsiones de aceite.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Es necesario probar las vacunas contra la FA para asegurarse de que el producto final no es infeccioso ni
tóxico. Algunos laboratorios determinan la falta de infectividad eluyendo el virus de la vacuna, pero esto no
es aplicable a todas las preparaciones. Por ejemplo, la saponina influye mucho en la elución del virus de las
vacunas con hidróxido de aluminio/saponina (16). Si el procedimiento de elución es apropiado a una
preparación particular, debe ser validado sembrando muestras paralelas de vacuna con pequeñas
cantidades de virus vivo (7).
La toxicidad y la falta de infectividad se pueden determinar simultáneamente en el ganado bovino mediante
una prueba in vivo (18). En la superficie dorsal de la lengua de cada una de tres cabezas de ganado sanas
y seronegativas, se inocula intradérmicamente 0,1 ml de vacuna en 20 sitios (cuatro filas de cinco puntos de
inoculación). Los animales se observan por lo menos durante 4 días, al cabo de los cuales se administra a
cada animal tres dosis completas de vacuna por la ruta recomendada por el fabricante. Los animales se
observan otros 6 días. Si alguno de los animales desarrollara síntomas de FA, la vacuna no supera la
prueba de inocuidad. Del mismo modo, se debe determinar cualquier toxicidad anormal atribuible a la
vacuna que pueda invalidar su aceptación. En teoría, las vacunas para otras especies deben probarse en
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
137
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
cuanto a inocuidad en las especies a las que van dirigidas, administrando una dosis doble de vacuna de
acuerdo con las instrucciones recomendadas por el fabricante en cuanto a ruta y volumen de la dosis. Los
animales deberían examinarse diariamente durante un mínimo de 7 días para poner de manifiesto signos
de toxicidad o de FA.
b)
Potencia
Se debe utilizar ganado de más de 6 meses de edad, obtenido de áreas sin FA, que no se hayan vacunado
previamente contra la FA y que carezcan de anticuerpos frente a los diferentes tipos de virus de la FA. Se
deben vacunar, por la ruta indicada por el fabricante, tres grupos de por lo menos cinco animales. La
vacuna se debe administrar a diferentes dosis por cada grupo, inoculando diferentes volúmenes de la
vacuna. Por ejemplo, si el prospecto señala que una inyección de 2 ml corresponde a la administración de
una dosis de vacuna, 1/4 de dosis corresponderá a inyectar 0,5 ml y 1/10 de dosis a 0,2 ml. Estos animales,
y un grupo control de otros dos no vacunados, se inoculan para desafío 3 semanas después de la
inoculación con una suspensión de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus
presentes en el vacuna ensayada, inoculando intradérmicamente 10.000 ID50 (dosis infectiva al 50%) en
dos sitios de la superficie superior de la lengua (0,1 ml por sitio). Los animales se observan durante 810 días. Los animales control no protegidos mostrarán lesiones en otros sitios además de la lengua y
desarrollarán lesiones en al menos tres patas. Del número de animales protegidos en cada grupo, se
calcula la PD50 (dosis protectora media) que contiene la vacuna. Existen varios métodos para calcular la
PD50 (22), pero se prefieren los procedimientos basados en el método de Kärber. La vacuna debe contener
al menos 3 PD50 por dosis para el ganado bovino cuando se emplea con fines profilácticos, aunque es
preferible emplear 6 PD50 por dosis. En ocasiones una vacuna de potencia elevada evita el desarrollo de
lesiones locales en la lengua. En algunos países de Sudamérica se realiza una variación de la prueba de
potencia, la prueba PGP (porcentaje de protección contra la infección generalizada de la pata). Se vacuna
con una dosis completa por la ruta recomendada por el fabricante a un grupo de 16 animales de 1824 meses de edad, con las mismas características que las descritas para la PD50. Estos animales, y un
grupo control de dos animales no vacunados, se inoculan en desafío 4 semanas después de la vacunación
con una suspensión de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus presentes en
la vacuna ensayada, inoculando intradérmicamente 10.000 BID50 (dosis infectiva bovina al 50%) en dos
sitios de la superficie superior de la lengua. Los animales control no protegidos mostrarán lesiones en otros
sitios, además de la lengua, y desarrollarán lesiones en al menos tres patas; para uso profiláctico rutinario,
la vacuna debe proteger al menos a 12 de los 16 animales vacunados.
No son corrientes las pruebas de potencia en otras especies, como ovejas, cabras o búfalos, y se considera
que es suficiente una prueba correcta en ganado bovino para garantizar su uso en otras especies. Cuando
se produzca una vacuna para uso principal en una especie particular, puede ser más apropiado realizar las
pruebas de potencia de la vacuna en esa misma especie. Sin embargo, teniendo en cuenta los datos
limitados que se poseen sobre el búfalo africano o el asiático (Bubalus bubalis) y las ovejas, y la frecuente
naturaleza subclínica de la enfermedad en estas especies, los resultados de la prueba de potencia en el
ganado bovino suelen ser un buen indicador de la aplicabilidad de la vacuna a otras especies.
Para la prueba de potencia de las vacunas contra la FA en cerdos, se puede adoptar un protocolo similar a
la prueba en ganado bovino. Utilizando tres grupos de cinco cerdos, se vacuna un grupo con la dosis
completa recomendada por el fabricante, otro grupo con 1/4 de la dosis y el tercer grupo con 1/16 de la
dosis. Tradicionalmente, la respuesta a las vacunas con aceite se deja desarrollar durante más tiempo, y el
día 28 después de la vacunación se inyectan los tres grupos, más dos cerdos control no vacunados, en una
prueba de desafío. El desafío consiste en la inyección intradérmica en los bulbos del talón de una pata, de
10.000 DICCT50 (0,2 ml), calculado por crecimiento en un cultivo celular porcino adecuado, de un virus
virulento homólogo a una cepa utilizada en la vacuna. Los animales se observan diariamente durante
10 días para vigilar la aparición de síntomas de FA, y se van eliminando tan pronto desarrollan una FA
generalizada para evitar una excesiva dosis de desafío a los restantes. Los animales control deben
desarrollar síntomas en más de una pata. Del número de animales protegidos en cada grupo, se calcula el
contenido en PD50 de la vacuna. Existen varios métodos para calcular la PD50 (22), pero se prefieren los
procedimientos basados en el método de Kärber. La vacuna debe contener al menos 3 PD50 por dosis para
cerdos. También se puede adoptar para cerdos un protocolo similar a la prueba PGP en el ganado
bovino, utilizando un grupo de 16 animales vacunados con una dosis completa de vacuna y dos animales
control no vacunados. El desafío se hace por inyección intradérmica en los bulbos del talón de una pata con
10.000 BID50 (0,2 ml) de un virus virulento homólogo a la cepa utilizada en la vacuna.
Para establecer la potencia de una vacuna, se pueden utilizar otras pruebas, como la medida en cultivo
celular de los anticuerpos neutralizantes del virus después de la vacunación, o de los anticuerpos por
ELISA, o de los anticuerpos de protección en ratones lactantes, con tal de que se haya establecido
estadísticamente una correlación satisfactoria entre los resultados obtenidos por la prueba con el serotipo
particular de la vacuna y la prueba de potencia en el ganado (42). Por ejemplo, se utiliza el porcentaje
esperado de protección para analizar los sueros de un grupo de al menos 16 animales y para expresar la
probabilidad de que un animal resulte protegido midiendo los anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos por
138
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.1. — Fiebre aftosa
ELISA o los anticuerpos de protección. En un grupo único al que se suministra una dosis completa de
vacuna, el porcentaje medio de protección individual esperado sería igual o mayor que el 75% si se
emplean 16 animales o igual o mayor que el 70% cuando se utilizan 30 animales en el grupo experimental.
La presencia en la vacuna de más de un serotipo no interfiere con la inducción de anticuerpos frente a otro
serotipo o con la correlación del título de anticuerpos y la protección.
c)
Pureza
El Código de Salud de la OIE para animales terrestres estipula que un criterio para volver a establecer un
estado de ausencia de FA después de un brote, si se utilizan vacunas, es probar a los animales vacunados
para la presencia de anticuerpos contra NSP. Por consiguiente, la vacuna o el antígeno que se utilice en
estas circunstancias debe estar purificado para reducir el contenido en NSP. Si la vacuna se produce para
un mercado donde no se utilizará la prueba NSP, no será necesaria esta pureza respecto a NSP. Un
método de prueba que se puede utilizar para determinar la pureza de la vacuna es vacunar tres veces a
tres terneros de 3-6 meses y después probarlos para la presencia de anticuerpos contra NSP utilizando las
pruebas descritas en la Sección B.2.d. de este capítulo. Si se detecta anticuerpo contra NSP, la vacuna se
debe purificar más, antes de su distribución. Un método alternativo consiste en vacunar los terneros
empleados en la prueba de inocuidad dos veces más en 3-6 meses y luego probarlos para presencia de
anticuerpos contra NSP.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre aftosa (ver Cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
141
CAPÍTULO 2.1.2.
ESTOMATITIS VESICULAR
RESUMEN
La estomatitis vesicular (EV) es una enfermedad vesicular de los caballos y el ganado bovino y
porcino causada por un vesiculovirus de la familia Rhabdoviridae. Cuando no afecta a los caballos,
es indistinguible clínicamente de la fiebre aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV) o la
enfermedad vesicular de los cerdos (EVC). Las ovejas, cabras y muchas otras especies salvajes
pueden resultar infectadas. El hombre también es susceptible. La enfermedad está limitada a
América; sin embargo, se describió previamente en Francia y en Sudáfrica.
Aunque la EV se transmite directamente por la ruta transcutánea o a través de la mucosa, el virus
de la EV se ha aislado de la mosca de la arena (Phlebotomus) y de mosquitos, lo que sugiere que
puede ser transmitida por insectos. En consecuencia, existe una variación estacional en los casos
de EV: desaparece al final de la estación lluviosa en áreas tropicales, y con las primeras heladas
en zonas templadas. También hay evidencias de que el virus de la EV podría ser un virus vegetal y
que los animales son el final de la cadena epidemiológica. La patogénesis de la enfermedad está
poco aclarada, y se ha observado que los anticuerpos humorales específicos no siempre evitan la
infección por el virus de la EV.
Aunque se puede sospechar que se trata de EV cuando hay caballos afectados además de cerdos
y vacas, es esencial un diagnóstico diferencial temprano porque los síntomas clínicos de la EV son
indistinguibles de los de la FA cuando afecta a ganado bovino y porcino, y de los de la EVC o la EV
cuando solo afecta a cerdos.
Identificación del agente: El virus de la EV se puede aislar fácilmente por inoculación de varios
sistemas de cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados de pollo. El antígeno vírico
se puede identificar por un enzimoinmunoensayo indirecto de tipo "sandwich" (IS-ELISA) -ésta es
la prueba más rápida y barata. La prueba de fijación de complemento (FC) es también una buena
alternativa. Puede utilizarse la prueba de neutralización del virus (NV), pero es elaborada y lleva
tiempo.
Pruebas serológicas: Los animales convalecientes desarrollan anticuerpos con especificidad de
serotipo a los 4-8 días de la infección que se demuestran por un ELISA de bloqueo en fase líquida,
por un ELISA competitivo (C-ELISA) y por NV. Otras pruebas que se han descrito son FC,
inmunodifusión en medio sólido y contra-inmunoelectroforesis.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En EE.UU. y en Colombia se han
usado vacunas con virus inactivados y con hidróxido de aluminio o aceite como adyuvantes,
respectivamente. Ambas vacunas inducen niveles altos de anticuerpos específicos en los sueros
del ganado vacunado. Sin embargo, no está todavía claro que los anticuerpos séricos eviten la
enfermedad. Se ha utilizado en condiciones de campo una vacuna con virus atenuados de eficacia
desconocida.
A. INTRODUCCIÓN
La estomatitis vesicular (EV) se describió en EE.UU. en 1926 (18) y 1927 (7) como una enfermedad vesicular de
los caballos, y, posteriormente, de ganado bovino y porcino. Las vesículas las causa el virus de la EV en la
lengua, labios, mucosa bucal, pezones, y en el epitelio de la banda coronaria de las patas del ganado vacuno,
caballos, cerdos, y muchas otras especies de animales domésticos y salvajes. También son susceptibles muchas
especies de animales de laboratorio. La enfermedad se limita a América; no obstante, se describió en Francia
(1915 y 1917) y en Sudáfrica (1886 y 1897) (11).
142
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
En humanos que están en contacto con animales afectados de EV o que manejan el virus infeccioso de la EV, se
han observado síntomas semejantes a los de la gripe, normalmente sin vesículas. Todas las manipulaciones que
impliquen el virus de la EV, incluyendo el material infeccioso de los animales, deben llevarse a cabo con las
adecuadas medidas de bioseguridad.
Hay dos tipos inmunológicos principales del virus de la EV, el de New Jersey (NJ) y el de Indiana (IND). Ambos
virus pertenecen al género Vesiculovirus, de la familia Rhabdoviridae, y se han estudiado con detalle a nivel
molecular. En las últimas décadas se han aislado de animales enfermos otros rhabdovirus estrechamente
relacionados. Estos virus de la EV están representados por las cepas Salto-Argentina/63 y Alagoas-Brasil/64,
que se consideran como los subtipos 2 y 3, respectivamente, del serotipo IND (8). Se han identificado las cepas
del serotipo NJ y del subtipo IND-1 en áreas endémicas de la enfermedad: Sudeste de EE.UU., México, América
central, Panamá, Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú. La cepa IND-2 Salto-Argentina/63 se aisló de caballos
en Argentina en 1963. 18Esta cepa, junto con la IND-2 Maipú-Argentina/86 y otras dos cepas aisladas en 1966 y
1979 en Brasil, y clasificadas en el mismo subtipo, sólo afectan a caballos (2, 3). El ganado que vive junto a
caballos afectados no presenta conversión de anticuerpos (2). El subtipo IND-3, representado por la cepa
Alagoas-Brasil/64, sólo se ha identificado esporádicamente en Brasil. Hasta 1977, las cepas del subtipo IND-3
solo se aislaban de caballos. Sin embargo, la cepa IND-3 Espinosa-Brasil/77 fue la primera aislada de ganado
bovino. Las cepas IND-3 conocidas afectan al ganado bovino en menor grado que a los caballos (2,3). Este
hecho confirma las primeras descripciones de 1926 y 1927 (7,18) de los serotipos NJ e IND en caballos, y
posteriormente en ganado bovino y en cerdos.
El mecanismo de transmisión del virus de la EV no está claro. El hecho de que el virus se aísle de la mosca de la
arena (Phlebotomus), mosquitos y otros insectos, apoya la hipótesis de que puede ser transmitido por insectos
(6, 10, 17). También hay hipótesis que sostienen que el virus de la EV es un virus vegetal presente en el pasto
(17) y que los animales están al final de la cadena epidemiológica. Bajo circunstancias especiales, el virus podría
sufrir un proceso de adaptación para infectar a los animales, seguido de una transmisión directa entre animales
susceptibles. Durante el brote epizoótico de 1982 en el este de EE.UU., hubo varios casos de transmisión directa
de animal a animal (20). Aunque no todos los años se diagnostica EV en el ganado en EE.UU., se considera que
es endémica entre los cerdos salvajes en Ossabaw Island, Georgia (5).
La incidencia de la enfermedad varía mucho entre el ganado afectado. Normalmente el 10-15% de los animales
muestra signos clínicos, que se observan sobre todo en los animales adultos. Los bóvidos y caballos de menos
de 1 año de edad son raramente afectados. La mortalidad en ambas especies está cercana a cero. Sin embargo,
se ha observado una elevada mortalidad en cerdos afectados por el virus NJ. Los animales enfermos se
recuperan aproximadamente a las 2 semanas. Las complicaciones de importancia económica más corrientes son
mastitis, y pérdida de producción láctea (16). Tanto los serotipos NJ e IND-1 en los brotes de 1995, 1997 y 1998
en EE.UU. causaron fundamentalmente síntomas clínicos en caballos, aunque se observó seroconversión en
bóvidos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
La EV no se puede diferenciar clínicamente con certeza de otras enfermedades vesiculares, como la fiebre
aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV), y la enfermedad vesicular de los cerdos (EVC) cuando no
hay caballos implicados. En cualquier caso sospechoso de EV, es urgente un diagnóstico de laboratorio
temprano.
La toma de muestras y la tecnología utilizada para el diagnóstico de la EV debe estar en concordancia con la
metodología empleada para el diagnóstico de FA, EV y EVC, a fin de facilitar el diagnóstico diferencial de estas
enfermedades vesiculares. Nota: el virus de la EV es un patógeno para humanos y se deben de tomar
precauciones adecuadas cuando se trabaja con tejidos potencialmente infectados o con el virus (ver Capítulo
I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología).
Las mejores muestras para el diagnóstico son el fluido vesicular, el epitelio que cubre las vesículas sin romper,
los trozos de epitelio de vesículas recién rotas, o frotis de las vesículas abiertas. Estas muestras se toman de las
lesiones de la boca, así como de las patas y de otros sitios que muestren desarrollo de vesículas. Se recomienda
sedar a los animales antes de tomar las muestras para evitar daños a los trabajadores y por razones de cuidado
animal. Las muestras epiteliares se colocan en botellas con caldo de triptosa y rojo de fenol tamponado con Tris,
pH 7,6. Si se va a realizar una fijación de complemento (FC) para la detección del antígeno, la muestra se puede
recoger en tampón glicerol/fosfato, pH 7,2-7,6. (Nota: el glicerol resulta tóxico para el virus de la EV y disminuye
la sensibilidad del aislamiento del virus; por consiguiente sólo se recomienda para toma de muestras para la
prueba FC). Las muestras deben mantenerse refrigeradas, y si pueden llegar al laboratorio en 48 horas después
de recogidas, deben enviarse refrigeradas. En caso de que las muestras se envíen congeladas en hielo seco,
deben tomarse precauciones especiales para asegurarse de que el CO2 no entre en la muestra y destruya el
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
virus. Hay requisitos especiales de embalaje para enviar muestras con hielo seco (ver Capítulo I.1.1. Métodos de
muestreo, para información adicional sobre el envío de muestras para diagnóstico).
Cuando en el ganado bovino no hay tejido epitelial disponible, se pueden recoger muestras de líquido esofágicofaríngeo (OP) por medio de una copa de esputo. En los cerdos, se puede tomar un frotis de garganta y enviarlo
al laboratorio para aislamiento de virus. Este material debe enviarse al laboratorio refrigerado y en caldo de
triptosa tamponado con Tris. Si las muestras van a estar embaladas más de 48 horas después de la recogida,
deben mandarse congeladas en hielo seco, como se indicó previamente. Las muestras de esputos para el
aislamiento del virus de la EV no deben tratarse con solventes tales como el cloroformo. Los virus se pueden
aislar de tejidos orales y nasales a los 7 días post-infección.
Cuando no es posible tomar muestras para la identificación del agente, se pueden utilizar muestras de suero de
los animales recuperados para detectar y cuantificar anticuerpos específicos. Se prefiere la toma de pares de
sueros del mismo animal, recogidos por separado entre 1-2 semanas, para comprobar el cambio en el título de
anticuerpo.
Los reactivos para un diagnóstico específico del virus de la EV no están comercialmente disponibles y cada
laboratorio debe producir los suyos u obtenerlos de un laboratorio de referencia. Los dos laboratorios de
referencia de la OIE para la estomatitis vesicular (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) y el Instituto de Salud
Animal1, producen y distribuyen reactivos para diagnóstico, previa petición.
1.
Identificación del agente
Para la identificación del virus de la EV y el diagnóstico diferencial de las enfermedades vesiculares, se deben
someter a pruebas inmunológicas las suspensiones clarificadas de las muestras que sean sospechosas de
contener el virus. Para el aislamiento del virus, se inoculan las mismas muestras en cultivos celulares
apropiados. La inoculación de la muestra misma en cultivos celulares de riñón de mono verde africano (Vero),
riñón de hámster neonato (BHK-21) o IB-RS-2 permite la diferenciación de las enfermedades vesiculares: el virus
de la EV causa efecto citopático (ECP) en las tres líneas celulares; el virus de la FA origina ECP en BHK-21 y en
IB-RS-2, mientras que el virus de la EVC sólo causa ECP en IB-RS-2. Muchas otras líneas celulares, así como la
mayoría de los cultivos primarios de células de origen animal, son susceptibles al virus de la EV.
El virus de la EV se multiplica y puede ser aislado de embriones de pollo de 8-10 días de edad por inoculación en
el saco alantoideo, de ratones lactantes de 2-7 días por inoculación a través de cualquier ruta, o de ratones de 3
semanas por inoculación intracerebral. En los tres casos, el virus de la EV causa la muerte entre los 2 y 5 días
después de la inoculación.
La ruta más susceptible para los caballos y el ganado bovino es la administración lingual intradérmica. Los
cerdos se inoculan en la banda coronaria de las patas o en el morro. Las lesiones vesiculares se pueden
observar a los 2-4 días de la inoculación en el tejido epiteliar de la boca, pezones y patas. La presencia de
vesículas secundarias por inoculación de ganado bovino y equino depende fundamentalmente de la cepa de
virus de la EV utilizada. Normalmente, el morro resulta afectado en los cerdos.
Si se desarrolla un ECP en los cultivos, la suspensión se puede identificar para la identificación del agente
mediante diversas pruebas inmunológicas y el cultivo celular se puede teñir con un anticuerpo fluorescente
específico para la EV. Se pueden realizar pruebas similares en suspensiones homogenizadas de tejidos del
músculo esquelético diseccionado de ratones muertos y de embriones de pollo y con suspensiones de muestras
epiteliales. El tejido cerebral de los ratones es una fuente excelente de virus.
Debido a las diferentes características morfológicas de los rhabdovirus (virus de la EV), picornavirus (virus de la
FMD y de la SDV) y calicivirus (VE), y al gran número de partículas víricas en los líquidos vesiculares y en los
tejidos epiteliales, la microscopía electrónica puede ser un instrumento diagnóstico útil para diferenciar la familia
de virus implicada.
Los métodos inmunológicos preferidos para identificar en el laboratorio los antígenos víricos son el
enzimoinmunoensayo (ELISA) (2, 9), la prueba FC (2, 13) y la tinción con anticuerpo fluorescente. La prueba de
neutralización del virus (NV), con antisueros positivos conocidos contra el virus de la EV de serotipos NJ e IND,
se puede utilizar en cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados, pero lleva más tiempo.
a)
Aislamiento del virus
i)
1
Inocular el cultivo celular en tubos Leighton y en botellas de 25 cm2 con la suspensión clarificada,
tejidos o con el líquido de las vesículas.
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom.
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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
ii)
Incubar los cultivos celulares inoculados a 37°C durante 1 hora.
iii)
Retirar el inóculo y lavar tres veces los cultivos celulares con medio de cultivo y añadir medio de
cultivo que contenga 2,5% se suero fetal bovino (FBS).
iv)
Incubar los cultivos de tejidos en tubos Leighton a 33-35°C y observar el ECP.
v)
Después de 18-24 horas de incubación, el cubre de un cultivo en tubo Leighton por cada muestra
inoculada se tiñe con anticuerpo fluorescente (AF) específico de las cepas New Jersey e Indiana del
virus de la EV.
vi)
El resto de los tubos Leighton y de las botellas de cultivo de 25 cm2 se incuban a 35-37°C otros 6 días
y se observa diariamente el EPC.
vii)
A los 7 días de la inoculación, el resto de los cubres de los tubos Leighton se tiñen con AF. Si no se
observa fluorescencia ni en los recipientes de cultivo se evidencia ECP, las muestras se consideran
negativas en cuanto a aislamiento del virus de la EV.
viii) Si se observa ECP y la tinción con AF es negativa, se realiza un segundo pase, como se indicó
anteriormente, usando las células de una botella de 25 cm2.
b)
Enzimoinmunoensayo
La técnica indirecta de ELISA tipo "sándwich" (IS-ELISA) (2, 9) es en la actualidad el método diagnóstico
elegido para la identificación de los serotipos víricos en la EV y otras enfermedades vesiculares.
Específicamente, el procedimiento ELISA identifica todas las cepas del virus de la EV de serotipo IND, con
un juego de antisueros polivalentes de conejo/cobaya preparados contra viriones de las cepas
representativas de los tres subtipos del serotipo IND (2). Para la detección de las cepas New Jersey del
virus de la EV, es adecuado un juego de antisueros monovalentes de conejo/cobaya (2, 9).
•
Procedimiento de la prueba:
i)
Fase sólida: Las placas ELISA se recubren, durante 1 hora a 37°C o durante la noche a 4°C, con
antisuero de conejo y con suero normal de conejo (como se describe en las refs. 2 y 4) que se han
diluido de manera adecuada en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Después, las placas se lavan
una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquean durante 1 hora a temperatura
ambiente con 1% de ovoalbúmina en PBS. Las placas se utilizan de inmediato o se lavan tres veces y
se guardan a -20°C para uso futuro.
ii)
Muestras de ensayo: Se depositan en los correspondientes pocillos las suspensiones de antígeno de
las muestras de ensayo (suspensiones al 10-20% de tejido epitelial, tejido muscular esquelético de
embrión de pollo o de ratones en PBS, o sobrenadantes clarificados de cultivos celulares sin diluir) y
se incuban las placas 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.
iii)
Detector: A los pocillos correspondientes se añaden antisueros monovalentes o polivalentes de
cobaya contra los serotipos NJ e IND, respectivamente, del virus de la EV, que sean homólogos al
suero de conejo de recubrimiento y que se han diluido convenientemente en PBS que contiene 0,05%
de Tween 20, 1% de ovoalbúmina, 2% de suero normal de conejo y 2% de suero bovino normal
(PBSTB). Se deja reaccionar durante 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.
iv)
Conjugado: Se añade un conjugado de peroxidasa/ IgG de conejo o cabra anti-cobaya, diluido en
PBSTB, y se deja reaccionar durante 30 minutos a 37°C en un agitador orbital.
v)
Substrato: Se añade H2O2 como substrato y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 15
minutos, añadiendo después ácido sulfúrico para detener la reacción. Los valores de absorbancia se
miden en un lector de ELISA.
A lo largo de la prueba, se utilizan volúmenes de 50 µl para los reactivos. Las placas se lavan cinco
veces en cada paso con PBS que contiene 0,05% de Tween 20. Se incluyen controles de los reactivos
utilizados.
vi)
Interpretación de los resultados: Un antisuero que dé una absorbancia superior al 20% de la de otro
antisuero, del suero negativo y de los controles, se considera positivo para el correspondiente subtipo
vírico.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
c)
Prueba de fijación de complemento
El método ELISA es preferible a la prueba FC, porque es más sensible y no está afectado por factores proo anti-complemento. Sin embargo, cuando no se dispone de reactivos para ELISA, se puede realizar la
prueba FC. Se describe la prueba FC para placas de microtitulación con pocillos de fondo en forma de U,
utilizando los reactivos titulados por la prueba CF50%.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Antisuero: Se deposita en los pocillos de la placa antisuero monovalente anti-NJ de cobaya y antisuero
polivalente anti-IND de cobaya contra el virus de la EV, diluidos en tampón veronal (VB) a una dilución
que contenga 2,5 CFU50 (unidades de 50% de fijación de complemento), contra el virus homólogo.
Los antisueros son los detectores utilizados en la prueba ELISA.
ii)
Muestras de ensayo: Se añaden a los pocillos con suero las suspensiones de antígeno de las
muestras de ensayo, preparadas como se describe para la prueba IS-ELISA.
iii)
Complemento: Se añaden al suero y al antígeno 4 CHU50 (unidades hemolíticas de complemento del
50%). (Una alternativa es utilizar 7,5, 10 y 20 CHU50 con objeto de alcanzar 4 CHU50 en la prueba).
La mezcla de antisueros, muestras de ensayo y complemento se incuba a 37°C durante 30 minutos.
iv)
Sistema hemolítico: Se añade a los pocillos una suspensión de eritrocitos de oveja (RBCs) en VB,
sensibilizados con 10 HU50 (unidades hemolíticas del 50%) de suero de conejo anti-RBC de oveja. El
sistema hemolítico tiene un valor de absorbancia de 0,66 a 545 nm, en la proporción de dos
volúmenes de sistema hemolítico + tres volúmenes de agua destilada. La mezcla se incuba durante 30
minutos a 37°C. A continuación, las placas se centrifugan y la reacción se observa visualmente.
Se necesitan volúmenes de 25 µl para los antisueros, muestras de ensayo y complemento, y 50 µl para el
sistema hemolítico. Se incluyen controles apropiados de los antisueros, antígenos, complemento, y sistema
hemolítico.
Es posible realizar la prueba CF50% en tubos (2) utilizando volúmenes de reactivos ocho veces mayor que
los indicados para la FC en placas de microtitulación. Con la prueba CF50%, la reacción se puede expresar
como lectura espectrofotométrica de la absorbancia a 545 nm.
v)
Interpretación de los resultados: Cuando los controles son los esperados, las muestras con hemolisis
<20% para un antisuero en comparación con el otro y con los controles se considera positiva para el
tipo correspondiente
Las muestras negativas en las pruebas ELISA o FC deberían inocularse en cultivo celular o en ratones
lactantes. Si no hay evidencia de infección vírica después de tres pases, la muestra se considera negativa
para el virus de la EV.
d)
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
Se puede usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar pequeñas áreas genómicas
del virus de la EV (12, 19). Esta técnica detectará la presencia del ARN del virus de la EV en muestras de
tejidos y líquidos vesiculares y en cultivo celular, pero no puede determinar si el virus es infeccioso. En
general, las técnicas con PCR no son de uso rutinario en el análisis diagnóstico de casos del virus de la EV.
2.
Pruebas serológicas
Para la identificación y la cuantificación de anticuerpos específicos en el suero, las pruebas preferibles son
ELISA y NV. La prueba FC se puede usar para la cuantificación de anticuerpos tempranos. Generalmente los
anticuerpos se pueden detectar entre 5 y 8 días después de la infección; el tiempo de persistencia de los
anticuerpos no se ha determinado con exactitud en las tres pruebas pero se piensa que es relativamente corto
por FC y por períodos largos mediante NV y ELISA (14).
a)
Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional)
El método ELISA de bloqueo en fase líquida (LP-ELISA) es el mejor método para la detección y
cuantificación de anticuerpos contra el virus de la EV. Se recomienda el uso de las glicoproteínas víricas
como antígeno, porque no son infecciosas, detectan los anticuerpos neutralizantes y proporcionan menos
resultados positivos falsos que la NV (4).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
•
Procedimiento de la prueba
i)
Fase sólida: Como se describe arriba en la Sección B.1.a. para la prueba IS-ELISA.
ii)
Fase líquida: En placas de microtitulación con pocillos de fondo en U, se preparan por duplicado series
de diluciones dobles de cada suero de ensayo, comenzando con 1/4. Se añade a cada pocillo un
volumen igual de glicoproteína NJ o IND del virus de la EV, en una dilución que proporcione una
reacción al 70%, y las placas se incuban 1 hora a 37°C. A continuación se transfieren 50 µl de esta
mezcla a las placas ELISA con la fase sólida y se deja reaccionar durante 30 minutos a 37°C en un
agitador orbital.
iii)
Detector, conjugado y substrato: Se utilizan los mismos reactivos y métodos que los indicados para ISELISA.
iv)
Interpretación de los resultados: Los títulos de punto final al 50% se expresan como log10 con
referencia al 50% de la reducción del control de suero negativo, de acuerdo con el método de
Spearmann-Kärber. Los títulos >1.3 (1/20) se consideran positivos.
•
Enzimoinmunoensayo competitivo (una prueba prescrita para el mercado internacional)
También se ha desarrollado un método ELISA competitivo para la detección de anticuerpos. El
procedimiento que se describe aquí se basa en el descrito por Afshar et al. (1). Utiliza antígenos
recombinantes NJ e IND-1 de la estomatitis vesicular según lo descrito por Katz et al. (15).
b)
•
Procedimiento de la prueba
i)
Fase sólida: Los antígenos se diluyen en tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se añaden 50 µl a
cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. Se incuban las placas durante toda la noche a 4°C; las
placas recubiertas se pueden guardar hasta 60 días a -70°C. Se descongelan las placas, se decanta
el antígeno y se añaden 100 µl de solución bloqueante. A continuación se incuban las placas durante
30 minutos a 25°C y se decanta la solución bloqueante. Las placas se lavan tres veces con una
solución de PBS/0.05% de Tween 20.
ii)
Fase líquida: A cada uno de los pocillos duplicados de cada muestra se añaden 50 µl de suero diluido
1/8 con PBS y 1% de leche en polvo desnatada. En cada placa ELISA se debe incluir un control de
suero positivo y de suero negativo para cada serotipo. Se incuban las placas a 37°C durante
30 minutos. Sin lavar, se añaden 50 µl de líquido ascítico policlonal a cada pocillo y las placas se
incuban a 37°C durante 30 minutos.
iii)
Detector: Se lavan las placas tres veces y se añade a cada pocillo 50 µl de suero anti-ratón obtenido
en cabra conjugado con peroxidasa de rábano y diluido en 1% de leche en polvo desnatada. Se
incuban las placas a 37°C durante 30 minutos, se lavan tres veces, y se añade a cada pocillo 50 µl de
solución de tetrametil-benzidina (TMB) como substrato. Se incuban las placas a 25°C durante 510 minutos y después se añade a cada pocillo 50 µl de ácido sulfúrico 0,05 M. Se leen las placas a
450 nm y la densidad óptica de los pocillos del control del diluyente debe ser < 1.0.
iv)
Interpretación de los resultados: Una muestra es positiva si la absorbancia es <50% de la absorbancia
del control del diluyente.
Neutralización del virus (una prueba prescrita para el mercado internacional)
La prueba NV se realiza en placas de microtitulación de cultivo de tejidos con pocillos de fondo plano
utilizando suero inactivado como muestra de ensayo, 1.000 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de
tejidos) de virus NJ o IND de la EV, y células Vero M, y una monocapa preformada (4) o una suspensión de
células IB-RS-2 para probar la presencia de virus no neutralizado.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Virus: El virus NJ o IND de la EV se crece en monocapas de células Vero y se guarda en nitrógeno
líquido o se congela a -70°C.
ii)
Muestras de ensayo: Se inactivan los sueros a 56°C durante 30 minutos antes del ensayo. En la
prueba se incluyen sueros estandarizados como control positivo y negativo.
iii)
Neutralización del virus: Se diluyen los sueros en las placas en series de diluciones dobles,
comenzando con una dilución 1/4. Se utilizan dos filas de pocillos por suero. Se añade el mismo
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Capítulo 2.1.2. — Estomatitis vesicular
volumen de la suspensión de virus NJ o IND de la EV que contenga aproximadamente
1.000 DICT50/25 µl y se incuba a 37°C durante 60 minutos para permitir que tenga lugar la
neutralización. A continuación, se depositan 50 µl de las mezclas en las monocapas celulares
preformadas en placas de microtitulación o se añaden 150 µl de suspensiones celulares de IB-RS-2 o
Vero con 300.000 células/ml a cada pocillo con la mezcla suero/virus. Se cubren las placas con tapas
no herméticas y se incuban 48-72 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 o bien se sellan con
tapas de presión y se incuban en atmósfera normal. (Se ha determinado que una titulación de virus de
1.000 DICT50 disminuye las reacciones inespecíficas y mantiene una elevada sensibilidad de la
prueba).
iv)
c)
Interpretación de los resultados: Los pocillos sin ECP se consideran protegidos. Las titulaciones a
punto final de los títulos de los sueros de ensayo se determinan por el método de Spearman-Kärber
cuando los títulos víricos están entre 750 y 1330 DICT50 y cuando los títulos de los sueros estándar
negativos y positivos están dentro del doble de sus valores medios estimados en una titulación previa.
Los títulos de cada suero para una neutralización del 100% se expresan como log10. Los sueros con
valores de 1/32 o superiores se consideran positivos para la EV.
Fijación de complemento (una prueba prescrita para el mercado internacional)
En la Sección B.1.b. se presenta una descripción detallada de esta prueba, que se modifica del siguiente
modo. La prueba FC se puede utilizar para la cuantificación de anticuerpos tempranos. Con este fin, se
mezclan diluciones dobles del suero con 2 CFU50 de antígeno conocido y con 5% de suero bovino normal o
de ternero incluido en 4 CHU50 de complemento. La mezcla se incuba durante 3 horas a 37°C o durante
toda la noche a 4°C. A continuación se añade el sistema hemolítico y se incuba durante 30 minutos a 37°C.
El título del suero es la dilución más alta a la que no se observa hemolisis. Los títulos de 1/5 o superiores se
consideran positivos. Esta prueba FC tiene sensibilidad baja y, frecuentemente, se ve afectada por factores
anticomplementarios o inespecíficos.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En EE.UU., Panamá, Guatemala, Perú y Venezuela se han probado vacunas con virus atenuados (16, 17) con
eficacia desconocida. En la actualidad, todavía no se dispone de vacunas comerciales con virus vivos o
inactivados.
AGRADECIMIENTOS
Algunas partes de este capítulo se tomaron o están basadas en el capítulo sobre la estomatitis
vesicular de ediciones anteriores de este Manual.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Estomatitis vesicular (ver Cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
149
CAPÍTULO 2.1.3.
ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA
RESUMEN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad contagiosa de los cerdos causada por
un enterovirus que se caracteriza por la aparición de vesículas en las bandas coronarias en los
talones de las pezuñas y, ocasionalmente, en los labios, la lengua, el hocico y las ubres. Las cepas
de la EVP muestran una virulencia variable, y la enfermedad puede ser subclínica, leve o grave,
pudiéndose observar esta última sólo cuando los cerdos están alojados en locales con suelos
abrasivos, en condiciones de humedad. La importancia crucial de la EVP es la imposibilidad de
distinguirla clínicamente de la fiebre aftosa (FA), y debe asumirse que los brotes de la enfermedad
vesicular en cerdos corresponden a FA hasta que se investiguen mediante pruebas de laboratorio
y se demuestre lo contrario.
Identificación del agente: En los cerdos en los que se aprecie la enfermedad vesicular, la
demostración del antígeno vírico de la EVP mediante enzimoinmunoensayo (ELISA) en una
muestra de material de una lesión o de fluido vesicular es suficiente para un diagnóstico positivo.
Si la cantidad de material de una lesión enviada para el diagnóstico no es suficiente (menos de 0,5
gramos) o si los resultados de las pruebas son negativos o no concluyentes, el aislamiento del
virus se puede llevar a cabo mediante la inoculación de cultivos celulares porcinos. Si finalmente
se produce un efecto citopático en los cultivos, la demostración del antígeno vírico de la EVP
mediante la técnica ELISA, será suficiente para un diagnóstico positivo.
Pruebas serológicas: El anticuerpo específico frente al virus de la EVP puede identificarse
mediante la prueba de microneutralización o por ELISA. Aunque se requieren de 2 a 3 días para
completar la prueba de microneutralización, ésta constituye la prueba definitiva para la detección
de anticuerpos frente al virus de la EVP. Una pequeña proporción (hasta el 0,1%) de los cerdos
normales, no infectados, reaccionarán positivamente en las pruebas serológicas para la EVP.
Estos “animales positivos aislados” sólo pueden diferenciarse de los cerdos infectados mediante
un nuevo muestreo de los animales positivos y de sus cohortes.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Actualmente no se dispone de
vacunas comerciales contra la EVP. Los reactivos estándares y de diagnóstico están disponibles
en los laboratorios de referencia regionales.
A. INTRODUCCIÓN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad subclínica, leve o severa, dependiendo de la cepa de
virus implicada, de la vía y la dosis de infección y de las condiciones de cría en las que se mantiene a los cerdos.
Clínicamente, la EVP no es distinguible de la fiebre aftosa (FA), y esto tiene una importancia crucial. Por lo tanto,
es urgente diferenciar los casos de la EVP de los de la FA, mediante la investigación en el laboratorio.
El período de incubación de la EVP está entre 2 y 7 días, después de los que puede aparecer una fiebre
pasajera hasta de 41°C. A continuación, se desarrollan las vesículas en la banda coronaria, de forma típica en la
unión con el talón. Estas vesículas pueden afectar a la banda coronaria completa, dando lugar a la pérdida de la
pezuña. Con menos frecuencia, las vesículas pueden aparecer en el hocico, particularmente en la superficie
dorsal, en los labios, la lengua y las ubres y pueden observarse erosiones superficiales en las rodillas. Los
cerdos afectados pueden renquear y estar sin apetito durante unos cuantos días. El aborto no es una
característica típica de la EVP. La recuperación completa se produce normalmente en 2-3 semanas, y como
única señal de la infección queda una línea horizontal y oscura en la pezuña, donde se ha interrumpido
150
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcina
temporalmente el crecimiento. Los signos clínicos varían según la edad de los cerdos afectados, las condiciones
en las que se les mantiene y la cepa de virus de la EVP implicada (8). La enfermedad causada por cepas
atenuadas puede pasar desapercibida, particularmente en los cerdos a los que se mantiene sobre hierba o en
locales con mucha paja. Los animales más jóvenes resultan más gravemente afectados, aunque la mortalidad
debida a la EVP es muy rara, a diferencia de lo que ocurre con la fiebre aftosa en los cerdos jóvenes. Se han
descrito síntomas nerviosos, pero no son frecuentes. Los cerdos afectados pueden excretar el virus por la nariz,
la boca y en las heces, hasta 48 horas antes de la aparición de los signos clínicos. La mayor parte de los virus se
produce en los primeros 7 días después de la infección, y la excreción de virus por la boca y la nariz se detiene
normalmente en menos de 2 semanas. El virus se puede seguir eliminando en las heces durante un periodo de
hasta 3 meses. El virus de la EVP es extraordinariamente resistente a la inactivación en el hábitat natural, y es
estable en el rango de pH 2,5–12,0 (9), a diferencia del virus de la fiebre aftosa, que resulta muy lábil fuera del
rango de pH 6,0–8,0.
Debido a que la EVP puede ser leve o subclínica, es imprescindible que se incluyan muestras de suero de los
cerdos sospechosos y de otros animales aparentemente no afectados del grupo, cuando se envíen muestras
procedentes de casos clínicamente sospechosos. El virus de la EVP puede circular desapercibido hasta que
afecta a un grupo particularmente susceptible y, por lo tanto, con el fin de establecer cuánto tiempo está presente
la enfermedad, es necesario comprobar la seroconversión frente al virus de la EVP en animales aparentemente
sanos.
La enfermedad vesicular porcina es clínicamente muy similar a la fiebre aftosa. Las muestras para el aislamiento
del virus o la detección antigénica deben manejarse y enviarse como si contuvieran el virus de la fiebre aftosa, y
deben transportarse en solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclada con glicerol (1/1), pH 7, 2–7, 6,
con antibióticos (concentración final por mililitro) como penicilina (1.000 Unidades Internacionales [UI]), sulfato de
neomicina (100 UI), sulfato de polimixina B (50 UI) y micostatina (100 UI) (6).
El virus de la EVP ha sido clasificado como un enterovirus, perteneciente a la familia Picornaviridae.
Antigénicamente se relaciona con el virus humano coxsackievirus B5. Hay informes de la seroconversión frente
al virus de la EVP en personal de laboratorio que está en contacto con el agente. Se informó de que la
enfermedad clínica era leve, con excepción de un único caso de meningitis asociada a la infección por el virus de
la EVP. Sin embargo, no se han descrito casos de seroconversión o de la enfermedad en granjeros o veterinarios
en contacto con cerdos infectados. No se ha podido demostrar la transmisión de coxsackievirus B5 entre cerdos
en condiciones experimentales.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Cualquier afección vesicular en los cerdos puede ser fiebre aftosa. En el caso de que se haya eliminado la fiebre
aftosa, se requiere la utilización de las instalaciones de un laboratorio especializado para el diagnóstico de la
EVP. Los países que carecen de dichas instalaciones habrán de enviar las muestras para ser investigadas al
1
Laboratorio de Referencia Mundial (WRL) para la Fiebre Aftosa de la FAO. En América se deberán realizar
también pruebas paralelas para el antígeno vírico de la estomatitis vesicular.
La investigación comenzará con el examen con una suspensión al 10% de material de lesión en PBS, mediante
un enzimoinmunoensayo (ELISA), utilizando antisueros específicos para los virus de la EVP y de la FA. Esta
suspensión se inoculará también en monocapas de células porcinas IB-RS-2 (u otras células porcinas
susceptibles), en células primarias tiroideas de bovino y en células primarias (o secundarias) renales de bovino.
