Download identificacion de bacterias lacticas participantes, cuantificacion de

M I C R O B I O L O G I A
I N D U S T R I A L
IDENTIFICACION DE BACTERIAS
LACTICAS PARTICIPANTES,
CUANTIFICACION DE ACIDO LACTICO
Y VITAMINA C, DURANTE EL PROCESO
DE FERMENTACION LACTICA DE REPOLLO BLANCO,
CHOUCROUTE, SA UERKRA UT, EN PUNTALARGA (BOYACA)
Martha R. Sánchez
Guerrero*, Sandra L. Tovar Morales*y
Marco A. Quijano-Rico Ph. D. ^
iguales o mejores características q u e el
o b t e n i d o e n Puntalarga. S e utilizaron
repollos blancos, Brassica
oleracea
variedad capitata,
a los q u e se les realizó un control de calidad. Para el aislamiento de la bacterias lácticas se utilizó
agar Rogosa, MRS y m e d i o diferencial
p a r a b a c t e r i a s á c i d o lácticas h o m o fermentativas y heterofermentativas
(HHD), y p a r a la identificación se utilizaron azúcares c o m o sustratos. Participaron en la segund a fermentación,
Lactobacillus
brevis, Lactobacillus
íermentum,
Lactobacillus
confusus, Lactobacillus
plantarían
y
Pediococcus
spp y en la tercera ferm e n t a c i ó n , Lactobacillus
sake,
Lactobacillus
curvatus,
Lactoba-
cillus
brevis
y Lactobacillus
plantarum.
El ácido láctico se cuantificó p o r c r o m a t o g r a f í a líquida de alta
presió n ( H P L C ) p a r a la p r i m e r a fermentación y por m é t o d o enzimático
p a r a la s e g u n d a y tercera fermentación,
la cuantificación de vitamina C tanto en
el repollo c o m o en el sauerkraut de las
tres fermentacione s fu e realizada por titulación. La fermentación q u e siguió el
m e j o r p r o c e s o f e r m e n t a t i v o f u e la seg u n d a , ya q u e los resultados microbiológicos y químicos, permitieron la producción de sauerkraut de excelente calidad organoléptica, bacteriológica y nutritiva.
n la zona aledaña al viñedo
de la loma de Puntalarga
(Colombia) gran parte de sus
habitantes centran sus actividades
a la agricultura, viviendo del cultivo
de diferentes alimentos que se producen en la región, debido a las ventajas geoclimáticas que esta les
brinda, encontramos productos co-
mo: papa, alverja, feijoa,cereza, lechuga y repollo entre otros, este último con un gran potencial de utilización en el campo de la fermentación láctica para la obtención de
sauerkraut, el cual ofrece un sin
número de beneficios para la salud
del hombre (14).
* Estudiantes Bacteriología. Pontificia
Universida d J a v e r i a n a . Facultad d e
Ciencias, S a n t a f é de Bogotá.
^ Q u í m i c o . D i r e c t o r Tesis de Pregrado. Viñedo y C a v a de la L o m a de
Puntalarga. Duitama.
Las bacterias que participan en
este proceso son bacterias ácido
lácticas (BAL), con gran utilidad
para la obtención de probióticos
(18), producción de ácido láctico y
en menor cantidad ácido acético
(10) y ácido fórmico que traen como
consecuencia la baja en el pH que
permiten la inhibición de microorganismos patógenos o alterantes de
alimentos (11) y a d e m á s por la producción de componentes antimicrobiales como bacteriocinas (4,7,9),
En este estudio, se identificaron las bacterias lácticas, se cuantificó ácido láctico, vitamina C y se monitoreó p H , durante el proceso de fermentación láctica
del r e p o l l o b l a n c o e n P u n t a l a r g a
(Boyacá). Se llevaron a c a b o tres fermentaciones diferentes c o n un t i e m p o
de duración de un mes, la primera con
el fin de observar si las condiciones de
la región eran óptimas y realizar posteriormente una s e g u n d a fermentación a
mayor escala, la q u e siguió un proceso
fermentativo normal durante los treinta
y un días de duración y por último se
llevó a c a b o u n a f e r m e n t a c i ó n e n
Santafé de Bogotá, p a r a observar m e jor el proceso fermentativo, y p a r a c o m parar si se producía un sauerkraut
con
E
10
Laboratorio Actual • A ñ o 13 • No. 28 • M a y o de 1 9 9 6
sustancias de acción similar como
el diacetilo (8), y ácidos grasos.