El virus de la FA crecerá en los tres sistemas de cultivo celular. Normalmente, el virus de la EVP sólo crecerá en
células de origen porcino; sin embargo, se tiene información de que el virus puede aislarse en células
secundarias de riñón de cordero. El virus de la EVP puede aislarse también a partir de muestras fecales.
a)
Cultivo
Una porción de la suspensión epitelial clarificada se inocula en monocapas de células IB-RS-2 u otras
células porcinas susceptibles. Para el diagnóstico diferencial (por ejemplo, la fiebre aftosa) se emplearán
también sistemas de cultivos celulares bovinos. Se ha comprobado que el medio completo de
Eagle/hidrolizado de lactalbúmina con extracto de levadura (LYH) en proporción 50/50, es un medio de
cultivo apropiado. Para el crecimiento celular, añadir suero bovino al 10%; para mantenimiento, añadir
suero bovino al 3% y para el aislamiento del virus, añadir sólo los antibióticos; en este caso se prefiere no
añadir suero.
1
Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la
Alimentación y la Agricultura), Institute for Animal Health, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom (también
es un Laboratorio de Referencia para la Fiebre Aftosa de la OIE).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
151
Capítulo 2.1.3. — Swine vesicular disease
Los cultivos se examinan dos veces al día. Si se observa efecto citopático (ECP), se recoge el
sobrenadante y se utiliza de antígeno en el ELISA para la identificación del virus. En los cultivos negativos
no se aprecia ningún efecto después de 48 o 72 horas, aunque se mantienen en observación durante 3
días más. Cuando se aísla el virus de heces en las que la cantidad de virus presente puede ser baja, puede
ser necesario un tercer pase del cultivo celular.
b)
Métodos inmunológicos
•
Enzimoinmunoensayo
Para la detección del antígeno vírico de la EVP se ha preferido utilizar un ELISA indirecto tipo “sándwich” en
lugar de la prueba de fijación del complemento. La prueba es la misma que se utiliza para el diagnóstico de
la FA. Se recubren dos hileras de pocillos de las placas ELISA con antisuero de conejo contra el virus de la
EVP. Este es el suero de captura. Se añaden las suspensiones de los sueros problema a cada una de las
hileras. Se incluyen también los controles apropiados. En la siguiente fase se añade el suero detector de
cobaya, seguido de la adición del suero anticobaya de conejo conjugado con peroxidasa de rábano. Se
hace un lavado exhaustivo entre cada etapa para eliminar los reactivos que no se hayan unido. La reacción
positiva se pone de manifiesto si se produce una reacción de color al añadir un cromógeno
(ortofenilendiamina) y un substrato (H2O2). En el caso de las reacciones fuertemente positivas el resultado
será evidente a simple vista, pero los resultados se pueden leer también por espectrofotometría a 492 nm,
en cuyo caso una lectura de absorbancia de ≥0,1 por encima del nivel de fondo indica una reacción positiva.
Como alternativa a los antisueros de cobaya y de ratón, se pueden emplear también anticuerpos
monoclonales apropiados (MAb), adheridos a la placa ELISA y utilizados como anticuerpo de captura o
conjugados con peroxidasa como anticuerpo de rastreo.
Para estudiar la variación antigénica entre las cepas del virus EVP, se puede utilizar también un ELISA
basado en los MAb. Los antígenos virales obtenidos en cultivos celulares son capturados por un antisuero
de conejo hiperinmune frente al virus de la EVP adherido a la fase sólida. Después se hacen reaccionar con
un grupo de MAb apropiados, y la unión de los MAb a las cepas de campo se compara con la unión a las
cepas originales. Una unión fuerte indica la presencia de epítopos compartidos por la cepa original y las
cepas de campo (1).
c)
Muestras fecales
i)
Se resuspende el material fecal (aproximadamente 20 g) en una cantidad mínima de tampón fosfato
(0,04 M de tampón fosfato o PBS).
ii)
Se deja en agitación o en un homogenizador rotatorio a 4°C durante toda la noche.
iii)
Se clarifica por centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos, en una centrífuga de alta velocidad.
iv)
Se recoge el sobrenadante y se inoculan cinco tubos de células IB-RS 2 con 0,2 ml por tubo. Se
permite la adsorción a 37°C durante 1 hora, sin agitación. Se lavan los tubos con PBS tres veces. Se
añade medio de mantenimiento sin suero (2 ml/tubo), y se incuban a 37°C colocados en una gradilla
giratoria o en un aparato alternativo apropiado que permita la agitación de los medios de cultivo.
v)
El sobrenadante restante se centrifuga a 28.000 rpm durante tres horas. Esto concentrará cualquier
virus que haya en el sobrenadante en bajas cantidades.
vi)
Se desecha el sobrenadante, y el precipitado se resuspende en 2 ml de PBS, sonicándolo
brevemente. Se añade un volumen igual de Freón y se agitan 2–3 ml. Se centrifugan a 4.000 rpm
durante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Se elimina el sobrenadante.
vii)
Se inoculan cinco tubos de cultivo de tejidos como en el paso (iv).
viii) Los tubos se incuban a 37°C durante 3 días, observándolos diariamente en busca de la aparición de
ECP.
d)
ix)
Si no hay pruebas de ECP transcurridos tres días, los cultivos celulares se congelan y descongelan, y
se realiza un pase ciego en tubos de células IB-RS-2 frescas. Se incuban durante tres días más,
examinando los tubos diariamente como antes.
x)
Se recoge el sobrenadante de los tubos que muestren ECP y se confirma la presencia del virus de la
EVP mediante la técnica ELISA (u otra prueba apropiada).
xi)
Si no hay ECP después del segundo pase, la muestra se declarará como NVD (ningún virus
detectado).
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Los métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos pueden utilizarse para la detección del genoma vírico
de la EVP en material clínico utilizando la trascripción inversa, seguida de la reacción en cadena de la
152
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcina
polimerasa (PCR), y para establecer las relaciones entre los aislados del virus de la EVP, mediante la
determinación de las secuencias de nucleótidos de parte del genoma. La secuenciación de
aproximadamente 200 nucleótidos dentro del gen 1D, que codifica la principal proteína estructural VP1, ha
permitido agrupar las cepas del virus de la EVP en función de la homología de sus secuencias, y relacionar
epidemiológicamente las cepas causantes de la enfermedad en distintas regiones o en épocas diferentes
(2). Con el fin de mejorar la sensibilidad del diagnóstico, se han desarrollado las técnicas que utilizan la
PCR. Se ha descrito una PCR que combina la extracción de RNA, mediante el uso de columnas de gel de
sílice, comercialmente disponibles, con una trascripción inversa acoplada a la PCR (RT-PCR), utilizando
para esto cebadores que corresponden a regiones muy conservadas de los genes 1C y 1D (7). La técnica
es rápida, detecta todos los genotipos del virus de la EVP y es suficientemente sensible para su uso en
muestras obtenidas de casos de sospecha de enfermedad clínica. Cuando se sospeche de infección
subclínica o cuando las muestras se recojan después de determinarse clínicamente la enfermedad, una RTPCR anidada, más sensible, puede combinarse con un método de extracción de RNA más elaborado, para
conformar un sistema de detección tan sensible, al menos, y considerablemente más rápido, como el pase
múltiple en cultivo de tejidos. Varios laboratorios han desarrollado ensayos alternativos de PCR utilizando
diferentes protocolos (3, 10, 11).
2.
Pruebas serológicas
Normalmente la enfermedad vesicular porcina se diagnostica sólo con los datos aportados por las pruebas
serológicas. Debido a la naturaleza subclínica o leve de la enfermedad, la primera sospecha de la enfermedad se
tiene con frecuencia después de las pruebas serológicas rutinarias que se realizan para la vigilancia de la
enfermedad o para el certificado de exportación. Para la detección de anticuerpos contra el virus de la EVP se
han utilizado la prueba de neutralización vírica (NV), la de inmunodifusión doble, la de inmunodifusión radial, la
de contra-inmunoelectroforesis y el ELISA (1, 4, 5). Las pruebas de NV y ELISA se han utilizado más
frecuentemente. La prueba de NV es la prueba estándar aceptada, pero tiene la desventaja de que lleva 2–3 días
completarla, y requiere instalaciones para cultivo celular. El ELISA es más rápido, y puede estandarizarse con
mayor facilidad. Una pequeña proporción de los sueros procedentes de animales que no han estado previamente
expuestos al virus de la EVP reaccionarán positivamente en pruebas serológicas de detección de anticuerpos
contra el virus de la EVP. El ELISA de competición que emplea el MAb 5B7 (MAC-ELISA) ha sido una técnica
fiable para la detección de anticuerpos de la EVP (1). Hasta el 1%, aproximadamente, de los resultados de los
sueros de cerdos normales son dudosos o positivos mediante el MAC-ELISA, y deben probarse de nuevo
mediante la prueba de NV. De estos sueros, también resultarán positivos en la prueba de NV hasta el 10%,
aproximadamente (es decir, el 0,1% de la población original). Se pueden considerar como no infectados los
animales que den positivo mediante ELISA pero negativo en la prueba de NV. Deben recogerse muestras
repetidas de animales que den positivo en ambas pruebas y también de sus cohortes. Una titulación constante o
decreciente del título en el animal positivo y la ausencia de anticuerpos contra el virus de la EVP en las cohortes
confirma el estado del animal positivo como un “positivo aislado”. Se desconocen los factores responsables de la
aparición de los “animales positivos aislados”. La reactividad serológica cruzada con el virus de la EVP podría
darse debido a la infección por otro picornavirus, aunque aún sin identificar, o puede deberse a factores
inespecíficos presentes en el suero. Puede resultar útil la identificación del isotipo del anticuerpo que se halla en
los sueros positivos (1), puesto que los sueros de los cerdos infectados contienen normalmente IgG específica
sola o IgG e IgM, mientras que los sueros de los “animales positivos aislados” contienen, exclusivamente, IgM.
a)
Neutralización vírica (prueba prescrita para el comercio internacional)
La microprueba cuantitativa de NV de detección de anticuerpos frente al virus de la EVP se lleva a cabo
utilizando células IB-RS-2 (o células de cerdo susceptibles apropiadas) en placas de microtitulación de
fondo plano para cultivos de tejidos.
Se hace crecer el virus en monocapas de células IB-RS-2 y, después de añadir un volumen igual de
glicerol, se guarda a –20°C. Se ha observado que el virus de la EVP es estable en estas condiciones
durante al menos 1 año. Antes de probar los sueros, se inactivan a 56°C durante 30 minutos. Un medio
apropiado para el cultivo es el medio completo de Eagle/LYH con antibióticos.
Esta es una prueba de volúmenes iguales en la que se utilizan volúmenes de 50 µl.
i)
A partir de una dilución 1/4, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilución 2 de los sueros en
las placas, empleando dos hileras de pocillos para cada uno de los sueros problema.
ii)
Se añade el virus previamente titulado. Cada volumen de 50 µl de suspensión vírica contiene
alrededor de 100 DICC50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular).
iii)
Se incluyen los siguientes controles: un suero fuertemente positivo, un suero débilmente positivo y un
suero negativo, un control celular, un control de medio de cultivo y una titulación del virus utilizada
para calcular el título vírico real empleado en la prueba.
iv)
Se cubren las placas y se incuban a 37°C durante 1 hora.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
153
Capítulo 2.1.3. — Swine vesicular disease
v)
Se prepara una suspensión celular de 106 células/ml en medio con suero bovino al 10% a fin de
favorecer el crecimiento celular. Se añaden 50 µl de esta suspensión celular a cada pocillo.
vi)
Se sellan las placas con cinta sensible a la presión y se incuban a 37°C durante 2–3 días.
Alternativamente, las placas pueden taparse con cubiertas no herméticas e incubarse a 37°C en una
atmósfera con dióxido de carbono al 5% durante 2-3 días.
vii)
Al cabo de 48 horas, se pueden realizar las lecturas al microscopio. Finalmente se fijan las placas y,
normalmente, se tiñen al tercer día. La fijación se realiza con formalina/solución salina al 10% durante
30 minutos. La tinción se realiza sumergiendo las placas durante 30 minutos en azul de metileno al
0,05% preparado en formalina al 10%. Las placas se enjuagan con agua corriente.
viii) Los tapices celulares teñidos de azul constituyen los resultados positivos; los pocillos negativos están
vacíos. Los títulos se expresan por la dilución final del suero presente en las mezclas de suero/virus
que corresponden al 50% a punto final. La prueba se considerará válida cuando la cantidad de virus
por pocillo realmente utilizada se encuentre entre 101,5 y 102,5 DICC50, y el título del suero estándar
positivo se encuentre dentro de los límites del doble de su título esperado.
ix)
b)
Interpretación de los resultados: En el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la
OIE/FAO (véase nota a pie de página 1), se considera negativo un título de NV inferior o igual a 1/11.
Un título comprendido entre 1/16 y 1/32 es dudoso, y se considera positivo un título igual o superior a
1/45. Sin embargo, dado que los títulos dependen del sistema celular empleado, los laboratorios
habrán de establecer sus propios criterios tomando como referencia los reactivos estándares que se
encuentran disponibles en el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO.
Enzimoinmunoensayo
En el ELISA desarrollado por Brocchi et al. (1), el antígeno vírico de la EVP es capturado en la fase sólida
utilizando el MAb 5B7. A continuación se evalúa la capacidad de los sueros problema para inhibir la unión
del anticuerpo MAb 5B7 conjugado con peroxidasa al antígeno capturado. Finalmente se detecta la
cantidad del MAb conjugado unido, mediante la adición de substrato y cromógeno.
i)
Se revisten las placas ELISA con 50 µl/pocillo de MAb 5B7 a una dilución de 10 µg/ml, en tampón
carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se incuban a 4°C durante toda la noche.
ii)
Se lavan las placas tres veces con PBS más Tween 20 al 0,05%, y se añaden 50 µl de antígeno de la
EVP (el virus de la EVP se ha hecho crecer en células IB-RS-2, se ha clarificado, filtrado e inactivado)
a una dilución óptima predeterminada. La dilución óptima del antígeno se determina mediante las
titulaciones de doble entrada del antígeno y del MAb conjugado que definen la dilución de trabajo,
presentando un valor de absorbancia situado en la parte superior de la región lineal de la curva de
titulación del antígeno (entre 1,5 y 2,0 unidades de densidad óptica). A continuación se incuban las
placas a 37°C durante 1 hora.
iii)
Después de tres lavados adicionales, se incuban 50 µl de los sueros problema diluidos (no
inactivados) y de los sueros control con el antígeno capturado a 37°C durante 1 hora. Los sueros se
someten a diluciones seriadas con un factor de dilución 3 directamente en los pocillos de las placas
ELISA, añadiendo 10 µl de suero a 65 µl de tampón (dilución 1/7,5) transfiriendo a continuación 25 µl a
los pocillos consecutivos, que contienen 50 µl de tampón mezclando y desechando finalmente 25 µl.
iv)
Después de 1 hora de incubación, se añaden 25 µl de una dilución óptima de MAb 5B7 conjugado con
peroxidasa (véase la etapa (ii)) a cada pocillo, y se incuban las placas a 37°C, durante 1 hora más.
v)
Después de una serie final de lavados, se inicia la reacción colorimétrica mediante la distribución de
50 µl por pocillo de la solución substrato (0,5 mg/ml ortofenilendiamina en tampón fosfato/citrato, pH 5,
más H2O2 al 0,02%).
vi)
Transcurridos 10 minutos, se detiene la reacción añadiendo 50 µl de ácido sulfúrico 2 N. Se lee la
absorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas.
El antígeno, los sueros y el conjugado se diluyen en PBS (pH 7,4) que contenga Tween 20 al 0,05% y
extracto de levadura al 1%; el tampón de dilución para los sueros contiene, además, suero de ratón al 1,0%,
bien recubriendo la placa o conjugado con peroxidasa, para impedir la unión inespecífica del suero de cerdo
al MAb 5B7.
vii)
Controles: Cuatro pocillos de cada placa con todos los reactivos, excepto el suero problema, para
confirmar la lectura de máxima absorbancia para el antígeno; el suero procedente de un cerdo
convaleciente a cuatro diluciones seleccionadas; el suero de un cerdo negativo y un suero estándar de
cerdo débilmente positivo.
viii) Interpretación de los resultados: Las reacciones se expresan por el porcentaje de inhibición de la
reacción del MAb con el antígeno de la EVP, causado por cada suero problema. Si el porcentaje de
inhibición medio en las diluciones 1/7,5 y 1/22,5 es más del 70%, los sueros se consideran
154
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.3. — Enfermedad vesicular porcina
fuertemente positivos. Los sueros que registren una media de más del 70% de inhibición en la dilución
1/7,5, pero menos del 70% de inhibición en la dilución 1/22,5 se consideran débilmente positivos o
dudosos. Se consideran negativos los sueros que muestren menos del 70% de inhibición en ambas
diluciones. Deberán confirmarse todos los resultados positivos y los dudosos utilizando la prueba de
NV.
SUEROS DE REFERENCIA ESTÁNDAR PARA LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS DE LA EVP
El Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la FAO/OIE mantiene una serie de sueros de
referencia que han sido exhaustivamente validados por los Laboratorios de Referencia Nacionales de la EVP de
los Estados Miembros de la Unión Europea.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Actualmente no existen vacunas disponibles comercialmente de EVP. Los sueros estándar pueden obtenerse del
Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO (véase nota a pie de página 1). El
anticuerpo MAb 5B7 puede conseguirse en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la enfermedad vesicular
porcina, que se encuentra en Italia (véase el cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual).
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7.
LIN F., MACKAY D.K.J. & KNOWLES N.J. (1997). Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse
transcription-polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 65, 111–121.
8.
LOXAM J.R. & HEDGER R.S. (1983). Swine vesicular disease: clinical signs, diagnosis, epidemiology and
control. Rec. sci. tech. Off. int. Epiz., 2, 11–24.
9.
MANN J.A. (1981). Swine vesicular disease. In: Virus Diseases of Farm Animals, Vol. 2, Gibbs E.P.J., ed.
Academic Press, London, UK, 365–381.
10. NUNEZ J.I., BLANCO E., HERNANDEZ T., GOMEX-TEJEDOR C., MARTIN M.I., DOPAZO J. & SOBRINO F. (1998). A RTPCR assay for the differential diagnosis of vesicular viral diseases of swine. J. Virol. Methods, 72, 227–235.
11. VANGRYSPERRE W. & DE CLERCQ K. (1996). Rapid and sensitive polymerase chain reaction based on
detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined
with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch.
Virol., 141, 331–344.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Enfermedad vesicular porcina (ver Cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
155
CAPÍTULO 2.1.4.
PESTE BOVINA
RESUMEN
La peste bovina es una enfermedad vírica aguda del ganado bovino doméstico, de los búfalos y de
los yaks, que se caracteriza por altas tasas de morbilidad y mortalidad. También puede afectar a
ovejas, cabras, cerdos y ungulados salvajes. Clínicamente, esta forma de enfermedad se
caracteriza por fiebre, un desarrollo progresivo de erosiones superficiales en las encías, lengua,
carrillos y paladar, junto con descargas oculares y nasales serosas o mucopurulentas. Las
complicaciones en el tracto alimentario están marcadas por la aparición de diarrea o disentería que
provoca una deshidratación grave y depresión. Este cuadro clínico se observa en la actualidad
muy raramente, pero en el este africano todavía se presenta una forma más leve de la
enfermedad, con el potencial de readquirir las características clásicas.
En la última década se han reconocido tres linajes de virus de la peste bovina, genéticamente
diferentes, como agentes de la enfermedad en África y Asia. El linaje 1 se limitó a Etiopía y Sudán,
el linaje 2 al este de África y el 3 a Asia. Recientemente, tanto el sur de Sudán como el oeste
asiático estaban infectados, pero ambas zonas se consideran libres de peste bovina en la
actualidad. La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO)
inició en 1992 un Programa Global de Erradicación de la Peste Bovina orientado a erradicar el
virus en el año 2010. El éxito de dicho programa puede juzgarse por el hecho de que dos de las
tres líneas independientes de peste bovina se han erradicado a nivel global.
Identificación del agente: La confirmación clínica de la peste bovina se basa en el hallazgo de
animales individuales o en pequeños grupos que muestran fiebre, inapetencia, depresión,
erosiones superficiales en el labio superior e inferior y en las encías, erosiones o escamaciones de
las papilas de los carrillos, descargas oculares serosas o mucopurulentas y/o descargas nasales,
diarrea, postración y posiblemente muerte. La confirmación en el laboratorio se basa en la
demostración de la presencia del virus, de ARN específico del virus o de antígenos precipitantes
en muestras del bazo, nódulos linfáticos o secreciones nasales u oculares de animales con
infección aguda. Es muy importante aislar el virus si ha tenido lugar un importante deterioro de la
salud animal en una extensión geográfica. Después de el éxito de la erradicación global, los países
libres de peste bovina pueden confirmar ahora la presencia de la peste de los pequeños rumiantes
(PPR) en las ovejas o cabras basándose en la apariencia clínica de los animales infectados y en la
presencia de antígenos precipitantes, aunque los síntomas clínicos y los antígenos inducidos son
comunes a ambos virus.
En los exámenes post-mortem de casos sospechosos de peste bovina se debe dedicar una
atención especial a la cuarta cavidad del rumen que puede estar muy engrosada o mostrar una
decoloración grisácea; a las placas de Peyer, que pueden mostrar necrosis linfoide; y al desarrollo
de un engrosamiento linear y un ennegrecimiento de las crestas de los repliegues del ciego, del
colon y del recto. Los diagnósticos diferenciales principales han de realizarse con la PPR en
ovejas y cabras, y la diarrea bovina vírica/enfermedad de las mucosas junto con la fiebre maligna
catarral en el ganado bovino; la diferenciación de estas enfermedades requiere utilizar métodos de
laboratorio apropiados.
Pruebas serológicas: La OIE ha desarrollado una serie de Estándares Recomendados para la
Vigilancia Epidemiológica de la Peste Bovina (la "vía de la OIE") que orienta las acciones de los
países miembros que desean demostrar que han logrado verse libres de la infección. Con este fin
se dispone de enzimoinmunoensayos de competición e indirecto que determinan la presencia de
anticuerpos en animales que se han infectado con el virus natural o con la vacuna de la peste
bovina. La prueba seleccionada debe ser sensible respecto al linaje de virus que puede
156
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
presentarse. Con la misma finalidad puede utilizarse la estimación de anticuerpos neutralizantes.
Los países miembros pueden buscar consejo en un Laboratorio de Referencia de la OIE respecto
a la selección de la prueba más apropiada a sus propósitos.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone de una vacuna viva
atenuada en cultivo celular. En los últimos años se ha restringido su empleo a campañas
intensivas de vacunación en los focos de enfermedad porque la inmunidad duradera que induce,
antes considerada de enorme importancia, interfiere ahora con las valoraciones serológicas postcampaña. Debido a que el uso de esta vacuna ha originado resultados confusos en la
serovigilancia, y a que todavía hay disponible una gran cantidad de ella, los países miembros
deben catalogar y asegurar todos los stocks restantes. Para combatir los últimos focos residuales
de virus y conservar a la vez la capacidad de desarrollar campañas de serovaloración y vigilancia,
existe una urgente necesidad de disponer de una vacuna marcada junto con pruebas apropiadas
que permitan discriminar entre los anticuerpos inducidos por la vacuna y los debidos a una
infección natural. Se han desarrollado experimentalmente vacunas marcadoras pero por desgracia
ninguna está comercializada. Por otra parte, hasta que se autoricen alternativas o hasta que un
país se libere de la peste bovina y necesite hacer declaración de que está libre de la enfermedad
provisionalmente, es posible que la vacunación con una vacuna heteróloga contra PPR pueda
representar una solución transitoria si resulta aprobada por las autoridades competentes.
A. INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el Programa de Erradicación Global de la Peste Bovina, dependiente de la Organización
para la Alimentación y la Agricultura (FAO) de las Naciones Unidas, ha realizado un enorme avance organizando
y documentando el descenso de la peste bovina (15). Históricamente, el virus estaba distribuido ampliamente por
toda Europa, África y Asia: Sin embargo, recientemente solo se ha detectado en África y Asia. El análisis de
secuencias genéticas ha mostrado que todos los aislamientos de peste bovina encajan en uno de tres linajes
filogenéticos no superpuestos, y ahora es posible describir la distribución del virus en términos de linajes
específicos. Así, el llamado linaje asiático (linaje 3) siempre se ha descrito solamente en Afganistán, India, Irán,
Irak, Kuwait, Omán, Pakistán, Rusia, Arabia Saudita, Turquía, Sri Lanka y Yemen. Como consecuencia de una
vacunación concertada y coordinada, y de campañas de vigilancia, este linaje de virus no ha vuelto a aparecer
desde septiembre de 2000 (en Pakistán). Aunque las estimaciones no son todavía completas, es casi seguro que
este virus ha sido erradicado con éxito.
Los virus de la peste bovina de los linajes 1 y 2 solo se han descrito en África. El linaje 1 parece haberse
distribuido desde Egipto hasta al sur de Sudán, por el este a Etiopía, y hacia el norte y el oeste de Kenia. Por otra
parte, el linaje 2 se ha descrito tanto en el este como en el oeste de África y en tiempos pudo estar distribuido por
el cinturón sub-sahariano a lo ancho de todo el continente (16). Ahora, no obstante, como resultado de otro
programa de vacunación coordinada y de vigilancia (en particular la Campaña Panafricana de Peste Bovina), en
los últimos 15 años, ni el oeste de África ni África central han descrito casos de peste bovina. Hasta hace poco
ambos linajes se describían en el este de África (el linaje 1 al sur de Sudán en 1998, y el linaje 2 en Kenia en
2001). La falta de evidencia actual de que el linaje 1 esté aún transmitiéndose apoya la idea de que este linaje
también ha sido erradicado.
El linaje 2, que reapareció en 1994, 1996 y 2001 en la fauna salvaje, está aún transmitiéndose en el ecosistema
relacionado con el pastoreo de Somalia (12), donde su continua presencia causa una considerable preocupación
(13). En 1994 este virus reapareció en el sudeste de Kenia, con efectos dramáticos sobre los búfalos del Parque
Nacional de Tsavo (3), ilustrando de este modo su capacidad para llevar a cabo una persistencia críptica durante
un período de al menos 30 años. En este período es probable que se transmitiera con bajo nivel de virulencia
entre el ganado susceptible. Aunque ahora parece que este virus ha evolucionado hasta el punto de escapar a la
atención veterinaria en áreas remotas, su presencia no pasó desapercibida por los pastores nómadas a cuyo
ganado infectaba. Más recientemente, en 2003 se describió una peste bovina suave en ganado de Kenia
próximo a la frontera con Somalia. Este virus no se ha aislado, pero estudios genéticos han relacionado el ARN
vírico con la cepa ancestral RBOK. Este enigma requiere una urgente resolución. El peligro que se cierne sobre
el ganado de otras partes de África, debido a la circulación de virus en lo que, casi con certeza, es el último
reservorio de la peste bovina, queda demostrado por su capacidad de extenderse a Kenia y a la vecina Tanzania
en los años 80 y de nuevo a mediados de la década de los 90 (18), adquiriendo virulencia en el proceso.
La peste bovina está causada por un virus con ARN de polaridad de antimensajero, que pertenece al género
Morbillivirus dentro de la familia Paramyxoviridae. Las descripciones clásicas de la peste bovina la describen
como una enfermedad muy grave del ganado bovino doméstico, de búfalos y de yaks. El virus también afecta a
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
157
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
ovejas, cabras, algunas razas de cerdos, y a una amplia variedad de especies salvajes dentro del orden de los
artiodáctilos, aunque no siempre con una forma clínica aparente.
Al describir la peste bovina en términos contemporáneos hay que considerar que en la mayor parte de los casos
es una enfermedad infecciosa leve del ganado, no fatal, pero con dos atributos muy peligrosos. El primero es una
casi segura capacidad para experimentar modulaciones de la virulencia. El segundo es su capacidad para
infectar especies animales de caza y causar una infección aguda asociada con altos niveles de mortalidad en
búfalos, antílopes elands (Taurotragus oryx), jirafas, kudus y cerdos verrugosos.
El período de incubación de la forma suave de la peste bovina asociada con el linaje 2 es de 1-2 semanas, y la
enfermedad clínica subsiguiente se puede considerar como poco más que un ataque febril subagudo. La fiebre
es variable, dura poco (3-4 días) y no es muy alta (38-40°C). La depresión que caracteriza a las formas más
agudas de peste bovina está ausente en los animales con afección suave que, sin perder el apetito, continúan
con sus actividades normales. Normalmente estos animales no presentan diarreas. En un examen detallado
puede haber una ligera congestión de las mucosas visibles y en la encía inferior se pueden observar pequeñas
áreas focales de necrosis epitelial blanquecina -a veces no mayores que la cabeza de un alfiler- junto a unas
cuantas papilas erosionadas en los carrillos. Algunos animales no muestra tales erosiones, cuya apariencia es
efímera. Otros animales pueden tener una ligera secreción ocular o nasal de tipo seroso pero, en contraste con
las formas más graves de la enfermedad, no llegan a ser mucopurulentas.
De vez en cuando puede aumentar la virulencia suave del linaje 2, en cuyo caso es aplicable la descripción
clásica de la peste bovina que sigue a continuación. Después de un período de incubación de 1-2 semanas, la
enfermedad clínica se caracteriza por un ataque febril agudo en el que se pueden distinguir fases prodrómicas y
erosivas. El período prodrómico dura aproximadamente 3 días, en los que los animales afectados desarrollan
fiebre de 40-41,5°C junto con anorexia parcial, estreñimiento, congestión de las mucosas visibles, descargas
nasales y oculares serosas, depresión y sequedad del morro. Sin embargo, no puede hacerse un diagnóstico
clínico preliminar de la peste bovina hasta el comienzo de la fase erosiva y el desarrollo de lesiones bucales
necróticas. En el pico febril aparecen, en el labio inferior y en la encía, manchas de epitelio necrótico y, en una
sucesión rápida, pueden extenderse a la encía superior y a la almohadilla dental, a la parte inferior de la lengua,
a los carrillos y a las papilas de los carrillos y al paladar. Mediante el aumento de las lesiones existentes y el
desarrollo de nuevos focos, la extensión de la necrosis oral puede incrementar notablemente en los 2-3 días
siguientes. Parte del material necrótico se desprende originando erosiones no hemorrágicas y superficiales de
las mucosas.
La diarrea es otra propiedad característica de la peste bovina y se desarrolla 1-2 días después de la aparición de
las lesiones bucales. Al principio es copiosa y acuosa, pero después puede contener mucosidades, sangre y
restos de epitelio, y en los casos graves puede estar acompañada por espasmos. Durante la fase erosiva, se
puede ver necrosis en los agujeros nasales, en la vulva, en la vagina y en el prepucio. Aparece anorexia, el
morro se seca por completo, el animal muestra depresión, el aliento es fétido y se desarrollan descargas
oculares y nasales mucopurulentas.
Aunque ocurren muertes, la mortalidad es variable y aumenta a medida que el virus tiene acceso a más animales
susceptibles. Las tasas de mortalidad inicial son probablemente del 10-20% y en las fases terminales de la
enfermedad los animales muestran postración 24-48 horas antes de la muerte. Algunos animales mueren con
lesiones necróticas graves, fiebre alta y diarrea, pero otros lo hacen después de una caída súbita de temperatura
corporal a valores inferiores a los normales. Alternativamente, puede remitir la fiebre hacia la mitad del período
erosivo y, 2-3 días más tarde, alcanzar la temperatura normal con una rápida resolución de las lesiones bucales,
detención de la diarrea e inicio de una convalecencia sin complicaciones.
Típicamente, las canales de los animales muertos están deshidratadas, macilentas y sucias. Las fosas nasales y
los carrillos muestran evidencias de descargas mucopurulentas, los ojos están hundidos y la conjuntiva
congestionada. En la cavidad oral hay una extensa descamación del epitelio necrótico, que siempre aparece
separado de las áreas adyacentes de mucosa sana. Las lesiones se extienden a menudo al paladar y pueden
implicar a la faringe y a la porción superior del esófago; normalmente, las distintas cavidades del rumen no están
afectadas, aunque ocasionalmente se encuentran placas necróticas en los pilares del rumen. La región pilórica
está especialmente afectada y muestra congestión, petequias y edema de la submucosa. La necrosis epitelial da
un color grisáceo a la membrana mucosa. Por lo general, el intestino delgado no está implicado, excepto por
cambios notables en las placas de Peyer donde la necrosis linfoide y la descamación dejan la estructura orgánica
engrosada o ennegrecida. En el intestino grueso los cambios afectan a la válvula ileocecal, el ganglio cecal y las
crestas de los repliegues longitudinales de las mucosas del ciego, colon y recto. Los repliegues aparecen muy
marcados en casos de muerte aguda y con color oscuro en casos duraderos; en ambos casos las lesiones se
conocen como "bandas de cebra".
Aunque las infecciones con el linaje 2 pueden pasar inadvertidas en el ganado, el virus es muy infeccioso para
especies de vida salvaje, y entre las especies susceptibles (búfalo, eland y kudu) se origina fiebre, descarga
nasal, estomatitis erosiva típica, gastroenteritis y muerte. Kock (10) observó además que los búfalos infectados
158
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
por el linaje 2 tenían los ganglios linfáticos periféricos inflamados, lesiones de la piel con placas queratinizadas y
queratoconjuntivitis. Los kudus se infectaron de modo similar, pero aunque la ceguera fue común -causada por
una queratoconjuntivitis aguda- la diarrea no fue un síntoma usual. Los elands también mostraron necrosis y
erosiones en la mucosa bucal junto con deshidratación y extenuación. Por tanto, en las presentes circunstancias,
el diagnóstico de peste en cualquiera de estas especies indica probablemente la transmisión simultánea del virus
al ganado circundante, aunque a un nivel subclínico.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
En vista de los esfuerzos orientados a la erradicación del linaje 2, cualquier brote de peste bovina tiene una
elevada significación epidemiológica. Por ello, las muestras de todos los brotes diagnosticados como peste
bovina sobre bases clínicas o patológicas deben ser enviadas para confirmación en el laboratorio. Se dispone de
una adecuada variedad de pruebas de laboratorio, pero es de capital importancia aislar el virus, identificar su
linaje y establecer su virulencia en ganado experimental (1). Aunque no es una prueba diagnóstica definitiva, una
prueba rápida en tira cromatográfica (Prueba Penside; ref. 6) resulta ser un instrumento útil para ayudar al
personal de campo a investigar brotes de peste bovina en las fases finales de erradicación. En Pakistán (9) y
Yemen, ha sido particularmente eficaz. La muestra preferida, siempre que sea posible, es sangre con
anticoagulante. La aparición de la viremia suele preceder ligeramente a la aparición de la fiebre y continuar
durante 1-2 días después de que la pirexia empieza a desaparecer. En consecuencia, los animales con fiebre
son probablemente virémicos y constituyen por tanto la mejor fuente de sangre con la que intentar el aislamiento
del virus. No obstante, como algunos animales febriles pueden ocasionalmente no ser virémicos, se deben tomar
muestras de diferentes animales con fiebre. Es importante asegurar que haya suficiente muestra disponible para
intentar al menos dos aislamientos del virus en el envío inicial cuando aparece un brote sospechoso. Los otros
procedimientos descritos deben intentarse solo si hay muestra disponible en exceso.
a)
Aislamiento del virus
El virus de la peste bovina puede cultivarse de la fracción de leucocitos de la sangre completa recogida con
heparina o EDTA (ácido etilén diamino tetra-acético) a una concentración final de 10 unidades
internacionales (UI)/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente. Las muestras deben mezclarse cuidadosamente y
llevarse al laboratorio con hielo, pero no congeladas. El virus también puede aislarse de muestras de
ganglios linfáticos del bazo, preescapulares o mesentéricos de animales muertos; estas muestras pueden
congelarse para el transporte.
Para aislar el virus de la sangre, se centrifuga la sangre no coagulada a 2.500 g durante 15 minutos hasta
producir una capa leucocitaria en la interfase entre el plasma y los eritrocitos. Esta capa se extrae tan
limpiamente como sea posible, se mezcla con 20 ml de solución salina fisiológica y se recentrifuga en un
proceso de lavado diseñado para eliminar cualquier anticuerpo neutralizante presente en el plasma. El
precipitado celular resultante se suspende en medio de mantenimiento para cultivo celular y se distribuye en
alícuotas de 2 ml sobre monocapas establecidas en tubos rodantes con células primarias de riñón de
cordero, células linfoblastoides B95a de mono tití o células de riñón de mono verde africano (Vero). El
medio de cultivo se decanta y se reemplaza cada 2-3 días y se observa la monocapa microscópicamente
para el desarrollo de efectos citopáticos (ECP). Éstos se caracterizan por refractibilidad, redondeamiento
celular, retracción de las células con formación de puentes citoplásmicos alargados (células estrelladas) y/o
formación sincitial. La velocidad a la que se desarrolla el ECP varía en función del substrato y de la cepa del
virus. En células primarias se puede esperar hasta 12 días, en células Vero una semana y en células B95a
2-4 días. Antes de declarar negativa una muestra importante se pueden intentar pases, pero una técnica
preferible sería inocular intravenosamente la suspensión celular, y cualquier residuo de la muestra original,
en un buey susceptible e intentar reaislar el virus de su sangre. Los aislamientos de virus se pueden
identificar parcialmente demostrando la presencia de precipitógenos específicos de morbilivirus en los
restos de células infectadas, o bien identificar por completo mediante inmunofluorescencia específica
utilizando un anticuerpo monoclonal (MAb) conjugado.
Alternativamente, se pueden emplear suspensiones al 20% (p/v) de ganglios linfáticos o de bazo. Éstas se
deben hacer homogenizando los tejidos sólidos con medio de mantenimiento de los cultivos sin suero y
1
utilizando técnicas normalizadas de homogenización o de corte e inoculando las monocapas como antes.
1
La liberación de virus de tejidos sólidos se puede lograr de diversos modos. El más sencillo es con un mortero, pero esta
técnica requiere el uso de arena estéril como abrasivo. Alternativamente, el tejido se puede moler sin abrasivo utilizando
un molinillo de vidrio, como por ejemplo el Ten Broeck. Las técnicas de corte son igualmente aplicables utilizando, por
ejemplo, batidoras Silverson o Waring. Las suspensiones que contienen los virus se clarifican por centrifugación a baja
velocidad. El volumen de inóculo no es importante; un volumen normal de trabajo es 1-2 ml. Los antibióticos más
utilizados son penicilina y estreptomicina, utilizados en combinación, cada uno a una concentración de 100 UI/ml. Se
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
159
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
b)
Detección de antígeno por inmunodifusión en gel de agar
Las pruebas de inmunodifusión en gel (IGDA) pueden hacerse en placas Petri o en portas de vidrio para
microscopio (7). En cualquier caso, la superficie se cubre con agar hasta una profundidad de unos 4 mm
utilizando una solución acuosa de agar o agarosa al 1% de alta calidad. Se cortan pocillos en disposición
hexagonal, con seis pocillos periféricos alrededor de un único pocillo central. En los portas, los pocillos
deben tener 3 mm de diámetro y estar separados 2 mm. En las placas Petri, los pocillos pueden
aumentarse a 4 mm y la distancia entre los pocillos a 3 mm. Cuanto más juntos se coloquen los pocillos
entre sí, menor es el tiempo de reacción.
Con una pipeta de pequeño volumen, se coloca en el pocillo central un suero de conejo hiperinmune contra
la peste bovina. De modo similar, se coloca en pocillos periféricos alternativos (es decir, en el pocillo uno,
tres y cinco) un control positivo de antígeno preparado de ganglios linfáticos homogenizados de conejos
infectados con la cepa de peste lapinizada Nakamura III. El control de antígeno negativo se coloca en el
pocillo cuatro. Los antígenos problema se obtienen de exudados de un corte del bazo o de nódulos
linfáticos enviados como muestra para la prueba; alternativamente, se homogeniza un pequeño trozo de la
muestra en solución salina. Los exudados oculares se pueden tomar directamente de los frotis o por
compresión de una micropipeta (debe quitarse el algodón del hisopo de toma de muestra, y colocarlo en el
extremo ancho de una punta desechable de plástico de una micropipeta de 50-250 µl; luego, con la varilla
del hisopo, se comprime el algodón y se fuerza hasta que salga un pequeño volumen del exudado por el
extremo delgado de la punta de la micropipeta). Las muestras se añaden a los pocillos dos y seis. Las
pruebas se desarrollan mejor a 4°C o a temperatura ambiente baja. El área de reacción debe
inspeccionarse a partir de las 2 horas para la aparición de líneas de precipitación limpias y netas entre los
pocillos, formando una línea de identidad con los controles. Si no se obtiene resultado en 24 horas, las
pruebas se desechan. Los resultados no son válidos si no se obtiene también reacciones de precipitación
que den una línea de identidad con la preparación de control positivo de antígeno.
Aunque la prueba no es muy sensible ni muy específica, es resistente y adaptable a condiciones de campo.
Una reacción positiva en un rumiante doméstico grande debe considerarse peste bovina. En un rumiante
pequeño, un resultado positivo debe considerarse como derivado de un caso de peste de los pequeños
rumiantes (PPR) y requiere una diferenciación posterior.
c)
Histopatología
En examen post-mortem, se recogen los tejidos y se colocan en 10% de formalina neutra tamponada para
histopatología e inmunohistoquímica; los tejidos adecuados son la base de la lengua, el ganglio linfático
retrofaríngeo y el tercer párpado. Se deben examinar cortes teñidos con hematoxilina y eosina para ver
formación de sincitios celulares y de células con cuerpos de inclusión víricos intranucleares. La presencia
de antígenos de la peste bovina puede demostrarse en los mismos tejidos fijados con formalina por tinción
con inmunoperoxidasa después de determinar la actividad de la peroxidasa basal endógena. Si se utiliza un
anticuerpo policlonal, esta prueba no diferencia entre peste bovina y PPR. Sin embargo, este problema
puede superarse utilizando una sonda de ARN antisentido contra el gen de la proteína N de la peste bovina
(5).
d)
Identificación del linaje por medio de la reacción en cadena de la polimerasa con trascripción
inversa
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (8) genera ADN adecuado para
análisis de las secuencias de los genes. El ARN vírico puede purificarse del bazo (no lo ideal debido a su
elevado contenido en sangre), de ganglios linfáticos y amígdalas (lo ideal), de linfocitos de la sangre
periférica (PBLs) o de frotis oculares o de lesiones bucales. Los tejidos sólidos (0,5-1,0 g) se trocean y se
2
homogenizan con 4,0 ml de solución desnaturalizante , los frotis oculares y bucales se tratan con 1,0 ml y
los PBLs purificados (de 5-10 ml de sangre completa) con 0,4 ml, según el procedimiento publicado. El ARN
obtenido se precipita con 2,5 volúmenes de etanol, se lava con etanol al 70%, se disuelve en agua estéril o
en tampón TE (Tris/EDTA, 10 mM, pH 7,5, con EDTA 1 mM), y se guarda a -70°C o -20°C hasta su empleo.
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realiza con cebadores hexanucleotídicos aleatorios para
utilizar más tarde diferentes lotes específicos de cebadores en el paso de amplificación por PCR. Después
2
160
puede obtener una mezcla similar de amplio espectro utilizando neomicina a 50 µg/ml. Debería incluirse fungizona a 2,5
µg/ml.
Solución D (solución desnaturalizante de rotura): el procedimiento es el recomendado para reducir el riesgo de manejar
tiocianato de guanidina venenoso. Debe realizarse en una cabina química de seguridad. Se indican las cantidades de
tiocianto de guanidina para una botella de 250 g, pero los volúmenes se pueden ajustar para otras cantidades. No
intentar pesar el tiocianato de guadina, sino disolverlo en la botella del fabricante añadiendo 293 ml de agua destilada
estéril, 17,6 ml de citrato sódico 0,75 M, pH 7,0, y 26,4 ml de sarcosil al 10%; luego se calienta en un baño de agua a
65°C hasta completa disolución. Esta solución se mantiene varios meses en la oscuridad a temperatura ambiente en una
cabina química de seguridad. La solución D final se hace añadiendo 0,36 ml de 2-mercaptoetanol a 50 ml de la solución
stock. Esta solución no debe mantenerse más de 1 mes.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
se amplifican alícuotas del ADNc resultante, usando al menos tres lotes de cebadores que puedan detectar
y diferenciar entre los dos morbilivirus. Estos juegos incluyen dos lotes "universales" basados en regiones
muy conservadas en los genes de la fosfoproteína y nucleoproteína que se detectan en todos los
morbilivirus, y un lote específico del virus de la peste bovina basado en las secuencias de los genes de las
proteínas de fusión del virus. Los productos de la PCR se analizan en un gel de agarosa al 1,5% (p/v) junto
con marcadores adecuados de ADN para identificar el producto específico de ADN. En cada RT-PCR se
debe incluir un control positivo, como el ARN del virus del sarampión o del moquillo canino, y un control
negativo con agua destilada estéril en vez de ARN. Las reacciones positivas deben confirmarse usando
lotes de cebadores "anidados" sobre secuencias del gen F o por análisis de las secuencias del ADN
producido. Es importante utilizar más de un juego de cebadores en el paso de la PCR cuando se prueba la
presencia de virus con ARN, pues su secuencia nucleotídica puede variar considerablemente y un cambio
en el extremo 3´ de la secuencia del cebador ocasiona la imposibilidad de amplificar el ADN. El Laboratorio
de Referencia Mundial en Inglaterra, que es también un laboratorio de referencia de la OIE para Peste
Bovina, y el laboratorio de referencia de la OIE en Francia (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual)
pueden aconsejar sobre el uso de la técnica para análisis de muestras de campo.
•
Inmunocaptura diferencial
Ni las observaciones clínicas ni las pruebas IGDA pueden diferenciar entre peste bovina y PPR. Por ello, en
países en que ocurren ambas enfermedades, se deben emplear otras pruebas si se sospecha cualquiera de
estas enfermedades en ovejas o cabras. Se puede conseguir una diferenciación rápida utilizando una prueba
ELISA de inmunocaptura diferencial (11). Esta prueba emplea MAbs dirigidos contra la proteína N de los dos
virus. Se utiliza como anticuerpo de captura un MAb que reacciona contra los dos virus, mientras que un
segundo MAb, que está biotinilado y es específico para un sitio antigénico no superpuesto de la proteína N, y que
puede ser específico de peste bovina, o bien de PPR, se utiliza para determinar la proteína N que ha sido
capturada.
Las placas (o tiras) para ELISA con alta capacidad de unión de proteínas se recubren con 100 µl de antígeno de
captura por pocillo. Después de tres lavados, se añade a los pocillos 50 µl de la muestra problema diluida 1/10
en un tampón e lisis, 25 µl de la dilución recomendada por el fabricante del MAb específico para el virus y 25 µl
de estreptavidina-peroxidasa a una dilución final de 1/3.000. Los pocillos se llevan a continuación a un agitador
orbital durante 1 hora a 37°C y después se lavan de nuevo. Después de la adición de 100 µl de ortofeniléndiamina (OPD), los pocillos se reincuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se
detienen añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 1 N y los resultados se miden a 492 nm en un lector ELISA
automático y se expresan como valores de absorbancia.
2.
Pruebas serológicas
a)
El enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional)
Se dispone de un ELISA competitivo para la detección de anticuerpos contra la peste bovina en el suero de
animales de cualquier especie que se haya expuesto previamente al virus. La prueba se basa en la
capacidad que presentan los sueros problema positivos para competir en la unión al antígeno de la peste
bovina con un MAb anti-proteína H de la peste bovina. La presencia de tales anticuerpos en la muestra
problema bloqueará la unión del MAb, produciendo una reducción en el color esperado de la reacción
después de añadir IgG anti-ratón conjugada con una enzima y una solución de substrato/cromógeno. Como
es un ensayo en fase sólida, se necesitan pasos de lavados para asegurar la eliminación de los reactivos
que no se unen.
El antígeno de la peste bovina se prepara a partir de cultivos celulares Madin-Darby de riñón bovino
infectados con la cepa atenuada Kabete "O" del virus de la peste bovina. El antígeno se concentra del
sobrenadante del cultivo celular infectado, por precipitación con sulfato amónico. El MAb se obtuvo
fusionando esplenocitos de ratones hiperinmunizados con la línea celular de mieloma NSO, y comprobando
que era específico para peste bovina (2); este MAb se designa en la actualidad como C1. Tanto el C1 como
el antígeno estandarizado de la peste bovina están disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE
para Peste Bovina en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Existen kits comercializados.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Reconstituir el antígeno liofilizado de peste bovina con 1 ml de agua estéril y, posteriormente, diluir
con solución salina tamponada con 0,01 M de fosfato (PBS), pH 7,4, hasta la dilución de trabajo
recomendada por el fabricante
ii)
Distribuir de inmediato volúmenes de 50 µl del antígeno diluido en un número apropiado de pocillos de
una microplaca para ELISA con alta capacidad de unión de proteínas y con fondo plano, utilizando dos
pocillos por suero problema. Golpear lateralmente la microplaca para asegurar que el antígeno se
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
161
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
distribuye uniformemente por el fondo de cada pocillo, tapar la microplaca e incubar en un agitador
orbital durante 1 hora a 37°C. Lavar después los pocillos tres veces con 0,002 M de PBS, pH 7,4.
iii)
Añadir a cada pocillo de la prueba 40 µl de tampón de bloqueo (0,01 M de PBS, 0,1% [v/v] de Tween
20 y 0,3% [v/v] de suero bovino normal) seguido por volúmenes de 10 µl a todos los sueros problema.
iv)
Seguir las recomendaciones del fabricante para preparar una dilución de trabajo del MAb en tampón
de bloqueo y añadir 50 µl del mismo a cada pocillo de la prueba. Tapar la placa y re-incubar en un
agitador orbital durante 1 hora a 37°C.
v)
Seguir las recomendaciones del fabricante para preparar una dilución de trabajo de inmunoglobulina
de conejo anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano en tampón de bloqueo y añadir 50 µl a cada
pocillo de la prueba. Tapar la placa y re-incubar en un agitador orbital durante 1 hora a 37°C.
vi)
Lavar las placas como antes e inmediatamente después añadir volúmenes de 50 µl de mezcla de
substrato/cromógeno (1 parte de H2O2 al 3% y 250 partes de OPD) e incubar a temperatura ambiente
durante 10 minutos sin agitación. A continuación, añadir 50 µl de una solución de parada, que consiste
en ácido sulfúrico 1 M.
vii)
El sistema de prueba debe incluir muestras de suero positivas y negativas para la peste bovina, un
control de MAb y un control de conjugado.
viii) Los valores de absorbancia se miden en un lector de ELISA con un filtro de interferencia a 492 nm y
los resultados de la prueba se expresan como valores de porcentaje de inhibición respecto al valor
obtenido en el control de MAb. Valores de inhibición de 50% o más se consideran positivos, y valores
inferiores al 50% se consideran negativos.
ix)
Actualmente se está analizando el ELISA competitivo "H" a dos valores de corte (50% y 35%) para
intentar aumentar la sensibilidad.
Se ha desarrollado un método ELISA indirecto que podría ser útil para programas de vigilancia de peste
bovina, especialmente en áreas en las que el virus del linaje II puede estar presente (20). Sin embargo, las
características de rendimiento de la prueba indican un problema de especificidad y por tanto su utilización
requerirá pruebas confirmativas.
b)
Neutralización del virus
La "norma de oro" en la prueba de neutralización vírica (NV) se lleva a cabo en cultivos de tubos rodantes
con células primarias de riñón de ternero siguiendo el método de Plowright & Ferris (14), dado que los
resultados obtenidos con esta prueba se validaron con ganado bovino. En el procedimiento de los tubos
rodantes, se diluye un suero no inactivado a intervalos decimales y después, comenzando con el suero sin
3,0
diluir, se mezcla con un volumen igual de virus que contenga aproximadamente 10 DICT50 (dosis infectiva
del 50% en cultivo de tejido) de la cepa vacunal atenuada Kabete "O" por ml. La mezcla se mantiene
durante toda la noche a 4°C y después se inoculan volúmenes de 0,2 ml en cada uno de cinco tubos
rodantes, y a continuación 1 ml de células indicadoras dispersadas y suspendidas en medio de crecimiento
5
a razón de 2 x 10 células por ml. Los tubos se incuban a 37°C, se vierten a los 3 días, se rellenan con
medio de mantenimiento y se colocan en el aparato de rotación; el examen final se hace a los 10 días.
1,8
Para calcular los puntos finales, la dosis vírica se considera satisfactoria si está entre los límites de 10 a
2,8
10 DICT50/tubo; hay que considerar que las diluciones del suero se doblan después de mezclarlas con la
dosis de virus. Esta prueba debe emplearse para examinar los sueros de animales que reaccionan con el
ELISA durante programas de vigilancia diseñados para demostrar la ausencia de infección o para cualificar
el ganado susceptible para pruebas de vacunación. En estas circunstancias, la presencia de cualquier
anticuerpo detectable en la dilución sérica final (1/2) se interpreta que indica una infección previa con peste
bovina. La prueba NV es la prueba de elección para examinar muestras de suero de animales salvajes.
Como prueba de análisis se puede utilizar un método en microplaca. En este procedimiento, se diluye una
dilución inicial de 1/5 a intervalos dobles. Después se incuban volúmenes de 50 µl de suero con volúmenes
1,8
2,8
de 50 µl de virus que contenga entre 10 y 10 DICT50 (17). Después de una incubación de 45 minutos o
5
de toda la noche, se añaden como indicadores 1-2 x 10 células de riñón de ternero, de riñón de cordero o
células Vero. Las pruebas terminan a los 6-7 días y pueden indicar neutralización inespecífica a elevadas
concentraciones de suero. En algunos sueros normales (respecto a una exposición previa de peste bovina)
parece haber factores que impiden la penetración y replicación del virus en las células indicadoras. En la
prueba en tubo estos factores probablemente se eliminan durante los cambios del medio de mantenimiento,
mientras que en el método de la microplaca permanecen presentes todo el tiempo. Si la dilución final más
concentrada de suero se limita a 1/10, este efecto desaparece.
162
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Muchos países han utilizado vacunas contra la peste bovina hasta reducir su incidencia a cero y luego han
seguido las recomendaciones de la OIE para que su estado de libres de peste bovina fuera reconocido
internacionalmente. Para obtener esta situación, el proceso de la vacunación anual contra la peste bovina ha
sido reemplazado en muchos casos por vigilancia activa y pasiva, clínica y serológica. La vacunación intensiva
en los focos de enfermedad (inmunoesterilización) se ha reservado para tratar de controlar campañas de
emergencia (18).
La vacuna viva atenuada en cultivo de tejidos contra la peste bovina (TCRV) descrita en ediciones previas de
este Manual fue desarrollada por Plowright mediante pases seriados de la cepa virulenta Kabete "O" (RBKO) en
células primarias de riñón de ternero. En vista del éxito del Programa de erradicación global de la peste bovina,
parece que la mayoría de los fabricantes de vacunas ya no elaboran este producto, aunque algunos conservan
considerables stocks. La vacuna con TRCV induce una inmunidad persistente que, desafortunadamente, no
puede distinguirse con facilidad de la respuesta de formación de anticuerpos inducida por el virus natural,
igualmente duradera. Debido al conflicto entre mantener la vigilancia como el mejor instrumento para determinar
la distribución natural del linaje 2 del virus y la posible necesidad de inmunizar simultáneamente animales con
vistas a interrumpir la transmisión vírica, existe una necesidad urgente para reemplazar la TCRV con una vacuna
marcadora. Se han descrito vacunas candidatas (4, 19) pero aún deben ser registradas por un fabricante con las
autoridades nacionales.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se exponen en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Como se ha indicado antes, la producción de TCRV se ha detenido virtualmente, y parece improbable su uso en
el futuro. Sin embargo, la descripción publicada en la edición previa de este Manual se repite aquí para que esté
disponible si las condiciones cambian.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Los lotes de inóculo empleados en la fabricación de TCRV deben producir una vacuna en cultivo celular
que sea segura, confiera una inmunidad en el ganado que dure al menos 5 años, retenga sus
características atenuadas durante al menos cinco pases en el ganado y que carezca de capacidad para
extenderse por contacto. Las subcepas de RBOK que se empleen en la producción de TCRV deben ser
identificables por registros históricos escritos que incluyan información sobre el origen de la cepa y sus
subsiguientes manipulaciones.
b)
Método de cultivo
La siembra de la vacuna debe mantenerse por un sistema de lotes de inóculo entre los pases 90 y 120. Los
lotes de virus de siembra deben conservarse en estado liofilizado a -20°C o a temperatura inferior. El virus
debe cultivarse en células Vero o en células primarias o cultivadas serialmente de riñón derivadas de un
feto bovino normal o de un ternero muy joven. Las células de cultivos seriados no pueden tener más de diez
pases del cultivo primario.
c)
Validación como una vacuna
Los lotes de inóculo deben ser:
2.
i)
Puros: Libres de contaminación con virus, bacterias, hongos o micoplasmas.
ii)
Inocuos: Que no induzcan una reacción clínica anormal inoculados en ganado susceptible a la peste
bovina.
iii)
Eficaces: Que induzcan inmunidad a la peste bovina en ganado susceptible.
Método de producción
Los lotes individuales de vacunas se preparan infectando cultivos celulares y, después de un tiempo de
incubación apropiado, se recoge el medio en el que se han liberado gran número de virus vivos. Para facilitar la
conservación a largo plazo y la distribución en la cadena de frío, este líquido se liofiliza en presencia de un
crioprotector que consiste en 5% de hidrolizado de lactalbúmina y 10% de sacarosa. El virus puede obtenerse en
células primarias de riñón de embriones bovinos o de terneros, o en células derivadas de estas fuentes hasta los
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
163
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
diez pases seriados. Además, la vacuna se puede producir en líneas celulares continuas aprobadas, con tal de
que se sepa que no están infectadas con el virus de la diarrea bovina vírica (BVDV) y que se mantengan por un
sistema de lotes de siembra; a este respecto se han utilizado células Vero. Para constituir un lote, los cultivos
infectados deben haber sido inoculados con el mismo virus de siembra e incubados y recogidos juntos. Se
permiten dos recogidas de la misma serie de cultivos, las cuales pueden juntarse para formar una suspensión
completa. Todas las fases de la producción de vacunas deben ir acompañadas de registros escritos.
3.
Control del proceso
Células: Las células primarias, las células cultivadas en serie o las líneas celulares continuas deben proceder de
animales o embriones normales y mantener una morfología normal durante el cultivo. Deben estar libres de
contaminación por otros virus, particularmente del BVDV. Cualquiera que sea el tipo de célula empleada en la
producción de vacunas, se deben mantener cultivos control no infectados utilizando los mismos medios y
condiciones de incubación que con las células infectadas y deben someterse a frecuentes observaciones
microscópicas. Después de recoger la vacuna, los cultivos control se lavan para eliminar el suero bovino y se reincuban durante 10 días en un medio que contenga sustitutos del suero bovino. Se vuelven a observar
microscópicamente para efectos citopáticos. Simultáneamente, se debe examinar una muestra de los cultivos
para la presencia del BVDV no citopático mediante una prueba de inmunofluorescencia o de inmunoperoxidasa,
o por RT-PCR. El suero utilizado en los medios de cultivo debe proceder de animales susceptibles a la peste
bovina.
Virus: Se debe realizar una titulación vírica del lote de siembra con diluciones del virus 1/20 en una microplaca o
en un sistema de tubos rodantes y utilizar diez réplicas por dilución. Debe realizarse una titulación similar en el
producto final. El virus debe proceder de cultivos mantenidos en botellas rodantes y no debe recogerse de
cultivos con más de 10 días de incubación desde la inoculación. El material recogido se clarifica por
centrifugación a baja velocidad antes de mezclarlo con un crioprotector. Se puede mantener sin liofilizar como
mucho durante 5 días a 4°C, pero por mucho más tiempo si se congela desde -20°C a -60°C. Como pueden
aparecer virus contaminantes durante las manipulaciones de fabricación o como consecuencia del uso de
medios contaminados, se utiliza suero de conejo hiperinmune para neutralizar el contenido de peste bovina de la
suspensión completa, después de lo cual la muestra debe utilizarse para infectar células Vero o de riñón de
ternero como se ha descrito antes. El producto final debe probarse para verificar la ausencia de bacterias,
hongos y micoplasmas.
4.
Control de lotes
a)
Identidad
El contenido de un recipiente de cada lote de producción debe exponerse a la neutralización con un
antisuero de conejo contra la peste bovina, utilizando un método con virus variable/suero constante, e
inocularse en células de riñón bovino. Se verifica la identidad del producto si no aparece ECP específico de
la peste bovina.
b)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de materiales biológicos pueden encontrarse en
el Capítulo I.1.5.
c)
Inocuidad y eficacia
Disponiendo de ganado susceptible a la peste bovina, se junta el contenido de cinco viales seleccionados al
azar y se emplea para inocular un buey con un volumen equivalente a 100 veces la dosis de campo para
ganado y otro buey con un volumen equivalente a una décima parte de una dosis de campo para ganado.
Estos animales se mantienen durante 3 semanas en estrecho contacto con un buey no inoculado. Durante
este período se controla diariamente la temperatura de los animales y se realizan frecuentes inspecciones
clínicas. Al final de las 3 semanas, el ganado se examina para anticuerpos neutralizantes contra la peste
bovina y se inocula en desafío con una cepa de peste bovina capaz de producir fiebre. La vacuna se
considera inocua y eficaz si no induce ninguna reacción clínica anormal, si los dos animales que recibieron
la vacuna resultan protegidos y si no existe evidencia de transmisión del virus vacunal. Esta prueba no es
una prueba de potencia. Cada lote de vacuna debe probarse también para inocuidad en pequeños
animales.
d)
Potencia
La estrecha relación entre la potencia inmunizante y la infectividad permite usar ésta última como base para
estimaciones de potencia. Se realizan tres titulaciones de infectividad utilizando células de una línea celular
aprobada o células de tres riñones diferentes de ternero o embrión bovino. En la primera titulación se puede
164
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.4. — Peste bovina
utilizar el conjunto de viales empleados en la prueba de inocuidad. La segunda y tercera determinación se
hace con otros contenidos, en cada caso con el procedente de tres recipientes finales. La sensibilidad de
las células usadas en cada sesión de trabajo debe medirse utilizando una preparación estándar de virus de
la peste bovina. El título final es la media geométrica de las tres determinaciones, realizando cada una con
diluciones decimales y diez observaciones por cada dilución.
e)
Duración de la inmunidad
Es necesario establecer rutinariamente la duración de la inmunidad al TCRV. Los resultados descritos
indican que puede esperarse una inmunidad para toda la vida después de la vacunación satisfactoria del
ganado libre de todo vestigio de inmunidad maternal.
f)
Estabilidad
El TCRV es muy estable cuando se liofiliza correctamente, y se mantiene por mucho tiempo tanto a +4°C
como a -20°C con tal de que el producto se conserve al vacío. Una reciente evidencia señala que la
velocidad de degradación del TCRV puede alterarse dependiendo del estabilizador y de variaciones del
ciclo de secado. Los resultados más ventajosos se asociaron al empleo como estabilizador de hidrolizado
de lactalbúmina al 5% y sacarosa al 10%, un ciclo de secado de 72-74 horas bajo un vacío reducido (100
miliTorr), un secado inicial de 16 horas a -30°C, y una temperatura final de conservación de 35°C. Con
títulos elevados, la vacuna se puede utilizar en el campo durante 30 días sin refrigeración. Después de la
reconstitución en solución salina normal o en sulfato magnésico 1 M, el virus es mucho más termolábil. El
período para distribución de la vacuna reconstituida en el campo no debería superar su vida media, pero
como este parámetro es dependiente de la temperatura y varía de 8 a 24 horas en un margen de 4°C a
37°C, se debe aplicar un límite de acuerdo con el sentido común; el límite pueden determinarlo las
autoridades nacionales de control, pero puede recomendarse un período universal de 4 horas.
g)
Conservantes
El TCRV contiene hidrolizado de lactalbúmina y sacarosa que se añaden como crioprotectores; por otra
parte, no contiene conservante químico específico.
h)
Precauciones (riesgos)
No se conocen riesgos asociados con la producción o el uso del TCRV.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste Bovina (ver Cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
166
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.1.5.
PESTE DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTES
RESUMEN
La peste de los pequeños rumiantes (PPR) es una enfermedad contagiosa aguda causada por un
morbilivirus de la familia Paramyxoviridae. Afecta a los pequeños rumiantes, especialmente, a las
cabras, que son muy susceptibles y, ocasionalmente, a los animales salvajes. La PPR existe en los
países de África situados entre el ecuador y el Sahara, en la península arábiga, en la mayoría de
los países de Oriente Medio y en el sudoeste de Asia.
La enfermedad clínica es parecida a la peste bovina en el ganado vacuno. Normalmente es aguda
y se caracteriza por secreciones nasales y oculares serosas. La PPR se caracteriza por pirexia
extrema, que puede durar 3–5 días, lesiones erosivas en la boca, diarrea y neumonía. En la
necropsia pueden aparecer las “rayas de cebra” características en el intestino grueso, pero éstas
no constituyen un hallazgo significativo. Cuando se combina con una infección bacteriana, pueden
aparecer también lesiones en los pulmones, congestión o bronconeumonía.
La enfermedad debe distinguirse de la peste bovina, lengua azul, fiebre aftosa y otras
enfermedades exantémicas.
Identificación del agente: Para hacer el diagnóstico mediante el aislamiento del virus es
importante tomar las muestras en el momento adecuado, y deberán obtenerse en la fase aguda
de la enfermedad cuando aún son evidentes los signos clínicos. Las muestras pueden proceder de
frotis de secreciones nasales, de las mucosas bucales y rectales y de sangre no coagulada.
El diagnóstico rápido se realiza mediante el enzimoinmunoensayo de captura (ELISA), la
contrainmunoelectroforesis e inmunodifusión en gel de agar. También puede emplearse la reacción
en cadena de la polimerasa.
Pruebas serológicas: En las pruebas serológicas empleadas rutinariamente se incluyen la
neutralización vírica y la técnica ELISA de competición. También pueden utilizarse otras como la
contrainmunoelectroforesis, la prueba de inmunofluorescencia indirecta para anticuerpos y una
prueba de inhibición de precipitación
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: La vacunación se ha llevado a
cabo utilizando la vacuna de histocultivos frente a la peste bovina, dado que existe una relación
antigénica entre la PPR y los virus de la peste bovina. Se ha elaborado una vacuna homóloga,
probada en ensayos de campo, que se encuentra disponible comercialmente. El uso de esta
vacuna frente a la PPR está plenamente recomendada para evitar las confusiones con la peste
bovina cuando se realizan estudios serológicos.
A. INTRODUCCIÓN
La peste de los pequeños rumiantes (PPR) es una enfermedad vírica aguda de los pequeños rumiantes
caracterizada por fiebre, secreciones oculonasales, estomatitis, diarrea y neumonía. Los animales infectados
presentan síntomas clínicos similares a los de la peste bovina del ganado vacuno, de la que debe distinguirse. El
virus de la PPR (PPRV) causa enfermedad clínica en las ovejas y las cabras, pero no produce signos clínicos
cuando afecta al ganado vacuno. Se transmite mediante aerosoles entre los animales que viven en contacto
íntimo (17).
El virus de la PPR se ha clasificado dentro del género Morbillivirus de la familia Paramyxoviridae (14) en base a
su similitud con los virus de la peste bovina, el moquillo canino y el sarampión. Los virus de este grupo tienen
seis proteínas estructurales: la proteína de la nucleocápside (Np), que encapsula el RNA genómico viral, la
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
167
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
fosfoproteína (P), que se asocia con la polimerasa (L) de proteína de gran tamaño), la proteína de la matriz (M),
la proteína de fusión (F) y la de hemaglutinación (H). La proteína de la matriz, íntimamente asociada con la cara
interna de la envoltura viral, hace de enlace entre la nucleocápside y las glucoproteínas externas H y F, que son
responsables de la unión y de la penetración del virus en el interior de la célula a la que infecta. La PPR fue
descrita por primera vez en Costa de Marfil (13), pero existe en la mayoría de los países de África, al sur del
Sahara y al norte del ecuador (17) y en casi todos los países de Oriente Medio hasta Turquía (12, 18, 23, 31). La
PPR está también muy extendida en India y en el sudoeste de Asia (27).
La enfermedad natural afecta principalmente a las cabras y a las ovejas, pero, normalmente, es más grave en las
cabras, donde causa enormes pérdidas, y sólo es grave en las ovejas de forma ocasional. Por lo general, se
admite que el ganado vacuno sólo puede ser infectado subclínicamente. Sin embargo, en condiciones de
pobreza puede ocurrir que el ganado vacuno desarrolle lesiones después de la infección por el virus de la PPR,
cuyos signos clínicos se adscribirían a la peste bovina. De hecho, en los años 50 se describió la enfermedad y la
muerte de terneras infectadas experimentalmente con tejido infectado por PPRV (27). Además, el PPRV se aisló
en India (1995) de un brote de la enfermedad similar a la peste bovina en los búfalos (15). Se sospecha que el
PPRV estuvo también implicado en la enfermedad epizoótica que afectó a los camellos de una joroba en Etiopía
en 1995–1996 (24, 25). En algunas muestras patológicas tomadas durante dicho brote se detectaron el antígeno
del virus de la PPR y el ácido nucleico del virus, pero no se aisló el virus vivo. Se ha descrito un caso de la
enfermedad clínica en la fauna salvaje con resultado de muerte de gacelas (Gazella dorcas), cabra montés
(Capra ibex nubiana), órices (Oryx gazella) y ovejas de Laristán (Ovis orientalis laristanica) (12). El venado de
cola blanca americano puede ser infectado experimentalmente (16).
El período de incubación es de 4–6 días, pero puede variar entre 3 y 10 días. La enfermedad clínica es aguda,
con fiebre alta (hasta 41°C) que puede durar de 3–5 días; los animales muestran decaimiento, anorexia y se les
seca el hocico. Las secreciones oculonasales serosas se vuelven progresivamente mucopurulentas y, si no se
produce la muerte, persisten durante 14 días. En los cuatro días siguientes después de la aparición de la fiebre,
las encías se vuelven hiperémicas y se desarrollan lesiones erosivas en la cavidad oral, produciéndose
abundante salivación. Estas lesiones pueden volverse necróticas. En la última etapa es frecuente una diarrea
sanguinolenta acuosa. También se produce neumonía, tos, crepitaciones pleurales y respiración abdominal. La
tasa de morbilidad puede ser hasta del 100% y, en brotes graves, la mortalidad puede alcanzar el 100%. La tasa
de mortalidad no sobrepasa el 50% en brotes más benignos. El diagnóstico presuntivo de la PPR se hace
basándose en estos datos clínicos, pero se requiere la confirmación del laboratorio donde existe la peste bovina
en el ganado vacuno.
En la necropsia, las lesiones son similares a las observadas en el ganado vacuno afectado por la peste bovina.
Las lesiones erosivas pueden extenderse desde la boca hasta la unión del rumen con el retículo. En el intestino
grueso, en la unión cecocólica, normalmente, aparecen hemorragias lineales o “rayas de cebra” características,
pero estas no constituyen un hallazgo significativo o común; habitualmente se presenta enteritis necrótica o
hemorrágica. Los nódulos linfáticos se agrandan, el bazo puede mostrar lesiones necróticas y se produce una
neumonía apical.
No se conocen los riesgos para la salud de los trabajadores que están en contacto con el virus de la PPR, ya que
no se tiene constancia de la infección por el virus en humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Toma de muestras
En los animales vivos, se toman frotis de las secreciones de la conjuntiva y de las mucosas nasal y bucal.
Para el aislamiento del virus, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para las pruebas
hematológicas se toma también sangre entera en anticoagulante, durante la fase temprana de la
enfermedad. En el examen post-mortem también deben tomarse asépticamente muestras (de dos o tres
animales) de los ganglios linfáticos, en particular de los ganglios mesentéricos y bronquiales, de los
pulmones, del bazo y de la mucosa intestinal; deben enfriarse en hielo y transportarse refrigeradas. Los
fragmentos de órganos obtenidos para el estudio histopatológico se colocan en formalina al 10%. Se puede
recoger sangre para realizar el diagnóstico serológico al final del brote.
b)
Inmuodifusión en gel de agar
La inmunodifusión en gel de agar (IGDA) es una prueba sencilla y barata que puede realizarse en cualquier
laboratorio e incluso sobre el terreno. El antígeno viral estándar de la PPR se prepara a partir de ganglios
linfáticos mesentéricos o bronquiales, de material del bazo o de los pulmones que se tritura y se hace una
168
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
suspensión al 1/3 en solución salina tamponada. Se centrifugan a 500 g durante 10–20 minutos y los
sobrenadantes se guardan en alícuotas a –20°C. El algodón del bastoncillo empleado para tomar los frotis
nasales u oculares, se quita utilizando un escalpelo y se introduce en una jeringa de 1 ml. La muestra se
extrae con 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) expulsando y llenando repetidamente los
0,2 ml de PBS en un tubo Eppendorf, utilizando el émbolo de la jeringa. La muestra resultante extraída del
hisopo ocular/nasal, así como el material de tejido triturado preparado con anterioridad pueden guardarse a
–20°C hasta su utilización. Pueden conservarse 1–3 años. El antígeno de control negativo se prepara de
forma similar a partir de tejidos normales. El antisuero estándar se obtiene hiperinmunizando ovejas con 1
ml de PPRV con un título de 104 DICC50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) por mililitro suministrado a
intervalos semanales durante 4 semanas. Se sangra a los animales entre 5 y 7 días después de la última
inyección (7). El antisuero hiperinmune estándar frente a la peste bovina también es eficaz para la
detección del antígeno de la PPR.
i)
Se dispensa agar al 1% en solución salina normal, conteniendo tiomersal (0,4 g/litro) o azida sódica
(1,25 g/litro) como agente bacteriostático, en placas de Petri (6 ml/placa de 5 cm).
ii)
Se excavan pocillos en el agar siguiendo un patrón hexagonal, con un pocillo central. Los pocillos
miden 5 mm de diámetro y están separados 5 mm.
iii)
El pocillo central se llena con el antisuero positivo; tres de los pocillos periféricos se llenan con el
antígeno positivo y uno con el antígeno negativo. Los dos pocillos periféricos restantes se llenan con el
antígeno problema, de forma que los antígenos problema y control negativo se alternen con los
antígenos de control positivo.
iv)
Normalmente, a las 18–24 horas aparecerán de 1 a 3 líneas de precipitado entre el suero y los
antígenos (9, 29). Estas líneas se intensifican lavando el agar con ácido acético glacial al 5% durante
5 minutos (este procedimiento se llevará a cabo con todas las pruebas aparentemente negativas antes
de registrar el resultado como negativo). Las reacciones positivas mostrarán líneas de identidad con el
antígeno control positivo.
Los resultados se obtienen en 1 día, pero la prueba no es suficientemente sensible para detectar formas
leves de la PPR, debido a la baja cantidad de antígeno viral que se excreta.
c)
Enzimoinmunoensayo de captura
El enzimoinmunoensayo (ELISA) de captura (19) en el que se utilizan diferentes anticuerpos monoclonales
(MAb) anti-proteína N permite una rápida identificación diferencial de los virus de la PPR o de la peste
bovina, y esto es de gran importancia, ya que las dos enfermedades tenían hasta hace poco una
distribución geográfica similar y pueden afectar a las mismas especies animales.
i)
Las placas de microtitulación ELISA (por ejemplo, placas Nunc Maxisorb de capacidad de adsorción
alta) se recubren con 100 µl de una solución de MAb de captura (diluido según las indicaciones del
Laboratorio de Referencia que proporciona el kit). Este MAb reacciona con el virus de la peste bovina
y con el PPRV.
ii)
Después del lavado, se añaden 50 µl de la suspensión de la muestra a cuatro pocillos, y los pocillos
de control se llenan con tampón.
iii)
Inmediatamente, se añaden a dos pocillos 25 µl de un MAb de detección biotinilado en el caso de la
PPR y 25 µl de estreptavidina/peroxidasa, y a los otros dos pocillos 25 µl de un MAb para la detección
de la peste bovina y 25 µl de estreptavidina/peroxidasa.
iv)
Las placas se incuban a 37°C durante 1 hora con agitación constante.
v)
Después de tres lavados enérgicos, se añaden 100 µl de ortofenilendiamina (OPD) en peróxido de
hidrógeno y se incuban las placas durante 10 minutos más a temperatura ambiente.
vi)
La reacción se detiene añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 1 N, y se mide la absorbancia a 492 nm en
un espectrofotómetro/lector de placas ELISA.
El valor de corte por encima del cual las muestras se consideran positivas se calcula a partir de cada blanco
(el blanco de la PPR y el blanco de la peste porcina) como el triple de los valores medios de absorbancia.
También puede realizarse un ELISA indirecto tipo “sandwich” permitiendo primero que la muestra reaccione
con el MAb de detección, y el inmunocomplejo formado es capturado después por el segundo MAb,
adsorbido a la placa ELISA.
La prueba es muy específica y sensible (puede detectar 100,6 DICC50/pocillo en el caso de la PPRV y
102,2 DICC50 en el del virus de la peste bovina). Los resultados se obtienen en 2 horas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
169
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
d)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Para distinguir la PPR de la peste bovina (5), se han empleado clones de cADN marcados con 32P, pero no
se recomienda su uso en diagnósticos rutinarios debido a la corta vida media del 32P y al requerimiento de
un equipo especial para la protección de los usuarios.
Se ha desarrollado una técnica de PCR basada en la amplificación de los genes de las proteínas Np y F
para el diagnóstico específico de la PPR (4, 11). Esta técnica es muy sensible comparada con otras
pruebas y los resultados se obtienen en 5 horas, incluyendo la extracción de RNA. El Laboratorio de
Referencia para la PPR de la OIE y de la FAO1 en Francia (véase el cuadro mostrado en la Parte 3 de este
Manual sobre animales terrestres) puede aconsejar sobre la utilización de esta técnica.
e)
Contrainmunoelectroforesis
La contrainmunoelectroforesis (CIE) es la prueba más rápida para la detección de antígeno viral (9, 21). Se
lleva a cabo sobre una superficie horizontal empleando una cubeta de electroforesis apropiada que consta
de dos compartimientos conectados a través de un puente. El aparato se conecta a una fuente de alto
voltaje. Sobre portaobjetos se dispensan volúmenes de 3 ml de agarosa o de agar (1–2%, [p/v]) disuelto en
tampón barbital acetato 0,025 M. Se excavan de seis a nueve pares de pocillos en el agar solidificado. Los
reactivos utilizados son los mismos que se emplean para la prueba IGDA. El baño de electroforesis se llena
con tampón barbital acetato 0,1 M. Los pares de pocillos del agar se llenan con los reactivos, disponiendo
los sueros en los pocillos del ánodo y el antígeno en los pocillos del cátodo. Se coloca el portaobjetos en el
puente de conexión y los extremos se conectan al tampón de las cubetas mediante papel poroso húmedo.
Se cubre el aparato y se aplica una corriente de 10–12 miliamperios por portaobjeto durante 30–60 minutos.
Se desconecta la corriente y se observan los portaobjetos con luz intensa. La presencia de 1–3 líneas de
precipitación entre pares de pocillos se considera una reacción positiva. No deberá haber reacciones entre
los pocillos que contengan los controles negativos.
f)
Métodos de cultivo y aislamiento
Incluso cuando el diagnóstico se haya realizado empleando técnicas rápidas, el virus deberá siempre
aislarse en cultivos tisulares a partir de muestras de campo para estudios posteriores (9, 17).
El PPRV puede aislarse en cultivos tisulares de células primarias renales de cordero o de células de riñón
de mono verde africano (células Vero). Los cultivos en monocapa se inoculan con el material del que se
sospecha (material de frotis, de la capa leucocitaria o de suspensiones de tejido al 10%) y se examinan
diariamente para detectar la aparición de efecto citopático (ECP). El ECP producido por el PPRV puede
producirse en 5 días y consiste en el redondeamiento celular y agregación que culmina en la formación de
sincitios en las células de riñón de cordero. En las células Vero a veces resulta difícil ver los sincitios. En el
caso de que existan, son muy pequeños. Sin embargo, en células Vero infectadas y teñidas siempre se
observan pequeños sincitios. Los sincitios se reconocen por una disposición circular de los núcleos dando
la impresión de una “esfera de reloj“. Los cultivos en cubreobjetos pueden producir un ECP antes de 5 días.
También hay inclusiones intracitoplasmáticas e intranucleares. Algunas células están vacuolizadas. En
secciones histopatológicas de tejidos infectados teñidas pueden verse cambios celulares similares.
Después de 5–6 días, se realizarán siempre pases ciegos ya que el ECP puede tardar tiempo en aparecer.
g)
Otras técnicas de detección viral
Otras técnicas de detección de virus tienen ventajas potenciales, pero aún no se utilizan ampliamente.
Mientras que para el aislamiento de virus se requiere que las muestras patológicas se conserven en
condiciones de frío hasta el comienzo de su procesamiento, éstas se pueden mantener a temperatura
ambiente fijadas en una solución de formalina, y después analizarlas directamente por inmunofluorescencia
(IF) o mediante una prueba inmunoquímica (2, 3, 28). Esto se ha empleado con éxito en extensiones
conjuntivales y en tejidos recogidos en la necropsia; las extensiones se fijan en acetona fría. Ahora se ha
demostrado que el PPRV al igual que el virus del sarampión tienen capacidad de hemaglutinación, a
diferencia de lo que ocurre con el virus de la peste bovina. Esta característica se ha aprovechado para el
diagnóstico específico, rápido y barato de la infección de la PPR (15, 33).
2.
Pruebas serológicas
Las cabras y las ovejas infectadas por el PPRV desarrollan anticuerpos que pueden ponerse de manifiesto para
confirmar un diagnóstico mediante las pruebas de detección de antígeno. Las pruebas que se utilizan
rutinariamente son la neutralización viral (NV) y la técnica ELISA de competición. Se han descrito otras pruebas
1
170
Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
como la CIE (10), la IGDA (31), la prueba de inhibición de la precipitación y la de inmunofluorescencia indirecta
para anticuerpos (8), pero tienen escaso interés comparadas con la NV y la técnica ELISA.
a)
Neutralización viral (prueba prescrita para el comercio internacional)
Aunque esta prueba es sensible y específica, su ejecución lleva mucho tiempo. La prueba estándar de
neutralización se lleva a cabo en cultivos de células primarias renales de cordero en tubos rotatorios.
Cuando no se disponga de células primarias, pueden utilizarse células Vero.
i)
Comenzando con 1 ml de suero inactivado, se hacen diluciones seriadas de razón dos. Las diluciones
se mezclan con una suspensión stock de virus que contenga aproximadamente 103 DICC50/ml.
ii)
Se incuban las mezclas virus/suero a 37°C durante 1 hora o a 4°C durante toda la noche.
iii)
Se inoculan 0,2 ml de la mezcla en cinco tubos rotatorios e inmediatamente después se añade 1 ml
de la suspensión de células Vero en medio de crecimiento, a una concentración de 2 ‰ 105 células/ml.
iv)
Se incuban los tubos en posición inclinada a 37°C durante 3 días.
v)
Se desechan los tubos que presenten ECP específico del virus. En los tubos restantes se substituye el
medio de crecimiento por medio de mantenimiento y se dejan en rotación durante 7 días más. La dosis
de virus de desafío es aceptable si desciende entre 101,8 y 102,8 DICC50/tubo. Se consideran positivos
los anticuerpos que sean detectables a una dilución de 1/8.
Normalmente, se lleva a cabo una prueba de neutralización cruzada con el virus de la peste bovina. Un
suero se considera positivo para la PPR cuando su título de neutralización es por lo menos el doble que
para la peste bovina.
b)
Enzimoinmunoensayo competitivo
Se ha descrito un ELISA de competición basado en el uso de una antinucleoproteína monoclonal y de una
nucleoproteína recombinante obtenida en baculovirus (20).
i)
Las placas de microtitulación (por ejemplo, placas Nunc Maxisorb de alta capacidad de adsorción) se
recubren con 50 µl de una dilución predeterminada de proteína N-PPR (producida por un baculovirus
recombinante) a 37°C durante 1 hora con agitación constante.
ii)
Se lavan las placas tres veces y se secan con papel absorbente.
iii)
Se distribuyen 45 µl de tampón de bloqueo (PBS Tween 20 al 0,5% 0,5 suero fetal bovino) a todos
los pocillos. Después se añaden 5 µl de los sueros problema a los pocillos de prueba (a una dilución
final 1/20) y 5 µl de diferentes sueros control (suero fuertemente positivo, positivo débil y negativo) a
los pocillos control.
iv)
Se añaden 50 µl de MAb diluido 1/100 en tampón de bloqueo, y se incuban a 37°C durante 1 hora.
v)
Se lavan las placas tres veces, y se secan con papel absorbente.
vi)
Se añaden 50 µl del conjugado anti-ratón diluido 1/1.000, y se incuban a 37°C durante 1 hora.
vii)
Se lavan las placas tres veces.
viii) Se prepara OPD en solución de peróxido de hidrógeno. Se añaden 50 µl de mezcla de
substrato/conjugado a cada pocillo. Se detiene la reacción después de 10 minutos con 50 µl de ácido
sulfúrico 1 M.
ix)
Se leen las placas en un lector ELISA a 492 nm.
La absorbancia se convierte a porcentaje de inhibición (PI) mediante la fórmula:
PI = 100 – (absorbancia de los pocillos problema/absorbancia de los pocillos de control del MAb) ‰
100
Se consideran positivos los sueros que muestren un PI superior a 50%.
También se han descrito otras dos técnicas de ELISA de competición basadas en el uso de la antihemaglutinina monoclonal (H) (1, 26).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
171
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las ovejas y las cabras que se recuperan de la PPR desarrollan una inmunidad activa contra la enfermedad. Se
ha demostrado la presencia de anticuerpos 4 años después de la infección (8), pero probablemente la inmunidad
es para toda la vida. Se dispone de una vacuna homóloga contra la PPR. En 1998, el Comité Internacional de la
OIE aprobó el uso de esta vacuna en los países que han decidido seguir las directrices de la OIE para la
vigilancia epidemiológica en relación con la peste bovina, con el fin de evitar la confusión cuando se realicen los
estudios serológicos.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
La vacuna homóloga contra la PPR es una vacuna viva obtenida en células Vero. La cepa original de virus
para la vacuna homóloga contra la PPR es la cepa PPR 75/1, aislada en Nigeria en 1975 (30). La cepa está
atenuada mediante pases en cultivos de células Vero (6). La cepa proporcionada para la producción de
vacuna corresponde al pase 70 en células Vero (PPRV 75/1 I.K6 BK2 Vero 70). Esta se conserva en forma
liofilizada a –20°C y puede obtenerse de los Laboratorios de Referencia (véase el Cuadro mostrado en la
Parte 3 de este Manual sobre animales terrestres). Los ensayos de actividad de la vacuna demuestran que
retenía la capacidad protectora (a una dosis de 103 DICC50) hasta el pase 120 en células Vero, que es el
número de pase más elevado hasta ahora probado.
b)
Método de cultivo
•
Células
La vacuna contra la PPR se produce en células Vero, que deben estar libres de contaminación por
bacterias, hongos y virus.
•
Medio de cultivo
El medio de cultivo se compone de un medio mínimo esencial (MEM) suplementado con antibióticos (por
ejemplo, penicilina estreptomicina a concentraciones finales de 100 UI [Unidades Internacionales]/ml y
100 µg/ml, respectivamente) y un agente antifúngico (nistatina [Mycostatin] a una concentración final de
50 µg/ml). El medio se enriquece con suero fetal bovino (medio completo) para el crecimiento celular. Esta
proporción de suero se reduce al 2% para el medio de mantenimiento cuando la monocapa celular está
completa.
•
Lote de inóculo primario del virus vacunal
Este lote está formado por el pase número 70 del virus en células Vero (PPRV 75/1 LK6 BK2 Vero 70). El
contenido liofilizado de un frasco de un banco de inóculo se reconstituye en 2 ml de agua estéril (o en
medio de cultivo celular sin suero). Este líquido se mezcla con células Vero resuspendidas en medio de
cultivo completo para proporcionar como mínimo 0,001 DICC50 por célula. Las placas de cultivo celular se
llenan con esta mezcla de virus/célula (alrededor de 2 ‰ 107 células Vero en una placa de 175 cm2), y se
incuban a 37°C. Las células cultivadas se observan regularmente para detectar el ECP. El medio se
renueva cada dos días, reduciendo la proporción de suero al 2% una vez que la monocapa de células esté
completa. El virus se recoge por primera vez cuando el ECP es del 40–50%. Esta suspensión viral se
guarda a –70°C. Se realizan recogidas sucesivas cada dos días hasta que el ECP alcanza el 70–80%,
momento en el que se procede a la congelación de las placas de cultivo (por lo general, pueden hacerse al
menos dos recogidas más antes de la congelación final de las placas de cultivo). Todas las suspensiones
de virus recogidas se someten a dos ciclos de congelación-descongelación. A continuación se unen para
formar un solo lote, que sirve de lote de inóculo primario. A su vez, este se divide en pequeños volúmenes
en botellas y se guardan a –70°C. El contenido de cinco frascos se descongela y se titula (el título mínimo
que se requiere es 105 DICC50/ml). Es mejor liofilizar este inóculo con el fin de guardarlo a –20°C. En este
caso será necesario titular el virus liofilizado (cinco botellas). Un lote preparado de esta forma debe pasar
todos las pruebas con relación a la esterilidad.