Las BAL se encuentran divididas en dos grandes grupos, las
homofermentativas y las heterofermentativas, aisladas de fermentaciones naturales de vegetales (5),
entre las heterofermentativas encontramos Leuconostoc mesenteroides que domina en la primera etapa de la fermentación seguida por
la aparición de la flora homofermentativa como Lactobacillus plantarían (6 ,13) que en su orden permiten obtener sauerkraut de excelente calidad (15).
En este estudio se identificaron
las bacterias lácticas participantes
durante dos procesos de fermentación, se cuantificó la vitamina C y
el ácido láctico al finalizar estas, utilizando para ello repollo blanco
Brassica oleracea variedad capítata proveniente de dos lugares diferentes.
MATERIALES Y METODOS
Fermentación. Se realizaron tres
fermentaciones en diferente tiempo
y lugar, dos el Puntalarga y la tercera en Santafé de Bogotá, con una
duración en cada una de ellas en
31 días. Se utilizó repollo blanco
Brassica oleracea variedad capítata obtenido del sitio de la fermentación. Se acondicionaron tanques
de plástico dependiendo de la cantidad de repollo utilizado en las fermentaciones. En la primera y tercera fermentación se utilizaron 15
Kg de repollo y en la segunda 80
kg, se les agregó el 2% de su peso
en sal (3), el corte de la materia prima se realizó en forma homogénea,
con 3mm de ancho.
Laboratorio Actual • A ñ o 13 • No. 28 • M a y o de 1 9 9 6
Análisis Microbiológico: En la
primera fermentación se realizó determinación de microorganismos a
la materia prima y tiempo después
para ver la posible influencia de estos en la fermentación y en general
para observar como funcionaban las
condiciones de la región durante el
proceso. Para ello se tomaron 11
gramos de repollo y se diluyeron en
99 mi de agua peptonada (Oxoid,
Hampshire, England), quedando
una dilución 10"1 y se sembró para
la determinación de coliformes
fecales (VRBA,Oxoid )a 45°C por
48 h, hongos y levaduras (YGC,
Merck) a 22°C por 5 días y en
Rogosa (Merck) a 37°C 48 horas,
posteriormente de la dilución 10'1
se tomó 1 mi y se llevó a dilución
10'2 con 9 mi de agua peptonada y
lml de esta se sembró para coliformes totales (VRBA, Oxoid) y para
mesófilos (SPC,Oxoid), luego se
hizo la dilución 10"3 y se sembró en
SPC, se realizó identificación de
Salmonella spp por el método de
Salmosyst (Merck).
En la segunda fermentación al
igual que en la primera se cultivaron las bacterias presentes en el repollo, realizando el mismo procedimiento anterior a excepción de
mesófilos. Se aislaron las bacterias
lácticas partiendo de una dilución
10 1 y realizando diluciones seriadas
hasta obtener la dilución 10 5 ,
sembrándose lml de esta en agar
Rogosa y HHD (12), al cual se le
hizo control utilizando una cepa
homofermentativa de Lactobacillus casei formando colonias azules y una cepa heterofermentativa
Leuconostoc mesenteroides
subp cremoris formando colonias
blancas, para la identificación de las
bacterias lácticas se utilizaron una
serie de sustratos de azúcares fermentables.
En la tercera fermentación se siguió el mismo esquema de procedimientos para la identificación de
las bacterias del repollo y al igual
que en la segunda fermentación se
siguió el comportamiento de las
bacterias lácticas utilizando los medios de MRS y HHD y posteriormente se identificaron las bacterias participantes en el proceso fermentativo
por medio de sustratos de azúcares
fermentables.
Análisis Química, se realizó cuantificación de vitamina C en el repollo, en el sauerkraut final de cada
una de las fermentaciones y en un
sauerkraut comercial como control, utilizando un método de titulación oxidimétrica visual de ácido
ascórbico con reactivo 2-6 diclorofenol indofenol en una solución
acidificada con la ayuda de ácido
oxálico al 0.4%.