Cuando se preparan lotes de inóculo, es importante no emplear dosis demasiado elevadas de virus para
infectar las células (alta multiplicidad de infección), ya que esto llevará a la acumulación de partículas
defectuosas en la suspensión viral producida, lo que disminuirá el título de los productos posteriores. Por
otra parte, una multiplicidad de infección baja (por ejemplo, 0,0001) prolongará el tiempo de cultivo.
172
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
•
Preparación del lote de inóculo de trabajo
Este lote se prepara en las mismas condiciones que el lote de inóculo primario. Se obtiene así un gran stock
de virus, a partir del que se preparará la vacuna final. Este lote se distribuye en recipientes que se guardan
a –70°C. Además, debe satisfacer las pruebas de esterilidad. Se titulan cinco muestras (el título mínimo
requerido es 106 DICC50/ml).
c)
Validación como vacuna
Es necesario confirmar o descartar la presencia del PPRV en el producto que se ensaya. Con este fin, se
utiliza un suero anti-PPR para neutralizar el virus en cultivo celular.
•
Procedimiento del ensayo
i)
Se mezcla el contenido de dos botellas de la vacuna con agua bidestilada estéril para obtener un
volumen igual al volumen que tenían antes de la liofilización.
ii)
Se hacen diluciones seriadas de la vacuna de razón diez, reconstituida en medio de cultivo libre de
suero (0,5 ml de suspensión viral 4,5 ml de medio).
iii)
A partir de cada botella, se realizan dos series de mezclas para las diluciones de virus, en placas de
96 pocillos, de la siguiente forma:
Serie 1:
Diluciones de la suspensión viral: –1
Suspensión viral (en µl)
50
Medio de cultivo (en µl)
50
–2
50
50
–3
50
50
–4
50
50
Serie 2:
Diluciones de la suspensión viral: –1
Suspensión viral (en µl)
50
antisuero PPR (en µl)
50
–2
50
50
–3
50
50
–4
50
50
(Nota: El antisuero PPR utilizado para este fin se prepara en cabras y se liofiliza. Se reconstituye con 1
ml de agua bidestilada estéril a una dilución 1/10.)
iv)
Se incuban las mezclas a 37°C durante 1 hora.
v)
A cada pocillo se añaden 100 µl de células resuspendidas en medio de cultivo completo (30.000
células/pocillo).
vi)
La microplaca se incuba a 37°C en presencia de CO2.
vii)
La placa se lee después de 10–15 horas de incubación.
Por lo general, el ECP se presenta sólo en los pocillos que contienen células infectadas con la mezcla de
virus y medio de cultivo. Si éste se detecta en los pocillos de la Serie 2, será necesario identificar el PPRV
mediante inmunofluorescencia, empleando un MAb frente a la PPR o mediante inmunocaptura (el MAb
frente a la PPR y el kit para la prueba de inmunocaptura pueden conseguirse en el Laboratorio de
Referencia para la PPR de la OIE en Francia (véase el Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual
sobre animales terrestres). Si esta identificación confirma la presencia del PPRV, el antisuero frente a la
PPR empleado debe de haber sido demasiado débil o debe cambiarse el lote. Si la inmunofluorescencia o
la inmunocaptura es negativa, debe haber un contaminante viral, y el material en estudio debe destruirse.
2.
Método de elaboración
a)
Producción de la vacuna
Esta operación se realiza a mayor escala. Las células pueden infectarse con virus a una multiplicidad de
infección como antes o con dosis más elevadas, por ejemplo, hasta 0,01. Los productos recogidos en
diferentes veces se juntan (para formar el producto final) tras dos ciclos de congelación-descongelación, y
se guardan a –70°C, pendientes de los resultados de titulación y de las pruebas de esterilidad. Si estos
resultados son satisfactorios, la vacuna se congela.
b)
Liofilización
El medio de liofilización (medio Weybridge) se compone de lactalbúmina al 2,5% (p/v), sacarosa al 5% (p/v)
y glutamato de sodio al 1% (p/v), pH 7,2.
Para proceder a la liofilización, se añade este medio a un volumen igual de la suspensión viral (que puede
haberse diluido de antemano para obtener el número deseado de dosis de vacuna por botella). La mezcla
resultante se conserva en frío, homogeneizada; a continuación se distribuye en botellas y se liofiliza. Al final
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
173
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
de un ciclo de liofilización, se regula la sonda y se conserva a 35°C durante 4 horas. Una vez completada la
operación, las botellas se tapan al vacío. Se seleccionan muestras al azar (por ejemplo, 5%) de este lote
final y se someten a pruebas en relación a su inocuidad, eficacia y esterilidad, y la humedad residual se
estima según el método de Karl Fisher (óptimo 3,5%). Si estas pruebas dan resultados no satisfactorios,
se destruye el lote completo.
3.
Control durante el proceso
Debe comprobarse que las células utilizadas en los cultivos celulares tengan aspecto normal y estén libres de
virus contaminantes, especialmente del virus de la diarrea vírica bovina. Debe llevarse a cabo una titulación del
virus del lote de inóculo empleando para ello medio MEM (sin suero) y realizando una serie de diluciones
decimales (0,5 ml virus 4,5 ml diluyente) hasta 10–6. Las células Vero de un frasco se tripsinizan y se
resuspenden en un medio de cultivo completo a una concentración de 300.000/ml. Se distribuyen en una placa
de 96 pocillos (a razón de 30.000 células por pocillo, equivalente a 100 µl de suspensión celular). A continuación,
se añaden 100 µl de dilución decimal del virus (diluciones que varían desde 10–2 hasta 10–6) a las células. Para
las células no infectadas se emplea como control una hilera de pocillos, a la que se añade medio de cultivo sin
virus (100 µl). La placa se incuba a 37°C en presencia de CO2. La lectura de las placas se realiza 10–15 días
después de la infección (examinando la aparición de ECP).
El título del virus se determina mediante el método de Spearman–Kärber. El título mínimo por dosis es de 102,5.
4.
Control de lotes
a)
Identidad
El contenido de cada recipiente procedente de cada lote envasado debe comprobarse en relación a su
identidad mediante cultivo, después de la neutralización con un antisuero específico.
b)
Esterilidad
Consiste en comprobar de la existencia de contaminantes víricos, bacterianos o fúngicos. Se lleva a cabo
sobre células y sueros antes de su utilización en la producción de vacuna, en el stock de inóculo y en la
vacuna antes y después de la liofilización. Cualquier producto que no pase esta prueba se destruye.
Las pruebas relacionadas con la esterilidad y la ausencia de contaminación de los materiales biológicos se
pueden encontrar en el Capítulo I.1.5.
c)
Inocuidad
Esta prueba se lleva a cabo en roedores con el fin de detectar la toxicidad no específica asociada al
producto. Para la realización de la prueba se necesita la vacuna reconstituida en disolvente (el contenido de
cinco botellas mezclados), seis cobayas que pesen cada uno 200–250 g; diez ratones no destetados (17–
22 g, línea Swiss o similar).
Se inyectan 0,5 ml de la vacuna intramuscularmente en una de las extremidades traseras de dos cobayas,
0,5 ml en la cavidad intraperitoneal de dos cobayas y 0,1 ml en la cavidad peritoneal de seis ratones. Dos
cobayas y cuatro ratones se conservan como controles sin inocular. Los animales se observan durante 3
semanas. La prueba debe repetirse si muere un cobaya o dos ratones. Los animales muertos se someten a
examen post-mortem con el fin de determinar la causa de la muerte. Al final de la tercera semana de
observación, se sacrifican todos los animales para la realización de un examen post-mortem. Se registran
todos los resultados. Se considera que la vacuna es satisfactoria, si durante la primera o segunda prueba,
al menos el 80% de los animales continúan con buen estado de salud durante el período de observación y
no se encuentran lesiones post-mortem significativas.
d)
Potencia y eficacia en los pequeños rumiantes
Para la realización de esta prueba se requiere el siguiente material: la vacuna reconstituida con solución
salina normal (los contenidos de cinco botellas mezclados) para producir 100 dosis y 0,1 dosis/ml; seis
cabras y seis ovejas, que tengan todas 1 año de edad aproximadamente y estén libres de anticuerpos
frente a la peste bovina o la PPR; jeringas estériles y agujas y el PPRV patógeno, previamente titulado en
cabras, diluido con solución salina normal estéril para obtener 103 de la dosis letal 50% para las cabras
(LD50).
Se vacunan dos cabras y dos ovejas subcutáneamente con 100 dosis por animal; se vacunan dos cabras y
dos ovejas subcutáneamente con 0,1 dosis por animal; los restantes animales se mantienen como controles
174
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.5. — Peste de los pequeños rumiantes
de animales que están en contacto. Durante tres semanas se observan los animales y diariamente se
registran sus temperaturas corporales. Al final de este período, se toma sangre de todos los animales para
la obtención de sueros. Todos los animales se desafían mediante una inyección subcutánea de 1 ml de la
suspensión del PPRV patógeno (103 DL50 por animal). Durante dos semanas se observan los animales y
diariamente se registran sus temperaturas corporales
Se considera que la vacuna es satisfactoria si todos los animales vacunados resisten la infección de
desafío, mientras que por lo menos la mitad de los animales control que han estado en contacto desarrollan
signos de la PPR. La prueba de neutralización sérica debe ser positiva para el anticuerpo de la PPR (en
suero diluido al menos 1/10) en los animales vacunados, únicamente en las muestras tomadas tres
semanas después de la vacunación. Si alguno de los controles también es positivo, el experimento debe
repetirse empleando otro lote de PPRV patógeno. Si los animales vacunados reaccionan al desafío
virulento, el lote de vacuna se destruye.
•
Titulación del anticuerpo neutralizante de la PPR
Para la realización de esta prueba, se requiere los siguiente: suspensiones celulares a una concentración
de 600.000 células/ml; placas de cultivo de células de 96 pocillos; los sueros a titular (inactivados por calor
a 56°C durante 30 minutos); medio completo de cultivo celular; diluciones del PPRV que den 1.000, 100, 10
y 1 DICC50/ml.
Se diluyen los sueros a 1/5, y después se hace una dilución doble en medio de cultivo celular. Se mezclan
100 µl de virus a 1.000 DICC50/ml (para dar 100 DICC50 en cada pocillo) y 100 µl de una dilución dada de
suero (empleando seis pocillos por dilución) en los pocillos de las placas de cultivo celular. Para el virus y
para las células no infectadas se dispone una serie de pocillos de control de la siguiente forma: seis pocillos
con 100 DICC50 (100 µl) por pocillo; seis pocillos con 10 DICC50 (100 µl) por pocillo; seis pocillos con 1
DICC50 (100 µl) por pocillo; seis pocillos con 0,1 DICC50 (100 µl) por pocillo y seis pocillos con 200 µl de
cultivo sin virus (control de células) por pocillo.
Los pocillos que contienen los controles de virus se completan hasta 100 µl con medio de cultivo completo,
y se incuban las placas a 37°C durante 1 hora, en presencia de CO2. Las placas se leen a la semana y a
las dos semanas de incubación. Los resultados deberían ser los siguientes: Aparición de efecto citopático
del 100% en los pocillos de control de virus de 100 y 10 DICC50, efecto citopático del 50% para la dilución
1 DICC50, no debe aparecer efecto citopático en la dilución 0,1 DICC50 ni en los pocillos donde el virus haya
sido neutralizado con suero durante la prueba y habrá efecto citopático en los pocillos donde el virus no
haya sido neutralizado con suero durante la prueba.
e)
Duración de la inmunidad
La duración de la inmunidad es de 3 años, como mínimo.
f)
Estabilidad
La vacuna liofilizada puede conservarse a 2–8°C durante al menos dos años (aunque es mejor a –20°C),
siempre y cuando se guarde al vacío y protegida de la luz. Recientemente se ha demostrado que esta
vacuna, resuspendida en un medio con trehalosa y sometida al método ultrarrápido de hidratación, puede
resistir a 45°C por un período de 14 días con una pérdida mínima de potencia (32).
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase Sección C.4.c.
c)
Potencia
Véase Sección C.4.d.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste de los pequeños rumiantes (ver Cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
177
CAPÍTULO 2.1.6.
PLEURONEUMONÍA BOVINA
CONTAGIOSA
RESUMEN
La pleuroneumonía contagiosa bovina (PBC) es una enfermedad del ganado bovino causada por
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC= colonias pequeñas).
Se manifiesta con anorexia, fiebre y síntomas respiratorios como disnea, poliapnea, tos y
descargas nasales. El diagnóstico depende del aislamiento del agente etiológico. Los principales
problemas para el control o la erradicación son la presencia frecuente de infecciones subagudas o
asintomáticas y la persistencia de portadores crónicos después de la fase clínica.
Identificación del agente: Las muestras que hay que tomar de animales vivos incluyen frotis
nasales y/o lavados broncoalveolares, o líquido pleural obtenido por punción. Las muestras a
tomar en las necropsias incluyen material de las lesiones pulmonares, nódulos linfoides, líquido
pleural y líquido sinovial de los animales con artritis. Es posible realizar el examen directo de los
exudados o frotis, pero ello requiere gran destreza.
Para el cultivo del agente patógeno, se homogenizan los tejidos en medios con antibióticos y se
inoculan en medios de cultivo que contienen inhibidores para evitar el crecimiento de las bacterias
contaminantes. El crecimiento de MmmSC tarda varios días.
En medio líquido, el crecimiento se observa en 3-10 días como una turbidez homogénea que forma
remolinos cuando se agita; en medio sólido, aparecen pequeñas colonias, de 1 mm de diámetro,
con la clásica morfología de "huevo frito". Las características bioquímicas de MmmSC son:
sensibilidad a la digitonina, reducción de sales de tetrazolio, utilización de glucosa, ausencia de
arginina hidrolasa, de fosfatasa y de actividades proteolíticas. Se han descrito medios especiales
que se recomiendan para estas pruebas. El diagnóstico se confirma con pruebas inmunológicas,
como la prueba de inhibición del crecimiento y la prueba de inmunofluorescencia (ambas utilizan
sueros hiperinmunes). La reacción en cadena de la polimerasa se utiliza actualmente como una
prueba rápida, específica, sensible y fácil de usar.
Pruebas serológicas: La prueba de fijación de complemento de Campbell & Turner modificada,
continúa siendo la prueba de diagnóstico prescrita para el comercio internacional. Sin embargo,
presenta limitaciones importantes respecto a sensibilidad y especificidad. Se ha considerado al
enzimoinmunoensayo como una prueba alternativa por el Comité Internacional de la OIE en Mayo
de 2000, y como una prueba prescrita ordenada por la OIE para el comercio internacional en el
2004. Se ruega consultar la página web de la OIE para la versión más reciente de este capítulo. Se
ha evaluado una prueba de inmunotransferencia y se ha descrito que es muy específica y sensible.
Requisitos para las vacunas: Para la producción de las vacunas se recomienda la cepa atenuada
T1/44. El título mínimo recomendado es 107 micoplasmas viables por dosis de vacuna.
A. INTRODUCCIÓN
La pleuroneumonía bovina contagiosa (PBC) es una enfermedad contagiosa del ganado bovino causada por
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC=colonias pequeñas). Se sabe que la
PBC se presenta en Europa desde el siglo XVI pero alcanzó una distribución mundial durante la segunda mitad
del siglo XIX debido al aumento en el mercado internacional de ganado vivo. A comienzos del siglo XX se
erradicó de muchos países mediante políticas de extirpación. Sin embargo, la enfermedad persiste aún en
muchas partes de África y del sur de Europa; en Asia, la situación es confusa. En Europa no se han descrito
brotes desde 1999. En condiciones naturales, MmmSC sólo afecta a rumiantes del género Bos, es decir
178
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
principalmente ganado bovino y cebúes. En Italia se ha aislado MmmSC (biotipo bovino) de búfalos (Bubalus
bubalus) (25), y en África y más recientemente en Portugal, de ovejas y cabras. Entre los animales salvajes se
ha descrito un único caso en búfalos americanos (bison) y ninguno en búfalos africanos (Syncerus caffer) u otros
rumiantes salvajes. Los animales salvajes no representan ningún papel en la epidemiología de la enfermedad. La
PBC se manifiesta por anorexia, fiebre y síntomas respiratorios, como disnea, poliapnea, tos y descargas
nasales. En el caso de brotes agudos en condiciones experimentales, la tasa de mortalidad puede alcanzar el
50% sin tratamiento con antibióticos. Esta mortalidad puede ser mucho menor en el campo; sin embargo, cuando
en un área se presenta por primera vez un brote, la mortalidad puede ser mayor. Los síntomas clínicos no son
siempre evidentes. Con frecuencia se presentan formas subagudas o asintomáticas cuando los animales se
recuperan parcialmente. En este caso, sus pulmones muestran lesiones encapsuladas típicas denominadas
"secuestros". Estos animales pueden ser responsables de la persistencia desapercibida de la infección en una
población o una región y desempeñar un papel importante en la epidemiología de la enfermedad. La transmisión
tiene lugar por contacto directo entre un animal infectado y otro sano. No existe evidencia de transmisión a través
de fomites ya que MmmSC no persiste en el ambiente. Las estrategias de control en la mayoría de los
continentes se basan en la detección inicial de los brotes, el control de los movimientos de los animales y una
política de extirpación. En África, el control de la enfermedad se basa en campañas de vacunación utilizando
cepas atenuadas de MmmSC como la T1/44 o T1sr. Aunque teóricamente el uso de antibióticos está prohibido,
se aplican ampliamente en condiciones de campo. Todavía no se han evaluado las consecuencias de estos
tratamientos antibióticos en términos de eficacia clínica, emergencia de cepas resistentes, persistencia de
portadores crónicos e impacto sobre la salud humana. El grupo de M. mycoides comprende seis especies de
micoplasmas o grupos de cepas de origen bovino y caprino (9, 21, 28). Este grupo se puede subdividir en dos
grupos, capricolum y mycoides, que incluyen especies estrechamente relacionadas. Estas seis especies de
micoplasmas comparten características serológicas y genéticas, y esto plantea problemas taxonómicos y de
diagnóstico (9) con las técnicas convencionales. La identificación específica de MmmSC se puede llevar a cabo
en la actualidad mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante la utilización de anticuerpos
monoclonales (MAbs). Aunque se ha considerado que MmmSC es un biotipo muy homogéneo, algunas técnicas
moleculares recientes, como la digestión enzimática del ADN completo o la transferencia tipo southern utilizando
como sonda un elemento de inserción, han identificado diferencias entre las cepas. Una técnica descrita
recientemente, que supone un modo más fácil de realizar epidemiología molecular de la PBC, consiste en un
análisis de la secuencia de locus múltiples (o tipado). Esta técnica permite diferenciar tres líneas principales que
se correlacionan con los orígenes geográficos (Europa, Sudáfrica y resto de África) (17). Las cepas de origen
europeo se pueden diferenciar claramente de las africanas (8, 32). Las cepas europeas recientes se caracterizan
por la delección de un gran fragmento de ADN y son incapaces de oxidar el glicerol, lo que puede explicar una
patogenicidad aparente inferior (33). Sin embargo, las cepas europeas aisladas en 1967 no mostraban esa
delección. Las cepas africanas parecen ser más diversas. No hay duda de que un mayor desarrollo técnico
permitirá una caracterización más fina de las cepas.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
El microorganismo causante se puede aislar de muestras de animales vivos o de material procedente de una
necropsia. Las muestras de animales vivos son frotis o descargas nasales, lavados broncoalveolares o
transtraqueales y líquido pleural tomado asépticamente por punción en la parte baja de la cavidad torácica entre
la séptima y octava costilla. También se puede cultivar la sangre (14). Las muestras de una necropsia son los
pulmones con lesiones, el líquido pleural ("linfa"), los nódulos linfáticos del tracto broncopulmonar y el líquido
sinovial de los animales con artritis. Las muestras deben tomarse de la interfase de las lesiones entre el tejido
enfermo y el normal.
El agente etiológico se puede detectar por cultivo, por métodos de estudio de ácidos nucleicos y por mediante
pruebas inmunológicas, que se describen más adelante. El estudio del agente es complejo y se puede llevar a
cabo por pruebas bioquímicas, métodos de detección de ácidos nucleicos y métodos inmunológicos. Estos
métodos se describen aquí en sus aspectos generales; sin embargo, se recomienda que la identificación
definitiva sea realizada por un laboratorio de referencia de la OIE.
La presencia de los patógenos varía mucho en función del estado de desarrollo de las lesiones, y un resultado
negativo no es definitivo, en particular después de un tratamiento con antibióticos.
Cuando se envían muestras al laboratorio, se aconseja utilizar un medio para el transporte que proteja los
micoplasmas y evite la multiplicación de otras bacterias (caldo de infusión de corazón sin peptona y glucosa,
10% de extracto de levadura, 20% de suero, 0,3% de agar, 500 Unidades Internacionales [IU]/ml de penicilina,
acetato de talio, 0,2 g/litro).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
179
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
Las muestras se mantienen frías a 4ºC si se mantienen unos días, o se congelan a -20ºC o menos por más
tiempo. Para traslados entre laboratorios, los fragmentos de pulmón o el líquido pleural también pueden
congelarse. Si no se pueden procesar el mismo día de su recogida las muestras se deberían congelar.
a)
Cultivo
MmmSC necesita medios apropiados para crecer (24). Para el aislamiento se pueden requerir 2-3 pases.
Muchos intentos de aislamiento fracasan porque el microorganismo es lábil, se presenta a menudo en
pequeñas cantidades, y es exigente en sus requerimientos nutritivos. Los medios deben contener un medio
básico (como infusión de corazón o peptona), extracto de levadura (preferiblemente fresco) y suero de
caballo (10%). Se pueden añadir otros componentes, como glucosa, glicerol, ADN y ácidos grasos, pero los
efectos varían según las cepas. Son necesarios inhibidores, como penicilina, colistina o acetato de talio,
para evitar el crecimiento de otras bacterias. El medio se puede utilizar líquido o solidificado con 1.0-1.2%
de agar. Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y deben permitir
el crecimiento de Mycoplasma spp. a partir de inóculos pequeños. La cepa de referencia se debe de cultivar
en paralelo con las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas funcionan correctamente.
Las muestras de pulmón se homogenizan en caldo con antibióticos, se diluyen diez veces para reducir la
contaminación bacteriana y se inoculan en cinco tubos de caldo y en medio sólido. El líquido pleural se
puede inocular directamente sin dilución previa. Se recomienda el uso de cierres herméticos en las placas
Petri o de incubadores con humedad controlada para evitar la desecación. Para asegurar las mejores
condiciones de crecimiento de los micoplasmas debe utilizarse un incubador de CO2 o una jarra de
anaerobios. Los tubos y las placas de Petri se inspeccionan diariamente durante 10 días. En medio líquido,
por lo general aparece en 2-4 días una turbidez homogénea, con frecuencia con un filamento frágil y
sedoso llamado "cometa", que es característico de MmmSC (o de M. capricolum subsp. capripneumoniae,
la causa de la pleuroneumonía caprina contagiosa). Durante los siguientes días se desarrolla una opacidad
uniforme con remolinos cuando se agita. En medio sólido, las colonias son pequeñas (1 mm de diámetro) y
presentan la forma clásica de "huevo frito" con un centro denso. En esta fase se puede realizar la prueba de
la inmunofluorescencia indirecta (IFI).
b)
Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas se consideran pruebas confirmativas, para realizarse en laboratorios de
referencia. Para el uso rutinario, las pruebas inmunológicas son suficientes, pero cuando éstas dan
resultados dudosos y en todos los casos de primeros aislamientos, las pruebas bioquímicas deben
confirmarse en un laboratorio de referencia. A este fin, después de uno o dos pases, se deben eliminar del
medio los antibióticos para comprobar si el aislado es un micoplasma o una forma-L de una bacteria que
recuperará su forma original en el medio sin inhibidores. Una vez hecho esto, y después de clonar (deben
seleccionarse al menos tres colonias), se puede identificar el microorganismo utilizando pruebas
bioquímicas (2, 12)
MmmSC es sensible a la digitonina (como todos los miembros del orden Mycoplasmatales), no produce
"velo y manchas", fermenta la glucosa, reduce las sales de tetrazolio (aeróbica o anaeróbicamente), no
hidroliza la arginina, carece de actividad fosfatasa y no tiene propiedades proteolíticas o éstas son muy
débiles.
Se han desarrollado medios especiales para estas pruebas que contienen los mismos ingredientes básicos
(caldo de infusión de corazón o caldo Bacto PPLO [organismos semejantes a los de la pleuroneumonía],
suero de caballo, 25% de solución de extracto de levadura, 0,2% de solución de ADN), a los que se añade
1% de una solución de glucosa al 50% para ver la utilización de glucosa, 4% de una solución de argininaHCl al 38% para ver la hidrólisis de arginina, y 1% de una solución de cloruro de dimetil tetrazolio para la
reducción del tetrazolio, más un indicador de pH (por ejemplo, rojo fenol). Para la demostración de
proteolisis, se realiza el crecimiento sobre agar caseína y/o agar con suero coagulado.
Una vez realizada la caracterización bioquímica, se debe realizar una de las siguientes pruebas
inmunológicas para confirmar la identificación: prueba de inhibición del crecimiento en disco (DGIT),
inmunofluorescencia (FAT) y prueba de inmunounión en punto sobre un filtro de membrana (MF-dot).
El aislamiento e identificación del agente de la PBC puede ser difícil y consumir mucho tiempo, y depende
del manejo cuidadoso de los procedimientos y medios adecuados. Cuando resulte posible, los laboratorios
bacteriológicos clásicos deberían montar una sección especial para trabajar solo con micoplasmas.
c)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Se han desarrollado sondas radioactivas o enzimáticas, pero su uso es restringido principalmente por
razones de seguridad.
180
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
Por otra parte, la PCR es sensible, muy específica, rápida y fácil de realizar. Se han descrito cebadores
específicos para el grupo M. mycoides (26) y para MmmSC (10, 20, 31) y se han desarrollado pruebas PCR
(5, 10, 20) que incluyen una nueva técnica que permite la identificación específica de las cepas T1
vacunales (18). La PCR se puede aplicar directamente después de desnaturalizar en agua hirviendo
muestras tales como exudados de pulmón, sin extracción de ADN. No obstante, la ebullición de las
muestras es menos sensible que la extracción de ADN y no debe utilizarse de modo rutinario. Incluso puede
aplicarse a muestras secas sobre papel de filtro. Los fragmentos de pulmón se tienen primero que
homogenizar y centrifugar a baja velocidad antes de la desnaturalización y la PCR. También puede
realizarse la PCR con orina o con sangre. La principal ventaja de la técnica de la PCR es que se puede
aplicar a muestras mal conservadas (contaminadas o sin micoplasmas viables, como puede ocurrir después
de un tratamiento con antibiótico. Si falla la detección directa del ADN en el órgano estudiado, las muestras
deben enriquecerse cultivándolas durante 24-48 horas en un medio apropiado, e intentar después la
detección del ADN en el cultivo. La PCR se ha convertido en el instrumento más importante para la
caracterización y diferenciación entre los miembros del grupo M. mycoides y MmmSC.
d)
Pruebas inmunológicas
Se puede poner de manifiesto el agente etiológico o sus antígenos mediante pruebas inmunoquímicas en
tejidos infectados, líquidos tisulares y/o cultivo del microorganismo. Sin embargo, como algunas de estas
pruebas dependen de que esté presente en la muestra un número mínimo de microorganismos, solo se
tienen en cuenta los resultados positivos.
i)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
La prueba IFI se puede realizar sobre frotis de materiales clínicos utilizando suero de conejo
hiperinmune contra MmmSC y anti-IgG marcada, de origen bovino. Se ha utilizado suero hiperinmune
bovino, pero puede tener anticuerpos con reacción cruzada. La prueba es satisfactoria cuando se
aplica a frotis de líquido pleural, pero lo es menos con frotis de pulmón, debido a una considerable
fluorescencia inespecífica. Sin embargo, se pueden obtener buenos resultados utilizando frotis de
pulmón con negro Ericromo como tinción de contraste.
ii)
Prueba del anticuerpos fluorescentes
Por lo general, esta prueba (FAT) se realiza sobre cultivos líquidos y sólidos. Es un poco menos
específica que la prueba IFI.
Cultivo líquido: Colocar dos gotas en un porta. Fijar 15 minutos con alcohol metílico y en una cámara
húmeda dejar en contacto durante 30 minutos a 37ºC con el suero hiperinmune marcado. Lavar tres
veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) y examinar en un microscopio de
epifluorescencia (x80).
Colonias en medio sólido: Tomar un trozo de agar con varias colonias jóvenes y colocarlo en un porta
con las colonias hacia arriba. Depositar una o dos gotas del suero hiperinmune marcado sobre el trozo
y dejarlo en una cámara húmeda durante 30 minutos. Colocar el trozo en un tubo y lavar dos veces
durante 10 minutos con PBS. Colocar el trozo en un porta con las colonias hacia arriba y examinar
como antes.
Cultivo en placa de Petri: El gel no debe ser muy grueso (menos de 3 mm) y debe contener el menor
suero de caballo posible. Lavar el gel tres veces con PBS, extender por la superficie 1 ml del suero
marcado e incubar 30 minutos en una cámara húmeda. Lavar cuatro veces con PBS y examinar
directamente en un microscopio. La FAT en una placa de Petri se utiliza fundamentalmente después
del aislamiento y antes de clonar, ya que es muy útil en el caso de infecciones mixtas con varias
especies de micoplasmas.
Interpretación de la FAT: En medio líquido, los micoplasmas aparecen de color verde brillante sobre
fondo oscuro. Sin embargo, con la FAT realizada sobre colonias en agar, se requiere experiencia
porque el fondo aparece como verde oscuro.
iii)
Prueba de inhibición del crecimiento en disco
La DGIT se basa en la inhibición directa del crecimiento del agente en medio sólido por un suero
inmune específico (12). Sin embargo, con frecuencia se presentan reacciones cruzadas con el grupo
mycoides y se debe tener mucho cuidado en diferenciar MmmSC (biotipo bovino) de MmmLC (biotipo
caprino; LC: colonias grandes). Es una prueba sencilla de realizar pero la interpretación de algunos
resultados requiere experiencia: pequeñas zonas de inhibición (de anchura menor de 2 mm), inhibición
parcial con "colonias invasoras", reacciones negativas y positivas falsas (muy raras). En esta prueba,
la calidad del suero hiperinmune utilizado resulta crítica para obtener buenos resultados.
iv)
Prueba de inmunodifusión en medio sólido
La prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) permite detectar el antígeno específico que está
presente en la superficie del MmmSC y el galactano circulante que invade el sistema hemolinfático de
los animales enfermos (13). Se puede probar líquido pleural o fragmentos homogenizados de pulmón
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
181
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
frente a un suero hiperinmune en dos pocillos practicados sobre el gel y separados entre sí 5 mm. El
gel se compone de agar Noble (12 g) y acetato de talio (0,2 g/litro) en PBS, pH 7,2 (1.000 ml). Se
considera que la prueba carece de sensibilidad y se sabe poco sobre su especificidad, pero ha servido
como prueba de análisis y solo se deben tener en cuenta los resultados positivos. Los resultados son
mejores cuando la placa se incuba a 37ºC y puede leerse en 24 horas. Se ha desarrollado una prueba
de campo, sencilla, que utiliza discos de papel impregnados, en vez de pocillos (23).
v)
Inmunotransferencia de punto en membrana de filtración
La prueba MF-dot se puede utilizar como prueba de rutina en el laboratorio. Esta técnica se puede
realizar con antisueros policlonales adoptando un procedimiento cuantitativo (22), aunque pueden
presentarse reacciones cruzadas dentro del grupo mycoides. Se han empleado MAbs específicos que
pueden evitar este problema (7).
vi)
Inmunohistoquímica
En lesiones pulmonares se pueden detectar sitios inmunoreactivos para MmmSC utilizando el método
peroxidasa-antiperoxidasa en secciones de muestras incluidas en parafina (11). En el diagnóstico de
la PBC esta prueba es solo suplementaria, pues en casos crónicos o después de tratamiento con
antimicrobianos no siempre se obtiene el aislamiento del agente (6); un resultado negativo no es
concluyente.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas para la PBC solo son válidas a nivel de poblaciones. Las pruebas individuales con
animales pueden resultar equívocas porque el animal se encuentre en las primeras fases de la enfermedad,
antes de que se produzcan los anticuerpos específicos, o porque pueda estar en la fase crónica de la
enfermedad, cuando muy pocos animales son seropositivos.
a)
Fijación de complemento (una prueba adecuada para determinar la ausencia de la enfermedad y la
prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba de fijación de complemento (FC) de Campbell & Turner continúa siendo el procedimiento
recomendado con carácter general (aunque el método actual difiere ligeramente del original), y es muy
utilizado en todos los países donde se presenta la infección (24). La prueba FC, como micrométodo, se ha
homologado en la Unión Europea (19). A efectos de titulación de antígeno y de armonización, se
prepararon sueros positivos como estándares internacionales (840 y 845, PS1 y PS2, respectivamente) y
están disponibles en el Laboratorio Nacional de Investigación Veterinaria, en Lisboa, Portugal (19). Sin
embargo, la prueba FC todavía resulta de difícil realización y requiere personal bien entrenado y con
experiencia.
182
•
Reactivos
i)
Tampón Veronal (VB) pH 7,3. Se utiliza una solución base concentrada que se diluye al 1/5 en agua
estéril bidestilada.
ii)
Las muestras de suero, sin eritrocitos, deben inactivarse a 56ºC durante 30 minutos y diluirse al 1/10
en VB.
iii)
El antígeno consiste en una suspensión de MmmSC previamente titulada y se utiliza a la dosis de 2
unidades fijadoras de complemento (unidades FC). Se debe mantener a 4ºC sin congelar. Se produce,
prueba y distribuye por laboratorios reconocidos internacionalmente.
iv)
El complemento (C´) se obtiene a partir de suero normal de cobaya. Se liofiliza y se reconstituye en
agua bidestilada. Después de la reconstitución se debe mantener a -20ºC. Se titula practicando una
serie de diluciones en VB con una cantidad apropiada de antígeno que se utiliza en la prueba.
Después de incubar a 37ºC durante 2 horas, a cada dilución se añade una cantidad apropiada de
eritrocitos de oveja sensibilizados (SRBC). El resultado de la titulación se lee después de incubar otra
hora. La dilución mas alta que provoca hemolisis completa de los SRBC es igual a 1 unidad de C´, de
donde se calcula la dilución requerida para 2,5 unidades en 25 µl.
v)
La hemolisina es un suero hiperinmune de conejo contra SRBC. La cantidad utilizada es de 6 dosis
hemolíticas leídas a punto final del 50% (HD50 [dosis hemolítica del 50%]).
vi)
Los SRBC se obtienen por punción aséptica de la vena yugular. Se pueden conservar en solución de
Alsever o con citrato sódico. Se utilizan como suspensión al 6%.
vii)
El sistema hemolítico (HS) se prepara diluyendo hemolisina en VB hasta una dosis de 12 HD50. Se
añade un volumen igual de suspensión de SRBC al 6% y el sistema se lleva a un baño de agua a
37ºC durante 30 minutos con agitación periódica.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
viii) Los dos sueros positivos estándar, PS1 y PS2, son sueros bovinos de animales infectados
naturalmente con un título bajo y alto, respectivamente, para armonización y control de la prueba FC, y
para titulación de antígeno (PS2). Son negativos para anticuerpos frente a Brucella, Mycobacterium
paratuberculosis,
Chlamydia,
Coxiella
burnetii,
Leptospira,
rinotraqueitis
bovina
infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, Mycoplasma bovis y virus de la leucosis bovina.
ix)
El suero de control negativo (NS) es un suero de bovino sano, negativo para los microorganismos
señalados.
•
Procedimiento de la prueba (utilizando microplacas)
i)
Colocar 25 µl de las muestras de los sueros de ensayo (ya diluidas a 1/10). Añadir 25 µl de antígeno a
una dosis de 2 unidades FC.
ii)
Añadir 25 µl de C´a una dosis de 2,5 unidades. Agitar vigorosamente e incubar a 37ºC durante
30 minutos con agitación periódica.
iii)
Añadir 25 µl de HS, agitar vigorosamente e incubar a 37ºC durante 30 minutos con agitación periódica.
Es necesario disponer de los siguientes controles:
Complemento: 0,5, 1 y 2,5 unidades.
Sistema hemolítico: 75 µl de VB + 25 µl de HS.
Antígeno: 25 µl de 2 unidades FC de antígeno + 25 µl de C´con 2,5 unidades + 25 µl de HS.
Nota: las microplacas deben agitarse vigorosamente dos veces durante el período de incubación. Se
utilizan siempre los controles indicados arriba, el PS y el NS, en cada microplaca o en una serie de
microplacas en que se utilizan los mismos lotes de reactivos.
iv)
Lectura e interpretación de los resultados: Después de centrifugar las microplacas a 125 g durante
2 minutos, la lectura se basa en el porcentaje observado de fijación de complemento.
Resultado positivo: 100% de hemolisis a 1/10;
Resultados dudosos: 25, 50 o 75% de hemolisis a 1/10.
Se recomienda que cualquier fijación de complemento, incluso parcial (25, 50 ó 75%), a una dilución
1/10 de suero se continúe con investigaciones adicionales.
Las limitaciones de la prueba FC resultan bien conocidas. Con una sensibilidad de >99,5%, la prueba FC
puede detectar casi todos los animales enfermos con lesiones agudas, pero sólo una pequeña proporción
de animales en las primeras fases de la enfermedad o con lesiones crónicas. Además, las intervenciones
terapéuticas o las operaciones profilácticas ejecutadas de modo incorrecto (sacrificio parcial de la
población) pueden aumentar el número de reacciones negativas falsas. Sin embargo, para grupos de
animales (una manada o unidad epidemiológica) la FC es capaz de detectar prácticamente el 100% de los
grupos infectados.
La naturaleza de la patogénesis de la enfermedad es tal que el período de incubación, durante el cual los
anticuerpos resultan indetectables por la prueba FC, puede prolongarse varios meses.
Pese a la alta sensibilidad de la prueba FC, pueden producirse resultados positivos falsos. Una causa
importante de ello es la existencia de reacciones serológicas cruzadas con otros micoplasmas, en particular
con otros miembros del grupo M. mycoides. La validez de los resultados debe confirmarse mediante
examen post-mortem y bacteriológico, y mediante pruebas serológicas con sangre tomada en el momento
del sacrificio.
b)
Enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional)
Se ha sometido a evaluación (3) un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) desarrollado por el Centro
de Colaboración de la OIE para el diagnóstico y Control de Enfermedades Animales en Países Tropicales
(ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) (16). En la actualidad, la IAEA está evaluando un ELISA indirecto
basado en una lipoproteína (1). En mayo de 2000 se designó a la C-ELISA como una "prueba alternativa"
por el Comité Internacional de la OIE y en mayo 2004 como una prueba prescrita. Comparada con la
prueba FC, la prueba C-ELISA tiene una sensibilidad similar pero una especificidad mayor. La C-ELISA es
una prueba para poblaciones de animales más fácil de realizar que la FC, pero sus características no han
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
183
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
sido determinadas por completo, todavía (16). Los reactivos para C-ELISA se pueden obtener como
preparaciones comercializadas1.
Las pruebas de validación llevadas a cabo en varios países europeos y africanos (3, 16) indican i) que la
verdadera especificidad de C-ELISA es de al menos 99,9%; ii) que la sensibilidad es similar a la de la
prueba FC; y iii) que mediante C-ELISA los anticuerpos se detectan muy poco tiempo después de que se
pueden detectar por la prueba FC y que los anticuerpos detectados por C-ELISA persisten mediante más
tiempo.
Esta prueba C-ELISA se suministra ahora como una preparación comercial lista para ser utilizada, que
contiene todos los reactivos necesarios incluyendo placas recubiertas, que se mantienen selladas por papel
de aluminio. La preparación se ha diseñado especialmente para ser resistente y ofrecer una buena
reproducibilidad. Los sueros se analizan en pocillos únicos. El substrato se ha modificado y en la actualidad
es TMB (tetrametil benzidina) en tampón líquido y la lectura se realiza a 450 nm. El color del substrato
cambia de verde pálido a azul en una primera fase y es amarillo después de añadir la solución de parada.
Los controles de MAbs muestran un color más oscuro mientras que los controles de suero muy positivo son
muy claros. El punto de corte se ha tomado al 50% y debería ser válido en cualquier país. En una población
afectada muchos animales mostrarán resultados positivos.
c)
•
Reactivos
i)
El antígeno base se prepara lavando una suspensión concentrada de micoplasmas (2 mg/ml) y lisando
con dodecil sulfato sódico al 0,1%. El antígeno base se mantiene a -20ºC hasta su uso.
ii)
Los MAbs se pueden conseguir del Centro de Colaboración de la OIE para el Diagnóstico y Control de
Enfermedades Animales en Regiones Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).
iii)
El conjugado es DAKO P260 diluido 1/1500 en PBS con 0,5% de suero de caballo y 0,05% de Tween
20.
iv)
El substrato es 1 mM ABTS (2, 2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico]) y H2O2 en tampón
citrato.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Las placas para ELISA se recubren con una solución
pH 7,4 (100 µl/pocillo) y se incuban toda la noche a 4ºC.
ii)
Se lavan las placas una vez en PBS diluido 1/5 con 0,05% de Tween 20.
iii)
Sueros no inactivados por el calor (diluidos 1/10) y MAb diluidos en PBS con 0-5% de suero de caballo
y 0,05% de Tween 20 se dejan en contacto con el antígeno durante 1 hora a 37ºC con agitación
moderada, en una cámara húmeda. El suero inactivado por calor no proporciona buenos resultados.
iv)
Se lavan las placas dos veces y se añade el conjugado a todos los pocillos (100 µl); luego se incuba
durante 1 hora a 37ºC.
v)
Se lavan las placas tres veces y se añade el substrato a todos los pocillos (100 µl).
vi)
Se realiza la lectura a 405 nm cuando la absorbancia alcanza 0,8-1,6 en el control de MAb.
de
antígeno
lisado
en
PBS,
Prueba de inmunotransferencia
Se ha desarrollado una prueba inmunoenzimática denominada prueba de inmunotransferencia (prueba IB)
que se considera con valor diagnóstico. Una estimación en condiciones de campo indicó una sensibilidad y
especificidad más altas que la prueba de FC. Se considera inmunodominante un perfil básico de bandas
antigénicas, que se presentan en animales infectados tanto experimental como naturalmente. La visión
ajustada del estado inmune del animal que proporciona esta prueba se debe a la posibilidad de un análisis
más preciso de la respuesta inmune del hospedador en relación con el perfil electroforético de los antígenos
de MmmSC; por tanto, esta prueba supera problemas relacionados con unión inespecífica. Debería
utilizarse fundamentalmente como una prueba confirmativa, después de otras pruebas, y en todos los casos
en los que la prueba FC ha dado un resultado falso sospechoso. Particularmente, posee valor donde se
están implantando políticas de control o erradicación de la enfermedad.
1
184
International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria, o CIRAD/EMVY, Santé
Animale, Campus International de Baillarguet, TA30/G, 34398 Montpellier cedex 5, Francia.
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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
•
Preparación de tiras de antígeno
i)
El antígeno se prepara lavando una suspensión de células de micoplasmas obtenida de un cultivo de
48 horas.
ii)
Se prepara una SDS/PAGE (dodecil sulfato sódico/electroforesis en gel de poliacrilamida) con gel de
concentración al 4% y gel de resolución en gradiente del 5-15% y se utiliza para electroforesis de la
muestra con marcadores apropiados de peso molecular.
iii)
Las proteínas separadas se transfieren a membranas de 0,45 µm de nitrocelulosa (14 x14 cm) a un
voltaje constante de 70 V en tampón de transferencia (20% de metanol en 193 mM de glicina, 25 mM
de Tris/HCl, pH 8,3).
iv)
Se seca la membrana y se marca el lado sobre el que se encuentran las proteínas. Se incuba la
membrana de nitrocelulosa en tampón de bloqueo (PBS que contiene 5% de leche desnatada, 1 M de
glicina y 1% de ovolabúmina) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 15
minutos en PBS con 0,1% (v/v) de Tween 20, la membrana se lava de nuevo con PBS solo. Se seca la
membrana y se corta una tira del borde, que se ensaya. Se identifican las bandas específicas de 110,
98, 95, 62/60 y 48 kDa.
v)
La hoja de la membrana de nitrocelulosa se corta en tiras de 0.4 cm de anchura y se marca cada tira.
Estas tiras son el antígeno usado en la transferencia.
•
Procedimiento de la prueba
NB: Las tiras deben disponerse con el antígeno hacia arriba durante el procedimiento.
d)
i)
Las muestras del suero de prueba se diluyen al 1/3 y se preparan sueros control positivo y negativo
utilizando tampón de dilución (PBS con 0,1% de leche desnatada y 0,1% de ovoalbúmina).
ii)
Se coloca una tira de antígeno en cada muestra de estudio (y en los controles) y se incuba a 37ºC
durante 2 horas con agitación continua. Después se lavan las tiras, como antes.
iii)
Las tiras se incuban con una dilución adecuada de Ig anti-bovina (cadenas H +L) conjugada con
peroxidasa, en tampón de dilución, durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitación continua.
Después, lavar como antes.
iv)
El substrato se prepara añadiendo 30 mg de 4-cloro-1-naftol, disuelto en 10 ml de metanol, a 50 ml de
PBS y 30 µl de H2O2. Se añade substrato a las tiras, que se dejan en la oscuridad con agitación
continua y se examinan periódicamente hasta que las bandas de proteínas aparecen oscuras. La
reacción se detiene con agua destilada.
v)
Lectura de los resultados: Las tiras se secan y se examinan respecto a la presencia del perfil básico
de inmunotransferencia de IgG para cinco bandas antigénicas específicas de 110, 98, 95, 62/60 y
48 kDa. Los sueros que dan un perfil inmunológico similar se consideran positivos.
Otras pruebas
Para detectar aglutininas específicas se ha desarrollado una prueba rápida de campo de aglutinación en
porta (SAT) con sangre entera o con suero (30): el antígeno es una suspensión densa de micoplasmas
coloreados que se mezcla con una gota de suero o sangre. Debido a una sensibilidad escasa, la prueba
sólo detecta animales en los estados iniciales de la enfermedad (es decir, la fase aguda). Debe usarse solo
a nivel poblacional. Se ha desarrollado una prueba de aglutinación con látex que es más fácil de interpretar
que la SAT (4).
Para la PBC, las pruebas FC y ELISA se pueden utilizar en programas de análisis y erradicación, y la
prueba IB altamente específica debería usarse como confirmativa. Sin embargo, la prueba IB no satisface el
análisis masivo y puede ser difícil de estandarizar en países con servicios de laboratorio marginales.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Desde principios del siglo XX se han descrito muchas vacunas contra la PBC (vacunas muertas y vacunas
heterólogas), pero ninguna ha sido realmente satisfactoria. En la actualidad, las únicas vacunas utilizadas se
producen con cepas atenuadas de MmmSC.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
185
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para preparar vacunas contra la PBC se utilizan dos cepas: la cepa T1/44, una cepa atenuada
naturalmente y aislada en 1951 por Sheriff & Piercy en Tanzania, y la cepa T1sr (34, 35). El pase número
44 por huevo es lo suficientemente atenuado para proteger al ganado sin producir reacciones postvacunales importantes. Después de la vacunación pueden presentarse reacciones locales en el punto de la
vacunación. Las razas de ganado deben caracterizarse en cuanto a sensibilidad antes de proceder a
vacunar en masa. Debe advertirse que cuando la vacuna se suministra por intubación puede producir PBC;
sin embargo, si se inyecta subcutáneamente no debe crear un problema serio de enfermedad (15).
La identidad de la cepa se puede comprobar con la inserción del perfil de la secuencia o por ensayo
específico con PCR (18).
La cepa de inóculo original se mantiene en forma liofilizada a -20ºC.
b)
Método de cultivo
Para la producción de vacunas se utiliza un sistema de lotes de inóculos liofilizados que se obtienen de
cultivos del inóculo primario. Estos lotes de inóculo se mantienen a -20ºC.
Los medios utilizados para los cultivos de siembra son el medio de Gourlay o el medio F66: ambos
contienen los mismos ingredientes básicos, pero el F66 es más complejo (24). Los medios se esterilizan por
filtración, poseen un pH de 7,8-8,0, y deben utilizarse en pocos días después de su preparación. El medio
se debe distribuir en tubos incubados a 37ºC durante 48 horas para comprobar su esterilidad antes del uso.
Para cultivos en masa de la cepa de vacuna se debe inocular directamente el contenido completo de un vial
de inóculo de siembra a 100 ml de medio, para evitar el riesgo de clonar sin pretenderlo el inóculo de la
vacuna.
2.
Método de producción
Los medios para producir vacunas, de Gourlay o F66, se describen en la Sección C.1.b. Deben distribuirse en
matraces de 1 litro (500 ml por matraz) y de 10 litros (5 litros por matraz) e incubarse a 37ºC durante 48 horas
para comprobar la esterilidad antes de su utilización.
Para obtener un recuento bacteriano alto, se deben recoger los cultivos justo antes del final de la fase logarítmica
de crecimiento, antes del punto máximo, pues el número de micoplasmas viables se reduce después
rápidamente. Por consiguiente se debe realizar una cinética de la curva de crecimiento en cada laboratorio de
producción. El contenido de un vial de inóculo de trabajo se usa en tubos en diluciones seriadas. Si no se
produce contaminación después de la incubación, se utiliza el segundo tubo, cuando el cultivo aún está en fase
exponencial, para inocular matraces de 1 litro. Los matraces de 10 litros se inoculan con el cultivo de 48 horas de
un matraz de 1 litro (10 ml/ litro de medio) y se incuban a 37ºC. Después de 24 horas de incubación, se
recomienda que la agitación magnética sea lenta. Justo antes de que se alcance el máximo (entre 60 y 70 horas
de incubación), se prepara el cultivo para liofilización.
Los siguientes pasos deben hacerse en hielo:
•
Adición del medio protector de liofilización: leche en polvo desnatada (al 4,5%, es decir 225 g por cada 5
litros).
•
Distribución en viales (el volumen depende del número de dosis necesarias por vial y de los pasos de la
liofilización).
Para liofilizar se recomiendan liofilizadores con estantes para controlar y observar los diferentes pasos. Los
viales deben cerrase en la máquina del liofilizador para evitar roturas.
3.
Control interno
En cada paso deben realizarse exámenes microscópicos de preparaciones teñidas con la tinción de Gram del
caldo, o de cultivos del caldo en medio sólido con sangre, para comprobar la ausencia de contaminación
bacteriana.
186
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
También debe realizarse un examen rápido para comprobar la presencia de MmmSC en el medio recogido, por
microscopía de contraste de fases y mediante FAT con un suero hiperinmune marcado.
Se inoculan muestras liofilizadas de las vacunas en agar micoplasma o en caldo para llevar a cabo pruebas de
inhibición del crecimiento (11).
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Se inoculan caldos bacteriológicos, así como agar sangre, y se incuba a 37ºC. Todos los medios deben
permanecer estériles (24). Las pruebas para esterilidad pueden encontrarse en el Capítulo I.1.5.
b)
Titulación
El título mínimo es de 107 micoplasmas por dosis de vacuna, pero se recomiendan títulos más altos, de al
menos 108. La titulación se lleva a cabo después de reconstituir la vacuna liofilizada en el diluyente
recomendado para la vacunación. Las titulaciones se deben realizar en al menos cinco viales de cada lote.
Técnica clásica: Se realizan diluciones decimales en medio de Gourlay. Para homogenizar la suspensión en
cada tubo resulta útil emplear un agitador de tipo vórtex. Primero, 5 ml de los tubos con diluciones de 10-6 a
10-12 se inoculan en cinco tubos de medio (1 ml por tubo, cinco tubos por dilución). Todos los tubos se
incuban luego 4 días a 37ºC y se detecta el crecimiento por el cambio de color en el indicador. El título se
obtiene utilizando la tabla del "Número Más Probable" de MacCrady o por modificación del método de Reed
& Muench. Esta técnica es simple y fácil de realizar pero carece de precisión (+ 0,5 log).
Se ha descrito un método de microtitulación que es más exacto (27) y que debería utilizarse cuando sea
posible.
Existen procedimientos alternativos de titulación que incluyen el uso de diluciones decimales preliminares,
como en la técnica clásica, pero la siembra de 20 alícuotas de 100 µl, por cada dilución, en una microplaca
que ya contiene el "medio con glucosa" y un indicador de pH. Se pueden probar cuatro diluciones en una
microplaca, dejando dos columnas para el control del medio. El título se calcula por una modificación del
método de Reed y Müench que consiste en restar 0,25 log del título final para obtener un "número de
organismos viables" y no una dosis infectiva del 50%. La precisión final debe ser del orden de 0,2-0,25 log.
Se pueden obtener titulaciones comparativas sembrando alícuotas de 20 µl de cada una de las diluciones
primarias en un medio sólido conveniente. Los títulos se obtienen luego como CFU (unidades formadoras
de colonias) y no debería diferir mucho de los títulos obtenidos en medio líquido. La titulación en medio
sólido requiere más destreza que en medio líquido.
c)
Inocuidad
Después de la reconstitución en tampón frío, la vacuna se inocula subcutáneamente en dos ratones, e
intraperitonealmente en otros dos ratones y en dos cobayas machos. Ninguno de los animales debe morir
en el mes siguiente y los cobayas no deben mostrar signos de orquitis. Las pruebas de inocuidad se deben
realizar por lo menos en dos cabezas de ganado bovino o de cebúes. Cada una se inocula con diez dosis
de vacuna y se observan para efectos adversos durante 4 semanas.
d)
Potencia
Se inyectan subcutáneamente por lo menos diez cabezas de ganado bovino en el sitio recomendado,
indicado en el prospecto. Se mantienen como controles no vacunados otros tantos animales. Después de
por lo menos 2 meses, todos los animales se ponen en contacto con ganado infectado experimentalmente,
en un espacio cerrado, utilizando al menos un donante de la infección por cada tres cabezas sometidas a
prueba. El ganado se mantiene en contacto durante 3 meses. Después, se sacrifican todos los animales y
se realizan exámenes post-mortem. Los animales vacunados no deberían mostrar más que síntomas
clínicos ligeros de la enfermedad, ni presentar lesiones post-mortem de pleuroneumonía. Al menos el 80%
de los animales control deben mostrar las típicas lesiones post-mortem. Esta prueba de potencia solo se
necesita realizar una vez; los lotes siguientes no se tienen que volver a probar, siempre que se produzcan
con arreglo a un protocolo estándar (34, 35). Cualquier modificación de tal protocolo estándar, como
incrementar el número de pases in vitro, debe estar estrictamente prohibido. Otras modificaciones, como la
producción en fermentadores con ajuste continuo de pH o adición de reactivos, debe acompañarse siempre
de una prueba de potencia para asegurar que la protección inducida no se ha visto alterada.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.6. — Pleuroneumonía bovina contagiosa
e)
Duración de la inmunidad
La cepa T1/44 confiere una protección aproximada de 1 año (14), pero la lograda con la cepa T1sr puede
durar sólo 6 meses. En algunos animales se produce seroconversión (prueba FC). Los anticuerpos
desaparecen a los tres meses de la vacunación.
f)
Estabilidad
La titulación periódica de la vacuna almacenada permite calcular la caducidad. Las vacunas liofilizadas
deben conservarse a -20ºC. A esta temperatura su período de conservación es de por lo menos 1 año (24),
y la viabilidad se puede conservar por muchos años sin pérdida de titulación, lo que permite la constitución
de stocks de emergencia. Naturalmente, los títulos de estos depósitos necesitan un control regular.
g)
Conservantes
Para liofilizar se añade leche desnatada en polvo: 45 g/litro de medio de cultivo. Para la reconstitución de
una vacuna liofilizada se utiliza solución salina normal. Alternativamente, se utiliza a temperatura ambiente
una solución molar de sulfato magnésico (248 g por litro). Esta solución molar protege a los micoplasmas de
la inactivación por el calor (24). Es importante la pureza de las sales que se emplean.
h)
Precauciones (riesgos)
Los procedimientos para uso en condiciones de campo y la reconstitución de las vacunas liofilizadas se han
descrito por Provost et al. (24).
Cuando se vacunan animales infectados, pueden aparecer reacciones intensas, como las que tuvieron
lugar recientemente después de las campañas de vacunación de emergencia en el este de África. Por lo
general, estas reacciones se presentan en 2-3 días. También pueden aparecer reacciones locales en el
sitio de la inyección después de 2-3 semanas con la cepa T1/44. Estas reacciones se conocen como
"reacción de Willems" y comprenden un edema invasivo que lleva a la muerte si no se administra
tratamiento antibiótico con tetraciclina o tilosina. La cepa T1sr carece por completo de patogenicidad
residual, lo que supone una alternativa de elección a la T1/44, aunque la duración de la inmunidad es más
corta. Hubo sospechas de ineficacia de la T1sr para controlar brotes en África del sur, lo que llevó a su
suspensión (29).
La sensibilidad general de una población bovina determinada debe probarse primero vacunando grupos de
muestra (24).
5.
Pruebas sobre el producto final
Estas pruebas se deben realizar después de la reconstitución de un conjunto de al menos cinco viales de la
vacuna liofilizada con el diluyente recomendado.
a)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad deben realizarse en ganado bovino o cebúes, de acuerdo con lo expuesto en la
Sección C.4.c.
b)
Potencia
Esta prueba se realiza siguiendo el protocolo descrito en la sección C.4.d. Debido a que la PBC no se
puede reproducir experimentalmente con facilidad, y por su coste, solo se necesita realizar una prueba de
potencia en cada lote de inóculo, con tal de que el título sea satisfactorio y que no cambien los parámetros
de producción.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Pleuroneumonía bovina contagiosa (ver Cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int)
190
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPITULO 2.1.7.
DERMATOSIS NODULAR CONTAGIOSA
RESUMEN
La dermatosis nodular contagiosa de los bóvidos (DNC) (Lumpy skin, LSD), knopvelsiekte) es una
enfermedad del ganado debida a poxvirus que se caracteriza por fiebre, nódulos en la piel, en
membranas mucosas y órganos internos, extenuación, inflamación de los nódulos linfáticos,
edema cutáneo, y a veces muerte. La enfermedad tiene importancia económica porque causa un
descenso en la producción, particularmente en vacas de leche. También causa daños en la piel.
DNC es producida por cepas de capripoxvirus que son indistinguibles de las que causan la viruela
de la oveja y de la cabra. Sin embargo, DNC tiene una distribución geográfica diferente a la viruela
ovina y caprina, lo que sugiere que las cepas de capripoxvirus de bóvidos no infectan ni se
transmiten a ovejas y cabras. Se estima que la transmisión del virus productor de DNC se efectúa
predominantemente a través de insectos, y que la transmisión natural por contacto en ausencia de
insectos vectores es poco efectiva. Hasta 1988, esta enfermedad se limitaba al África sub–
sahariana, pero luego se extendió a Egipto. Sólo se ha confirmado en laboratorio un brote de DNC
fuera de África, en 1989 en Israel, que se eliminó por sacrificio de todos los animales infectados o
en contacto con ellos, y por vacunación. Los brotes descritos en 1993 en Bahrain y Reunion no
pudieron confirmarse mediante aislamiento de los virus.
Identificación del agente: La confirmación más rápida de la DNC es la demostración de los
viriones típicos de los capripoxvirus en materiales de biopsias o en las costras desecadas usando
el microscopio electrónico de transmisión en combinación con una historia clínica de la dermatosis
nodular contagiosa generalizada y de inflamación de los ganglios linfáticos superficiales en el
ganado. El capripoxvirus es distinto del parapoxvirus, que causa la estomatitis papular bovina y la
seudo–viruela bovina, pero no puede diferenciarse morfológicamente del de la viruela bovina y del
virus vacunal, que son en ambos casos ortopoxvirus que infectan a los bóvidos. Sin embargo,
ninguno de éstos producen una infección generalizada y ambos son bastante raros en los bóvidos.
El virus productor de la DNC crece en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque
el mejor crecimiento se obtiene utilizando células testiculares de cordero. El capripoxvirus produce
un efecto citopático, y cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos característicos, y difiere del virus
de la seudo–DNC (Allerton–mamitis herpética), que es un herpesvirus productor de sincitios y
cuerpos de inclusión intranucleares. El antígeno del virus se puede poner de manifiesto en cultivo
de tejidos mediante tinción con inmunoperoxidasa o inmunofluorescencia y el virus se puede
neutralizar utilizando antisueros específicos.
Para la detección del antígeno se ha desarrollado un enzimoinmunoensayo (ELISA) usando en la
detección un suero policlonal obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante del
capripoxvirus. También se ha descrito la detección del genoma usando cebadores específicos del
capripoxvirus que corresponden a los genes que codifican las proteínas responsables de la fusión
y de la unión.
Pruebas serológicas: La prueba de neutralización vírica representa la técnica serológica más
específica, pero, debido a que la inmunidad a la infección por la DNC es fundamentalmente de tipo
celular, el ensayo no es lo suficientemente sensible como para identificar animales que han tenido
contacto con el virus productor de la DNC y que han desarrollado solo bajos niveles de anticuerpo
neutralizante. Las pruebas de inmunodifusión en gel de agar y las de inmunofluorescencia indirecta
son menos específicas debido a reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. La
técnica Western blot utilizando la reacción entre el antígeno P32 del virus de la DNC con sueros
problema es sensible y específica, pero de realización difícil y costosa. El uso de este antígeno,
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
191
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
expresado por un vector adecuado, en un enzimoinmunoensayo ofrece perspectivas para constituir
una técnica serológica aceptable y estandarizada.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Todas las cepas de capripoxvirus
examinadas hasta la fecha, bien sean derivadas de ganado vacuno, ovino o caprino, comparten
antígenos inmunizantes. Se han empleado como vacunas vivas cepas atenuadas de origen bovino
y cepas derivadas de ovejas y cabras.
A. INTRODUCCIÓN
La dermatosis nodular contagiosa de los bóvidos (DNC) se detectó primero en Zambia en 1928, extendiéndose a
Botswana en 1943 (15), y luego a Sudáfrica, donde infectó a más de ocho millones de cabezas de ganado
causando importantes pérdidas económicas. En 1957 alcanzó a Kenia, asociada a un brote de viruela ovina (24).
En 1970, la DNC se extendió hacia el norte por Sudán, y en 1974 se extendió al oeste alcanzando Nigeria,
siendo descrita en Mauritania, Mali, Ghana y Liberia en 1977. Otra epizootia de DNC afectó entre 1981 y 1986 a
Tanzania, Kenia, Zimbabwe, Somalia y Camerún, con un nivel de mortalidad del 20% en el ganado infectado. Sin
embargo la verdadera dimensión de esta epizootia no está clara y probablemente afectó a un área considerable
de África central. En 1988, la DNC se estableció en Egipto, y en 1989 se describió en Israel un único brote. La
DNC debe ser considerada como una enfermedad potencialmente capaz de establecerse fuera de África. El
método principal de transmisión es mecánico por medio de artrópodos vectores (6, 9).
La gravedad de los signos clínicos de la DNC (Dermatosis nodular contagiosa), o DNC (Lumpy skin, Neethling o
knopvelsiekte), depende de la cepa de capripoxvirus y de la raza del hospedador. Bos taurus es más susceptible
a la enfermedad que Bos indicus; también se ha descrito que el búfalo asiático es susceptible. Dentro de Bos
taurus, la raza Channel Island de piel fina desarrolla una enfermedad mas grave, siendo los terneros lactantes
los que presentan mas riesgo. No obstante, incluso dentro de grupos de ganado de la misma raza mantenidos
juntos en las mismas condiciones, existe una amplia variación en cuanto a los signos clínicos presentes, que
varía desde una infección subclínica hasta la muerte (7). Puede darse el caso de imposibilidad de infección de un
grupo entero por el virus, en función de la prevalencia del vector.
En animales con infección aguda, se presenta fiebre inicial, que puede superar los 41°C y persistir durante una
semana. El período de incubación en condiciones de campo no se ha descrito, pero, después de una
inoculación, es de 6–9 días hasta la aparición de la fiebre. Aparece rinitis y conjuntivitis, y en ganado lechero se
produce una reducción notable en la producción. Se desarrollan nódulos de 2–5 cm de diámetro por todo el
cuerpo, en especial por la cabeza, cuello, ubres y periné. Estos nódulos afectan a la dermis y a la epidermis e
inicialmente pueden exudar suero, aunque en las siguientes dos semanas se convierten en tapones necróticos
que atraviesan todo el grosor de la piel. Todos los nódulos linfáticos superficiales aumentan de tamaño, los
miembros se vuelven edematosos y el animal tiende a no moverse. Los nódulos que aparecen en las
membranas mucosas de los ojos, la nariz, la boca, el recto, las ubres y los genitales se ulceran rápidamente, y
por entonces todas las secreciones contienen virus DNC. Con la aparición de los signos clínicos, las descargas
nasales y oculares se vuelven mucopurulentas y puede aparecer queratitis. También se desarrollan nódulos en la
boca, tejido subcutáneo y en el músculo, en la tráquea y tracto alimentario, sobre todo en el abomaso, y en los
pulmones, desembocando en una neumonía primaria y secundaria. Las vacas preñadas pueden abortar, y se
han descrito abortos con fetos cubiertos de nódulos. Los toros pueden quedar estériles de modo permanente o
temporal. La recuperación de la infección grave es lenta; el animal queda extenuado, puede presentar neumonía
y mamitis, y los tapones necróticos de la piel, que pueden haber sido objeto de ataque por las moscas, se
eliminan dejando profundos huecos en la piel (21).
El virus de la DNC no se transmite a humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
•
Recogida de muestras, envío y preparación
El material para aislamiento del virus y detección del antígeno debe recogerse de los nódulos de la piel, lesiones
pulmonares o nódulos linfáticos mediante biopsia o post–mortem. Las muestras para aislamiento de virus y la
detección de antígeno por enzimoinmunoensayo (ELISA) se deberían recoger en la primera semana de aparición
de los síntomas clínicos, antes de que se desarrollen anticuerpos neutralizantes (12). Las muestras para
detección genómica por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden obtenerse cuando los anticuerpos
neutralizantes ya estan presentes. No obstante, la presencia de virus se puede evidenciar hasta transcurridos 35
días en lesiones antiguas. También se puede usar para aislar el virus la capa pardusca que aparece en la sangre
192
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
mantenida en heparina o EDTA (ácido etilén diamino tretraacético) durante la fase virémica del DNC (antes de la
generalización de las lesiones o dentro de los 4 días de la generalización). Las muestras para histología deben
incluir tejido del área adyacente y han de ser colocadas inmediatamente después su recogida en formalina al
10% en un volumen 10 veces superior al volumen de la muestra.
Los tejidos con formalina no necesitan requisitos especiales de transporte. Las muestras de sangre con
anticoagulante para el aislamiento de virus a partir de la capa pardusca deben colocarse inmediatamente en
hielo y procesarse tan pronto como sea posible. En la práctica, las muestras pueden mantenerse a 4°C hasta 2
días antes de su posterior manipulación, pero no deberían congelarse ni mantenerse a temperatura ambiente.
Los tejidos para aislamiento de virus y detección de antígeno deben mantenerse a 4°C, en hielo o a –20°C. Si
resulta necesario transportar las muestras a grandes distancias sin refrigeración, el medio debe contener glicerol
al 10%; las muestras deben de ser de un tamaño suficiente para que el medio no penetre durante el transporte la
parte central de la biopsia, que debería usarse para el aislamiento de virus.
El material para histología debe prepararse por técnicas estándar y teñirse con hematoxilina y eosina (H&E) (2).
El material de las lesiones para aislamiento de virus y detección de antígeno se trocea usando tijeras y pinzas
estériles y luego se pulveriza a mano en un mortero estéril con arena estéril y un volumen igual de tampón
fosfato salino (PBS) también estéril que contiene penicilina sódica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato
de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ml) o fungizona (2.5 µg/ml) y neomicina (200 UI/ml). La
suspensión se congela y descongela tres veces y luego se clarifica parcialmente mediante centrifugación usando
una centrífuga de mesa a 600 g durante 10 minutos. Las capas de color pardusco se preparan a partir de sangre
no coagulada por centrifugación a 600 g durante 15 minutos, y la capa se extrae con cuidado usando una pipeta
Pasteur estéril y se lleva a 5 ml de agua fría doblemente destilada. Después 30 segundos se añaden 5 ml de
medio de crecimiento frío a doble concentración y se mezcla. La mezcla se centrifuga a 600 g durante 15
minutos, se elimina el sobrenadante y el precipitado sedimento celular se suspende en 5 ml de medio de
crecimiento, como medio Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después centrifugar a 600 g otros 15 minutos,
el precipitado sedimento resultante se resuspende en 5 ml de CMEM fresco. Alternativamente, la capa pardusca
se puede separar de una muestra con heparina utilizando un gradiente de Ficoll.
a)
Cultivo
El virus de la DNC crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino o caprino, aunque se considera
que los cultivos primarios y secundarios de células de testículo de cordero (LT) son las más adecuadas,
especialmente las procedentes de la raza ovina de lana. La muestra se prepara como antes, es decir, 1 ml
de sobrenadante clarificado o de la capa pardusca se inocula en un frasco de cultivo de 25 cm2 a 37°C y se
permite la absorción durante 1 hora. El cultivo se lava luego con PBS caliente y se recubre con 10 ml de un
medio adecuado, como GMEM, que contenga antibióticos y 2% de suero fetal bovino. Si se dispone de
ellos, también se infectan tubos de cultivo de tejidos que contengan células LT y un cubreobjetos, o
portaobjetos para cultivo de tejidos.
Los frascos de cultivo se examinan diariamente durante 14 días para observar el efecto citopático (ECP) y
se reemplaza el medio cuando aparece turbio. Las células infectadas desarrollan un ECP característico que
consiste en la retracción de la membrana celular de las células adyacentes, y en un eventual
redondeamiento de las células y la marginación de la cromatina nuclear. Al principio sólo se ven pequeñas
áreas de ECP, a veces tan sólo a los 2 días después de la infección; en los siguientes 4–6 días las áreas se
extienden hasta abarcar toda la lámina de células. Si no aparece ECP después 14 días, el cultivo se debe
congelar y descongelar tres veces, y el sobrenadante clarificado se inocula en un cultivo fresco de células
LT. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes si se usan cubres infectados, se toma un cubre, se fija
con acetona y se tiñe con H&E. La presencia de cuerpos de inclusión citoplasmáticos que sean
eosinofílicos, variables en tamaño pero que pueden ser como la mitad del núcleo y rodeados por un halo
claro, constituye un diagnóstico de infección por poxvirus. El ECP se puede evitar o retrasar incluyendo en
el medio un antisuero específico anti–DNC. El herpesvirus o el virus seudo–DNC producen un cuerpo de
inclusión intranuclear de tipo Cowdry A. La formación de sincitios no es una característica de la infección
por capripoxvirus, a diferencia del herpesvirus que causa la seudo–DNC.
Algunas cepas de capripoxvirus que causan DNC se han adaptado para crecer en la membrana
corioalantoidea de huevos de gallina embrionados y en células de riñón de mono verde africano (células
Vero). Esto no es recomendable para el aislamiento primario.
•
Microscopía electrónica
Antes de la centrifugación, el material de la suspensión de la biopsia original se prepara para su examen en
el microscopio electrónico de transmisión colocando una rejilla hexagonal de malla 400 para microscopía
electrónica, cubierta con una película de carbón activado por descarga en vapor de pentilamida, sobre una
gota de la suspensión colocada sobre parafina o una placa de cera. Después de 1 minuto, la rejilla se
transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante 20 segundos y luego a una gota de ácido
fosfotúngstico al 1%, pH 7.2, durante 10 segundos. La rejilla se deseca con papel de filtro, se seca al aire y
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
193
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
se coloca en el microscopio electrónico. El virión del capripoxvirus tiene forma de ladrillo, está cubierto por
cortos elementos tubulares y mide aproximadamente 290 x 270 nm. Una membrana que procede de la
célula hospedadora puede rodear algunos de los viriones, y se deben examinar tantos como sea posible
para confirmar su aparición (19).
Los viriones de los capripoxvirus no se diferencian de los de los ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal
y del virus de la viruela, que no son comunes en el ganado y no causan infección generalizada, ningún otro
ortopoxvirus causa lesiones en el ganado vacuno. No obstante, el virus vacunal puede causar infección
generalizada en terneros jóvenes inmunocomprometidos. Por el contrario, los ortopoxvirus son una causa
corriente de enfermedades cutáneas en el búfalo doméstico originando la viruela del búfalo, una
enfermedad que normalmente se manifiesta con lesiones de varioliformes en los pezones, pero que
también puede causar lesiones cutáneas en otros sitios, como el periné, la zona media de los muslos y la
cabeza. Los ortopoxvirus que causan la viruela del búfalo no pueden distinguirse fácilmente por
microscopía electrónica de los capripoxvirus. Los viriones de los parapoxvirus que producen la estomatitis
papular bovina y la seudoviruela son mas pequeños, de tamaño oval y cada uno está cubierto por un único
elemento tubular continuo que aparenta formar estriaciones sobre el virión. El capripoxvirus es también
distinto del herpevirus que provoca la seudo–DNC (Allerton– mamitis herpética).
b)
Métodos inmunológicos
•
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
El antígeno del capripoxvirus puede también identificarse en los cubres infectados o en los portas de cultivo
de tejidos usando pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubres o los portas deben estar lavados y
secos y fijados en acetona fría durante 10 minutos. El método indirecto, en el que se utilizan sueros de
ganado inmune, presenta mucho color de fondo y reacciones no específicas. Sin embargo, se puede
preparar un conjugado directo a partir de sueros de ganado vacuno enfermo (o de ovejas o cabras
enfermas por el capripoxvirus) o a partir de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Se debe
incluir un cultivo de tejidos no infectado como control negativo ya que pueden causar problemas las
reacciones cruzadas, debidas a la presencia de anticuerpos contra el cultivo celular.
•
Inmunodifusión en gel de agar
Se ha usado una prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) para detectar el antígeno precipitante del
capripoxvirus, pero tiene la desventaja de que este antígeno también lo presentan los parapoxvirus. Se
prepara agarosa (al 1%) en tampón borato, pH 8,6, se calienta para disolver, y se vierten 2 ml en un porta
(76 x 26 mm). Cuando el agar se solidifica, se cortan pocillos sobre él para originar una roseta de seis
pocillos alrededor de un pocillo central. Cada pocillo tiene 5 mm de diámetro y debe haber una distancia de
7 mm entre el centro del pocillo central y el centro de cada pocillo periférico. Los pocillos se llenan del
siguiente modo: a tres pocillos periféricos se añaden 10 µl de la suspensión al 10% a partir de las lesiones,
alternando con pocillos que contengan controles positivos de antígeno, mientras que al pocillo central se
añaden 10 µl de suero control positivo contra capropoxvirus. Los portas se colocan en una cámara húmeda
a temperatura ambiente durante 48 horas , y se examinan para ver líneas de precipitación con un
transiluminador. El material ensayado es positivo si aparece una línea de precipitación con el suero control
que resulta confluente con la producida por el control positivo de antígeno.
Para preparar el antígeno para la prueba IGDA, se toman dos frascos de cultivo de 125 cm2 con células LT,
se infecta uno con el capripoxvirus y se recoge cuando presenta un 90% de ECP (8–12 días). El frasco se
congela y descongela dos veces, y las células se agitan para que se liberen de la superficie del frasco. El
contenido se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, la mayor parte del sobrenadante se decanta y se
guarda, y el precipitado se resuspende en el resto de sobrenadante. Las células se lisan usando un
dispositivo de ultrasonicación durante aproximadamente 60 segundos. Este homogenado se centrifuga
luego como antes, y el sobrenadante resultante se mezcla con el anteriormente obtenido. El sobrenadante
conjunto se añade a continuación a un volumen idéntico de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a
4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y se recoge el precipitado
resuspendiéndolo en un pequeño volumen de solución salina al 0.8% para su uso en la prueba IGDA. El
frasco no infectado se somete al mismo procedimiento para obtener un control de antígeno del cultivo de
tejidos (18).
•
Enzimoinmunoensayo
Después la clonación de la proteína estructural P32 del capripoxvirus que es muy antigénica, es posible
usar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos diagnósticos, incluyendo la
obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos monoclonales
(Mabs). Estos reactivos han facilitado el desarrollo de un ELISA altamente específico. Utilizando antisuero
de conejo hiperinmune, obtenido mediante inoculación a conejos de capripoxvirus purificado, el antígeno
del virus presente en suspensiones de biopsias o en sobrenadantes de cultivo de tejidos puede ser
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
inmovilizado en una placa de ELISA. La presencia del antígeno puede así demostrarse utilizando suero de
cobaya, producido contra el grupo específico de la proteína estructural P32, inmunoglobulina anti–cobaya
comercial obtenida en conejo conjugada con peroxidasa de rábano y una solución de substrato
cromogénico.
c)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Mediante técnicas serológicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus de ganado vacuno,
ovejas o cabras. Sin embargo, se pueden caracterizar las cepas comparando los fragmentos genómicos
que se generan mediante digestión con el enzima HindIII a partir de sus ADN purificados (1,3,17). Esta
técnica ha establecido diferencias entre aislamientos realizados en diferentes especies, pero no son sólidas
y existe evidencia de la existencia de movimiento de cepas entre especies distintas y de recombinación de
cepas en condiciones naturales (14).
Se puede utilizar PCR para detectar el genoma del capripoxvirus en muestras de biopsias o de cultivo de
tejidos. Los cebadores para los genes correspondientes a las proteínas víricas de unión y de fusión son
específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos obtenidos por PCR se puede confirmar
usando los sitios reconocidos por enzimas de restricción (16). El genoma del virus productor de la DNC
contiene unos 156 genes (23).
2.
Pruebas serológicas
a)
Neutralización de virus
Un suero problema se puede titular frente a una concentración constante de capripoxvirus (100 DICT50
[50% dosis infectiva en cultivo de tejidos]) o bien una cepa estándar de virus se puede titular frente a una
dilución constante del suero problema para calcular el índice de neutralización. Debido a variaciones en la
sensibilidad del cultivo de tejidos a los capripoxvirus, y la consiguiente dificultad en asegurar el uso de 100
DICT50 , el método preferido es el índice de neutralización. El método se describe usando una placa de
microtitulación para cultivo de tejidos con 96 pocillos de fondo plano, pero puede realizarse igualmente en
tubos de cultivo de tejidos con los cambios de volumen adecuados, aunque resulta más difícil determinar en
tubos los resultados de punto final. Se ha descrito que el uso de células Vero en el ensayo de neutralización
del virus suministra resultados más repetitivos.
•
Procedimiento del ensayo
i)
Los sueros problema, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen al 1/5 con medio
Eagle/HEPES (N–2–hidroxietilpiperazina, ácido N–2–etanosulfónico) y se inactivan a 56°C durante 30
minutos.
ii)
A continuación, se añaden 50 µl del primer suero inactivado a los pocillos de las columnas 1 y 2 , de
las filas A hasta la H, en la placa de microtitulación. El segundo suero se coloca en las columnas 3 y 4,
el tercero en las columnas 5 y 6, el control de suero positivo en las columnas 7 y 8, el control de suero
negativo en las columnas 9 y 10, y se añaden 50 µl de Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y
12 y a todos los pocillos de la fila H.
iii)
Una cepa de referencia de capripoxvirus, normalmente una cepa vacunal que se sepa que crece bien
en cultivo de tejidos, y con un título superior a 6 log10 DICT50 por ml se diluye con Eagle/HEPES en
pequeños recipientes para dar una dilución seriada de 5.0; 4.0; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.5 log10 DICT50 por
ml (equivalente a 3.7; 2.7; 2.2; 1.7; 1.2; 0.7; 0.2 log10 DICT50 por 50 µl).
iv)
Comenzando por la fila G y la preparación de virus más diluida, se añaden 50 µl de virus a cada
pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilución de virus, colocando la dilución de virus de titulación
mayor en la fila A.
v)
Las placas se cubren y se incuban 1 hora a 37°C.
vi)
A partir de monocapas crecidas con anterioridad se preparan células LT en una suspensión que
contenga 105 células/ml en medio Eagle con antibióticos y 2% de suero fetal bovino. Después incubar
las placas de microtitulación, se añaden 100 µl de la suspensión celular a todos los pocillos excepto a
los pocillos H11 y H12, que sirven como control para el medio. El resto de los pocillos de la fila H son
los controles de las células y del suero.
vii)
Las placas de microtitulación se cubren e incuban a 37°C por 9 días.
viii) Utilizando un microscopio invertido, las monocapas se examinan diariamente a partir del día 4 para
observar ECP. No debería apreciarse ECP en las células de la fila H. Utilizando la cepa vacunal 0240
KSGP de capripoxvirus, la lectura final se hace al día 9, y el título del virus en cada titulación por
duplicado se calcula según Kärber (1931). Si se deja más tiempo, aparece de modo invariable un
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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
aumento de virus debido a que el virus que fue en principio neutralizado parece disociarse del
anticuerpo.
ix)
Interpretación de los resultados: El índice de neutralización es el logaritmo del título de la diferencia
entre el título del virus en el suero negativo y en el suero problema. Un índice > 1.5 se considera
positivo. El ensayo se puede hacer más sensible si se examina el suero del mismo animal antes y
después de la infección. Debido a que la inmunidad a los capropoxvirus está predominantemente
mediada por células, un resultado negativo, en especial después una vacunación en que la respuesta
es necesariamente suave, no implica que el animal del que deriva el suero no está protegido.
Se ha descrito un método con virus–constante y suero–variable empleando diluciones de suero del
orden de 1/5 a 1/500 y células de músculo fetal bovino. Como estas células tienen menor sensibilidad
al capripoxvirus que las células LT, se evita el problema del aumento de virus cuando el ensayo se
deja más tiempo.
Los anticuerpos al capripoxvirus se pueden detectar a los dos días de la aparición de los síntomas
clínicos. Permanecen detectables durante unos 7 meses, pero normalmente se aprecia el título más
alto entre los días 21 y 42.
b)
Inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA no es recomendable como prueba serológica en el diagnóstico de la DNC por la reacción
cruzada con anticuerpos contra los virus de la estomatitis papular bovina y de la seudoviruela. Una
consecuencia de estas reacciones cruzadas es la aparición de resultados positivos falsos. La escasa
sensibilidad de la prueba también puede conducir a resultados negativos falsos.
c)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Para la prueba de inmunofluorescencia indirecta se puede usar un cultivo de tejidos infectado por
capripoxvirus crecido sobre cubres o sobre portas de los usados en microscopía. Se debe incluir en la
prueba un cultivo de tejidos no infectado, así como un control de suero positivo y negativo. Los cultivos
infectados y el control se fijan en acetona a –20°C durante 10 minutos y se mantienen a 4°C. Las diluciones
del suero problema se realizan en PBS, empezando a 1/20 o 1/40, y los positivos se identifican usando una
gamma–globulina anti–bovina conjugada con isotiocianato de fluoresceína. El título de anticuerpos puede
superar 1/1000 después la infección. Los sueros pueden ser probados a 1/50 y 1/500. Pueden existir
reacciones cruzadas con el virus orf (dermatitis pustular contagiosa de la oveja), el de la estomatitis papular
bovina y quizás con otros poxvirus.
d)
Análisis Western blot
La técnica de Western blot realizada con sueros problema frente a lisados de células infectadas por
capripoxvirus representa un sistema sensible y específico para detectar anticuerpos contra las proteínas
estructurales del capripoxvirus, aunque la prueba resulta costosa y difícil de realizar.
Las células LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se aprecia un 90% de ECP, se
congelan y descongelan tres veces, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación. El
sobrenadante se decanta, y las proteínas se preparan para separación por SDS/PAGE (dodecil sulfato
sódico/electroforesis en gel de poliacrilamida). Se recomienda un sistema vertical de gel discontinuo,
usando gel concentrador con acrilamida al 5% en Tris (125 mM), pH 6,8 y SDS (0,1%), y gel de resolución
con acrilamida (10–12.5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), empleando como tampón de desarrollo
un tampón de glicina conteniendo Tris (250 mM), glicina (2M), y SDS (0.1 M). Las muestras de
sobrenadante se preparan por ebullición durante 5 minutos con un tampón de lisis apropiado antes de su
carga en la electroforesis. Alternativamente, el antígeno derivado del cultivo de tejidos puede ser
reemplazado por virus purificados o por antígenos recombinantes.
Se deben correr en paralelo con las proteínas de la muestra una serie de marcadores de peso molecular.
Las proteínas separadas en el gel después la SDS/PAGE se transfieren electroforéticamente a una
membrana de nitrocelulosa (NCM). Después de la transferencia, la NCM se lava exhaustivamente con PBS
y se bloquea con 3% de seroalbúmina bovina (BSA) en PBS, o con 5% de leche en polvo desnatada en
PBS, en un agitador rotatorio a 4°C durante toda la noche. A continuación, la NCM se puede trocear
empleando un aparato comercial para permitir el ensayo simultáneo de múltiples muestras de suero, o se
puede cortar en tiras y cada una de ellas incubarse luego por separado. La NMC se lava cuidadosamente
con cinco cambios de PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio y luego se incuba a temperatura
ambiente durante 1,5 horas en un agitador con el suero apropiado a una dilución 1/50 en tampón
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
bloqueante (3% BSA y 0.05% de Tween 20 en PBS; o 5% de leche en polvo desnatada y 0,05% de Tween
20 en PBS). La membrana se lava de nuevo exhaustivamente y se incuba (en tampón bloqueante) con
anti–inmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rábano a una dilución determinada por
la titulación. Después una incubación posterior a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se lava la
membrana y se añade una solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (10 mg en 50 ml de 50mM
Tris-HCl, pH 7,5, y 20 µl de peróxido de hidrógeno al 30% [v/v]). Esto se incuba luego durante
aproximadamente 3–7 minutos a temperatura ambiente en un agitador con observación constante, y la
reacción se detiene lavando con PBS antes de que se desarrolle un excesivo color de fondo. En cada
ocasión se debería usar un suero negativo y positivo como control.
Las muestras que se consideran positivas en el ensayo y el control positivo producirán un modelo de
bandas que corresponde a la reacción frente a proteínas de peso molecular 67, 32, 26, 19 y 17 kDa –que
son las principales proteínas estructurales del capripoxvirus– mientras que las muestras de suero negativo
no reaccionarán conforme a este modelo. Un suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (estomatitis
papular bovina, seudoviruela) reaccionará con algunas de las proteínas de capripoxvirus, pero no con la
proteína de 32 kDa que es específica de capripoxvirus.
e)
Enzimoinmunoensayo
Se ha desarrollado una técnica ELISA para capripoxvirus usando la proteína estructural expresada P32 del
capripoxvirus y Mabs obtenidos contra la proteína P32 (8).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se han usado dos cepas atenuadas de capripoxvirus como vacunas para el control específico de la DNC (3, 4):
una cepa de poxvirus de oveja y cabra de Kenia mantenida en cultivo durante 18 pases en células LT o células
de músculo fetal bovino, y una cepa de Sudáfrica, después 60 pases de cultivo en células de riñón de cordero y
20 pases en membrana corioalantoidea de huevos embrionados de gallina. Todas las cepas de capripoxvirus
examinadas hasta la fecha, bien sean de origen bovino, ovino o caprino, comparten un sitio común de
neutralización, de modo que los animales que se recuperan de la infección por una cepa se hacen resistentes a
la infección por cualquier otra cepa. Por ello, es posible proteger al ganado contra la DNC utilizando cepas de
capripoxvirus procedentes de ovejas o cabras (10). En 1989 y 1990 la cepa Rumana de la vacuna de la viruela
ovina se empleó para ayudar a controlar el brote de la DNC en Egipto (20). Sin embargo, resulta esencial realizar
ensayos controlados antes de introducir una cepa vacunal no utilizada normalmente en el ganado, sobre todo
cuando se usan las razas más susceptibles en el período de lactancia. La protección después la vacunación es
probablemente duradera, pero a medida que la inmunidad desaparece, puede ocurrir una replicación localizada
de capripoxvirus en el lugar de inoculación, aunque el virus no llegará a tener una extensión generalizada. Las
dos cepas de capripoxvirus que se han utilizado rutinariamente como vacunas pueden producir una fuerte
reacción local en el sitio de inoculación en razas de Bos taurus, que algunos propietarios consideran inaceptable.
Esto ha desalentado el uso de vacunas pese a que las consecuencias de un brote de la DNC son con seguridad
mas graves.