Para esto se pesaron 20 grs de
la muestra previamente macerada
y se adicionaron 70 mi de ácido
oxálico al 0.4% en un balón aforado de 100 mi color ámbar, se agitó
por diez minutos y se aforó a 100
mi con el mismo reactivo, posteriormente se repartió en dos tubos y se
centrifugó por cinco minutos a
2.500 rpm, el sobrante se filtró y a
20 mi de este filtrado se adicionaron 5 mi de ácido acético al 10%
que se titularon con 2-6 diclorofenol
indofenol.
La determinación de ácido láctico se realizó por HPLC para la primera fermentación y por método
enzimático para la segunda y tercera fermentación. Para el análisis
cromatográfico se pasó la muestra
por filtros 0.45 ul (Millipore, Millford,
USA) se utilizó como fase móvil
KH 2 P0 4 al 0.2M llevada a pH 2.4
con H 3 P0 4 y como fase estaciona-
11
ría se utilizó un cartucho de SepPak C18 (Millipore). Para la determinación del ácido láctico, mediante una técnica enzimática (Merck)
se pasó la muestra por filtros de
0.45ul se prepararon blancos de D
y L lactato que contenían 1 mi de
buffer glycylglicina a pH 10 y ácido
L-glutámico (R,), 1 tableta de NAD
' y transaminasa glutámico pirúvica
(R2) y 1.6 mi de agua destilada.
Las muestras contenían los reactivos (Rl) (R2), 1.5 mi de agua destilada y 0.1 mi de la muestra, se
mezcló y pasados tres minutos se
leyó en absorbancia (EJ a 365nm.
Posteriormente se agregaron 0.02
mi de las enzimas D-LDH y L-LDH
para la cuantificación del respectivo isómero, se mezcló y se realizó
una segunda lectura en absorbancia
(E2) a los treinta minutos. Se hicieron los cálculos correspondientes.
Se monitoreó el pH diario en la
segunda y tercera fermentación utilizando tiras de pH (Merck).
Los resultados de la (Tabla 1),
muestran recuentos altos en cuanto
a bacterias mesófilas, coliformes totales y coliformes fecales en la materia prima utilizada, bacterias que
fueron inhibidas ocho días después
del inicio de la fermentación, como
consecuencia de la susceptibilidad
de estos microorganismos a la alta
c o n c e n t r a c i ó n de sal, c a í d a de
pH(2,13) debido a la producción de
ácidos, al cambio de medio a que
son sometidas ya que se disminuye
la disponibilidad de oxígeno y a las
sustancias q u e producen los microorganismos (bacteriocinas) que
hacen a las bacterias resistentes o
susceptibles a éstas (17).
El producto final de esta fermentación fue un sauerkraut de excelentes características organolépticas,
que condujo a realizar una segunda
fermentación.
El recuento de las bacterias del
repollo utilizado en la segunda fermentación, mostró recuentos inferiores a los obtenidos en la primera
fermentación (Datos no publicados).
RESULTADOS Y D I S C U S I O N
El comportamiento de las bacterias lácticas (Fig. 1) en el medio
Microbiología
Microorganismos
identificados
Mesófilos
Coliformes
totales
Coliformes
fecales
Mohos/levaduras
Rogosa
Salmonella
MI
12x10"
83x10"
<10
63x1o 3
<10
<10
32x10'
Negativo
Tabla 1. Determinación de las bacterias presentes en la materia prima de la primera fermentación y ocho días después de iniciada.
M, : Repollo
M2 : Muestra tomada 8 días después de iniciada la primera fermentación.
12
Las bacterias lácticas identificadas en este proceso con la utilización de azúcares fueron: Pediococcus spp, Lactobacillus plantarían, Lactobacillus spp, Lac
tobacillus fermentum, Lactobacillus confusus y Lactobacillus brevis.
Pasados 31 días de esta fermentación de forma accidental y no previniendo el ambiente donde fué colocado el tanque de fermentación
(cava), una levadura identificada
morfológicamente, contaminó el
sauerh-autperdiendo
sus características normales y apreciándose la
formación de una capa viscosa y
blanca, a d e m á s la capacidad del
tanque proporcionó a la levadura,
i d e n t i f i c a d a por c o l o r a c i ó n d e
Gram, el oxígeno suficiente para
poderse desarrollar (14).