Se está desarrollando una nueva generación de vacunas que emplea el genoma de los capripoxvirus como un
vector para genes de otros patógenos de rumiantes, por ejemplo genes de los virus de la peste bovina y de la
peste de pequeños rumiantes. La vacuna recombinante proporcionará protección contra la DNC y contra la peste
bovina mediante una única vacunación (22).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
La cepa de capripoxvirus usada en la producción de vacunas debe estar acompañada de una historia que
recoja su origen y sus pases en cultivo de tejidos o en animales. Debe ser segura en cuanto a su uso en
todas las razas de ganado en las que se pretende emplearla, incluyendo animales gestantes. También
debe ser no transmisible, permanecer atenuada después posteriores pases en cultivo de tejidos, y
proporcionar una protección completa frente al desafío de cepas virulentas naturales durante un mínimo de
1 año. Se debe preparar y almacenar una cantidad de inóculo original del virus vacunal para disponer de
inóculos de trabajo repetitivos para la producción regular de la vacuna.
b)
Método de cultivo
El inóculo de vacuna debe ser liofilizado y guardado en viales de 2 ml a –20°C. Se puede guardar en estado
húmedo a –20°C, pero entonces es más estable a –70°C o a temperatura inferior. Para un rendimiento
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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
óptimo, el virus debería ser cultivado en cultivos primarios o secundarios de células LT procedentes de
oveja de lana. También pueden emplearse células Vero.
c)
Validación como vacuna
Los lotes de inóculo deben ser:
i)
Puros: Libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tal como los virus de la enfermedad de la
frontera y de la diarrea vírica bovina, y libres de contaminación por bacterias, hongos y/o
micoplasmas.
ii)
Seguros: Producir una reacción clínica mínima en todas las razas de ganado cuando se administran
por la vía recomendada.
iii)
Eficaces: Estimuladores de inmunidad completa frente a la DNC en todas las razas de ganado durante
al menos 1 año.
Las pruebas necesarias se describen en la Sección C.4.
2.
Método de producción
Los lotes de vacuna se producen en monocapas frescas de cultivos secundarios de células LT. Se reconstituye
un vial de inóculo con GMEM y se inocula sobre una monocapa de células LT que previamente se ha lavado con
PBS templado, y se permite la absorción durante 15 minutos a 37°C antes de añadir más GMEM. Después 4–
6 días, se apreciará un ECP generalizado (50–70%). El cultivo se congela y descongela tres veces, y se extrae la
suspensión centrifugándola a 600 g durante 20 minutos. Antes de la recogida, se debe examinar el cultivo para
detectar cualquier evidencia de ECP no específica, turbidez del medio o cambio en el pH del medio. Se puede
necesitar un segundo pase para producir el virus suficiente para formar un lote productivo (para obtener
106 dosis se necesita la producción de 5 frascos de cultivo de 175 cm2).
El proceso se repite y las cosechas de frascos numerados individualmente se mezclan cada una por separado
con un volumen igual de 5% de hidrolizado de lactoalbúmina estéril y 10% de sacarosa, y se transfieren a
botellas con numeración individual para almacenamiento a –20°C. Antes de la conservación, se retiran 0,2 ml de
cada botella para control de esterilidad. Se extraen otros 0,2 ml adicionales; se obtiene una mezcla de 2 ml para
uso en titulación de virus, a partir de muestras de 0,2 ml tomadas de 10 botellas. Se debe llevar un registro
escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas.
3.
Control interno
Células: Las células deben proceder de los testículos de corderos jóvenes sanos de una manada de ovejas de
lana que esté exenta de priones (scrapie). Normalmente se suelen subcultivar con éxito hasta diez veces.
Cuando se usan para producción de vacunas, se deben crecer en paralelo cultivos control no infectados que se
mantienen durante al menos un pase adicional para observación posterior. Deben ser analizados para descartar
la presencia de cepas no citopáticas de virus de la diarrea vírica bovina o de la enfermedad de la frontera
mediante técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se deben preparar y analizar
las células antes de la producción de vacunas, y mantener un stock estéril en DMSO (dimetil sulfóxido)
conservado en nitrógeno líquido (alícuotas de 1–2 ml conteniendo 20 x 106 células /ml). El suero empleado en el
medio de crecimiento debe carecer de anticuerpos frente a capripoxvirus y de contaminación con pestivirus.
Virus: El inóculo de virus y la vacuna final deben valorarse en tubos de cultivo de tejidos o placas de
microtitulación. La dosis de campo mínima recomendada de las vacunas de Kenia y de Sudáfrica es
3,5 log10DICT50, aunque la dosis protectora mínima es 2,0 log10 DICT50. El capripoxvirus es muy susceptible a la
inactivación por la luz solar, y se deben tomar medidas para evitar la pérdida de actividad en condiciones de
campo. La dosis de campo recomendada en bóvidos para la vacuna Rumana de viruela ovina es 2,5 log10dosis
infectivas en la oveja (SID50), y la dosis recomendada para bóvidos de la cepa adaptada RM65 de la vacuna
Rumana de la viruela ovina es 3 log10DICT50 (11).
Se deben examinar muestras de vacunas para descartar la presencia de virus no deseados incluyendo cepas
citopáticas y no citopáticas de pestivirus, y se deberían mezclar con un suero inmune de alto título frente a
capripoxvirus que se haya visto antes que sea negativo para anticuerpos frente a pestivirus, a fin de evitar que el
virus mismo de la vacuna interfiera en la prueba. La vacuna puede mantenerse a –20°C hasta que se completen
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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
todas las pruebas de esterilidad y de titulación, y después debe ser liofilizada. Se realiza una titulación posterior
en cinco viales de las preparaciones liofilizadas escogidas al azar para confirmar el nivel de virus.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación con otros materiales biológicos pueden
encontrarse en el Capítulo I.1.5.
b)
Seguridad y eficacia
Seis cabezas de ganado de sensibilidad a la DNC conocida se confinan en una unidad animal amplia de
alto nivel de contención y se recogen muestras de suero. Cinco viales escogidos al azar de la vacuna
liofilizada se reconstituyen con PBS estéril y se mezclan. Dos cabezas se inoculan con 100 veces la dosis
de campo de la vacuna, el resto de la vacuna se diluye con PBS estéril y se inoculan subcutáneamente dos
cabezas de ganado con la dosis de campo recomendada. Las restantes dos cabezas son los animales
control. Los animales se examinan clínicamente todos los días y se anotan sus temperaturas rectales. El
día 21 después la inoculación se toman de nuevo muestras de suero y se infectan mediante inoculación
intradérmica con una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clínica durante los
siguientes 14 días. Los animales control deberían desarrollar los síntomas clínicos típicos de la DNC,
mientras que no debería haber reacción sistémica o local en los vacunados, excepto una reacción de
hipersensibilidad tardía, que debe desaparecer a los 4 días. Se toman de nuevo muestras de suero a los
30 días de la vacunación. Las muestras de suero del día 21 se analizan para detectar seroconversión
respecto a enfermedades víricas seleccionadas que pudieran haber contaminado la vacuna, y las muestras
de los días 0 y 30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos frente a pestivirus. Debido a la
variable respuesta del ganado a la infección por la DNC, puede no observarse una enfermedad
generalizada en los animales control, aunque debería presentarse una amplia reacción local.
La vacuna totalmente reconstituída también se prueba en ratones y cobayas. Dos cobayas se inoculan
intramuscularmente con 0,5 ml en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones se inoculan
intraperitonealmente con 0,5 ml y 0,1 ml, respectivamente. Otros dos cobayas y cuatro ratones se
mantienen como controles no inoculados. Los animales se observan durante tres meses, se sacrifican y se
realiza un examen. No debería haber evidencia de patología debida a la vacuna.
c)
Pruebas de potencia
Las pruebas de potencia en el ganado deben realizarse para cepas vacunales de capripoxvirus si no se
conoce la dosis mínima inmunizante. Esto se lleva a cabo normalmente comparando el título de un virus de
prueba en el costado de animales vacunados y de animales control. Después de la vacunación, los flancos
de al menos tres animales y tres controles se afeitan para eliminar el pelo. Se preparan diluciones
logarítmicas decimales del virus prueba en PBS estéril y se inoculan intradérmicamente seis diluciones (0,1
ml por inóculo) a lo largo de la longitud del costado; cuatro réplicas de cada dilución se inoculan más abajo
del costado. Se desarrollará un hinchamiento edematoso posiblemente en todos los 24 puntos de
inoculación en los animales control, aunque habrá poca o nula reacción en los cuatro sitios de los inóculos
más diluídos. Los animales vacunados deben desarrollar una reacción inicial de hipersensibilidad en los
sitios de inoculación a las 24 horas, que remiten con prontitud. Pueden aparecer pequeñas áreas de
necrosis en el sitio de inoculación del virus de prueba más concentrado. Se calcula el título del virus prueba
para animales vacunados y animales control; una diferencia > 2.5 log10 en el título logarítmico se considera
como evidencia de protección.
d)
Duración de la inmunidad
Después la vacunación, la inmunidad frente al virus natural virulento dura dos años con la cepa de Kenia y
tres años con la vacuna de Sudáfrica, y la protección contra una infección generalizada después de
inoculación intradérmica es eficaz para toda la vida. La duración de la inmunidad producida por otras cepas
vacunales debe ser establecida en bóvidos realizando ensayos controlados en un medio en el que no haya
posibilidad de que las cepas naturales de capripoxvirus de campo interfieran los resultados.
e)
Estabilidad
Las preparaciones de vacuna la DNC adecuadamente liofilizadas, particularmente aquellas que contienen
un agente protector, como sacarosa e hidrolizado de lactoalbúmina, son estables durante más de 25 años
si se guardan a –20°C, y durante 2–4 años si se almacenan a 4°C. Hay evidencias de que pueden
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Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
permanecer estables a temperaturas más elevadas, pero no se han descrito experimentos controlados de
larga duración.
f)
Conservantes
Las preparaciones liofilizadas no requieren mas que un conservante, como sacarosa o hidrolizado de
lactoalbúmina.
g)
Precauciones (riesgos)
No existen más precauciones que las descritas anteriormente para esterilidad y ausencia de agentes no
deseados. Las cepas de la DNC no constituyen un riesgo para la salud humana.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Se debe realizar pruebas de inocuidad en el producto final de cada lote como se indica en la Sección C.4.b.
b)
Potencia
Una vez que se ha determinado la potencia de la cepa particular usada para la producción de vacuna en
cuanto a la dosis mínima requerida para producir inmunidad, no es necesario repetir esto en el producto
final de cada lote, con tal que se haya determinado el título del virus presente.
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200
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.7. — Dermatosis nodular contagiosa
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23. TULMAN E.R., AFONSO C.L., LU Z., ZSAK L. KUTISH G.F. & ROCK D.L. (2001). Genome of Lumpy Skin Disease
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Dermatosis nodular contagiosa (ver Cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
201
CAPITULO 2.1.8.
FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT
RESUMEN
La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoonosis aguda o hiperaguda de rumiantes domésticos de
África. Está causada por un único serotipo de un bunyavirus del género Phlebovirus que es
transmitido por mosquitos. La enfermedad se presenta en condiciones climáticas que favorecen la
reproducción de los mosquitos vectores y se caracteriza por lesiones hepáticas. La enfermedad es
más grave en ovejas, cabras y ganado bovino, en los que origina abortos en animales gestantes y
una alta tasa de mortalidad en los recién nacidos. Los animales adultos no gestantes, aunque son
susceptibles a la infección, son más resistentes a las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
Existe una amplia variación en la susceptibilidad al FVR entre animales de distinto genotipo.
Aquellas razas o cepas que son exóticas en África o que proceden de áreas donde la FVR no es
endémica, tienden a ser más susceptibles. Los camellos sufren una infección asintomática por
FVR, pero las tasas de aborto pueden ser tan altas como en el ganado bovino.
Los humanos resultan sensibles a la infección mediante contacto con material infectado o por
picaduras de mosquito. La infección humana por vectores es una característica llamativa en países
con una población relativamente pequeña de animales hospedadores. En tales áreas, la FVR
puede manifestarse primero en humanos. Ha causado enfermedad grave en personal de
laboratorio y debe ser manejado con un alto nivel de bioseguridad (13,15). Se recomienda que el
personal de laboratorio esté vacunado.
Identificación del agente: el virus FVR representa un único serotipo de un bunyavirus del género
Phlebovirus y tiene las propiedades morfológicas y fisicoquímicas típicas de los bunyavirus. El
virus tiene un genoma segmentado con ARN de una sola cadena y polaridad negativa y consta de
tres segmentos: L (grande), M (medio) y S (pequeño), cada uno de los cuales está contenido en
una nucleocápsida separada dentro del virión. El segmento S es un ARN de doble sentido, es
decir, presenta codificación bidireccional (9).
El virus se puede aislar de la sangre, recogida preferentemente con anticoagulante, durante la fase
febril de la enfermedad, o del hígado, bazo y tejidos cerebrales de animales muertos o de los
órganos de fetos abortados. Los aislamientos primarios se hacen normalmente en cultivos
celulares de varios tipos, tales como células de riñón de mono verde africano (células Vero),
células de riñón de hámster neonato, retículo de embrión de pollo (CER: células desarrolladas por
Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Science, Tokio, Japón) o en células
primarias de origen ovino o bovino. Alternativamente, para el aislamiento primario del virus se
pueden usar hámsteres, ratones adultos o lactantes, huevos de gallina embrionados o corderos de
dos días de edad.
Se puede efectuar un diagnóstico rápido usando como antígeno el sobrenadante de muestras
homogenizadas en pruebas de neutralización vírica (NV); por tinción inmunofluorescente de frotis
de hígado, bazo, cerebro o cultivos celulares infectados; o por demostración del virus en el suero
tomado durante la fase febril de la enfermedad mediante enzimoinmunoensayo o por
inmunodifusión.
La presencia de lesiones histopatológicas características en el hígado sirve de ayuda al
diagnóstico.
Pruebas serológicas: Los animales infectados desarrollan anticuerpos específicos que pueden
ser demostrados por NV a los 3 días después de la infección o por enzimoinmunoensayo a los 67 días, y por inhibición de la hemaglutinación. Otras pruebas serológicas menos usadas incluyen
inmunofluorescencia, fijación de complemento e inmunodifusión.
202
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas con virus vivos y los
antígenos para uso en países donde FVR es endémica o en otros durante brotes epidémicos,
deben prepararse a partir de cepas no patógenas de virus FVR crecidas en cultivos celulares de
ratón o atenuadas por mutación. La cepa de FVR atenuada por mutación no se encuentra todavía
en fase recomendable para su uso.
En países que están libres del virus FVR, las vacunas y las pruebas diagnósticas deben limitarse a
aquellas en las que se emplea virus inactivado. Se pueden obtener cepas adecuadas de virus en el
Laboratorio de Referencia para FVR de OIE (véase Cuadro presentada en la Parte 3 de este
Manual).
A. INTRODUCCIÓN
La Fiebre del Valle del Rift (FVR) es una enfermedad febril zoonósica aguda o hiperaguda, transmitida por
mosquitos, y causada por un virus de la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus. Normalmente se presenta en
forma epizoótica en extensas áreas de un país después de fuertes lluvias e inundaciones, y se caracteriza por
altas tasas de abortos y mortalidad neonatal, principalmente en ovejas, cabras y ganado bovino. La
susceptibilidad al FVR varía considerablemente en razas diferentes. Algunos animales autóctonos de África
muestran sólo infecciones asintomáticas, mientras que los foráneos o de otras razas sufren una manifestación
clínica grave con mortalidad y aborto. Los animales susceptibles de mayor edad no gestantes y algunas otras
especies no muestran signos de enfermedad. Los camellos se han relacionado con frecuencia con las epidemias
de FVR en el este de África y Egipto. La enfermedad clínica no aparece en camellos adultos, pero se presentan
abortos y se han observado algunas muertes postnatales tempranas.
Los síntomas de la enfermedad suelen ser poco específicos, haciendo difícil el reconocimiento de casos
individuales (5-8, 16, 28). Sin embargo, es característica la existencia de numerosos abortos y de
mortalidad entre animales jóvenes, junto a la enfermedad en humanos. La FVR tiene un período de incubación
corto: 12-36 horas en corderos. Puede aparecer una fiebre bifásica de hasta 41°C, y la fiebre permanece alta
hasta poco antes de la muerte. Los animales afectados muestran decaimiento, poca tendencia al desplazamiento
o a la alimentación, y pueden presentar hinchazón en los nódulos linfáticos superficiales y dolor abdominal. Los
corderos raramente sobreviven más de 36 horas tras la aparición de los signos de enfermedad. Los animales
mayores de 2 semanas pueden morir con manifestaciones agudas, hiperagudas o desarrollar una infección
asintomática. Algunos animales pueden regurgitar la ingesta y presentar diarrea hemorrágica o sanguinolenta de
olor nauseabundo junto con descargas nasales mucopurulentas con restos de sangre. A veces se puede
observar ictericia, particularmente en los bóvidos. Además de estos síntomas, el ganado adulto puede presentar
lagrimeo, salivación y falta de producción láctea. En ovejas gestantes, la mortalidad y la frecuencia de aborto
varían del 5% a casi el 100% en diferentes brotes y en diferentes manadas. La tasa de muerte en el ganado
vacuno es normalmente inferior al 10%.
Las lesiones hepáticas de la FVR son muy similares en todas las especies, variando principalmente con la edad
del individuo infectado (6). Las lesiones más notables se presentan en fetos abortados y corderos recién nacidos
y consisten en un aumento de tamaño moderado o grande del hígado que se presenta blando y sin consistencia,
con color que varía de marrón amarillento a marrón rojizo y manchas irregulares de congestión. En el
parénquima, siempre se presentan numerosos focos necróticos de color blanco grisáceo, pero que pueden no
ser fácilmente discernibles. En la oveja adulta, las lesiones son menos graves y aparecen focos necróticos
distribuidos por todo el parénquima de color rojizo o blanco grisáceo. Por lo general, la pared de la vesícula biliar
presenta hemorragias y edema. Las lesiones hepáticas en los corderos se acompañan casi siempre de
numerosas hemorragias pequeñas en la mucosa del rumen. El contenido del intestino delgado y del rumen es de
color chocolate oscuro a consecuencia de la presencia de sangre parcialmente digerida. En todos los animales,
el bazo y los nódulos linfáticos periféricos se inflaman, están edematosos y pueden presentar petequias.
A nivel microscópico, la lesión más evidente de la FVR tanto en animales como en humanos es la necrosis
hepática. En los fetos y neonatos de ganado vacuno y ovino, los focos necróticos consisten en agregados
densos de restos celulares y nucleares, algo de fibrina y unas cuantas células inflamatorias. Existe una
importante necrosis lítica en la mayoría de los hepatocitos y se pierde la arquitectura normal del hígado. En casi
el 50% de los hígados afectados, se encuentran cuerpos de inclusión intranuclear que son eosinofílicos y ovales
o bacilares. También se observa mineralización de los hepatocitos necrosados. En los animales adultos, la
necrosis hepática es menos difusa y en las ovejas la ictericia es mas frecuente que en los corderos (26).
En humanos, las infecciones por FVR son normalmente asintomáticas o asociadas a una manifestación no fatal
similar a la gripe que varía de moderada a grave (15). Una minoría de pacientes puede desarrollar lesiones
oculares, encefalitis o una enfermedad hepática grave con manifestaciones hemorrágicas, que, por lo general, es
fatal. En humanos, el virus FVR ha causado infección grave entre personal de laboratorio. La plantilla debe ser
vacunada y trabajar con un nivel 3 de contención, en condiciones de un nivel 4 de contención, o llevar protección
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
203
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
respiratoria. Se necesita tener un cuidado especial cuando se trabaja con animales infectados o cuando se
realizan análisis post-mortem (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de
microbiología).
No se han demostrado diferencias antigénicas significativas entre aislamientos de FVR y cepas cultivadas en
laboratorio de muchos países, pero se han visto diferencias en cuanto a patogenicidad (27).
La infección en humanos a través de mosquitos vectores es una característica propia de países que, como
Egipto, tienen una población relativamente escasa de animales hospedadores y una gran población de
mosquitos.
La FVR se presenta normalmente como epizootias en África, que pueden incluir varios países en una región
aislada y al mismo tiempo. Estas manifestaciones siguen a ciclos periódicos de lluvias excepcionalmente fuertes
que pueden ocurrir muy raramente en zonas semiáridas (ciclos de 25-35 años), o más frecuentemente (ciclos de
5-15 años) en praderas de la sabana. En períodos entre epizootias puede ocurrir un bajo nivel indetectable de
FVR. Se debe sospechar la existencia de FVR cuando a lluvias extraordinariamente fuertes sigue la presentación
de abortos junto a una enfermedad fatal caracterizada por necrosis y hemorragias en el hígado, que afecta sobre
todo a corderos, cabritos y terneros, y que es paralela a la aparición de una enfermedad semejante a la gripe en
trabajadores de granjas y personal que maneja carne cruda.
Cuando existen sospechas de que se manipula carne y muestras de tejido infectadas por el virus FVR se deben
utilizar medidas preventivas para proteger a los trabajadores de la infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
El virus FVR se puede aislar del suero y de la sangre recogida con anticoagulante durante la fase febril de la
enfermedad, del hígado, del bazo, y del cerebro de animales que hayan muerto, o de fetos abortados.
Normalmente el aislamiento primario se realiza en hámsteres, ratones jóvenes o adultos, o en cultivos celulares
de varios tipos.
a)
Cultivo
Para el aislamiento de virus debe disponerse de aproximadamente 5 ml de sangre recogida durante el
estado febril de la enfermedad o unos 5 g de hígado, bazo o cerebro recogidos tras la muerte. Las muestras
deben mantenerse a 0-4°C durante el transporte. Si es probable que dicho transporte dure más de 24
horas, la muestra se debe congelar y enviar en hielo seco.
Se suspende aproximadamente 1 g de tejido homogenizado al 1/10 en medio de cultivo celular o solución
salina tamponada, pH 7.5, conteniendo penicilina sódica (1.000 Unidades Internacionales [UI]/ ml), sulfato
de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ ml) o fungizona (2.5 µg/ ml). La suspensión se centrifuga a
1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante líquido se inyecta intracerebralmente en ratones de 1-5 días
o intraperitonealmente en hámsteres o ratones adultos. Los ratones jóvenes morirán o estarán claramente
enfermos al día 2. Los ratones adultos muestran signos de afección 1-3 días más tarde. Aunque los
animales de laboratorio preferidos son los ratones y hámsteres, también se pueden usar corderos y huevos
de gallina embrionados.
Para el cultivo del virus de la FVR pueden utilizarse varias células en monocapa, entre las que se incluyen
células de riñón de mono verde africano (Vero), riñón de hámster neonato (BHK), retículo de embrión de
pollo (CER: células desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Research,
Tokio, Japón; recaracterizada como una línea celular de hámster) (3) y células primarias de riñón o testículo
de ternero y cordero, que se inoculan con 1 ml de sobrenadante de la muestra y se incuban a 37°C durante
1 hora . Se aconseja inocular también algunos cultivos con una dilución 1/100 del inóculo. Con esto se evita
la producción de partículas defectivas que se produce con el uso de inócula con muy alta concentración de
virus. También deben prepararse algunos tubos con cubreobjetos. Los cultivos se lavan con tampón fosfato
salino a temperatura ambiente y se recubren con medio que contiene 2% de suero exento de anticuerpos
contra FVR. Los cultivos se observan microscópicamente durante 5-6 días. El virus FVR produce un efecto
citopático (ECP) caracterizado por provocar una ligera redondez en las células y a continuación la
destrucción de toda la monocapa celular en 12-24 horas. La identificación específica del antígeno del virus
FVR se puede realizar 18-24 horas tras la infección mediante tinción por inmunofluorescencia de las
preparaciones en los cubres.
204
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
El virus también puede ser detectado por inmunofluorescencia en frotis de hígado, bazo y cerebro. A veces
se puede hacer un diagnóstico rápido demostrando la presencia del antígeno vírico en tejidos o sueros de
animales febriles por pruebas de fijación de complemento o de inmunodifusión en gel de agar (IGDA).
También se puede lograr un diagnóstico rápido mediante detección del ARN vírico usando una reacción en
cadena de la polimerasa con trascripción inversa (RT-PCR).
b)
Inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA es de utilidad en laboratorios sin disponibilidad de servicio de cultivo de tejidos. Se
homogeniza aproximadamente 1 gramo de tejido, preferentemente hígado, y se hace una suspensión al 1020% en tampón borato salino, pH 9,0. El material se centrifuga a 1.000 g y el sobrenadante se usa en la
prueba. Las versiones de micro-IGDAs se realizan en portas estándar para microscopía que se cubren con
3 ml de agarosa al 1% en tampón borato salino. Se preparan diseños de seis pocillos periféricos y un pocillo
central que se llenan con los reactivos del siguiente modo: un suero positivo, preferentemente hiperinmune,
en el pocillo central, control positivo de antígeno en los pocillos 1 y 4, tejidos problema en los pocillos 2 y 5,
y tejidos negativos en los pocillos 3 y 6. Se debe formar una línea continua de precipitado entre el antígeno
control y el suero positivo que debería extenderse hasta incluir una línea entre el tejido problema y el suero
en caso de la prueba que fuera positiva.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa
Se puede conseguir también un diagnóstico rápido por detección del ARN vírico (23) usando una prueba
RT-PCR. La PCR se usó, entre otras técnicas, para la detección de antígeno en dos recientes brotes de
FVR en África –uno en Kenia en 1998 y un brote limitado en Sudáfrica en 1999. La RT-PCR seguida por
secuenciación de la región que codifica la proteína NS(S) se ha empleado en análisis filogenéticos para
caracterizar dos ramas distintas del virus FVR –una egipcia y otra sub-sahariana- convirtiendo a esta
técnica en un poderoso instrumento de epidemiología molecular (22).
d)
Histopatología
El examen histopatológico del hígado de los animales afectados revelará una citopatología característica, y
la inmunotinción permitirá la identificación específica del antígeno viral del FVR en las células infectadas.
Esta es una herramienta diagnóstica importante porque el hígado y otros tejidos se pueden mantener en
formol salino en condiciones de campo con propósitos de diagnóstico, lo que facilita el manejo y transporte
en áreas alejadas del laboratorio.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas de neutralización del virus (NV) incluyendo la microneutralización, la neutralización por reducción de
placas (PRN) y la neutralización en ratón se han usado para detectar anticuerpos contra el virus FVR en el suero
de una variedad de especies. Las pruebas de neutralización son muy específicas y reflejarán las respuestas más
tempranas, pero estas pruebas sólo pueden llevarse a cabo con virus vivos y su uso no es recomendable fuera
de las áreas endémicas o en laboratorios sin los adecuados servicios de bioseguridad y personal vacunado.
Otras pruebas disponibles son enzimoinmunoensayo (ELISA), inhibición de la hemaglutinación (HI), IGDA,
inmunofluorescencia, radioinmunoensayo y fijación de complemento. Sin embargo, en estas pruebas pueden
ocurrir reacciones cruzadas entre el virus FVR y otros phlevovirus. Una ventaja de estas pruebas es el hecho de
que pueden realizarse con antígeno inactivado y, por consiguiente, pueden ser utilizadas en países exentos de
FVR.
La técnica ELISA es un método seguro y sensible que puede usarse con varias especies para detectar
anticuerpos contra el virus FVR. Una prueba ELISA con captura de IgM permite diagnosticar una infección
reciente en una muestra aislada de suero.
La prueba de HI puede emplearse con gran seguridad en áreas no endémicas. No obstante, los sueros de
individuos que han tenido infecciones previas con phlebovirus distintos de FVR pueden reaccionar con el
antígeno de FVR a títulos tan altos como 40 y, más raramente, a títulos de 320 (27). En casos sospechosos, el
Laboratorio de Referencia de la OIE para FVR (ver Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual) puede ayudar
a realizar pruebas de neutralización para determinar la especificidad. El título de anticuerpos por HI tras la
vacunación con virus FVR vacunal puede ser tan alto como 640 o, raramente, 1.280, mientras que los títulos que
se alcanzan tras infecciones naturales por el virus FVR son, por lo general, significativamente más altos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
205
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
a)
Neutralización vírica
La prueba NV se puede usar para determinar la presencia de anticuerpos en animales infectados por vía
natural y en animales vacunados con la vacuna VRF. La prueba es muy específica y se puede usar para
probar sueros de cualquier especie. Normalmente se usa para medir la eficacia de la vacuna. Algunos
factores, además de los anticuerpos neutralizantes, pueden jugar un papel en la resistencia frente al FVR.
Como antígeno se usa una cepa neurotrópica para cerebro de ratón muy atenuada del virus FVR
denominada cepa Smithburn (25), también conocida como virus vivo modificado y adaptado a cultivos
celulares. El antígeno se guarda a 4°C en forma liofilizada. Este stock se titula para determinar la dilución
que producirá 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) en 25 µl bajo las condiciones de la
prueba.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Inactivar el suero problema durante 30 minutos en un baño a 56°C.
ii)
Añadir 25 µl del medio de cultivo celular con 5% de suero negativo para FVR y antibióticos en cada
uno de los 96 pocillos de una placa de cultivo celular.
iii)
Añadir 25 µl del suero problema al primer pocillo de cada fila y hacer diluciones dobles. Titular cada
suero por duplicado de 1/10 a 1/80 a efectos de prueba o por cuadruplicado y a más altas diluciones
para determinar el título de punto final. Incluir controles positivos y negativos de sueros conocidos.
iv)
Añadir 25 µl de antígeno vírico FVR (diluido con medio del cultivo celular y calculado para suministrar
100 DICT50 por pocillo) a cada pocillo que contenga el suero problema diluido y a los pocillos de las
filas que contengan controles de suero positivo y negativo. Además, hacer diluciones dobles de
antígeno en al menos dos filas de las que contienen solo medio del cultivo celular.
v)
Incubar 30 minutos a 37°C.
vi)
Añadir 50 µl por pocillo de células Vero, CER o cualquier otra suspensión celular apropiada, a una
concentración de 3 x 105 células/ml o a una dilución que se conozca que origina una monocapa
confluente en 12 horas.
vii)
Incubar las placas durante 3-5 días en una atmósfera de 3-5% de CO2.
viii) Las monocapas se examinan diariamente usando un microscopio invertido para evidenciar ECP. No
debería producirse ECP en las filas que contienen el suero control positivo y debería presentarse un
ECP claro en las filas que contengan el suero control negativo indicando la presencia de virus.
Determinar los resultados por el método de Spearman-Kärber.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se ha desarrollado y utilizado ampliamente un método indirecto ELISA que emplea un antígeno inactivado
producido en cultivo celular y conjugado con proteína G-peroxidasa (21). El antígeno FVR para ELISA se
prepara a partir de cultivos Madin-Darby y el control negativo de antígeno se prepara a partir de monocapas
no inoculadas. Los sedimentos celulares se extraen con un método que emplea sacarosa-acetona (4) y se
inactivan con beta-propriolactona (24).
•
Procedimiento de la prueba
A menos que se señale lo contrario, los volúmenes usados son 50 µl/ pocillo, todas las diluciones se
hacen con tampón con 3% (peso/volumen) de leche deshidratada, y todos los lavados se repiten tres
veces.
206
i)
Cubrir la mitad de la placa con 50 µl/pocillo de antígeno positivo y la otra mitad con antígeno negativo
a una dilución predeterminada. Incubar toda la noche a 4°C. Lavar la placa.
ii)
Añadir 100 µl/pocillo de tampón bloqueante, incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.
iii)
Añadir el suero problema y los sueros control a una dilución predeterminada por duplicado al antígeno
positivo y al negativo. Incubar 1 hora a 37°C. Lavar la placa.
iv)
Añadir el conjugado de Proteína G/peroxidasa de rábano a dilución adecuada. Incubar 1 hora a 37°C.
Lavar la placa.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
v)
Añadir el substrato tetrametilbenzidina como se presenta comercialmente y dejar la placa 20 minutos a
temperatura ambiente (22°C) en la oscuridad (tiempo de desarrollo).
vi)
Añadir solución que detiene la reacción (ácido sulfúrico 2 M) y leer la placa a una densidad óptica de
450/650 nm.
vii)
La disposición de la placa es como se indica:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
A
(1)
(1)
(5)
B
(2)
(2)
(6)
C
(3)
(3)
(19)
D
(4)
(4)
(20)
E
(1)
(1)
(5)
F
(2)
(2)
°(6)
10
11
12
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
(19)
(c+)
(c+)
(20)
(c– –)
(c– –)
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
G
(3)
(3)
(19)
(19)
(c+)
(c+)
H
(4)
(4)
(20)
(20)
(c– –)
(c– –)
A, B, C y D = Ag positivo; E, F, G, y H= Ag negativo
c)
Inhibición de la Hemaglutinación
La prueba IH adaptada en versión de microtécnica se basa en Clarke & Casals (4). Se emplea antígeno de
hígado de hámster extraído en sacarosa/acetona en una placa de ensayo de 96 pocillos con fondo en U y
se diluye de modo que se usan en la prueba 4 unidades hemaglutinantes. Los inhibidores inespecíficos de
la hemaglutinina se extraen de los sueros antes de la prueba mediante extracción con caolín y luego por
adsorción en eritrocitos de ganso prensados (RBC). Las diluciones dobles seriadas de los sueros se hacen
en tampón borato salino, pH 9,0, y se ensayan frente a volúmenes iguales de antígeno. Las placas se dejan
a 4°C durante la noche antes de añadir 50 µl de RBC al 0,5% a cada uno de los pocillos. Las placas se
leen tras 30 minutos a temperatura ambiente y los puntos finales se indican como el inverso de la dilución
más alta de suero que produce una inhibición total de la hemaglutinación.
En cada prueba se incorporan sueros control positivo y negativo. Una prueba se considera válida solamente
si los sueros control dan los resultados esperados. Los sueros con títulos inferiores a 1/40 se consideran
negativos.
La técnica de HI es una prueba adecuada de ensayo para inspecciones aunque no es muy específica.
Entre los phlebovirus ocurren reacciones cruzadas notables, pero los títulos homólogos exceden a los
heterólogos. Experimentalmente, se ha demostrado que hay phlebovirus africanos distintos del FVR que no
son patógenos para los rumiantes, y no es probable que los anticuerpos que ellos puedan inducir originen
confusión en el diagnóstico de FVR (27).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se ha usado una vacuna viva preparada con la cepa atenuada Smithburn del virus FVR para controlar FVR en
ganado bovino y ovino no gestante en áreas endémicas y durante brotes epidémicos, mientras que se usan virus
vacunales inactivados a partir de cepas naturales en el caso de animales gestantes y en países libres de FVR (1,
2). Las vacunas con virus inactivados deben prepararse a partir de cepas muy inmunogénicas del virus FVR
producidas en cultivo celular. El virus debe inactivarse con formaldehído y mezclarse con un adyuvante para
potenciar la inmunogenicidad. Las vacunas inactivadas deben ensayarse muy cuidadosamente en cuanto a
seguridad para garantizar que no existe ningún virus vivo residual.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza
genérica y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales o regionales.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
207
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
En humanos, se ha usado durante 25 años una vacuna experimental inactivada con considerable éxito en cuanto
a protección de personas con riesgo de FVR. En la actualidad esta vacuna se está produciendo en células
diploides. Sin embargo, la limitada disponibilidad de esta vacuna impide su uso en la población general.
Dos nuevas candidatas a vacunas producidas a partir de aislamientos humanos de FVR están siendo sometidas
a diversos ensayos con vistas a reemplazar las vacunas existentes.
La primera, MV P12, es una cepa mutada de virus cultivado en presencia de 5-fluorouracilo con mutagénesis
seriada que produce en una atenuación para el ratón. Se ha probado en ovejas la inmunogenicidad y la
patogenicidad y el virus no provoca abortos en ovejas gestantes (17). MV P12 confirió protección en corderos
jóvenes (10,14) y en ganado bovino (18, 19). En pruebas posteriores más extensas realizadas en ovejas la
vacuna produjo abortos y teratología fetal grave cuando se usó después de 28 días de gestación (12).
La segunda candidata, Clon 13, una variante de virus que origina pequeñas placas de lisis y que no reacciona
con dos anticuerpos monoclonales específicos, resultó ser avirulenta para ratones y hámsteres y muy
inmunogénica. Su inmunogenicidad y patogenicidad se ha probado en corderos, ovejas, y cabras jóvenes y
adultas (20). En ensayos adicionales se comportó como no abortiva en ovejas gestantes y confirió más de un
80% de protección frente a un virus prueba de desafío (11). El virus Clon 13 presenta la pérdida de una porción
del segmento de ARN pequeño que codifica proteínas no estructurales, lo que podría conducir a una vacuna
estable.
En la siguiente descripción de producción de vacunas, se suministra información sobre la producción de vacuna
viva junto a información sobre producción de vacuna inactivada. Debe resaltarse que las vacunas vivas y las
inactivadas nunca deben producirse simultáneamente en los mismos servicios, debido al riesgo de contaminar la
vacuna viva atenuada con una cepa virulenta de virus antes de ser inactivada. El personal que maneja virus FVR
vivo debe estar vacunado y trabajar con nivel de contención 3 para minimizar el riesgo de autoinfección.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo vírico
Vacuna viva: El stock de antígeno deriva de la cepa original neurotrópica de Smithburn. Esta cepa no es
letal en ratones adultos inyectados intraperitonealmente y es segura cuando se usa en todas las razas de
ganado vacuno, ovejas y cabras. Sin embargo, puede causar anormalidades fetales o aborto en animales
gestantes.
Vacuna inactivada: Se puede usar como virus de inóculo una cepa de virus FVR altamente inmunogénica
adaptada a crecer en cultivos celulares. Se diferencia de la cepa atenuada en que es letal para los ratones
adultos cuando se inyecta intraperitonealmente.
b)
Método de cultivo
Tanto las cepas de virus atenuado como la inactivada se producen en cultivos celulares de células BHK,
Vero o CER. Los virus se guardan en forma liofilizada en viales que contienen 1 ml de una suspensión de
cultivo celular. El título vírico (tras inoculación intracerebral en ratones jóvenes) debe ser de al menos 106.5
LD50 en el ratón (50% de la dosis letal) por ml.
c)
Validación como vacuna
Los virus inoculados deben carecer de agentes indeseables, ser seguros para el uso y capaces de
estimular una inmunidad eficaz en las especies y razas a las que va dirigida.
Œ
Pruebas
El inóculo de virus liofilizado se regenera en medio de cultivo celular estéril sin antibióticos y se comprueba
la ausencia de bacterias y hongos. El contenido de un vial así reconstituído se inocula en dos tubos de
medio con tioglicolato y en dos tubos de medio con hidrolizado de soja y caseína. Los cultivos con
tioglicolato se incuban a 37°C durante 7 días y los cultivos con hidrolizado de soja y caseína a 20°C durante
14 días. Los cultivos deberían permanecer negativos.
Además, se mezclan 5 ml del inóculo de virus reconstituído con un mismo volumen de antisuero específico
contra FVR producido en conejos. Después de incubar las mezclas suero/virus a 37°C durante 30 minutos,
las suspensiones víricas se ensayan en cultivos celulares antes y después de una neutralización, así como
en ratones adultos y jóvenes, huevos embrionados y cobayas. El virus neutralizado es:
208
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
i)
Sembrado en seis cultivos en tubos rotativos con células primarias de riñón de cordero y seis cultivos
en tubos rotativos con células BHK. Los cultivos celulares se incuban a 37°C y se observan
diariamente durante 7 días para observar ECP, tras los cuales se someten a la prueba de
hemadsoción con RBCs de cobaya a 4°C y a 37°C. No debería presentarse ECP ni hemadsorción. Si
el cultivo degenera o presenta sospechas de ECP, el material de estos cultivos debería mezclarse de
nuevo con antisuero y reinocularse en cultivos celulares frescos, que se observan durante otro período
adicional de 14 días. La presencia de ECP específico o de hemadsorción descalifica la muestra como
inóculo vírico.
ii)
Inoculado intraperitonealmente (0,2 ml) en grupos de al menos seis ratones adultos y seis ratones de
2-5 días de edad. Los ratones deberían permanecer sanos durante 14 días. Si muriera algún ratón, se
emulsiona un tejido adecuado, se mezcla con antisuero y se reinocula en otros grupos de ratones,
observándolos de nuevo durante otro período de 14 días. Si existe alguna evidencia de mortalidad
específica, se descalifica la muestra como inóculo vírico.
iii)
Inoculado en al menos diez huevos de gallina embrionados de 8 días mediante el método del punzón
(combinación de la ruta de la membrana coriolantoidea y del saco alantoideo). Los huevos se incuban
a 37°C durante 8 días y se observan diariamente con transiluminación. Los embriones que mueren a
las 24 horas se eliminan. Si después de 24 horas permanecen vivos menos del 70% de los embriones,
la prueba debería, no obstante, repetirse. La causa de muerte embrionaria durante el consiguiente
período de observación debería determinarse estableciendo pruebas adecuadas de esterilidad y de
HI, y por examen de frotis del saco vitelino. Si estas pruebas resultan negativas, debería hacerse,
como antes, una reinoculación de suspensiones obtenidas de los embriones mezcladas con antisuero.
Al día 4 de incubación, se abren al menos 4 huevos y se recoge el líquido del alantoides. Los huevos
restantes se abren el día 8 de incubación. Se examinan las membranas de ambos grupos en cuanto a
lesiones y en cuanto a anormalidades del embrión. El líquido del alantoides se somete a una prueba
HI con RCBs de cobaya y pollo a 4°C y a 37°C. La evidencia de mortalidad embrionaria específica, de
actividad hemaglutinante en el líquido alantoideo, cualquier lesión en las membranas o anormalidades
embrionarias descalifican la muestra como inóculo vírico.
iv)
Inyectado intraperitonealmente con 1,0 ml de inóculo vírico en dos cobayas. Los cobayas deben
permanecer sanos en un período de observación de 14 días.
No superar cualquiera de estas pruebas descalifica al antígeno para uso como inóculo vírico.
2.
Método de producción
Un vial de inóculo vírico liofilizado se reconstituye y se diluye entre 1/100 y 1/1.000 con medio Eagle en el caso
de las vacunas atenuadas y 1/1.000 en el caso de vacunas inactivadas. Para preparar una suspensión de
trabajo, se siembra el virus diluído en un cultivo confluente de células BHK en botellas rotativas y se incuba a
37°C. Cuando el 70% de las células aparecen afectadas (ECP), se recoge el medio y las células y este material
se diluye entre 1/100 y 1/1.000, tras lo cual se siembran de nuevo 10 ml en botellas rotativas con células BHK
confluentes y se incuba otra vez. Tan pronto como se observa un 70% de ECP, se recoge el medio y las células
y se almacenan.
Tanto las suspensiones virales de las vacunas atenuadas como de las inactivadas se titulan intracerebralmente
en ratones neonatos y deberían presentar un título de la menos 106.5 LD50/ml en ratón. Alternativamente, se
puede realizar una titulación de lesiones en células CER.
La vacuna atenuada se liofiliza inmediatamente después de completar las pruebas de titulación y de esterilidad.
Debería usarse un estabilizador, como por ejempo 5% de peptona en tampón fosfato 0,3 M. El volumen de la
vacuna inactivada se ajusta de modo que la vacuna final contenga al menos 106.5 LD50/ml. La suspensión viral
ajustada se inactiva luego a 37°C durante 24 horas con formaldehído a una concentración final de 0,2%. Tras la
inactivación, se añade a la suspensión el mismo volumen de gel de hidróxido de aluminio. La vacuna debe tener
un pH final de 7-7,5.
3.
Control el proceso
Previamente a la inoculación de los cultivos celulares, el inóculo vírico se somete a pruebas de esterilidad en
medios con tioglicolato y con hidrolizado de soja y caseína (ver Sección C.1.c y Capítulo I.1.5. Pruebas para
esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
209
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
Se selecciona una muestra representativa de cada lote de vacuna y cada contenido se reconstituye con 5 ml de
agua destilada estéril analizándose para comprobar ausencia de bacterias y hongos.
En las vacunas inactivadas, debe comprobarse la inactivación mediante dos pases en el mismo tipo de cultivo
celular que se usó en la producción de la vacuna.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Antes de la liofilización o de la inactivación, cada envase de vacuna almacenada, y después muestras
representativas de cada lote, se prueban respecto a esterilidad en medio con tioglicolato e hidrolizado de
soja y caseína (ver también Capítulo I.1.5. de este Manual).
b)
Inocuidad
Vacuna viva: Se seleccionan al azar recipientes finales de la vacuna atenuada liofilizada y cada uno se
reconstituye en agua destilada como si se tratara de una vacunación. Se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con una dosis de vacuna. Las ovejas se observan diariamente durante 14 días y se
anota su temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
La vacuna también se inyecta intraperitonealmente en seis ratones adultos (0,25 ml en cada uno), dos
hámsteres y dos cobayas (1 ml en cada uno). Los animales se observan diariamente durante un período de
14 días durante el cual deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
Vacuna inactivada: En el caso de la vacuna inactivada contra FVR, se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con 2,0 ml de vacuna, se observan diariamente durante 3 semanas y se anota la
temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
Además, la seguridad se determina también por inyección intracerebral de seis ratones adultos y dos
familias de ratones neonatos, y mediante inyección intraperitoneal de dos cobayas y dos hámsteres. Los
ratones, hámsteres y cobayas se observan durante 14 días. Deben permanecer sanos. Una mortalidad
atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
c)
Potencia
Vacuna viva: Se recostituye la vacuna atenuada liofilizada de dos recipientes finales y se titula
intracerebralmente en ratones neonatos. La vacuna final debe contener al menos 104.4 LD50/dosis en ratón.
Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares.
Dos recipientes finales se mantienen una semana a 37°C, se recosntituyen y se titulan como antes. Cada
uno debe contener al menos 103.4 LD50/dosis en ratón. Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones
en cultivos celulares.
Las ovejas inoculadas (ver sección C.4.b.) se sangran a las 2 y 3 semanas de la vacunación y su respuesta
en anticuerpos se determina por PRN. Un título de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es
considerado satisfactorio.
Vacuna inactivada: Las ovejas, inyectadas subcutáneamente para determinar la seguridad (Sección C.4.b.),
se sangran a las tres semanas y su respuesta en anticuerpos se determina por la prueba NV. Un título de
anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más es considerado satisfactorio.
d)
Duración de la inmunidad
Tanto las vacunas vivas atenuadas como las inactivadas han tenido un amplio uso en condiciones de
campo. Se considera que la vacuna viva induce una inmunidad que dura toda la vida contra la enfermedad
clínica, aunque existe cierta controversia sobre la inmunogenicidad de la vacuna Smithburn. Sin embargo,
el ganado vacuno se puede inmunizar con la vacuna de virus vivo usando esta cepa. La experiencia sobre
la eficacia de campo de las vacunas inactivadas es limitada porque se han empleado en áreas donde FVR
no es endémica, y donde en consecuencia no existe desafío natural frente a la vacuna. Sin embargo,
durante el brote de 1976-1978 en Sudáfrica, observaciones realizadas por veterinarios estatales apoyan la
eficacia de la vacuna. En epizootias más recientes en otras partes, la vacuna inactivada no tuvo éxito en la
protección de los animales contra el aborto, tras dos vacunaciones. Cuando se usa la vacuna inactivada, se
210
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.8. — Fiebre del Valle del Rift
debe dar una dosis de recuerdo a los 3-6 meses de la vacunación inicial y después la vacunación se
debería repetir anualmente (1, 2).
e)
Estabilidad
Cuando se mantienen a 4°C, las vacunas atenuadas liofilizadas son estables durante al menos 4 años,
mientras que la vacuna inactivada puede mantenerse muchos años. No se recomienda el almacenamiento
a temperaturas superiores.
f)
Conservantes
No se usan conservantes.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque los humanos se pueden infectar durante el manejo de material infectado, no se conoce ningún caso
de enfermedad en el hombre con virus de la vacuna atenuada, pero a menudo ocurre seroconversión. Sin
embargo, las cepas usadas para preparar vacuna inactivada pueden causar enfermedad. Por tanto, todo
personal con probabilidad de exposición al virus de la vacuna debería ser vacunado con la vacuna
inactivada con formalina para el hombre.
5.
Pruebas en el producto final
a)
Esterilidad
Se recogen muestras representativas del producto final y se ensayan como se indica en la Sección C.4.a.
b)
Contenido en humedad
La humedad presente en muestras liofilizadas de la vacuna atenuada no debería superar el 3%.
•
Agradecimiento
Partes de este capítulo se tomaron del capítulo sobre FVR en las ediciones previas de este Manual o están
basadas en él.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre del valle del Rift (ver Cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
212
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.1.9.
LENGUA AZUL
RESUMEN
La lengua azul (LA) es una enfermedad vírica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos,
que se presenta en las ovejas y los rumiantes domésticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas
cimarrón, la mayor parte de los antílopes africanos y muchos otros miembros de los artiodáctilos.
El efecto de la infección varía desde una manifestación que pasa desapercibida en la gran mayoría
de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas, cabras, ciervos y
rumiantes salvajes infectados. Los síntomas clínicos de la enfermedad en rumiantes domésticos y
salvajes incluyen una respuesta febril caracterizada por inflamación y congestión, edema facial con
hemorragias, y ulceración de las membranas mucosas. En los casos graves la lengua azul puede
mostrar una hiperemia intensa y llegar a estar edematosa y sobresalir de la boca. La hiperemia se
puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las ingles, axilas y perineo. A menudo
ocurre una grave degeneración muscular. La dermatitis puede ocasionar rotura de la lana. Las
ovejas pueden presentar cojera a consecuencia de coronitis, es decir, inflamación de la banda
coronaria de las pezuñas, o de miopatía esquelética. Una enfermedad grave similar de los
rumiantes salvajes es la causada por el virus de la enfermedad hemorrágica epizootica (EHDV)
que, como el virus de la LA (BTV), es un miembro del género Orbivirus, pero que está clasificado
en un serogrupo diferente. A veces, la EHD puede causar en el ganado síntomas clínicos que
parecen similares a los de la lengua azul.
Identificación del agente: El BTV es un miembro del género Orbivirus de la familia Reoviridae.
Dentro del género hay 14 serogrupos. El serogrupo LA contiene 24 serotipos. Los primeros se
diferencian por pruebas inmunológicas que detectan proteínas víricas que están conservadas
dentro de cada serogrupo. La mayoría de los serogrupos parecen ser diferentes desde el punto de
vista inmunológico, pero existe una reacción cruzada considerable entre los integrantes de los
serogrupos LA y EHD. El serotipo de los virus individuales dentro de cada serogrupo se identifica
mediante pruebas de neutralización. Las partículas completas de BTV tienen una cápsida doble y
la cápsida externa contiene dos proteínas, una de las cuales es el determinante principal de la
especificidad del serotipo. La cápsida interna icosaédrica contiene dos proteínas mayoritarias, tres
proteínas minoritarias y diez módulos de ARN de cadena doble. La proteína VP7 es una proteína
importante de la cápsida que posee los antígenos que confieren especificidad a cada serogrupo.
La identificación tradicional del virus implica su aislamiento la amplificación en cultivos de tejido y
la subsiguiente aplicación de pruebas específicas para establecer el serogrupo y el serotipo.
Recientemente, la aplicación de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha
permitido la amplificación muy rápida del ARN del BTV en muestras clínicas, y, en la actualidad,
existen procedimientos basados en la PCR que permiten obtener información sobre el serogrupo y
el serotipo del virus.
Pruebas serológicas: En los rumiantes las respuestas serológicas aparecen a los 7-14 días
después de la infección por BTV y, por lo general, son duraderas. Para detectar los anticuerpos
específicos contra un serogrupo de LA se usaban hasta hace poco pruebas como la
inmunodifusión en medio sólido o el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA), aunque estas
pruebas tenían el inconveniente importante de ser incapaces de distinguir de forma fiable entre
anticuerpos contra los virus de los serogrupos de LA y de EDH. Un método competitivo ELISA
basado en anticuerpos monoclonales ha resuelto este problema y para detectar específicamente
anticuerpos anti-BTV se recomiendan ensayos de tipo ELISA competitivo. Los procedimientos
actuales para determinar la especificidad de serotipo de los anticuerpos son tediosos porque
requieren determinar la capacidad de los sueros de ensayo para inhibir la infectividad de una serie
de virus de serotipo conocido mediante pruebas de neutralización de larga duración.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
213
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países, como
Sudáfrica, donde no vacunar puede conducir a brotes de la enfermedad, se utilizan vacunas vivas
atenuadas que son específicas en cuanto a serotipo. Los virus atenuados se preparan por pases
seriados del virus natural en huevos embrionados de pollo o en células cultivadas. La virulencia se
atenúa después de los pases seriados y, en paralelo, los virus se replican con títulos más bajos en
las ovejas. Las vacunas con virus atenuados son teratogénicas y no se deben administrar a ovejas
grávidas durante la primera mitad del embarazo, debido a que pueden causar la muerte fetal y
anormalidades. Cuando se establece un grado adecuado de atenuación a efectos de la vacuna, se
debe buscar un equilibrio entre un nivel de replicación suficiente para reducir la virulencia, pero
debe estimular la inmunidad de protección en las ovejas, y la necesidad de reducir el título del virus
en sangre para evitar la infección de insectos picadores. Los procedimientos para ensayar la
eficacia de la vacuna y el potencial teratogénico en ovejas son de realización fácil. En contraste, se
han realizado pocos estudios para determinar si los virus atenuados pueden o no transmitirse de
ovejas vacunadas a otros animales mediante insectos. El hecho de que los virus atenuados sean
teratogénicos hace que la determinación de su transmisión sea un asunto muy importante,
especialmente si se usan por primera vez en un país vacunas con virus vivos.
A. INTRODUCCIÓN
Las moscas del género Culicoides transmiten el virus de la lengua azul (BTV) a animales susceptibles, y a partir
de ellos, llegando a infectarse durante su alimentación sobre vertebrados con viremia. Después de un período de
replicación de 6-8 días, y después de su aparición en la glándula salivar, el virus se puede transmitir a un
hospedador vertebrado durante la ingestión de sangre. Las moscas infectadas permanecen infectadas toda la
vida. El papel central del insecto en la epidemiología de la LA implica que la prevalencia de la enfermedad está
gobernada por factores ecológicos, como pluviosidad elevada, temperatura, humedad y características edáficas
que favorezcan la supervivencia del insecto (6). En muchas partes del mundo la enfermedad tiene, por tanto, una
frecuencia estacional (13).
La LA es una enfermedad vírica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos, que se presenta en las
ovejas y los rumiantes domésticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas cimarronas, la mayor parte de los
antílopes africanos y otros artiodáctilos. El efecto de la infección varía desde una manifestación que pasa
desapercibida en la gran mayoría de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas,
cabras, ciervos y rumiantes salvajes infectados. Aunque en general la frecuencia de infección por BTV es mayor
en el ganado bovino que en las ovejas, la enfermedad típica es rara en el ganado bovino y los síntomas, cuando
ocurren, son mucho más suaves que en las ovejas. En los rumiantes no domésticos, la enfermedad puede variar
de una manifestación hemorrágica aguda con alta mortalidad, como la que se observa en el ciervo de cola
blanca (Oidocoilus virginianus), hasta una enfermedad desapercibida como la del alce norteamericano (Cervus
canadensis). El virus de la enfermedad hemorrágica epizootica (EHDV) puede producir una enfermedad en los
rumiantes salvajes con manifestaciones clínicas idénticas a las observadas después de la infección por BTV.
Los síntomas clínicos de la enfermedad en los rumiantes domésticos y en los salvajes varían desde estados
subclínicos en la mayor parte de los casos hasta una respuesta febril aguda caracterizada por inflamación y
congestión, que conduce a un edema en la cara, párpados y orejas, y hemorragias y ulceración de las
membranas mucosas. Pueden aparecer grandes erosiones en los carrillos y en la parte de la lengua opuesta a
los molares. La lengua puede tener una hiperemia intensa y aspecto edematoso, sobresalir de la boca y, en
casos graves, volverse cianótica. La hiperemia se puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las
ingles, axilas y perineo. A menudo existe una grave degeneración muscular. La dermatitis puede originar roturas
de la lana. Es corriente la presencia de coronitis con hemorragia en la banda coronaria de la pezuña, pudiendo
causar cojera. Cuando una oveja muere a consecuencia de la enfermedad de la LA aguda, los pulmones pueden
mostrar hiperemia interalveolar con edema alveolar grave y el árbol bronquial puede contener espuma. La
cavidad torácica puede contener varios litros de líquido parecido al plasma y el saco del pericardio puede
presentar hemorragias petequiales. La mayor parte de los casos presentan una hemorragia característica cerca
de la base de la arteria pulmonar (11).
El BTV es un miembro del género Orbivirus, que es uno de los nueve géneros clasificados en la actualidad
dentro de la familia Reoviridae. Dentro del género Orbivirus, se diferencian 14 grupos, desde el punto de vista
serológico. Los orbivirus mejor estudiados pertenecen a los serogrupos de la LA, EHD y la enfermedad africana
del caballo (AHS). Dentro de los serogrupos, los miembros individuales se diferencian por pruebas de
neutralización y hasta la fecha se han descrito 24 serotipos de BTV. Existe una notable reacción cruzada
inmunológica entre los miembros de los serogrupos de la LA y la EHD (16). En este capítulo no se presentarán
detalles de las pruebas específicas para la EHD.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
Las partículas del BTV se componen de tres capas proteicas. La cápsida externa contiene dos proteínas, la VP2
y la VP5. La VP2 es el antígeno de neutralización más importante y el determinante de la especificidad de
serotipo. Esta proteína es también la responsable de la hemaglutinación y de la unión del BTV a las células de
mamíferos. La capacidad de un MAb contra VP5 para neutralizar el virus de la AHS (AHSV) y para reaccionar
con la proteína equivalente del BTV y del EDHV confirma el papel de VP5 en la neutralización de los orbivirus y
destaca la extensión de la reacción cruzada inmunológica entre los miembros de los distintos serogrupos de
Orbivirus (24). La eliminación de la cápsida externa VP2/VP5 deja una partícula con una cápsida icosaédrica
interna formada por dos capas compuestas de dos proteínas mayoritarias, la VP7 y la VP3, tres proteínas
minoritarias, y diez módulos de ARN de cadena doble. La VP7 es un determinante importante de la especificidad
de serogrupo y el componente que contiene los epítopos que se usan en enzimoinmunoensayos competitivos (CELISA) para detectar anticuerpos contra BTV. La VP7 también puede ser la responsable de la unión del BTV a
las células de insectos (39). Las subunidades de VP7 contienen dos dominios.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente (una prueba prescrita para el comercio internacional)
a)
Aislamiento del virus
Se usan los mismos procedimientos para rumiantes domésticos y salvajes. Hay varios sistemas en uso para
el aislamiento de virus, pero dos de los más eficaces son los huevos embrionados de pollo (ECE) y la oveja.
La identificación de BTV por inoculación en oveja puede ser una estrategia útil si el título de virus en la
muestra de sangre es muy bajo, como suele ser el caso después de varias semanas después de la
infección vírica. Los intentos de aislar el virus en cultivos celulares in vitro pueden ser más adecuados, pero
con frecuencia la probabilidad de éxito es mucho menor que la lograda mediante sistemas in vivo. Dentro
de una población de virus, no todas las partículas de BTV son idénticas a nivel genético y de composición
en aminoácidos, y sólo una pequeña proporción de los virus presentes en la sangre de animales infectados,
quizás ínfima, puede tener las secuencias de aminoácidos precisas en las proteínas víricas que son críticas
para unirse y replicarse en las células en cultivo. Este puede ser el motivo por el que la inoculación directa
de células cultivadas con sangre virémica que contiene un número relativamente pequeño de partículas
virales sea un modo ineficaz de aislar el BTV. Por uno o dos pases en ECE es más probable que se genere
una preparación con un título alto de virus, y una que contenga virus con la capacidad de replicarse en
cultivo de tejidos. El cultivo celular parece ser una técnica más sensible para el aislamiento del EHDV.
•
Aislamiento en huevos embrionados de pollo
i)
Se recoge sangre de animales febriles con un anticoagulante como heparina, EDTA (ácido etilamina
diamina tetra-acético) o citrato sódico, y las células sanguíneas se lavan tres veces con solución salina
estéril tamponada con fosfato (PBS). Las células lavadas se resuspenden en PBS o en cloruro sódico
isotónico y se guardan a 4°C o se usan inmediatamente para intentar el aislamiento del virus.
ii)
Para guardar a largo plazo cuando no es posible la refrigeración, las muestras de sangre se recogen
en oxalato-fenol-glicerina (10). Si las muestras se pueden congelar, se recogen entonces en solución
tamponada de peptona con lactosa o dimetil sulfóxido al 10% (36) y se mantienen a –70°C o a
temperatura inferior. El virus no es estable a –20°C en períodos largos.
iii)
El bazo y los nódulos linfáticos son los órganos preferidos para intentos de aislamiento del virus en
casos mortales. Los órganos y tejidos deben mantenerse a 4°C y transportarse a un laboratorio donde
se homogenizan en PBS o solución salina isotónica, y se utilizan como se describe más adelante para
las células de la sangre.
iv)
Se resuspenden en agua destilada células de la sangre lavadas o se sonican en PBS y se inoculan
0,1 ml intravascularmente en 6-12 ECE de 9-12 días de edad. Este proceso es difícil de realizar y
requiere práctica. El trabajo de Clavijo et al. contiene los detalles (8).
v)
Los huevos se incuban en una cámara húmeda a 33,5°C y se observan diariamente al trasluz.
Cualquier muerte embrionaria ocurrida en las primeras 24 horas post-inoculación se considera
inespecífica.
vi)
Los embriones que mueren entre los días 2 y 7 se mantienen a 4°C y los que permanecen vivos el día
7 se sacrifican. Con frecuencia, los embriones infectados presentan un aspecto hemorrágico. Los
embriones muertos y los que vivían el día 7 se homogenizan por separado. Se homogenizan los
embriones completos, después de eliminar sus cabezas, u órganos concretos, como el hígado, y los
restos de eliminan por centrifugación.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
vii)
El virus se puede identificar directamente en el sobrenadante mediante ELISA de captura de antígeno
(18) o indirectamente por métodos de detección de antígenos, como inmunofluorescencia o
inmunoperoxidasa, después de su amplificación en cultivo celular, como se describe en la sección
siguiente.
viii) Si, después de la inoculación con el material de la muestra, los embriones no mueren, se hace un
inóculo con el material del primer pase por huevo y se vuelve a pasar por ECE o por cultivo celular.
•
Aislamiento en cultivo celular
Los virus también se pueden añadir a células L de ratón en cultivo, o a células de riñón de hámster neonato
(BHK-21), de riñón de mono verde africano (Vero) o de Aedes albopictus (AA). Mediante adición directa a
células en cultivo, la eficacia del aislamiento suele ser más baja en comparación con la que se alcanza en
ECE. La mejor eficacia de aislamiento en cultivo celular se logra pasando primero los homogenados de
ECE por células AA, y luego por aplicación de procedimientos de detección de antígeno o pases
adicionales por líneas celulares de mamíferos, como células BHK-21 o Vero. En células AA no se observa
necesariamente un efecto citopático (ECP). Se analizan las monocapas celulares para observar la
presencia de un ECP durante 5 días a 37°C con 5% de CO2 y humedad. Si no aparece ECP, se realiza un
segundo pase en cultivo celular.
La identidad del BTV en el medio de cultivo de células que manifiestan un ECP se puede confirmar
mediante varios métodos que se describen más adelante, incluyendo la prueba ELISA de captura de
antígeno, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, o neutralización del virus (NV).
b)
•
Aislamiento en oveja
i)
Las ovejas se inoculan con células lavadas procedentes de 10 ml a 500 ml de sangre, o con 10-50 ml
de suspensión de tejido. Los inóculos se administran subcutáneamente en alícuotas de 10-20 ml.
Volúmenes superiores pueden facilitar el aislamiento del virus y deben administrarse
intravenosamente.
ii)
Las ovejas se mantienen 28 días para comprobación de los anticuerpos utilizando la prueba de
inmunodifusión en medio sólido (1) o la prueba C-ELISA como se describe más adelante.
Métodos inmunológicos
•
Serogrupo de los virus
Los aislamientos de Orbivirus se suelen seroagrupar por su reactividad con antisueros estándar específicos
que detectan proteínas, como la VP7, que se conservan dentro de cada serogrupo. La reacción cruzada
entre miembros de los serogrupos LA y EHD plantea la posibilidad de que un aislamiento de EHD pueda
confundirse con BTV debido a una reacción de inmunofluorescencia débil con un antisuero policlonal antiBTV. Por esta razón, se puede usar un MAb específico del serogrupo LA. Varios laboratorios han generado
tales reactivos específicos de grupo (3, 22). En contraste con el seroagrupamiento, el método corriente de
serotipado es mediante pruebas de NV usando métodos que se describen más adelante. Los métodos más
utilizados para la identificación de los virus a nivel de serogrupo son los siguientes.
i)
Inmunofluorescencia
Se infectan monocapas de células BHK o Vero sobre portas de vidrio con virus adaptado al cultivo de
tejido o con virus de lisados de ECE. Después de 24-48 horas, o después de la aparición de un ECP
incipiente, las células infectadas se fijan con agentes como paraformaldehído, acetona o metanol, se
deja secar y el antígeno vírico se detecta utilizando un antisuero anti-BTV y los procedimientos
estándar para inmunofluorescencia.
ii)
Enzimoinmunoensayo de captura de antígeno
Se pueden detectar directamente los virus en lisados de ECE, en el medio de cultivo y en insectos
infectados. En esta técnica, los virus y/o las partículas de la cápsida se capturan por el anticuerpo
adsorbido a una placa ELISA y el virus unido se detecta usando un segundo anticuerpo. El anticuerpo
de captura puede ser policlonal o un MAb específico de serogrupo. Para detectar los virus capturados,
se han usado con éxito MAbs específicos de serogrupo y anticuerpos policlonales contra las partículas
de la cápsida expresadas en baculovirus (18).
iii)
Prueba inmune puntual (14)
Se adsorben sobre nitrocelulosa pequeños volúmenes (2 µl) de sobrenadante de cultivo de células
infectadas o de células infectadas que han sido lisadas o sonicadas y se deja secar. Los sitios de
unión inespecífica se bloquean incubando con una solución que contenga proteína de leche
216
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
desnatada. Después de incubar con un MAb reactivo para el serogrupo LA, el anticuerpo se detecta
utilizando IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano.
•
Serotipado por neutralización de virus
Las pruebas de neutralización son específicas de tipo para los 24 serotipos de BTV actualmente
reconocidos y pueden emplearse para serotipar un virus aislado o modificarse para determinar la
especificidad de los anticuerpos en los sueros. En el caso de un aislamiento no tipado, la localización
regional característica de los serotipos de BTV eliminará, por lo general, la necesidad de realizar la
neutralización con todos los 24 antisueros, en particular cuando se han identificado los serotipos
endémicos.
Existe una serie de métodos disponibles, que se basan en el cultivo celular, para detectar la presencia de
anticuerpos neutralizantes anti-BTV. Las líneas celulares más utilizadas son BHK, Vero y L929. Más
adelante se resumen cuatro métodos para serotipar el BTV. Se ha descrito que los antisueros específicos
de serotipo generados por cobayas y conejos presentan menos reacción cruzada que los obtenidos de
ganado vacuno u ovino. Es importante incluir controles del antisuero para asegurarse de que se utiliza un
nivel eficaz de antisuero de referencia frente a títulos comparables y estandarizados de virus de referencia y
virus no tipado.
i)
Reducción de placas (o calvas)
El virus que va a ser serotipado se diluye hasta que contenga aproximadamente 100 unidades
formadoras de placas (PFU) y se incuba sin suero o con antisueros individuales estándar de una serie
de serotipos de BTV. Se añaden las mezclas de virus/antisuero a las monocapas celulares y se
determina el título de virus mediante ensayos de placas (o calvas). Se considera que el virus no
identificado es serológicamente idéntico a un serotipo estándar cuando éste último resulta neutralizado
de forma similar si se realiza la prueba en paralelo con el virus problema.
ii)
Inhibición de placas (o calvas)
Las pruebas se realizan en placas Petri de 90 mm de diámetro que contienen monocapas celulares
confluentes que se infectan con aproximadamente 5 x 104 PFU de virus estándar y de virus no tipado.
Después de la adsorción y la eliminación del inóculo, la monocapa se cubre con agarosa. En discos
individuales de papel de filtro se añaden antisueros estándar anti-BTV, que se colocan sobre la
superficie de agarosa. Las placas se incuban por lo menos 4 días. Alrededor del disco que contenga el
antisuero homólogo aparecerá una zona de neutralización del virus con la consiguiente supervivencia
de la monocapa celular.
iii)
Neutralización en microtitulación
En una placa de microtitulación con pocillos de fondo plano se añaden aproximadamente 100 DICT50
(dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) del virus estándar y del virus no tipado en un volumen de
50 µl por pocillo, y se mezcla con el mismo volumen de antisuero estándar diluido con medio de cultivo
de tejidos. En un volumen de 100 µl se añaden aproximadamente 104 células por pocillo y, después de
incubar durante 4-6 días, se leen los resultados de la prueba utilizando un microscopio invertido. Los
pocillos se analizan respecto al grado de ECP observado. Los pocillos que contengan sólo células o
células y antisuero no deberían mostrar ECP. Por el contrario, los pocillos con células y virus deberían
mostrar un ECP claro. Se considera que el virus no identificado es serológicamente idéntico al serotipo
estándar de BTV si ambos resultan neutralizados en la prueba con un grado similar.
iv)
Prueba de inhibición de la fluorescencia (5)
Este método de neutralización, rápido y sencillo, requiere varias concentraciones de un virus
desconocido y concentraciones estándar de antisueros de referencia. Los virus aislados que han
crecido en cultivo celular se diluyen en serie y se mezclan con antisueros individuales de referencia en
los pocillos de una placa Lab-Tek durante 1 hora antes de añadir las células. Después de incubar
16 horas, las células se fijan y se tratan con un procedimiento inmunofluorescente que utiliza un MAb
específico del serogrupo LA. El serotipo del virus se indica por la especificidad del antisuero que causa
una reducción mayor en el número de células fluorescentes.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa (prueba prescrita para el mercado internacional)
La amplificación del ácido nucleico vírico dirigida por cebadores ha revolucionado el diagnóstico de la LA (8,
26, 37). Las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido la identificación rápida
del ácido nucleico vírico del BTV en la sangre y otros tejidos de animales infectados. Respecto al comercio
internacional, la PCR ha permitido la identificación de animales con anticuerpos contra BTV que son
negativos para la presencia del ácido nucleico viral, lo que permite su importación. La PCR también se
puede emplear para establecer el serogrupo de los Orbivirus y, en último término, para serotipar el BTV a
los pocos días de recibir una muestra clínica, como sangre de una oveja infectada. Los enfoques clásicos,
que dependen del aislamiento del virus y de su identificación serológica, pueden tardar por lo menos 3-4
semanas en suministrar información sobre serogrupos y serotipos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
Los cebadores oligonucleotídicos utilizados hasta ahora derivan del ARN 7 (gen VP7) (37), del ARN 6 (gen
NS1) (9), del ARN 3 (gen VP3) (30), del ARN 10 (gen NS3) (4) y del ARN 2 (VP2) (26). En general, el
tamaño de los productos amplificados de la transcripción es pequeño -del orden de varios centenares de
nucleótidos- pero también puede ser un gen completo. En el procedimiento que se describe más adelante
con detalles se amplifica un fragmento del ARN 6 con 101 nucleótidos. Los cebadores que derivan de
genes más conservados, como el VP3, VP7 y NS1, se pueden utilizar para serogrupos (es decir,
reaccionarán con todos los miembros del serogrupo LA), mientras que aquellos cuya secuencia deriva de
las secuencias de genes VP2 permiten obtener información sobre el serotipo vírico. Se ha utilizado un
ensayo de PCR múltiple, que depende del tamaño de los productos amplificados, para identificar en una
sola reacción los cinco serotipos norteamericanos del BTV, tanto aislados como en mezclas (19).
En el BTV, la secuencia nucleotídica de genes homólogos puede variar en función del área geográfica del
aislamiento del virus (17). Esto supone una oportunidad única para complementar estudios epidemiológicos
sobre el BTV, al suministrar información sobre el potencial origen geográfico de los virus aislados, un
proceso que se denomina genotipado o topotipado. Por tanto, la determinación de la secuencia de
porciones del ARN 3 y ARN 6 puede indicar si el virus procede de Australia, Norteamérica o Sudáfrica.
Parece probable que la secuenciación de BTV aislados de otras partes del mundo permita una
discriminación más fina del origen geográfico. No obstante, la relación entre la secuencia y el origen
geográfico puede no ser directa. Por análisis mediante PCR del ARN del segmento genómico 7 (38) los
genotipos específicos de zonas geográficas no quedaron tan claramente definidos como lo fueron usando
el ARN del segmento genómico 3 (17). El desarrollo del topotipo como instrumento epidemiológico
depende, por tanto, de la adquisición de datos sobre las secuencias de BTV aislados de muchas regiones
diferentes del mundo y de la disponibilidad de los datos en bancos de datos de fácil acceso. En principio,
con una base de datos sobre secuencias del ARN 2 suficientemente grande, se podría determinar
rápidamente el serotipo del virus por amplificación del ARN 2 mediante PCR. Para facilitar este proceso, se
deberían hacer accesibles nuevos datos de secuenciación derivados tanto de aislamientos de BTV
caracterizados como no caracterizados enviando los datos a sitios de la web tales como:
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/ and
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv_sequences.htm.
El sitio de la web http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv2-segment-2-tree.htm presenta
análisis de árboles filogenéticos de aislamientos de BTV basados en la secuencia del ARN 2. Estos datos
representarán un recurso para estudios epidemiológicos, la identificación de nuevos aislados y el diseño de
nuevos cebadores para PCR posterior por trascripción inversa (RT) y, posiblemente, para pruebas
específicas de serotipo de BTV.
Se ha observado que en la sangre de terneros y ovejas infectadas se puede detectar el ácido nucleico del
BTV durante al menos 30 días, y a veces hasta 90 días, después de que el virus pueda aislarse. Cuando la
sangre positiva para el virus (infecciosa) o negativa para el virus pero positiva por PCR (detectable sólo por
PCR) se inoculó o se dio por alimento al vector Culicoides sonoriensis, se demostró que el virus se
multiplicada y se transmitía sólo por los vectores expuestos a la sangre infecciosa. Los vectores expuestos
a sangre sólo positiva por PCR no amplificaban ni transmitían el BTV (23). Debido a esto, el diagnóstico
basado en PCR debe interpretarse con limitaciones. El procedimiento basado en PCR detecta ácido
nucleico específico del virus, pero no indica necesariamente la presencia de virus infeccioso.
La capacidad de las pruebas PCR para detectar un pequeño número de moléculas de ácido nucleico
significa que tales pruebas son muy sensibles a la contaminación por ácidos nucleicos extraños, incluyendo
cualquier cebador utilizado en el laboratorio o polonucleótidos amplificados previamente. Por tanto es
importante disponer de un área "limpia" que contenga todo el equipo necesario para la preparación de los
reactivos y de las pruebas y un área separada para el propio equipo de amplificación. Se deben utilizar
guantes de látex y cambiarlos con frecuencia en todas las fases del procedimiento, en particular después
de trabajar con muestras de ARN o de ADN amplificado. Esto ayuda a proteger a los reactivos y a las
muestras de la contaminación por ARNasas ubicuas y otros agentes y de la contaminación cruzada con
ADN. La posibilidad de falsos positivos por contaminación de la muestra realza la importancia de secuenciar
los productos de la PCR para determinar, por ejemplo, si la secuencia amplificada es idéntica o diferente de
la de un control positivo. Los resultados negativos falsos, debidos, por ejemplo, a muestras de baja calidad
o a cebadores inadecuados, se pueden identificar determinando la imposibilidad de amplificar algún gen del
BTV o del hospedador, como el de la globina, en extractos de células infectadas.
La prueba de PCR que se describe comprende tres procedimientos separados. En el primero se extrae el
ARN del BTV a partir de sangre mediante un agente caotrópico como tiocianato de guanidina (GuSCN) para
desnaturalizar las proteínas y liberar el ARN vírico. Para esto existen varias preparaciones comerciales en
el mercado y el protocolo indicado describe la utilización de uno de esos preparados, el IsoQuick (Orca
Research, Bothell, Washington, EE.UU.). Los reactivos suministrados con la preparación vienen numerados
y su uso se indica en el protocolo descrito más adelante. Existen otras preparaciones disponibles y una de
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Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
ellas, la TRIZOL (Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.), es particularmente útil para la
extracción del ácido nucleico del virus del bazo o de coágulos de sangre. Los operadores deben seguir las
indicaciones señaladas en cada caso y el uso de las soluciones de los reactivos suministradas o
recomendadas. El segundo procedimiento es la desnaturalización del ARN vírico de cadena doble y la
transcripción inversa para generar cADN, que se amplifica por PCR. En el procedimiento descrito a
continuación se utiliza el Superscript™ Amplification System (Life Tecnologies) para transcribir el ARN vírico
y reactivos de Perkin-Elmer para la PCR. Existen preparaciones y reactivos equivalentes en otras fuentes
comerciales. El paso final del proceso es el análisis del producto de la PCR por electroforesis. Los
procedimientos para determinar la secuencia del producto amplificado no se describen aquí.
•
Extracción del ARN viral
i)
Se recoge, en tubos con EDTA, sangre entera de los animales a ensayar y de controles no infectados
y se centrifuga a 800-1.000 g durante 10 minutos. Se aspira el plasma y los eritrocitos (RBCs) se
resuspenden suavemente en PBS estéril. Los RBCs se sedimentan por centrifugación a 1.000 g
durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante.
ii)
A continuación se añaden 400 µl de los RBCs de ensayo a cada uno de cuatro tubos de
microcentrífuga de 1,7 ml y otros 400 µl de RBCs control a cada uno de dos tubos de microcentrífuga.
A cada tubo se añade el mismo volumen de agua libre de ARNasa y se agitan brevemente en un
vórtex para mezclar y lisar las células. Se congelan dos tubos que contengan los RBCs de ensayo a 70°C con fines de reposición y se continúa la extracción por duplicado.
iii)
Se centrifugan los RBCs lisados del ensayo y del control a 12.000-16.000 g durante 10 minutos y se
elimina el sobrenadante. Luego se añaden 800 µl de agua libre de ARNasa y los tubos se agitan en un
vórtex y se centrifugan de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante
y el precipitado con los RBCs se deja escurrir.
iv)
Se añade un pequeño volumen de BTV (por ejemplo, 5 µl que contengan de 103 a 107 PFU) a uno de
los dos tubos con el precipitado de RCBs control. Este es el control positivo. El otro tubo que contiene
el precipitado de RCBs control se convierte en el control negativo.
v)
A continuación se añade a cada precipitado 75 µl de tampón de muestra (reactivo A de IsoQuick), y se
agitan vigorosamente en un vórtex, añadiendo después 125 µl de la solución de lisis que contiene
GuSCN (reactivo 1 de IsoQuick). La mezcla se agita vigorosamente en un vórtex durante
30 segundos.
vi)
Antes de utilizar la matriz de extracción que acompaña a la preparación comercial (reactivo 2 de
IsoQuick más el colorante 2A) se agita vigorosamente y se añaden 500 µl a los lisados. Después se
añaden 400 µl de tampón de extracción (reactivo 3 de IsoQuick) y los tubos se agitan en un vórtex
durante 10 segundos.
vii)
Se incuban los tubos a 65°C durante 10 minutos, se agitan brevemente después de 5 minutos y se
centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
viii) La fase acuosa (500 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añade el mismo
volumen de matriz de extracción (reactivo 2 de IsoQuick). Los tubos se agitan en vórtex durante
10 segundos y se centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
ix)
La fase acuosa (330 µl) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrífuga y se añaden 33 µl acetato
sódico al 10% (reactivo 4 de IsoQuick) y 365 µl de isopropanol. Después de mezclar suavemente, se
colocan los tubos de 20 minutos a 1 hora a -20°C.
x)
El ARN se precipita por centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y
se añade 1,0 ml de etanol al 70% mezclando suavemente. Después de centrifugar a 5.000 g
durante 5 minutos, se decanta el sobrenadante y se añade 1,0 ml de etanol al 100%. Se guardan los
tubos a –70°C hasta que se usen en la RT-PCR.
•
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
i)
Se centrifuga el ARN en etanol a 12.000 g durante 5 minutos. Se decanta el l etanol y se invierten los
tubos para dejar escurrir. El precipitado, que puede pasar desapercibido, no debe secarse porque esto
haría difícil su resuspensión. También es posible que un precipitado seco se desprendiera del tubo
invertido.
ii)
Se añade a cada tubo 12 µl de agua libre de ARNasa, se mezcla y se calienta a 65°C durante 510 minutos. Las muestras se colocan en hielo.
iii)
En una campana de bioseguridad "limpia", se preparan en agua libre de ARNasa las soluciones stock
que contienen 200 pmoles/µl de los cebadores A, B, C y D y se guardan a -70°C.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Cebadores de la primera fase de la PCR (para amplificar el ARN 6 desde el nucleótido 11 al 284)
Cebador A: 5’-GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC-3’
Cebador B: 5’-AAG-CCA-GAC-TGT-TTC-CCG-AT-3’
Cebadores de la PCR (para amplificar el RNA 6 del nucleótido 170 al 270)
Cebador C: 5’-GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA-3’
Cebador D: 5’-CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT-3’
iv)
Las soluciones stock de los cebadores se diluyen a una concentración de 15-20 pmoles/µl. Se
preparan los cebadores para la primera fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes iguales de
A y B. Se preparan los cebadores para la otra fase de la reacción de PCR mezclando volúmenes
iguales de C y D. Las mezclas de cebadores se congelan a -20°C en pequeñas alícuotas.
v)
Se rotulan los tubos de reacción y se añade a cada tubo 4 µl de mezcla de los cebadores (A+B) para
la primera fase de síntesis. Los tubos se dejan en hielo.
vi)
En una campana extractora de humos "limpia" se diluyen por separado, en agua libre de ARNasa,
hidróxido metilmercúrico a 50 mM (dilución 1/20) y 2-mercaptoetanol a 350 mM (dilución 1/40). Estos
compuestos están catalogados respectivamente como extremadamente tóxico y muy tóxico. Hay que
utilizar ambos con mucho cuidado y eliminarlos, así como las puntas de pipeta utilizadas con ellos,
según las normas de seguridad,
vii)
Después se añaden 4 µl de las muestras de ARN de ensayo y de control positivo y negativo (paso (ii))
sobre los 4 µl de mezcla de cebadores de PCR (38).
viii) A cada tubo de PCR se añaden 2,0 µl de la dilución 1/20 de hidróxido metilmercúrico con agitación
suave y se deja estar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir 2,0 µl de la dilución
1/40 de 2-mercaptoetanol. Por razones de seguridad, algunos laboratorios utilizan formamida en vez
de hidróxido metilmercúrico para desnaturalizar el ARN de dos cadenas. Sin embargo, es preferible el
hidróxido metilmercúrico para una sensibilidad óptima.
ix)
En una campana "limpia" se prepara una mezcla para ADNc que contenga los siguientes reactivos en
volumen suficiente para el número de muestras que se van a ensayar. La cantidad indicada es por
muestra y los reactivos son los contenidos en la preparación Superscript™ Preamplification System
(Life Technologies).
10‰tampón SuperscriptTM (200 mM Tris/HCl, pH 8,4, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM
Mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Dithiothreitol (DTT) (0,1 M)
Transcriptasa inversa (200 units/µl)
2,0
2,0
1,25
2,0
0,75
µl
µl
µl
µl
µl
x)
Después se añaden 8 µl de la mezcla a cada tubo de PCR hasta un volumen final de20,0 µl.
xi)
Se colocan los tubos de PCR en un termociclador, como el GeneAmp™ PCR System 9600, que se
programa para transcripción inversa del siguiente modo:
Mantener 44°C
Mantener 4°C
xii)
50 minutos
Constante
Se sacan los tubos del termociclador y se añade a cada tubo 1,0 µl de ARNasa H y una bola de cera.
El ciclador se programa del siguiente modo:
Mantener 37°C
Mantener 98°C
Mantener 4°C
20 minutos
4 minutos
Constante
xiii) En una campana "limpia" se prepara una mezcla de primera amplificación que contenga los siguientes
reactivos en volumen suficiente para el número de muestras de ensayo. Todos los reactivos, excepto
el agua, son comercializados por Perkin-Elmer. La cantidad que se indica es por muestra.
ARNasa sin agua
10‰tampón PCR Perkin-Elmer (100 mM Tris/HCl, pH 8,3, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM)
Mezcla de dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq ADN polimerasa (5 unidades/µl)
62,0 µl
7,0 µl
7,0 µl
4,0 µl
0,85 µl
xiv) La mezcla de la primera fase se saca del área "limpia" y se lleva al área del termociclador y se
depositan 80 µl en cada tubo con muestra. La capa de cera no debe romperse. Cada tubo debe
contener entonces 101 µl.
220
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
xv)
Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la primera fase de
amplificación (correcto para el GeneAmp PCR System 9600 -la programación en otros termocicladores
debe determinarse):
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
40 ciclos:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
20 segundos
20 segundos
20 segundos
Un ciclo:
Mantener 95°C
Mantener 58°C
Mantener 72°C
Mantener 4°C
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante
xvi) 15 minutos antes de que se complete la programación, se preparan tubos de PCR para la siguiente
reacción en una campana "limpia", y se mantienen en hielo:
ARNasa sin agua
Mezcla de cebadores (C+D)
Bola de cera
17 µl por tubo
4,0 µl por tubo
xvii) Cuando se completa la primera fase de amplificación, se sacan los tubos del termociclador y se
colocan en una cabina de seguridad biológica (no la campana "limpia). Después, se transfiere 1,5 µl
del producto de la primera fase al tubo correspondiente de PCR de la segunda fase que contiene
cebador, agua y una bola de cera.
xviii) Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la formación de una
capa de cera:
Mantener 98°C
Mantener 4°C
4 minutos
Constante
xix) En una campana "limpia" se prepara la mezcla de los siguientes reactivos en volumen suficiente para
el número de muestras a ensayar. Los reactivos son los mismos que en la primera fase (paso xii). Las
cantidades que se indican son por muestra:
ARNasa sin agua
10 ‰ tampón PCR
MgCl2
Mezcla de dNTP
Taq ADN polymerasa
17,0 µl
5,0 µl
3,5 µl
4,5 µl
0,5 µl
xx)
La mezcla se pasa de la campana "limpia" al termociclador y se depositan 30 µl en cada tubo. Cada
tubo debe contener entonces 52 µl.
xxi)
Se colocan los tubos en el termociclador, que se programa como se indica para la segunda
amplificación. Después de completar el proceso, los tubos se mantienen a 4°C o a –20°C hasta la
electroforesis:
Un ciclo:
40 ciclos:
Un ciclo:
Mantener
95°C
Mantener
58°C
Mantener
72°C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
Mantener
95°C
Mantener
58°C
Mantener
72°C
20 segundos
Mantener
95°C
Mantener
58°C
Mantener
72°C
Mantener 4°C
20 segundos
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
20 segundos
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante
221
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
•
Análisis electroforético del producto de la PCR
i)
Al principio se prepara tampón 1 x TBE (Tris/borato, pH 8,6, y EDTA 1,5 mM) a partir de una solución
stock x 10. Para el sistema de Bio-Rad Wide Mini-Sub cell, se preparan 700 ml (100 ml para el gel y
600 ml para el depósito de tampón).
ii)
Se prepara en tampón TBE una solución al 3% de agarosa NuSieve 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland,
Maine, EE.UU.) o una agarosa equivalente. La solución se hierve hasta que la agarosa se disuelve por
completo y luego se deja enfriar hasta 40°C. Se añade bromuro de etidio a una concentración de
0,5 µg/ml tanto al tampón de la agarosa como al del depósito. El bromuro de etidio es mutagénico y
tóxico. Se debe utilizar siempre guantes, ropa protectora y protección ocular.
iii)
Se cierran los extremos de la bandeja de electroforesis y se vierte la solución de agarosa. El peine se
inserta en la agarosa hasta que se solidifica en una superficie nivelada a los 30-60 minutos. El peine y
el cierre se eliminan con cuidado de la bandeja de electroforesis.
iv)
Verter el tampón en el depósito del aparato de electroforesis e insertar la bandeja con la agarosa de
modo que el tampón cubra la agarosa.
v)
Las muestras de ensayo y los controles positivos y negativos se preparan para electroforesis en tubos
de microcentrífuga del modo siguiente:
Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl
ADN amplificado de cada tubo de PCR y un tubo extra para
un ADN marcador
15,0 µl
Solución de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 µl
Marcador de 100 pares de bases (Cat. 15268-019, Life Technologies,
Grand Island, New York, EE.UU.)
1,0 µl
vi)
Se cargan las muestras en los pocillos adecuados del gel y se corren a 65-75 voltios durante 1-1,5
horas o hasta que el colorante alcance la mitad de la longitud del gel. El gel se lleva a un
transiluminador y se fotografía para documentación permanente. Usar protección ocular para
visualizar las bandas en el gel.
vii)
Las muestras positivas para LA tendrán una banda de 101 pares de bases. Para que la prueba sea
válida, el control positivo debe mostrar una banda del tamaño correcto, y el negativo y los controles sin
ARN no deben mostrar banda. Las muestras se consideran positivas si hay una banda del mismo
tamaño que la del control positivo. Las muestras duplicadas deberían mostrar la misma reacción. Si
existe disparidad, la prueba debe repetirse.
viii) Durante una noche se coloca en el tampón del depósito un envase (Ameresco, Solon, Ohio, EE.UU.)
al objeto de eliminar el bromuro de etidio. Después se puede verter el tampón al alcantarillado y debe
colocarse el envase, después de reutilizarlo 10-15 veces,
en un recipiente identificado
adecuadamente como bromuro de etidio y, finalmente, incinerado.