M2
65x10"
65x10"
65x10"
<10
56x10'
Negativo
HHD, mostró un predominio de
bacterias heterofermentativas con
relación a homofermentativas a través de todo el proceso, demostrando que las condiciones ofrecidas en
la región de Puntalarga son aptas
para o b t e n e r un sauerkraut
de
excelente calidad.
— • — HETEROFERMENTATIVA
—Q—HOMOFERMENTATIVA
1400
1200
100
800
600
400
200
0
día
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0
Fig. 1. Comparación de las bacterias lácticas homofermentativas
y heterofermentativas en la segunda fermentación.
Laboratori o Actual • A ñ o 13 • No. 28 • M a y o de 1 9 9 6
Se identificaron microscópicamente con azul de metileno mohos
como: Aspergillus spp, Alternaría spp y Fenicillum spp.
Las bacterias lácticas identificadas en este ensayo fueron Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sake,
Lactobacillus curvatus y Lactobacillus brevis.
Análisis Químico:
Los mejores contenidos de vitamina C y ácido láctico, se obtuvieron
Laboratorio Actual • A ñ o 13 • No. 28 • M a y o de 1 9 9 6
HOMOFERMENTATIVAS
2500 2000
En la tercera fermentación realizada en Santafé de Bogotá, los recuentos de las bacterias presentes
en el repollo como: mesófilos,
coliformes totales, coliformes fecales
mohos y levaduras y Salmonella
fueron similares a la primera fermentación (Datos no publicados).
Con relación a las bacterias
lácticas, se observa un predominio
de bacterias homofermentativas,
con relación a la heterofermentativas (Fig.2), comportamiento totalmente diferente al ocurrido en la
segunda fermentación, posiblemente debido al ecosistema bacteriano
existente en las diferentes zonas de
donde se obtuvo el repollo y al tratamiento recibido después de su recolección que hacen variar las bacterias presentes. También se observó en la última fermentación, que
el pH no disminuyó como en la segunda, debido al predominio de
bacterias homofermentativas, lo que
posiblemente permitió la producción
de ácido láctico sobre otros productos como ácido acético y fórmico
que producen algunas de las bacterias heterofermentativas y que por
esto en el segundo ensayo, el pH
llegó a un valor de 3.5 y en la tercera fermantación a 3.8.
— • — HETEROFERMENTATIVAS
l
1500
1000
500
0
0
3
6
9 12 15 18 21 24 27 30
Fig. 2. Comparación de las bacterias lácticas homofermentativas
y heterofermentativas
en la tercera fermentación.
y concentración de sal influyen en
el contenido de la vitamina C (16).
en la segunda fermentación, a pesar de haberse contaminado accidentalmente, alterando las características normales del producto,como
se mencionó anteriormente. Se cree
que el bajo contenido de vitamina
C en la tercera fermentación se debió a la falta de previsión del manejo de la luz en el lugar donde se llevó a cabo este ensayo, obviando la
fotosensibilidad de la vitamina, además factores como la temperatura
Muestra
Resultado
o
mg/lOOg
Los resultados del pH (Tabla 4)
indican que las fermentaciones realizadas en la región de Puntalarga
fueron mejores a la realizada en
Santafé de Bogotá, además se obtuvieron buenos resultados al compararsen con el sauerkraut comexcial.
Fermentación
No. 1
Fermentación
No. 2
Fermentación
No. 3
11
14.2
2.01
Repollo
23.6
Sauerkraut
comercial
2.13
Tabla 2. Comparación de resultados de vitamina C obtenidos en el repollo,
sauerkraut
de cada fermentación, y en el sauerkraut
come/vial
Muestra
Resultado
o
Fermentación
No. 1
HPLC
Fermentación
No. 2
M. enzimático
Fermentación
No. 3
M. enzim ático
Saverkrau t
comercial
M. enzimático
2.2%
2 . 7 g/lt
2 . 6 g/lt
2.6 g/lt
Tabla 3. Comparación de resultados de ácido láctico, obtenidos en el repollo,
L.iuerkrautde
cada fermentación, y sauerkraut comercial.
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