Los equipos y reactivos para dos pruebas serológicas ordenadas - la prueba de inmunodifueión en gel de
agar (IGDA) y la prueba C-ELISA- se pueden obtener de tres fabricantes autorizados en EE.UU (VMRD,
P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, U.S.A.; o Veterinary Diagnostic Technology, 4980 Van Gordon
Street, Suite 101, Wheat Ridge, Colorado 80033, U.S.A.; o Diagxotics, 27 Cannon Road, Wilton,
Connecticut 06897, U.S.A.). Los reactivos para C-ELISA están disponibles en: European Union ‘Community
Reference Laboratory’ for BTV (Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking GU24 0NF, United
Kingdom).
2.
Pruebas serológicas
Los anticuerpos contra BTV generados en animales infectados pueden detectarse de varios modos que
dependen de la sensibilidad y el tipo de prueba utilizada. Se inducen tanto anticuerpos específicos de serogrupo
como anticuerpos específicos de serotipo, y si el animal no ha estado previamente expuesto al BTV, los
anticuerpos neutralizantes que se generan son específicos para el virus infectante. Las infecciones múltiples con
diferentes serotipos de BTV dan lugar a la producción de anticuerpos capaces de neutralizar serotipos a los que
el animal no ha estado expuesto. Hay dos explicaciones para este fenómeno. Primero, varios serotipos
comparten epítopos de neutralización definidos por MAbs monoclonales. Segundo, los serotipos también
comparten un gran número de epítopos que están presentes en una conformación neutralizante en un serotipo,
pero en conformaciones no neutralizantes en otros serotipos.
a)
Fijación de complemento
Hasta 1982 se utilizó ampliamente una prueba de fijación de complemento (7) para detectar anticuerpos
contra BTV, que fue en gran medida reemplazada por la prueba IGDA aunque la prueba FC todavía se
utiliza en algunos países.
222
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
b)
Inmunodifusión en gel de agar (una prueba prescrita para el mercado internacional)
La prueba IGDA para detectar anticuerpos anti-BTV es de desarrollo simple y el antígeno utilizado en la
prueba es relativamente fácil de generar. Desde 1982, la prueba ha sido el procedimiento estándar de
ensayo para controlar el movimiento internacional de rumiantes. Sin embargo, una de las desventajas de la
IGDA utilizada para LA es su falta de especificidad, por la que puede detectar anticuerpos contra otros
Orbivirus, en particular los del serogrupo EHD. Por tanto, los sueros positivos por IGDA deben ser probados
de nuevo utilizando una prueba específica para el serogrupo LA. La falta de especificidad y la subjetividad
que se ejerce durante la lectura de los resultados ha promovido el desarrollo de procedimientos basados en
ELISA para la detección específica de anticuerpos anti-BTV. La versión preferida, una técnica C-ELISA, se
describe en la sección B.2.c.
c)
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se prepara una capa de 2,8 mm de grosor de agarosa al 0,9% en NaCl al 0,85% y se cortan pocillos
circulares de 4,0 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm, con un pocillo central y seis pocillos
periféricos.
ii)
Se prepara antígeno vírico generando una preparación soluble de células BHK o Vero infectadas 2448 horas antes con un serotipo individual de BTV. El antígeno se puede concentrar por precipitación o
ultrafiltración.
iii)
Se colocan tres sueros positivos y tres sueros de ensayo de forma alterna en los pocillos que rodean
el pocillo central que contiene el antígeno y se incuban las placas 24 horas en un ambiente húmedo a
20-25°C.
iv)
Se forma una serie de líneas de precipitina entre el antígeno y los sueros positivos, y las líneas
generadas por los sueros de ensayo positivos se juntarán con las de los controles positivos. Con
muestras débilmente positivas las líneas control se curvan hacia el antígeno y se separan del pocillo
de la muestra de ensayo, pero no forman una línea continua con los pocillos de control de la prueba.
Con muestras negativas, las líneas de precipitina continúan en los pocillos de la muestra sin curvarse
hacia el antígeno.
v)
Todas las muestras débilmente positivas y otras muestras que produzcan resultados dudosos deben
repetirse utilizando pocillos de 5,3 mm de diámetro separados entre sí 2,4 mm o probarse de nuevo
utilizando C-ELISA como se describe a continuación.
Enzimoinmunoensayo competitivo
La prueba competitiva ELISA, o prueba ELISA bloqueante para LA, se desarrolló para medir anticuerpos
específicos contra BTV sin detectar anticuerpos de reacción cruzada con otros Orbivirus (1, 3, 22, 28, 31).
La especificidad es el resultado de utilizar uno de varios MAbs con reactividad de serogrupo para LA, como
MAb-3-17-A3 (3) o MAb 20E9 (21, 22). Los anticuerpos proceden de varios laboratorios y, aunque son
diferentes, todos parecen unirse a la región amino-terminal de la principal proteína de la cápsida, VP7. En la
prueba C-ELISA, los anticuerpos de los sueros de ensayo compiten con los MAbs para unirse al antígeno.
El siguiente procedimiento de C-ELISA se ha estandarizado después de estudios comparativos en varios
laboratorios internacionales.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Durante una noche a 4°C o durante 1 hora a 37°C, se recubren los 96 pocillos de las placas de
microtitulación con 50-100 µl de antígeno derivado de cultivos celulares obtenido por sonicación (3) o
del antígeno principal de la cápsida VP7 expresado en baculovirus (29) o levaduras (25), y diluidos en
0,05 M de tampón carbonato, pH 9,6.
ii)
Las placas se lavan cinco veces con PBST (0,01 M de PBS con 0,05% o 0,1% de Tween 20, pH 7,2).
iii)
A continuación se añaden por duplicado 50 µl de sueros de ensayo a una única dilución, 1/5 (1) o 1/10
(22), en PBST que contenga 3% de seroalbúmina bovina (BSA).
iv)
Inmediatamente, se añade a cada pocillo 50 µl de una dilución predeterminada de MAb diluido en
PBST que contenga 3% de BSA. Los pocillos de control de MAb contienen tampón de dilución en vez
de suero de ensayo.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
223
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
v)
Se incuban las placas 1 hora a 37°C o 3 horas a 25°C, con agitación continua.
vi)
Después de lavar como se indicó anteriormente, los pocillos se llenan con 100 µl de una dilución
apropiada de IgG (H+L) anti-ratón obtenida en conejo y marcada con peroxidasa de rábano, realizada
en PBST con 2% de suero normal bovino.
vii)
Después de incubar 1 hora a 37°C, se elimina la solución del conjugado y las placas se lavan cinco
veces con PBS o PBST. Los pocillos se llenan con 100 µl de solución de substrato que contiene 1,0 M
de ABTS (2,2´-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 ácido sulfónico]), y 4 mM de H2O2 en 50 mM de citrato
sódico, pH 4,0, y las placas se agitan a 25°C durante 30 minutos. (Se pueden utilizar otros substratos
y dejar que la reacción continúe con agitación por un tiempo adecuado para permitir el desarrollo de
color).
viii) La reacción se detiene adicionando un agente bloqueante, como azida sódica.
ix)
Después de poner a cero el lector de ELISA con los pocillos que sólo contienen substrato y agente
bloqueante, se miden los valores de absorbancia a 414 nm. Los resultados se expresan como
porcentajes de inhibición y derivan de los valores medios de absorbancia de cada muestra por la
fórmula siguiente:
% inhibición = 100 -[(Media de la absorbancia de la muestra de ensayo) / (Media de la absorbancia del
control de MAb)] x 100.
NB: Algunos laboratorios prefieren usar un control de suero negativo que previamente se ha visto que
tiene un porcentaje de inhibición igual a cero como alternativa al control de MAb.
x)
Porcentajes de inhibición >50% se consideran positivos. Una inhibición entre el 40% y el 50% se
considera sospechosa. Los resultados de los duplicados de los sueros de ensayo pueden variar con
tal de que los valores caigan dentro del valor de inhibición escogido.
xi)
En cada placa se deben incluir sueros positivos fuertes y débiles y un control de suero negativo. Un
positivo débil debe dar un 60-80% de inhibición y un negativo menos de 40% de inhibición.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
De las varias opciones de vacunas posibles, es decir, las vivas atenuadas, las muertas, o las recombinantes,
sólo están en uso las vacunas con virus vivos atenuados en varios países. En Sudáfrica, por ejemplo, se han
usado durante más de 40 años y se saben que inducen una inmunidad eficaz y duradera (11). Aunque algunos
estudios de laboratorios han investigado la eficacia de las vacunas inactivadas contra el virus (15), éstas no
parecen haberse utilizado en condiciones de campo. Existen varias posibilidades en el desarrollo de vacunas
recombinantes contra BTV, como la presentación por otros virus vivos de los antígenos de neutralización del BTV
y de partículas incompletas (VLP) que se generan en células de insectos infectadas por medio de baculovirus
recombinantes que expresan las cuatro proteínas mayoritarias de la cápsida VP2, 3, 5 y 7. Sólo la última
posibilidad ha demostrado ser una promesa significativa (33). Sin embargo, queda aún mucho por determinar,
como la duración de la respuesta neutralizante generada con las VLP, la necesidad de múltiples VLPs de
diferentes serotipos, y el escalado comercial de la producción de VLP como proceso eficaz y de coste adecuado.
La descripción que sigue es aplicable a las vacunas con virus atenuados.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El inóculo base o primario se prepara a partir de una placa o calva única de BTV atenuado que se ha
cultivado por pases seriados. Los lotes de inóculo secundario, que se utilizan como inóculos en la
producción de vacunas, derivan por lo general de no más de tres pases adicionales respecto al inóculo
primario. El virus del inóculo primario debe estar exento de bacterias, virus, hongos y micoplasmas
contaminantes, y en particular de contaminación por pestivirus, y tiene que mostrar la especificidad
serotípica deseada. Antes de la producción de la vacuna, cada lote de inóculo primario debería probarse
también para transmisión y reversión de la virulencia. Se deben probar en ovejas la avirulencia, seguridad e
inmunogenicidad de muestras de la vacuna preparada de inóculos víricos secundarios del máximo nivel de
pases permitidos.
b)
Método de cultivo
Las primeras vacunas de la LA se propagaron en ECE (2). Más recientemente, se han utilizado varias
células diferentes para adaptarlas al cultivo celular y a los pases seriados. Entre éstas están las células
224
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
primarias de embrión bovino, células de riñón de cordero y de cordero fetal, y la línea celular continua de
células BHK. Las células utilizadas para la atenuación deben ser cuidadosamente comprobadas para
detectar la presencia de virus contaminantes. No sólo las líneas celulares pueden contener virus
oncogénicos, sino que también las células primarias pueden tener infecciones latentes o no aparentes,
como las debidas a contaminación por pestivirus. A este respecto, se debe tener un cuidado especial con el
suero fetal bovino utilizado en los cultivos celulares, pues puede estar contaminado. Los virus de las
vacunas se atenúan por pases en ECE, en cultivos celulares, o en ambos sistemas.
c)
Validación como vacuna
Las vacunas atenuadas contra la LA deben ser seguras y eficaces, y a continuación se presenta una
descripción breve de las pruebas relacionadas con estos parámetros. Además, los virus atenuados no
deben revertir a virulentos durante su replicación en animales vacunados ni transmitirse desde tales
animales por insectos vectores. Este último criterio es muy importante porque la transmisión de virus
atenuados mediada por insectos desde animales vacunados a no vacunados, con los subsiguientes pasos
replicativos en cada especie hospedadora, aumenta la probabilidad de reversión a la virulencia. Aunque las
pruebas de reversión a virulencia y de transmisión se realizan raramente, se resumen en una breve
descripción los requisitos.
i)
Avirulencia
Se inoculan varias ovejas, que por C-ELISA sean seronegativas para LA, con el stock de inóculo
primario o un volumen equivalente de medio de cultivo celular. Las temperaturas se anotan dos veces
al día. Los animales se controlan regularmente durante 28 días para síntomas clínicos o reacciones
locales y sistémicas a fin de asegurar la avirulencia e seguridad. Las muestras de sangre que se
toman a intervalos regulares se pueden utilizar para determinar la viremia y la respuesta de
anticuerpos. La prueba es válida si todas las ovejas inoculadas con vacuna muestran evidencia de
crecimiento vírico sin signos de enfermedad, excepto una enfermedad suave y pasajera. En Sudáfrica
se calcula un índice de reacción clínica (33) para cada animal entre los días 4 y 14, y debe estar por
debajo de un valor estándar específico.
ii)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad de las vacunas atenuadas no contemplan la cuestión de la teratogenicidad
(34). Las vacunas con virus atenuados son teratogénicas y no deben administrarse a ovejas gestantes
durante la primera mitad del embarazo debido a que pueden causar anormalidades fetales y muerte
(20).
iii)
Eficacia
Las ovejas vacunadas y no vacunadas reciben un inóculo de desafío con virus virulento del mismo
serotipo, y los animales se analizan para síntomas clínicos de LA. Se toman diariamente las
temperaturas rectales dos veces. Las ovejas control no vacunadas deberían mostrar signos de LA. Sin
embargo, es difícil asegurar la aparición de la enfermedad clínica en ovejas por la inoculación de
algunos serotipos y aislados de BTV y, por tanto, la evidencia de infección en las ovejas control no
vacunadas puede reducirse a la aparición de un aumento de temperatura de por lo menos 1.7°C sobre
la media anterior al inóculo de desafío. Se analizan los sueros, pre- y post-vacunación, para la
presencia de anticuerpos neutralizantes.
iv)
Transmisión
Los procedimientos para determinar si un virus atenuado se puede transmitir por insectos que se
alimentan sobre ovejas virémicas vacunadas son difíciles de realizar y de analizar estadísticamente.
Por ello, es raro que se investigue este criterio de validación de la vacuna Hay datos que indican que
los virus adaptados a condiciones de laboratorio se pueden transmitir por insectos vectores (35). Un
procedimiento adecuado para determinar la transmisión de un virus atenuado requiere que las ovejas
estén vacunadas y que, durante la viremia, estén expuestas a Culicoides no infectados a los que se
deja alimentar sobre animales no infectados controlados para presencia de BTV y anticuerpos antiBTV. Como el título de virus atenuados en la sangre de las ovejas vacunadas es muy bajo, se
necesitarían muchos Culicoides, y sólo una pequeña proporción de éstos llegarían a infectarse y vivir
lo suficiente para alimentarse sobre otra oveja no infectada y transmitirle potencialmente el virus. Es
difícil diseñar un experimento de laboratorio que tenga en cuenta el número de variables presentes en
situaciones de campo. Sin embargo, en Sudáfrica se estima que el título mínimo de virus circulante en
el torrente sanguíneo de un animal debe ser por lo menos 103 antes de que un Culicoides se infecte al
alimentarse, aunque también se ha sugerido que a veces un título inferior puede resultar infectivo.
Para seleccionar una cepa de virus atenuado que sea adecuada, se recoge sangre completa entre los
días 4 y 14 post-vacunación y se determina el título viral. Sólo los virus atenuados que generan títulos
inferiores a 103 se consideran aceptables para vacunas.
Lo datos actuales indican que durante la viremia, y a diferencia de los virus de tipo salvaje, las cepas
de BTV adaptadas a condiciones de laboratorio pueden aparecer en el semen de toros y carneros
(32). Las implicaciones de estas observaciones en la transmisión de los virus son confusas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
225
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
v)
Reversión a la virulencia
Los estudios de validación confirman que en ovejas vacunadas los virus atenuados no revierten a
virulentos. Por consiguiente, si los insectos no transmiten los virus atenuados de animales vacunados
a no vacunados, la reversión a la virulencia resulta ser sólo una posibilidad teórica. Sin embargo, si los
virus atenuados pudieran transmitirse de animales vacunados, la reversión a la virulencia durante
varios ciclos de replicación en oveja-insecto sería una posibilidad bien distinta. El único modo
apropiado de comprobar la reversión a la virulencia bajo estas circunstancias es comparar la virulencia
del virus vacunal con la del virus sujeto a varios ciclos de replicación oveja-insecto, como se comentó
anteriormente. Esto es difícil de realizar. Por consiguiente, no se ha determinado el efecto de varios
pases en insecto y en oveja sobre la virulencia de los virus atenuados. En Sudáfrica se considera que
si, durante la fase virémica, la sangre de los animales vacunados se pasa en serie tres veces por
oveja sin reversión a la virulencia, las posibilidades de reversión en el campo serán muy pequeñas.
2.
Método de producción
La atenuación de aislados naturales de BTV se realizó primero por pases seriados en ECE. Más recientemente,
parece claro que el pase por células en cultivo también resulta en atenuación de la virulencia. No se han hecho
estudios para relacionar con precisión el número de pases y el grado de atenuación de virus o serotipos
individuales. Para preparar virus atenuados, los aislamientos de campo se adaptan a cultivo celular y se pasan in
vitro hasta 40 veces o más. En teoría, en esta etapa se seleccionan varios virus purificados de placas o calvas y
cada uno se examina para el nivel de viremia que generan y su capacidad para inducir una respuesta inmune de
protección en ovejas vacunadas. El virus ideal es el que se replica a bajo título pero que induce respuesta
inmune protectora y éste puede representar la fuente del stock de virus para inóculo primario de la vacuna.
3.
Control interno
Todos los componentes de origen animal, como el suero y las células, deben probarse para presencia de
bacterias, virus, hongos o micoplasmas viables.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Cada lote de vacuna tiene que ser probado para presencia de bacterias, virus extraños, hongos y
micoplasmas, y en particular contaminación por pestivirus. Por ejemplo, en Sudáfrica, se inocula un
conjunto de diez ampollas seleccionadas al azar en caldo de soja y caldo de tioglicolato y se incuba a
temperatura ambiente y a 37°C, respectivamente, durante 14 días. Si el cultivo aparece contaminado, el
lote queda descalificado.
b)
Inocuidad
Cada lote se prueba para inocuidad en ratón adulto y neonato, en cobayas y en oveja. Si se advierten
reacciones adversas o síntomas notables, se repite la prueba. Cualquier incremento en la temperatura
corporal del animal por encima de la esperada para esa cepa particular de virus atenuado que se está
ensayando debe considerarse como sintomático. Si los resultados no son satisfactorios, el lote se
descalifica.
c)
Potencia
Cada lote se prueba inoculando ovejas susceptibles. Los sueros de pre-vacunación y los de 21 y 28 días
post-vacunación se prueban por ensayos NV para determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes.
Para superar este aspecto, el título de anticuerpo debe ser igual o superior a unos valores establecidos por
estándares internacionales de vacunas.
d)
Duración de la inmunidad
Los estudios sobre vacunas con BTV vivo atenuado han mostrado que en ovejas los anticuerpos aparecen
antes del día 10 post-vacunación, alcanzan un máximo aproximadamente 4 semanas después y persisten
durante más de un año. Existe una relación temporal entre el aumento en el título de anticuerpos
neutralizantes y la desaparición del virus de la circulación periférica. Las vacunas con BTV vivo atenuado se
han usado más de 40 años y se sabe que inducen una inmunidad eficaz y duradera (13). En áreas
endémicas de Sudáfrica se presentan muchos serotipos de BTV, y se usan vacunas polivalentes. La
inclusión en la vacuna de 15 serotipos implica que no se genera una respuesta inmune eficaz frente a todos
los serotipos, probablemente porque la masa antigénica de algunos antígenos individuales específicos de
serotipo es pequeña. Para intentar ampliar la respuesta, se repite anualmente la vacunación (12).
226
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.9. — Lengua azul
e)
f)
Estabilidad
La estabilidad debe probarse a lo largo de un período de 2 años. Se considera que las vacunas
en forma líquida o liofilizada tienen una caducidad de 1 y 2 años, respectivamente. Cada lote de
vacuna se somete a una prueba de caducidad acelerada, guardándolas a 37°C durante 7 días.
Luego se titulan y evalúan con arreglo a un procedimiento estándar, como se determina en las
pruebas iniciales de la vacuna.
Precauciones (riesgos)
La vacuna polivalente es segura excepto cuando se usa en ovejas en la primera mitad del embarazo. Los
corderos que tengan inmunidad por el calostro no pueden ser vacunados con eficacia antes de los 6 meses
de edad.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
b)
Ver C.4.b.
Potencia
Ver C.4.c.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Dr. Peter Mertens su valiosa correspondencia sobre el futuro del diagnóstico por PCR, al Dr. H.
Aitchison por suministrar información sobre la producción y ensayo de la vacuna LA en Sudáfrica, a los
Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios en Ames, Iowa, EE.UU., por facilitar el protocolo detallado de
PCR para la lengua azul, y a todos los críticos del capítulo publicado previamente en el Manual del año 2000.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Lengua azul (ver Cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
229
CAPÍTULO 2.1.10.
VIRUELA OVINA Y VIRUELA CAPRINA
RESUMEN
La viruela ovina y caprina son enfermedades víricas de las ovejas y de las cabras que se
caracterizan por fiebre, aparición de pápulas o nódulos generalizados, vesículas (raramente),
lesiones internas (particularmente en los pulmones), y por la muerte. Ambas enfermedades están
causadas por cepas de capripoxvirus, que pueden infectar a las ovejas y a las cabras, y, aunque la
mayoría de las estirpes examinadas causan la enfermedad clínica en su forma más grave ya sea
en las ovejas o en las cabras, se han aislado algunas cepas que son igualmente patógenas en
ambas especies. Se ha propuesto que se haga referencia a la viruela maligna de las ovejas y de
las cabras causada por capripoxvirus, incluyendo la viruela ovina y caprina de Kenia, la dermatitis
caprina de India y la forma nodular de la enfermedad de las ovejas y de las cabras del norte de
África, como la viruela caprina.
La viruela caprina es endémica en África (al norte del Ecuador), Oriente Medio, Turquía, Irán,
Afganistán, India, Nepal, en zonas de la República Popular China, y, desde 1984, en Bangladesh.
Recientemente, la enfermedad ha hecho frecuentes apariciones en el sur de Europa.
Identificación del agente: La confirmación más rápida de la viruela caprina en el laboratorio es la
identificación de los viriones típicos de la viruela caprina utilizando el microscopio electrónico de
transmisión en combinación con una historia clínica de la infección generalizada de la viruela
caprina. El virión de la viruela caprina es diferente del de otro poxvirus que comúnmente infecta a
las ovejas y a las cabras – un parapoxvirus que causa el ectima contagioso o dermatitis pustular
contagiosa. Se puede identificar un antígeno de precipitación mediante una prueba de
inmunodifusión en gel de agar (IGDA) utilizando material de biopsia de un ganglio linfático de un
caso temprano de viruela caprina y de sueros inmunes específicos; sin embargo, se produce una
reacción cruzada con parapoxvirus. El capripoxvirus crece en los cultivos de tejidos de origen
ovino, caprino o bovino, aunque los aislados de campo pueden necesitar hasta 14 días para
crecer, o requerir uno o más pases adicionales en cultivos de tejidos. El virus produce inclusiones
intracitopasmáticas que se observan con claridad mediante la tinción con hematoxilina y eosina. El
antígeno se puede detectar también en cultivos de tejidos utilizando sueros específicos y las
técnicas de inmunoperoxidasa o de inmunofluorescencia. El antígeno de capripoxvirus y los
cuerpos de inclusión se pueden observar en secciones obtenidas en un criostato o en secciones
de parafina teñidas de material procedente de lesiones de biopsias o exámenes post-mortem.
Se ha elaborado un enzimoinmunoensayo (ELISA) utilizando un suero de detección policlonal
obtenido frente a un recombinante del antígeno inmunodominante de capripoxvirus. Se ha descrito
también la detección del genoma empleando cebadores específicos de capripoxvirus para los
genes de las proteínas de fusión y de unión.
Pruebas serológicas: La prueba de neutralización viral es la prueba serológica más específica,
pero, debido a que la inmunidad a la infección de la viruela caprina está predominantemente
mediada por células, la prueba no es lo suficientemente sensible para identificar a los animales
que han tenido contacto con el virus y que sólo han desarrollado niveles bajos de anticuerpo
neutralizante. Las pruebas IGDA y de inmunofluorescencia indirecta son menos específicas debido
a las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. El análisis de
inmunoelectrotransferencia (Western blotting) es sensible y específico, pero resulta caro y difícil de
llevar a cabo utilizando la reacción entre el antígeno P32 de capripoxvirus y los sueros de ensayo.
230
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina
El uso de este antígeno, expresado en un vector adecuado, en una prueba ELISA ofrece la
posibilidad de realizar una prueba serológica aceptable y estandarizada.
Requisitos para las vacunas y los biológicos de diagnóstico: Las vacunas vivas y las
inactivadas se han empleado para el control de la viruela caprina. Todas las cepas de
capripoxvirus examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralización principal y muestran
protección cruzada. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad a corto plazo en el mejor de
los casos.
A. INTRODUCCIÓN
La viruela ovina y la viruela caprina son endémicas en África del norte y central, en Oriente Medio y en India. La
viruela caprina está causada por cepas de capripoxvirus y produce una enfermedad clínica característica en
razas sensibles de ovejas y cabras, que no puede confundirse con ninguna otra. En los animales autóctonos, la
enfermedad y la mortalidad generalizadas son menos frecuentes, aunque sí se observan en los lugares donde la
enfermedad ha estado ausente en una zona o en un pueblo durante un período de tiempo al introducir métodos
intensivos de cría, o en asociación con otros agentes causantes de enfermedades, tal como el virus de la peste
de los pequeños rumiantes o el virus de la fiebre aftosa.
La viruela caprina es la restricción más importante para la introducción de razas exóticas de ovejas y cabras, y
para el desarrollo de la producción intensiva de animales de cría. Las cepas de capripoxvirus que originan la
dermatosis nodular contagiosa (tal como la Neethling) se encuentran también en bovinos, pero no hay pruebas
de que estas cepas causen la enfermedad en ovinos y en caprinos de forma natural. La distribución geográfica
de la dermatosis nodular contagiosa difiere de la de la viruela ovina y caprina.
Las cepas de capripoxvirus se transmiten entre los ovinos y los caprinos, aunque la mayoría solamente causan la
enfermedad clínica más grave en una especie; también se produce recombinación entre estas cepas, originando
un espectro que muestra preferencias intermedias por el hospedador y un rango de virulencia. Algunas cepas
son igualmente patógenas en ovinos y en caprinos. La viruela caprina tiene la capacidad de propagarse y
establecerse en países fuera de su distribución normal. En 1983 se propagó a Italia, en 1985 y 1989 a Chipre, y
en 1988 y en numerosas ocasiones posteriores a Grecia, pero no llegó a establecerse en estos países. Sin
embargo, en 1984 se propagó a Bangladesh donde persiste. Durante la última década se produjeron apariciones
más frecuentes en Grecia y en Bulgaria.
El período de incubación está entre 8 y 13 días después del contacto entre un animal infectado y animales
susceptibles. Dicho período puede reducirse a 4 días después de una infección experimental por inoculación
intradermal o por transmisión mecánica por insectos. Algunas razas de oveja europea, tal como la Soay, pueden
morir de una infección aguda antes del desarrollo de las lesiones cutáneas. En otras razas se produce una
elevación inicial de la temperatura rectal por encima de los 40°C, seguido, en primer lugar, por el desarrollo de
máculas – pequeñas zonas rodeadas de hiperemia que son más obvias sobre la piel no pigmentada – entre los
2–5 días, y, posteriormente, por el desarrollo de pápulas – hinchazones duras de entre 0,5 y 1 cm de diámetro –
que pueden cubrir el cuerpo o restringirse a la entrepierna, la axila y el perineo. Las pápulas pueden estar
cubiertas por vesículas llenas de fluido, pero esto no es muy común. En algunas razas de cabra europea se ha
observado una forma de viruela caprina hemorrágica, en la que todas las pápulas parecen coalescer o unirse por
todo el cuerpo; esta forma es siempre mortal.
Dentro de las 24 horas de la aparición de pápulas generalizadas, los animales infectados desarrollan rinitis,
conjuntivitis y el aumento del tamaño de todos los nódulos linfáticos superficiales, en particular de los nódulos
linfáticos prescapulares. Las pápulas sobre los párpados producen blefaritis de gravedad variable. Conforme se
ulceran las pápulas de las membranas mucosas de los ojos y de la nariz, las secreciones se vuelven
mucopurulentas, y las mucosas de la boca, el ano, y el prepucio o la vagina se necrosan. La respiración se hace
pesada y ruidosa debido a la presión en el tracto respiratorio superior producida por los nódulos linfáticos
retrofaríngeos hinchados, y al desarrollo de lesiones pulmonares.
Si el animal afectado no muere en esta fase aguda de la enfermedad, las pápulas comienzan a necrosarse a
partir de la necrosis isquémica después de la formación de trombos en los vasos sanguíneos situados en la
base de la pápula. En los siguientes 5–10 días, las pápulas forman costras que persisten hasta 6 semanas
dejando pequeñas cicatrices. Las lesiones cutáneas son susceptibles al ataque de las moscas, y es común una
neumonía secundaria. No es habitual la anorexia a no ser que las lesiones en la boca interfieran físicamente la
alimentación. El aborto es poco común.
Las lesiones cutáneas son a menudo menos obvias en el examen post-mortem del animal con infección aguda
que en el animal vivo. Las membranas mucosas están necrosadas y todos los nódulos linfáticos del cuerpo han
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
231
Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina
aumentado de tamaño y están edematosos. Las pápulas, que pueden ulcerarse, se pueden encontrar
habitualmente en la mucosa abomasal, y algunas veces en la pared del rumen y del intestino grueso, en la
lengua, en el paladar duro y en el blando, en la tráquea y en el esófago. Ocasionalmente, pueden observarse
zonas de aproximadamente 2 cm de diámetro en la superficie del riñón y del hígado, y se ha descrito su
presencia en los testículos. Hay numerosas lesiones graves de hasta 5 cm de diámetro por todas partes de los
pulmones y en particular, en los lóbulos diafragmáticos.
Los signos clínicos y las lesiones observadas en el examen post-mortem varían considerablemente con la raza
del hospedador y la cepa de capripoxvirus. Las razas autóctonas son menos sensibles y, con frecuencia,
muestran sólo unas pocas lesiones que pueden confundirse con picaduras de insectos o con la dermatitis
pustular contagiosa. Sin embargo, con frecuencia se observan casos de animales afectados de viruela caprina
de forma generalizada y a veces mortal en casos de: corderos que han perdido su inmunidad derivada de la
maternidad; animales que han sido mantenidos aislados; y animales traídos a zonas endémicas, procedentes de
pueblos aislados, y, en particular, si se les ha sometido a estrés durantes el desplazamiento a largas distancias y
se les ha mezclado con otras ovejas y cabras y sus patógenos. Después de la infección con capripoxvirus se
produce invariablemente una gran mortalidad en razas ovinas y caprinas importadas sin ninguna protección
previa. La viruela caprina no es infecciosa para los humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Œ
Recogida, envío y preparación de muestras
El material para el aislamiento del virus y la detección del antígeno debe recogerse mediante biopsia o en el
examen post-mortem de las pápulas cutáneas, de las lesiones de los pulmones o de los nódulos linfáticos. Las
muestras para el aislamiento del virus y para el enzimoinmunoensayo (ELISA) de detección de antígenos se
recogerán en la primera semana de la manifestación de los signos clínicos, antes de que se produzcan
anticuerpos neutralizantes. Las muestras para la detección genómica mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) pueden recogerse cuando ya está presente el anticuerpo neutralizante. Para el aislamiento del
virus se puede también utilizar la capa leucoplaquetaria de la sangre recogida en heparina o EDTA (ácido
etilendiamino tetracético) durante el estadio virémico de la viruela caprina (antes de la generalización de las
lesiones o en los cuatro días de generalización de la enfermedad). Las muestras para el examen histológico han
de incluir tejido procedente de las áreas circundantes, y se han de colocar inmediatamente después de su
recogida en formalina al 10% en un volumen que sea diez veces el de la muestra.
Los tejidos en formalina no necesitan requisitos especiales para el transporte. Las muestras de sangre con
anticoagulante para el aislamiento del virus a partir de la capa leucoplaquetaria se colocarán inmediatamente en
hielo y se procesarán lo antes posible. En la práctica, las muestras deben conservarse a 4°C durante dos días
antes de su procesamiento, pero no deben congelarse o mantenerse a temperatura ambiente. Los tejidos
destinados al aislamiento de virus, la detección de antígenos o la detección de genoma se conservarán a 4°C, en
hielo o a –20°C. Si hay que transportar las muestras a largas distancias sin refrigeración, el medio de transporte
deberá contener glicerol al 10%; las muestras tendrán el tamaño suficiente para que el medio de transporte no
llegue a la parte central de la biopsia que se utilizará para el aislamiento/detección del virus.
El material para el análisis histológico se preparará mediante técnicas normalizadas y se teñirán con
hematoxilina y eosina (H-E). El material de las lesiones para el aislamiento de virus y para la detección del
antígeno se corta empleando tijeras y fórceps, y después se muele en un almirez con la mano de mortero con
arena estéril y un volumen igual de tampón fosfato (PBS) que contenga penicilina sódica (1.000 unidades
internacionales [UI]/ml, sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatina (100 UI/ml) o fungizona (2,5 µg/ml) y
neomicina (200 UI/ml). La suspensión se congela y descongela tres veces y posteriormente se clarifica por
centrifugación, empleando una centrífuga de mesa, a 600 g durante 10 minutos. La capa leucoplaquetaria puede
prepararse a partir de sangre sin coagular por centrifugación a 600 g durante 15 minutos, y transferirse
cuidadosamente a 5 ml de agua bidestilada fría empleando una pipeta Pasteur estéril. Pasados 30 segundos, se
añaden 5 ml de medio de crecimiento frío y a doble concentración, y se mezclan. La mezcla se centrífuga a 600
g durante 15 minutos, se desecha el sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en 5 ml de medio de
crecimiento como el medio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Después de la centrifugación a 600 g
durante 15 minutos, el sedimento resultante se resuspende en 5 ml de GMEM recién preparado.
Alternativamente, la capa leucoplaquetaria se puede preparar a partir de una muestra heparinizada utilizando un
gradiente de Ficoll.
a)
Cultivo
El capripoxvirus crecerá en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque se considera que
los cultivos primarios y secundarios de células de testículo (LT) o de riñón (LK) de cordero son las más
232
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina
susceptibles, en particular las que se derivan de una raza ovina lanar. Se inocula un frasco de cultivo
celular de 25 cm2 de células ovinas de testículo o riñón (con un 90% de confluencia) con 1 ml ya sea de la
suspensión de la capa leucoplaquetaria o del sobrenadante de la preparación clarificada de la biopsia, y se
permite la absorción a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente, se lava el cultivo con PBS caliente y se cubre
con 10 ml de un medio adecuado, como GMEM, conteniendo antibióticos y suero fetal bovino al 2%. Si se
dispone de ellos, se infectan también tubos de cultivos de tejidos que contengan células LT o LK y un
cubreobjetos, o portaobjetos con cultivos de tejidos.
Los frascos se examinarán diariamente durante 14 días en busca de indicios de efecto citopático (ECP), y si
el medio está turbio se reemplaza. Las células infectadas desarrollan un ECP característico consistente en
la retracción de la membrana celular de las células circundantes, y finalmente en el redondeamiento de las
células, quedando la cromatina nuclear situada en el margen. Al principio sólo se observan pequeñas zonas
de ECP, algunas veces tan sólo 4 días después de la infección, que se expanden durante los siguientes 4-6
días hasta cubrir todo el tapiz celular. Si antes de 14 días no hay pruebas del ECP, se congelará y
descongelará el cultivo tres veces, y el sobrenadante clarificado se inoculará en un cultivo fresco de células
LT o LK. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes, en el caso de que se estén usando varios
cubreobjetos infectados, se tomará un cubreobjetos, se fijará con acetona y se teñirá empleando H-E. La
presencia de los cuerpos de inclusión intracitoplásmáticos eosinófilos que son de tamaño variable, pero que
pueden ser hasta la mitad del tamaño del núcleo y están rodeados por un halo claro, constituye un
diagnóstico de la infección por poxvirus. La formación de sincitios no es una característica de la infección
por capripoxvirus. El efecto citopático se puede evitar o retrasar mediante la inclusión en el medio de un
suero anticapripoxvirus. Algunas cepas de capripoxvirus se han adaptado para crecer en las células de
riñón de mono verde africano (células Vero), pero éstas no se recomiendan para el aislamiento primario.
•
Microscopía electrónica
Antes de la centrifugación, el material de la suspensión original se prepara para su examen en un
microscopio electrónico de transmisión de la siguiente manera: sobre una gota de la suspensión colocada
sobre parafina o sobre una placa de cera, se deja flotar una rejilla de microscopía electrónica de 400 mallas
hexagonales con un substrato de pileoform-carbón activado por una descarga luminiscente en vapor de
pentilamina. Transcurrido 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampón Tris/EDTA, pH 7,8, durante
20 segundos y después a una gota de ácido fosfotungsténico al 1%, pH 7,2, durante 10 segundos. Se
escurre la rejilla empleando papel de filtro, se deja secar al aire y se coloca en el microscopio electrónico. El
virión de la viruela caprina tiene forma de ladrillo, y está cubierto por elementos tubulares cortos y mide
aproximadamente 290 ‰ 270 nm. Algunos de los viriones pueden rodearse de una membrana que procede
de la célula del hospedador y se debe examinar el mayor número posible de células para confirmar su
aparición (16).
Los viriones de los capripoxvirus no se distinguen de los de ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal,
ningún ortopoxvirus causa lesiones en las ovejas o en las cabras. Los viriones de parapoxvirus que causan
dermatitis pustular contagiosa son más pequeños, de forma ovalada, y cada uno de ellos está cubierto por
un único elemento tubular continuo que aparece como estriaciones sobre el virión.
•
Histología
Después de la preparación, de la tinción con H-E y del montaje del material de biopsia fijado con formalina,
se examinarán varias secciones al microscopio óptico. En el examen histológico, los aspectos más
característicos de las lesiones cutáneas en estado agudo son un infiltrado celular masivo, vasculitis y
edema. Las lesiones tempranas se caracterizan por una inflamación perivascular marcada. Inicialmente, la
infiltración es por macrófagos, neutrófilos y ocasionalmente eosinófilos, y a mediada que progresa la lesión
se infiltran más macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Un rasgo característico de todas las
infecciones por capripoxvirus es la presencia en la dermis de cantidades variables de “células de la viruela
ovina”. Estas células de la viruela ovina pueden aparecer también en otros órganos en los que hay lesiones
microscópicas de viruela ovina y caprina. Estas células son grandes, estrelladas, eosinófilas, con
inclusiones intracitoplásmáticas mal definidas y núcleos vacuolados. La vasculitis va acompañada de
trombosis e infartación, produciendo edema y necrosis. Los cambios epidérmicos consisten en acantosis,
paraqueratosis e hiperqueratosis. Los cambios en los órganos son similares, con infiltración celular
predominante y vasculitis. Las lesiones en el tracto respiratorio superior se caracterizan por la ulceración.
•
Inoculación animal
El sobrenadante de la preparación de la biopsia clarificada (véase Sección B.1.a. Cultivo) se puede utilizar
también para la inoculación intradermal en corderos sensibles. Estos corderos se examinarán diariamente
en busca de evidencias de una reacción cutánea.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina
b)
Métodos inmunológicos
•
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
El antígeno de capripoxvirus puede también identificarse en cultivos de tejidos infectados sobre
cubreobjetos o sobre portaobjetos, utilizando las pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubreobjetos o
los portaobjetos se lavarán, se dejarán secar al aire y se fijarán con acetona fría durante 10 minutos. La
prueba indirecta utilizando sueros ovinos o caprinos está expuesta a la aparición de un color de fondo muy
oscuro y a reacciones no específicas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de
sueros de ovejas o cabras convalecientes o de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado.
Como un control negativo, deben incluirse los cultivos de tejidos sin infectar, porque las reacciones
cruzadas pueden causar problemas debido a los anticuerpos contra los antígenos de los cultivos de tejidos.
Se ha utilizado también la técnica con anticuerpos fluorescentes sobre portaobjetos en cortes de tejido
preparados en un criostato.
•
Inmunodifusión en gel de agar
Para la detección del antígeno de precipitación de capripoxvirus se ha utilizado la prueba de inmunodifusión
en gel de agar (IDGA), pero tiene la desventaja de que este antígeno es compartido por el parapoxvirus. La
agarosa (1%) se prepara en tampón borato, pH 8,6, se disuelve por calor, y se vierten 2 ml sobre un
portaobjetos de cristal (76 ‰ 26 mm). Cuando al agar ha solidificado, se excavan 6 pocillos formando una
roseta alrededor de un pocillo central. Cada pocillo mide 5 mm de diámetro, y hay una distancia de 7 mm
entre el centro del pocillo central y el centro de cada uno de los pocillos periféricos. Los pocillos se llenan de
la siguiente manera: en tres pocillos de la periferia se depositan 18 µl de la suspensión de la lesión
alternando con el antígeno de control positivo, y en el pocillo central se depositan 18 µl de suero de control
positivo de capripoxvirus. Los portaobjetos de colocan en una cámara húmeda a temperatura ambiente
durante 48 horas, y se examinan para detectar la formación de líneas de precipitación visibles empleando
un transiluminador. El material ensayado es positivo si se forma una línea de precipitación con el suero
control que es confluyente con la producida por el antígeno de control positivo. Esta prueba, sin embargo,
no permite distinguir entre la infección de la viruela caprina y la dermatitis pustular contagiosa (ectima
contagioso).
Para preparar el antígeno para la prueba IDGA, uno de los dos frascos de 125 cm2 con células LT o LK se
infecta con capripoxvirus, y cuando se alcanza un grado de efecto citopático del 90% (8–12 días) se
recogen las células. Se congela y descongela el frasco dos veces, y se agita éste para liberar las células del
frasco. El contenido se centrifugan a 4.000 g durante 15 minutos, se decanta la mayor parte del
sobrenadante y se guarda, y el sedimento se resuspende en el sobrenadante restante. Las células se
lisarán utilizando una sonda ultrasónica durante 60 segundos aproximadamente. A continuación este
homogenado se centrifuga como antes, el sobrenadante resultante se mezcla con el que ya está recogido.
El sobrenadante mezclado se añade a un volumen igual de sulfato amónico saturado a pH 7,4 y se deja a
4°C durante 1 hora. Esta solución se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y el precipitado se recoge y
se resuspende en un volumen pequeño de solución salina al 0,8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco
que no se ha infectado se procesa de forma totalmente idéntica para obtener el antígeno control del cultivo
celular (14).
•
Enzimoinmunoensayo
Después de la clonación de la proteína estructural P32 de capripoxvirus, que es muy antigénica, se puede
utilizar el antígeno recombinante expresado para la producción de reactivos para el diagnóstico, incluyendo
la obtención de antisuero policlonal monoespecífico contra P32 y la producción de anticuerpos
monoclonales (MAbs). Estos reactivos han facilitado la elaboración de un ELISA muy específico (4).
Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido por inoculación a conejos con capripoxvirus
purificado, se puede inmovilizar el antígeno de la viruela caprina procedente de suspensiones de biopsias o
del sobrenadante de cultivos de tejidos en una placa ELISA. A continuación, la presencia del antígeno
inmovilizado puede ponerse de manifiesto utilizando un suero de cobaya obtenido contra el grupo
específico de la proteína estructural P32, la inmunoglobulina comercial anticobaya de ratón conjugada con
peroxidasa de rábano y una solución substrato cromogénico.
c)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
Mediante técnicas serológicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus bovinos, ovinos o
caprinos. Sin embargo, estas cepas se pueden caracterizar comparando los fragmentos genómicos
originados por la digestión con HindIII de su ADN purificado (1, 13). Con esta técnica se han identificado
diferencias entre aislados de diferentes especies, pero no son consistentes, y hay pruebas de movimiento
de cepas entre especies y de recombinación entre cepas en condiciones naturales (9).
La técnica de la PCR se puede utilizar para detectar el genoma de capripoxvirus en muestras de biopsia o
en cultivos de tejidos. Los cebadores para los genes de las proteínas virales de unión y de fusión son
específicos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos de la PCR puede confirmarse utilizando los
lugares de reconocimiento de las enzimas de restricción (10, 11).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.1.10. — Viruela ovina y viruela caprina
2.
Pruebas serológicas
a)
Neutralización viral
Un suero de ensayo se puede titular bien frente a un título constante de capripoxvirus (100 DICC50 [dosis
infectiva 50% en cultivo celular]) o bien una cepa de un virus de referencia se puede titular frente a una
dilución constante de un suero de ensayo para calcular el índice de neutralización. El método preferi